JPH09201200A - 絡み合ったポリマー網状組織による試料混合物中の核酸配列決定鋳型の閉じ込め - Google Patents

絡み合ったポリマー網状組織による試料混合物中の核酸配列決定鋳型の閉じ込め

Info

Publication number
JPH09201200A
JPH09201200A JP8308615A JP30861596A JPH09201200A JP H09201200 A JPH09201200 A JP H09201200A JP 8308615 A JP8308615 A JP 8308615A JP 30861596 A JP30861596 A JP 30861596A JP H09201200 A JPH09201200 A JP H09201200A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
matrix
mixture
polymer
nucleic acid
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8308615A
Other languages
English (en)
Inventor
Ben F Johnson
エフ ジョンソン ベン
Steven M Menchen
エム メンチェン スチーブン
Will Bloch
ブロッホ ウイル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Biosystems Inc
Original Assignee
Perkin Elmer Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perkin Elmer Corp filed Critical Perkin Elmer Corp
Publication of JPH09201200A publication Critical patent/JPH09201200A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 部分配列ＤＮＡ断片をキャピラリーチューブ
に動電学的に導入する間に、部分配列ＤＮＡ断片の分離
を促進するキャピラリー電気泳動システムを提供する。 【解決手段】 鋳型ＤＮＡの移動を遅らせるために有効
な絡み合ったポリマーマトリックスに試料を埋め込み、
キャピラリーチューブ中の分離媒体にキャピラリー電気
泳動試料を動電学的に装填するキャピラリー電気泳動シ
ステム、および方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般にＤＮＡのような核
酸のキャピラリー電気泳動に関し、さらに特に試料溶液
中の核酸鋳型の移動を制限するための試料調製技法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】ゲル電気泳動は蛋白質、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）、およびリボ核酸（ＲＮＡ）のような大き
い生体分子を分離する強力な方法である。ゲル電気泳動
においては、生体分子の混合物は選択されたゲル媒体に
置かれ、ゲルは外部電場にかけられる。ゲルを通る生体
分子の移動速度（ｖ）は電場（Ｅ）の強度、分子の正味
電荷（ｚ）、および媒体の摩擦係数（ｆ）に依存する。
【０００３】ｖ＝Ｅｚ／ｆ この摩擦係数は分子のサイズと形、粘度、および媒体の
多孔性に依存する。ゲルは、より小さい粘度の媒体で小
さい温度勾配によって生じる対流を抑え、そして大きい
分子の移動を抑える分子篩として作用するが、より小さ
い分子を容易にゲルの孔に通して移動させ、これによっ
てサイズによる分離を行うので、電気泳動分離を行うた
めの好ましい媒体となった。ポリアクリルアミドゲル
は、化学的に不活性であり、それらの孔径は所望比のア
クリルアミドおよびメチレンビスアクリルアミド（架橋
剤）、および重合に使用される全単量体濃度を選択して
制御することができるので、一般に分離を行うために選
択される媒体であった。ポリアクリルアミドゲルは一般
的には、電気泳動媒体の存在で、遊離基開始剤を使用し
て、成分単量体の遊離基重合によって生成する。蛋白質
の電気泳動分離は、蛋白質変性の条件下に架橋ポリアク
リルアミドゲル中で行われる場合が多い。例えば、蛋白
質は洗剤溶液、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）に溶解して、メルカプトエタノールまたはジチオト
レイトール処理を行い、任意のジスルフィド結合を減ら
すことができる。ＳＤＳアニオンは２個のアミノ酸残基
に対してＳＤＳ約１分子の割合で蛋白質に結合し、これ
によって変性蛋白質に大きい正味の負の電荷と嵩を与え
る。蛋白質−ＳＤＳコンプレックスの電荷と嵩は天然蛋
白質の質量にほぼ比例する。これによってゲルマトリッ
クス内の蛋白質またはペプチドの置換は分子上の電荷と
サイズを基礎とした分子サイズに関係させることができ
る。核酸の場合には、ほぼサイズに依存する電荷密度を
もち、ゲルマトリックス中の置換はさらに直接、分子の
サイズに関係する。
【０００４】電気泳動コンプレックスは通常、クーマシ
ーブルーのような染料を用いて染色することにより、ま
たは分子が放射活性による標識をつけるときオートラジ
オグラフィーによって視覚化される。グリコシル化およ
び膜蛋白質のような種に見られるものを除いては、ゲル
内の生体分子の置換は分子の質量の対数にほぼ直線的に
比例する。質量が２％ほど小さく相違する蛋白質は電気
泳動によって区別できる場合が多い。
【０００５】迅速な高分解分離を可能にする１つの電気
泳動技法は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）である。１
つのＣＥ法では、キャピラリーチューブは液体電気泳動
媒体で充填され、液体媒体はチューブ内で架橋または温
度固化して非流動性の安定した分離媒体を形成する。試
料量を電気泳動注入によりチューブの一端に引入れ、チ
ューブに電場を印加して媒体を通って分析物を引きだ
す。一般的には、ＣＥによって行われる生体分離は内径
が約５０〜２００ミクロンで、長さが約１０〜１００ｃ
ｍまたはそれ以上の範囲の溶融シリカキャピラリーチュ
ーブを用いる。
【０００６】ポリマー濃度および／または分離媒体の架
橋度は広範囲の分子量および電荷にわたって種の分離を
行うように変えることができる。例えば、約１,０００
塩基よりも大きい核酸断片を分離する際に、１つの好ま
しい温度固化物質がアガロースであり、その場合にアガ
ロースの濃度は、５〜６０キロベースのサイズの範囲で
断片を分離するために、約０.３％から、１００〜３,０
００塩基対の範囲で断片を分離するため、約２％まで変
えることができる。さらに小さい断片、一般的に約１,
