JPH09194393A - 免疫寛容を誘導する方法、免疫寛容誘導食品キットおよび免疫寛容誘導剤キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 脂溶性成分または脂溶性成分を含有する
物質を、抗原と同時には哺乳動物に摂取させないことを
特徴とする哺乳動物に対する免疫寛容の誘導方法、なら
びに脂溶性成分を含まない抗原含有調製物と、脂溶性成
分を含まない抗原不含調製物とから構成される免疫寛容
誘導食品キット及び免疫寛容誘導剤キット。 【効果】 免疫寛容を効果的に誘導することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アレルギー反応や
免疫学的拒絶反応の発症を予防・治療する方法に関し、
特に抗原の摂取や吸引、あるいは経皮的な接触によって
誘発される食物アレルギーや花粉アレルギー、あるいは
蜂アレルギー、漆かぶれ等の各種のアレルギー反応や、
臓器移植の際の免疫学的拒絶反応の発症を、免疫寛容の
効果的な誘導に基づいて予防・治療する方法、ならびに
それに用いる食品および薬剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】アレルギーの再発を予防する基本対策
は、アレルゲンの暴露を回避することである。たとえ
ば、食物アレルギーにおいては、アレルゲンを含む食品
を食べない、あるいはその摂取量を控えるとか、十分な
加熱によってアレルゲン性を減弱させるなどの対策がと
られる。また、花粉アレルギーにおいては、マスクや保
護メガネを着用したり、花粉の飛散量が多い時の外出を
控えるといった対策が最も簡単で、かつ効果的である。
これらの基本対策は、日常生活の中で行われている。し
かし、これらの対策は、アレルギー症状の再発を防止す
るものであって、自然寛解に期待する場合はあるもの
の、根本的な治療を目的とした手段ではない。

【０００３】近年、家系的にアレルギーのハイリスク児
を対象として、乳たん白質の部分分解ペプチドを窒素源
とする母乳代替ミルクがアレルギーの発症予防を目的と
して市販されている。しかし、通常のミルクまたは乳製
品に切り替えた後も、牛乳アレルギーが発症しにくいと
する根拠に乏しいことから、これらのミルクも単なる抗
原回避のための一選択肢に過ぎないことは明らかであ
る。

【０００４】これに対し、免疫寛容状態の誘導は、期待
する効果を少なくとも免疫学的な機序で説明できる治療
または予防方法である。これらの方法として、減感作療
法や経口寛容が知られており、これまでにも実際に行わ
れている。経皮的な減感作療法を治療に応用した報告が
いくつかある。ワーナーらは、ダニ抗原調製物を用いて
減感作療法を行い、吸入性ダニ抗原に誘発される遅発型
喘息反応が抑制されたと報告している（Warner,J.O. et
al.:Lancet, 2: 912 1978）。また、ノーマンらは、ブ
タクサ花粉の主要抗原である抗原IgE の尿素変性物を用
いて減感作療法を行い、開花期にIgE 抗体産生の増加が
抑制されることを認めた（Norman,P.S. et al.:J.Aller
gy Clin.Immunol., 66: 336 1980）。

【０００５】食物アレルギーの療法に経口的な減感作療
法を行った例として、パトリアルカらの報告がある（Pa
triarca,G. et al., eds:Food Allergy, Milano, Masso
m Italia: pp131 1979）。彼らは、牛乳、卵または果物
にアレルギーを示す患者に、１回１μｇの投与量から始
め、その後1.5 倍づつ倍増し、最終的には10ｇの投与に
成功したことを報告している。シェナッサらは、ピーナ
ッツアレルギー患者の減感作療法を報告している（Shen
assa M.M. et al.:J.Allergy Clin.Immunol.,75: 177 1
985）。しかし食物アレルギーの場合、疾患の原因がそ
もそも同じルートを経由した抗原であることや、極微量
の抗原によっても重篤な症状に陥ることが多いことか
ら、特異的経口減感作療法を用いて、アレルギー反応を
起こすことなく治療することは、少なくとも未処理の抗
原のままでは危険が多く、難しいと考えられる。

【０００６】最近、経口免疫寛容は、自己免疫疾患の有
効な治療法として注目されている。トレンサムらは、慢
性関節リウマチ炎患者の治療例を報告している（Trenth
am,D.E. et al.,:Science, 261:1727 1993）。患者に、
0.1 〜0.5 mgのニワトリII型コラーゲンを90日間、合計
33mg摂取させたところ、リウマチ炎の症状が減弱し、28
人中４人が完治した。またワイナーらは、多発性硬化症
患者を対象とした臨床成績を報告している（Weiner,H.
L. et al.,:Science, 259:1321 1993）。彼らは、患者
にミエリン塩基性たん白質を含むウシミエリン抗原を１
日300 mg、１年間投与した。全体としては、有意な効果
はなかったが、特定の集団については効果が認められ
た。

【０００７】予防を目的とした寛容誘導の従来技術とし
ては、漆かぶれの予防に関するインディアン（Dakin,
R.:Am.J.Med.Sci.,4:98 1829）や漆職人の生活習慣がよ
く知られている。彼らは、子供に漆を食べさせると、後
に漆にかぶれにくくなることを先祖から教えられてお
り、継承している。

【０００８】経口免疫寛容の現象を科学として初めて研
究し、報告したのは、ウェルズらである（Wells,H.G. e
t al.,: J.Infect.Dis., 8:66 1911）。彼らは、未感作
のモルモットに卵白アルブミンを食べさせると、その抗
原を用いてアナフィラキシー反応が誘発できないことを
示した。ハンソンらは、卵白アルブミン高応答性系統の
マウスに、卵白アルブミンの水溶液を単回、および複数
回胃内投与した後、水酸化アルミニウムゲルをアジュバ
ントとして、同抗原を腹腔免疫した（Hanson,D.G. et a
l.,:J.Immunol., 123: 2337 1979）。その結果、血清の
抗−卵白アルブミン抗体、およびレアギン抗体の産生が
ほぼ完全に抑制されたと報告している。

