JPH09201190A - 分子育種法による高鉄含量植物およびその作出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】分子育種法により植物の鉄含量を増加させる。 【解決手段】外来フェリチン遺伝子（例，ダイスフェリ
チンｃＤＮＡ）が発現可能に導入された植物細胞。外来
フェリチン遺伝子が発現可能に導入された植物細胞を有
する植物（例，レタス）。上記植物から得られる依然と
して外来フェリチンを発現可能である後代（例，種
子）。外来フェリチン遺伝子を植物細胞内に導入して形
質転換植物細胞を得、該形質転換植物細胞を植物に再生
することからなる鉄含量の増加した植物の作出方法。外
来フェリチン遺伝子を導入した植物細胞を有する植物形
質転換体を得、該形質転換体中の植物細胞に外来フェリ
チン遺伝子を発現させて植物細胞中の鉄含量を増加させ
る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は分子育種法による高
鉄含量植物の作出に関するものである。より詳しくは、
本発明は、分子育種法を利用することにより、外来フェ
リチン遺伝子を導入した植物細胞、植物およびその後
代、ならびに上記植物の作出方法および外来フェリチン
遺伝子を植物に導入して植物中の鉄含量を増加させる方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生物にとって必須元素である鉄は、植物
体においてはフェレドキシン等の機能分子として利用さ
れている他に、フェリチンと呼ばれる、内部に鉄を貯蔵
するタンパク質に存在することが知られている。通常の
金属タンパク質は１分子あたり数個の金属原子と結合し
ているのに対し、フェリチンは１分子あたり最高４５０
０個の鉄原子を貯蔵することができる。このため、植物
体中のフェリチン含有量を高めることで、フェレドキシ
ン等の機能分子に影響を与えることなく、植物体中の鉄
含量だけを増加させることができると考えられる。フェ
リチンは動・植物を問わず生物に広く存在する成分で、
分子量が約４５００００の巨大なタンパク質であり、日
常摂取している肉や野菜の中にも含まれている。また、
ヒトやウマ等のフェリチンはタンパク質の分子マーカー
として市販されているものがあり、植物ではダイズおよ
びトウモロコシ等から遺伝子をクローニングした例も報
告されている〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8222
-8226 (1991), Plant Molecular Biology 19: 563-575
(1992)〕。

【０００３】一方、次代の食物供給手段の一つとして、
野菜工場の開発が現在進められている。野菜工場におけ
る共通した特徴は、温度や光条件の制御による生産性の
向上および安定化を図り、極力外部との交流を遮断する
と共に水耕栽培方式を採用することにより、無農薬で清
浄な野菜生産を可能にしたことである。しかし、このよ
うな野菜工場での栽培を目標にした専用の品種は現在存
在せず、もっぱら土耕栽培で使用されている品種を用い
ているのが現状である。これは、近年の野菜工場の著し
い発達に、従来の交配を基本とした育種が対応できなか
ったことが原因の一つと考えられる。従って、野菜工場
の特質、すなわち物理環境や植物栄養学的な制御技術の
進歩に対応した植物の早期育成が望まれている。

【０００４】野菜工場で栽培される野菜はホウレンソ
ウ、レタス、ミツバ等が主なものである。これらのう
ち、レタスは水耕栽培に適しているため野菜工場におけ
る生産量が多く、市場でもサラダ用等として需要が多
い。レタスは元来ホウレンソウ等に比べて鉄含量が低い
が、シュウ酸等の人体に好ましくない成分は多量には含
んでおらず、品種改良によってレタスの鉄含量を高める
ことができれば、「鉄を豊富に含むサラダ用の野菜」と
いう新しいコンセプトを消費者に提案できるようにな
り、野菜工場用の新品種としての需要が見込まれる。

【０００５】なお、通常の栽培技術として、培養液中の
鉄濃度を上げることにより植物体中の鉄含量を増加させ
ることは知られている。これは、高度な培養液管理を必
要とし、一般には適用しにくい。また、不適切な管理に
より、この栽培技術をレタスに適用しても、鉄含量が増
加しないばかりでなく、高い鉄濃度により生長が阻害さ
れるという弊害が生じる可能性がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、レタ
ス等の植物の鉄含量の増加を分子育種法により可能にす
ることを課題としてなされたものであり、より具体的に
は、外来フェリチン遺伝子を導入した植物細胞、植物お
よび後代、ならびに上記植物の作出方法および外来フェ
リチン遺伝子を植物に導入して植物中の鉄含量を増加さ
せる方法の提供を課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ダイズ由来
のフェリチン遺伝子を外来遺伝子として植物細胞に導入
し、その外来遺伝子の細胞内での発現、形質転換植物体
の再生および該植物体での鉄含量等について検討したと
ころ、このような遺伝子組換えの手法により、植物体中
の鉄含量を増加させ得ることを見出し、さらに鋭意検討
の末、本発明を完成させた。

【０００８】すなわち、本発明は、外来フェリチン遺伝
子が発現可能に導入された植物細胞に関する。また、本
発明は、外来フェリチン遺伝子が発現可能に導入された
植物細胞を有する植物に関する。さらに、本発明は、上
記植物から得られる依然として外来フェリチンを発現可
能である後代に関する。

【０００９】本発明において外来フェリチン遺伝子と
は、形質転換される植物細胞以外の細胞であって、前記
形質転換される植物細胞とは同種であっても異種であっ
てもよい細胞に由来するフェリチン遺伝子のうち、植物
細胞に導入されて鉄を多量に貯蔵できるフェリチンを発
現し得るものを意味する。この外来フェリチン遺伝子に
は、該遺伝子から発現されたフェリチンが活性であれば
（すなわち、該フェリチンが鉄貯蔵機能等の特有の性質
を有すれば）、その塩基配列の一部が遺伝子工学的に改
変された遺伝子や、一の遺伝子に対して縮重の関係にあ
るコドンを有する遺伝子を包含することはいうまでもな
い。また、本発明において植物細胞とは、単一の植物細
胞のみならず、該細胞の集合体で芽や根というような分
化構造を有していないカルスと呼ばれるもの等を包含す
る。本発明において植物とは、上記植物細胞から再生さ
れた完全な植物体およびカルスから該植物体に至る途上
にある不定芽や不定胚等をも意味する。さらに、本発明
において後代とは、上記植物から得られる、次代の植物
体となり得る種子、塊茎、ムカゴ等を意味する。

