JPH09196923A - タンパク質試薬としてのガラス／セルロース - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク誤差指示薬及び緩衝液を含有する試
薬片の使用による、水性流体（特に、尿）中のタンパク
質を検出する方法に関する。 【解決手段】 緩衝液及びタンパク誤差指示薬を含む試
薬を水性流体と接触させる該水性流体中のタンパク質測
定法であって、ガラス／セルロースの組み合わせの存在
下での実施を含む方法及びその試験具。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク誤差指示
薬及び緩衝液を含有する試験片の使用による水性流体
（特に、尿）中のタンパク質の検出に関する。より詳細
には、本発明は、試験片基材用の特定の種類の材料（即
ち、ガラス／セルロースの紙）の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】尿中タンパク質の測定は、中枢神経系と
同様に腎臓及び循環系に影響するいくつかの病態の診断
において重要である。尿中のタンパク質を定量的及び定
性的に測定することは、しばしば必要であり、特に糖尿
病及び腎臓疾患の診断において必要である。糖尿病と関
係する主要な尿タンパク質は、分析で最も一般的に求め
られるアルブミンである。

【０００３】尿中タンパク質の測定用の種々の方法が知
られており、そのうち最も簡便な方法は、タンパク誤差
指示薬及び緩衝液を含浸した吸収性の試験片を、少量の
尿で濡らすことを含む。タンパク誤差指示薬は、イオン
化し得る基を含有するｐＨ指示薬であり、該イオン化基
は、タンパク質の存在下で置換されて、検出可能な色変
化を与える。これは、該指示薬がｐＨ変化の影響下に行
うのと同じ色変化であり、ｐＨ増加はタンパク質不在で
指示薬の色の変化を起こし、それにより偽陽性の結果を
生じ得ることから、緩衝液を該試験片に包含させて、そ
れにより、そのようなｐＨ増加を防ぐことが重要であ
る。生物試料中のタンパク質検出用のタンパク誤差指示
薬の用途は、米国特許第５，２７９，７９０号明細書及
び同５，４２４，２１５号明細書に開示されている。

【０００４】種々の材料が、試験片の担体材料として使
用されているが、最も一般的なのはろ紙である。大部分
のろ紙は、通常のセルロース性のパルプ繊維から作られ
るが、一部は、ガラスのような合成繊維又はパルプ繊維
とガラス繊維の混合物から製造される。天然由来の繊維
は、ペクチン酸、ろう質（Waxy substance) 、電解質、
タンパク質及び他の植物成分を異なる度合いで含有する
ため、ガラス繊維又はセルロース繊維とガラス繊維の混
合物から作られたろ紙は、時には、天然のセルロース性
繊維のみを含有するものよりも好まれる。米国特許第
３，８４６，２４７号明細書には、試薬片の基質とし
て、織られるか、又はからみ合わせたガラス繊維（wove
n or matted glass fiber）の用途を記載している。前
述のように、水性流体中のタンパク質測定用試験片の吸
収性マトリックスとして、セルロース／ガラス繊維のろ
紙を用いることにより、一定の利点が見出される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明は、緩衝液及びタンパク誤差指示薬染料
を含浸させた固体担体を含む乾燥試薬片を用いる、水性
流体中のタンパク質を測定する方法（染料とタンパク質
の相互作用の結果、比色定量的に検出可能な応答をもた
らす方法）の改良に関する。該改良は、ガラス／セルロ
ースの紙を固体担体として用いることを含む。

【０００６】さらに、本発明の範囲内に含まれるのは、
水性流体中のタンパク質の試験具であり、その試験具
は、タンパク誤差指示薬及び緩衝液を含有する、担体と
してのガラス／セルロースの紙を含む。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で有益なガラス／セルロー
スのろ紙は、典型的には、標準的な製紙法により製造さ
れ、その方法においては、製紙材料のスラリー、この場
合はガラス及びセルロース性の繊維をスクリーンに送
り、水切りすることにより、乾燥時に、所望の目的に十
分な物理的一体性を有する残分を残すように製造され
る。本発明に有用な典型的ガラス／セルロースのろ紙
は、ガラス繊維約３０〜９０重量％及びセルロース繊維
約１０〜７０重量％を含むであろう；ガラス５０〜７０
重量％からセルロース５０〜３０重量％までの濃度が、
好ましい。ガラス／セルロースの組み合わせのセルロー
スの部分は、カルボキシメチル、ジエチルアミノエチ
ル、スルホキシエチル、トリメチルヒドロキシプロピル
及びそれらの混合（組み合わせ）のようなセルロース誘
導体化基を含有してもよい。

