JPH09184840A - イムノクロマト法用試験用具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来のイムノクロマト法用試験用具に於ける問
題点、即ち測定のためのサンドイッチ型免疫複合体形成
反応を固相上で行わせるために短時間で測定を完了させ
ることができず測定精度の低下や検出感度の低下を招
く、という問題を解決した、液体試料中の測定対象物質
を高感度に精度良く測定し得るイムノクロマト法用試験
用具及びこれを用いた測定方法の提供。 【解決手段】(a)毛管現象により移動可能なように保持
された、1)視覚的に検知し得るシグナルが得られるマー
カーで標識された、測定対象物質に特異的な第１抗体、
及び2)測定対象物質に特異的で、第１抗体と認識部位が
異なり且つビオチンが結合した第２抗体を含む第１部分
と、(b)アビジンが固定化されている部位を有する第２
部分とを具備し、(c)当該第１部分と第２部分とが、相
互間に毛管現象が生じるように連結された、イムノクロ
マト法用試験用具、及びこれを用いた測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体試料中の測定対象
物質量を測定するためのイムノクロマト法用試験用具及
びそれに用いた測定方法に関する。

【０００２】

【従来技術及びその問題点】毛管現象を利用するクロマ
トグラフィーの手法と免疫学的手法とを組み合わせた測
定方法、所謂イムノクロマト法（イムノフロー法）は、
簡便で、特別な装置を用いることなく判定を容易に且つ
短時間で測定できる方法として、殊に優れた半定量分析
法として広く利用されている測定方法である。

【０００３】イムノクロマト法の基本原理は、測定対象
物質を含有する液体試料を、マーカーにより標識された
抗体を含有させた部位に供して反応させ、生じた測定対
象物質とマーカー標識抗体との複合物を毛管現象によ
り、測定対象物質に特異的に結合する抗体が固定化され
ている第２部分に移動させて、当該第２部分に固定化抗
体−測定対象物質−マーカー標識抗体の所謂サンドイッ
チ型免疫複合体を形成させ、固定化されたマーカーに由
来する発色に基づいて測定対象物質量を測定するという
ものである。

【０００４】例えば特公平7ー13640号公報には、同一平
面上に存在し互いに毛管現象が生じるように連結され
た、a)その中に移動可能なように保持された小胞マーカ
ーにより標識された測定対象物質に特異的な抗体（トレ
ーサー）を含み且つ試料添加部位である第１部分及び、
b)その中に測定対象物質に特異的に結合する抗体が固定
化されている第２部分を有するイムノクロマト法用試験
用具、及びこれを用いた測定対象物質の測定方法が開示
されている。

【０００５】また、国際公開第WO84/04171号公報には、
イムノクロマト法用試験用具の一部分に測定対象物質に
対する抗体を固定化させるために、アビジン−ビオチン
反応を利用した方法が開示されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法においては、測定対象物質を検出するための、所
謂抗原抗体反応に関与する抗体の１つが固相上に固定化
されているため、固定化抗体−測定対象物質−マーカー
標識抗体からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応の
反応速度は、このような複合体の形成を液相中で行わせ
る場合より当然に遅くなる。即ち、従来のイムノクロマ
ト法用試験用具のように固相上にサンドイッチ型免疫複
合体を形成させる反応では反応が完了するのに時間がか
かるため、短時間に測定を行おうとすれば、サンドイッ
チ型免疫複合体形成反応が充分に完了していない状態で
測定を行わざるを得ない場合があった。尚、固相上での
サンドイッチ型免疫複合体形成反応の反応速度が遅いこ
とは、例えば酵素免疫吸着測定法（ELISA）等の固相上
でのサンドイッチ型免疫複合体形成反応を利用する免疫
学的測定法に於ける反応タイムコースが、数時間ではプ
ラトーに達していないことからも予想できる。

【０００７】従って、イムノクロマト法のような短時間
（多くの場合10分以内）で測定を完了させる必要のある
測定方法においては、サンドイッチ型免疫複合体形成反
応が充分に完了していない状態で測定を行うことは、測
定精度の低下や検出感度の低下を招く、という問題点を
有していた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記した如き
状況に鑑み成されたもので、(a)毛管現象により移動可
能なように保持された、1)視覚的に検知し得るシグナル
が得られるマーカーで標識された、測定対象物質に特異
的な第１抗体、及び2)測定対象物質に特異的で、第１抗
体と認識部位が異なり且つビオチンが結合した第２抗体
を含む第１部分と、(b)アビジンが固定化されている部
位を有する第２部分とを具備し、(c)当該第１部分と第
２部分とが、相互間に毛管現象が生じるように連結され
た、イムノクロマト法用試験用具、の発明である。