【００１０】本発明はまた、外来フェリチン遺伝子を植
物細胞内に導入して形質転換植物細胞を得、該形質転換
植物細胞を植物に再生することからなる鉄含量の増加し
た植物の作出方法に関する。

【００１１】本発明において、植物細胞内への外来フェ
リチン遺伝子の導入は公知のあらゆる方法により行い得
るが、例示すれば、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミ
ドに所望の外来フェリチン遺伝子を発現可能に組み込
み、それをアグロバクテリウム・チュメファシエンス(A
grobacterium tumefaciens) またはアグロバクテリウム
・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を介して導入
することができる。Ｔｉプラスミドを用いた場合、外来
フェリチン遺伝子の導入はリーフディスク法により植物
細胞に直接行われ得る。また、植物プロトプラストを予
め調製した後、外来フェリチン遺伝子を保持するプラス
ミドを用いてエレクトロポレーション法、マイクロイン
ジェクション法、ポリエチレングリコール法、直接塗布
法により外来フェリチン遺伝子を植物細胞中に導入する
こともできる。

【００１２】本発明はさらに、外来フェリチン遺伝子を
導入した植物細胞を有する植物形質転換体を得、該形質
転換体中の植物細胞に外来フェリチン遺伝子を発現させ
て植物細胞中の鉄含量を増加させる方法に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の一つの好ましい態様を以
下に示す。しかしながら、本発明が該態様に限定される
ものでないことはいうまでもない。カナマイシン耐性遺
伝子（ＮＰＴ ＩＩ）およびカリラワー・モザイク・ウ
イルスの３５Ｓプロモーターにより転写制御されている
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を有するバイナ
リーベクターのＧＵＳを切除した箇所に７８０塩基対
（ｂｐ）を有するダイズフェリチンｃＤＮＡを連結した
プラスミドｐＢＧ−１を導入したアグロバクテリウム・
チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３９３）の培養懸濁液に、植物、例えばレタス、ミ
ツバ、ブロッコリー、カリフラワー、セロリ、サラダ
菜、キャベツ、ホウレンソウ、ダイズ、ニンジン、キュ
ウリ、トマト、ジャガイモ等のリーフディスクを浸漬し
た後、カナマイシン耐性をマーカーとして形質転換体を
選抜する。その後、必要に応じ、該形質転換体の継代培
養を繰り返し、カルス、不定芽そして植物体、さらには
種子、塊茎等の後代を作出することができる。それら各
工程における条件等は使用した植物等に応じ適宜選択さ
れる。

【００１４】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００１５】実施例１：レタスの形質転換 最初に本実施例で使用される材料および行われる試験の
方法について説明し、次にその試験の結果およびそれに
基づく考察を記載する。 Ａ．材料および方法 Ａ．１ 水耕培養液中の鉄濃度の変化に伴うレタス鉄含
量 （１）レタスの栽培 野菜工場において頻繁に作付けられているリーフレタス
型のレタス（Lactucasativa L，品種：リーフレタスグ
リーン；サカタのタネ）をウレタンキューブに播種し、
２５℃、１６時間日長、１００００ルクスで育苗した
後、２週間目に２５℃に制御した自然光温室内のＮＦＴ
式水耕栽培ベッドへ移植し栽培を継続した。水耕培養液
は１／２濃度の園試処方とし、その中に含まれる鉄の濃
度を０、０．１６、１．６、１６ｍｇ／ｌの４種類に設
定した。なお、１／２濃度の園試処方の鉄濃度は１．６
ｍｇ／ｌである。水耕栽培ベッドへ移植して３０日後に
地上部を約１２ｇ生重採取した。 （２）鉄含量の測定 サンプリングしたレタスの地上部を６０℃の通風乾燥器
で乾燥し、粉砕した試料０．５ｇに濃硝酸５ｍｌを添加
後、試料と硝酸がなじんでから３０％過酸化水素水１ｍ
ｌを加えた。以後、この操作を数回繰り返し、液が透明
になった後に、蒸発乾固させた。これに、１Ｎ ＨＣｌ
２５ｍｌ加え、無機成分を抽出後、濾紙で濾過した液を
河野の方法〔電力中央研究所報告：Ｕ８９０１３（１９
８９）〕に従って、ＩＣＰ（高周波誘導結合型プラズマ
発光分光分析計；セイコー電子工業）分析に供した。

【００１６】Ａ．２ レタスにおけるフェリチン遺伝子
の存在確認 Shure らの方法〔Cell. 35 225-233 (1983) 〕を改変し
て、全ＤＮＡをレタス（品種：リーフレタスグリーン）
の成熟葉から抽出した。まず、成熟葉３ｇを液体窒素存
在下で乳鉢と乳棒で細かく破砕した。そして、抽出液
（０．３５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），０．０２Ｍ ＥＤＴＡ，２％サルコ
シル，５％ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＥＤＴＡ）緩衝液
で飽和させたフェノール，５．０Ｍ尿素）２０ｍｌと１
０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）１．４７ｍｌを
加え、６５℃で５分間静置した後、ゆっくりと室温に戻
した。試料液に等量のフェノール・クロロホルムを加
え、３０分震盪後、スイングローター（ＬＣ−１２０；
トミー社）を用いて２８００ｒｐｍで２０分間遠心分離
した。上清を新しい容器に移し、等量のフェノール・ク
ロロホルムを加え同様な操作を繰り返した。次に遠心分
離後の上清に等量の水飽和エーテルを加え、２０分震盪
した後、再びスイングローターを用いて２８００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した。上清に１／１０量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加した後、エタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを減圧乾燥
後、６００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