【０００８】該ろ紙は、低濃度のペクチン酸、ろう質又
はタンパク質のような異質な材料、及び電解質を含有し
てもよい。繊維長及び直径は、本発明の実施に対しては
臨界的ではないが、長さ１００〜９００μm(ミクロン）
及び直径２〜５０μm の範囲の繊維が、好ましい。なぜ
なら、この範囲では、多孔性及び引張強さのような該ろ
紙の物理的性質を調整し得るためである。

【０００９】タンパク誤差指示薬は、タンパク質の存在
下で置換されて、検出可能な色変化を与えるイオン化基
を含有するこれらのｐＨ指示薬を包含する。典型的に
は、該タンパク誤差指示薬は、フェノールスルホンフタ
レイン染料である。そのような指示薬の例は、テトラブ
ロモフェノールブルー（ＴＢＢＰ）、５′，５″−ジニ
トロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラ
ブロモフェノールスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴ
Ｂ）、クマシーブリリアントブルー、ファーストグリー
ンＦＣＦ、ライトグリーンＳＦ、ピロガロールレッド及
びピロカテコールバイオレットである。

【００１０】接触中の液体が塩基性を増すと、該タンパ
ク誤差指示薬は、典型的に呈色反応を与える。こうし
て、ＤＩＤＮＴＢは、２．１以上のｐＨ値では無色から
青色へ変化し、ＴＢＰＢは、pH３．７を越えると黄色か
ら青色へ変化し、該色変化のため、尿のようにかなり高
いｐＨ値を有する流体を試験する場合、緩衝液が必要と
される。これは、該タンパク誤差指示薬が、タンパク質
の存在により置換されて検出可能な色変化を与えるイオ
ン化基を含有するためである。前述のように、試験片中
に緩衝液を包含させて、それにより、タンパク質不在で
指示薬の色変化を起こし、偽陽性の結果を与えるｐＨ増
加を防止することが重要である。適切な緩衝液は、クエ
ン酸、リン酸、シトラコン酸、ジグリコール酸、グリシ
ン、マレイン酸、リシン、サルコシン及びベタインを包
含する。酒石酸及び他の緩衝液と組み合わせた酒石酸
は、好ましい緩衝系である。

【００１１】本発明の試験具は、典型的には、試薬系で
含浸したガラス／セルロースのろ紙から切り取った紙片
である。この含浸は、典型的には、２度浸し法で実施す
る。第一回目の浸し液は水又は水と極性有機溶媒の混合
物を含み、その中に、該緩衝液（典型的には、５０〜７
５０mMの濃度で）、並びに場合によりバインダーとして
のポリマー及び緩衝液の浸出防止のみではなく安定性と
湿潤性付与用としての界面活性剤を溶解している。タン
パク質が、イオン化基を置換し、色彩を形成し得るよ
う、タンパク誤差指示薬をプロトン化した形にとどめて
おくため、この浸し溶液のｐＨ値を、１．５〜３．５の
範囲内に保持する。乾燥後、該紙片を、指示薬を溶解し
た第二の有機溶媒溶液に浸す。この溶液は、典型的に
は、０．２〜５．０mMの濃度、そして場合によりルトナ
ール(Lutonal）Ｍ４０、ポリビニルメチルエーテル及び
／又はＫＯＫ１００７１、ポリピレングリコール／カル
ボナートコポリマーのような色彩を強化させる高分子を
溶解している。

【００１２】含浸及び乾燥後、該紙片は使用可能であ
り、使用は、通常、試験片を尿試料へ浸し、そして手作
業により（manually）又はよりよい定量のために反射分
光計を使用して、指示薬の色変化からもたらされる応答
を読みとることを伴う。

【００１３】本発明の実施方法を、以下の例により、よ
り詳細に説明する。

【００１４】

【実施例】

実施例Ｉ ろ紙の切片を１インチ角に切り、これを、２回飽和させ
ることにより、該切片をＴＢＰＢ試薬にする。即ち、最
初に、混合液のｐＨを３．７に維持する緩衝液として
の、クエン酸ナトリウム２００mM及びクエン酸１８０mM
の組み合わせを含有する水性エタノール混合液（水８
１．８％／エタノール１８．２％）に飽和させた。２回
目の飽和は、１０５℃で５分間乾燥後、ＴＢＰＢ指示薬
染料を３．０mMの濃度で含有するエタノール混合液を用
い、そして前述と同様に乾燥することによって行った。