０００塩基対よりも小さいものは、通常架橋ポリアクリ
ルアミド中で分離される。アクリルアミドポリマーの濃
度は、１００〜１,０００塩基対の範囲で断片を分離す
るために、約３.５％から、１０〜１００塩基対の範囲
で分離を行うために、約２０％まで範囲を変えることが
できる。蛋白質を分離するため、約３〜２０％の濃度で
の架橋ポリアクリルアミドが一般に適当である。一般
に、分別される分子種が小さい程、高い濃度の架橋ポリ
マーが必要である。
【０００７】上記のタイプの固化電気泳動媒体で得られ
る分離は、小さい分子量種の場合、電気泳動チューブ
内、特にキャピラリーチューブ内で高ポリマー濃度で均
質の、均一のポリマーマトリックスを形成することが困
難なため、制限されていた。チューブ中の高濃度の固化
マトリックスを形成するための１つの一般的方法では、
架橋していない低粘度の形で、高濃度のポリマー溶液を
チューブ内に流体の形で導入する。次にこの流体物質
は、例えば、過硫酸塩および架橋剤の存在で露光するこ
とにより架橋される。
【０００８】高ポリマー濃度では、チューブ内に形成さ
れる重合反応熱勾配は、一様でない反応速度および熱乱
流を生成する傾向があり、マトリックスを不均一にす
る。また、架橋反応中に生成した閉じ込められた気泡が
マトリックス全体に空隙を生成させる。マトリックス中
の非均一性は、特に密接に関係する小さい分子量の種の
中で、達成することができる分解度を制限する。これら
の問題は、高圧でゲル物質を重合化することにより解消
されるが、キャピラリーゲル内で圧をコントロールする
ことは技術的に難しい問題となる。
【０００９】温度固化ゲルの場合には、ポリマーは流体
の形で電気泳動チューブ内に導入され、次にチューブ内
で冷却することによりゲルを固体にすることができる。
しかし、この方法は、必要な温度固化硬化性をもつこと
が知られている寒天およびアガロースのようなポリマー
は、高ポリマー濃度でも、低分子量の種を分離するため
に有効ではないので、小さいペプチドおよびオリゴヌク
レオチドのような低分子量の種を分離するには一般に適
さない。
【００１０】架橋または温度固化マトリックスに関連し
た第２の制限は、ゲル支持体から架橋ゲルマトリックス
を除去することが困難なことである。キャピラリーチュ
ーブ支持体の場合には、この問題はゲル内の分離物質の
回収を妨げ、またキャピラリーチューブの再使用を妨げ
る。キャピラリー電気泳動システムに使用されるゲルマ
トリックスは、歴史的には一般的にアガロースゲルのよ
うな固体ゲルまたは架橋ポリアクリルアミドマトリック
スのような架橋ポリマーマトリックスであった。このよ
うなゲルは泡や空隙なしにキャピラリーチューブに導入
することは難しく、一般にチューブの再利用は不可能で
ある。さらに最近、分離媒体としてポリマー溶液を使用
するキャピラリー電気泳動システムが開示された。米国
特許第５,０９６,５５４号は、「カウンター移動キャピ
ラリー電気泳動による核酸分別」と題して、ゲル中でＤ
ＮＡ移動のそれとは反対方向に電気浸透流によってチュ
ーブを移動するポリマー溶液中でＤＮＡが分別される電
気泳動システムを記述している。他の共有の米国特許第
５,１６４,０５５号は、「高粘度ポリマーマトリックス
および方法」に関し、キャピラリー電気泳動における架
橋ゲルマトリックス用の代用マトリックスとして粘弾性
ポリマー溶液の使用を開示している。他の共有米国特許
第５,１２６,０２１号は、「キャピラリー電気泳動用の
低粘度ポリマー溶液」と題して、選択されたメッシュサ
イズと低溶液粘度をもつ低粘度ポリマー溶液を含むキャ
ピラリー電気泳動チューブを開示している。メッシュサ
イズは一本鎖オリゴヌクレオチドを分離するための５０
〜１００オングストロームから、比較的大きい２本鎖Ｄ
ＮＡ断片または蛋白質を分離するための３００オングス
トロームまたはそれ以上の範囲である。さらにまた１９
９３年１月２１日に出願された共有の米国特許出願第０
８／００３,９６８号は、線状ポリアクリルアミドの低
粘度溶液を使用するキャピラリー電気泳動によるＤＮＡ
配列決定法を開示している。１９９３年１２月１７日に
出願された他の共有米国特許出願第０８／１７０,０７
８号は、ＤＮＡ配列決定に有用な壁被覆剤と篩分剤の両
方として働く低粘度ポリマー組成物を開示している。こ
れらの特許および共有の特許出願はその全体が参考文献
としてここに組み込まれる。
【００１１】さらに最近、粘性のポリマー電気泳動媒体
が開発され、これは安定化ゲルであり、容易にキャピラ
リーチューブから除去され、水性媒体中で凝集したレギ
ュラー代替コポリマーのマトリックスからなる。このコ
ポリマーは、親水性ポリマー部分と疎水性ポリマー部分
からなり、疎水性部分は親水性ポリマー部分によって相
互に分離される。この媒体の特徴は、１）限定された分
子のサイズの範囲で生物ポリマー分子の高分解電気泳動
分離を行うための媒体の能力；および２）コポリマーの
水性分散液の粘度の著しい上昇が観察されるコポリマー
濃度によって限定される共重合凝集転移濃度を超えるコ
ポリマーの濃度である。疎水性ポリマー鎖がどのように
配列されるかによって、コポリマーは櫛またはタフト構
造、ブロック構造、または星形構造をもつことができ
る。この粘性の電気泳動ポリマー媒体は１９９２年９月
２４日に出願された共有米国特許出願第０７／９５０,
８６３号に詳細に記載されており、その全体が参考文献
としてここに組み込まれる。核酸標的、鋳型および、Ｄ
ＮＡプライマー伸長生成物のような部分配列核酸断片被
検体を含む液体核酸配列決定試料混合物を、上記のよう
なアガロースゲルまたはポリマーゲルのようなゲル媒体
を充填したキャピラリー電気泳動チューブに動電学的に
装填することは、被検体の試料をキャピラリー電気泳動
チューブに導入する好ましい方法である。動電学的装填
は好ましくは被検体を導入し、従って実質的に、試料を
濃縮する。しかしながら、キャピラリー電気泳動媒体に
導入された被検体の分量はキャピラリーチューブ中のＣ
Ｅ媒体の注入端面の核酸鋳型蓄積によって限られてい
る。この鋳型蓄積は大きい生体分子でキャピラリーチュ
ーブ端を詰まらせて、被検体が媒体をさらに通過するこ
とを妨げる。この現象は、注入され電気泳動が行われる
部分配列断片の最大量を効果的に制限する。
【００１２】この詰まる問題は、キャピラリー端の目詰
まりが試料成分の進入を封鎖するだけでなく、キャピラ
リーチューブ中に広範囲の泡を生成することになり、伸
長生成物の分離とキャピラリーの導電性の両方を妨げる
ので、キャピラリー電気泳動においては特にきびしい。
例えば、米国特許出願第０７／９５０,８６３号に記載
されているように、櫛形ポリマーゲル媒体を充填した従
来のＣＥキャピラリーチューブが目詰まりするまでの最
大注入時間は０.７ｋＶ（０.４ＩＡＡ）で６０秒であ
り、これは４.５ｋＶで８秒に等しい。キャピラリー電
気泳動チューブのこの目詰まりは、次にはキャピラリー
電気泳動中の分離できる伸長生成物（部分配列断片）の