【００１７】ＤＮＡ（５μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
で消化後、完全に消化されていることをミニゲルによる
電気泳動で確認した後、アガロースゲル電気泳動によっ
て、ＤＮＡを分離した。次にナイロン膜（Hybond-N⁺ ；
アマルシャム社）にＤＮＡを転写してサザンハイブリダ
イゼーションに供試した。ハイブリダイゼーションには
ジゴキシゲニンでラベルしたダイズフェリチンｃＤＮＡ
（後述）をプローブとしてナイロン膜６０ｃｍ² あたり
４０ｎｇを用いた。プレハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションの温度は６８℃とし、ときどき
攪拌した。検出は、アルカリホスファターゼによる免疫
学的検出法（DIG-ELISA DNA Labeling and Detection K
it; ベーリンガー・マンハイム社製のものを使用）に基
づいて行った。

【００１８】プローブ用のダイズフェリチンｃＤＮＡを
得るために、次項Ａ．３（１）に示すダイズと同様な方
法で栽培し、培養液交換後９６時間の成葉をサンプリン
グして、そこから全ＲＮＡを抽出した。次に、全ＲＮＡ
を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction ）を行った。逆転写反応に
はランダムプライマーを用い、ＰＣＲ反応には表３のプ
ライマーＧ−１、Ｇ−１Ｒを用いた。得られたＰＣＲ産
物をシークエンスすると既知フェリチンシークエンスと
相同性が９４％であったので、以後、このＰＣＲ産物を
プローブとして実験に用いた。

【００１９】Ａ．３ レタスとダイズにおけるフェリチ
ン遺伝子の発現と遺伝子の単離 （１）鉄欠乏に対する発現量の変化 レタス（品種：リーフレタスグリーン）を上記Ａ．１
（１）と同様に播種、育成後、１／２濃度の園試処方培
養液で湛液式栽培した。播種して１ヵ月後に鉄を除いた
１／２濃度の園試処方培養液と交換した。さらに５日経
過後、１／２濃度の園試処方培養液と交換した。この時
点を０時間として、以後、１２、２４、４８時間後に成
葉１ｇをサンプリングした。ダイズ（Glycine max ，品
種：北の四季；大谷種苗園）についても同様な実験を行
い、成葉のサンプリングを行った。ただし、ダイズの場
合は１２時間後のサンプリングは行わなかった。サンプ
ルを液体窒素中で破砕した後、２ｍｌのグアニジンチオ
シアネート液を加え、ホモジナイザーで２分間処理した
後、処理液を１００００ｒｐｍで１０分間室温にて遠心
分離した。上清１．４ｍｌに対しＣｓＣｌ０．７ｇを加
え完全に溶解させた。その後、５．７Ｍ ＣｓＣｌ０．
８ｍｌに重層した。スイングローター（ＴＬＳ５５；ベ
ックマン社）を用い５５０００ｒｐｍで３時間、２０℃
にて超遠心分離を行った。沈澱を蒸留滅菌水に溶解した
後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を
加え、エタノール沈澱処理をした。沈澱をＴｒｉｓ−Ｓ
ＤＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１
％ＳＤＳ）溶液１ｍｌに溶解させ、フェノール・クロロ
ホルム抽出を２回およびクロロホルム抽出を１回行い、
再びエタノール沈澱処理を行った。沈澱を３００μｌ蒸
留滅菌水に溶解させ、４０μｇ／μｌとなるように調整
した。得られた全ＲＮＡを１レーンあたり２０μｇずつ
アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ナイロ
ン膜（Ａ．２に記載と同様のもの）へＲＮＡをキャピラ
リーブロットした。ハイブリダイゼーションはG. Engle
r-Blumらの方法〔Anal. Biochem. 210. 235-244 (199
3)〕に準拠した。プローブはＡ．２のサザンハイブリダ
イゼーションに供したものと同じものを使用した。

【００２０】（２）遺伝子の単離と塩基配列の決定 ノーザンハイブリダイゼーションの結果から、最も発現
量の高かった２４時間後のダイズ成熟葉から抽出した全
ＲＮＡをｐｏｌｙ（ｔ）カラムに２回通して、ｍＲＮＡ
を精製した。そして、タンパク質への翻訳開始点から終
結点までを含む領域において増幅が行われるようにＰＣ
Ｒプライマーをデザイン（表３，Ｇ−１，Ｇ−２Ｒ）
し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、逆転写反応のプライ
マーは１６ｍｅｒのｄＴＴＰとした。反応条件は表３の
とおりである。反応終了後、ＰＣＲ産物をゲルから切出
し、ＰＣＲ ＩＩベクター（インビトロゲン社）へ連結
して、塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、蛍光
式オートシーケンサー（３７３Ａ−１８；ＡＢＩ社）を
用いた。

【００２１】Ａ．４ レタスへの外来遺伝子導入法の確
立 （１）外来遺伝子の導入と選抜 構築したプラスミドｐＢＧ−１（図２）をアグロバクテ
リウム（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ）へバイ
ナリーベクター法により導入した。なお、形質転換効率
や、形質転換後の鉄含有量の違いに対して、品種により
影響の表れかたが異なってくる可能性を考慮し、３種の
リーフレタス型のレタス（品種；グリーンウエーブ，マ
ミー：共にタキイ種苗，テルミー：サカタのタネ）を供
試材料とした。無菌播種して５日目のレタスの両端を切
除した子葉をｐＢＧ−１を導入したアグロバクテリウム
培養懸濁液中に５分間浸漬させた。そして、余分な懸濁
液を濾紙で除去後、ＭＳ培地（０．１ｍｇ／ｌ ＮＡ
Ａ，０．１ｍｇ／ｌ ＢＡ）に置床した。２日後、５０
ｍｇ／ｌカナマイシンと１００ｍｇ／ｌセファロリジン
を含有する培地へ外植体を継代した。以後、Enomoto ら
の方法〔Plant Cell Reports 9: 6-9 (1990)〕に従っ
た。形質転換体の選抜には５０ｍｇ／ｌカナマイシンを
用いた。

