JPH09187277A - 鋳型として全血液を用いた核酸の直接的ｐｃｒ増幅法 - Google Patents

鋳型として全血液を用いた核酸の直接的ｐｃｒ増幅法

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JPH09187277A
JPH09187277A JP8001572A JP157296A JPH09187277A JP H09187277 A JPH09187277 A JP H09187277A JP 8001572 A JP8001572 A JP 8001572A JP 157296 A JP157296 A JP 157296A JP H09187277 A JPH09187277 A JP H09187277A
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dna
dna polymerase
nucleic acid
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JP8001572A
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Yukio Hattori
幸夫 服部
Naoko Okayama
直子 岡山
Kunimitsu Yamamoto
邦光 山本
Yasuhiro Yamashiro
安啓 山城
Kiyomi Yamamoto
きよみ 山本
Yuzo Oba
雄三 大庭
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Toyobo Co Ltd
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Toyobo Co Ltd
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
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Abstract

(57)【要約】 【目的】無処理の血液からＰＣＲ反応により特定標的Ｄ
ＮＡ配列を容易に増幅させる方法を提供する。 【構成】採血された無処理の血液もしくは輸血用保存血
液を鋳型とし、特定標的ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオ
チドであるプライマー、４種のデオキシリボヌクレオチ
ドトリフォスフェートおよび耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ、例えばTth ＤＮＡポリメラーゼもしくはΔTth ＤＮ
Ａポリメラーゼをトリトン−Ｘ１００などの界面活性剤
の濃度が０．０５〜０．１５％である反応液中にて作用
させ、加熱および冷却を繰り返すことにより、上記血液
中の特定標的ＤＮＡ配列を増幅するＤＮＡ増幅方法およ
び該方法を利用する上記血液中の特定核酸の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試料としてヒト体内
から採取した全血液を用いた直接的核酸増幅法に関し、
特に採血後の血液を無処理のまま、鋳型として使用する
核酸の増幅方法ならびに得られた増幅産物から標的核酸
を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の増幅法、特にＤＮＡ増幅反応とし
ては、耐熱性酵素として特徴つけられているＤＮＡポリ
メラーゼを用いて、ＲＮＡ鋳型から逆転写酵素を用いて
合成されたｃＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡを鋳型とし
て、２種またはそれ以上のプライマーを使用するポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す
る）(Saiki,1985,Since,230:1350-1354)により、極微量
の標的ＤＮＡを増幅する反応である。ＰＣＲの開発当初
から、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが標的ＤＮＡを増幅す
るために使用され、その増幅産物は種々の操作に応用さ
れている。例えばエイズ、Ｃ型肝炎、結核、コレラなど
の病気の診断、あるいは遺伝子病などの診断などに応用
されている。
【０００３】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、各種超好熱
菌、好熱菌などから単離され、広く研究されている。そ
の中で代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるサーマ
ス・アクアチカス(Tharmus aquaticus) 由来のTaq ＤＮ
Ａポリメラーゼが、初期の頃から広く使用されている。
また、近年、同じ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるサー
マス・サーモフィルス(Tharmus thermophilus HB8)由来
のTth ＤＮＡポリメラーゼ等も広く用いられるようにな
ってきている。
【０００４】一方、ＤＮＡ増幅反応に使用する鋳型ＤＮ
Ａは、各種サンプルより抽出する必要がある。特にヒト
血液からのＤＮＡ抽出は煩雑な操作を必要とし、検体数
が多くなると実験者の負担が非常に大きくなる。また、
鋳型ＤＮＡの純度はＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応の結果
