JPH09194391A - スイカズラ科植物ニワトコより得られるプロテアーゼ阻害活性を有する新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａ
ｅ）植物ニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄ
ｉａｎａ ＢＬＵＭＥ）を抽出、分画し、エンテロキナ
ーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼなど
のセリンプロテアーゼに強い阻害活性を有し、併せて優
れた血中安定性を示す新規な４種のポリペプチドを得
た。 【効果】 新規な生理活性ポリペプチドを提供する。こ
れらのポリペプチドは、強いセリンプロテアーゼ阻害活
性と優れた血中安定性を有しており、膵炎治療剤として
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はスイカズラ科（Ｃａ
ｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）植物ニワトコ（Ｓａｍｂｕ
ｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ ＢＬＵＭＥ）より得
られる、セリンプロテアーゼ阻害活性を有する新規ポリ
ペプチド、及び該ポリペプチドを有効成分とするセリン
プロテアーゼ阻害剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】急性膵炎、或いは慢性膵炎の急性期に
は、種々の要因により活性化した膵蛋白分解酵素による
膵臓組織の破壊と、活性化した酵素の血中への逸脱によ
る全身の組織、臓器障害など重篤な症状が発現すること
が知られている。その原因として膵セリンプロテアー
ゼ、特にカギ酵素としてのトリプシンの関与が重要視さ
れており、近年、上記の状態を改善する治療薬として、
いくつかの合成抗トリプシン剤が開発上市されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これらの合成抗トリプ
シン剤の出現により、膵炎治療にはかなりの進歩が見ら
れているが、合成抗トリプシン剤は血中半減期が短い欠
点を有し、より有効な薬剤の開発が求められている現状
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような現状のもと、
本発明者らは、トリプシンのみならずトリプシノーゲン
を活性化する酵素エンテロキナーゼにも着目し、より有
効な薬剤を開発すべく、天然資源を広く探索した結果、
スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）の植物
ニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ
ＢＬＵＭＥ）の花及び葉に含有される４種の新規ポリ
ペプチドを見い出した。

【０００５】すなわち、本発明は、次式（Ｉ）〜（IV） 式（Ｉ） Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− １ ５ Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− 10 15 Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− 20 25 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ 30 35

【０００６】 式（II） Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− １ ５ Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− 10 15 Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− 20 25 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ 30 35

【０００７】 式（III) Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− １ ５ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ− 10 15 Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ− 20 25 Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ 30 35

【０００８】 式（IV） Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− １ ５ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− 10 15 Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− 20 25 Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ 30 35 で表わされるポリペプチドであり、これら化合物の活性
を検討したところ、求めていたセリンプロテアーゼ阻害
活性を有することと併せて、優れた血中安定性を有する
ことを確認し、本発明を完成するに至った。

【０００９】

【発明の具体的説明】本発明者らは、スイカズラ科（Ｃ
ａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）の植物ニワトコ（Ｓａｍ
ｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ ＢＬＵＭＥ）の
抽出物がエンテロキナーゼを強く阻害することを見い出
し、活性成分を４種単離したが、これら化合物が新規ポ
リペプチドであり、強いセリンプロテアーゼ阻害活性
と、優れた血中安定性を有していることを発見した。一
般に、植物から目的物を得るには、抽出、精製、単離と
いう工程を経るが、本発明についても、このような工程
に沿って説明する。

【００１０】１．抽出工程 ニワトコの花軸を含む花部、或いは葉部から活性物質を
抽出するには、水或いは２０〜７０％メタノール水溶
液、またはこれらに酢酸などの有機酸類、塩酸などの鉱
酸類を０．１〜１０％の濃度になるように加えたものが
適するが、１〜５％酢酸水溶液、或いは、１〜５％濃度
に酢酸を含む３０〜６０％メタノール水溶液が好まし
い。

【００１１】花は生のまま、葉は生のまま或いは乾燥し
て、３〜６倍量の抽出溶媒に浸し、室温、或いは加温し
て抽出することが出来る。併せて、ポリペプチド類を抽
出する一般的な方法、例えば緩衝液、塩類を含む溶液な
どを用いることが出来ることは言うまでもない。

【００１２】２．精製工程 抽出工程により得られた活性ポリペプチドを含む抽出液
は多数の夾雑物を含むが、効率良く目的物質を濃縮する
方法として、例えば、ダイヤイオンＨＰ−２０（以下Ｈ
Ｐ−２０）などの合成吸着剤に目的物質を吸着すること
で、多くの夾雑物を除いた粗画分を得ることが出来る。

【００１３】すなわち、抽出液が水または酢酸含有の水
溶液の場合はそのまま、メタノールを含有している場合
は減圧下メタノールを留去後、バッチ法或いはカラム法
でＨＰ−２０に吸着し、ＨＰ−２０を水、次いで３０〜
３５％メタノール水溶液で洗浄後、目的である活性ポリ
ペプチドを例えばメタノール、アセトン、水等の混液で
溶出することにより、無機塩、単糖類など多くの夾雑物
を除いた粗画分を得ることが出来る。次に、ＨＰ−２０
のメタノール、アセトン、水の混液溶出画分の有機溶媒
を減圧下留去後、得られた水溶液をそのまま、或いは１
〜３％になるように酢酸を加えて例えばｎ−ブタノー
ル、或いは酢酸エチル等と振盪し水層を得ることで、脂
溶性の高い夾雑物を除くことが出来る。