【００２２】（２）ＰＣＲによる確認 独立した外植体由来の形質転換レタスおよびコントロー
ルとして１／２濃度の園試処方培養液で培養したレタス
（品種；テルミー）から成葉０．１〜０．２ｇ採取し、
サザンハイブリダイゼーションの場合と同じ方法で全Ｄ
ＮＡを抽出し、５０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。１μ
ｌＤＮＡ溶液と各１μｌのプライマー（５０μＭ）２
種、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ４μｌ混合液、×１０ＰＣＲ
緩衝液およびＴａｑポリメラーゼ１ユニットを混合し、
全体の容量を５０μｌに調整した。ＰＣＲ反応は変性９
４℃で１５秒、アニール５５〜６０℃で３０秒、伸長７
２℃で３０秒を３５サイクル行った。ここで用いたプラ
イマー、Ｇ−２、Ｇ−２Ｒ、Ｇ−３、Ｇ−３Ｒの塩基配
列と外来ＤＮＡへの結合領域をそれぞれ表３および図３
（Ｃ）に示す。

【００２３】Ｂ．結果 Ｂ．１ 培養液中の鉄濃度とレタスの鉄含量 培養液中の鉄濃度１．６ｍｇ／ｌで栽培したリーフレタ
ス型レタスの鉄含量は３６μｇ／ｇ乾重となり、文献値
〔四訂日本食品成分表，医歯薬出版（１９８４）〕によ
るクリスプヘッド型レタスの５２μｇ／ｇ乾重に対し
て、乾重率を９．６％とした場合、約７０％の鉄含有量
となった（表１）。しかし、培養液の鉄濃度を１０倍の
１６ｍｇ／ｌにして栽培したレタスの鉄含量は４２７μ
ｇ／ｇ乾重となり、ホウレンソウの文献値（同上）に匹
敵する値を示した。次に、各栽培区での植物体の生育状
況を見ると、鉄濃度１．６ｍｇ／ｌで栽培したレタスに
比べて１６ｍｇ／ｌで栽培したレタスの生長は劣ってお
り、生育の初期段階では、黄化を起こしている個体も見
られた。また、葉端は褐変しており、鉄の過剰によると
考えられる障害を起こしていた。なお、０ｍｇ／ｌおよ
び０．１６ｍｇ／ｌで栽培したレタスは、育苗後、水耕
ベッドへ移植した時点からほとんど生育を示さず、白色
化し枯死する個体も多数見られた。よって、レタス中の
鉄含量を測定することはできなかった。

【００２４】

【表１】

【００２５】Ｂ．２ レタスフェリチン遺伝子とその発
現 レタスにダイズやトウモロコシに存在するフェリチン遺
伝子が存在するか否かを確認するために、既に存在が確
認されているダイズフェリチンｃＤＮＡの部分配列をプ
ローブとしてサザンブロット分析を行った。その結果、
レタス全ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで消化した場合
に８．２ｋｂｐのバンドが１本検出された。コントロー
ルとして用いた未消化ＤＮＡでは、高分子量付近におい
てバンドが検出された。各々のバンドの濃度はほぼ等し
く、かつ、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで消化した場合のバン
ドは１本であったことから、レタスにもフェリチン遺伝
子が存在し、その遺伝子は染色体上の１遺伝子座にのみ
存在することが示唆された。

【００２６】さらに、ダイズやトウモロコシのフェリチ
ン遺伝子では、培養液中の鉄濃度の急激な変化に対して
反応し、発現量が高まることが知られており、レタスの
フェリチン遺伝子についても同様なことが期待された。
そこで、５日間の鉄欠乏状態から急激に鉄を供給するこ
とによって生じる刺激（以後、鉄刺激と記載する，Ａ．
３（１）参照）を与えたレタスおよびダイズの植物体か
らＲＮＡを抽出して、フェリチン遺伝子の鉄刺激に対す
る発現の様子を調べる目的でノーザンブロット分析を行
った。その結果、ダイズでは刺激を与えてから、２４時
間後に発現量が強まり、４８時間後には減少した。ま
た、鉄刺激を与えられていない状態の０時間においても
いくらかの発現を示した。一方、レタスでは、鉄刺激に
よる発現量の変化や、鉄刺激を与えられていない状態に
おいて発現は見られなかった。なお、レタスとダイズの
遺伝子レベルでの相同性を比較すると、タンパク質をコ
ードしている領域の相同性は９５％と高いにもかかわら
ず、このような違いが生じた原因は、遺伝子の制御領域
の違いによるものと考えられる。

【００２７】以上のことから、レタスにはフェリチン遺
伝子が存在しているが、その発現は弱いか、またはダイ
ズとは異なる発現の様式を有することがわかった。この
ことは、培養液の鉄濃度を変化させることによって、フ
ェリチンの発現量を高め、レタスの鉄含量を増加させる
ことが困難なことを示している。

【００２８】Ｂ．３ ダイズフェリチン遺伝子の単離 レタスでは鉄刺激によるフェリチン遺伝子の発現は認め
られなかったので、既に存在が知られているダイズから
遺伝子を単離し、それをレタスに導入することとした。
鉄刺激によって発現量の増加した葉から抽出したｍＲＮ
Ａを鋳型としＲＴ−ＰＣＲによってフェリチンｃＤＮＡ
を合成した。さらに、これらのｃＤＮＡがフェリチンｃ
ＤＮＡであることをサザンハイブリダイゼーションによ
って確認した後、このｃＤＮＡをベクターｐＣＲ ＩＩ
にクローニングし、塩基配列を決定した（図１）。得ら
れた遺伝子は７８０ｂｐであり、ＰＣＲ反応で予定して
いた領域を増幅しており、翻訳開始コドンであるＡＴＧ
と終結コドンのＴＡＧを保持していた。既知ダイズフェ
リチン遺伝子との相同性は９５％であった。また、遺伝
子の配列から予想されるアミノ酸配列の相同性は９４％
だった。さらにアミノ酸配列の比較において、既知配列
と今回得られた配列のうち、親水性や疎水性等の類似の
性質を有するアミノ酸を同じものと仮定した場合、その
相同性は９８％となった。以上の結果から、得られたダ
イズｃＤＮＡはフェリチン遺伝子と結論づけられた。