【００１５】乾燥状態で、水のピペッティング後、及び
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）３０mg/dL を含有する水
のピペッティング後に、該試薬正方片を測定した。Beck
manDU-70 分光光度計の測定台上に、該試薬試料を固定
するため、白色のポリスチレン正方片を使用した。

【００１６】それぞれの試薬正方片（乾燥／水／ＨＳ
Ａ）の反射スペクトルを、ラプスフェア(Labsphere）社
（North Sutton, NH）製のRSA BE-70 反射スペクトル分
析装置を用いて測定した。種々な種類のろ紙のバックグ
ラウンド及びタンパク応答を、表１に示した。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】

【００１９】表１中の結果について、バックグラウンド
は、何も含まない水に基づいており、そしてタンパク応
答は、水／タンパクと水の観察の相違に基づいている。
試薬は、理想的には、コントロールよりも、より低いか
又は同等の値のバックグラウンド、及びより大きいタン
パク応答を示すであろう。これは、バックグラウンドが
低くなるほど試験がより特異的となり、即ち、より少な
い高比重尿の干渉現象、及びタンパク応答が大きいほど
タンパク質に対する感度が増大するためである。微小タ
ンパク尿症（microalbuminuria）は、低タンパク質レベ
ルの正確な測定が必要な一例である。本実験では、バッ
クグラウンドの変化及びタンパク応答において、それぞ
れ１００％を示した綿／木の基準ろ紙を、コントロール
として選択した。これらの１００％変化は、１００％の
指定値を有する基準ろ紙から得たバックグラウンド及び
タンパク応答であった。それぞれの紙から得たバックグ
ラウンド及びタンパク応答が、基準に対して、報告され
た。例えば、バックグラウンド１４６％は、基準のバッ
クグラウンドよりも４６％大きい。微小タンパク尿を測
定する際に、増大したタンパク応答は特に重要であり、
そこでタンパク質は、尿中に通常３〜８mg/dL の濃度で
存在し、同様に、タンパク尿の場合にはタンパク質は通
常１５〜３０mg/dL の濃度で存在した。

【００２０】表１より、綿リンター３０％（典型的に
は、繊維長５００〜３，０００μm を有する）及びガラ
ス７０％を含む綿ガラス紙である、ワットマン（Whatma
n Ltd.）社製のF-255-03ろ紙が、一定のバックグラウン
ド（コントロールの１１０％）の維持及びタンパク応答
増大（コントロールの２５１％）の表示の二つの目標点
を達成する最良の結果を与えたことが判る。対照的に、
ガラス繊維ロットＢは、タンパク応答１４３％の変化を
示しつつ、バックグラウンドの増加も示した。バックグ
ラウンドの増加は高ＳＧ尿素を偽陽性として読取ったこ
とに起因し得るため、このバックグラウンドの増加は容
認できない。このスペクトルの他の端は、漂白した軟材
（針葉樹）の木パルプをベースとしたろ紙であり、多少
のバックグラウンドの減少を与えたが、コントロール試
薬と比較して２１％しかタンパク応答の増大を示さなか
った。

【００２１】ろ紙中のガラス及びセルロースの繊維長
は、タンパク応答に重要ではない。繊維長２５〜１００
μm を典型的に有する、微結晶セルロースを、同様に使
用することもできる。しかしながら、繊維長は、確か
に、多孔性及び引張強さのような、紙の物理的性質に影
響する。

【００２２】実施例II もう一つのフェノールスルホンフタレイン染料、５′，
５″−ジニトロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，
６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン（ＤＩ
ＤＮＴＢ）を使用した以外は、実施例Ｉのように、ろ紙
片をタンパク試薬片に調製し、試験した。

【００２３】本実験では、ろ紙を乾燥ＤＩＤＮＴＢタン
パク試薬にし、試薬片に加工し、それをヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）の０〜８mg/dL を含有する尿に浸した
後、バイエル・ダイアグノスティックス(Bayer Diagnos
tics）社製のClinitek-200+ 測定器で試した。ＨＳＡの
添加に先立って、天然由来のタンパク質をすべて除去す
るために、該尿をろ過膜に通してろ過した。