【０００９】また、本発明は、1)視覚的に検知し得るシ
グナルが得られるマーカーで標識された、測定対象物質
に特異的な第１抗体及び2)測定対象物質に特異的で、第
１抗体と認識部位が異なり且つビオチンが結合した第２
抗体とを毛管現象により移動可能なように保持した第１
部分に液体試料を供して液相中で反応を開始させ、反応
生成物を毛管現象により、アビジンが固定化されている
部位を有する第２部分に運ばせ、該第２部分のアビジン
固定化部位に捕捉された反応生成物中のマーカーに由来
する発色の程度に基づいて、該液体試料中の測定対象物
質量を測定する方法、の発明である。

【００１０】即ち、本発明者は、従来のイムノクロマト
法用試験用具に於ける問題点、即ち測定のためのサンド
イッチ型免疫複合体形成反応を固相上で行わせるために
短時間（例えば10分以内）で測定を完了させることがで
きず測定精度の低下や検出感度の低下を招く、という問
題を解決したイムノクロマト法用試験用具を開発すべく
鋭意研究を重ねた結果、測定対象物質、1)視覚的に検知
し得るシグナルが得られるマーカーで標識された、測定
対象物質に特異的な第１抗体（以下、マーカー標識第１
抗体と略記する。）、及び2)測定対象物質に特異的で、
第１抗体と認識部位が異なり且つビオチンが結合した第
２抗体（以下、ビオチン結合第２抗体と略記する。）と
を第１部分の液相中で反応させて、先ずマーカー標識第
１抗体−測定対象物質−ビオチン結合第２抗体のサンド
イッチ型免疫複合体（即ち、反応生成物）を液相中で形
成させ、次いでこれをアビジン固定化部（判定部）を有
する展開膜（第２部分）に毛管現象により運ばせ、アビ
ジン−ビオチン反応を利用して当該サンドイッチ型免疫
複合体を判定部に捕捉させ、結果的に判定部に捕捉され
た当該サンドイッチ型免疫複合体（反応生成物）中の第
１抗体に標識されたマーカーに由来する発色の程度に基
づいて測定対象物質量を測定するように構成したイムノ
クロマト法用試験用具を用いれば、従来のイムノクロマ
ト法用試験用具に於ける上記した如き問題を解決して、
測定対象物質を高感度に精度良く測定し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１１】本発明の、相互に毛管現象により連結可能
な第１部分及び第２部分は、通常毛管現象を生じさせる
ことのできる吸水性の膜状物或いはシート状物を使用し
て形成されるが、このような膜状物或いはシート状物と
しては、吸水性を有する膜状物或いはシート状物として
通常この分野で用いられるものであれば特に限定される
ことなく挙げられるが、例えばニトロセルロース膜、セ
ルロースナイトレート膜、グラスフィルター膜、ナイロ
ン膜、修飾ナイロン膜、ポリビニリデンジフルオロライ
ド（ＰＶＤＦ）膜等の膜状物、例えば濾紙、不織布（例
えばレーヨン，綿糸等のセルロース系繊維、ガラス繊
維、例えばナイロン，ポリエステル，ポリプロピレン，
ポリウレタン等から調製された化学繊維等から調製され
たもの）等のシート状物等が好ましく挙げられる。

【００１２】本発明の第１部分に保持させるマーカー標
識第１抗体やビオチン結合第２抗体を調製するために使
用される抗体としては、測定対象物質に対する抗体であ
れば何れにてもよく特に限定されない。即ち、常法、例
えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会
出版センター(1981)」等に記載の方法に準じて、馬、
牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象
を免疫して作製されるポリクローナル抗体でも、或はま
た常法、即ちケラーとミルスタイン［Nature,vol.256,4
95(1975)］により確立された細胞融合法に従い、マウス
の腫瘍ラインからの細胞と測定対象物で予め免疫された
マウスの脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマ
等が産生するモノクローナル抗体でも何れにてもよく、
これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等
は任意である。尚、均一の性質を有する抗体の得易さを
考慮すると、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル
抗体の方が好ましい。また、これら抗体は、要すればペ
プシン，パパイン等の酵素を用いて消化してＦ(ab')₂、
Ｆab'、或は Ｆabとして使用してもよいことは言うまで
もない。