【００２９】Ｂ．４ ベクターの構築 プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマイシン耐性遺伝子
（ＮＰＴ ＩＩ）およびカリラワー・モザイク・ウイル
スの３５Ｓプロモーターにより転写制御されているβ−
グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を有するバイナリー
ベクターである。このｐＢＩ１２１を制限酵素ＳｍａＩ
とＳａｃＩで消化した後、アガロース電気泳動により分
画し、ＮＰＴ ＩＩを含む断片を回収した（図２）。一
方、フェリチンｃＤＮＡをクローニングしたプラスミド
ｐＣＲ ＩＩを制限酵素ＥｃｏＲ ＶおよびＳａｃＩで
消化後、フェリチンｃＤＮＡを含む断片を回収した。そ
して、ＮＰＴ ＩＩを含む断片とフェリチンｃＤＮＡの
２つのＤＮＡ断片をリガーゼにより連結し、新しくバイ
ナリーベクターｐＢＧ−１を構築した。このｐＢＧ−１
を導入したアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬ
ＢＡ４４０４株（ＡＴ−ｐＢＧ１と命名）は通産省 工
業技術院 生命工学工業技術研究所 特許微生物寄託セ
ンターに１９９６年１月１７日寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３９３の受託番号を有する。

【００３０】フェリチンｃＤＮＡを制御する３５Ｓプロ
モーターは、植物の遺伝子組換え実験において最も汎用
されているプロモーターであり、発現量が大きいこと
と、発現時期や発現する組織の範囲が広いことで知られ
ている。従って、ｐＢＧ−１をレタスへ導入した場合、
３５Ｓプロモーターによりフェリチン遺伝子は恒常的に
発現され、レタス中のフェリチン含量が上昇することが
予測される。さらに、ｐＢＧ−１はＮＰＴ ＩＩを保持
していることから、植物へｐＢＧ−１が導入された場
合、カナマイシンにより選抜することが可能となる。以
上のことから、ｐＢＧ−１を導入後、カナマイシンの選
抜を受けた形質転換レタスは、外来のフェリチン遺伝子
の恒常的な発現により高いフェリチン含有量となり、さ
らに、その結果として、鉄含量が高まることが期待され
る。

【００３１】Ｂ．５ 形質転換体の作出 形質転換体であるカナマイシン耐性個体を選抜する目的
で、Ａ．４（１）に示したようにレタス外植体をカナマ
インシ５０ｍｇ／ｌ含有ＭＳ固体培地で培養した。生長
の早い個体では培養３０日後には不定芽の形成が見られ
た。数回の継代の後、不定芽を切り分け、植物ホルモン
を含まない培地へ移植し、発芽を促した。培養開始後９
０日程度で、馴化可能となった。表２はレタスの品種毎
に遺伝子導入効率を調査した結果であり、カナマイシン
に対しての抵抗性と感受性を表示した。品種によりばら
つきは大きく、供試数に対する抵抗性を示した個体の割
合は２〜１２％であった。選抜の精度に関しては、コン
トロールの個体が１００％感受性を示したことから、品
種間差や、導入した遺伝子が要因となるエスケープ（非
形質転換体に含まれるカナマイシン耐性個体）はほとん
どないものである。

【００３２】以上のことから、選抜したレタスに外来遺
伝子が導入されている可能性が示されたが、さらにこの
ことを確実に示すため、カナマイシン耐性を示したレタ
スから全ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ分析によって２
次スクリーニングを行った。図３（Ｃ）に示した位置に
プライマーがアニールするようにプライマーをデザイン
した。ＮＰＴ ＩＩの検出にはＧ−３、Ｇ−３Ｒプライ
マー、フェリチンｃＤＮＡの検出にはＧ−２、Ｇ−２Ｒ
プライマーを用いた（表３）。予測されるＰＣＲ産物の
サイズはＮＰＴ ＩＩは５９３ｂｐ、フェリチンｃＤＮ
Ａは３８７ｂｐである。ＰＣＲの結果、カナマイシン耐
性レタスから抽出したＤＮＡを鋳型にした場合、両方の
遺伝子共に、予測されるサイズのバンドが検出された。
これに対し、コントロールの非形質転換レタスから抽出
したＤＮＡを鋳型にした場合、両方の遺伝子共に、予測
されるサイズのバンドが検出されなかった。以上の結果
から、カナマイシン耐性レタスは外来遺伝子である、Ｎ
ＰＴ ＩＩおよびフェリチンｃＤＮＡを保持しているこ
とが明らかになった。供試したレタス品種によって、形
質転換効率に相違が見られたが（表２）、カナマイシン
で選抜された個体は、全ての外来遺伝子を保持していた
ことから、供試レタスへの外来遺伝子導入法は確立され
たといえる。

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】

【００３５】Ｃ．考察 Ｃ．１ レタスフェリチン遺伝子 フェリチンは広く生物界に存在していると考えられてい
るが、高等植物では、ダイズやエンドウ等の豆類やトウ
モロコシからしか遺伝子は単離されていない。これらの
植物の種子は子葉が発達した無胚乳種子または特異的に
発達した胚乳を有する種子である。そして、これらの植
物は発芽時に貯蔵している鉄を用いると考えられてい
る。従って、貯蔵器官として特に発達した種子を持たな
いレタス等の植物からフェリチン遺伝子を単離すること
は非常に困難である。なぜならば、遺伝子の単離は通
常、目的のタンパク質を精製後、アミノ酸配列を解読
し、それを基にして類推したＤＮＡを合成、さらにそれ
をプローブとして単離を行うので、レタスのようにフェ
リチンを大量に貯蔵する器官を持たない場合は、遺伝子
の単離が難しくなる。このような状況の中、本発明者
は、初めて豆類やコーン以外の植物のフェリチン遺伝子
の存在を示し、このレタスフェリチン遺伝子は豆類やコ
ーンと同じようにコピー数が少なく、ジーンファミリー
を形成していない可能性を示した。

【００３６】Ｃ．２ レタスフェリチン遺伝子の発現 ダイズとレタスに対して同様な鉄刺激を与えた場合
（Ｂ．２参照）、全く異なる遺伝子の発現を示した。す
なわち、ダイズでは鉄刺激後ｍＲＮＡへの転写が高ま
り、その後、速やかに転写が抑制されたが、レタスの場
合、特に変化は見られなかった。従って、このような鉄
刺激に対しては、レタスフェリチン遺伝子は反応しない
といえる。一方、培養液中の鉄濃度を通常の１．６ｍｇ
／ｌから１０倍の１６ｍｇ／ｌにして栽培した場合で
も、レタスは生育することができ、その際の鉄含量は著
しく増加していた（表１）ことから、レタスにはフェリ
チンが存在する可能性が示唆された。これらの２つの現
象から、レタスではフェリチン遺伝子の発現機構がダイ
ズ等とは異なり、一過的な鉄刺激には反応しないが、継
続的な鉄のストレスに対しては、何らかの反応性を示す
ものと予測される。従って、レタスの場合、フェリチン
の生理的機能として、動物において見られるように、鉄
貯蔵のみならず、鉄の解毒という機能を合わせ持ってい
る可能性がある。