【００１４】３．単離工程 精製工程により夾雑物を除いた粗画分から、目的である
活性ポリペプチドを単離するには、蛋白質、ポリペプチ
ドなどの精製、単離に用いる一般的な方法を用いること
が出来る。すなわち、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ等が
あるが、本発明においてはこれらに加えて、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーも利用し得る。

【００１５】精製工程で得られた粗画分を弱陽イオン交
換樹脂、例えばダイヤイオンＷＫ−１０Ｓなどのカラム
に通液し、水、次いで３５％メタノールで洗浄後、第一
溶出液である５０％アセトンにて溶出する画分と、第二
溶出液である０．１〜１．０Ｍ濃度に酢酸アンモンを含
有するメタノール、アセトン、水等の混液にて溶出する
画分に目的物質を回収することが出来る。

【００１６】５０％アセトン溶出部はそのまま濃縮乾固
し、酢酸アンモン溶出部は、ＨＰ−２０カラムで脱塩後
濃縮乾固し、各々目的である活性ポリペプチドを含有す
る画分を得ることが出来る。イオン交換クロマトグラフ
ィーの５０％アセトン溶出画分は、ＯＤＳシリカゲルを
担体とし、例えば０．１ＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −ＮａＯＨ緩衝
液（ｐＨ７）と酢酸とアセトニトリルの混液を溶出溶媒
とする逆相カラムクロマトグラフィーで分画し、ポリペ
プチド化合物（Ｉ）及び（II）を含む画分と、ポリペプ
チド化合物（IV）を含む画分に分画することが出来る。

【００１７】この両画分を更に、１〜５％酢酸を溶出溶
媒としたセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラ
フィーで精製後、０．１％濃度にトリフルオロ酢酸（以
下ＴＦＡ）を含有した含水アセトニトリルを溶出溶媒と
した逆相カラムクロマトグラフィーで分画し、最終的
に、分取ＨＰＬＣを用いポリペプチド化合物（Ｉ）と
（II）、及びポリペプチド化合物（IV）を各々単離する
ことが出来る。

【００１８】イオン交換クロマトグラフィーの酢酸アン
モン溶液溶出画分についても、同様に分画を進め、ポリ
ペプチド化合物（III)及び、ポリペプチド化合物（Ｉ）
と（II）を単離することが出来る。このようにして得ら
れる化合物（Ｉ）〜（IV）は、ニワトコの抽出部位によ
り構成が異なるが、その結果を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】４．構造決定 スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）植物ニ
ワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ
ＢＬＵＭＥ）から上記のように単離した４種の活性ポリ
ペプチドについて、気相プロテインシークェンサー（ア
プライドバイオシステムズ４７３Ａ プロテインシーク
ェンサー）により常法通り各々アミノ酸配列分析を行
い、請求項１記載のアミノ酸配列式（Ｉ）〜（IV）で示
される新規なポリペプチドであることが明らかとなっ
た。

【００２１】５．セリンプロテアーゼに対する阻害活性 ニワトコより得られた４種の新規ポリペプチド化合物に
ついて、各種セリンプロテアーゼに対する阻害活性を検
討したところ、エンテロキナーゼ、トリプシン、α−キ
モトリプシン、喀痰エラスターゼ、カテプシンＧに強い
活性を認め、また化合物により阻害スペクトルに差が認
められたが、その結果を表２に示す。

【００２２】

【表２】

【００２３】６．血中安定性 ニワトコより得られる４種の新規ポリペプチド化合物
が、セリンプロテアーゼに強い阻害活性を示すことが明
らかとなり、これら化合物について更なる有用性を確認
するため、化合物（Ｉ）と（III)を用い、ウサギ血漿中
での安定性を血漿中インヒビターの影響が少ないエンテ
ロキナーゼ阻害活性を指標に検討した。両化合物ともに
優れた安定性を示したが、その結果を表３に示す。

【００２４】

【表３】

【００２５】以上のように本発明は、スイカズラ科植物
ニワトコから得られるセリンプロテアーゼに強い阻害活
性を有し、併せて優れた血中安定性を示す４種の新規ポ
リペプチドに関するものである。以下に実施例を示し、
本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらに
限定されるものではない。

【００２６】

【実施例】

実施例１ニワトコ花からの抽出と、ダイヤイオンＨＰ−２０によ
る精製 ４月上旬〜下旬にかけて採集したニワトコの花軸を含む
花部約３６ｋｇを生のまま約１８０リットルの５０％メ
タノール水溶液で室温、３週間抽出した。吸引濾過によ
り抽出液を得、減圧下濃縮し約５リットルの水溶液とし
た。抽出残渣には、２．５％酢酸水溶液約４０リットル
を加え、室温にて２週間抽出した後、吸引濾過により約
４２リットルの抽出液を得た。

【００２７】５０％メタノール抽出液より製した濃縮水
溶液約５リットルは、ｎ−ブタノール約２．５リットル
と振盪後静置し、水層を分取した。ｎ−ブタノール層は
水１リットルで抽出し、この水層と先の水層を合し、減
圧下溶存しているｎ−ブタノールを留去し、水溶液とし
た。この水溶液を、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化
成；以下ＨＰ−２０）約５リットルを水で充填したカラ
ム（１２×４４ｃｍ）に通液した後、カラムを水約１
２．５リットル、次いで３０％メタノール約２０リット
ルで洗浄した。