【０００９】経口免疫寛容を誘導する抗原は、食物抗原
に限定されない。アラマキらは、マウスにブタクサの花
粉抽出物を経口投与後、同抗原をアジュバントとともに
追加免疫したところ、特異IgE 抗体の産生が抑制された
ことを報告している（Aramaki,Y. et al.,:Immunol.Let
t.40:21 1994）。石井らは、水酸化アルミニウムをアジ
ュバントとして、モルモットにダニ抽出液を非経口的に
免疫した後、経口的に１週間投与したところ、ダニ吸入
誘発試験での閾値とヒスタミン吸入閾値が上昇し、経口
減感作効果を認めたと報告し、経口減感作療法が花粉ア
レルギーに対しても有効であろうと考察している（Ishi
i, A. et al., Int.Arch.Allergy Appl.Immunol., 94:2
88,1991）。

【００１０】経口免疫の誘導のされ易さには、動物の種
類によって差があるといわれている。これまでの報告に
よると、反芻動物やウサギ、モルモットは誘導されにく
く、マウスやラットなどの齧歯類は誘導され易いとされ
ている。ヒトにおいても経口寛容が成立する可能性は、
コーレンブラットらや、ローニーが示唆している（Kore
nblatt,P.E. et al.,: J.Allergy, 41: 226 1968; Lwo
ney,E.D.,:J.Invest.Dermatol., 512:411 1968）。最近
ハズビーらは、ヒトが通常食さないたん白質として、ス
カシ貝ヘモシアニン0.5 ｇをボランティアに摂取させ、
その後皮下免疫したところ、免疫寛容が少なくともＴリ
ンパ球においては誘導されうることを示した（Husby,S.
et al.,:J.Immunol., 152:4663 1994）。

【００１１】以上の例では、抗原は偶然にも全て水溶液
として与えられているが、その根拠は何も述べられてい
ない。抗原以外に他の成分を加えた試験群との比較がな
されていないことから、水溶液として与えたことが意図
的な選択でないのは明白である。

【００１２】一般的に、免疫応答を誘導する性質が強い
抗原ほど、免疫寛容を誘導する性質も強いことが知られ
ている。このため、寛容を誘導する目的に用いられる抗
原（寛容原）は、多くの場合、未分解のものである。こ
れに対し、榎本ら（特開平5-5000号）や、ドミニク・シ
ャルル・アンデ・ベリら（特開平7-101873号）は、牛乳
アレルギーの発症予防におけるたん白質加水分解物の利
用を提唱している。たとえば榎本らは、分子量１万以下
のカゼイン分解ペプチドや乳清たん白質分解ペプチドを
含む固形飼料をマウスに与えた。その後、それらたん白
質の未分解物をフロインドのアジュバントとともに腹腔
に追加免疫したところ、ペプチド不含のイオン交換水を
与えていた群に比較して、特異抗体の産生が有意に低い
ことを認めた。分子量が１万以下のたん白質部分分解ペ
プチドは、抗原性がある程度低減されている一方で、寛
容誘導能は保持されているため、アレルギー防御機構を
十分活性化できる食品素材として有用であるとしてい
る。

【００１３】しかし、榎本らの成績では、たん白質の部
分分解物がペプチドの前投与によって誘導したとする寛
容が、元の未分解たん白質をその後に摂取させた場合に
対しても有効であることは一切示されていない。同様の
ことは、寛容誘導抗原として未分解のたん白質を与えた
比較群についてもいえる。この成績にはそもそも、未分
解のたん白質を与え続けたことによって、特異抗体の産
生が誘導されたとする比較群が含まれていないことに問
題がある。

【００１４】経皮的な特異的減感作療法を（食物や花
粉、ダニ、家塵などによって引き起こされる）アレルギ
ーの有効な対症療法とする報告が多いが、原因物質を注
射するためショックや喘息、発熱などのアレルギー症状
を誘発する危険性が高い。そこで、重合や変性などによ
ってアレルゲン性を減弱したものを注射することが試み
られているが、これらの作用を完全に回避するには至っ
ていない。

【００１５】経皮的減感作療法の最大の問題点は、治療
が数カ月以上の長期に及ぶ取り組みであることや、少な
からぬ苦痛を伴うことである。このため、治療のための
努力は長続きせず、途中で断念してしまう場合が極めて
多い。加えて、乳幼児を含めた低年齢層の療法として処
方するには、心情的にも難しい要素が多くなる。またこ
うした特性の故に、治療を目的とする場合はともかく、
不確定要素の多い予防を目的とするとなると、その逐次
の効果を実感できないだけに、敬遠されがちである。

【００１６】こうした問題点を抱える経皮的特異減感作
療法に代わる手段として、経口減感作療法が最近注目さ
れている。経口減感作療法は、注射の苦痛を伴わない利
点があり、早くから花粉やダニのアレルゲンの治療に応
用され、効果もある程度認められている。そのため、各
種のアレルギー疾患の根本的な予防や治療において、有
用な手段となりうるであろうと期待されている。

【００１７】しかし、食品アレルギーの場合、疾患の原
因がそもそも摂取した抗原であるため、経口免疫寛容を
用いて、アレルギー反応を起こすことなく治療するのは
難しいと考えられる。また、動物実験の多くは、特異抗
体の産生や遅延型反応の抑制効果を認め、寛容が誘導さ
れることを報告しているが、ヒトへの応用となると、逆
に感作を成立させたり、アレルギー症状を誘発する危険
性が多分にあり得ることを考慮すると、有効な手段にな
る得るであろうとの期待にとどまっているのが実状であ
る。

【００１８】経口減感作療法が、花粉やダニのアレルギ
ーの治療において常に奏効するとは限らないことや、食
物アレルギーの発症予防における応用が躊躇されている
最大の理由は、摂取抗原によって誘導される寛容とアレ
ルギーという全く相反する現象の選択が、一体何によっ
て決定されるのかという機序が明らかでなかったためで
ある。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、摂取抗原によって誘導される寛容またはその阻害の
機序を明らかにし、その機序に基づいて、アレルギー反
応を起こすことなく免疫寛容を誘導する方法を確立する
とともに、免疫寛容を誘導する食品および薬剤を提供す
ることである。

