JPH09201191A

JPH09201191A - ブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ

Info

Publication number: JPH09201191A
Application number: JP1036596A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Taniguchi; 直之谷口; Hisafumi Uozumi; 尚史魚住; Shusaku Yanagiya; 周作柳谷
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-01-24
Filing date: 1996-01-24
Publication date: 1997-08-05
Anticipated expiration: 2016-01-24
Also published as: JP3642361B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ブタ由来の新規な理化学的性質を有する糖転
移酵素、α１→６フコシルトランスフェラーゼを提供す
る。【解決手段】ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６
（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→
４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチ
ド鎖のアスパラギン残基を示す）を受容体として、ＧＤ
Ｐ−フコースから、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→
６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１
→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮ
Ａｃ−Ｒを生成し、至適ｐＨが７．０であり、非還元条
件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量約６０，０００を示
すブタ脳から得られる新規α１→６フコシルトランスフ
ェラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はブタ由来のα１→６
フコシルトランスフェラーゼに関し、詳細にはアスパラ
ギン型糖鎖（Ａｓｎ型糖鎖）の根幹部のＡｓｎに結合し
たＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に、α１
→６結合でもって、ＧＤＰ（グアノシンジホスフェー
ト）−フコースからフコースを転移する酵素であって、
糖鎖の修飾や合成などの糖鎖工学および／または癌など
の疾病の診断に有用なブタ由来の新規なα１→６フコシ
ルトランスフェラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内で種々の重要な生理作用を有する
糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンの糖鎖部分の
構造と機能に関する関心が高まっており、近年、その研
究が盛んに行われている。糖鎖は糖加水分解酵素および
糖転移酵素の作用により形成されるが、その中でも糖転
移酵素が寄与するところが大きい。一般に、糖転移酵素
は糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖
に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素であると定義される
が、その受容体糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、
通常、一つのグリコシド結合は、対応する一つの糖転移
酵素によって形成される。それ故、糖転移酵素は複合糖
質の糖鎖部分の構造研究、特定の糖鎖構造の簡便な合
成、天然の糖鎖構造の修飾など様々な用途への利用、ま
た、糖鎖の人工的な改変による複合糖質あるいは細胞性
質の改変への利用が期待されている。しかしながら、現
在、利用できる糖転移酵素の種類とその供給には限りが
あり、このことが、実用上の大きな障壁となっていた。
これらのことから、基質特異性の明らかな種々の糖転移
酵素の開発と量的供給が望まれているのが実情である。

【０００３】α１→６フコシルトランスフェラーゼは、
細胞内小器官のゴルジ体に存在する酵素であり、アスパ
ラギン結合型糖鎖のプロセッシングを制御する酵素のう
ちの一つであると考えられる重要な酵素である。該酵素
をアスパラギン結合型糖鎖に作用させることで、その制
御機構の解明、糖鎖構造形成の制御等に役立つと考えら
れる。また、肝臓癌や嚢胞性線維症などのいくつかの疾
病におけるα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性の
上昇、本酵素反応生成物の割合の増加が知られており、
該酵素の診断用途としての早急なる開発も望まれてい
る。

【０００４】従来、α１→６フコシルトランスフェラー
ゼは、各種動物の体液あるいは臓器中、各種動物の培養
細胞に活性は検出されているものの、精製された酵素標
品としては、ヒト嚢胞性線維症細胞破砕物由来の酵素
〔ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
(Journal of Biological Chemistry）、第２６６巻、第
２１５７２〜２１５７７頁（１９９１）〕以外には知ら
れてない。しかしながら、この報告では、１）至適ｐＨ
が５．６であって、生理学的ｐＨとは異なる、２）ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が３
４，０００および３９，０００と比較的低分子量であ
る、３）ヒト細胞由来のため大量および安定供給が事実
上、困難であるなどの欠点を有していた。