【００３７】Ｃ．３ フェリチン遺伝子を導入したレタ
ス 収穫の２４時間前から高濃度のクエン酸鉄アンモニウム
溶液（鉄濃度１６０ｍｇ／ｌ）に根を浸漬することによ
り、レタス地上部の鉄含量を増加させたことが報告され
ている〔日本土壌肥料学雑誌 ６５：（４）４３６−４
４０（１９９４）〕。この方法は、根の吸水力を利用し
た一過性のものであり、クエン酸鉄アンモニウムによっ
て、根の吸水力が著しく低下しない短時間処理が有効と
考えられている。また、長時間のクエン酸鉄アンモニウ
ム溶液への根の浸漬により鉄塩の過剰障害が観察されて
いる。このことから、遺伝子操作によりレタス中でフェ
リチンを大量に合成し、その中に過剰の鉄を貯蔵させる
ことができる本発明の方法と、上記栽培方法を組み合わ
せることにより、レタスの栽培方法の有効性が格段に向
上するものである。

【００３８】本発明における不定芽形成率（供試数に対
する抵抗性個体の割合）は２〜１２％であったが（表
２）、Enomoto らの結果では２４％であったことが報告
されている〔Plant Cell Reports 9: 6-9 (1990)〕。こ
の形質転換効率の違いは品種間差および外来遺伝子の相
違によると考えられる。

【００３９】これまでレタスの形質転換体作出の報告例
はいくつかみられるが、それらは全て形質転換系の開発
が主目的である。そのため、導入された遺伝子は、選抜
のための抗生物質耐性遺伝子やプロモーターの機能を解
析するためのレポーター遺伝子等である。従って、実際
の農業や野菜工場のために、必要な形質の改良を目的と
した遺伝子の導入は本発明が初めてである。また、レタ
ス以外の植物においては花色を抑制する遺伝子や、耐
病、耐虫性の遺伝子、光合成機能を補強するための遺伝
子等の導入の報告はあるものの、食味や栄養素に着目し
た報告は、貯蔵タンパク質遺伝子以外はほとんどなされ
ておらず、フェリチン遺伝子を人為的に導入することに
よる本発明の形質転換体の作出は、これまでにない新し
い成分育種の可能性を示したものといえる。

【００４０】実施例２：タバコの形質転換 本実施例においても、まず使用される材料および行われ
る試験の方法について説明し、次にその試験の結果等を
記載する。 Ａ．材料および方法 Ａ．１ 形質転換タバコの作出 （１）無菌播種後、プラントボックス内で維持・継代し
ていたタバコ（Nicotiana tabacum c.v. Petit-Havana
SR1 ）から、約７ｍｍ角のリーフディスクを切り出し
た。次に、実施例１に記載したように調製したダイズフ
ェリチン遺伝子を有するプラスミドｐＢＧ１を導入した
アグロバクテリウムの培養懸濁液の濃度が約ＯＤ５９５
＝１になるように培地で希釈し、リーフディスクをその
中に２分間、浸漬させた。リーフディスクは以後、実施
例１に記載の方法に従って選抜を行った。ただし、スク
リーニング用の化合物としてカナマイシンとクラフォラ
ンを使用した。得られた形質転換体の葉０．１ｇからフ
ェノール・ウレア法によりＤＮＡを抽出し、下の（２）
の方法に従うＰＣＲ法にて遺伝子導入を確認した個体
（図４）を以後の実験に供した。形質転換体は１／５０
００ａポットによる土耕と園試処方の培養液を用いた水
耕により栽培した。どちらも開花後、袋を被せ、自殖・
結実させた。

【００４１】（２）ＰＣＲ 葉から抽出したＤＮＡは２０μｇ／ｍｌでＲＮａｓｅを
含むＴＥ緩衝液４０μｌに溶解した。そのＤＮＡ溶液１
μｌを鋳型とし、全液量を５０μｌとして反応を行っ
た。反応条件は下の表４に示す。このＰＣＲに使用した
プライマーは上流側が５’−ＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣ
ＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴ−３’、下流側が５’−ＣＡＴＴ
ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴ−３’である。
また、本試験において使用されるプライマーにより増幅
される断片のサイズは６９８ｂｐであり、形質転換体を
検出するのに適するようにプロモーターの一部とフェリ
チンｃＤＮＡの一部を含むようにデザインされた。

【００４２】

【表４】

【００４３】Ａ．２ 抗体の作成 ダイズフェリチンの構造遺伝子を発現ベクターｐＱＥ３
０（Qiagen社）に連結した後、大腸菌（Escherichia co
li Ｍ１５）に導入した。ＩＰＴＧで誘導することによ
りフェリチンのサブユニットのペプチドを過剰発現させ
た。次に、大腸菌を破壊後、ペプチドを抽出・精製し、
緩衝液をＰＢＳに交換後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりペ
プチドの濃度を測定した。精製したペプチド２００μｇ
をフロイントの完全アジュバントと混合後、ウサギ皮下
に２週間毎に注射した。最後の注射から１週間後に全採
血を行い、血清を採取した。得られた、抗フェリチン抗
血清の特異性をウエスタンブロット法により調べた。そ
の結果、上記抗血清は、ダイズフェリチン遺伝子を組み
込んだ大腸菌から抽出したタンパク質（抗原）と、ダイ
ズから抽出したタンパク質にのみ反応した。しかし、レ
タスやタバコから抽出したタンパク質や、精製したヒ
ト、ウマのフェリチンには反応しなかった（図５）。従
って、本抗血清はダイズフェリチンに対して特異性があ
り、形質転換レタス中の外来遺伝子由来のフェリチンを
検出することが可能であると考えられた。次に、この抗
血清の抗体価をエリザ（ＥＬＩＳＡ）法にて常法に従い
測定した。抗原量０．４〜１００ｎｇにおいて、抗フェ
リチン抗血清との反応は直線性を示し、抗原を４ｎｇと
したとき、抗フェリチン抗血清の希釈倍率は１０³ 〜１
０⁴ において直線性を示した。