【００２０】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らは、脂溶性成分の摂取が免疫寛容の
誘導を著しく阻害していることを発見するに至った。し
かも、これまでの報告と異なり、抗原の再暴露を、摂取
という粘膜を介した実際の経路において評価し、寛容を
効果的に誘導できることを確認した。この知見を得た結
果、これまで抗原の経口投与によって誘導が困難であっ
た特異抗体の誘導が可能となったことを受けて、まず、
免疫寛容の誘導をより実際的な角度から評価・確認する
方法を新規に確立した。この方法を用いて、上記知見の
検討を重ねた結果、免疫寛容を誘導するためには、抗原
の摂取から一定時間以内は脂溶性成分の摂取を避けるこ
と、および摂取量を一定量内に制限することが必須であ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００２１】即ち、本発明は、脂溶性成分または脂溶性
成分を含有する物質を、抗原と同時に、好ましくは抗原
の摂取前４時間以内、摂取後２時間以内に哺乳動物に摂
取させないことを特徴とする、哺乳動物に対する免疫寛
容の誘導方法である。また、本発明は、抗原の摂取前４
時間以内、摂取後２時間以内における、脂溶性成分また
は脂溶性成分を含有する物質の摂取量を、哺乳動物の体
重kg当たり0.1 ｇ以下とすることを特徴とする、哺乳動
物に対する免疫寛容の誘導方法である。

【００２２】さらに、本発明は、脂溶性成分を含まない
抗原含有調製物と、脂溶性成分を含まない抗原不含調製
物とから構成される免疫寛容誘導食品キットおよび免疫
寛容誘導剤キットである。さらにまた、本発明は、脂溶
性成分を含まない抗原含有調製物と、該抗原含有調製物
の摂取時より起算して、前４時間以内、後２時間以内に
おける脂溶性成分の摂取量が、哺乳動物の体重kg当たり
0.1 ｇ以下であることを満足する抗原不含調製物とから
構成される免疫寛容誘導食品キットおよび免疫寛容誘導
剤キットである。

【００２３】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
は、哺乳動物に抗原を摂取させた時における、脂溶性成
分または脂溶性成分を含有する物質の摂取量を低く抑え
ることにより、免疫寛容を誘導する。具体的には、脂溶
性成分または脂溶性成分を含有する物質の摂取量を、哺
乳動物の体重kg当たり0.1 ｇ以下、好ましくは0.05ｇ以
下とし、特に好ましくは、脂溶性成分または脂溶性成分
を含有する物質を摂取させない。

【００２４】また、好ましくは、抗原の摂取前４時間以
内、特に８時間以内、摂取後２時間以内、特に４時間以
内における、脂溶性成分または脂溶性成分を含有する物
質の摂取量を低く抑えることにより、免疫寛容を誘導す
る。この場合においても、当該時間内における脂溶性成
分または脂溶性成分を含有する物質の摂取量を、哺乳動
物の体重kg当たり0.1 ｇ、好ましくは0.05ｇ以下とし、
特に好ましくは、脂溶性成分または脂溶性成分を含有す
る物質を摂取させない。

【００２５】本発明における脂溶性成分とは、アセトン
やエーテル、あるいはクロロホルム−メタノール混合液
など、有機溶剤に溶解するが水には溶解しない性質を有
するものをいい、魚油を含む各種の動物性脂肪や植物性
脂肪をはじめ、リン脂質や油性ビタミン類などがこれら
に含まれる。これらの脂溶性成分は、通常、生物体をは
じめ、様々な天然物の構成成分として存在するが、それ
らより分画、濃縮、あるいは精製されたり合成されたり
する場合もある。

【００２６】本発明における抗原とは、非自己として認
識され、自己と区別される性質を有する成分、およびそ
の成分を含有する物質の総称をいう。例えば、身近な物
としては、たん白質やペプチド、およびそれらを構成成
分とする食物や花粉などを挙げることができる。ペプチ
ドは、たん白質の加水分解物でもよく、合成品でもよ
い。また、たん白質は遺伝子操作によって得られたもの
でもよい。

【００２７】これらの抗原は、脂溶性成分が除去されて
いる方が好都合であるが、上記条件を満たす範囲となる
ように脂溶性成分の含有量が低減されていれば、必ずし
も精製する必要はない。本発明による免疫寛容の誘導方
法は、経口摂取によって行うことができるため、経皮的
減感作療法のような苦痛を伴うことがなく、簡便に実施
することができる。このような免疫寛容の誘導方法は、
食物アレルギーや花粉アレルギー等の各種のアレルギー
疾患の予防や治療、および臓器や組織の移植における拒
絶反応を減弱する上で、極めて有用である。なお、免疫
寛容の誘導に係る本発明の方法は、ヒト以外の哺乳動物
を対象とする。

【００２８】次に、本発明の免疫寛容誘導食品キットお
よび免疫寛容誘導剤キットについて説明する。本発明の
免疫寛容誘導食品キットは、脂溶性成分を含まない抗原
含有調製物と、脂溶性成分の含有量の少ない、または脂
溶性成分を含まない抗原不含調製物とから構成される。
抗原含有調製物は、抗原を含有し、かつ脂溶性成分を含
まないものであればいかなるものであってもよく、抗原
の種類も特に限定はされない。

【００２９】このような抗原含有調製物としては、例え
ば、牛乳たん白質、卵白、大豆たん白質などに代表され
る食物たん白質の単離物をはじめ、花粉やダニ、家塵等
からのたん白質抽出物、およびそれらの加熱変性物や部
分加水分解物、あるいは合成ペプチドやそれらの混合物
が挙げられる。さらに、適当な糖質やビタミン類、およ
び電解質を強化した栄養組成物であってもよい。これら
の抗原含有調製物は、必ずしも単離物や精製物である必
要はなく、脂溶性成分の含有量が本発明の条件を満たす
範囲となるように除去されていればよい。従って、遠心
分離を繰り返し、乳脂肪を十分除去した脱脂乳や、卵黄
の混入を十分避けて調製した卵白、あるいはこれらの混
合物であってもよい。

