JPH09216825A - リボザイム、リポソーム製剤及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリ
ボザイムを含有するリポソーム製剤の提供。 【効果】 本発明のリポソーム製剤は、リボザイムを含
有するものであるから、効果的に細胞内でリボザイムを
働かせることができる。特にリポソームがセンダイウイ
ルス又はその処理物で処理されたものは、患部の細胞内
又は目的とする組織の細胞内への取り込みが促進され
る。リボザイムが特定の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ
を特異的に分解するものであれば、当該遺伝子に起因す
る疾患等を予防及び／又は治療することが可能となる。
例えば、リボザイムがアポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解
するリボザイムであれば、動脈硬化症や高リポ蛋白質
（ａ）血症の予防及び／又は治療が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なリボザイ
ム、リポソーム製剤及びその用途に関する。詳細には、
アポ（ａｐｏ）蛋白（ａ）のリボザイム、リボザイムを
含有するリポソーム製剤、リボザイムを含有する動脈硬
化症又は高リポ蛋白質血症の治療及び／又は予防のため
の使用、治療剤及び／又は予防剤ならびに治療方法及び
／又は予防方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リポ蛋白質（ａ）（以下Ｌｐ（ａ）と称
する。）はその中心にＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）をも
ち、その周囲にアポ蛋白（ａ）と呼ばれる糖蛋白質がジ
スルフィド結合により、ａｐｏ Ｂ−１００と呼ばれる
蛋白質と結合した高分子複合体である。Ｌｐ（ａ）の血
中濃度の上昇が虚血性心疾患や脳梗塞等の動脈硬化性疾
患と密接に結びついていることは、数多くの疫学調査に
より報告されている。アポ蛋白（ａ）の発現を抑え、Ｌ
ｐ（ａ）の血中濃度を下げることにより、これらの疾患
の治療又は予防につながると考えられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】１９８７年に、アポ蛋
白（ａ）のｃＤＮＡの塩基配列が決定され、その結果、
アポ蛋白（ａ）が、血栓溶解に重要なプラスミノーゲン
のｃＤＮＡと高い相同性を有することが明らかになっ
た。従って、アンチセンス技術を用いたアポ蛋白（ａ）
の抑制は困難が予測され、有効な手段が存在しなかっ
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】これらの課題を解決する
ために、本発明者等は、アポ蛋白（ａ）を産生する細胞
に、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを切断するリボザイムを
含有する製剤を投与することにより、アポ蛋白（ａ）の
発現を抑制できることを見出した。

【０００５】一方、リボザイムを生体内で効率良く働か
せるために、ウイルスベクターを用いてリボザイムを細
胞内へ導入する方法が採られていたが、あまり有効では
なかった。本発明者等は、リボザイムをリポソーム製剤
で投与することにより、効果的に細胞内でリボザイムを
働かせることができることをも見出し、本発明を完成す
るに至ったものである。

【０００６】本発明のリポソーム製剤で用いられるリボ
ザイムはどのようなものでもよい。例えば選択された特
定の遺伝子の過剰発現を予防及び／又は治療するために
用いる場合には、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分
解するものであればよく、具体的にはアポ蛋白（ａ）の
発現抑制には、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを切断できる
ものであればどのようなものでも良い。

【０００７】このようなリボザイムとしては、上記ｍＲ
ＮＡを分解するように設計されたハンマーヘッド型リボ
ザイム、ヘアピン型リボザイム等が挙げられる。ハンマ
ーヘッド型リボザイムとしては、例えばジャガイモやせ
いも病ウイロイド、アボガドサンブロッチウイロイド等
のウイロイドに含まれるリボザイム、アルファルファ条
斑ウイルス、ベルベットタバコ斑紋ウイルス等のウイソ
イドに含まれるリボザイムが挙げられる。

