JPH09182584A

JPH09182584A - スレオニンアナログ耐性微生物およびビオチンの製造法

Info

Publication number: JPH09182584A
Application number: JP29155796A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Kanzaki; 直之神崎; Tomohiro Kawamoto; 朋広河本; Junji Matsui; 純二松井; Kazuo Nakahama; 一雄中濱; Ouji Ifuku; 欧二伊福
Original assignee: Shiseido Co Ltd; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 1997-07-15
Anticipated expiration: 2016-11-01
Also published as: JP3860629B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ビオチンの収率の高い製造法を提供する。【解決手段】ビオチンオペロンの一部ないし全部を含
むプラスミドを有し、スレオニンアナログ耐性を示す微
生物、およびこの微生物を培地で培養し、培養物中にビ
オチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
するビオチンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規スレオニンアナ
ログ耐性微生物およびこれを利用するビオチンの製造法
に関する。本発明により得られるビオチンは、医薬品、
化粧品の原料、飼料添加物等として用いられる。

【０００２】

【従来の技術】ビオチン(ビタミンＨ)はビタミンＢ群の
一種で、カルボキシル化酵素の補酵素として脂肪酸合成
や糖代謝に関与している。このビオチンは、医薬品、化
粧品の原料または飼料添加物等として化学合成法によ
り、年間約１０トン製造されているが、その工程が複雑
なことから、かなり高価である。一方、発酵法によるビ
オチンの生産は古くから研究されているが、生産性が低
いため実用化されていない。そこで遺伝子組換え技術を
用いてビオチンを製造し、安価なビオチンを提供する方
法が期待されている。これらの製造方法に用いられる遺
伝子工学的に改良した微生物としては、エシェリヒア(E
scherichia)属に属するものとしてα−デヒドロビオチ
ン耐性株(例、特開昭６１−１４９０９１号公報等)など
が知られている。これらエシェリヒア属に属する微生物
以外のものとして以下の微生物が知られている。例えば
バチルス(Bacillus)属に属するものとしては、バチルス
・スフェリカスを形質転換し、ついでテノイルトリフル
オロアセトン耐性を付与した微生物(特開平４−１１８
９４号公報)が、あるいは、セラチア(Serratia)属に属
するものとしては、セラチア・マルッセンスＳＢ４１１
にエチオニン耐性を付与し、次いでＳ−アミノエチルシ
ステイン耐性を付与し、その後ビオチン遺伝子断片を含
む組換えプラスミドで形質転換させた微生物(特開平５
−１９９８６７号公報)が、同様にビオチン構造類似物
質であるアクチチアジン酸または５−(２−チエニル)−
n−吉草酸耐性を付与した形質転換体(特開平２−２７９
８０号公報)、ニコチン酸アナログ耐性を付与した形質
転換体(特願平６−３１１７７８号)などが知られてい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ビオチンの生産方法では、ビオチンの工業的製造には不
十分なため、ビオチンの生産性をさらに向上させる生産
方法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】ピメリルＣoＡからデチ
オビオチン（ビオチン前駆体）への主合成経路にＳ−ア
デノシルメチオニンが必要である。本発明者らは、メチ
オニンの生合成経路を強化することによって、Ｓ−アデ
ノシルメチオニンの供給系が強化され、デチオビオチン
およびビオチンの蓄積量が向上すると予想した。そこ
で、メチオニンの生合成経路を強化する目的でビオチン
生産菌からスレオニンアナログ耐性株を分離し、デチオ
ビオチンおよびビオチン蓄積量が著しく増大した株を取
得した。この知見に基づきさらに鋭意検討した結果、本
発明を完成した。すなわち本発明は、(１)ビオチンオペ
ロンの一部ないし全部を含むプラスミドを有し、スレオ
ニンアナログ耐性を示す微生物、(２)微生物が、エシェ
リヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、また
はセラチア(Serratia)属に属する微生物である上記(１)
記載の微生物、(３)スレオニンアナログが、β−ヒドロ
キシノルバリンである上記(１)記載の微生物、および
(４)上記(１)記載の微生物を培地で培養し、培養物中に
ビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするビオチンの製造法を提供するものである。