【００３０】抗原不含調製物は、抗原を含まず、かつ脂
溶性成分の含有量が少ないか、脂溶性成分を含まないも
のであればいかなるものであってもよい。脂溶性成分の
具体的な含有量は、上記抗原含有調製物の摂取時より起
算して、前４時間以内、好ましくは８時間以内、後２時
間以内、好ましくは４時間以内における脂溶性成分の摂
取量が、哺乳動物の体重kg当たり0.1 ｇ以下、好ましく
は0.05ｇ以下となるような量である。

【００３１】このような抗原不含調製物は、抗原含有調
製物の摂取によって免疫寛容を誘導する際、事前に摂取
した食品の脂溶性成分の影響を回避するとともに、栄養
を補給し、空腹を満たす役割を有し、例えば、上記の条
件を満たす飲料水や通常の食品または飼料、あるいはア
ミノ酸混合物の水溶液、水溶性ビタミン溶液、電解質補
給溶液、糖質補給溶液などが該当する。

【００３２】この免疫寛容誘導食品キットを使用するに
は、少なくとも前４時間以内に脂溶性成分含有食品を摂
取した場合には、まず抗原不含調製物を摂取する。乳児
の場合には空腹を満たすことができる。脂溶性成分含有
食品の摂取時より４時間以上、好ましくは８時間以上経
過した随意の時に抗原含有調製物を摂取する。抗原含有
調製物の摂取時より起算して、それ以降の少なくとも２
時間以内、好ましくは４時間以内は、脂溶性成分含有調
製物の摂取を避けるか、あるいは抗原不含調製物を代替
として摂取する。この処置以降は、脂溶性成分含有食品
の摂取が可能である。乳児では、母乳の授乳が可能であ
る。母乳が与えられない場合には、市販のアレルギー疾
患用ミルクの授乳が可能である。

【００３３】これを１サイクルとして、ある期間継続的
または断続的に実施する。抗原の摂取量と所要期間には
個体差があり、一概に特定することは難しいが、免疫学
的な手法によって寛容の成立が十分確定できるまで実施
する。当然のことではあるが、寛容が誘導されるまでの
期間、対象となる抗原の暴露は回避し続けなければなら
ない。このように本発明の免疫寛容誘導食品キットを使
用することより、効果的に免疫寛容を誘導することがで
きる。

【００３４】本発明の免疫寛容誘導剤キットも同様に、
脂溶性成分を含まない抗原含有調製物と、脂溶性成分の
含有量の少ない、または脂溶性成分を含まない抗原不含
調製物とから構成され、経口的に摂取することができ
る。抗原含有調製物は、抗原を含有し、かつ脂溶性成分
を含まないものであればいかなるものであってもよく、
抗原の種類も特に限定はされない。このような抗原含有
調製物としては、例えば上記免疫寛容誘導食品キットの
抗原含有調製物と同様のものを用いることができる。

【００３５】抗原不含調製物は、抗原を含まず、かつ脂
溶性成分の含有量が少ないか、脂溶性成分を含まないも
のであればいかなるものであってもよい。脂溶性成分の
具体的な含有量は、上記抗原含有調製物の摂取時より起
算して、前４時間以内、好ましくは８時間以内、後２時
間以内、好ましくは４時間以内における脂溶性成分の摂
取量が、哺乳動物の体重kg当たり0.1 ｇ以下、好ましく
は0.05ｇ以下となるような量である。

【００３６】このような抗原不含調製物としては、例え
ば、上記の条件を満たすアミノ酸混合物の水溶液、水溶
性ビタミン溶液、電解質補給溶液、糖質補給溶液及びこ
れらの各種混合溶液などが挙げられる。剤型は液体のほ
かに、粉末、タブレット、カプセル等、特に限定されな
い。この免疫寛容誘導剤キットを、上記免疫寛容誘導食
品キットと同様の方法によって使用することにより、効
果的に免疫寛容を誘導することができる。

【００３７】本発明の免疫寛容誘導剤キットは、毒性が
全くないか、または極めて低く、後述する実施例９のキ
ットＡ 1,000mg／日及びキットＢ 1,000mg／日をマウス
（６週齢の雌 ddY，日本ＳＬＣから購入後、自家繁殖）
に対して強制経口投与したが、急性毒性は全く認められ
なかった。

【００３８】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。なお、以下の実施例では、抗原として牛
乳たん白質、脂溶性成分として食物油脂を用いている
が、本発明における抗原は牛乳たん白質に限定されるも
のではなく、また脂溶性成分も食物油脂に限定されるも
のではない。

【００３９】〔実施例１〕マウス（６週齢の雌 ddY，日
本ＳＬＣから購入後、自家繁殖；以下同じ。）に摂取さ
せる試料溶液として、以下の３種類を調製した。 ｗ液：イオン交換水 ａ液：乳清たん白質の12.5％水溶液 ｅ液：乳清たん白質12.5％と大豆油１％を含む乳化液

【００４０】各群５匹のマウスからなる３群（Ｗ，Ａ，
Ｅ群）に、飲料水として、対応するアルファベットの試
料溶液を14日間自由摂取させた。この間、１匹のマウス
が１日に摂取する試料は、平均して５mlであった。15日
目に、乳清たん白質0.1 ％の生理食塩水溶液１容とフロ
インドの完全アジュバント１容とからなる乳化液0.1ml
を、マウスの腹腔に免疫した。29日目に、フロインドの
不完全アジュバントを用いて、同様に免疫した。試料溶
液の摂取開始日より起算して36日目に尾静脈より採血
し、ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)法で、
血清中の抗−乳清たん白質抗体価を測定した。