【００１３】本発明に係るマーカー標識第１抗体に於け
るマーカーとしては、視覚的に検知し得るシグナルが得
られるものであって、これを第１抗体に標識したものが
毛管現象により移動可能なものであれば良く特に限定さ
れないが、具体的には例えば金コロイド、鉄コロイド、
銀コロイド等の金属コロイド、例えばセレニウムコロイ
ド等の非金属コロイド、例えばポリスチレン，ポリアク
リルアミド等の高分子ポリマーを原料として調製された
着色ラテックス、例えばローダミンＢ，カルボキシルフ
ルオレッセン等の蛍光色素や例えばメチルオレンジ，ク
ーマシーブリリアントブルーR250等の色素等を内包する
着色リポソーム、例えばローダミンイソチオシアネー
ト、フルオレッセンイソチオシアネート（FITC）等の蛍
光色素、例えばクーマシーブリリアントブルーR250等の
色素等が挙げられるが、取扱易さや感度等の点を考慮す
ると中でも金コロイドが好ましい。

【００１４】本発明に用いられる金コロイドとしては、
通常市販のものを用いればよいが、常法、例えば塩化金
酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法［Nature Phys.
Sci.,vol.241,20(1973)等］により調製したものを用い
てもよい。また、金コロイドの粒径は特に限定されない
が、通常５nm〜90nm、好ましくは10nm〜70nmの範囲のも
のが挙げられる。

【００１５】抗体にこれらのマーカーを標識して本発明
に係るマーカー標識第１抗体を調製する方法としては、
この分野で用いられる例えば物理的吸着法［例えばTech
niques in Immunocytochemistry, volume 1, p108-133,
Acadenic Press 社やJ.Histochem.Cytochem.,vol.25,
1187〜1200(1977)、Experientia,vol.31,1147(1975)等
に記載の方法］、化学的結合法［例えば特公平7-107535
号公報、J.Immunol.Methods,vol.75,351(1984)、B.B.
A.,vol.640,66(1981)、B.B.R.C.,VOL.89,1114(1979)、
J.Immunol.Methods,vol.22,165(1984)等に記載の方法］
等は全て挙げられ、マーカーの種類に応じて適宜選択し
て目的のマーカー標識第１抗体を調製すればよい。

【００１６】尚、マーカーとして金コロイドを用いたマ
ーカー標識第１抗体の調製は、自体公知の方法［例えば
Techniques in Immunocytochemistry, volume 1, p108-
133,Acadenic Press 社、J.Histochem.Cytochem.,vol.2
5,1187〜1200(1977)、Experientia,vol.31,1147(1975)
等に記載の方法］により容易に行うことができる。

【００１７】具体的には、例えば以下の如くして容易に
得ることができる。即ち、市販の金コロイド、或は常
法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方
法［Nature Phys.Sci.,vol.241,20(1973)等］により調
製された金コロイドと、目的の第１抗体とを、常法［J.
Histochem.Cytochem.,vol.25,1187〜1200(1977)、Exper
ientia,vol.31,1147(1975)等］により処理することによ
り容易に調製することができる。より具体的には、金コ
ロイドと、金コロイド１mgに対して通常0.5〜100μg、
好ましくは１〜50μgの測定対象物質に対する第１抗体
とを、適当な緩衝液中で５〜30分間室温下に反応させた
後、例えばポリエチレングリコール等の分散剤を添加し
て遠心分離等により目的の金コロイド標識第１抗体を分
取することにより容易に得られる。尚、得られた金コロ
イド標識第１抗体は、例えばポリエチレングリコール等
の分散剤を含む溶液中に均一に分散させて保存すればよ
い。

【００１８】尚、上記反応に於いて用いられる緩衝液
は、金コロイドと測定対象物質に対する第１抗体との結
合反応を阻害しないものであればその種類、濃度、pＨ
等は特に限定されない。