量を厳しく制限する。
【００１３】キャピラリーチューブの端の目詰まりを解
決する１つの方法はＵＤＧ酵素で脱ピリミジンを行い試
料から鋳型ＤＮＡを効果的に除去することである。この
方法はスウェルドロウらの「ＤＮＡの自動化配列決定用
キャピラリーゲルの安定性」Electrophoresis 1992, 1
3, 475-483 に記載されている。ＵＤＧは、ＤＮＡポリ
メラーゼによって偶然に組み込まれ、またはシトシン脱
アミノによって生成される副次的なウラシル残基を除去
するようにＤＮＡを修正する酵素である。スウェルドロ
ウ法によれば、ウラシルはｄＵＴＰおよびＴＴＰの混合
物の存在でＰＣＲ中に配列決定鋳型に計画的に組み込ま
れる。
【００１４】キャピラリー電気泳動チューブの目詰まり
を解決する他の方法は、試料を導入した直後にキャピラ
リーチューブの鋳型目詰まり末端を切り離すことであ
る。このような切断端は新しい端面を示し、進行中の工
程から緩衝液および／または被検体を導入し、次の試料
をチューブ中に導入する。この工程は、キャピラリーの
長さを短くしてＤＮＡ断片分離の分解と再生が不利にな
る前に、少しの試料を同じキャピラリーチューブに逐次
的に通すことができるのみのこの工程は不利である。あ
るいは、新しいチューブが各試料について使用される。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、キャ
ピラリー電気泳動チューブの入り口端部に導入すること
ができる液体試料中の１または複数の被検体の分量を増
加する方法を提供することである。本発明の他の目的
は、試料溶液中の大きい高分子の移動を遅らせて、さら
に小さい生物分子を電気泳動媒体中に導入する間の時間
を長くする方法を提供することである。
【００１６】さらに本発明の目的は、部分配列ＤＮＡ断
片をキャピラリーチューブに動電学的に導入する間に、
鋳型ＤＮＡの移動を遅らせるために有効な絡み合ったポ
リマーマトリックスに試料混合物を埋め込むことによっ
て、部分配列ＤＮＡ断片の分離を促進するキャピラリー
電気泳動システムを提供することである。本発明の他の
目的は水溶液中で安定な核酸変性剤溶液を提供すること
である。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明のこれらおよび他
の目的は、ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡ伸長生成物を含むＤ
ＮＡ配列決定試料混合物中の絡み合ったまたは凝集オー
プンポリマー網状構造を配合することによって達成され
る。ポリマーマトリックスは絡み合いによってまたはミ
セル相互作用によって安定化された構造の網状組織であ
る。試料構成物は、次に動電学的注入によってキャピラ
リー電気泳動チューブに導入される。
【００１８】さらに特に、本発明のこれらおよび他の目
的は、キャピラリーチューブに被検体を動電学的に装填
または注入する前にＤＮＡ配列決定試料混合物に小濃度
の長い線状ポリマー溶液を導入することによって好まし
く達成される。この長い線状ポリマー溶液は、米国特許
第５,１２６,０２１号に記載するように、ＤＮＡ鋳型の
生体高分子、およびＤＮＡ伸長生成物のような生体分子
を含む試料混合物が統合しまたは埋め込まれる絡み合っ
たオープンポリマー網状組織を生成する。この絡み合っ
たオープンポリマー網状組織はＤＮＡ鋳型生体高分子の
移動を遅らせると同時に、部分配列決定断片、例えばＤ
ＮＡ伸長生成物のようなさらに小さい生体分子の通過を
効果的に自由にさせる。実質的に、絡み合ったオープン
ポリマー網状組織またはマトリックスは、約２,０００
塩基または塩基対（ｂｐ）よりも大きいサイズの大きい
生体分子の移動を優先的に制限する篩分の性質を有す
る。選択された長い線状ポリマーは好ましくは分子量が
２×１０5 と５×１０6 ダルトンの間のヒドロキシエチ
ルセルロース（ＨＥＣ）である。化学的に似ているポリ
マーも使用することができる。
【００１９】好ましくは、ＤＮＡ配列決定試料混合物
は、室温で二本鎖ＤＮＡを変性するため、すなわち二本
鎖ＤＮＡを一本鎖にするために十分な変性剤を含む。好
適な変性剤は尿素、ジメチルホルムアミド、ラクタム、
およびラクトンを含む。さらに好ましくは、変性剤は２
−ピロリジノンである。以下、本発明を詳細に説明す
る。
【００２０】本発明によるシステムと方法は、基本的に
は、試料混合物が埋め込まれる絡み合ったポリマー網状
構造を形成するために有効な分子量を有する線状ポリマ
ーを混合物中に導入することによって、溶媒内の関係す
る生体高分子および生体分子被検体を含む試料混合物に
生体高分子を閉じ込める。網状構造またはマトリックス
は、マトリックスを通って１方向に生体分子を引っ張る
方向に電場を印加するとき、マトリックスを通る生体高
分子の移動を遅らせるために有効なメッシュサイズを有
する。
【００２１】生体高分子は蛋白質、または核酸、特にゲ
ノムＤＮＡ、核酸配列決定鋳型、またはＰＣＲ生成物を
含み、そして一般的に少なくとも５,０００ダルトンの
分子量を有する。少なくとも約２,０００塩基または塩
基対のＤＮＡ配列決定鋳型に対して、分子量は少なくと
も約６×１０5 ダルトンである。さらに特に、本発明に
よる試料混合物中にＤＮＡ配列決定鋳型高分子を閉じ込
める方法は次の工程からなる： ａ）少なくともＤＮＡ鋳型高分子、ＤＮＡ伸長生成物、
および溶媒を含む液体核酸配列決定試料混合物を用意
し、そして ｂ）約２０００塩基よりもサイズの大きい生体分子断片
のみの移動を制限するために有効な篩分の性質を網状構
造が有するＤＮＡ伸長生成物およびＤＮＡ鋳型を含む混
合物中に、絡み合ったオープンポリマー網状構造を配合
することができる線状ポリマーを導入する。
【００２２】本発明は、特に、キャピラリーチューブ中
のゲルのような伸びた分離媒体中で電気泳動により核酸
断片を配列決定するために適している。本発明によるＤ
ＮＡ配列のような核酸配列を決定するための方法は、次
の工程からなる： ａ）比較的高分子量の鋳型核酸分子も含む断片混合物中
に部分配列核酸断片の混合物を生成し； ｂ）電場がマトリックスを横切って配置されるとき、マ
トリックスを通る鋳型核酸分子の移動を優先的に遅らせ
るために有効なポリマーマトリックス中に断片混合物を
埋め込み； ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って配置するとき、こ
のような部分配列断片を分離するために有効な細長い電
気泳動媒体の一端領域と連絡してマトリックスと埋め込
まれた混合物を配置し； ｄ）マトリックスを通って媒体中に通して核酸断片を引
出す方向において、マトリックスおよび前記媒体の他端
領域との間に電場を印加し、これによって電気泳動媒体
に入る部分配列断片の量を実質的に増加させることがで
きる。
【００２３】比較的高分子量の鋳型核酸も含む断片混合