【０００５】スレオニンアナログとしては、例えばβ−
ヒドロキシノルバリン等が挙げられる。ビオチンオペロ
ンとしては、例えばエシェリヒア属、バチルス属、セラ
チア属由来のビオチンオペロン等が挙げられる。エシェ
リヒア属由来としてはエシェリヒア・コリ(Escherichia
coli)由来のビオチンオペロン(特開昭６１−２０２６
８６号等)が挙げられる。該ビオチンオペロンには、ビ
オチン生合成に関与するbioＡ、bioＢ、bioＦ、bioＣ、
bioＤの５つの遺伝子がコードされている。また、これ
らのビオチンオペロンの一部を改変したものも本発明で
は用いることができ、例えば、エシェリヒア・コリのビ
オチンオペロンの制御領域およびbioＢ開始コドン近傍
のいずれかの塩基配列が野性型に比べて少なくとも１塩
基対変異しているもの等が挙げられる。ここでビオチン
オペロンの制御領域とは、bioＡとbioＢの間に存在する
r鎖を示す配列表の配列番号１、およびより詳細には図
１に示す塩基配列のうちbioＢ開始コドンＡＴＧのＡを
１として−１番目の塩基対から−８６番目の塩基対まで
の領域をいい、bioＢ開始コドン近傍とは、bioＢ開始コ
ドンＡＴＧのＡを１として１番目の塩基対から６番目の
塩基対までの領域をいう。さらに具体的には、bioＢ開
始コドンＡＴＧのＡを１として上流−５３番目、−５番
目、下流４番目の少なくともいずれかひとつのＧＣ対が
ＡＴ対に変異されたもの等が挙げられる(特開平５−２
１９９５６号)。

【０００６】本発明で用いるプラスミドとしては、例え
ばエシェリヒア属、バチルス属またはセラチア属に属す
る微生物に保持され、かつ遺伝子が発現できるものが挙
げられる。好ましくはエシェリヒア属に属する微生物に
保持されているプラスミドである。該プラスミドとして
は、例えばpＸＢＡ３１２(エシェリヒア・コリＤＲＫ−
３３２３[pＸＢＡ３１２](ＦＥＲＭＢＰ−２１１７)
由来、特開平２−５０２０６５号公報)、pＸＢＲＰ３１
９[エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３１９(Ｉ
ＦＯ１５７２１, ＦＥＲＭＢＰ−４７２４)由来、
後述の実施例１参照]、pＡＴ７１(エシェリヒア・コリ
ＨＢ／pＡＴ７１（ＦＥＲＭＢＰ−５６６８）由来)お
よびそれらの誘導体等が挙げられる。本発明の微生物と
しては、ビオチンオペロン生成蓄積能を有する微生物で
あればよく、例えばエシェリヒア(Escherichia)属、バ
チルス(Bacillus)属またはセラチア(Serratia)属などに
属する微生物が挙げられる。このうちエシェリヒア属に
属する微生物が好ましい。該微生物としては、例えばエ
シェリヒア・コリ(Escherichia coli)などが挙げられ、
好ましい例としては後述の実施例で得られたエシェリヒ
ア・コリＨＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９（ＩＦＯ１５
８９４、ＦＥＲＭＢＰ−５６６７）、エシェリヒア・
コリＨＢ／pＡＴ７１（ＩＦＯ１５８９５、ＦＥＲＭ
ＢＰ−５６６８）などが挙げられる。