【００２８】洗浄後のＨＰ−２０カラムは、メタノー
ル：アセトン：水＝３：３：４混液（以下ＭＡＷ混液）
約１０リットル、次いでＭＡＷ＝３：４：３混液約１０
リットル、さらにメタノール約５リットルで溶出し、こ
れら各溶出液を合し、減圧下濃縮して約２．５リットル
の水溶液とした。一方、２．５％酢酸水溶液による抽出
液は、ＨＰ−２０約２．５リットルを水で充填したカラ
ム（１２×２２ｃｍ）に通液した後、カラムを水約５リ
ットル、次いで３０％メタノール約５リットルで洗浄し
た。

【００２９】洗浄後のＨＰ−２０カラムは、ＭＡＷ＝
３：３：４混液約５リットル、次いでＭＡＷ＝３：４：
３混液約５リットルで溶出し、これら各溶出液を合し、
減圧下濃縮して約１リットルの水溶液とした。この水溶
液に約０．５リットルのｎ−ブタノールを加え振盪後静
置し、水層を分取した。ｎ−ブタノール層は水約０．５
リットルで抽出し、この水層と先の水層を合し、減圧下
溶存しているｎ−ブタノールを留去し、約１リットルの
水溶液とした。

【００３０】実施例２ダイヤイオンＷＫ−１０Ｓイオン交換カラムクロマトグ
ラフィーによる精製 ニワトコ花の５０％メタノール抽出液、及び２．５％酢
酸抽出液から実施例１により導かれた水溶液を、ダイヤ
イオンＷＫ−１０Ｓ（Ｈ⁺ ）（三菱化成）約１．４リッ
トルを充填したカラム（７×３７ｃｍ）に通液し、水約
５リットル、次いで３０％メタノール約７リットルで洗
浄した。

【００３１】洗浄後のカラムは、第一溶出画分として５
０％アセトン約７リットルで溶出し、次いで第二溶出画
分として０．５Ｍ濃度に酢酸アンモンを含有するＭＡＷ
＝３：３：４混液約７リットルで溶出した。５０％アセ
トン溶出画分は減圧下濃縮乾固し、約７ｇの乾固物を得
た。０．５Ｍ酢酸アンモン溶出画分は減圧下有機溶媒を
留去した後、ＨＰ−２０を充填したカラムにて脱塩処理
を行い、約５．５ｇの乾固物を得た。

【００３２】実施例３イオン交換クロマトグラフィーの５０％アセトン溶出画
分から化合物（Ｉ）（II）（IV）の単離 実施例３−１イオン交換クロマトグラフィー５０％アセトン溶出画分
の逆相カラムクロマトグラフィー ０．１ＭＫＨ₂ ＰＯ₄ −ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）（以
下緩衝液という）と酢酸とアセトニトリルの混液（１
６：１：３）を用い、ＯＤＳシリカゲル（富士デヴィソ
ン；ＤＭ−２０３５ＭＴ）約１７５ｇを充填したカラム
（５×１８ｃｍ）にイオン交換クロマトグラフィー５０
％アセトン溶出画分約６．５ｇを付し、逆相カラムクロ
マトグラフィーを行った。

【００３３】溶出は、緩衝液と酢酸とアセトニトリル混
液の比率を変えながら、次のように行った。 緩衝液：酢酸：アセトニトリル 液量ｍｌ フラクションＮｏ． １６： １： ３ ３００ １ １５： １： ４ ２００ ２ １００ ３ １００ ４ １００ ５ １４．５： １： ４．５ １００ ６ １００ ７ １００ ８ １００ ９ １００ １０ １３．５： １： ５．５ １００ １１ １００ １２ １００ １３ １００ １４ １００ １５ １２： １： ７ １００ １６ １００ １７ １００ １８ １００ １９ ６０％アセトニトリル ４００ ２０

【００３４】各フラクションはＴＬＣ（ＲＰ−１８ＷＦ
₂₅₄ ｓ；メルクＡｒｔ１３１２４）を用い、展開溶媒と
して緩衝液：酢酸：アセトニトリル＝１２．５：１：
６．５、呈色試薬としてニンヒドリンを用い分析した。
Ｒｆ値０．３３〜０．３５にニンヒドリン陽性スポット
を示すフラクション４〜６、及びＲｆ値０．１３〜０．
１５にニンヒドリン陽性スポットを示すフラクション１
６〜１７を、各々ＨＰ−２０カラムで脱塩後濃縮乾固
し、フラクション４〜６からは約１．１ｇの、フラクシ
ョン１６〜１７からは約０．５８ｇの乾固物を得た。

【００３５】実施例３−２逆相カラムクロマトグラフィー、フラクション４〜６の
セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー 実施例３−１記載の、逆相カラムクロマトグラフィーの
フラクション４〜６約１ｇを、セファデックスＬＨ−２
０（以下ＬＨ−２０；ファルマシア）を３％酢酸水溶液
で充填したカラム（３．５×４２ｃｍ）に付し、同溶媒
で溶出し、フラクションコレクターにて約１４ｍｌずつ
分取した。各フラクションは実施例３−１記載の条件に
てＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．３３〜０．３５にニンヒド
リン陽性スポットを示すフラクション１６〜２１を集め
濃縮乾固し約４５０ｍｇの乾固物を得た。

