JPH09220090A - 新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途 - Google Patents
新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途Info
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- JPH09220090A JPH09220090A JP33093896A JP33093896A JPH09220090A JP H09220090 A JPH09220090 A JP H09220090A JP 33093896 A JP33093896 A JP 33093896A JP 33093896 A JP33093896 A JP 33093896A JP H09220090 A JPH09220090 A JP H09220090A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安定性の向上した新規なサーモライシン様プロ
テアーゼ、及びこれをフェニルアラニンメチルエステル
（ＰＭ）とのカップリング反応に使用してその反応効率
の向上に資する方法の提供。 【解決手段】水溶性媒体中で、Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニルアスパラギン酸（Ｚ−Ａｓｐ）及びＰＭとのカッ
プリングにサーモライシン様プロテアーゼを使用する酵
素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの合成
方法において、該サーモライシン中に存在し、特定のア
ミノ酸残基により囲まれている電子密度における空孔の
容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残
基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性又はかさの大きい
アミノ酸残基により置換していることにより、又は、電
子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与えることに
より、その空孔の少なくとも一部が埋められ、その空孔
の容積が減少していることを特徴とする新規なサーモラ
イシン様プロテアーゼ、及び、そのプロテアーゼをＺ−
Ａｓｐ及びＰＭとのカップリング反応に使用する方法。
テアーゼ、及びこれをフェニルアラニンメチルエステル
（ＰＭ）とのカップリング反応に使用してその反応効率
の向上に資する方法の提供。 【解決手段】水溶性媒体中で、Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニルアスパラギン酸（Ｚ−Ａｓｐ）及びＰＭとのカッ
プリングにサーモライシン様プロテアーゼを使用する酵
素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの合成
方法において、該サーモライシン中に存在し、特定のア
ミノ酸残基により囲まれている電子密度における空孔の
容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残
基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性又はかさの大きい
アミノ酸残基により置換していることにより、又は、電
子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与えることに
より、その空孔の少なくとも一部が埋められ、その空孔
の容積が減少していることを特徴とする新規なサーモラ
イシン様プロテアーゼ、及び、そのプロテアーゼをＺ−
Ａｓｐ及びＰＭとのカップリング反応に使用する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、水溶性媒体中でＮ
−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（以降、Ｚ
−Ａｓｐ、と略記し、このＺ−ＡｓｐはＺ−Ｌ−Ａｓｐ
又はＺ−Ａｓｐラセミ体を意味する）及びフェニルアラ
ニンメチルエステル（以降、ＰＭと略記し、このＰＭは
Ｌ−ＰＭ又はＰＭラセミ体を意味する）のカップリング
にサーモライシン様プロテアーゼを使用して、酵素反応
によりベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以降、Ｚ−
ＡＰＭに略記する）を合成する改善された方法に関連す
る。
−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（以降、Ｚ
−Ａｓｐ、と略記し、このＺ−ＡｓｐはＺ−Ｌ−Ａｓｐ
又はＺ−Ａｓｐラセミ体を意味する）及びフェニルアラ
ニンメチルエステル（以降、ＰＭと略記し、このＰＭは
Ｌ−ＰＭ又はＰＭラセミ体を意味する）のカップリング
にサーモライシン様プロテアーゼを使用して、酵素反応
によりベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以降、Ｚ−
ＡＰＭに略記する）を合成する改善された方法に関連す
る。
【０００２】この発明は高度に安定化された新規なサー
モライシン様プロテアーゼにも関連する。
モライシン様プロテアーゼにも関連する。
【０００３】Ｚ−ＡＰＭは砂糖の約２００倍の甘味度を
有し、苦味が残らない等の優れた嗜好性を有する重要な
人工甘味料であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル（以降、ＡＰＭと略記する）の