【０００７】本発明のスレオニンアナログ耐性およびビ
オチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを有
する微生物としては、好ましくはスレオニンアナログ耐
性およびビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラ
スミドで形質転換された微生物である。本発明の微生物
は、例えば親株となる微生物にスレオニンアナログ耐性
を付与し、得られたスレオニンアナログ耐性株にビオチ
ンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導入す
る、あるいは、親株となる微生物にビオチンオペロンの
一部ないし全部を含むプラスミドを導入し、得られた微
生物にスレオニンアナログ耐性を付与する、またはビオ
チンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを保持
している親株となる微生物にスレオニンアナログ耐性を
付与することにより得られる。本発明で用いる親株とな
る微生物としては、ビオチン生成蓄積能を有する微生物
であればいずれでもよく、例えばエシェリヒア(Escheri
chia)属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Serrat
ia)属に属する微生物等が挙げられる。エシェリヒア属
に属する微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ(E
scherichia coli)に属する微生物などが挙げられ、具体
的にはエシェリヒア・コリＩＦＯ１４４１０、エシ
ェリヒア・コリＷ−３１１０(ＩＦＯ１２７１３)お
よびその由来株エシェリヒア・コリＤＲ−８５(特開
昭６１−２０２６８６号)、エシェリヒア・コリＤＲ
−３３２(特開昭６２−１５５０８１号)、エシェリヒア
・コリＤＲＫ−３３２３(特表平２−５０２０６５号)、
エシェリヒア・コリＢＭ４０６２(特表昭６４−５０
００８１号)、後述の参考例で得られたエシェリヒア・
コリＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９(ＩＦＯ１５５７
０, ＦＥＲＭＢＰ−４９２７)、エシェリヒア・コリ
ＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９(ＩＦＯ１５７７１，ＦＥ
ＲＭＢＰ−４９２８)などが挙げられる。上記のエシ
ェリヒア・コリＩＦＯ１４４１０およびエシェリヒ
ア・コリＩＦＯ１２７１３は、リスト・オブ・カル
チャーズ(List of Cultures)第９版、１９９２年(ＩＦ
Ｏ発行)にそれぞれ収載されている公知株であり、財団
法人発酵研究所から入手することができる。

【０００８】バチルス属に属する微生物としては、例え
ばバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に属
する微生物などが挙げられ、より具体的にはバチルス・
スフェリカスＩＦＯ３５２５およびその由来株バチル
ス・スフェリカスＮＺ−８８０２(特開平４−１１８９
４号)など挙げられる。上記のバチルス・スフェリカス
ＩＦＯ３５２５は、リスト・オブ・カルチャーズ(Lis
t of Cultures)第９版、１９９２年(ＩＦＯ発行)に収載
されている公知株であり、財団法人発酵研究所から入手
できる。セラチア属に属する微生物としては、例えばセ
ラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)に属す
る微生物などが挙げられ、具体例としてはセラチア・マ
ルセッセンスＳn ４１およびその由来株セラチア・マル
セッセンスＴＡ５０２４(特開平２−２７９８０号)、セ
ラチア・マルセッセンスＳＢ４１１およびその由来株セ
ラチア・マルセッセンスＥＴ２、セラチア・マルセッセ
ンスＥＴＡ２３(特開平５−１９９８６７号)などが挙げ
られる。上記した微生物は、そのまま用いてもよいが、
さらにこれらの変異株を用いてもよい。これらの微生物
の中で、ビオチンオペロンの一部ないし全部を含むプラ
スミドを保持しないものは、必要に応じ、後工程で、ビ
オチンオペロンの一部ないし全部を含むプラスミドを導
入すればよい。

【０００９】スレオニンアナログ耐性株を得る方法とし
ては、自体公知の方法、例えばＮ−メチル−Ｎ'−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(Ｎ−methyl−Ｎ'−nitro
−Ｎ−nitrosoguanidine, 以下、ＮＴＧと略すこともあ
る)などの薬剤で処理する方法、紫外線で照射する方法
などが挙げられる。次に変異処理した菌体の懸濁液を適
当な濃度、例えば親株が生育できない濃度のスレオニン
アナログを含む培地(例、寒天平板培地)にまき、生育す
るコロニーを分離することにより容易にスレオニンアナ
ログ耐性株を得ることができる。上記の方法で得られた
スレオニンアナログ耐性株を培養し、培養上清中のビオ
チンを定量することによりビオチンの蓄積量が向上した
菌を選ぶことができる。ビオチンオペロンの一部ないし
全部を含むプラスミドを導入する方法としては、自体公
知の方法に従って行えばよい。まず、ビオチンオペロン
の一部ないし全部を含むプラスミドを構築する方法とし
ては自体公知の方法、例えば、制限酵素によるＤＮＡの
切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの結合などを行
い、目的とするプラスミドを構築する方法[モレキュラ
ー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル・コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecul
ar Clonig, A Laboratory Manual, ColdSpring Habor L
aboratory)１９８２]等が挙げられる。上記のプラスミ
ドを用いて宿主細菌を形質転換する方法としては、自体
公知の方法、例えばエシェリヒア属に属する細菌を宿主
とする場合は、上記のモレキュラー・クローニング，ア
・ラボラトリー・マニュアル・コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(Molecular Cloning A Laborat
ory Manual, Cold Spring Habor Laboratory), １９８
２に記載されている方法等が挙げられる。上記の方法で
スレオニンアナログ耐性微生物が得られるが、これらの
微生物はそのまま用いても良いが、さらに変異処理した
り、プラスミドを改良したものを用いても良い。