【００２４】該ＤＩＤＮＴＢタンパク試薬を、ろ紙を２
回飽和することによって調製した。その１回目は、緩衝
液（クエン酸ナトリウム）及びポリマー強化剤、並びに
紙の濡れ引っ張り強さを増加させるために、ある場合
は、結合性ポリマー及びポリビニルアルコールを含有す
る水性エタノール混合液であった。水酸化ナトリウム及
び塩酸を用い、該混合液のｐＨを２．１に調整した。該
２回目飽和液は、ＤＩＤＮＴＢ及びポリマー強化剤、即
ち、ルタノールＭ４０及びＫＯＫ１００７１、を含有す
るトルエン／ＴＨＦ混合液であった。該混合溶液を、そ
の要素の役割、使用濃度及び許容得範囲について同定
し、表２に表し、ろ紙を飽和するのに使用した。各飽和
の後、該紙を１０５℃で７分間乾燥した。

【００２５】

【表３】

【００２６】１個のガラスマトリックスのみ及び数種の
セルロースろ紙のみ、並びに、数種の異なるセルロース
／ガラスろ紙を用いて行った、本実験の結果を、表３に
示した。

【００２７】

【表４】

【００２８】表３から、ＴＢＢＰ以外の染料についての
タンパク応答の改善が見られることが確認できた。唯一
の例外、即ち、オルトリン酸セルロース：ガラスは、お
そらくタンパク質と染料との相互作用が阻害されたた
め、タンパク応答を改善し得なかったのであろう。セル
ロース／ガラスの配合へのＰＶＡの添加は、結果を変化
させなかった。

【００２９】本発明は、特定の理論又は操作方法に基づ
いて断言するわけではないが、ガラス／セルロースで観
察される応答の改善は、該マトリックスと該試薬の化学
物質／試料タンパクとの相互作用の減少によると考え
る。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性流体を緩衝液及びタンパク誤差指示
   薬を含む試薬と接触させ、そこで染料とタンパク質の該
   反応が、染料から比色分析による検出が可能な応答が生
   じる水性流体中のタンパク質測定方法であって、ガラス
   ／セルロースの組み合わせの存在下で該方法を実施する
   ことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 該ガラス／セルロースの組み合わせが、
   試薬の担体として用いる、ガラス及びセルロース繊維を
   含む紙である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 該ガラス／セルロースの紙が、ガラス３
   ０〜９０重量％を含み、残りの部分が実質的にセルロー
   スである、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 該ガラス／セルロースの紙が、ガラス５
   ０〜７０重量％及びセルロース５０〜３０重量％を含
   む、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 該組み合わせのセルロースの部分が、誘
   導体化セルロース基を含有する、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 該誘導体化セルロース基が、カルボキシ
   メチル、ジエチルアミノエチル、スルホキシエチル、ト
   リメチルヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であ
   る、請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 該タンパク誤差指示薬が、フェノールス
   ルホンフタレイン染料である、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 該フェノールスルホンフタレイン染料
   が、テトラブロモフェノールブルー、５′，５″−ジニ
   トロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラ
   ブロモフェノールスルホンフタレイン、クマシーブリリ
   アントブルー、ファーストグリーンＦＣＦ、ライトグリ
   ーンＳＦ、ピロガロールレッド又はピロカテコールバイ
   オレットである、請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 該水性流体が、尿である、請求項１記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 水性流体中のタンパク質を測定するた
    めの試験具であって、基材として、緩衝液、及びタンパ
    ク質を包含する水性流体と接触させられて、比色分析に
    より検出が可能な応答を示すタンパク誤差指示薬染料を
    含む、ガラス／セルロースの紙を含むことを特徴とする
    試験具。
11. 【請求項１１】 ガラス／セルロースの紙が、ガラス３
    ０〜９０重量％を含み、残りの部分が実質的にセルロー
    スである、請求項１０記載の試験具。
12. 【請求項１２】 ガラス／セルロースの紙が、ガラス５
    ０〜７０重量％及びセルロース５０〜３０重量％を含
    む、請求項１１記載の試験具。
13. 【請求項１３】 該タンパク誤差指示薬が、フェノール
    スルホンフタレイン染料である、請求項１０記載の試験
    具。
14. 【請求項１４】 該フェノールスルホンフタレイン染料
    が、テトラブロモフェノールブルー、５′，５″−ジニ
    トロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラ
    ブロモフェノールスルホンフタレイン、クマシーブリリ
    アントブルー、ファーストグリーンＦＣＦ、ライトグリ
    ーンＳＦ、ピロガロールレッド又はピロカテコールバイ
    オレットである、請求項１３記載の試験具。