物中の部分配列核酸断片の混合物の電気泳動分離によっ
て、核酸断片の配列決定に使用するための本発明による
電気泳動システムは、次の： １）このような混合物をマトリックス中に埋め込み、電
場をマトリックスを横切って配置するとき、マトリック
スを通って鋳型核酸の移動を優先的に遅らせるために有
効なポリマーマトリックス； ２）電場を媒体の端部領域に印加するとき、このような
部分配列断片を分離するために有効な細長い電気泳動媒
体であって、前記マトリックスと連絡する一端を有する
前記媒体；および ３）核酸断片をマトリックスを通して引出し媒体に通す
方向で、媒体の他端領域とマトリックスとの間に電場を
印加するための装置、から成る。
【００２４】この装置は、キャピラリー電気泳動に一般
に使用されるようなD.C.電圧またはパルス電圧源であっ
てもよい。本発明方法を実施するために適するキャピラ
リー電気泳動システムの簡略化した概略図を図６に示
す。このシステム１０は分離媒体１４を支持するキャピ
ラリーチューブ１２を含む。この媒体は前記のような絡
み合ったポリマー、ゲル、または任意の他の分離媒体で
あってもよい。システム中の陽極コンテナまたは貯蔵器
１６は電気泳動溶液１８を含む。２０で示されるチュー
ブの陽極端は、電気泳動中に、図に示されるように、試
料溶液に浸漬される。電気泳動分離の間に、システム中
の貯蔵器２２はマーカー溶液を含み、または分離される
生体分子の試料溶液２４を含むことができる。この試料
溶液は絡み合ったポリマーマトリックスを含み、試料中
の大きい生体高分子の移動を遅らせる。チューブ１２の
下部陽極端２０を貯蔵器液体（１８または２４）に浸漬
できる位置に配置するために、２個の陽極貯蔵器はカル
ーセル等に収容することができる。ここには示していな
いが、カルーセルは電気泳動行程間または異なる溶液間
のチューブを清浄しフラッシングするための溶液を含む
追加の貯蔵器を収容でき、２種またはそれ以上の溶液を
単一の電気泳動分別法に使用する。
【００２５】チューブ１２の反対側の陰極端２６は、陽
極貯蔵器２８内に密封され、図に示されるように、貯蔵
器２８に含まれる陰極電解液３０に浸漬される。システ
ム１０中の高電圧電源３２は、２個の貯蔵器間に選択さ
れた電位を印加するため、図に示されるように陽極と陰
極貯蔵器１８および２８に連結される。電源リード線は
陽極と陰極の貯蔵器中の白金電極３４、３６に、それぞ
れ連結される。電源は、好ましくは５〜５０ｋＶの間の
電圧設定で、電極を通って一定電圧（ＤＣ）を印加する
ために設計することができる。或いは、または追加し
て、電源は貯蔵器間の選択された頻度のパルス電圧を印
加するように設計することができる。一般に、キャピラ
リーチューブが短い程、印加できる電場強度が高く、電
気泳動分離が一層迅速になる。
【００２６】パルス電圧モードで操作されるとき、電源
は好ましくは約５０ＨｚないしＫＨｚの範囲までの調整
できる周波数で矩形波パルス、および約１０〜３０ＫＶ
のｒｍｓボルト数の出力を出力する。ＭＨｚ範囲におい
てもパルス周波数が高い程幾つかの応用に適することが
できる。図６に示されるシステムの記述を満たすと、チ
ューブ中の光学検出ゾーン４０を通って移動する核酸断
片を光学的にモニターするため、システム中の検出器３
８はチューブの陰極端付近に位置させる。検出器はＵＶ
吸収検出および／または螢光放射検出のいずれかのため
に設計することができる。例えば、フローセルをキャピ
ラリーホルダーと置換して、アプライド・バイオシステ
ムズ（フォスター・シティ、ＣＡ）によって変更された
クラトス７８３ＵＶ吸光度検出器を使用して、ＵＶ吸光
度は一般に２０５〜２８０ｎｍで行われる。螢光放射検
出は好ましくは、下記のように、核酸断片を結合した螢
光種によって、約２４０〜５００ｎｍの間に調整できる
選択された励起波長で行われる。螢光検出器の１例は、
ヒューレット−パッカード（パロアルト、ＣＡ）から入
手でき、キャピラリーチューブ検出のために上記のよう
に変更されたＨＰ１０４６Ａ検出器である。検出器は電
気泳動ピークを記録するため積分器／プロッター４５に
接続される。
【００２７】本発明の追加の局面では、出願人は、ラク
タム、すなわち、環状アミド、および／またはラクト
ン、すなわち、環状エステルが高分解動電学的分離を行
う核酸のための好ましい変性剤であることを見出した。
この性質は、水中での高溶解性と組み合わせて、芳香族
分子用の溶媒として非常に有効であることに由来する。
これら２つの特徴は芳香族核酸塩基も有効に溶解する水
性電解液を形成することができ、これによって核酸中の
相互作用をスタッキングする任意の塩基を破壊する。ラ
クタムは水溶液中で安定性に優れているため、核酸変性
剤としてラクトンよりは好ましい。好ましい核酸変性剤
はＮ−アルキルピロリドン、例えば、Ｎ−エチルピロリ
ドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、およびＮ−シ
クロヘキシルピロリドン、δ−バレロラクタム、ε−カ
プロラクタム、およびＮ−メチル−ε−カプロラクタム
である。さらに好ましいラクタムは２−ピロリジノンお
よび１−メチル−２−ピロリジノンである。種々のラク
タムの比較的実施しやすい数値は融点、密度、水溶性、
および市販品として入手できる純度のような性質にあ
り、応用から応用へと変えることができる。加水分解に
大きく耐えられるだけでなく、ＤＮＡを変性する際に、
１グラム当たりまたは１モル当たりで、一層有効である
ため、Ｎ−メチルピロリジノンおよび２−ピロリジノン
は従来の核酸変性剤、ホルムアミドおよび尿素よりも好
ましい、これらの利点は動電学的分離のための少なくと
も２種類の試薬を改良することができる；核酸を分離装
置に導入するために使用される試料装填溶媒および分離
中に核酸が移動する媒体。実際に、これらの利点は、変
性条件下に核酸を動電学的に分離するための既成用途の
試薬の市販および分配を、初めて可能にする。
【００２８】核酸分離の場合には、また変性溶媒にキレ
ーターを含むことも好ましい。キレーターは第一に過剰
のＭｇ++が核酸に結合することを妨げるのに役立ち、こ
れによってそのコンホメーションと溶解性を変える。好
ましいキレーターはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエ
ーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジ
エチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ",Ｎ"−五酢酸
（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ',Ｎ",Ｎ'",Ｎ'"−六酢酸（ＴＴＨＡ）、およびトラ
ンス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',