合成の前駆体である。
有し、苦味が残らない等の優れた嗜好性を有する重要な
人工甘味料であるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル（以降、ＡＰＭと略記する）の
合成の前駆体である。
【０００４】
【従来の技術】水溶性媒体中でＮ−ベンジルオキシカル
ボニルアスパラギン酸及びフェニルアラニンメチルエス
テルのカップリングにサーモライシン様プロテアーゼを
使用して、酵素反応によりベンジルオキシカルボニル−
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルを酵素反応により合成する方法は、特開平８−１
９６２９２に記載されている。このプロセスにおいて
は、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭがほぼ等モル使用され、反応
系のｐＨが４．５〜６．０の範囲であり、高濃度の塩が
必要であり、反応中のサーモライシンの活性はかなり高
いが、反応開始時と比較して、反応終了時における酵素
の活性低下は著しいことが分かっており、この低下は酵
素の使用量が大きくなり、コストアップに繋がってしま
う。
ボニルアスパラギン酸及びフェニルアラニンメチルエス
テルのカップリングにサーモライシン様プロテアーゼを
使用して、酵素反応によりベンジルオキシカルボニル−
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルを酵素反応により合成する方法は、特開平８−１
９６２９２に記載されている。このプロセスにおいて
は、Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭがほぼ等モル使用され、反応
系のｐＨが４．５〜６．０の範囲であり、高濃度の塩が
必要であり、反応中のサーモライシンの活性はかなり高
いが、反応開始時と比較して、反応終了時における酵素
の活性低下は著しいことが分かっており、この低下は酵
素の使用量が大きくなり、コストアップに繋がってしま
う。
【０００５】ここで、本発明をさらに理解するために、
サーモライシン及びその安定性に関する情報を以下に示
す。
サーモライシン及びその安定性に関する情報を以下に示
す。
【０００６】サーモライシンはバチルス・サーモプロテ
オリチカス（Bacillus thermoproteo-lyticus ）の培養
液中に最初に発見された金属プロテアーゼである（End
o,S.(1962) J. Fermentation Tech.,40, 346-353 ）。
そのアミノ酸配列（Titani,K.,etal., (1972) Nature N
ew Biol., 238 , 35-37; EP-A-0418625; Miki, Y.(199
4),J. Mol. Biol. 160 , 623-639)や三次元構造（Vrien
d,G.(1993), J. Computer- Aided Molecular Design, 7
, 367-396 ; Holmes, M.A. and Mattews, B.W.,(198
2), J. Mol.Biol. 160, 623-639)及び触媒機構(Kester,
R.,K., andMattews B.W.,(1982) J. Biol. Chem. 252,
7704-7710)が記載されている。
オリチカス（Bacillus thermoproteo-lyticus ）の培養
液中に最初に発見された金属プロテアーゼである（End
o,S.(1962) J. Fermentation Tech.,40, 346-353 ）。
そのアミノ酸配列（Titani,K.,etal., (1972) Nature N
ew Biol., 238 , 35-37; EP-A-0418625; Miki, Y.(199
4),J. Mol. Biol. 160 , 623-639)や三次元構造（Vrien
d,G.(1993), J. Computer- Aided Molecular Design, 7
, 367-396 ; Holmes, M.A. and Mattews, B.W.,(198
2), J. Mol.Biol. 160, 623-639)及び触媒機構(Kester,
R.,K., andMattews B.W.,(1982) J. Biol. Chem. 252,
7704-7710)が記載されている。
【０００７】これらの記載によると、サーモリラインの
分子中に含まれる亜鉛イオンと同様に１４３番目のグル
タミン酸残基及び２３１番目のヒスチジンが、サーモラ
イシンにおけるプロテアーゼ活性の発現に対して重要で
あることが指摘された。これ以後、これらの１４３番目
及び２３１番目のアミノ酸残基をプロテアーゼ反応に対
する触媒残基と略記する。
分子中に含まれる亜鉛イオンと同様に１４３番目のグル
タミン酸残基及び２３１番目のヒスチジンが、サーモラ
イシンにおけるプロテアーゼ活性の発現に対して重要で
あることが指摘された。これ以後、これらの１４３番目
及び２３１番目のアミノ酸残基をプロテアーゼ反応に対
する触媒残基と略記する。
【０００８】サーモライシンと同様のアミノ酸配列を有
し、サーモライシンと同じ様な触媒活性を有するプロテ
アーゼが文献（例えば、Imanaka, et. al., (1986) Nat
ure,324 , 695-697)に報告された。サーモライシンのア
ミノ酸配列の特定の場所に変異を導入することに関する
研究も文献（Kubo, M., et al，(1992) Appl.Environ.