【００１０】上記の方法により得られた本発明の微生物
を培地で培養し、ビオチンを培地に生成させる。本発明
の培養に用いられる培地は、用いられる微生物が利用し
得る栄養源を含むものなら、液状でも固状でもよいが、
大量に処理するとこには液体培地を用いるのがより適当
である。培地には同化し得る炭素源、消化し得る窒素
源、無機物質、微量栄養素等が適宜配合される。炭素源
としては、例えばブドウ糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デ
キストリン、澱粉、マンニトール、ソルビトール、グリ
セロール、油脂類(例、大豆油、オリーブ油、ヌカ油、
ごま油、ラード油、チキン油など)、各種脂肪酸(例、ラ
ウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、オレイン酸など)等が用いられる。窒素源として
は、例えば肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、
脱脂大豆粉、コーンスチープリカー、ペプトン、綿実
粉、癈糖蜜、尿素、チオ尿素、アンモニア、アンモニウ
ム塩類(例、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど)等が用いられ
る。さらにナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバル
ト、ニッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸などの塩
類、酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適宜用い
られる。さらに、アミノ酸(例、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸、アラニン、リジン、バリン、メチオニン、プ
ロリン等)、ペプチド(例、ジペプチド、トリペプチド
等)、ビタミン類(例、Ｂ₁、Ｂ₂、ニコチン酸、Ｂ₁₂、Ｃ
等)、核酸類(例、プリン、ピリミジンおよびその誘導
体)等を用いてもよい。培地のpＨを調節する目的で無機
または有機の酸、アルカリ類等を加えてもよく、あるい
は消泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量が使用され
る。培地のpＨは約４〜１０が好ましく、特にpＨ約６〜
９が好ましい。

【００１１】培養の手段としては静置培養、振とう培
養、通気撹拌培養のいずれでもよい。大量の培養の際は
通気撹拌培養が好ましい。培養の温度は１５〜４２℃、
好ましくは３０〜３７℃である。培養時間は培養条件に
よって適宜選択されるが１〜１０日、好ましくは２〜４
日である。培養方法としては自体公知の方法、例えばバ
ッチ培養、フィード培養などが挙げられる。得られた培
養液を遠心分離し、その上清に蓄積されたビオチンを定
量する。ビオチンの定量方法としては、自体公知の方法
に従えばよく、例えば、ラクトバチルス・プランタルム
(Lactobacillus plantarum)を定量菌とするバイオアッ
セイ法(「ザ・ビタミンズ」(The Vitamins), 第７巻、３
０３頁(１９６７)、「ビタミン学、実験法[ＩＩ]」４７５
頁、日本ビタミン学会編(１９８５年)等)等が挙げられ
る。上記の方法で微生物を培養し、培養物中にビオチン
を生成蓄積させ、次のこの培養物からビオチンを採取す
る。生成したビオチンは主として培養濾液中に存在する
ので、培養液を自体公知の方法(例、濾過、遠心分離等)
により濾液と菌体を分離し、得られた濾液からビオチン
を分離、精製するのが有利である。また、培養液から直
接に精製してもよい。上記の分離、精製する方法として
は、例えば、適当な溶媒に対する溶解性および溶解度の
差、溶液からの析出法および析出速度の差、種々の吸収
親和力の差、イオン交換体によるイオン交換クロマトグ
ラフィーあるいは減圧濃縮、凍結乾燥、結晶化、再結
晶、乾燥などの手段が単独あるいは任意の順序に組み合
わせて、または反復して利用される。本発明で得られる
ビオチンは、医薬品や化粧品の原料、飼料添加物等とし
て使用しうる。