【０００５】一方、糖鎖の合成法としては、化学合成法
も時として採用されているが、その複雑な合成経路およ
び反応の特異性から、実用上は少糖類の合成に適用され
るに限定されている。特に、受容体基質であるアスパラ
ギン結合型糖鎖の合成は、事実上、困難であった。さら
に、フコースをα１→６結合で、アスパラギン型糖鎖の
Ａｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃに結合させる反応は、非
常な困難性を伴う。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、糖鎖
構造解析、糖鎖工学用試薬、診断薬として、大量にしか
も安定に供給可能なα１→６フコシルトランスフェラー
ゼを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは、該酵素の受容体であるアスパラギン
型糖鎖に類似した蛍光標識された基質を用いることによ
り、フコースをα１→６結合でもって、アスパラギン型
糖鎖のＡｓｎに結合したＧｌｃＮＡｃに結合させる酵素
の検討に着手し、その結果、精製出発材料として入手が
容易なブタ脳の抽出画分に、該酵素活性を検出し、該画
分から該酵素を精製し、その酵素学的および理化学的性
質を解明し、本発明に到達した。

【０００８】すなわち、本発明は下記理化学的性質を有
するブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼであ
る。（１）作用：ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）
を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパ
ラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧ
ｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１
→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１
→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα
１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する。（２）至適ｐＨ：至適ｐＨは、７．０である。（３）ｐＨ安定性：４℃、５時間の処理で、ｐＨ４．０
〜１０．０の範囲で安定である。（４）至適温度：至適作用温度は、３０〜３７℃であ
る。（５）阻害、活性化：活性の発現に、２価金属イオンを
要求せず、また、５ｍＭＥＤＴＡ存在下においても活
性は阻害されない。（６）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）を示す。

【０００９】

【発明の実施態様】本発明の酵素の精製出発材料として
は、フコシルトランスフェラーゼ活性を有するブタの臓
器または体液がある。臓器の具体例としては、例えば、
脳、精巣、膵臓、肺、腎臓等が挙げられる。また、血液
や血清などのブタ体液を用いることもできる。

【００１０】本発明のα１→６フコシルトランスフェラ
ーゼは、例えばブタ脳の破砕物から粗酵素抽出物を調製
し、次に、この粗酵素抽出物から、目的の酵素を分離す
る。この場合、ブタ脳中のα１→６フコシルトランスフ
ェラーゼは、膜結合型酵素であるので、脳破砕物より適
当な界面活性剤を用いて粗酵素抽出液を得ることが通
常、採用される。さらに、この粗酵素抽出液から公知の
精製手段を組み合わせて、精製酵素標品を得ることがで
きる。例えば、限外ろ過膜による濃縮や脱塩、基質類似
体を固定化したアフィニティーカラムクロマトグラフィ
ー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水結合カ
ラムクロマトグラフィーなどの組み合わせにより精製を
行い、他のトランスフェラーゼの夾雑活性のない実質的
に単一の酵素標品を得ることができる。例えば、ブタ脳
をリン酸緩衝液中でワーリングブレンダーを用いて破
砕、超遠心分離により膜画分を集めた後、この膜画分よ
り界面活性剤、トリトン（Triton）Ｘ−１００を含むリ
ン酸緩衝液で目的酵素を抽出し、さらに超遠心分離によ
って上清を集めて、粗酵素抽出液を得ることができる。
ＧＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロース、ＧｌｃＮ
Ａｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍ
ａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４Ｇ
ｌｃＮＡｃ−アスパラギン−セファロース等のアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーに供し、フコシルトラ
ンスフェラーゼ活性を示す各画分を集めて、精製するこ
とができる。

【００１１】本発明の一実施態様であるブタ脳由来のα
１→６フコシルトランスフェラーゼの理化学的性質を下
記に示す。（１）作用：ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）
を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパ
ラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧ
ｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１
→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１
→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα
１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの生成物を与える。

【００１２】（２）活性測定法本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼ活性の測
定は、次のようにして行った。すなわち、糖鎖末端のア
スパラギンを４−（２−ピリジルアミノ）ブチルアミン
〔ＰＡＢＡ：−ＮＨ₂（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−ｐｙｒｉｄ
ｉｎｅ〕で蛍光標識してある下記化１で示される化合物
を酵素活性の測定基質として用いた。該基質を用いるこ
とにより、フコースがα１→６結合で転移した酵素反応
の生成物の高速液体クロマトグラフィーによる蛍光検出
が可能となる。