【０００８】これらのリボザイムを例えば、アポ蛋白
（ａ）に特異的にデザインし、核酸合成機等を用いるこ
とにより製造することができる。リボザイムは通常ＲＮ
Ａで構成されるが、その安定化のためにＤＮＡ、核酸修
飾体、擬核酸を含むものであってもよく、またリボザイ
ムであるオリゴヌクレオチドの一部又は全部が、リン酸
ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子で置換したチ
オリン酸ジエステル結合をもつオリゴヌクレオチド（Ｓ
−オリゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷をもたな
いメチルホスフェート基で置換したオリゴヌクレオチド
等の生体内で分解を受けにくくするために改変されたオ
リゴヌクレオチドが含まれていてもよい。

【０００９】本発明で用いられる好ましいリボザイムと
しては、アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを特異的に切断でき
るが、プラスミノーゲンのｍＲＮＡを切断できないもの
が挙げられる。このようなリボザイム、例えばハンマー
ヘッド型リボザイムは、以下のようにして作成すること
ができる。

【００１０】アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡにおいて、ハン
マーヘッド型リボザイムの特異的切断部位であるＧＵＸ
（Ｘは任意のヌクレオチド）部位を検索する。さらに、
その特異的切断部位を含む周辺の配列が、プラスミノー
ゲンのｍＲＮＡに類似の配列を持たない配列、又は少な
くともプラスミノーゲンのｍＲＮＡに特異的切断部位Ｇ
ＵＸを持たない配列を検索し、その配列を特異的に切断
するようにリボザイムをデザインする。その配列は、ア
ポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡの５’末端付近（約２００塩
基）から選ばれるのが好ましく、またアポ蛋白（ａ）の
ｍＲＮＡが二次構造を取るとき、一本鎖になる部分に特
異的切断部位ＧＵＸが存在するような配列から選ばれる
のが好ましい。その具体的な例としては、一般式（１）
で表されるＲＮＡ鎖又はその類似体であるところのリボ
ザイムが挙げられる。

【００１１】

【化２】

【００１２】〔式中、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、
Ｘｎ及びＸｍは任意のオリゴヌクレオチドで形成され、
一緒になってステムループを形成し、3'- （Ｙ）ＣＡ
（Ｚ）-5' でアポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡの相補配列とな
り、（Ｙ）及び（Ｚ）は３塩基以上のヌクレオチドであ
る。〕

【００１３】好ましいリボザイムとしては、一般式
（２）で表されるＲＮＡ鎖又はその類似体であるところ
のリボザイムが挙げられる。

【００１４】

【化３】

【００１５】〔式中、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、
Ｘｎ及びＸｍは任意のオリゴヌクレオチドで形成され、
一緒になってステムループを形成する。〕

【００１６】本発明で用いられるリボザイムの製造方法
としては、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法
を用いることができる。例えば、ＤＮＡ合成装置を用い
て目的のリボザイムを直接合成してもよいし、また少量
のリボザイム、又は当該リボザイムを含む核酸もしくは
当該核酸の一部を合成した後、ＰＣＲ法又はクローニン
グベクター等を用いて核酸を増幅してもよい。

【００１７】さらに、これらの方法により得られた核酸
を、制限酵素等を用いて切断し、あるいはＤＮＡリガー
ゼ等を用いて結合するなどして、目的とする核酸を製造
してもよい。また、さらに細胞内でより安定なリボザイ
ムを得るために、核酸の塩基、糖、リン酸部分に例えば
アルキル化、アシル化等の化学修飾を施してもよい。

【００１８】リボザイムを主成分として含有する本発明
の製剤は、通常は血管内に投与されるが、主薬であるリ
ボザイムが目的の組織に取り込まれるような製剤であれ
ば特に限定されるものではなく、経口投与、他の非経口
投与、外用の形で投与してもよい。さらに、リボザイム
の効果をあげるために、フッシリティター等を使用する
こともできる。

【００１９】本発明の製剤は、溶液、懸濁液、シロッ
プ、リポソーム製剤、乳剤、シロップ等の液体の投与形
態であってもよいし、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル
剤等の固形の投与形態であってもよい。必要に応じ、上
記製剤には、各種助剤、安定剤、潤滑剤、その他一般に
使用される添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ス
テアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白陶土、蔗
糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチ
ン、落下生油、オリーブ油、カカオバター、エチレング
リコール等が添加され得る。