【００１２】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
さらに具体的に説明する。培地中の％はＷ／Ｖ％を示
す。下記参考例で得られたエシェリヒア・コリ(Escheri
chia coli)ＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９およびエシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)ＡＮＡ９１／pＸＢＲＰ
３１９は、１９９４年１２月２日より各々受託番号ＩＦ
Ｏ１５７７０およびＩＦＯ１５７７１として財団法
人発酵研究所(ＩＦＯ)に寄託され、また１９９４年１２
月１２日よりブタペスト条約下受託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−４９２７およびＦＥＲＭＢＰ−４９２８として通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ
寄託されている。また、下記実施例で得られたエシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)ＨＮＶ１４８／pＸＢＲ
Ｐ３１９およびエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
ＨＢ／pＡＴ７１は、１９９５年１０月３０日より、そ
れぞれ受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５６６７およびＦＥ
ＲＭＢＰ−５６６８として通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。

【００１３】参考例１ (１)エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３／pＸＢＡ３
１２(ＦＥＲＭＢＰ−２１１７)(特表平２−５０２０
６５号)から単離したプラスミドpＸＢＡ３１２(図２参
照)を制限酵素ＥcoＲＩで切断した後、ＰstＩで部分分
解し、アガロースゲル電気泳動、電気溶出法により完全
長のビオチンオペロンを含むＥcoＲＩ−ＰstＩ断片(６.
０Ｋbp)を単離した。得られたpＸＢＡ３１２のＥcoＲＩ
−ＰstＩ断片とプラスミドpＢＲ３２２のＥcoＲＩ−Ｐs
tＩ断片(３.６Ｋbp)とを連結してプラスミドpＸＢＡ３
１９を得た。プラスミドpＭＷ１１９(ニッポンジーン、
日本)を制限酵素ＡatＩＩとＡvaＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動と電気溶出法により、ＡatＩＩ−ＡvaＩ
断片(０.４Ｋbp)を得、次いでブランティングキット(宝
酒造、日本)を用いて、ＡatＩＩ−ＡvaＩ断片の両端を
平滑化した。得られたＡatＩＩ−ＡvaＩ断片をpＸＢＲ
３１９のＳmaＩ部位に連結することによりプラスミドp
ＸＢＲＰ３１９を得た。 (２)エシェリヒア・コリＩＦＯ１４４１０[(財)発
酵研究所より入手]をＮＴＧで変異処理して得られた優
良株に上記(１)で得られたプラスミドpＸＢＲＰ３１９
を導入し、さらにＮＴＧで変異処理したのち各種の薬剤
耐性株を分離した。この中からビオチン蓄積量が多い菌
株を選び、エシェリヒア・コリＭＭ４４／pＸＢＲＰ３
１９(ＦＥＲＭＢＰ−４７２４)を得た。 (３)上記(２)で得られたエシェリヒア・コリＭＭ４４／
pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２xＹＴ培地(酵母エキス１
０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g
／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し
た。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２xＹＴ培地に
移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液
を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン
酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２
回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを
含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。
遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄し
たのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、１
mg／ml β−クロロ−Ｄ−アラニン、４μg／mlチアミン
塩酸塩および２０μg／mlカザミノ酸を含むＭ９最少培
地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置することによ
ってβ−クロロ−Ｄ−アラニン耐性株のコロニーが出現
し、このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＢＤ１０
／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭＢＰ−４７２５)を得
た。 (４)上記(３)で得られたエシェリヒア・コリＢＤ１０
／pＸＢＲＰ３１９(ＦＥＲＭＢＰ−４７２５)をＮＴ
Ｇで変異処理したのち各種の薬剤耐性株を分離した。こ
の中からビオチン蓄積量が多い菌株を選び、エシェリヒ
ア・コリＭＳ１０／pＸＢＲＰ３１９を得た。 (５)上記(４)で得られたエシェリヒア・コリＭＳ１０／
pＸＢＲＰ３１９を２０mlの２xＹＴ培地(酵母エキス１
０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g
／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し
た。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２xＹＴ培地に
移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液
を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイン
酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で２
回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧを
含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理した。
遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗浄し
たのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液を、３
０μg／ml ６−アミノニコチンアミド、４μg／mlチア
ミン塩酸塩および２０μg／mlカザミノ酸を含むＭ９最
少培地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置すること
によって６−アミノニコチンアミド耐性株のコロニーが
出現した。このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＡ
ＮＡ９１／pＸＢＲＰ３１９と命名した。