【００１９】また、本発明に用いられるビオチン結合第
２抗体の調製方法としては、例えば市販のビオチン化試
薬、より具体的には例えばスクシンイミド基が導入され
たビオチン（例えば、ＮＨＳ-ビオチン）やN-ヒドロキ
シコハク酸イミド（ＮＨＳ）とビオチンをスペーサーを
介して結合したもの等を、抗体のアミノ基に反応させる
方法［例えばJ.Biol.Chem.,vol.264, 272-279(1989)、
新生化学実験講座12，分子免疫学III，p103ー104，東京
化学同人社等］、例えば市販の N-[6-(Biotinamide)hex
yl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamide（ビオチンーＨ
ＰＤＰ） や N-Iodoacetyl-N-biotinylhexylenediamine
を、抗体のチオール基に反応させる方法［例えばAnnals
of the New York Academy of Science,vol.254, 203(1
975)等］、ヒドラジノ基が導入されたビオチンを、アル
デヒド化された抗体のアルデヒド基に反応させる方法
［例えばJ.Biol.Chem.,vol.172, 71(1948);Biotech.App
l.Biochem.,vol.9, 488-496(1987)等］、ビオチンにマ
レイミド基を導入した誘導体を用いて抗体より調製した
Fab'のSH基と結合させる方法、ヒドラジノ基が導入され
たビオチンを抗体の糖鎖と結合させる方法、ヒドラジノ
基が導入されたビオチンを水溶性カルボジイミド存在下
で抗体のカルボキシル基と結合させる方法等、通常この
分野で使用される抗体の活性を失わせない方法であれば
何れの方法を利用しても良い。

【００２０】このように調製されたマーカー標識第１抗
体とビオチン結合第２抗体を本発明の第１部分に毛管現
象により移動可能なように保持させる方法としては、通
常この分野で用いられる方法であれば特に限定されない
が、具体的には例えば上記した如き膜状物又はシート状
物を、マーカー標識第１抗体とビオチン結合第２抗体と
を含有する溶液中に浸漬後、送風乾燥或いは凍結乾燥す
る方法、上記した如き膜状物又はシート状物に、マーカ
ー標識第１抗体とビオチン結合第２抗体とを含有する溶
液を塗布、噴霧或いは滴下した後、送風乾燥或いは凍結
乾燥する方法等が挙げられる。尚、マーカー標識第１抗
体とビオチン結合第２抗体とを含有させる溶液として
は、通常この分野で用いられている、例えばトリス緩衝
液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、
グッド緩衝液等、通常抗原抗体反応を利用した測定法に
用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpＨとして
は抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定はさ
れないが、通常５〜９の範囲から好ましく選択される。
また、このような溶液中には、目的の抗原抗体反応を阻
害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリ
ン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定
化剤、界面活性剤、糖類等を適宜含有させて於いても良
い。尚、マーカー標識第１抗体とビオチン結合第２抗体
を保持させるために用いられる膜状物やシート状物は、
これら抗体が非特異的に吸着されて測定への影響が生じ
るのを防止するために、予め所謂ブロッキング処理を施
しておくことが望ましい。このようなブロッキング処理
は、通常この分野で行われる方法、例えばこれら膜状物
やシート状物を例えばアルブミン、グロブリン、カゼイ
ン、ポリビニルアルコール、界面活性剤等のブロッキン
グ剤（但し、測定への影響のないものを選択して使用す
る。）を含有する適当な緩衝液（例えばpＨが５〜９程
度の例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩
衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）中に適当な時間
浸漬した後に乾燥する方法等により行えばよい。

【００２１】本発明の第１部分に保持させるマーカー標
識第１抗体及びビオチン結合第２抗体の量としては、測
定対象物質の種類や、検出限界や検量限界をどの程度に
設定するかによって変動し、特に限定されないが、例え
ば本発明の第１部分の単位面積（cm²）当たりの保持量
（免疫グロブリン量として）として通常0.01μg〜10m
g、好ましくは0.05μg〜１mg、より好ましくは0.1〜100
μgの範囲から適宜選択される。