【００１３】

【化１】〔ＰＡ：ピリジルアミノ基を示す〕

【００１４】具体的な測定方法を以下に述べる。上記化
１で示される受容体蛍光標識基質６２．５μＭ、供与体
基質（ＧＤＰ−フコース）６２５μＭを含む２５０ｍＭ
メス（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ７．０、４０μｌに、試料
液１０μｌおよび１．２５％トリトンＸ−１００を添加
混合する。３７℃で１時間反応させた後、５分間の煮沸
により反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラ
フィーに供し、生成物のピークを蛍光検出器で定量す
る。酵素量１単位は、この条件下で、１分間に１ｐｍｏ
ｌｅのＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮ
Ａｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮ
Ａｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ〔Ｒ
はＡｓｎ−ＮＨ−（ＣＨ₂）₄−ＰＡ〕を生じるものと
した。

【００１５】（３）至適ｐＨ本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、ｐＨ
７．０〜７．５付近に高い活性を示す。（４）ｐＨ安定性本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、ｐＨ
４〜１０で比較的安定であり、特にｐＨ５〜９の間にお
いてより良好な安定性を示す。（５）至適温度本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、至適
温度が３７℃付近に認められ、また、２０〜４０℃の範
囲で十分な作用を保持する。（６）２価金属イオン要求性本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼは、マグ
ネシウム、マンガンなどの２価金属イオンの非存在下で
も十分な活性を示す。さらに、キレート剤であるＥＤＴ
Ａ５ｍＭの存在下でも十分な活性を示す。（７）分子量本発明のα１→６フコシルトランスフェラーゼの精製標
品は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、分子量約６０，０００のところに単一バンドを示
す。

【００１６】以上の性質より判断して、本発明のα１→
６フコシルトランスフェラーゼは、至適ｐＨ、金属イオ
ン要求性、分子量の点で、従来のヒト嚢胞性線維症細胞
由来のα１→６フコシルトランスフェラーゼ（至適ｐＨ
５．６、分子量３４，０００および３９，０００）とは
明らかに相違する新規な酵素である。

【００１７】本発明のα１，６−フコシルトランスフェ
ラーゼの期待される用途としては、１）糖鎖構造の改変
と機能解析：アスパラギン型糖鎖に新たにフコースを導
入し、糖鎖構造を人工的に改変することができ、細胞機
能変化や複合糖質のプロセッシング制御機構の解明およ
び糖鎖の役割を解明することができる、２）酵素活性に
よる病変の診断：本酵素活性は腫瘍化に伴う種々の病変
を反映しており、酵素活性を測定することにより癌など
の疾病の診断を行うことができる、３）特異抗体による
病変の診断：本酵素により誘導される特異抗体を用いる
ことにより種々の疾病の診断を行うことができる、など
の極めて有用な用途がある。

【００１８】次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。実施例１（１）ブタ脳の破砕物と粗抽出液の調製ブタ脳、１００ｇを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）中でワーリングブレンダーを用いて破砕
した後、超遠心分離により膜画分を集めた。この膜画分
を、濃度０．５％のトリトンＸ−１００を含む同緩衝
液を用いて、酵素の抽出を行った。抽出操作後、遠心分
離によって上清を集め、粗酵素抽出液とした。

【００１９】（２）粗抽出液からの酵素の精製０．０５％トリトンＸ−１００、５０ｍＭＫＣｌを
含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
で、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン−セファロース
のカラム（トランスフェリン由来のアシアロアガラクト
糖ペプチドカラム）を平衡化し、実施例１で調製した粗
酵素抽出液を供した。非吸着画分に蛋白質が検出されな
くなるまでカラムを同緩衝液で洗浄した後、活性画分
を、１ＭＫＣｌを含む同緩衝液で溶出させた。次に、
酵素の活性画分を限外濾過膜により濃縮、脱塩を行った
後、同緩衝液で平衡化したＧＤＰ−ヘキサノールアミン
−セファロースのカラムに供した。溶出は１００ｍＭＧ
ＤＰを含む同緩衝液により行った。活性画分を集めて限
外ろ過膜で濃縮、脱塩を行うことにより、α１→６フコ
シルトランスフェラーゼを得ることができた。このよう
にして得られたα１→６フコシルトランスフェラーゼ
は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で、分子量
約６０，０００の位置に単一バンドを示し、不純物に起
因する他のバンドはみられず、また、他のトランスフェ
ラーゼ活性もなく、高純度の酵素標品であった。