【００３６】実施例３−３ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー、フラクション１
６〜２１から化合物（Ｉ）（II）の単離 実施例３−２記載のＬＨ−２０カラムクロマトグラフィ
ーのフラクション１６〜２１約４４０ｍｇを、ＯＤＳシ
リカゲル約２００ｇを０．１％ＴＦＡ／２０％アセトニ
トリルで充填したカラム（５×２０ｃｍ）に付し、逆相
カラムクロマトグラフィーを行った。

【００３７】溶出は、アセトニトリル含量を変えながら
次のように行った。 ０．１％ＴＦＡ／ａｑ．アセトニトリル 液量ｍｌ フラクションＮｏ． ／２０％アセトニトリル ３００ １ ３００ ２ ２００ ３ ２００ ４ ／２１％アセトニトリル ２００ ５ ２００ ６ ２００ ７ ２００ ８ ２００ ９ ／２２．５％アセトニトリル ２００ １０ １００ １１ １００ １２ １００ １３ １００ １４ １００ １５ １００ １６ １００ １７ ／２３％アセトニトリル １００ １８ １００ １９ １００ ２０ １００ ２１ １００ ２２ ２００ ２３ ６０％アセトニトリル ４００ ２４

【００３８】各フラクションは実施例３−１記載の条件
にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．３３〜０．３５にニンヒ
ドリン陽性スポットを示すフラクションのうちフラクシ
ョン８〜１０を濃縮乾固し、約１６０ｍｇの乾固物を得
た。この画分のＨＰＬＣ分析（カラム；ＹＭＣ，Ｊ’ｓ
ｐｈｅｒｅＯＤＳ−Ｍ８０４．６×２５０ｍｍ 溶媒；
０．１％ＴＦＡ／２３．５％アセトニトリル 流速；１
ｍｌ／ｍｉｎ．検出；ＵＶ２２０ｎｍ）の結果を図１に
示すが、保持時間９〜１１分に２本のメインピークを認
めた。この２本のピークを、同条件の分取ＨＰＬＣを行
うことにより、保持時間の短いピークから化合物（Ｉ）
を、保持時間の長いピークから化合物（II）を各々単離
した。

【００３９】実施例３−４逆相カラムクロマトグラフィー、フラクション１６〜１
７から化合物（IV）の単離 実施例３−１記載の、逆相カラムクロマトグラフィーの
フラクション１６〜１７約０．５ｇを、ＬＨ−２０を１
％酢酸水溶液で充填したカラム（３．５×４２ｃｍ）に
付し、同溶媒で溶出し、フラクションコレクターにて約
１４ｍｌずつ分取した。

【００４０】各フラクションは実施例３−１記載の条件
にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．１３〜０．１５にニンヒ
ドリン陽性スポットを示すフラクションのうちフラクシ
ョン１５〜２２を濃縮乾固し、約２７０ｍｇの乾固物を
得た。この画分のＨＰＬＣ分析（カラム；ＹＭＣ，Ｊ’
ｓｐｈｅｒｅＯＤＳ−Ｍ８０４．６×２５０ｍｍ 溶
媒；０．１％ＴＦＡ／３０％アセトニトリル 流速；１
ｍｌ／ｍｉｎ．検出；ＵＶ２２０ｎｍ）の結果を図２に
示すが、保持時間１４．５〜１６．５分に１本のメイン
ピークを認めた。このメインピークを、同条件の分取Ｈ
ＰＬＣを行うことにより、化合物（IV）を単離した。

【００４１】実施例４イオン交換クロマトグラフィー０．５Ｍ酢酸アンモン溶
出画分から化合物（Ｉ）（II）（III)の単離 実施例４−１イオン交換クロマトグラフィー０．５Ｍ酢酸アンモン溶
出画分の逆相カラムクロマトグラフィー 実施例２に記載のイオン交換クロマトグラフィー０．５
Ｍ酢酸アンモン溶出画分約５ｇを、ＯＤＳシリカゲル約
２００ｇを緩衝液と酢酸とアセトニトリルの混液（１
６：１：３）にて充填したカラム（５×２０ｃｍ）に付
し、逆相カラムクロマトグラフィーを行った。

【００４２】溶出は、緩衝液と酢酸とアセトニトリル混
液の比率を変えながら、次のように行った。 緩衝液：酢酸：アセトニトリル 液量ｍｌ フラクションＮｏ． １６： １： ３ ３００ １ ２００ ２ １５： １： ４ １００ ３ １００ ４ １００ ５ １００ ６ １００ ７ １４： １： ５ １００ ８ １００ ９ １００ １０ １００ １１ １００ １２ １００ １３ １３： １： ６ １００ １４ １００ １５ １００ １６ １００ １７ １００ １８ １２： １： ７ １００ １９ １００ ２０ １００ ２１ １００ ２２ メタノール ３００ ２３

【００４３】各フラクションは実施例３−１記載の条件
にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．２３〜０．２５にニンヒ
ドリン陽性スポットを示すフラクションのうちフラクシ
ョン７をＨＰ−２０カラムで脱塩後濃縮乾固し、乾固物
約８００ｍｇを得た。また、Ｒｆ値０．３３〜０．３５
にニンヒドリン陽性スポットを示すフラクション８〜９
をＨＰ−２０カラムで脱塩後濃縮乾固し、乾固物約６２
０ｍｇを得た。