【００２２】本発明の第２部分、所謂展開膜に固定化さ
れるアビジンとしては、ビオチンとの結合能力を持った
ものであれば特に限定されないが、具体的には例えば卵
白由来のアビジン、微生物由来のストレプトアビジン、
これらの誘導体［例えば、アビジンの糖鎖を切断して得
られるニュートロアビジン（NeutrAvidin。ピアース社
製）等］等が挙げられる。また、本発明に用いられるア
ビジンは市販されているものをそのまま用いることが可
能であり、目的の測定を阻害する成分が含まれていなけ
ればその品質、精製度等は特に限定されない。

【００２３】本発明の第２部分（展開膜）へのアビジン
の固定化方法としては、通常この分野で用いられる方法
であれば特に限定されないが、具体的には例えば当該第
２部分として使用する上記した如き材質からなる膜状物
やシート状物の一部にアビジン溶液を塗布、滴下或いは
噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法、膜状
物やシート状物中の例えばアミノ基、カルボキシル基等
の官能基を利用して化学的にアビジンを結合させる方法
等が挙げられる。尚、このようにして得られたアビジン
固定化部を有する膜状物やシート状物は、非特異的な吸
着による測定への影響を防止するために所謂ブロッキン
グ処理を施しておくことが望ましい。このようなブロッ
キング処理は、通常この分野で行われる方法、例えばこ
れら膜状物やシート状物を例えばアルブミン、グロブリ
ン、カゼイン、ポリビニルアルコール、界面活性剤等の
ブロッキング剤（但し、測定への影響のないものを選択
して使用する。）を含有する適当な緩衝液（例えばpＨ
が５〜９程度の例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベ
ロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）中に
適当な時間浸漬した後に乾燥する方法等により行えばよ
い。

【００２４】本発明の第２部分中に固定化させるアビジ
ンの量としては、測定対象物質の種類や、検出限界や検
量限界をどの程度に設定するかによって変動し、特に限
定されないが、例えば本発明の第２部分中のアビジン固
定化部の単位面積（cm²）当たりのアビジン保持量とし
て通常0.01μg〜１mg、好ましくは0.1μg〜100μg、よ
り好ましくは0.5μg〜50μgの範囲から適宜選択され
る。

【００２５】また、サンドイッチ型免疫複合体形成反応
を充分に完了させるために、或いは液体試料中の着色物
質による測定への影響や測定対象物質と結合していない
マーカー標識第１抗体による測定への影響を回避するた
めには、第２部分に於けるアビジン固定化部は、第１部
分との連結端並びに第２部分の他端からある程度離れた
位置（例えば第２部分の中程等）に設けておくことが望
ましい。

【００２６】本発明のイムノクロマト法用試験用具の測
定対象物質としては、特に限定されないが、例えば血
液、血漿、血清、髄液、尿、糞便等の生体由来の試料や
これらを適宜適当な緩衝液等で希釈或いは懸濁させて得
られる液体試料中に含まれる、例えばアルブミン，ヘモ
グロビン，ミオグロビン，トランスフェリン，プロテイ
ンＡ，Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例え
ば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ），低比重リポ蛋白質（Ｌ
ＤＬ），超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等の核
酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ，乳酸脱水素酵
素，リパーゼ，アミラーゼ等の酵素、例えばＩgＧ，Ｉg
Ｍ，ＩgＡ，ＩgＤ，ＩgＥ等の免疫グロブリン（或はこ
れらの、例えばＦc部，Ｆab部，Ｆ(ab)₂部等の断片）、
例えばフィブリノーゲン，フィブリン分解産物（ＦＤ
Ｐ），プロトロンビン，トロンビン等の血液凝固関連因
子、例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エイ
ズウイルス等のウイルスに対する抗体、例えばＢ型肝炎
ウイルス、梅毒トリポネーマ（ＴＰ）、クラミジア、カ
ンジダ等の微生物関連抗原、例えばクラミジア等の微生
物に対する抗体、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ
ＣＧ）等のホルモン等が挙げられる。