Microbiol., 58, 3779-3787 ）及び特許出願（EP-A-
0.616.033）に報告されている。その特許出願におい
て、１４４番目、１５０番目、１８７番目及び２２７番
目への変異導入は、酵素活性を向上することが示されて
いる。これ以降、野性型サーモライシンのＺ−ＡＰＭ合
成活性値の０．２〜１０倍活性値が高いプロテアーゼを
“サーモライシン様プロテアーゼ”と略記する。
し、サーモライシンと同じ様な触媒活性を有するプロテ
アーゼが文献（例えば、Imanaka, et. al., (1986) Nat
ure,324 , 695-697)に報告された。サーモライシンのア
ミノ酸配列の特定の場所に変異を導入することに関する
研究も文献（Kubo, M., et al，(1992) Appl.Environ.
Microbiol., 58, 3779-3787 ）及び特許出願（EP-A-
0.616.033）に報告されている。その特許出願におい
て、１４４番目、１５０番目、１８７番目及び２２７番
目への変異導入は、酵素活性を向上することが示されて
いる。これ以降、野性型サーモライシンのＺ−ＡＰＭ合
成活性値の０．２〜１０倍活性値が高いプロテアーゼを
“サーモライシン様プロテアーゼ”と略記する。
【０００９】この様に、ここで言う“サーモライシン様
プロテアーゼ”とは、アミノ酸配列が配列表１に示すア
ミノ酸配列と一致するプロテアーゼか、又は、配列表１
に示すアミノ酸配列において、一つ又はそれ以上のアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されているプロ
テアーゼ、又は、一か所もしくはそれ以上の場所に、一
残基もしくはそれ以上のアミノ酸残基が挿入されている
か、もしくは、一つ以上のアミノ酸残基が脱落している
アミノ酸配列を有する金属プロテアーゼである。
プロテアーゼ”とは、アミノ酸配列が配列表１に示すア
ミノ酸配列と一致するプロテアーゼか、又は、配列表１
に示すアミノ酸配列において、一つ又はそれ以上のアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されているプロ
テアーゼ、又は、一か所もしくはそれ以上の場所に、一
残基もしくはそれ以上のアミノ酸残基が挿入されている
か、もしくは、一つ以上のアミノ酸残基が脱落している
アミノ酸配列を有する金属プロテアーゼである。
【００１０】野性型サーモライシンや、その様にして変
異を導入したサーモライシンは、中性付近の緩衝液では
非常に安定であり、その様なｐＨでは非常に活性が高
い。サーモライシン及び“サーモライシン様プロテアー
ゼ”の安定性は、ｐＨが約４．５〜６の範囲の弱酸中で
は減少する；サーモライシンはｐＨが４以下では完全に
失活することが知られている。
異を導入したサーモライシンは、中性付近の緩衝液では
非常に安定であり、その様なｐＨでは非常に活性が高
い。サーモライシン及び“サーモライシン様プロテアー
ゼ”の安定性は、ｐＨが約４．５〜６の範囲の弱酸中で
は減少する；サーモライシンはｐＨが４以下では完全に
失活することが知られている。
【００１１】さらに、サーモライシンの安定性は、ベン
ジルオキシカルボニル−α−アスパラギン酸（以降、Ｚ
−Ａｓｐと略記する。）の濃度により変化することが知
られており（特開平８−１３１１７０）、その中で、サ
ーモライシンは、３０倍以上のモル比でＺ−Ａｓｐを存
在させると安定化し、また、この効果はＺ−ＡＰＭの合
成のためのカップリング反応に有利であるかもしれない
と記載されている。しかしながら、この特許において
は、長時間に亘るＺ−ＡＰＭの合成の間のサーモライシ
ンの安定性や、非常に低い活性触媒の濃度におけるＺ−
ＡＰＭカップリング生成反応については全く記述されて
いない。
ジルオキシカルボニル−α−アスパラギン酸（以降、Ｚ
−Ａｓｐと略記する。）の濃度により変化することが知
られており（特開平８−１３１１７０）、その中で、サ
ーモライシンは、３０倍以上のモル比でＺ−Ａｓｐを存
在させると安定化し、また、この効果はＺ−ＡＰＭの合