【００４４】実施例４−２逆相カラムクロマトグラフィー、フラクション７から化
合物（III)の単離 実施例４−１記載の、逆相カラムクロマトグラフィーの
フラクション７約７５０ｍｇを、ＬＨ−２０を３％酢酸
水溶液で充填したカラム（３．５×４０ｃｍ）に付し、
同溶媒で溶出し、フラクションコレクターにて約２０ｍ
ｌずつ分取した。各フラクションは実施例３−１記載の
条件にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．２３〜０．２５にニ
ンヒドリン陽性スポットを示すフラクションのうちフラ
クション１２〜１４をまとめ濃縮乾固し、約１６０ｍｇ
の乾固物を得た。

【００４５】この画分のＨＰＬＣ分析（カラム；ＹＭ
Ｃ，Ｊ’ｓｐｈｅｒｅＯＤＳ−Ｍ８０４．６×２５０ｍ
ｍ 溶媒；０．１％ＴＦＡ／２３．５％アセトニトリル
流速；１ｍｌ／ｍｉｎ．検出；ＵＶ２２０ｎｍ）の結
果を図３に示すが、保持時間１１〜１２分にメインピー
クを認めた。このメインピークを、同条件の分取ＨＰＬ
Ｃを行うことにより、化合物（III)を単離した。

【００４６】実施例４−３逆相カラムクロマトグラフィー、フラクション８〜９か
ら化合物（Ｉ）（II）の単離 実施例４−１記載の、逆相カラムクロマトグラフィーの
フラクション８〜９約６００ｍｇをＬＨ−２０を３％酢
酸水溶液で充填したカラム（３．５×４０ｃｍ）に付
し、同溶媒で溶出し、フラクションコレクターにて約１
５ｍｌずつ分取した。

【００４７】各フラクションは実施例３−２記載の条件
にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．３３〜０．３５にニンヒ
ドリン陽性スポットを示すフラクション７〜１２をまと
め濃縮乾固し、約１８０ｍｇの乾固物を得た。これを、
実施例３−３に記載のＨＰＬＣ条件にて分取ＨＰＬＣを
行うことにより、化合物（Ｉ）及び（II）を単離した。

【００４８】実施例５ニワトコ葉からの抽出と、ダイヤイオンＨＰ−２０によ
る精製 ９月〜１０月に採集したニワトコ葉約１９ｋｇを風乾
（風乾後３．４ｋｇ）し、細砕後約６０リットルの５％
酢酸水溶液に浸し、室温にて１カ月抽出した。吸引濾過
により抽出液を得、これに約２０リットルのＨＰ−２０
を加え、時々撹拌しながら１週間吸着させた。

【００４９】ＨＰ−２０を吸引濾過し、イオン交換水で
洗液が中性になるまで充分洗浄後、さらに約４０リット
ルの３０％メタノール水溶液で洗浄した。洗浄したＨＰ
−２０は、ＭＡＷ＝３：３：４混液約４０リットルにて
溶出し、得られた溶出液は減圧下濃縮し、約２リットル
の水溶液とした。得られた水溶液に約１リットルのｎ−
ブタノールを加え振盪後静置し、水層を分取した。ｎ−
ブタノール層は水約１．５リットルで抽出しこの水層と
先の水層を合し、減圧下溶存しているｎ−ブタノールを
留去し約３リットルの水溶液とした。

【００５０】実施例６ダイヤイオンＷＫ−１０Ｓイオン交換カラムクロマトグ
ラフィーによる精製 ニワトコ葉の５％酢酸抽出液から実施例５により導かれ
た水溶液を、ダイヤイオンＷＫ−１０Ｓ（Ｈ⁺ ）約０．
８リットルを充填したカラム（７×２１ｃｍ）に通液
し、水約１リットル、次いで４０％メタノール約２リッ
トルで洗浄した。

【００５１】洗浄後のカラムは、第一溶出画分として５
０％アセトン約３リットルで溶出し、次いで第二溶出画
分として０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ濃度
に酢酸アンモンを含有するＭＡＷ＝３：３：４混液各々
約３リットルで順次溶出した後、メタノール約１リット
ルにて溶出した。５０％アセトン溶出画分は減圧下濃縮
乾固し、約３．３７ｇの乾固物を得た。０．１Ｍ〜０．
４Ｍ酢酸アンモン溶出画分及び、メタノール溶出画分は
減圧下有機溶媒を留去した後、ＨＰ−２０を充填したカ
ラムにて脱塩処理を行い、約３．５ｇの乾固物を得た。

【００５２】実施例７イオン交換クロマトグラフィーの５０％アセトン溶出画
分から化合物（IV）の単離 実施例６で得られたダイヤイオンＷＫ−１０Ｓイオン交
換カラムクロマトグラフィー５０％アセトン溶出画分約
１．９ｇを、シリカゲル約７５ｇをクロロホルム：メタ
ノール：水：酢酸＝６５：３５：７：１０の混液で充填
したカラム（３×２１ｃｍ）に付し、同溶媒で約８００
ｍｌ溶出した。