【００１４】参考例２参考例１で得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／p
ＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１
％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％およびＭgＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ０.０１％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを
含む２００ml容ひだ付フラスコで３７℃で１６時間振と
う培養した。得られた培養液の０.６mlをグルコース５
％、コーンスティープリカー５％、硫安０.２％、ＤＬ
−アラニン０.３％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄
０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０１％、ＦeＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ０.００１％、ＭnＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ０.０
０１％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる種培
地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコに
移し、３７℃で３０時間振とう(２２０回転／分)培養し
た。培養後の培養液を遠心分離し、培養上清中のビオチ
ンを定量したところ、１６０mg／mlのビオチンが蓄積し
ていることがわかった。

【００１５】実施例１参考例１で得られたエシェリヒア・コリＡＮＡ９１／p
ＸＢＲＰ３１９を２０mlの２×ＹＴ培地(酵母エキス１
０g／Ｌ、ペプトン１６g／Ｌおよび塩化ナトリウム５g
／Ｌ含有)に接種し、３７℃で１６時間振とう培養し
た。得られた培養液の０.２mlを２０mlの２×ＹＴ培地
に移し、３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養
液を遠心分離し、集められた菌体をＴＭ緩衝液(マレイ
ン酸５.０８g／Ｌ、トリス６.０５g／Ｌ、pＨ６.０)で
２回洗浄した。この洗浄菌体を２００μg／mlのＮＴＧ
を含むＴＭ緩衝液に懸濁し、３７℃で２５分間処理し
た。遠心分離して処理菌体を集め、ＴＭ緩衝液で２回洗
浄したのち、同じ緩衝液に懸濁した。得られた懸濁液
を、２g／Ｌのβ−ヒドロキシノルバリンを含むＭ９最
少培地の寒天平板にまき、３７℃で５日間放置すること
によってβ−ヒドロキシノルバリン耐性株のコロニーが
出現した。このうち１株を選び、エシェリヒア・コリＨ
ＮＶ１４８／pＸＢＲＰ３１９（ＦＥＲＭＢＰ−５６
６７、ＩＦＯ１５８９４）と命名した。

【００１６】実施例２実施例１で得られたエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／
pＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１
％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％およびＭgＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ０.０１％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを
含む２００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２２０回転／
分で１６時間振とう(２２０回転／分)培養した。得られ
た培養液の０.６mlをグルコース５％、コーンスティー
プリカー５％、炭酸カルシウム２％、硫安０.２％、Ｄ
Ｌ−アラニン０.３％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ
₄０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０１％、ＦeＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ０.００３％、ＭnＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ０.０
０３％およびチアミン塩酸塩０.００２％からなる主培
地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひだ付フラスコに
移し、３７℃で３０時間振とう(２２０回転／分)培養し
た。培養後、培養液を遠心分離し、得られた培養上清中
のビオチン蓄積量をラクトバチルス・プランタルムＩＦ
Ｏ３０７０を定量菌としてバイオアッセイ法により定
量したところ、１７５mg／Ｌであった。親株を同条件下
で培養したところ、１６０mg／Ｌに過ぎなかった。