【００４１】測定結果を、図１のグラフに示す。非経口
的に乳清たん白質を免疫した場合、予め同一のたん白質
を水溶液で摂取させておいたＡ群では、特異IgG とIgE
抗体価は、抗原不含のイオン交換水を摂取させたＷ群の
抗体価に比して有意に低かった。Ａ群では、摂取した乳
清たん白質によって、非経口免疫に対する寛容が誘導さ
れていた。

【００４２】一方、油脂とともに乳清たん白質を予め摂
取させたＥ群では、特異IgG とIgE抗体価は、抗原不含
のイオン交換水を与えたＷ群とほぼ等しく、Ａ群に比し
て有意に高値であった。Ｅ群では、免疫寛容の抑制が認
められた。これらの結果から、脂溶性成分の摂取は、経
口抗原による免疫寛容の誘導を抑制し、その後の非経口
免疫に対する免疫応答を維持することが示された。

【００４３】〔実施例２〕マウスに摂取させる試料溶液
として、以下の５種類を調製した。 ｗ液：イオン交換水 ａ液：乳清たん白質の0.5 ％水溶液 ｅ液：乳清たん白質0.5 ％と大豆油１％を含む乳化液 ｃａ液：カゼインの0.5 ％水溶液 ｃｅ液：カゼイン0.5 ％と大豆油１％を含む乳化液

【００４４】各群５匹のマウスからなる５群（Ｗ，Ａ，
Ｅ，ＣＡ，ＣＥ群）に、飲料水として、対応するアルフ
ァベットの試料溶液を14日間自由摂取させた。摂取開始
日より起算して８，15，22，36，57日目に尾静脈より採
血し、血清中の抗−乳清たん白質抗体価および抗−カゼ
イン抗体価をELISA 法で測定した。

【００４５】測定結果を、図２のグラフに示す。たん白
質を水溶液で与えたＡ群とＣＡ群の血清特異抗体は、抗
原不含のイオン交換水を与えたＷ群の血清特異抗体と同
様に、57日目まで検出されなかった。一方、抗原を乳化
液として油脂とともに与えたＥ群およびＣＥ群では、15
日目以降になると、明らかな抗体産生が認められるよう
になった。このように、脂溶性成分の摂取は、経口抗原
による免疫寛容の誘導を抑制し、その後の経口的再刺激
に対する免疫応答を維持することが示された。また、脂
溶性成分のこの作用は、抗原の高次構造の違いに関係な
く発揮されることが示された。

【００４６】〔実施例３〕マウスに摂取させる試料溶液
として、以下の４種類を調製した。 ｗ液：イオン交換水 ｆ液：育児用調製粉乳（ＦＫ−Ｐ，明治乳業）の12.5％
溶液 ｈａ液：分子量１万以下の乳清たん白質トリプシン水解
物12.5％を含む水溶液 ｈｅ液：分子量１万以下の乳清たん白質トリプシン水解
物12.5％と大豆油１％を含む乳化液

【００４７】ｈａ液およびｈｅ液におけるトリプシン水
解物は、以下のようにして調製した。分離乳清たん白質
（Davisco International Inc., USA ）の５重量％水溶
液50kgを調製し、45℃に加熱後、３Ｎ水酸化ナトリウム
によってpH8.0 とした。これにブタトリプシン（PTN 6.
OS, NOVO, デンマーク）を基質に対し１重量％添加し、
pH8.0 、45℃で撹拌しつつ３時間酵素反応を行った。反
応終了後、３Ｎ塩酸を用いてpH7.0 に調整し、プレート
式熱交換機による120 ℃15秒間の瞬間加熱を行い、酵素
を失活した。この酵素分解液を分画分子量１万の限外濾
過膜を使用した濾過装置にかけ、透過液を凍結乾燥し、
分子量１万以下の乳清たん白質トリプシン水解物を得
た。

【００４８】各群５匹のマウスからなる３群（Ｗ，Ｈ
Ａ，ＨＥ群）に、飲料水としてｆ液を14日間自由摂取さ
せた。15日目より14日間、各群に対応するアルファベッ
トの試料溶液を自由摂取させた。ｆ液摂取開始日より起
算して８，15，22，29，43，64日目に尾静脈より採血
し、血清中の抗−乳清たん白質抗体価をELISA 法で測定
した。

【００４９】測定結果を、図３のグラフに示す。調製粉
乳溶液の摂取を中止した後の特異抗体価は、トリプシン
水解物を油脂とともに摂取させたＨＥ群では、64日目に
やや低下した。一方、トリプシン水解物を水溶液として
与えたＨＡ群と、抗原不含のイオン交換水を与えたＷ群
では、抗体価の低下は29日目より認められるようにな
り、ＨＥ群より早かった。しかもその程度は、ＨＡ群の
方が顕著な傾向にあった。このように、既に抗原感作が
成立し、抗体産生の見られる状態に対して、抗原の部分
分解ペプチドの経口投与によって寛容を誘導しようとす
るとき、脂溶性成分の摂取は、その寛容の誘導を強く抑
制することが示された。

【００５０】〔実施例４〕実施例１と同様の試料溶液ａ
液およびｅ液を調製した。 ａ液：乳清たん白質の12.5％水溶液 ｅ液：乳清たん白質12.5％と大豆油１％を含む乳化液

【００５１】各群10匹のマウスからなる２群（Ａ，Ｅ
群）に、飲料水として、対応するアルファベットの抗原
液を７日間自由摂取させた。８日目より、摂取抗原の交
差試験を行った。即ち、各群を群内で５匹づつ２グルー
プに分け、群内の一方のグループには、７日までと同じ
抗原液を、他方のグループには、もう一方の群に与えて
いた抗原液を８日目からさらに14日間自由摂取させた
（Ａａ，Ａｅ，Ｅａ，Ｅｅ群）。摂取開始日より起算し
て８，15，22，29，43，64日目に尾静脈より採血し、血
清中の抗−乳清たん白質抗体価をELISA 法で測定した。