Ｎ'−四酢酸（ＣＤＴＡ）を含む。さらに好ましいキレ
ーターはトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−
Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−四酢酸（ＣＤＴＡ）である。
【００２９】本発明による絡み合ったポリマーマトリッ
クス中に埋め込まれた試料混合物を含む試料溶液の１好
適例は、ＤＮＡ鋳型およびプライマー伸長生成物、２−
ピロリジノンと水およびマグネシウムキレーター、例え
ば、ＥＤＴＡからなる溶媒中に溶解した約４×１０6 ダ
ルトンの分子量をもつヒドロキシエチルセルロース（Ｈ
ＥＣ）のような長い線状ポリマー（例えばユニオンカー
バイドＱＰ１００ＭＥ）を含む試料混合物であり、ポリ
マー濃度は生体高分子の電気泳動移動度を制限する値に
調整される。溶液混合物中の線状ポリマーの有効最小濃
度は０.１ないし約０.２パーセントの間である。この濃
度は４.５ｋＶで少なくとも４０秒の注入時間を首尾よ
く達成する。これは従来の動電学的注入時間よりも８の
増加因数である。好ましい溶媒は１０％（wt／wt）と７
０％（wt／wt）の間の２−ピロリジノン水溶液である。
【００３０】
【実施例】以下、実施例に基づき本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 実施例１ ジェイ・アンド・ダブリュ・サイエンティフィック、フ
ォルソム、ＣＡ、カタログ番号１２６−１０１３から入
手したタイプＤＢ−１キャピラリーチューブを用意し
て、長さ50センチに切断した。チューブの内径は50mmで
あった。次にキャピラリーをメタノールと水で洗浄し
た。キャピラリーは次に125mM ボレート−四メチル水酸
化アンモニウム（ＴＭＡ）中の７％Ｃ４Ｆ９／カーボワ
ックス４６００、1.25mMのＥＤＴＡ、6.6 モルの尿素お
よび標準状態で9.0 のｐＨからなるポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）／フッ素化コポリマーゲルを流体力学的
に充填した。50cmのキャピラリーチューブは８分で半分
充填され、そして32分で完全に充填された。
【００３１】最初の試料は、試料溶液中に絡み合ったポ
リマーのないコントロール試料であった。Ｃで終端する
断片の単色配列決定ラダーは、配列決定キットを使用し
てアプライド・バイオシステムズ（パーツ番号４０１１
１９）のプロトコルを付随させるジデオキシ配列決定法
によって用意した。Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ鋳型（ｍ１３
ｍｐ１８（＋）鎖、0.1pモル）を、螢光染料プライマー
（ＦＡＭ Ｍ１３（−２１）プライマーにアニールし
て、３１終止塩基としてジデオキシシチジンを用い、Ｔ
ａｑポリメラーゼを使用してプライマー伸長を行った。
試料を５μlのホルムアミドおよび0.5μlの25mMソジウ
ムＥＤＴＡ、ｐＨ９を含むガラス瓶に入れた。試料は、
５μlのホルムアミドと2.5mMのＥＤＴＡに溶解した0.5p
gのＭ１３鋳型ＤＮＡのＦＡＭ Ｔａｑ Ｍ１３（−２
１）プライマー配列からの反応物を含んでいた。試料を
次に９０℃で２分間加熱した。動電学的注入の前に、チ
ューブに９kV、5.8８μAで、試験準備行程を行った。動
電学的試料注入を0.4μA、0.9kVで、60秒間行い、全部
で24μクーロンのチャージをかけた。得られた電気泳動
図を図１に示す。
【００３２】実施例２ 長さが50cmで直径が50μmのキャピラリーチューブ切片
に、125mMのホウ酸−ＴＭＡ中のＣ４Ｆ９／カーボワッ
クス４６００、1.25mMのＥＤＴＡ、6.6モルの尿素およ
び9.0のｐＨからなる７％ゲルを、実施例１に記載した
ように用意した。この場合の試料は５μlのホルムアミ
ドおよび0.5μlの25mMソジウムＥＤＴＡ、および0.1％
のＱＰ１０ＯＭＨ ＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロー
ス）に溶解した0.5mgのＭ１３鋳型ＤＮＡのＦＡＭ Ｔａ
ｑ Ｍ１３（−２１）プライマー配列からの反応物であ
った。試料溶液は90℃で２分間加熱し、次に動電学的に
キャピラリーチューブに4.5kVで、３μA、20秒間注入し
た。得られた電気泳動図を図２および３に示す。
【００３３】実施例３ 長さが50cmで直径が50μmのキャピラリーチューブに、1
25mMのボレート−ＴＭＡ中のＣ４Ｆ９／カーボワックス
４６００、1.25mMのソジウムＥＤＴＡ、6.6モルの尿素
および9.0のｐＨからなる７％ゲルを用意した。この場
合の試料は５μlのホルムアミドおよび５μlの25mMソジ
ウムＥＤＴＡ、および0.15％のＱＰ１０ＯＭＨ ＨＥＣ
に溶解した0.5pgのＭ１３鋳型ＤＮＡのＦＡＭ Ｔａｑ
Ｍ１３（−２１）プライマー配列からの反応物であっ
た。試料溶液は９０℃で２分間加熱し、次に動電学的に
キャピラリーチューブに4.5kVで、３μA、20秒間注入し
た。得られた電気泳動図を図４に示す。
【００３４】実施例４ 長さが50cmで直径が50μmのキャピラリーチューブに、1
25mMのボレート−ＴＭＡ中のＣ４Ｆ９／カーボワックス
４６００、1.25mMのＥＤＴＡ、6.6モルの尿素および9.0
のｐＨからなる７％ゲルを用意した。この場合の試料は
５μlのホルムアミドおよび0.5μlの25mMソジウムＥＤ
ＴＡ、および0.15％のＱＰ１０ＯＭＨＨＥＣに溶解した
0.5mgのＭ１３鋳型ＤＮＡのＦＡＭ Ｔａｑ Ｍ１３（−
２１）プライマー配列からの反応物であった。試料溶液
は90℃で２分間加熱して、次に動電学的にキャピラリー
チューブに4.5kVで、３μA、40秒間注入した。この実験
の結果を図５に示す。
【００３５】図１から５までの電気泳動図は時間に対す
る信号振幅をプロットした。信号の振幅は一般に注入し
た被検体の量に比例する。ピークの上の数字はセグメン
ト中の塩基対の数を示す。実施例１の試料混合物は他の
実施例にあるような絡み合ったポリマーを含んでいない
コントロールであった。図１に表されたコントロール試
料注入と比較して、図２から５に示したキャピラリーチ
ューブに導入されるＤＮＡ伸長生成物の量は、各実施例
２、３、および４において実質的に大きい。コントロー
ル電気泳動図（図１）の増幅は、ＱＰ１０ＯＯＭＨ Ｈ
ＥＣの絡み合ったポリマーを含む実施例のそれよりも少
なくとも約８倍ないし10倍である。
【００３６】実施例５ 次の実施例は核酸のスラブゲル電気泳動を使用するため
に適当な安定な変性装填溶媒の調製を記載するものであ
る。トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−四酢酸（ＣＤＴＡ；シグマケミカル社、
セントルイス、ＭＯ）2.42gに、十分な10％水酸化テト
ラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ；ＳＡ Chem, Inc., C
lebume, ＴＸ）を添加し、全容量9.0mlで0.77M濃度のＣ
ＤＴＡのテトラメチルアンモニウム塩（ＴＭＡ−ＣＤＴ
Ａ）の透明な溶液を得た。400mgのオイルブルーＮ（シ
グマケミカル社）を9.6gの２−ピロリジノン（アルドリ
ッチ ケミカル社、ミルウォーキー、ＷＩ）に溶解し、
４％溶液を作成した。25℃以下に室温が下がったとき、
この溶液から沈降した染料固体は、貯蔵瓶を繰り返し反
転させて容易に再懸濁させた。２−ピロリジノン（また
はＮＭＰ）のこれと他の溶液全部を、プラスチック容器
中に貯蔵する際に生じる螢光不純物が浸出しないように
ガラス容器に貯蔵した。
【００３７】975μlの２−ピロリジノンに、15μlの0.7
7M ＴＭＡ−ＣＤＴＡおよび10μlの４％オイル・ブルー
Ｎ（上記）を添加し、1.00mlの装填試薬Ａを与えた：0.
44％オイル・ブルーＮ、11.6nM ＴＭＡ−ＣＤＴＡ、1.5
％Ｈ2Ｏ、98.5％２−ピロリジノン。装填試薬Ａは無期
限に20〜30℃で安定である。210μlの装填試薬Ａに30μ
lのＧｅｎｅＳｃａｎ２５００−ＴＡＭＲＡ螢光電気泳
動サイズスタンダード（アプライド・バイオシステムズ
・ディビジョン・オブ・パーキン・エルマー、フォスタ
ーシティ、ＣＡ）を添加し、240μlの装填試薬Ｂを得
た：0.035％オイルブルーＮ、10.2nM ＴＭＡ−ＣＤＴ
Ａ、132μlＨ2Ｏ、86％Ｚ−ピロリトン、および12.5％
希釈のＧｅｎｅＳｃａｎ２５００−ＴＡＭＲＡサイズス
タンダード。装填試薬Ｂは20〜30℃で少なくとも２週
間、４℃で無期限に安定であった。４℃で沈澱した２−
ピロリジノンの固体水和物は熱水道水中で貯蔵容器を攪
拌すると容易に再溶解した。
【００３８】変性電気泳動スラブゲルに装填するための
核酸試料を調製するため、４μlの装填試薬Ｂを３μlの
核酸試料（例えば、完全ポリメラーゼ鎖反応〔ＰＣＲ〕
またはオリゴヌクレオチド連結反応アッセイ〔ＯＬＡ〕
からの反応混合物）と200μlのマイクロ遠心分離チュー
ブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ、パーキン・エルマー、
ノルウォーク、ＣＴ）中で混合し、２分間98℃にてモデ
ル９６００ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９６００（パ
ーキンエルマー）で加熱した。１電気泳動ゲルのレーン
を完全に充填するに十分な通常２４個のこのような試料
を同時に用意した。この装填試料の最終２−ピロリジノ
ン濃度は49％であり、50％尿素またはホルムアミドより
も良いＤＮＡ変性能を与えた。ＣＤＴＡ濃度は13.6nMま
での３μl試験試料中でＭｇ2+ 濃度を中和するのに十分
であった；ＰＣＲおよびＯＬＡは慣例上、10nMよりも高
くないＭｇ2+ 濃度を含む。５μl容量の装填試料を薄
い、すなわち、250μmの厚さの、50％尿素を含む６％ま
たは８％ポリアクリルアミドゲルの試料壁に塗布し、そ
の器具の使用説明書に従って３７３Ａ自動化ＤＮＡシー
ケンサー（アプライド・バイオシステムズ）で電気泳動
した。電気泳動図はＧＥＮＥＳＣＡＮ６７２ソフトウェ
ア（アプライド・バイオシステムズ）を使用してソフト
ウェアの使用説明書に従い分析した。螢光標識をつけた
ＤＮＡ断片（サイズ標準物おＰＣＲ生成物の両方）のピ
ークは、変性剤としてホルムアミドおよびＭｇ2+ キレ
ーターとしてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含
む従来の装填試薬と同一の分解と感度を示した。しか
し、安定性が小さいので、従来の装填剤は使用前に短時
間に配合する必要がある。さらに、ＤＮＡ試料と装填試
薬Ｂの最終混合物はゲルに応用する前に数日間20〜30℃
で貯蔵することができた。このような貯蔵は、ホルムア
ミドが加水分解に不安定のために、従来のホルムアミド
配合物には勧められない。ホルムアミドまたは尿素を加
水分解するとき、得られた塩（アンモニウムホルメート
またはアンモニウムカーボネート）は、電気泳動分解能
を非常に減らすことができるやり方で装填試料の導電率
を増加する。ホルムアミドまたは尿素は、ポリアクリル
アミドゲルを注入する緩衝液に使用するならば、変性剤
加水分解が電気泳動走行中に過剰な電流と加熱をもたら
す。さらに、変性剤加水分解生成物はゲル中で時間変化
の電流を生じて再現性が難しいという問題を導くことに
なる。
【００３９】本発明は特定例に関して記載したが、本方
法での試料構成は特に記載したものとは別のものを実施
することができることは言うまでもない。種々のポリマ
ーおよびコポリマーを使用してシステム中のＤＮＡ配列
決定鋳型の移動を遅らせたり阻止したりすることがで
き、本発明によるシステムおよび方法は、ポリマーまた
はコポリマーが、試料が埋め込まれる絡み合ったポリマ
ーマトリックスを形成するようにする。
【００４０】本発明に使用することができる上記ポリマ
ーの他に、試料混合物中のポリマーまたはコポリマーの
濃度は、ＤＮＡ配列決定鋳型のような高分子の移動に影
響する。例えば、ＱＰ１０ＯＭＨ ＨＥＣのような高分
子量ＨＥＣを使用するとき、有効最小濃度0.1％ないし
0.2％である。異なるポリマーを使用する場合、濃度は
関係する被検体の移動度に影響を与えることなく移動度
制限を最適にするように変えなければならない。
【００４１】本発明の具体例は、請求の範囲の固有の範
囲および正しい目的から逸脱することなく改良、改変、
および変化が行われる。従って、請求の範囲の精神およ
び広い意図の中に含まれるような変化、改良、および改
変は全て包含される。ここに引用された全ての特許、特
許出願、および刊行物はその全体を参考文献としてここ
に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、コントロール実施例１の結果の電気泳
動図である。
【図２】図２は、実施例２の結果の電気泳動図の第１の
部分である。
【図３】図３は、実施例２の結果の電気泳動図の第２の
部分である。
【図４】図４は、実施例３の結果の電気泳動図である。
【図５】図５は、実施例４の結果の電気泳動図である。
【図６】図６は、本発明によるシステムの概略図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スチーブン エム メンチェン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94536 フレモント，バンダ ウェイ 768 (72)発明者 ウイル ブロッホ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94401 サン マテオ，ノース クレイル モント ストリート 607Ａ