【００５３】その後、溶出溶媒をｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：２混液に変更し、溶出液をフラクショ
ンコレクターにて約１２ｍｌずつ分取した。各フラクシ
ョンは実施例３−２記載の条件にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ
値０．１３〜０．１５にニンヒドリン陽性スポットを示
すフラクション７〜１３をまとめ減圧下濃縮乾固し、約
２７０ｍｇの乾固物を得た。

【００５４】この乾固物約２５０ｍｇを、ＯＤＳシリカ
ゲル約１００ｇを０．１％ＴＦＡ／３１％アセトニトリ
ルで充填したカラム（３．５×２０ｃｍ）に付し、同溶
媒にて溶出し、溶出液はフラクションコレクターにてフ
ラクション７７まで約１５ｍｌずつ分取し、次いで、溶
出液を０．１％ＴＦＡ／３２％アセトニトリルに変更し
て同様に分取した。

【００５５】各フラクションは実施例３−１記載の条件
にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．１３〜０．１５にニンヒ
ドリン陽性スポットを示すフラクション８７〜１０１を
まとめ減圧下濃縮乾固し、約４０ｍｇの乾固物を得た。
この乾固物を、実施例３−４と同様にセファデックスＬ
Ｈ−２０カラムクロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣを行
うことにより、化合物（IV）を得た。

【００５６】実施例８イオン交換クロマトグラフィー０．１〜０．４Ｍ酢酸ア
ンモン溶出画分から化合物（III)の単離 実施例６で得られたダイヤイオンＷＫ−１０Ｓイオン交
換クロマトグラフィー０．１〜０．４Ｍ酢酸アンモン溶
出画分約３ｇを、ＯＤＳシリカゲル約８５ｇを緩衝液：
酢酸：アセトニトリル＝１６：１：３混液で充填したカ
ラムに付し、逆相クロマトグラフィーを行った。

【００５７】溶出は、緩衝液と酢酸とアセトニトリル混
液の比率を変えながら、次のように行った。 緩衝液：酢酸：アセトニトリル 液量ｍｌ フラクションＮｏ． １６： １： ３ １００ １ １００ ２ １５： １： ４ １００ ３ １００ ４ １４．５： １： ４．５ １００ ５ ５０ ６ ５０ ７ １４： １： ５ ５０ ８ ５０ ９ ５０ １０ ５０ １１ ５０ １２ ５０ １３ ５０ １４ ５０ １５ ５０ １６ ５０ １７ ５０ １８ ５０ １９ ５０ ２０

【００５８】各フラクションは実施例３−１記載の条件
にてＴＬＣ分析し、Ｒｆ値０．２３〜０．２５にニンヒ
ドリン陽性スポットを示すフラクションのうちフラクシ
ョン１１〜１２をＨＰ−２０カラムで脱塩後濃縮乾固
し、乾固物約１０４ｍｇを得た。この乾固物を、実施例
４−２と同様にセファデックスＬＨ−２０カラムクロマ
トグラフィー、分取ＨＰＬＣを行うことにより、化合物
（III)を得た。

【００５９】実施例９化合物（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）のアミノ酸配列
決定 実施例１〜８に示したように、ニワトコの花及び葉から
単離した４種の化合物（Ｉ）〜（IV）について、気相プ
ロテインシークェンサー（アプライドバイオシステムズ
社製４７３Ａプロテインシークェンサー）により、常法
通りアミノ酸配列分析を行ったところ、各々請求項１記
載のアミノ酸配列式（Ｉ）〜（IV）で示されるアミノ酸
配列を有することが判明した。

【００６０】実施例１０−１化合物（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）のエンテロキナ
ーゼ阻害活性 Ｐ．Ｍａｒｇａｒｉｔｅｌｌａの方法（Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｒｅｓ．，２１，５８５，１９８１）を一部改変し以下
の様に実施した。０．２２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）３００μｌに適当
に希釈した試料２０μｌとエンテロキナーゼ（シグマ
社；ブタ腸由来，５ｕｎｉｔ／ｍｇ）の溶液（０．８ｕ
ｎｉｔ／ｍｌ）２０μｌを加えて３７℃で５分間インキ
ュベートを行ない、続いて基質Ｓ−２２２２（カビ社；
Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミル−
グリシル−Ｌ−アルギニン−Ｐ−ニトロアニリド塩酸
塩：Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−γ−メト
キシグルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−Ｐ−ニト
ロアニリド塩酸塩＝１：１（Ｗ／Ｗ））の溶液（１ｍｇ
／ｍｌ精製水）２０μｌ加えて、更に３７℃で２０分間
インキュベートした後、２０％酢酸溶液を３００μｌ加
えて反応を止め、Ｓ−２２２２より遊離したＰ−ニトロ
アニリン量を４０５ｎｍの吸光量として測定した。

【００６１】試料の対照として、上記の操作においてＳ
−２２２２を添加する前に２０％酢酸溶液を３００μｌ
加えて反応を停止し、以下同様に行ない（最後の２０％
酢酸溶液は加えない）吸光値を求めた。また、試料に代
り同緩衝液（０．２２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３））２０μｌを加えて以
下試料と同様に操作して得たものを対照の吸光値とし
た。