【００５２】測定結果を、図４のグラフに示す。初めの
７日間に抗原を水溶液で摂取したＡ群は、その後油脂と
ともに抗原を与えたＡｅ群においても、Ａａ群と同様
に、特異抗体産生の上昇は認められなかった。逆に、初
めの７日間に油脂とともに抗原を与えたＥ群は、その後
油脂を含まない水溶液の抗原を与えたＥａ群において
も、Ｅｅ群と同様に、15日目より特異抗体産生が認めら
れた。

【００５３】このように、抗原による初期感作のときに
油脂が共存すると、免疫寛容の成立が著しく阻害される
ことが明らかとなった。これまでの結果から、免疫寛容
を効果的に誘導するためには、脂溶性成分の摂取量を一
定水準以下に控えるか、脂溶性成分と抗原の摂取の間に
一定時間以上の間隔を設けることが必要と考えられ、以
下に検討した。

【００５４】〔実施例５〕試料溶液として、表１の８種
類（ｅ０，ｅ１，ｅ２，ｅ３，ｅ４，ｅ５，ｅ６，ｅ
７）を調製した。

【００５５】

【表１】

【００５６】各群５匹のマウス（平均体重25ｇ）からな
る８群に、１匹当たり0.2 mlのｅ０〜ｅ７の試料液を１
日１回、７日間、胃ゾンデを用いて投与した（それぞれ
Ｅ０〜Ｅ７群）。８日目からさらに14日間、全てのマウ
スに、最も油脂含量の多いｅ１試料液を自由摂取させ
た。投与開始日より起算して８，15，22，29，43，64日
目に尾静脈より採血し、血清中の抗−乳清たん白質抗体
価をELISA 法で測定した。

【００５７】測定結果を、図５のグラフに示す。初めの
７日間に、抗原とともに与えた油脂量が体重kg当たり0.
5 ｇ以上のＥ１〜Ｅ３群では、15日目において抗体産生
が認められた。その抗体価は、Ｅ１群で顕著であった。
Ｅ２群とＥ３群の抗体価は、その後のｅ１試料液の自由
摂取によって全マウスに認められるようになった。一
方、初めの７日間に、抗原とともに与えた油脂量が体重
kg当たり0.1 ｇ以下のＥ０群とＥ５〜Ｅ７群では、その
後にｅ１試料液を与えても、特異抗体の産生は全マウス
で認められなかった。

【００５８】このように、摂取した抗原に対する抗体産
生の程度は、初期感作期間における油脂の摂取量に強く
依存することが示された。しかも、一定量以下であれ
ば、寛容が優位に働き、その後に多くの油脂を抗原と同
時に摂取しても、その寛容状態が維持されることが明ら
かとなった。

【００５９】より詳細には、初期感作期間において、脂
溶性成分の摂取量を一定の水準以下、即ち体重kg当たり
0.1 kg以下、好ましくは0.05ｇ以下に抑えることによっ
て、その後に脂溶性成分を抗原と同時に摂取しても、効
果的に免疫寛容を誘導できることが示された。

【００６０】〔実施例６〕下記の試料溶液を調製した。 ａ液：乳清たん白質の25％水溶液 ｏ液：卵白アルブミン25％と大豆油50％を含む乳化液 ｅ液：乳清たん白質12.5％と大豆油１％を含む乳化液

【００６１】各群５匹のマウスからなる９群に、胃ゾン
デを用いて、ａ液0.1 mlを７日間、胃内投与した。この
とき、ａ液投与時より起算して−８、−４、−２、−
１、−0.5 、０、＋１、＋２、＋４時間目に相当する時
刻に、ｏ液0.1 mlを胃内投与した（−８Ｈ群〜＋４Ｈ
群）。マウスは、−８時間目より４時間目までの間絶食
させ、固形食に由来する脂溶性成分の摂取を避けた。

【００６２】その後15日目より14日間、全てのマウスに
ｅ液を自由摂取させた。この期間は、固形試料を自由に
摂取させた。投与開始日より起算して８，15，22，29，
43，64日目に尾静脈より採血し、血清中の抗−乳清たん
白質抗体価をELISA 法で測定した。

【００６３】測定結果を、図６のグラフに示す。特異抗
体の産生は、乳清たん白質抗原と油脂とを投与する時間
の間隔が短いほど増大した。最大の亢進効果は、全期間
を通じて同時に投与した０Ｈ群で認められた。一方、−
８Ｈ、−４Ｈ、＋２Ｈ、＋４Ｈ群では、油脂を同時に投
与した以降も含め、全期間を通して特異抗体の産生が認
められなかった。

【００６４】このように、摂取した抗原に対する抗体産
生の程度は、初期感作期間における抗原と油脂の摂取時
間の差に依存することが示された。しかも、ある一定時
間以上の間隔を保つと、寛容が優位に働き、その後に油
脂を抗原と同時に摂取しても、一度成立した寛容状態は
維持されることが示された。

【００６５】より詳細には、初期感作期間に、抗原の摂
取時より起算して一定の時間内、即ち抗原摂取の前４時
間以内および後２時間以内、好ましくは、前８時間以
内、後４時間以内の脂溶性成分の摂取を控えることによ
り、効果的に免疫寛容を誘導できることが示された。

【００６６】〔実施例７〕マウスに摂取させる試料溶液
として、以下の４種類を調製した。 ｗ液：脱イオン水 ｈａ液：分子量１万以下のカゼイン，乳清たん白質，卵
白アルブミン，大豆たん白質のトリプシン水解物をそれ
ぞれ３％づつ含む水溶液 ｈｅ液：分子量１万以下のカゼイン，乳清たん白質，卵
白アルブミン，大豆たん白質のトリプシン水解物をそれ
ぞれ３％づつと、大豆油２％とを含む乳化液 ｅ液：カゼイン、乳清たん白質、卵白アルブミンおよび
大豆たん白質をそれぞれ0.5 ％づつと、大豆油２％とを
含む乳化液