【００１７】実施例３実施例１で得られたエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／
pＸＢＲＰ３１９をグルコース２％、炭酸カルシウム１
％、コーンスティープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ０.０１％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０５％、チア
ミン塩酸塩０.００２％およびテトラサイクリン塩酸塩
０.００１２％からなる種培地(pＨ７.１)１２５mlを含
む５００ml容ひだ付フラスコで３７℃、２１０回転／分
で１６時間振とう培養した。得られた培養液全量をグル
コース３％、コーンスティープリカー６％、硫安０.２
％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、ＭgＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０２％、ＤＬ−アラニン０.３％、Ｍ
nＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ０.００３％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ０.００３％、Ｆe₂(ＳＯ₄)₃・nＨ₂Ｏ０.０２％、
チアミン塩酸塩０.００２％、２５％アンモニア水１.６
ml／Ｌおよびアクトコール(武田薬品工業（株）製、消
泡剤)０.０２％からなる主培地(pＨ７.１)２.５Ｌに移
し、５Ｌ容ジャーファーメンタ中で３７℃、通気量２.
５Ｌ／分で培養した。撹拌数は菌体量に比例して、５５
０回転から８５０回転まで上昇していき、また、グルコ
ース濃度は０.１から０.５％の範囲になるように６６.
７％グルコース水溶液を連続添加した。培養中はpＨが
６.５から７.０の範囲になるように２５％アンモニア水
で制御し、また、泡がたたないように適宜アクトコール
を添加した。このようにして、７２時間培養した結果、
ビオチン７１０mg／Ｌを含む培養液が得られた。

【００１８】実施例４ (１)プラスミドpＡＭＰ７２(特開平５−２１９９５６)
を制限酵素ＮcoＩとＥcoＴ２２Ｉで完全分解し、ビオチ
ンオペロンのプロモータを含む１kb断片をアガロースゲ
ル電気泳動で分離、回収した。その一方でpＸＢＲＰ３
１９を同様にＮcoＩとＥcoＴ２２Ｉで完全消化し、約１
０kbの断片を回収し、先の１kb断片と連結することによ
りプラスミドpＸＢＲＰ７１を作製した。 (２)(１)で作製したプラスミドpＸＢＲＰ７１を制限酵
素ＥcoＲＩとＳalＩで完全消化し、アガロースゲル電気
泳動後、ビオチンオペロンを含む７kb断片を得た。その
一方で、プラスミドpＢＲ３２２(宝酒造(株)製)を制限
酵素ＡvaＩで完全に分解した後、エタノール沈澱し、ブ
ランティングキット(宝酒造(株)製)で平滑化した。熱失
活後、制限酵素ＥcoＲＩで完全消化し、アガロースゲル
電気泳動で分離し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む
１．４kb断片を得た。また、プラスミドpＳＴＶ２８(宝
酒造(株)製)を制限酵素ＸmnＩとＳalＩで完全消化し、
複製開始点を含む１．１kb断片を得た。以上で得られた
３断片を連結し、プラスミドpＡＴ７１を作製した。 (３)実施例１で得たエシェリヒア・コリＨＮＶ１４８／
pＸＢＲＰ３１９から継代培養でプラスミドpＸＢＲＰ３
１９が脱落した株、ＨＮＶ１４８を得た。得られたＨＮ
Ｖ１４８をチアミンを含まないＭ９最少寒天平板培地に
まき、３７℃で４日間放置することによって、チアミン
非要求性株を得た。このうちの１株を選び、エシェリヒ
ア・コリＨＢと命名した。 (４)(３)で得られたエシェリヒア・コリＨＢ株に(２)で
作製したプラスミドpＡＴ７１を導入し、エシェリヒア
・コリＨＢ／pＡＴ７１（ＩＦＯ１５８９５）を得た。