【００２７】本発明のイムノクロマト法用試験用具を調
製するには、例えば以下の如くして行えばよい。即ち、
先ず、例えば適当な大きさのポリ塩化ビニルシート、ポ
リエチレンシート、ポリプロピレンシート、ポリスチレ
ンシート等を担体として用い、該担体上に例えば両面テ
ープ等を用いて、上記の如くして作製したアビジン固定
化部（判定部）を有する膜状物又はシート状物を接着し
て第２部分（即ち展開膜）を形成し、次いでマーカー標
識第１抗体（例えば金コロイド標識第１抗体等）及びビ
オチン結合第２抗体を保持させた膜状物又はシート状物
を例えば両面テープ等を用いて、該第２部分と相互間に
毛管現象が生じるように接着させて第１部分を形成する
ことにより調製し得る。尚、第１部分と第２部分との間
で毛管現象を生じさせ易くするために、第１部分が第２
部分の下端に約１〜２mm程度重なるように接着させるよ
うにしても良い。また、本発明のイムノクロマト法用試
験用具に於いては、液体試料の吸収及び第１部分でのサ
ンドイッチ型免疫複合体形成反応を円滑に行わせるため
に、第１部分の下端に更に液体試料吸収部を設け、液体
試料を先ずこの部分に滴下し、毛管現象を利用して第１
部分にこれを運ばせて反応を開始させるようにしても良
い。当該液体試料吸収部は、液体試料を吸収し得る膜状
物やシート状物（第１部分や第２部分を形成するために
用いられる膜状物やシート状物と同じものでよい）を例
えば両面テープ等を用いて、第１部分と相互間に毛管現
象が生じるように接着させることにより調製し得る。
尚、第１部分と液体試料吸収部との間で毛管現象を生じ
させ易くするために、液体吸収部分が第１部分の下端に
約１〜２mm程度重なるように接着させるようにしても良
い。尚、全体の大きさとしては、液体試料吸収部に液体
試料を例えば滴下等してから毛管現象により第２部分の
末端にまで液体試料が展開されるまでの時間が、通常15
分以内、好ましくは10分以内となるように設定される。
このようにして得られた本発明のイムノクロマト法用試
験用具の好ましい態様の一つを図１に示す。

【００２８】尚、図１に於いて各数字は夫々以下のもの
を示す。 １：担体 ２：液体試料吸収部 ３：第１部分 ４：第２部分 ５：判定部（アビジン固定化部）

【００２９】また、本発明の測定方法を用いた測定は、
例えば以下の如く行えばよい。即ち、先ず上記した如く
して調製された本発明のイムノクロマト法用試験用具の
第１部分に液体試料を例えば滴下したり、第１部分を液
体試料中に浸漬する等して（尚、当該試験用具に液体試
料吸収部が設けられている場合は、液体試料吸収部に液
体試料を滴下したり、液体試料吸収部を液体試料中に浸
漬する等し、ここから毛管現象を利用して第１部分に液
体試料を供するようにする。）、第１部分に於いて液体
試料中の測定対象物質、1)マーカー標識第１抗体、及び
2)ビオチン結合第２抗体とを反応させて、先ずマーカー
標識第１抗体−測定対象物質−ビオチン結合第２抗体の
サンドイッチ型免疫複合体（即ち、反応生成物）を液相
中で形成させる。次いでこれをアビジン固定化部（判定
部）を有する展開膜（第２部分）に毛管現象により運ば
せ、アビジン−ビオチン反応を利用して当該サンドイッ
チ型免疫複合体を判定部に捕捉させる。尚、測定対象物
質と結合しなかったマーカー標識第１抗体は、毛管現象
により更に下流に運ばれる。次いで、結果的に判定部に
捕捉されたサンドイッチ型免疫複合体中の第１抗体に標
識されたマーカーに由来する発色の程度を目視にて観察
し、その結果を予め作製しておいたマーカーに由来する
発色の程度と測定対象物質量との関係を表わす色調表に
当てはめる等することにより、測定対象物質量を定量的
に測定することができる。

【００３０】尚、発色の程度が特定の色調より薄ければ
陰性、濃ければ陽性としておけば、本発明の方法により
測定対象物質の半定量も可能である。また、発色の程度
の判定は、例えば、プレテスター RM-405、プレテスタ
ー RM-505（何れも和光純薬工業（株）製）等の尿試験
紙用のテスター、例えばデンシトメーター等を用いて行
っても良いことはいうまでもない。

【００３１】また、本発明のイムノクロマト法用試験用
具は、アビジン−ビオチン反応を利用するため、展開膜
（第２部分）には、アビジンを固定化した部分以外に目
的の測定に直接関与する試薬は含まれていない。そのた
め、本発明のイムノクロマト法用試験用具は、第１部分
を適当なマーカー標識第１抗体及びビオチン結合第２抗
体を保持した膜状物或いはシート状物に適宜変更するの
みで、種々の測定対象物質の測定に使用可能なイムノク
ロマト法用試験用具を製造し得るという、製造上の有利
性をも有している。以下に実施例を挙げ、本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定さ
れるものではない。