【００６７】ｈａ液およびｈｅ液における水溶液は、以
下のようにして調製した。乳酸カゼイン（New Zealand
Dairy Board, N.Z）、分離乳清たん白質（Davisco Inte
rnational Inc., USA ）、卵白アルブミン（和光純
薬）、大豆たん白質（不二製油、大阪）の５％水溶液10
kgをそれぞれ調製し、45℃に加温後、３Ｎ水酸化ナトリ
ウムによってpH8.0 とした。これにブタトリプシン（PT
N 6.OS, NOVO,デンマーク）を基質に対し１重量％添加
し、pH8.0 、45℃で撹拌しつつ３時間酵素反応を行っ
た。反応終了後、３Ｎ塩酸を用いてpH7.0 に調整し、95
℃で10分間の加熱を行い、酵素を失活した。この酵素分
解液を、分画分子量１万の限外濾過膜を使用した濾過装
置にかけ、透過液を凍結乾燥した。これら分子量１万以
下のトリプシン水解物それぞれを３％ずつ含有する水溶
液を調製した。

【００６８】各群５匹のマウスからなる３群（Ｗ，Ｈ
Ａ，ＨＥ群）に、対応するアルファベットの試料溶液を
１匹当たり0.2 ml、１日１回の頻度で14日間、胃ゾンデ
を用いて投与した。15日目より14日間、飲料水の代わり
にｅ液を全群に自由摂取させた。投与開始日より起算し
て15，22，29，57日目に尾静脈より採血し、それぞれの
たん白質に特異的な血清中の抗体価をELISA 法で測定し
た。

【００６９】測定結果を、図７のグラフに示す。脱イオ
ン水を投与したＷ群の抗体産生は、ｅ液に変更後14日目
に、全てのたん白質に対して認められるようになった。
トリプシン水解物を油脂とともに投与したＨＥ群の特異
抗体価は、全てのたん白質について15日目でわずかに上
昇し、ｅ液変更後７日目より急上昇した。一方、トリプ
シン水解物を水溶液として与えたＨＡ群の抗体価は、57
日目までの全期間を通じて、全てのたん白質について全
く認められなかった。

【００７０】このように、抗原の部分分解ペプチドを寛
容原として経口投与し、寛容を誘導しようとするとき、
脂溶性成分の摂取は、抗原の種類によらず、免疫寛容の
誘導を強く抑制することが示された。これに対し、脂溶
性成分の摂取を控えた場合には、種類の異なる抗原の部
分分解ペプチドの混合物であっても、経口投与すること
によって、効果的に寛容を誘導し得ることが示された。

【００７１】〔実施例８〕マウスに摂取させる試料溶液
として、以下の４種類を調製した。 ｗ液：脱イオン水 ｈｓ液：分子量１万以下の乳清たん白質トリプシン，キ
モトリプシン，パパイン，ニュートラーゼ分解物をそれ
ぞれ３％ずつ含む水溶液 ｈｍ液：分子量１万以下の乳清たん白質トリプシン＋キ
モトリプシン＋パパイン＋ニュートラーゼ分解物を12％
含む水溶液 ｅ液：乳清たん白質２％と大豆油２％とを含む乳化液

【００７２】ｈｓ液における乳清たん白質分解物は、以
下のようにして調製した。トリプシン（PTN 6.OS, NOV
O, デンマーク）、キモトリプシン（800S, NOVO）、パ
パイン（パパイン Ｗ−40，天野製薬，名古屋）および
ニュートラーゼ（0.5L, NOVO）のそれぞれの酵素に対し
て、分離乳清たん白質（Davisco International Inc.,
USA ）の５％水溶液10kgを調製し、45℃に加熱後、３Ｎ
水酸化ナトリウムによってpH8.0 とした。

【００７３】これに、上記各酵素を基質に対して１重量
％となるように別々に添加し、撹拌しながらpH8.0 、45
℃で３時間酵素反応を行った。反応終了後、３Ｎ塩酸を
用いてpH7.0 に調整し、95℃、10分間の加熱を行い、酵
素を失活した。この酵素分解液を分画分子量１万の限外
濾過膜を使用した濾過装置にかけ、透過液を凍結乾燥し
た。これら分子量１万以下の酵素分解物をそれぞれ３％
ずつ含む水溶液を調製した。

【００７４】一方、ｈｍ液における乳清たん白質分解物
は、以下のようにして調製した。分離乳清たん白質（Da
visco International Inc., USA ）の５％水溶液10kgを
調製し、45℃に加熱後、３Ｎ水酸化ナトリウムによって
pH8.0 とした。これに、トリプシン（PTN 6.OS, NOVO,
デンマーク）、キモトリプシン（800S, NOVO）、パパイ
ン（パパイン Ｗ−40，天野製薬，名古屋）およびニュ
ートラーゼ（0.5L, NOVO）を、基質に対してそれぞれが
１重量％となるように添加し、撹拌しながらpH8.0 、45
℃で３時間酵素反応を行った。反応終了後、３Ｎ塩酸を
用いてpH7.0 に調整し、95℃、10分間の加熱を行い、酵
素を失活した。この酵素分解液を分画分子量１万の限外
濾過膜を使用した濾過装置にかけ、透過液を凍結乾燥し
た。これら分子量１万以下の酵素分解物を12％含む水溶
液を調製した。

【００７５】各群５匹のマウスからなる３群（Ｗ，Ｈ
Ｓ，ＨＭ群）に、対応するアルファベットの試料溶液を
１匹当たり0.2 ml、１日１回の頻度で14日間、胃ゾンデ
を用いて投与した。15日目より14日間、飲料水の代わり
にｅ液を全群に自由摂取させた。投与開始日より起算し
て15，22，29，57日目に尾静脈より採血し、乳清たん白
質に特異的な血清中の抗体価をELISA 法で測定した。