成のためのカップリング反応に有利であるかもしれない
と記載されている。しかしながら、この特許において
は、長時間に亘るＺ−ＡＰＭの合成の間のサーモライシ
ンの安定性や、非常に低い活性触媒の濃度におけるＺ−
ＡＰＭカップリング生成反応については全く記述されて
いない。
【００１２】また、本発明者等の最近の検討により、ｐ
Ｈ＝４．５〜６の範囲では、そのカップリング反応にお
いて、この酵素の安定性が十分でなく、０．３モル／リ
ットル以上のＺ−Ａｓｐ濃度でも、このカップリング反
応は効率的に実施できないことが明らかとなった。
Ｈ＝４．５〜６の範囲では、そのカップリング反応にお
いて、この酵素の安定性が十分でなく、０．３モル／リ
ットル以上のＺ−Ａｓｐ濃度でも、このカップリング反
応は効率的に実施できないことが明らかとなった。
【００１３】一方、文献（Nakanishi et al (1990) App
l. Microbiol. Biotechnol. 32,633-636)によると、Ｚ
−Ａｓｐの存在はかえってサーモライシンの安定性に悪
影響を及ぼすことが示されている。
l. Microbiol. Biotechnol. 32,633-636)によると、Ｚ
−Ａｓｐの存在はかえってサーモライシンの安定性に悪
影響を及ぼすことが示されている。
【００１４】他方、サーモライシンと反対に、ｐＨ＝７
付近でＺ−ＡＰＭの不安定であり、ｐＨ＝４．５〜６の
弱酸中でより安定である。
付近でＺ−ＡＰＭの不安定であり、ｐＨ＝４．５〜６の
弱酸中でより安定である。
【００１５】ｐＨ＝７付近でのＺ−ＡＰＭの不安定性と
ｐＨ＝４．５〜６付近でのサーモライシンの不安定性
は、サーモライシンを使用するＺ−ＡＰＭの合成を効率
良く進めるのに大きな障害となっている。ｐＨ＝７付近
でサーモライシンを使用してＺ−ＡｓｐとＰＭとのカッ
プリング反応によりＺ−ＡＰＭを合成する場合は、生成
したＺ−ＡＰＭと出発原料のＰＭが分解し、サーモライ
シンが安定であるが、Ｚ−ＡＰＭの回収率が低下すると
いう問題がある。また、ｐＨ＝４．５〜６付近でこの反
応を実施すると、サーモライシンが活性低下するという
傾向があり、原料および生成物は安定であるがＺ−ＡＰ
Ｍの効率的合成は困難である。
ｐＨ＝４．５〜６付近でのサーモライシンの不安定性
は、サーモライシンを使用するＺ−ＡＰＭの合成を効率
良く進めるのに大きな障害となっている。ｐＨ＝７付近
でサーモライシンを使用してＺ−ＡｓｐとＰＭとのカッ
プリング反応によりＺ−ＡＰＭを合成する場合は、生成
したＺ−ＡＰＭと出発原料のＰＭが分解し、サーモライ
シンが安定であるが、Ｚ−ＡＰＭの回収率が低下すると
いう問題がある。また、ｐＨ＝４．５〜６付近でこの反
応を実施すると、サーモライシンが活性低下するという
傾向があり、原料および生成物は安定であるがＺ−ＡＰ
Ｍの効率的合成は困難である。
【００１６】従って、ｐＨ＝４．５〜６付近でのサーモ
ライシンの安定性を改善すれば、Ｚ−ＡＰＭをこのｐＨ
領域で効率的に合成することができる。
ライシンの安定性を改善すれば、Ｚ−ＡＰＭをこのｐＨ
領域で効率的に合成することができる。
【００１７】先行文献としての（特開平６−１８１７６
１）には、１４４番目ロイシン残基、１５０番目アスパ
ラギン酸残基、１８７番目のグルタミン酸残基及び２２
７番目のアスパラギン残基の少なくとも１つのアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基と置換することにより、Ｚ−Ａ
ＰＭ分解及びＺ−ＡＰＭ合成に対する酵素活性が改善さ
れたことが開示されている。ここでは、Ｚ−Ａｓｐ／Ｐ
Ｍのモル比が約０．５であり、ｐＨ＝７付近でＺ−ＡＰ
Ｍが分解又は合成がされた。しかしながら、このプロテ
アーゼの安定性、特に、ｐＨ＝７以下で、Ｚ−Ａｓｐ／
ＰＭのモル比が０．８〜１．７でのＺ−ＡＰＭの合成に
使用された場合の安定性については、全く検討されてい
ない。
１）には、１４４番目ロイシン残基、１５０番目アスパ
ラギン酸残基、１８７番目のグルタミン酸残基及び２２