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）関係する生体分子被検体および前記
    生体分子よりも実質的に大きい分子量を有する生体高分
    子と溶媒の混合物を用意し； ｂ）電場をマトリックスを横切って配置するとき、マト
    リックスを通る生体高分子の移動を優先的に遅らせるた
    めに有効なポリマーマトリックス中に混合物を埋め込
    み； ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って配置するとき、こ
    のような生体分子を分離するために有効な細長い電気泳
    動媒体の一端領域と連絡して中に混合物が埋め込まれた
    マトリックスを配置し； ｄ）マトリックスを通って媒体中を通って生体分子を引
    出す方向において、マトリックスおよび前記媒体の他端
    領域との間に電場を印加し、これによって電気泳動媒体
    に入る生体高分子に比例して生体分子の割合を実質的に
    増加させることができる、各工程からなる生体分子を電
    気泳動により分離する方法。
  2. 【請求項２】 前記生体高分子がＤＮＡ配列決定鋳型で
    ある請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記関係する被検体が部分配列ＤＮＡ断
    片である請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記生体高分子が少なくとも５０００ダ
    ルトンの分子量を有する請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記生体高分子がＤＮＡ配列決定鋳型で
    ある請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ポリマーがヒドロキシエチルセルロ
    ースである請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 溶媒がさらに変性剤を含む請求項１記載
    の方法。
  8. 【請求項８】 変性剤が尿素、ホルムアミド、ラクタ
    ム、およびラクトンからなる群から選択される請求項７
    記載の方法。
  9. 【請求項９】 変性剤が２−ピロリジノンである請求項
    ７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 変性剤の濃度が水溶液中で約１０％
    （wt/wt)と約７０％（wt/wt)の間である請求項７記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 ａ）約６×１０5 ダルトンよりも大き
    い分子量を有する少なくとも１のＤＮＡ鋳型高分子、Ｄ
    ＮＡプライマー伸長生成物、および溶媒を含む配列決定
    試料混合物を用意し、そして ｂ）ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡ伸長生成物を中に埋め込む
    混合物中に絡み合ったオープンポリマー網目構造を配合
    する混合物中に線状ポリマーを導入し、網目構造はＤＮ
    Ａ鋳型の移動を遅らせるために有効な篩分けの性質を有
    する、各工程からなる試料混合物中にＤＮＡ配列決定鋳
    型高分子を閉じ込める方法。
  12. 【請求項１２】 溶媒がさらに変性剤を含む請求項１１
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 変性剤が水溶液であり、変性剤が尿
    素、ホルムアミド、ラクタム、およびラクトンからなる
    群から選択される請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 変性剤が２−ピロリジノンである請求
    項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 変性剤の濃度が水溶液中で約１０％
    （wt/wt)と約７０％（wt/wt)の間である請求項１２記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 ａ）高分子および関係する被検体と溶
    媒の試料混合物を用意し； ｂ）前記試料混合物を中に埋め込む絡み合ったポリマー
    網目構造を形成するために有効な分子量を有する線状ポ
    リマーを混合物に導入し、前記網目構造は前記マトリッ
    クスに電場を印加するとき前記混合物中に高分子の移動
    を遅らせるために有効なメッシュサイズを有し； ｃ）試料混合物とマトリックスに分離媒体を充填したキ
    ャピラリー電気泳動チューブの一端を挿入し； ｄ）試料混合物中のチューブの一端と、キャピラリー電
    気泳動チューブ中の分離媒体に動電学的に引き入れる関
    係する被検体の量を優先的に増加するために有効なチュ
    ーブの他端との間に電位を印加する、各工程からなるキ
    ャピラリー電気泳動用ゲル充填キャピラリーチューブに
    試料を装填する方法。
  17. 【請求項１７】 前記高分子が核酸鋳型である請求項１
    ６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記関係する被検体がＤＮＡ伸長生成
    物を含む請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記絡み合ったポリマーマトリックス
    が約２×１０5 と５×１０6 ダルトンの間の分子量を有
    する線状ポリマーから形成される請求項１６記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 溶媒がさらに変性剤を含む請求項１６
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 変性剤が水溶液であり、変性剤が尿
    素、ホルムアミド、ラクタム、およびラクトンからなる
    群から選択される請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 変性剤が２−ピロリジノンである請求
    項２０記載の方法。
  23. 【請求項２３】 変性剤の濃度が水溶液中で約１０％
    （wt/wt)と約７０％（wt/wt)の間である請求項２０記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 高分子および関係する被検体と溶媒か
    らなる試料が、電場をマトリックスを横切って印加して
    前記被検体を前記マトリックスを通って引き出すとき、
    マトリックスを通る前記試料内の前記高分子の移動を遅
    らせるために有効なメッシュサイズを有する絡み合った
    ポリマーマトリックスに埋め込まれている、キャピラリ
    ー電気泳動分離媒体に動電学的に注入するためのキャピ
    ラリー電気泳動試料。
  25. 【請求項２５】 前記高分子がＤＮＡ配列決定鋳型であ
    る請求項２４記載の試料。
  26. 【請求項２６】 前記関係する被検体がＤＮＡ伸長生成
    物である請求項２５記載の試料。
  27. 【請求項２７】 前記絡み合ったポリマーマトリックス
    が約２×１０5 と５×１０6 ダルトンの間の分子量を有
    する線状ポリマーから形成される請求項２４記載の試
    料。
  28. 【請求項２８】 ａ）比較的高分子量の鋳型核酸分子も
    含む断片混合物中に部分配列核酸断片の混合物を生成さ
    せ； ｂ）マトリックスを横切って電場を配置するとき、マト
    リックスを通る鋳型核酸分子の移動を優先的に遅らせる
    ために有効なポリマーマトリックス中に断片混合物を埋
    め込み； ｃ）電場を媒体の端部領域を横切って配置するとき、こ
    のような部分配列断片を分離するために有効な細長い電
    気泳動媒体の一端領域と連絡してマトリックスと埋め込
    まれた混合物を配置し； ｄ）マトリックスを通って媒体中を通って核酸断片を引
    出す方向において、マトリックスおよび前記媒体の他端
    領域との間に電場を印加し、これによって電気泳動媒体
    に入る部分配列断片の量を実質的に増加させる、各工程
    からなる核酸断片を配列決定する方法。
  29. 【請求項２９】 前記絡み合ったポリマーマトリックス
    が約２×１０5 と５×１０6 ダルトンの間の分子量を有
    する線状ポリマーから形成される請求項２８記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】 前記核酸断片がＤＮＡ断片である請求
    項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 断片混合物がさらに変性剤を含む請求
    項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 変性剤が尿素、ホルムアミド、ラクタ
    ム、およびラクトンからなる群から選択される請求項３
    １記載の方法。
  33. 【請求項３３】 変性剤が２−ピロリジノンである請求
    項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 比較的高分子量の鋳型核酸も含む断片
    混合物中の部分配列核酸断片の混合物を電気泳動分離す
    ることによって、核酸断片を配列決定する際に使用する
    ための電気泳動システムであって；混合物がマトリック
    ス中に埋め込まれており電場をマトリックスを横切って
    配置するとき、マトリックスを通って鋳型核酸の移動を
    優先的に遅らすために有効なポリマーマトリックス；一
    端が前記マトリックスと連絡している細長い電気泳動媒
    体の端部領域を横切って電場を配置するとき、部分配列
    断片を分離するために有効な前記媒体；およびマトリッ
    クスを通って媒体中を通って核酸断片を引出す方向にお
    いて、マトリックスおよび前記媒体の他端領域との間に
    電場を印加するための装置、から成る電気泳動システ
    ム。
  35. 【請求項３５】 前記核酸断片および核酸鋳型がＤＮＡ
    断片および鋳型である請求項３４記載のシステム。
  36. 【請求項３６】 前記マトリックスが第１のコンテナに
    保持され、前記第１のコンテナ中の前記マトリックス中
    に入れられた一端と第２のコンテナ中の緩衝液に入れら
    れた他端とを有するキャピラリーチューブ中に前記媒体
    が含まれる、第１および第２のコンテナからさらになる
    請求項３４記載のシステム。
  37. 【請求項３７】 ポリマー網目構造が約２×１０5 と５
    ×１０6 ダルトンの間の分子量を有する線状ポリマーか
    ら形成される請求項３４記載のシステム。
  38. 【請求項３８】 マトリックスが変性剤含有溶液に溶解
    している請求項３４記載のシステム。
  39. 【請求項３９】 変性剤が尿素、ホルムアミド、ラクタ
    ム、およびラクトンからなる群から選択される請求項３
    ８記載のシステム。
  40. 【請求項４０】 変性剤が２−ピロリジノンである請求
    項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ラクタムおよびラクトンからなる群か
    ら選択される変性剤からなる核酸の電気泳動に有用な変
    性溶媒。
  42. 【請求項４２】 ラクタムがＮ−アルキルピロリジノ
    ン、δ−バレロラクタム、ε−カプロラクタム、および
    Ｎ−メチル−ε−カプロラクタムからなる群から選択さ
    れる請求項４１記載の変性溶媒。
  43. 【請求項４３】 変性剤が電解水溶液中に存在し、変性
    剤の濃度が約５％（wt/wt)と約７０％（wt/wt)の間であ
    る請求項４１記載の変性溶媒。
  44. 【請求項４４】 キレーターからさらになる請求項４１
    記載の変性溶媒。
  45. 【請求項４５】 キレーターがエチレンジアミン四酢酸
    （ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノ
    エチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ'−四酢酸（ＥＧＴ
    Ａ）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ',Ｎ",Ｎ"−
    五酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，
    Ｎ，Ｎ',Ｎ",Ｎ'",Ｎ'"−六酢酸（ＴＴＨＡ）、および
    トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，
    Ｎ',Ｎ'−四酢酸（ＣＤＴＡ）からなる群から選択され
    る請求項４４記載の変性溶媒。
  46. 【請求項４６】 キレーターがトランス−１，２−ジア
    ミノシクロヘキサン（ＣＤＴＡ）である請求項４４記載
    の変性溶媒。
JP8308615A 1995-11-08 1996-11-06 絡み合ったポリマー網状組織による試料混合物中の核酸配列決定鋳型の閉じ込め Pending JPH09201200A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/554,247 US5891313A (en) 1993-11-23 1995-11-08 Entrapment of nucleic acid sequencing template in sample mixtures by entangled polymer networks
US08/554247 1995-11-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH09201200A true JPH09201200A (ja) 1997-08-05