【００２０】リボザイムを含有する製剤としては、一般
に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態による
製剤が好ましい。例えばセンダイウイルス等を用いた膜
融合リポソーム製剤、エンドサイトーシスを利用するリ
ポソーム製剤等のリポソーム製剤、リポフェクトアミン
（ライフテックオリエンタル社製）等のカチオン性脂質
を含有する製剤、又はレトロウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター等を用いるウイルス製剤を用いるのが
有利であり、特に膜融合リポソーム製剤が好ましい。

【００２１】リポソーム製剤は、そのリポソームの構造
体が、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、多重層リポ
ソーム（ＭＬＶ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）
のいずれであってもよい。その大きさも、ＬＵＶでは２
００ｎｍから１０００ｎｍ、ＭＬＶでは４００ｎｍから
３５００ｎｍ、ＳＵＶでは２０ｎｍから５０ｎｍ程度の
粒子径を取り得るが、センダイウイルス等を用いる膜融
合リポソーム製剤の場合は、粒子径２００ｎｍから１０
００ｎｍのＭＬＶを用いるのが好ましい。

【００２２】リポソームの製造方法は、リボザイムが保
持されるものであれば特に限定されることなく用いら
れ、慣用の方法、例えば逆相蒸発法（Szoka,F.,et al:B
iochim. Biophys. Acta, Vol.601 559(1980)）、エーテ
ル注入法（Deamer, D. W. :Ann. N. Y. Acad. Sci., Vo
l.308 250(1978) ）、界面活性剤法（Brunner, J., eta
l: Biochim. Biophys. Acta, Vol.455 322(1976) ）等
が用いられ得る。

【００２３】リポソーム構造を形成するための脂質とし
ては、リン脂質、コレステロール類、窒素脂質等が用い
られるが、一般的にはリン脂質が好適である。具体的に
は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホ
スファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトー
ル、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン
酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチ
ン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あ
るいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジ
セチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコ
リン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイ
ルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファ
チジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタ
ノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリ
ン等の合成リン脂質が挙げられる。

【００２４】これらのリン脂質を含む脂質は単独で用い
ることもできるが、二種以上を併用することも可能であ
る。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基を
有する原子団を分子内に持つ脂質を用いることにより、
電気的に陰性なリボザイムの結合率を増加させることも
できる。これらリポソーム形成時の主要なリン脂質の他
に、一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレ
ステロール、ステアリルアミン、α−トコフェロール等
の添加剤を用いることもできる。

【００２５】このようにして得られるリポソーム製剤
は、患部の細胞内又は目的とする組織の細胞内への取り
込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばセンダ
イウイルス、不活化センダイウイルス、センダイウイル
スより精製された膜融合促進蛋白質、ポリエチレングリ
コール等が加えられていてもよい。

【００２６】リポソーム製剤の製造法の例を具体的に説
明すると、例えば前記したリン脂質等のリポソーム形成
物質とリポソーム形成用添加剤としてのコレステロール
等と共に、テトラヒドロフラン、クロロホルム、エタノ
ール等の有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて
減圧下に溶媒を留去して容器内面にリポソーム形成物質
の膜を形成する。これにリボザイムを含有する緩衝液を
加えて攪拌し、得られたリポソームにさらに所望により
前記した膜融合促進物質を加えた後、リポソームを単離
する。

【００２７】このようにして得られるリボザイムを含有
するリポソーム製剤は、適当な溶媒中に懸濁させるか、
あるいは一旦凍結乾燥したものを適当な溶媒に再分散さ
せて治療に用いることができる。

【００２８】リボザイムを主成分として含有する製剤に
おける、リボザイムの含有割合は、適用疾患、適用部
位、投与形態及び投与方法に応じて、種々設定すること
ができるが、通常０．０１％から１００％、好ましくは
０．０１％から１０％である。