【００６２】阻害活性は次式に従って求めた。 上記の方法に従って５０％阻害率を示す試料濃度を求め
た（ＩＣ₅₀）。

【００６３】実施例１０−２化合物（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）のトリプシン阻
害活性 Ｂ．Ｋａｓｓｅｌらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９，８４４，１９７０）を一部改
変し以下の様に実施した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）３００μｌに適当に希釈した試料２０μｌとト
リプシン（和光純薬；ブタ膵臓，４０００〜５０００
ＵＳＰｕｎｉｔ／ｍｇ）の溶液（４０μｇ／ｍｌ）３０
μｌを加えて３０℃で５分間インキュベートを行ない、
基質ＢＡＰＡ（ペプチド研究所；Ｎ−α−ベンゾイル−
ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩）の溶液
（３ｍｇ／ｍｌ，５０％ＤＭＳＯ）２０μｌを加えて、
更に３０℃で３０分間インキュベートした後、２０％酢
酸溶液を３００μｌ加えて反応を停止し、４０５ｎｍの
吸光値を求めた。以下、エンテロキナーゼ阻害活性と同
様の手法によりトリプシン阻害活性ＩＣ₅₀値を求めた。

【００６４】実施例１０−３化合物（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）のα−キモトリ
プシン阻害活性 Ｔ．Ａｃｈｓｔｅｔｔｅｒらの方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０７，４４５，１９８
１）を一部改変し以下の様に実施した。０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８．０）４００μｌに適当に希釈した試料
２０μｌとα−キモトリプシン（シグマ社；タイプVII)
の溶液（０．６５μｇ／ｍｌ同緩衝液）５０μｌを加え
３７℃で５分間インキュベートを行ない、基質（シグマ
社；サクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェ
ニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩）の溶液
（３．０ｍＭ ｉｎ ５０％ＤＭＳＯ）２０μｌ加え
て、更に３７℃で３０分間インキュベートした後、２０
％酢酸溶液を３００μｌ加えて反応を停止し、４０５ｎ
ｍの吸光値を求めた。以下、エンテロキナーゼ阻害活性
と同様の手法によりα−キモトリプシン阻害活性ＩＣ₅₀
値を求めた。

【００６５】実施例１０−４化合物（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）の喀痰エラスタ
ーゼ阻害活性 Ｋ．Ｎａｋａｊｉｍａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５４，４０２７，１９７９）を一部改変し以下
の様に実施した。０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）４００μｌに適当に希釈
した試料２０μｌと喀痰エラスターゼ（エラスチンプロ
ダクト社）の溶液（１３．０ｕｎｉｔ／ｍｌ同緩衝液）
２０μｌを加え３７℃で５分間インキュベートを行な
い、基質（ケンブリッジリサーチバイオケミカル社；メ
トキシサクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−バ
リン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩）の溶液（３ｍＭ ｉ
ｎ ５０％ＤＭＳＯ）２０μｌを加えて、更に３７℃で
２０分間インキュベートした後、２０％酢酸溶液を３０
０μｌ加えて反応を停止し、４０５ｎｍの吸光値を求め
た。以下、エンテロキナーゼ阻害活性と同様の手法によ
り喀痰エラスターゼ阻害活性ＩＣ₅₀値を求めた。

【００６６】実施例１０−５化合物（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）のカテプシンＧ
阻害活性 １．０Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）４００μｌに適当に希釈した試料２０
μｌとヒトカテプシンＧ（ベトガー社；３０〜３８ｕｎ
ｉｔ／ｍｇ）の溶液（７．０μｇ／ｍｌ）２０μｌを加
え３７℃で５分間インキュベートを行ない、基質（シグ
マ社；サクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フ
ェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩）の溶液
（３ｍＭｉｎ ５０％ＤＭＳＯ）２０μｌを加えて、更
に３７℃で６０分間インキュベートした後、２０％酢酸
溶液を３００μｌ加えて反応を停止し、４０５ｎｍの吸
光値を求めた。以下、エンテロキナーゼ阻害活性と同様
の手法によりカテプシンＧ阻害活性ＩＣ₅₀値を求めた。

【００６７】実施例１１化合物（Ｉ）、（III)のエンテロキナーゼ阻害活性を指
標とする血中安定性試験 ０．７５％（Ｗ／Ｖ）クエン酸ナトリウムを含むウサギ
新鮮血漿５００μｌに被検化合物（０．５ｍｇ／ｍｌ）
５０μｌを添加しよく混合した後、３７℃で１０分、３
０分、９０分、１８０分間インキュベートし、加温時間
ごとにそれぞれ４０μｌサンプリングした。

【００６８】サンプリングした試料４０μｌを０．２２
Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以
下緩衝液Ａ，ｐＨ８．３）４００μｌ添加し、更にエン
テロキナーゼの溶液（１ｕｎｉｔ／ｍｌ緩衝液Ａ）３０
μｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。続
いて、エンテロキナーゼの合成基質Ｓ−２２２２の溶液
（１ｍｇ／ｍｌ精製水）を２０μｌ加えて３７℃で３０
分間インキュベートした。

【００６９】加温後、反応液に２０％酢酸溶液３００μ
ｌを加え反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光値から
エンテロキナーゼ活性Ｘをもとめた。上記操作におい
て、基質Ｓ−２２２２を添加する前に２０％酢酸溶液を
加え先に反応を停止し、この溶液に基質Ｓ−２２２２を
添加し以下同様に操作し、求めたエンテロキナーゼ活性
値をＸ′とした。