Family

ID=24212604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8308615A Pending JPH09201200A (ja) 1995-11-08 1996-11-06 絡み合ったポリマー網状組織による試料混合物中の核酸配列決定鋳型の閉じ込め

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5891313A (ja)
EP (1) EP0773225B1 (ja)
JP (1) JPH09201200A (ja)
AT (1) ATE340181T1 (ja)
AU (1) AU7063196A (ja)
CA (1) CA2189381A1 (ja)
DE (1) DE69636563T2 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1002126A4 (en) 1997-06-25 2004-11-03 Life Technologies Inc IMPROVED METHOD FOR ISOLATING AND RECOVERY TARGET DNA OR RNA MOLECULES WITH A DESIRED NUCLEOTIDE SEQUENCE
US6146511A (en) * 1998-01-30 2000-11-14 The Perkin-Elmer Corporation Electrophoretic nucleic acid purification method
US6294064B1 (en) * 1999-11-23 2001-09-25 Beckman Coulter, Inc. Method and reagent for suppressing the injection of nucleic acid sequencing template into micro-bore capillary during DNA separation with capillary electrophoresis
US6465692B1 (en) * 1999-12-22 2002-10-15 Beckman Coulter, Inc. Reagents for preparing a sample containing biomolecular analytes for capillary electrophoretic separation and methods for making the reagents
US8975328B2 (en) * 2000-06-30 2015-03-10 Institute Curie Non-thermosensitive medium for analyzing species in a channel and for minimizing adsorption and/or electroosomosic phenomena
FR2811083B1 (fr) * 2000-06-30 2002-11-22 Inst Curie Milieu liquide non-thermosensible pour l'analyse d'especes au sein d'un canal
EP1406720B1 (en) * 2001-07-19 2013-12-04 Life Technologies Corporation Buffers for electrophoresis and use thereof
US7381317B2 (en) * 2002-08-12 2008-06-03 Beckman Coulter, Inc. Methods and compositions for capillary electrophoresis (CE)
US20040226620A1 (en) * 2002-09-26 2004-11-18 Daniel Therriault Microcapillary networks
US7053125B2 (en) * 2002-11-14 2006-05-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Controlled dispersion of colloidal suspension by comb polymers
US7141617B2 (en) * 2003-06-17 2006-11-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Directed assembly of three-dimensional structures with micron-scale features
US8007724B2 (en) * 2003-11-07 2011-08-30 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having at least one auxiliary buffer passage
US20050191657A1 (en) * 2003-11-18 2005-09-01 Demorest David M. Stringency modifiers in hybridization assays
US20070014699A1 (en) 2005-06-23 2007-01-18 Beckman Coulter, Inc, Methods and apparatus for improving the sensitivity of capillary zone electrophoresis
US9285297B2 (en) 2005-08-22 2016-03-15 Applied Biosystems, Llc Device, system, and method for depositing processed immiscible-fluid-discrete-volumes
US7956102B2 (en) * 2007-04-09 2011-06-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Sol-gel inks
US7922939B2 (en) * 2008-10-03 2011-04-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Metal nanoparticle inks
US8187500B2 (en) * 2008-10-17 2012-05-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Biphasic inks
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
CA2825149C (en) * 2011-01-31 2020-06-16 Biotype Gmbh Reduced artifact denaturing capillary electrophoresis of nucleic acids
WO2018217816A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Integenx Inc. Compositions, methods, kits and devices for molecular analysis
WO2018217789A2 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Integenx Inc. Compositions, methods, kits and devices for molecular analysis

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US396893A (en) 1889-01-29 Apparatus for making molds
DE2920527A1 (de) * 1979-05-21 1981-02-05 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von polyurethankunststoffen
US4737258A (en) * 1984-05-14 1988-04-12 Fuji Photo Film Co., Ltd. Element for electrophoresis containing polyacrylamide gel membrane
US5055517A (en) * 1988-04-29 1991-10-08 At Biochem Electrophoretic media
US5096554A (en) 1989-08-07 1992-03-17 Applied Biosystems, Inc. Nucleic acid fractionation by counter-migration capillary electrophoresis
US4911807A (en) * 1989-09-05 1990-03-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fractionation and sample loading by cassette in capillary electrophoresis
US5264101A (en) * 1989-11-06 1993-11-23 Applied Biosystems, Inc. Capillary electrophoresis molecular weight separation of biomolecules using a polymer-containing solution
US5164055A (en) 1990-01-29 1992-11-17 Applied Biosystems, Inc. High-viscosity polymer matrix and methods
DE69104775T2 (de) * 1990-05-29 1995-06-01 Waters Investments Ltd Verfahren und Vorrichtung zum Durchführen der Kapillarelektroforese.
US5085756A (en) * 1990-08-21 1992-02-04 Hewlett-Packard Company Column separation system for electrophoresis with sample pretreatment
EP0497448A1 (en) * 1991-02-01 1992-08-05 Beckman Instruments, Inc. Capillary gel electrophoresis in the presence of at least one neutral non-urea denaturing agent
US5340452A (en) * 1991-02-01 1994-08-23 Beckman Instruments, Inc. On-column preconcentration of samples in capillary electrophoresis
US5126021A (en) 1991-07-17 1992-06-30 Applied Biosystems Inc. Low-viscosity polymer solution for capillary electrophoresis
US5420265A (en) * 1992-12-16 1995-05-30 Hybridon, Inc. Separation of phosphorothioate oligonucleotides by capillary gel electrophoresis
US5374527A (en) * 1993-01-21 1994-12-20 Applied Biosystems, Inc. High resolution DNA sequencing method using low viscosity medium
US5874212A (en) * 1993-05-13 1999-02-23 Thomas Jefferson University Detection of single base mutations and other variations in double stranded DNA by conformation-sensitive gel electrophoresis
US5455344A (en) * 1993-09-03 1995-10-03 Fmc Corporation Agarose compositions for nucleic acid sequencing
US5453163A (en) * 1993-10-29 1995-09-26 Yan; Chao Electrokinetic packing of capillary columns
WO1995014921A1 (en) * 1993-11-23 1995-06-01 Perkin-Elmer Corporation Entrapment of nucleic acid sequencing template in sample mixtures by entangled polymer networks
AU1254295A (en) * 1993-12-17 1995-07-03 Perkin-Elmer Corporation, The Uncharged polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis

Also Published As

Publication number Publication date
DE69636563T2 (de) 2007-09-13
AU7063196A (en) 1997-06-19
ATE340181T1 (de) 2006-10-15
DE69636563D1 (de) 2006-11-02
CA2189381A1 (en) 1997-05-09
EP0773225A2 (en) 1997-05-14
EP0773225A3 (en) 2000-07-19
US5891313A (en) 1999-04-06
US6051636A (en) 2000-04-18
EP0773225B1 (en) 2006-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH09201200A (ja) 絡み合ったポリマー網状組織による試料混合物中の核酸配列決定鋳型の閉じ込め
JP3176373B2 (ja) ポリマー含有溶液を使用する生体分子のキャピラリー電気泳動分子量分離
Dolnı́k DNA sequencing by capillary electrophoresis
EP0680516B1 (en) High resolution dna sequencing method using low viscosity medium
Kasper et al. Separation and detection of DNA by capillary electrophoresis
Guttman et al. Separation of DNA by capillary electrophoresis
JP4342954B2 (ja) 逆行する高親和性インターカレーション型色素を用いた核酸の電気泳動分離検出
AU689648B2 (en) Separation of nucleic acids by capillary electrophoresis in thermal gradients in viscous polymer solutions
CA2153175C (en) Entrapment of nucleic acid sequencing template in sample mixtures by entangled polymer networks
JP3935146B2 (ja) 電気泳動用の緩衝液およびそれらの使用
Yan Gel-Free Separation and Detection of DNA via Micelle-tagging Electrophoresis in Entangled Micelle Networks
Dubrow Capillary gel electrophoresis
JP2004333190A (ja) 電気泳動装置
Freitag Capillary Gel Electrophoresis
JPH03113358A (ja) キャピラリー電気泳動法
JP2001004591A (ja) キャピラリー電気泳動用ゲル及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20040628

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20050426

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20061211

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070305

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070308

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20070731