に大きく影響する。これはＤＮＡ試料中の種々の蛋白質
等がＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害することに起因す
る。従って、サンプル間の純度の差が結果の判定を左右
し、判定の信頼性を低下させる結果となる。
【０００５】これらの問題を解決するために、血液から
の鋳型調製を簡便にしたＦｏＬＴＰＣＲ(Formamide Low
Temperature PCR) が、Panaccio M. により開発され
た。これは、ホルムアミドに作用により血液中の白血球
から鋳型ＤＮＡを露出させ、得られたＤＮＡを鋳型とし
て増幅反応を行う方法である。しかしながら、採血後の
血液をホルムアミドと混合した後、熱処理を行う必要が
あり、操作の煩雑性は大きく改善されるに至っていな
い。また、検出のばらつきもみられ、これも問題であ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、採血
後の血液を無処理のまま鋳型として使用し、検出感度を
飛躍的に上昇させた核酸増幅法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、好ましくはトリ
トンＸ−１００等の界面活性剤を含む緩衝液中で、好ま
しくはサーマス・サーモフィルス由来の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼを使用することにより、上記課題が解決され
ることを見いだして、本発明を完成させるに至った。
【０００８】すなわち、ヒト体内から採取した全血液で
あって、白血球からもたらされる標的ＤＮＡを含む血液
試料に、該標的ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドで
ある２種またはそれ以上のプライマー、デオキシリボヌ
クレオチドフォスフェートおよび耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼを緩衝液中にて作用させて、（ａ）上記２種または
それ以上のプライマーを該標的ＤＮＡにアニールさせ、
（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマ
ー伸長反応を行って２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｃ）得ら
れた２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離し、そして
（ｄ）得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、上記工程
（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことことを特徴とする鋳型と
して全血液を用いた核酸の直接的ＰＣＲ増幅法である。
【０００９】また、本発明はヒト体内から採取した全血
液であって、白血球からもたらされる標的ＤＮＡを含む
血液試料に、該標的ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチ
ドである２種またはそれ以上のプライマー、デオキシリ
ボヌクレオチドフォスフェートおよび耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを緩衝液中にて作用させて、（ａ）上記２種ま
たはそれ以上のプライマーを該標的ＤＮＡにアニールさ
せ、（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作用によりプラ
イマー伸長反応を行って２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｃ）
得られた２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離し、そして
（ｄ）得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、上記工程
（ａ）〜（ｃ）を繰り返し、さらに得られたＤＮＡ増幅
産物に標的核酸検出用プローブを作用させて、標的核酸
を検出することを特徴とする標的核酸の検出法である。
【００１０】
【発明の実施態様】本発明において使用するヒト体内か
ら採取した全血液であって、白血球からもたらされる標
的ＤＮＡを含む血液試料とは、ヒト体内から採取した無
処理の全血であるものが好ましい。採取方法はヒト血液
を各種採血管、例えばＥＤＴＡ採血管により採血する。
本発明で用いる血液試料としては、具体的には採血後、
低温、例えば４℃で長期保存したものを使用する。好ま
しくは、採血後、０〜１３０日以内の血液を使用する。
本発明で用いる採血後の血液としては、ＰＣＲ反応液
中、１〜１０％含まれることが好ましい。１０％を越え
ると増幅反応が難しく、１％未満であっても増幅反応が
難しい。この存在量にて鋳型ＤＮＡとなり、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ反応を阻害することはない。好ましく
は、ＰＣＲ反応液中、２〜６％で最も良好な増幅産物を
検出することができる。
【００１１】本発明に使用するＰＣＲ反応液とは、標的
ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドである２種または
それ以上のプライマー、４種のデオキシリボヌクレオチ
ドフォスフェートおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、金