【００１９】実施例５実施例４で得られたエシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７
１をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンステ
ィープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ₂ＰＯ₄０.１％、
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％およびＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０１
％からなる種培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００ml容ひ
だ付フラスコで３７℃、２２０回転／分で１６時間振と
う培養した。得られた培養液の０.６mlをグルコース５
％、コーンスティープリカー５％、炭酸カルシウム２
％、硫安０.２％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.０１％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.００３％、ＭnＳＯ
₄・４〜６Ｈ₂Ｏ０.００３％およびチアミン塩酸塩０.
００２％からなる主培地(pＨ７.１)３０mlを含む２００
ml容ひだ付フラスコに移し、３７℃、２２０回転／分で
３０時間振とう培養した。培養後、培養液を遠心分離
し、得られた培養上清中のビオチン蓄積量を定量したと
ころ、２００mg／Ｌであった。

【００２０】実施例６実施例４で得られたエシェリヒア・コリＨＢ／pＡＴ７
１をグルコース２％、炭酸カルシウム１％、コーンステ
ィープリカー４％、硫安０.４％、ＫＨ₂ＰＯ₄０.１％、
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０１％、
ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０５％、チアミン塩酸塩０.０
０２％およびテトラサイクリン塩酸塩０.００１２％か
らなる種培地(pＨ７.１)１２５mlを含む５００ml容ひだ
付フラスコで３７℃、２１０回転／分で１６時間振とう
培養した。得られた培養液全量をグルコース３％、コー
ンスティープリカー６％、硫安０.２％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０.１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.２％、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.０５％、ＤＬ−アラニン０.３％、ＭnＳＯ₄・４〜６
Ｈ₂Ｏ０.００３％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.００３
％、Ｆe₂(ＳＯ₄)₃・nＨ₂Ｏ０.１％、クエン酸カルシ
ウム１％、チアミン塩酸塩０.００２％、２５％アンモ
ニア水１.６ml／Ｌおよびアクトコール(武田薬品工業
(株)製、消泡剤)０.０２％からなる主培地(pＨ７.１)
２.５Ｌに移し、５Ｌ容ジャーファーメンタ中で３７
℃、通気量２.５Ｌ／分で培養した。撹拌数は菌体量に
比例して、５５０回転から９５０回転まで上昇してい
き、また、グルコース濃度は０.１から０.５％の範囲に
なるように６６.７％グルコース水溶液を連続添加し
た。培養中はpＨが６.５から７.０の範囲になるように
２５％アンモニア水と３０％水酸化カリウム水溶液で制
御し、また、泡がたたないようにアクトコールを適宜添
加した。また、培養２４時間目から７２時間目にかけ
て、１.２５％のクエン酸第２鉄３００mlをフィードし
た。このようにして、８２時間培養した結果、９７０mg
／Ｌのビオチンが蓄積した。

【００２１】

【発明の効果】本発明の微生物は優れたビオチン生産能
を有しており、この微生物を培養することにより、ビオ
チンを大量に生産することができる。

【００２２】

【配列表】

配列番号:１配列の長さ:１１４配列の型:核酸鎖の数:二本鎖トポロジー:直鎖配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ起源生物名:エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 配列 CGTCCGTTGT CATAATCGAC TTGTAAACCA AATTGAAAAG ATTTAGGTTT ACAAGTCTAC 60 ACCGAATTAA CAACAAAAAA CACGTTTTGG AGAAGCCCCA TGGCTCACCG CCCA 114

【図面の簡単な説明】

【図１】ビオチンオペロンの制御領域およびbioＢ開
始コドン近傍の塩基配列を示す。

【図２】プラスミドpＸＢＡ３１２のＤＮＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者松井純二大阪府吹田市江坂町２丁目１−11−1109 (72)発明者中濱一雄京都府長岡京市梅が丘１丁目16番地の２ (72)発明者伊福欧二神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１株式会社資生堂内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビオチンオペロンの一部ないし全部を含
むプラスミドを有し、スレオニンアナログ耐性を示す微
生物。
【請求項２】微生物が、エシェリヒア(Escherichia)
属、バチルス(Bacillus)属またはセラチア(Serratia)属
に属する微生物である請求項１記載の微生物。
【請求項３】スレオニンアナログが、β−ヒドロキシ
ノルバリンである請求項１記載の微生物。
【請求項４】請求項１記載の微生物を培地で培養し、
培養物中にビオチンを生成蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とするビオチンの製造法。