【００４４】Ａ．３ タンパク質の検出 タバコおよびレタスの成葉０．１ｇを１．５ｍｌエッペ
ンドルフ型チューブに入れ、抽出液（８０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７），２％ＳＤＳ，２％２−ＭＥ，２０
％グリセロール）と海砂を加え磨砕した。３分間沸騰水
中に入れた後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
たものをタンパク質抽出液とした。 ・ウエスタンブロット分析 試料のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法により
測定し、１２．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。次いで、ゲルからは、
セミブロットシステムにより膜面積１ｃｍ² あたり２．
５ｍＡで９０分間（緩衝液：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０．１９２Ｍグリシン，５％メタノール）イモビロ
ン膜へ電気的にタンパク質を転写した。転写後、膜をＴ
ＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，ｐＨ７．５）で数回洗浄し、５％スキムミルクを
加えたＴＢＳ中４℃で１２時間ゆっくり攪拌しながら、
インキュベートした。膜を０．０５％ツイーン２０を含
むＴＢＳ（以後、ＴＴＢＳと記載する）で１５、１０、
５分間の３回洗浄した。そして、抗フェリチン抗血清を
５％スキムミルクを加えたＴＴＢＳで２０００倍希釈し
た溶液に３０分間入れ、ゆっくり攪拌した。攪拌後、Ｔ
ＴＢＳで上記と同様の時間で３回洗浄した。次に、膜を
ＴＴＢＳで１０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ抗ヤギ血
清溶液で３０分間インキュベートした。再び、ＴＴＢＳ
で上記と同様の時間で３回洗浄した。最後に、染色キッ
トを所定量希釈して、それを膜上にゆっくり注ぎ、静置
した。数分後、反応によるバンドが現れたら、蒸留水で
膜を洗浄し、反応を停止させた。

【００４５】Ａ．４ 鉄含量の測定 頂芽から３、４葉を採取し、６０℃で８日間通風乾燥さ
せた。乾燥した葉を十分に破砕し、０．１ｇを秤量後、
直径１７ｍｍ、高さ１０５ｍｍの試験管に入れた。濃硝
酸を２ｍｌ添加後、６０℃に一昼夜加温して乾燥させ
た。再び、濃硝酸を２ｍｌ添加し、内容物を溶解させた
後、３０％過酸化水素水０．２ｍｌを１時間毎に５回添
加した。添加するときには常温におき、添加後は６０℃
に加温した。最後に、温度を８０℃まで上昇させ、内容
物を完全に蒸発乾固させた。これに、２Ｎ ＨＣｌを
２．５ｍｌ添加し、無機成分を抽出した。抽出溶液５０
μｌを４０倍希釈し、フレームレス原子吸光度計（セイ
コー電子工業）で測定した。

【００４６】Ｂ．結果 Ｂ．１ 外来フェリチン遺伝子の発現 フェリチン遺伝子が導入されたタバコを水耕により栽培
し、最後に培養液を交換した１週間後に葉を採取した。
形質転換タバコではフェリチンサブユニットがウエスタ
ンブロットにより検出されたが、コントロールのタバコ
では検出されなかった（図６）。このことから、導入遺
伝子は、構成的に作用すると考えられている３５Ｓプロ
モーターによって、制御されており、タバコ内でも同様
に構成的に発現されていることがわかった。しかし、個
体間で、全タンパク質あたりのフェリチンサブユニット
量に差があった。これは、導入遺伝子が、タバコの染色
体のどの部分に組み込まれたかによる、位置効果の影響
であると推測される。また、検出された分子量は２６０
００であり、導入遺伝子由来のペプチドの３１０００
（図６のレーンＭ）より小さかった。導入した遺伝子か
ら推定されるペプチドの分子量は３１０００であるが、
この遺伝子にはペプチドの色素体への輸送に必要なシグ
ナルペプチドをコードしていると考えられている塩基配
列を含んでいる。従って、この現象は、形質転換体で発
現したペプチドは翻訳された後、色素体へ運搬され、そ
の場所において内在性のフェリチンと同様に改変された
ことを示唆するものであり、外来遺伝子由来のフェリチ
ンが色素体で機能可能であることが認められた。

【００４７】Ｂ．２ 形質転換タバコの鉄含量 フェリチンの検出の場合と同時に、同じ個体から葉を採
取した。栽培した形質転換タバコと、コントロールの鉄
含量を比較した結果を図７に示す。コントロールは実際
に測定した６個体のうち鉄含量が最大と、最小の価を除
外した４個体を採用した。また、形質転換体は上位４個
体を採用した。コントロールの鉄含量の平均は８８．２
μｇ／乾重ｇ、形質転換体の鉄含量の平均はコントロー
ルの約１２０％の１０７．５μｇ／乾重ｇであった。次
に、両者の平均値の差をｔ−検定により計算したとこ
ろ、５％水準で有意差が認められた。この差は、外来の
ダイズフェリチン遺伝子由来のフェリチンが植物体中で
機能分子として働き、そこに鉄が貯えられたことに起因
するものである。

【００４８】Ｂ．３ 形質転換タバコの形態 上記のようにして得られた形質転換タバコの形態を図８
および図９に示す。これらの図は共に鉢上げ６０日後の
植物体を示すものであり、図８はその葉（形質転換体が
右側であり、左側は未処理のコントロール）を示し、図
９はその草姿〔形質転換体は（Ｂ）、コントロールは
（Ａ）〕を示す。これらの結果から、外来フェリチン遺
伝子導入により形質転換されたタバコ植物体と形質転換
されていない通常の植物体に外観上の差異は認められな
かった。