属イオンおよび必要により界面活性剤を含む緩衝液であ
る。
【００１２】本発明において使用するプライマーとは、
増幅されるべき核酸の各核酸鎖に相補的なオリゴヌクレ
オチドであり、２種またはそれ以上のプライマーからな
る。該プライマーは、２本鎖核酸の配列の異なる各鎖と
実質的に相補的であって、一方のプライマーから合成さ
れた伸長生成物がその相補体から分離された場合に、そ
の伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の合成の
ための鋳型として機能することができるように選択され
る。プライマーの合成は、例えばＡＢＩ社ＤＮＡシンセ
サイザー３９１型を用いて、ホスホアミダイド法にて行
う。
【００１３】本発明において使用するデオキシリボヌク
レオチドフォスフェート（ｄＮＴＰ）とは、ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰあるいはこれらの誘
導体を意味する。
【００１４】本発明において使用する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼとしては、例えばサーマス・アクアチカス由来
のＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス由来
のＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス由
来のＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス
由来のＤＮＡポリメラーゼ、超好熱始原菌由来のＤＮＡ
ポリメラーゼなどが挙げられる。これらの耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼは、これらの細菌から分離・精製したも
の、あるいはこれらの細菌から単離した耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする遺伝子をクローン化した組換え
ＤＮＡ技術によって産生したものなどがある。好ましい
具体例としては、サーマス・サーモフィルスが産生する
Tth ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素をコードする遺伝
子を組み込んだ組換宿主細胞から精製されたr-Tth ＤＮ
Ａポリメラーゼ、また、Tth ＤＮＡポリメラーゼの５’
→３’エキソヌクレアーゼ活性部分を除いたΔTth ＤＮ
Ａポリメラーゼなどが挙げられる。その濃度は、反応液
２５μｌに対して、好ましくは１単位以上、さらに好ま
しくは２．５単位を使用する。
【００１５】本発明においてＰＣＲ増幅反応に使用する
緩衝液としては、特に制限されないが、トリス塩酸緩衝
液が好ましい。また、そのｐＨはｐＨ８．０〜９．０、
好ましくはｐＨ８．９である。その濃度は、好ましくは
１０〜２０ｍＭである。
【００１６】本発明においてＰＣＲ反応液に使用する金
属イオンとは、マグネシウムイオンであり、例えば、塩
化マグネシウムを使用する。マグネシウムイオン濃度
は、好ましくは１．０〜２．０ｍＭである。
【００１７】ＰＣＲ反応液には、さらに界面活性剤、例
えば非イオン界面活性剤、具体例としてはトリトンＸ−
１００などを含有することが好ましい。その濃度は０．
５％〜２％、好ましくは１％である。
【００１８】本発明では、採血後の血液を鋳型として含
む試料に、ＰＣＲ反応液を作用させ、前記血液中の白血
球からもたらされるＤＮＡを鋳型として、標的ＤＮＡを
増幅する。具体的には（ａ）上記２種またはそれ以上の
プライマーを該標的ＤＮＡにアニールさせ、（ｂ）耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマー伸長反応
を行って２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｃ）得られた２本鎖
ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離し、そして（ｄ）得られた
ＤＮＡ増幅産物を鋳型として、上記工程（ａ）〜（ｃ）
を繰り返すことにより、前記血液試料中の白血球からも
たらされるＤＮＡを鋳型として、標的ＤＮＡを増幅させ
ることができる。工程（ａ）においては、例えば９０℃
にて、１０分間保温する。工程（ｂ）においては、例え
ば９５℃にて、３０秒保温する。工程（ｃ）において
は、例えば７０℃にて、３分間保温する。工程（ｄ）に
おいては、例えば５５℃にて、１分間保温する。本発明
では、工程（ａ）〜（ｃ）を３０〜４０回、繰り返すこ
とが好ましい。
【００１９】ＰＣＲ反応液の好ましい組成例は、以下の
通りである。 トリス緩衝液 １０〜 ２０ｍＭ 塩化カリウム ２００〜３００ｍＭ 塩化マンガン １．０〜２．０ｍＭ ｄＮＴＰ １．０〜２．０ｍＭ ウシ血清アルブミン ４００〜６００μｇ／ｍｌ コール酸ナトリウム ０．０５〜０．１５％ トリトン−Ｘ１００ ０．０５〜０．１５％
【００２０】また、本発明では前記血液試料中の白血球
からもたらされるＤＮＡを鋳型として特定標的ＤＮＡ配
列を、好ましくはＰＣＲにより増幅し、増幅産物を標的
核酸と相補的な検出プローブにて検出する。本発明にお
いて使用する核酸検出用プローブとは、試料中の検出し
ようとする核酸の一部または全部に対して、相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドであり、標識または標識
結合物質を有していてもよい。標識としては、アルカリ
ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼなどの酵素、放射性物質、蛍光性物質などが挙げら
れ、標識結合物質としては、アビジン、ストレプトアビ
ジンまたはビオチンなどが挙げられる。
【００２１】核酸検出法の一例としては、検出しようと
する核酸を捕捉すべきプローブを担体、例えばポリスチ
レン・ビーズなどに固定させ、本発明により増幅したＤ
ＮＡ増幅産物を捕捉プローブと反応させ、捕捉プローブ
と結合した増幅産物に上記検出用プローブを反応させ、
検出用プローブが有する標識または標識結合物質を通常
の検出法に従い、測定することにより、試料中の核酸を
検出することができる。
【００２２】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳細に説明す
る。参考例１ オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９１型を用いて、ホス
ホアミダイド法にて、下記配列を有する第１および第２
オリゴヌクレオチドを合成した。第１オリゴヌクレオチ
ド：ヒトβ−グロビン遺伝子のコード領域の上流、−２
３３番目から−２０８番目のオリゴヌクレオチド配列と
相補的な配列を有する（配列番号１）。第２オリゴヌク
レオチド：ヒトβ−グロビン遺伝子の第６１３番目から
第６３８番目のオリゴヌクレオチド配列と相補的な配列
を有する（配列番号２）。合成の手法はＡＢＩ社マニュ
アルに従い、０．２μＭスケールで実施した。各種オリ
ゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一晩
実施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン
交換カラムにて実施した。
【００２３】実施例１ （１）鋳型ヒト血液試料の調製 ＥＤＴＡ採血管にて採取した新鮮ヒト末梢血、および４
℃で保存した輸血保存血液を用いた。 （２）増幅反応 操作（ａ）：参考例１の第１および第２オリゴヌクレオ
チドを各２５ｐｍｏｌ（配列番号１及び２）、および上
記ヒト血液試料ならびに輸血保存血液１μｌを下記ＰＣ
Ｒ反応溶液に加え、更に TthＤＮＡポリメラーゼ（東洋
紡製）あるいはΔTth ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）
２．５単位を添加し、９０℃に１０分間保温した。 反応溶液１ ２００μＭ ｄＮＴＰｓ １０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９） １．５ｍＭ 塩化マグネシウム ２８０ｍＭ 塩化カリウム ５００μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン ０．１ ％ コール酸ナトリウム ０．１ ％ トリトン−Ｘ１００ 操作（ｂ）：上記反応後、続いて、下記ＰＣＲ増幅反応
条件１を３５回繰り返した。 操作（ｃ）：上記反応液を４℃にて保存した。
【００２４】操作（ｄ）：ＰＣＲ反応産物を２％アガロ
ースで１００Ｖ、２０分間電気泳動した。 操作（ｅ）：電気泳動後、エチヂウム・ブロマイドで染
色し、紫外線照射下で検出した。その結果を図１に示
す。図中、レーン１〜６は TthＤＮＡポリメラーゼを使
用、レーン７〜１３はΔTth ＤＮＡポリメラーゼを使
用、レーンＭは分子マーカーであるφX174/HaeIII を示
す。図１から明らかなように、Tth ＤＮＡポリメラーゼ
またはΔTth ＤＮＡポリメラーゼを使用して、標的ＤＮ
Ａ配列を高い効率で増幅することができる。
【００２５】
【発明の効果】本発明では、採血後、無処理のままの血
液を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばTthＤＮＡポリ
メラーゼまたはΔTth ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液
中で、好ましくは界面活性剤、例えばトリトンＸ−１０
０の存在下に作用させ、直接ＰＣＲ反応を行うことが可
能である。これにより飛躍的に安定した（どういうこと
か、課題のところで説明要）ＤＮＡ増幅反応を行える。
【００２６】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..26 他の特徴：ヒトβ−グロビン遺伝子の第２３３番目から
２０８番目のヌクレオチド配列と相同な配列を有する。 配列 AGTABCAATT TGTACTGATG GTATGG 26
【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..25 他の特徴：ヒトβ−グロビン遺伝子の第６１３番目から
６３８番目のヌクレオチド配列と相同な配列を有する。 配列 CGATCCTGAG ACTTCCACAC TGATG 25
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における反応液中のＤＮＡ増幅産物の
電気泳動結果を示す図面代用写真である。 図中、レーン 1〜 6 : Tth DNA ポリメラーゼを使用 レーン 7〜13 :ΔTth DNA ポリメラーゼ使用 レーン M :φX174/HaeIII 分子量マーカー
フロントページの続き (72)発明者 大庭 雄三 山口県宇部市南区城野133

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト体内から採取した全血液であって、
    白血球からもたらされる標的ＤＮＡを含む血液試料に、