【００２９】リボザイムを主成分として含有する製剤の
投与方法は、疾患の種類、使用するリボザイムの種類等
により適宜選択することができる。かかる製剤中におけ
るリボザイムとしての投与量は、年齢、その他患者の条
件、疾病の種類、使用するリボザイムの種類等により適
宜選択されるが、例えば血液内投与、筋肉内投与、関節
内投与等では、一般には１回あたり１０から１０，００
０ｎmoleを１日１から数回投与することができる。

【００３０】

【実施例】以下に本発明の実施例及び実験例を示すこと
により、本発明をさらに具体的に説明する。

【００３１】〔実施例１：リボザイムの製造〕アポ蛋白
（ａ）のｍＲＮＡの５’末端周辺の二次構造を予測し、
切断部位となる構造がＧＴＨ（ＨはＣ、Ｕ又はＡ）であ
り、ループアウトしている１２０番、１５１番、１６４
番付近をターゲットとするリボザイム（配列表の配列番
号１〜３、下記の式（３）〜（５）参照）を設計した。

【００３２】

【化４】

【００３３】

【化５】

【００３４】

【化６】

【００３５】これらの設計に従い、ＤＮＡ−ＲＮＡ合成
機を用いて合成した。但し、式（３）〜（５）におい
て、下線部はＳオリゴＤＮＡ（ＵのかわりにＴを用い
た）を用い、それ以外はＲＮＡを用いて合成した。

【００３６】〔実施例２：リポソーム製剤の製造〕フォ
スファチジルセリン、フォスファチジルコリン及びコレ
ステロール（重量比１：４．８：２、合計１０ｍｇ）を
テトラヒドロフランに溶解させて三つの脂質溶液を得
た。ロータリーエバポレーターを用いて、これら脂質溶
液からテトラヒドロフランを留去し、脂質をフラスコ内
表面にそれぞれ付着させた。

【００３７】これら各フラスコに、実施例１で得られた
各リボザイム（各１０nmol）を含む三つの生理食塩水
（ＢＳＳ；139mM のNaCl, 5.4mM のKCl, 10mM のTris-H
Cl, pH7.6) 200 μl をそれぞれ加え、常法により攪拌
及び超音波処理して、リボザイムを含むリポソーム懸濁
液をそれぞれ調製した。得られた各リポソーム懸濁液
（0.5ml, 10mg の脂質を含有する。）に、精製したセン
ダイウイルス（Ｚ株：10000 hemaglutinating units ）
を混合し、ＢＳＳでそれぞれ合計４ｍｌとした。なお、
センダイウイルスは、使用する３分前にＵＶ照射（１１
０ｅｒｇ／ｍｍ² ／ｓｅｃ）により不活化した。

【００３８】各混合物を４℃で５分間保持した後、３７
℃で穏やかに３０分間振とうした。スクロース密度勾配
遠心により、リポソームに結合していないセンダイウイ
ルスを除いた後、最上層を採取し、ＢＳＳで濃度を調節
して、１μＭのリボザイムが封入されたリポソーム製剤
をそれぞれ得た。

【００３９】また、同様にヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子
（２００μｇ）を用い、上記の方法と同様にしてヒトア
ポ蛋白（ａ）遺伝子を封入したリポソーム製剤を得た。

【００４０】〔実験例〕マウス培養肝細胞に、実施例２
で得られたヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子封入リボソーム単
独、又は式（４）の構造を持つリボザイムを封入したリ
ポソーム及びヒトアポ蛋白（ａ）遺伝子封入リポソーム
の混合物を添加し、４℃で１０分間、その後３７℃で３
０分間インキュベートした後、３日後に上清の中のリポ
蛋白（ａ）、アポ蛋白（ａ）及びプラスミノーゲンを測
定した。結果は、表１に示すようにリボザイムの投与に
より、プラスミノーゲン発現は変化なく、ヒトアポ蛋白
（ａ）遺伝子封入リポソーム単独の場合よりも、アポ蛋
白（ａ）の発現・産生のみが抑制された。発現・産生量
は培養上清をそれぞれに対するモノクローナル抗体を用
いて測定した。表１中の数値の単位はｍｇ／ｄｌであ
る。