７番目のアスパラギン残基の少なくとも１つのアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基と置換することにより、Ｚ−Ａ
ＰＭ分解及びＺ−ＡＰＭ合成に対する酵素活性が改善さ
れたことが開示されている。ここでは、Ｚ−Ａｓｐ／Ｐ
Ｍのモル比が約０．５であり、ｐＨ＝７付近でＺ−ＡＰ
Ｍが分解又は合成がされた。しかしながら、このプロテ
アーゼの安定性、特に、ｐＨ＝７以下で、Ｚ−Ａｓｐ／
ＰＭのモル比が０．８〜１．７でのＺ−ＡＰＭの合成に
使用された場合の安定性については、全く検討されてい
ない。
【００１８】他の先行文献として既述の特開平８−１３
１１７０には、Ｎ−保護アミノ酸の添加による金属プロ
テアーゼの安定化について開示されている。ここでは、
Ｚ−Ａｓｐ／ＰＭのモル比が約０．５であり、ｐＨ＝６
付近でＺ−ＡＰＭが分解又は合成がされた。しかしなが
ら、この文献においても、このプロテアーゼの安定性、
特に、ｐＨ＝６以下で、Ｚ−Ａｓｐ／ＰＭのモル比が
０．８〜１．７でのＺ−ＡＰＭの合成に使用された場合
の安定性については、全く検討されていない。
１１７０には、Ｎ−保護アミノ酸の添加による金属プロ
テアーゼの安定化について開示されている。ここでは、
Ｚ−Ａｓｐ／ＰＭのモル比が約０．５であり、ｐＨ＝６
付近でＺ−ＡＰＭが分解又は合成がされた。しかしなが
ら、この文献においても、このプロテアーゼの安定性、
特に、ｐＨ＝６以下で、Ｚ−Ａｓｐ／ＰＭのモル比が
０．８〜１．７でのＺ−ＡＰＭの合成に使用された場合
の安定性については、全く検討されていない。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】従って、酵素の活性低
下を少なくするプロセスの改善が必要性が存在してい
た。さらに、基質のモル比及びｐＨ領域に関してより柔
軟な反応条件が期待されている。
下を少なくするプロセスの改善が必要性が存在してい
た。さらに、基質のモル比及びｐＨ領域に関してより柔
軟な反応条件が期待されている。
【００２０】本発明の目的は、上述の様な課題を解決
し、従来のサーモライシン様プロテアーゼの安定性、特
に、約４．５〜６．０のｐＨ領域での安定性を向上さ
せ、この安定化されたサーモライシン様プロテアーゼを
Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭとのカップリング反応に使用し
て、ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを合成して、こ
の合成方法の効率を向上する方法を提供することにあ
る。
し、従来のサーモライシン様プロテアーゼの安定性、特
に、約４．５〜６．０のｐＨ領域での安定性を向上さ
せ、この安定化されたサーモライシン様プロテアーゼを
Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭとのカップリング反応に使用し
て、ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを合成して、こ
の合成方法の効率を向上する方法を提供することにあ
る。
【００２１】
【課題を解決するための手段】発明者等は、文献（Vrie
nd,G. and Eijsink, V.(1993), J. Computer-Aided Mol
ecular Design, 7, 367-396; Holmes, M.A. and Mattew
s, B.W.,(1982), J.Mol.Biol. 160,623-639)に明かにさ
れているサーモライシンの立体構造を詳細に解析した結
果、酵素分子中央部に空隙が存在し、この空隙を埋める
ことが出来れば、サーモリシン様プロテアーゼの安定性
を向上させることが可能であることを突き止めた。さら
に、詳細に検討した結果、そのサーモリシン様プロテア
ーゼにおいて、１４４番目のロイシン残基、１４９番目
のスレオニン残基、２４０番目のアラニン残基、２７０
番目のアラニン残基、２８８番目のアラニン残基により
囲まれている電子密度における空孔の容積を、それらの