【００３２】

【実施例】 実施例１． （イムノクロマト法用試験用具の作製） （１）判定部（ストレプトアビジン固定化部）を有する
展開膜の作製 バイオダインＣ膜（修飾ナイロン膜：日本ポール社製。
５mm×40mm）の下端より20mmの位置にストレプトアビジ
ン溶液（２mg/ml：50mMリン酸緩衝液、pＨ7.4。ストレ
プトアビジン；和光純薬工業（株）製。）をＴＬＣアプ
リケーター（商品名：リノマート。カマグ社製）を用い
て線状に塗布した後に、乾燥させて、判定部（ストレプ
トアビジン固定化部）を作製した。得られた判定部を有
する膜を、ブロッキング溶液［0.5％Tween20（花王
（株）商品名）、0.5％カゼイン及び0.15M NaCl含有50m
Mリン酸緩衝液、pＨ7.4。］に浸漬し、２時間ブロッキ
ング処理を行った後再度乾燥させたものを展開膜とし
た。

【００３３】（２）ビオチン結合抗体溶液の作製 抗ＢＪＰ−λ鎖（ベンスジョーンズ蛋白）モノクロ−ナ
ル抗体溶液（ＩgＧ含量：0.05mg /ml in 0.1M NaHCO₃ s
ol.。和光純薬工業（株）製）４mlと、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド−ビオチン（N-Hydroxysuccinimido-bio
tin。シグマ社製。）溶液（13mg/ml in DMF）100μｌと
を混合後、４℃で一晩反応させた。その後反応液を、50
mMリン酸緩衝液（pＨ7.4）で透析し（１リットル×
２。）、得られた溶液をビオチン結合抗体溶液（５ml）
とした。

【００３４】（３）金コロイド標識抗体溶液の作製 ビオチン結合抗体を作製するために用いたモノクローナ
ル抗体とは認識部位が異なる抗ＢＪＰーλ鎖モノクロ−
ナル抗体溶液（ＩgＧ含量：20mg/ml）10μｌと、フレン
ス（Frens）の方法［Nature Phys.Sci.,vol.241,20-22
(1973)］で調製し0.1M K₂CO₃でpＨを6.5に調整した金コ
ロイド溶液（金コロイドの平均粒経：15nm。ＯＤ_520nm
＝1.2）６mlとを混合し１時間反応させた後、反応液に
分散剤としてポリエチレングリコール（シグマ社製。商
品名：カーボワックス20M）を終濃度で0.05％となるよ
うに添加した。その後、反応液を15000rpm×20分で遠心
分離処理し、上清を捨て、得られた残渣を50mMリン酸緩
衝液（0.05％ポリエチレングリコール含有。pＨ7.4。）
３mlに懸濁後、再度15000rpm×20分で遠心分離処理し
た。得られた残渣を50mMリン酸緩衝液（0.05％ポリエチ
レングリコール含有。pＨ7.4。）３mlに懸濁したものを
金コロイド標識抗体溶液とした。

【００３５】（４）ビオチン結合抗体及び金コロイド標
識抗体のグラスファイバー膜への保持 （２）で調製したビオチン結合抗体溶液と（３）で調製
した金コロイド標識抗体溶液とを等量混合した溶液に、
予めブロッキング溶液［0.5％Tween20（花王（株）商品
名）、0.5％カゼイン及び0.15M NaCl含有50mMリン酸緩
衝液、pＨ7.4。］でブロッキング処理したグラスファイ
バー膜（５mm×６mm。ミリポア社製）を浸漬した後、乾
燥させて、ビオチン結合抗体及び金コロイド標識抗体を
トレーサーとして保持させたグラスファイバー膜を得
た。