【００７０】次に、上記操作において、被検化合物の代
りに緩衝液Ａ５０μｌをウサギ血漿５００μｌに添加
し、以下同様に操作し求めたエンテロキナーゼ活性値を
Ｙとした。また、この時基質Ｓ−２２２２を添加する前
に２０％酢酸溶液を加え先に反応を停止し、この溶液に
基質Ｓ−２２２２を添加し以下同様に操作し、求めたエ
ンテロキナーゼ活性値をＹ′とした。

【００７１】活性値Ｘ，Ｘ′，Ｙ，Ｙ′を求めた検量線
は以下の様に作成した。上記操作において、サンプリン
グ試料の代りに生理食塩水４０μｌを緩衝液Ａ４００μ
ｌに加え、以下同様に操作して得られた吸光値をエンテ
ロキナーゼ１単位とした。一方、ウサギ血漿の代りに、
緩衝液Ａ５００μｌを用いて、以下同様に操作して得ら
れた吸光値をエンテロキナーゼ０単位として検量線を作
成した。

【００７２】各サンプリング時間毎のウサギ血漿中での
化合物（Ｉ）、（III)の残存するエンテロキナーゼ阻害
活性率は次式に従い求めた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による化合物（Ｉ）及び（II）の精製段
階で、実施例３−３記載の逆相カラムクロマトグラフィ
ーに於ける、フラクション８〜１０のＨＰＬＣによる溶
出パターンを示すクロマトグラムである。

【図２】本発明による化合物（IV）の精製段階で、実施
例３−４記載のＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーに
於ける、フラクション１５〜２２のＨＰＬＣによる溶出
パターンを示すクロマトグラムである。

【図３】本発明による化合物（III)の精製段階で、実施
例４−２記載のＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーに
於ける、フラクション１２〜１４のＨＰＬＣによる溶出
パターンを示すクロマトグラムである。

【配列表】

配列番号：Ｉ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：サンブクス シーボルディアナ（Ｓａｍｂｕｃ
ｕｓ ｓｉｂｏｌｄｉａｎａ） 配列： Cys Thr Arg Glu Ile Cys Phe Pro Gly Lys Ser Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 1 5 10 15 Cys Leu Pro Phe Ala Gly Asp Asp Ser Gly Arg Gly Gly Cys Phe Met Val 20 25 30 35 配列番号：II 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：サンブクス シーボルディアナ（Ｓａｍｂｕｃ
ｕｓ ｓｉｂｏｌｄｉａｎａ） 配列： Cys Thr Arg Glu Ile Cys Phe Pro Gly Lys Ser Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 1 5 10 15 Cys Leu Pro Phe Ala Gly Asp Asp Ser Gly Arg Gly Gly Ser Phe Cys Val 20 25 30 35 配列番号：III 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：サンブクス シーボルディアナ（Ｓａｍｂｕｃ
ｕｓ ｓｉｂｏｌｄｉａｎａ） 配列： Ala Cys Thr Arg Glu Phe Cys Phe Pro Gly Lys Ser Thr Cys Ala Leu Gly Cys 1 5 10 15 Thr Cys Val Ala Phe Pro Gly Asp Asp Ser Gly Arg Gly Gly Cys Phe Arg 20 25 30 35 配列番号：IV 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：サンブクス シーボルディアナ（Ｓａｍｂｕｃ
ｕｓ ｓｉｂｏｌｄｉａｎａ） 配列： Ala Cys Thr Leu Glu Ile Cys Pro Val Gly Lys Ser Cys Ala Gly Gly Cys Thr 1 5 10 15 Cys Leu Ala Phe Pro Gly Asp Asp Ser Gly Phe Gly Gly Cys Phe Arg Val 20 25 30 35

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阿形 光治 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 (72)発明者 釣谷 昌敞 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 (72)発明者 深谷 康博 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 (72)発明者 前田 孚 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 (72)発明者 富田 基郎 神奈川県横浜市青葉区もみの木台29−10

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の式のポリペプチド： 式（Ｉ） Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− １ ５ Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− 10 15 Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− 20 25 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ 30 35 式（II） Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− １ ５ Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− 10 15 Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− 20 25 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ 30 35 式（III) Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− １ ５ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ− 10 15 Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ− 20 25 Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ 30 35 式（IV） Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− １ ５ Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ− 10 15 Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− 20 25 Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ 30 35
2. 【請求項２】 スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃ
   ｅａｅ）植物ニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏ
   ｌｄｉａｎａ ＢＬＵＭＥ）より抽出、精製、単離して
   得られる請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチド化合物の少
   なくとも一種を有効成分とするセリンプロテアーゼ阻害
   剤。
4. 【請求項４】 請求項１記載のポリペプチド化合物の少
   なくとも一種を有効成分とするエンテロキナーゼ阻害
   剤。
5. 【請求項５】 請求項１記載のポリペプチド化合物の少
   なくとも一種を有効成分とするトリプシン阻害剤。
6. 【請求項６】 請求項１記載のポリペプチド化合物の少
   なくとも一種を有効成分とするα−キモトリプシン阻害
   剤。
7. 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチド化合物の少
   なくとも一種を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
8. 【請求項８】 請求項１記載のポリペプチド化合物の少
   なくとも一種を有効成分とするカテプシンＧ阻害剤。