残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、そのアミノ
酸残基よりも疎水性又はかさの大きいアミノ酸残基によ
り置換していることにより、又は、電子密度の空孔を囲
むアミノ酸残基に影響を与える（その周辺の部位のアミ
ノ酸置換を行う）ことにより、その空孔の少なくとも一
部が埋められ、その空孔の容積を減少させることが可能
であること、及び、この様なサーモライシン様プロテア
ーゼは、低ｐＨやＺ−Ａｓｐの濃度が高い状態におい
て、他のプロテアーゼよりも安定性が優れていることを
見出だし、本発明を完成するに至った。
nd,G. and Eijsink, V.(1993), J. Computer-Aided Mol
ecular Design, 7, 367-396; Holmes, M.A. and Mattew
s, B.W.,(1982), J.Mol.Biol. 160,623-639)に明かにさ
れているサーモライシンの立体構造を詳細に解析した結
果、酵素分子中央部に空隙が存在し、この空隙を埋める
ことが出来れば、サーモリシン様プロテアーゼの安定性
を向上させることが可能であることを突き止めた。さら
に、詳細に検討した結果、そのサーモリシン様プロテア
ーゼにおいて、１４４番目のロイシン残基、１４９番目
のスレオニン残基、２４０番目のアラニン残基、２７０
番目のアラニン残基、２８８番目のアラニン残基により
囲まれている電子密度における空孔の容積を、それらの
残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、そのアミノ
酸残基よりも疎水性又はかさの大きいアミノ酸残基によ
り置換していることにより、又は、電子密度の空孔を囲
むアミノ酸残基に影響を与える（その周辺の部位のアミ
ノ酸置換を行う）ことにより、その空孔の少なくとも一
部が埋められ、その空孔の容積を減少させることが可能
であること、及び、この様なサーモライシン様プロテア
ーゼは、低ｐＨやＺ−Ａｓｐの濃度が高い状態におい
て、他のプロテアーゼよりも安定性が優れていることを
見出だし、本発明を完成するに至った。
【００２２】即ち、本発明は、水溶性媒体中で、Ｚ−Ａ
ｓｐとＰＭとのカップリング反応にサーモライシン様プ
ロテアーゼを使用する酵素反応によるＺ−ＡＰＭの合成
方法において、配列表１のアミノ酸配列を有するサーモ
ライシン中に存在し、少なくとも１４４番目のロイシン
残基、１４９番目のスレオニン残基、２４０番目のアラ
ニン残基、２７０番目のアラニン残基、２８８番目のア
ラニン残基により囲まれている電子密度における空孔の
容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残
基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及び嵩の大きいア
ミノ酸残基により置換していることにより、又は、電子
密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与える（その周
辺の部位のアミノ酸置換を行う）ことにより、その空孔
の少なくとも一部が埋められ、その空孔の容積が減少し
ている新規なサーモリシン様プロテアーゼを使用するこ
とを特徴とする酵素反応によるＺ−ＡＰＭ合成方法、特
に、置換するアミノ酸残基としては、ヒスチジン、イソ
ロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、スレオニン、
チロシン及びバリンの群から選ばれるアミノ酸残基が好
ましく、さらに、１４４番目のロイシン残基がフェニル
アラニン残基又はチロシン残基で置換されることを特徴
とする新規なサーモライシン様プロテアーゼを使用する
ことが特に好ましい。
ｓｐとＰＭとのカップリング反応にサーモライシン様プ
ロテアーゼを使用する酵素反応によるＺ−ＡＰＭの合成
方法において、配列表１のアミノ酸配列を有するサーモ
ライシン中に存在し、少なくとも１４４番目のロイシン
残基、１４９番目のスレオニン残基、２４０番目のアラ