    該標的ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドである２種
    またはそれ以上のプライマー、デオキシリボヌクレオチ
    ドフォスフェートおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを緩
    衝液中にて作用させて、（ａ）上記２種またはそれ以上
    のプライマーを該標的ＤＮＡにアニールさせ、（ｂ）耐
    熱性ＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマー伸長反
    応を行って２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｃ）得られた２本
    鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離し、そして（ｄ）得られ
    たＤＮＡ増幅産物を鋳型として、上記工程（ａ）〜
    （ｃ）を繰り返すことことを特徴とする鋳型として全血
    液を用いた核酸の直接的ＰＣＲ増幅法。
  2. 【請求項２】 緩衝液が、トリス緩衝液であり、かつマ
    グネシウムイオンを含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 マグネシウムイオン濃度が１．０〜２．
    ０ｍＭである請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 緩衝液が、さらに界面活性剤を含有する
    請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 界面活性剤が非イオン界面活性剤である
    請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 ヒト体内から採取した全血液が採血後、
    無処理のものである請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・
    サーモフィラス由来の酵素である請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・
    サーモフィルス由来の３’→５’エキソヌクレアーゼ活
    性部位を欠損させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請
    求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 ヒト体内から採取した全血液であって、
    白血球からもたらされる標的ＤＮＡを含む無処理の血液
    試料に、該標的ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドで
    ある２種またはそれ以上のプライマー、デオキシリボヌ
    クレオチドフォスフェートおよびサーマス・サーモフィ
    ラス由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたはサーマス・
    サーモフィルス由来の３’→５’エキソヌクレアーゼ活
    性部位を欠損させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを界面活
    性剤およびマグネシウムイオンを含む緩衝液中にて作用
    させて、（ａ）上記２種またはそれ以上のプライマーを
    該標的ＤＮＡにアニールさせ、（ｂ）耐熱性ＤＮＡポリ
    メラーゼの作用によりプライマー伸長反応を行って２本
    鎖ＤＮＡを合成し、（ｃ）得られた２本鎖ＤＮＡを１本
    鎖ＤＮＡに分離し、そして（ｄ）得られたＤＮＡ増幅産
    物を鋳型として、上記工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返すこ
    と特徴とする鋳型として全血液を用いた核酸の直接的Ｐ
    ＣＲ増幅法。
  10. 【請求項１０】 ヒト体内から採取した全血液であっ
    て、白血球からもたらされる標的ＤＮＡを含む血液試料
    に、該標的ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドである
    ２種またはそれ以上のプライマー、デオキシリボヌクレ
    オチドフォスフェートおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
    を緩衝液中にて作用させて、（ａ）上記２種またはそれ
    以上のプライマーを該標的ＤＮＡにアニールさせ、
    （ｂ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマ
    ー伸長反応を行って２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｃ）得ら
    れた２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離し、そして
    （ｄ）得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、上記工程
    （ａ）〜（ｃ）を繰り返し、さらに得られたＤＮＡ増幅
    産物に核酸検出用プローブを作用させて、核酸を検出す
    ることを特徴とする標的核酸の検出法。
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