【００７６】測定結果を、図８のグラフに示す。脱イオ
ン水を投与したＷ群の抗体産生は、ｅ液に変更後14日目
に認められるようになった。異なる酵素による処理を施
された分解物を投与したＨＭ群の抗体産生は、57日目ま
での全期間を通じて全く認められなかった。同様に、そ
れぞれの酵素分解物の混合物を投与したＨＳ群の特異抗
体価も、57日目までの全期間を通じて全く認められなか
った。

【００７７】このように、２種以上の酵素を同時、また
は連続して使用し、交差反応によって調製した部分分解
ペプチドは、経口投与による免疫寛容の誘導に効果的で
あることが示された。酵素の性質によっては、それぞれ
単独で酵素反応を終了し、失活後、混合物としても有効
であることが示された。

【００７８】〔実施例９〕免疫寛容誘導食品キットの一
例として、表２に示すキットＡおよびキットＢを調製し
た。キットＡは脂溶性成分不含の抗原不含組成物であ
り、キットＢは、免疫寛容の誘導を望む目的抗原を含
む、脂溶性成分不含の組成物である。このキットＡおよ
びＢでは、糖質、ミネラル類およびビタミン類を強化し
たものを使用しているが、これらの強化栄養成分は、必
要に応じて調製することができる。キットの形状も粉
末、液体に限定される必要はなく、用途に応じてタブレ
ット、カプセル等であっても構わない。また、本免疫寛
容誘導食品キットは、免疫寛容誘導剤キットとしても使
用可能である。

【００７９】

【表２】

【００８０】免疫寛容誘導組成物であるキットＢは、単
独で用いることもできるが、キットＢの投与前４時間以
内と投与後２時間以内、好ましくは投与前８時間以内と
投与後４時間以内の脂肪摂取量が、体重１kg当たり0.1
ｇ、好ましくは0.05ｇ以下を維持できない場合には、キ
ットＡと組み合わせて使用することができる。

【００８１】キットＡは、母乳栄養児、あるいはアレル
ギー疾患用ミルクで哺育している人工栄養児や母乳との
混合栄養児にキットＢを与え、経口免疫寛容を誘導しよ
うとする場合に有用である。即ち、キットＢを与える前
４時間以内、後２時間以内に授乳が必要な場合におい
て、その乳が脂溶性成分に富む母乳あるいはアレルギー
疾患用ミルクである場合には、それらに代えてキットＡ
を与えることにより幼児の空腹を満たし、あるいは栄養
補給を行うことができ、キットＢを与える前４時間以
内、後２時間以内、好ましくは前８時間以内、後４時間
以内における脂肪の摂取を確実に回避せしめることが可
能となる。このようにキットＡを利用することによっ
て、キットＢを用いた寛容誘導のための時間帯以外は、
自由に母乳栄養を与えることが可能となる。

【００８２】

【発明の効果】本発明によれば、免疫寛容を効果的に誘
導することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス血清抗−乳清たん白質抗体のELISA 分析
の結果を示すグラフである。

【図２】大豆油含有または不含の乳たん白質を摂取した
マウスの血清特異抗体価の経日変化を示すグラフであ
る。

【図３】調製粉乳摂取後にペプチド溶液を摂取したマウ
スの抗−乳清たん白質抗体価の経日変化を示すグラフで
ある。

【図４】乳清たん白質の水溶液と乳化液とを交差摂取さ
せたマウスの血清抗−乳清たん白質抗体価の経日変化を
示すグラフである。

【図５】乳清たん白質の初期投与時に異なる量の大豆油
を投与したマウスの血清抗−乳清たん白質抗体価の経日
変化を示すグラフである。

【図６】時間差を設けて乳清たん白質水溶液と大豆油を
投与したマウスの血清抗−乳清たん白質抗体価の経日変
化を示すグラフである。

【図７】免疫寛容原として大豆油含有又は不含の混合た
ん白質酵素分解物を摂取したマウスの血清特異抗体価の
経日変化を示すグラフである。

【図８】免疫寛容原として乳清たん白質酵素分解物を摂
取したマウスの血清抗−乳清たん白質抗体価の経日変化
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桑田 有 東京都東村山市栄町１−21−３ 明治乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脂溶性成分または脂溶性成分を含有する
   物質を、抗原と同時には哺乳動物に摂取させないことを
   特徴とする、哺乳動物に対する免疫寛容の誘導方法。
2. 【請求項２】 脂溶性成分または脂溶性成分を含有する
   物質を、抗原の摂取前４時間以内、摂取後２時間以内に
   哺乳動物に摂取させないことを特徴とする、哺乳動物に
   対する免疫寛容の誘導方法。
3. 【請求項３】 抗原の摂取前４時間以内、摂取後２時間
   以内における、脂溶性成分または脂溶性成分を含有する
   物質の摂取量を、哺乳動物の体重kg当たり0.1 ｇ以下と
   することを特徴とする、哺乳動物に対する免疫寛容の誘
   導方法。
4. 【請求項４】 脂溶性成分を含まない抗原含有調製物
   と、脂溶性成分を含まない抗原不含調製物とから構成さ
   れる免疫寛容誘導食品キット。
5. 【請求項５】 脂溶性成分を含まない抗原含有調製物
   と、該抗原含有調製物の摂取時より起算して、前４時間
   以内、後２時間以内における脂溶性成分の摂取量が、哺
   乳動物の体重kg当たり0.1 ｇ以下であることを満足する
   抗原不含調製物とから構成される免疫寛容誘導食品キッ
   ト。
6. 【請求項６】 脂溶性成分を含まない抗原含有調製物
   と、脂溶性成分を含まない抗原不含調製物とから構成さ
   れる免疫寛容誘導剤キット。
7. 【請求項７】 脂溶性成分を含まない抗原含有調製物
   と、該抗原含有調製物の摂取時より起算して、前４時間
   以内、後２時間以内における脂溶性成分の摂取量が、哺
   乳動物の体重kg当たり0.1 ｇ以下であることを満足する
   抗原不含調製物とから構成される免疫寛容誘導剤キッ
   ト。