ニン残基、２７０番目のアラニン残基、２８８番目のア
ラニン残基により囲まれている電子密度における空孔の
容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残
基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及び嵩の大きいア
ミノ酸残基により置換していることにより、又は、電子
密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与える（その周
辺の部位のアミノ酸置換を行う）ことにより、その空孔
の少なくとも一部が埋められ、その空孔の容積が減少し
ている新規なサーモリシン様プロテアーゼを使用するこ
とを特徴とする酵素反応によるＺ−ＡＰＭ合成方法、特
に、置換するアミノ酸残基としては、ヒスチジン、イソ
ロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、スレオニン、
チロシン及びバリンの群から選ばれるアミノ酸残基が好
ましく、さらに、１４４番目のロイシン残基がフェニル
アラニン残基又はチロシン残基で置換されることを特徴
とする新規なサーモライシン様プロテアーゼを使用する
ことが特に好ましい。
【００２３】以下の表１に、アミノ酸残基のかさの大き
さ（単位：ｃｍ3／ｍｏｌ，文献（Zamyatnin, A.A.(198
4) Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,13, 145-165) からの
値）及び疎水性の大きさ（π値，文献（Fauchere, J.L.
and Pliska, V.(1983) Eur.J. Med Chem., 18, 369-37
5)からの値）を示す。
さ（単位：ｃｍ3／ｍｏｌ，文献（Zamyatnin, A.A.(198
4) Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,13, 145-165) からの
値）及び疎水性の大きさ（π値，文献（Fauchere, J.L.
and Pliska, V.(1983) Eur.J. Med Chem., 18, 369-37
5)からの値）を示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】この表からも明らかな様に、もとのアミノ
酸残基よりもかさの大きなアミノ酸残基を選んで置換す
ればよく、例えば、１４４番目のロイシン残基に対して
は、チロシン残基及びフェニルアラニン残基が適当であ
り、フェニルアラニン残基の方が、かさが大きいばかり
でなく、疎水性も大きく好ましい。１４９番目のスレオ
ニン残基に対しては、チロシン残基及びフェニルアラニ
ン残基の他に、イソロイシン、ヒスチジン及びバリンも
適当となる。特に、ヒスチジン以外はかさが大きいばか
りでなく、疎水性も大きく好ましい。
酸残基よりもかさの大きなアミノ酸残基を選んで置換す
ればよく、例えば、１４４番目のロイシン残基に対して
は、チロシン残基及びフェニルアラニン残基が適当であ
り、フェニルアラニン残基の方が、かさが大きいばかり
でなく、疎水性も大きく好ましい。１４９番目のスレオ
ニン残基に対しては、チロシン残基及びフェニルアラニ
ン残基の他に、イソロイシン、ヒスチジン及びバリンも
適当となる。特に、ヒスチジン以外はかさが大きいばか
りでなく、疎水性も大きく好ましい。
【００２６】また、このＺ−ＡＰＭの合成条件として、
その水溶性媒体のｐＨ＝４．３〜８．０、Ｚ−Ａｓｐ／
ＰＭのモル比が０．８〜１．７（通常は１：２）の範
囲、Ｚ−Ａｓｐの仕込み濃度が０．２モル／ｋｇ以上で
あることも特徴とし、特開平６−１８１７６１に記載さ
れている従来のサーモライシン様プロテアーゼは使用で
きない様な新規な反応系でのＺ−ＡＰＭの合成に使用す
る方法にも関する。
その水溶性媒体のｐＨ＝４．３〜８．０、Ｚ−Ａｓｐ／
ＰＭのモル比が０．８〜１．７（通常は１：２）の範
囲、Ｚ−Ａｓｐの仕込み濃度が０．２モル／ｋｇ以上で
あることも特徴とし、特開平６−１８１７６１に記載さ