【００４９】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明は、
分子育種法による高鉄含量植物の作出を初めて可能にし
たものである。より具体的には、本発明は、外来フェリ
チン遺伝子を発現可能に導入することにより、植物の生
長が阻害されることなく、しかも鉄含量が増加した形質
転換植物細胞、形質転換植物体およびその後代、ならび
にそれら植物体等の作出方法および植物体中の鉄含量の
増加方法の提供を可能にした。フェリチンは１分子あた
り最高４５００個もの鉄原子を貯蔵でき、しかも肉や野
菜の日常われわれが摂取している食品に含有されてい
る。このため、本発明は、シュウ酸等の人体に望ましく
ない成分を含むために問題のあったホウレンソウに代わ
る、「鉄を豊富に含むサラダ用野菜」としてのレタスや
ミツバ等を提供することができるものである。また、本
発明は、レタスやミツバ等の水耕栽培に適する植物に容
易に適用できるため、野菜工場における野菜品種の育成
に効果的である。このように、本発明は、無農薬、完
熟、新鮮等の種々の特徴を有する野菜工場での栽培のた
めの専用品種の開発に極めて有効である。さらに、本発
明の分子育種法による高鉄含量植物の作出は、水耕栽培
を主とする野菜工場のみならず、土地耕栽培にも適用可
能であることはいうまでもない。特に、フェリチンは鉄
の貯蔵と共に、植物体外の一過性の鉄の増加や現象に対
する解毒作用ともいうべき緩衝作用があることが報告さ
れているので、従来では作付けが不可能とされている、
土壌中に鉄分の少ない地域や逆に過剰な地域において
も、本発明のフェリチン遺伝子が組み込まれた植物は生
育可能であり、栽培可能であるという利点も有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例において使用されるダイズフェ
リチンｃＤＮＡ、およびそれから予測されるアミノ酸配
列と既知配列との相同性を示す図面である。（Ａ）：本
実施例で得られたダイズフェリチンｃＤＮＡの塩基配
列。タンパク質への翻訳シグナル配列（ＡＴＧ，ＴＧＡ
の太文字で表記）を有する。全長７８０ｂｐ。（Ｂ）：
塩基配列から予測されるアミノ酸配列（上段）と既知ダ
イズフェリチンのアミノ酸配列（下段）。＊は同じアミ
ノ酸、・は類似のアミノ酸を示す。

【図２】本発明の実施例において使用される外来フェリ
チン遺伝子を導入するためのベクターｐＢＧ−１の構築
を示す図面である（Ａｍｐ＋：アンピシリン耐性遺伝
子，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，３５Ｓプ
ロモーター，ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子，Ｎ
ｏｓＴ：ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター）。

【図３】本発明の実施例１において行われたＰＣＲ分析
の結果を示す図面である。（Ａ）カナマイシン耐性遺伝
子および（Ｂ）ダイズフェリチンｃＤＮＡの検出（Ｃ：
非形質転換体，Ｐ：ポジティブコントロール，Ｂ：ブラ
ンク，Ｍ：サイズマーカー）。（Ｃ）：外来ＤＮＡがレ
タス染色体に組み込まれている様子を示す模式図（太線
はＰＣＲプライマーがアニールする位置。影部分と斜線
部分はそれぞれ、レタス染色体およびベクターの非翻訳
領域を示す。ＮｏｓＰ：ノパリン合成酵素遺伝子プロモ
ーター，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，Ｔ：
ノパリン合成遺伝子ターミネーター，３５Ｓ−Ｐ：カリ
フラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター，フェリ
チン：ダイズフェリチンｃＤＮＡ）。

【図４】本発明の実施例２において行われたＰＣＲ分析
の結果を示す図面である。（Ａ）：プラスミドｐＢＧ−
１の物理地図（太線はＰＣＲプライマーがアニールする
位置。ＮｏｓＰ：ノパリン合成酵素遺伝子プロモータ
ー，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，Ｔ：ノパ
リン合成遺伝子ターミネーター，３５Ｓ−Ｐ：カリフラ
ワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター，フェリチ
ン：ダイズフェリチンｃＤＮＡ）。（Ｂ）：ダイズフェ
リチンｃＤＮＡの検出（Ｃ：非形質転換体，Ｐ：ポジテ
ィブコントロール，Ｂ：ブランク，Ｍ：サイズマーカ
ー）。

【図５】本発明の実施例２において作成した抗体の特異
性の検討結果を示す図面である。 （Ａ）：クーマシーブルー染色。（Ｂ）：ウエスタンブ
ロット。Ｍ：マーカー，レーン１：大腸菌に発現させた
ダイズフェリチンサブユニット，レーン２：レタス全タ
ンパク質，レーン３：タバコ全タンパク質，レーン４：
ダイズ全タンパク質，レーン５：ウマフェリチン，レー
ン６：ヒトフェリチン。

【図６】ウエスタンブロットによる通常栽培におけるフ
ェリチンの発現の検出を示す図面である（実施例２参
照）。Ｍ：大腸菌に発現させたダイズフェリチンサブユ
ニット，Ｃ：非形質転換体。

【図７】成熟葉の乾燥重あたりの鉄含量を示すグラフで
ある（実施例２参照）。Ｃ：非形質転換体，Ｔ：形質転
換体（各々４個体ずつの平均±標準誤差を示す）。

【図８】本発明の実施例２で得られた形質転換タバコの
葉を非形質転換体のものと対比して示す生物の形態を示
す写真である。

【図９】本発明の実施例２で得られた形質転換タバコの
草姿を非形質転換体のものと対比して示す生物の形態を
示す写真である。（Ａ）：非形質転換体，（Ｂ）：形質
転換体。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 外来フェリチン遺伝子が発現可能に導入
   された植物細胞。
2. 【請求項２】 外来フェリチン遺伝子が発現可能に導入
   された植物細胞を有する植物。
3. 【請求項３】 請求項２記載の植物から得られる依然と
   して外来フェリチンを発現可能である後代。
4. 【請求項４】 外来フェリチン遺伝子を植物細胞内に導
   入して形質転換植物細胞を得、該形質転換植物細胞を植
   物に再生することからなる鉄含量の増加した植物の作出
   方法。
5. 【請求項５】 外来フェリチン遺伝子を導入した植物細
   胞を有する植物形質転換体を得、該形質転換体中の植物
   細胞に外来フェリチン遺伝子を発現させて植物細胞中の
   鉄含量を増加させる方法。