【００２０】本発明の酵素の至適ｐＨを緩衝液のｐＨを
変化させ求めた結果を図１に示す。該酵素は、ｐＨ７．
０〜７．５付近に高い活性を示した。なお、緩衝液は、
２００ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液（黒丸）を使用し
た。グラフの横軸は本発明により得られるα１→６フコ
シルトランスフェラーゼのｐＨ、縦軸は相対活性（％）
を表す。

【００２１】本発明の酵素のｐＨ安定性についても、同
様に検討した。図２は、該酵素を各緩衝液中でそれぞれ
のｐＨにおいて、４℃、５時間処理した後の残存活性を
示しているが、該酵素はｐＨ４〜１０で比較的安定であ
り、特にｐＨ５〜９の間においてより良好な安定性を示
した。緩衝液は、ｐＨ３．５〜５．５は５０ｍＭ酢酸緩
衝液（黒三角）を、ｐＨ５．５〜７．５は５０ｍＭメ
ス（ＭＥＳ）緩衝液（黒丸）を、ｐＨ７．５〜９．０は
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（白丸）を、ｐＨ９．０
〜１１．５は炭酸水素ナトリウム緩衝液（白三角）を、
それぞれ用いた。グラフの横軸は本発明により得られる
α１→６フコシルトランスフェラーゼのｐＨ、縦軸は残
存活性（％）を表す。

【００２２】本発明の酵素の至適温度は、図３に示すよ
うに３７℃付近に認められ、また、２０〜４０℃の範囲
で十分な作用を保持すると考えられた。また、凍結品は
−２０℃で少なくとも数カ月間は安定にその活性を保持
した。緩衝液は、２００ｍＭメス（ＭＥＳ）緩衝液、ｐ
Ｈ７．０（黒丸）を使用した。グラフの横軸は、処理温
度（℃）、縦軸は、本発明により得られるα１→６フコ
シルトランスフェラーゼの相対活性（％）を表す。

【００２３】多くの糖転移酵素はその活性の発現にマグ
ネシウム、マンガンなどの２価金属イオンを必要とする
が、本発明の酵素はこれらの２価金属イオン非存在下で
も十分な活性を示した。さらに、キレート剤であるＥＤ
ＴＡ５ｍＭの存在下でも十分な活性を示したことから、
２価金属イオンの要求性は示さないと結論した。

【００２４】

【発明の効果】本発明のブタ由来α１→６フコシルトラ
ンスフェラーゼは、公知のヒトα１→６フコシルトラン
スフェラーゼとは、理化学的性質が種々の点で大きく異
なり、より生理学的条件に近い反応至適条件で作用を示
す。したがって、本発明により、糖鎖の修飾や合成など
の糖鎖工学および／または癌などの疾病の診断に、有用
な新規α１→６フコシルトランスフェラーゼを提供する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素の至適ｐＨを示す。

【図２】本発明の酵素の４℃におけるｐＨ安定性を示
す。

【図３】本発明の酵素の至適温度を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記理化学的性質を有するブタ由来α１
→６フコシルトランスフェラーゼ。（１）作用：ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）
を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡ
ｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパ
ラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧ
ｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１
→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１
→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα
１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する。（２）至適ｐＨ：至適ｐＨは、７．０である。（３）ｐＨ安定性：４℃、５時間の処理で、ｐＨ４．０
〜１０．０の範囲で安定である。（４）至適温度：至適作用温度は、３０〜３７℃であ
る。（５）阻害、活性化：活性の発現に、２価金属イオンを
要求せず、また、５ｍＭＥＤＴＡ存在下においても活
性は阻害されない。（６）分子量：約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）を示す。
【請求項２】ブタの脳から精製された請求項１記載の
ブタ由来α１→６フコシルトランスフェラーゼ。