【００３６】（５）イムノクロマト法用試験用具の作製 塩化ビニル製シート（５mm×60mm。シンエイ産業（株）
製。）の上端に両面テープを用いて、上記（１）で作製
した判定部（ストレプトアビジン固定化部）を有する展
開膜を接着して第２部分を形成し、次いで（４）で作製
したビオチン結合抗体及び金コロイド標識抗体を保持さ
せたグラスファイバー膜を、両面テープを用いて該展開
膜の下端に約１〜２mm程度重なるように接着させて第１
部分を形成した。更に該グラスファイバー膜の下端に約
１〜２mm程度重なるように液体試料吸収用膜（ロプロソ
ーブ：日本ポール社製）（５mm×１６mm）を両面テープ
を用いて接着し液体試料吸収部を形成して、概略図１に
示されるようなイムノクロマト法用試験用具を作製し
た。

【００３７】（測定操作）上で作製したイムノクロマト
法用試験用具の液体試料吸収部に液体試料（ＢＪＰーλ
鎖を１μg/ml含有する10mMリン酸緩衝塩類溶液。pＨ7.
4）80μｌを滴下した。一方、別のイムノクロマト法用
試験用具の液体試料吸収部に、陰性対照として10mMリン
酸緩衝塩類溶液（pＨ7.4。）を80μｌを滴下した。液体
試料が毛管現象によりイムノクロマト法用試験用具の先
端（展開膜の末端）まで展開した時点（約８分）で、判
定部（ストレプトアビジン固定化部）の着色を観察した
ところ、ＢＪＰ−λ鎖を含んだ液体試料を滴下した場合
には、赤紫色の明瞭なラインが観察され、一方、陰性対
照の液体試料を滴下した場合には、判定部（ストレプト
アビジン固定化部）上に赤紫色のラインは観察されなか
った。これらの結果から、本発明のイムノクロマト法用
試験用具を用いて液体試料中のＢＪＰ−λ鎖を定量又は
半定量し得ることが判る。

【００３８】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、液体試料中
の測定対象物質量を測定するためのイムノクロマト法用
試験用具及びそれに用いた測定方法を提供するものであ
る。本発明によれば、従来のイムノクロマト法用試験用
具に於ける問題点、即ち測定のためのサンドイッチ型免
疫複合体形成反応を固相上で行わせるために短時間（例
えば10分以内）で測定を完了させることができず測定精
度の低下や検出感度の低下を招く、という問題を生じさ
せることなく、液体試料中の測定対象物質を高感度に精
度良く測定し得るという効果を奏する。

【００３９】また、本発明のイムノクロマト法用試験用
具は、アビジン−ビオチン反応を利用するため、展開膜
（第２部分）には、アビジンを固定化した部分以外に目
的の測定に直接関与する試薬は含まれていない。そのた
め、本発明のイムノクロマト法用試験用具は、第１部分
を適当なマーカー標識第１抗体及びビオチン結合第２抗
体を保持した膜状物或いはシート状物に適宜変更するの
みで、種々の測定対象物質の測定に使用可能なイムノク
ロマト法用試験用具を製造し得るという、製造上の有利
性をも有している。従って、本発明は、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のイムノクロマト法用試験用具の好まし
い態様の１つを示す。

【符号の説明】

図１に於いて各数字は夫々以下のものを示す。 １：担体 ２：液体試料吸収部 ３：第１部分 ４：第２部分 ５：判定部（アビジン固定化部）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(a)毛管現象により移動可能なように保持
   された、1)視覚的に検知し得るシグナルが得られるマー
   カーで標識された、測定対象物質に特異的な第１抗体、
   及び2)測定対象物質に特異的で、第１抗体と認識部位が
   異なり且つビオチンが結合した第２抗体を含む第１部分
   と、 (b)アビジンが固定化されている部位を有する第２部分
   とを具備し、 (c)当該第１部分と第２部分とが、相互間に毛管現象が
   生じるように連結された、イムノクロマト法用試験用
   具。
2. 【請求項２】1)視覚的に検知し得るシグナルが得られる
   マーカーで標識された、測定対象物質に特異的な第１抗
   体及び2)測定対象物質に特異的で、第１抗体と認識部位
   が異なり且つビオチンが結合した第２抗体とを毛管現象
   により移動可能なように保持した第１部分に液体試料を
   供して液相中で反応を開始させ、反応生成物を毛管現象
   により、アビジンが固定化されている部位を有する第２
   部分に運ばせ、該第２部分のアビジン固定化部位に捕捉
   された反応生成物中のマーカーに由来する発色の程度に
   基づいて、該液体試料中の測定対象物質量を測定する方
   法。