【００４１】

【表１】

【００４２】また、アポ蛋白（ａ）遺伝子の導入された
培養肝細胞培地の血管平滑筋細胞への添加により細胞増
殖は抑制された。アポ蛋白（ａ）遺伝子の導入されたマ
ウス肝臓においても、リボザイムはアポ蛋白（ａ）遺伝
子発現を抑制した。

【００４３】アポ蛋白（ａ）に対するリボザイムがプラ
スミノーゲンに影響を与えることなく、選択的にアポ蛋
白（ａ）のみを抑制することが示され、動脈硬化、特に
高リポ蛋白（ａ）血症に有効であると考えられる。

【００４４】

【発明の効果】本発明のリポソーム製剤は、リボザイム
を含有するものであるから、効果的に細胞内でリボザイ
ムを働かせることができる。特にリポソームがセンダイ
ウイルス又はその処理物で処理されたものは、患部の細
胞内又は目的とする組織の細胞内への取り込みが促進さ
れる。

【００４５】本発明のリポソーム製剤において、リボザ
イムが特定の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを特異的に
分解するものであれば、当該遺伝子に起因する疾患等を
予防及び／又は治療することが可能となる。例えば、リ
ボザイムがアポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリボザ
イムであれば、動脈硬化症や高リポ蛋白質（ａ）血症の
予防及び／又は治療が可能となる。

【００４６】本発明のリボザイムは、アポ蛋白（ａ）の
ｍＲＮＡを分解するリボザイムであり、血栓溶解に重要
なプラスミノーゲンに影響を与えることなく、選択的に
アポ蛋白（ａ）のみを抑制できるから、当該リボザイム
を含有する製剤、特にリポソーム製剤は、動脈硬化症や
高リポ蛋白質（ａ）血症の予防及び／又は治療に有効で
ある。

【００４７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 配列： AGCAAUCCUG CUGAUGAGUC CGUGAGGACG AAACCACAUG GC 42

【００４８】配列番号：2 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 配列： GUGCCUCGAU CUGAUGAGUC CGUGAGGACG AAACUCUGUC CA 42

【００４９】配列番号：3 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 配列： AGUGGUGGAG CUGAUGAGUC CGUGAGGACG AAACGUGCCU CG 42

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 48/00 // Ａ６１Ｋ 48/00 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 荻原 俊男 大阪府箕面市桜ヶ丘２−７−29 (72)発明者 金田 安史 大阪府箕面市小野原東６−12−８ (72)発明者 菊池 洋 愛知県豊橋市北山町東浦２−１−３−102

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リボザイムを含有するリポソーム製剤。
2. 【請求項２】 アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリ
   ボザイムを含有する請求項１記載のリポソーム製剤。
3. 【請求項３】 リポソームをセンダイウイルス又はその
   処理物で処理した請求項１記載のリポソーム製剤。
4. 【請求項４】 特定の遺伝子から転写されたｍＲＮＡを
   特異的に分解するリボザイムを含有するリポソーム製
   剤。
5. 【請求項５】 アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリ
   ボザイムを含有する動脈硬化症の予防及び／又は治療
   剤。
6. 【請求項６】 アポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡを分解するリ
   ボザイムを含有する高リポ蛋白質（ａ）血症の予防及び
   ／又は治療剤。
7. 【請求項７】 一般式（１） 【化１】 〔式中、Ｘは任意のヌクレオチドを表し、Ｘｎ及びＸｍ
   は任意のオリゴヌクレオチドで形成され、一緒になって
   ステムループを形成し、3'- （Ｙ）ＣＡ（Ｚ）-5' でア
   ポ蛋白（ａ）のｍＲＮＡの相補配列となり、（Ｙ）及び
   （Ｚ）は３塩基以上のヌクレオチドである。〕で示され
   るＲＮＡ鎖又はその類似体であるところのリボザイム。