れている従来のサーモライシン様プロテアーゼは使用で
きない様な新規な反応系でのＺ−ＡＰＭの合成に使用す
る方法にも関する。
【００２７】アミノ酸残基を置換する方法としては、特
開平６−１８１７６１にも記述されているＭ１３ファー
ジ変異生成方法（Vandeyar M.,et al., (1988) Gene,
65,129)がある。この方法は、最初に、プラスミドｐＵ
ＣＴＺ５５よりＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を取り出し、
制限酵素ＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ１
９に組み換えることにより、組み換え体ファージＭ１３
ＴＺＳｐ−Ｂｃを作製する。この組み換え体ファージＭ
１３ＴＺＢａ−Ｓｐを鋳型とし、変異導入プライマーと
逆方向プライマーを用いてＰＣＲ反応にて両プライマー
間を増幅し、得られる変異導入ＤＮＡ断片を制限酵素Ｓ
ｐｈＩとＢａｍＨＩにて消化し、プラスミドｐＵＢＴＺ
２のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片と置き換え、大腸菌に形
質転換することにより変異体が得られる方法である。
開平６−１８１７６１にも記述されているＭ１３ファー
ジ変異生成方法（Vandeyar M.,et al., (1988) Gene,
65,129)がある。この方法は、最初に、プラスミドｐＵ
ＣＴＺ５５よりＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を取り出し、
制限酵素ＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ１
９に組み換えることにより、組み換え体ファージＭ１３
ＴＺＳｐ−Ｂｃを作製する。この組み換え体ファージＭ
１３ＴＺＢａ−Ｓｐを鋳型とし、変異導入プライマーと
逆方向プライマーを用いてＰＣＲ反応にて両プライマー
間を増幅し、得られる変異導入ＤＮＡ断片を制限酵素Ｓ
ｐｈＩとＢａｍＨＩにて消化し、プラスミドｐＵＢＴＺ
２のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片と置き換え、大腸菌に形
質転換することにより変異体が得られる方法である。
【００２８】組み換え体ファージＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ
を鋳型とし、順方向変異導入プライマーとＭ１３逆方向
変異導入プライマーを用い、ＰＣＲ反応にて両プライマ
ー間を増幅する（ＰＣＲ１）。これとは別にＭ１３ＴＺ
Ｂａ−Ｓｐを鋳型とし、逆方向変異導入プライマーとＭ
１３順方向変異導入プライマーを用い、ＰＣＲ反応にて
両プライマー間を増幅する（ＰＣＲ２）。反応液中のプ
ライマーを除去した後、変異導入された両ＤＮＡ断片と
Ｍ１３順方向変異導入プライマー及びＭ１３逆方向変異
導入プライマーを用い、ＰＣＲ反応にて両ＤＮＡ断片を
伸長させる（ＰＣＲ３）。得られる変異導入されたＤＮ
Ａ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＢａｍＨＩにて消化し、プ
ラスミドｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片と置
き換え、大腸菌に形質転換することにより変異体が得ら
れる。この構築方法を図４に示す。
を鋳型とし、順方向変異導入プライマーとＭ１３逆方向
変異導入プライマーを用い、ＰＣＲ反応にて両プライマ
ー間を増幅する（ＰＣＲ１）。これとは別にＭ１３ＴＺ
Ｂａ−Ｓｐを鋳型とし、逆方向変異導入プライマーとＭ
１３順方向変異導入プライマーを用い、ＰＣＲ反応にて
両プライマー間を増幅する（ＰＣＲ２）。反応液中のプ
ライマーを除去した後、変異導入された両ＤＮＡ断片と
Ｍ１３順方向変異導入プライマー及びＭ１３逆方向変異
導入プライマーを用い、ＰＣＲ反応にて両ＤＮＡ断片を
伸長させる（ＰＣＲ３）。得られる変異導入されたＤＮ
Ａ断片を制限酵素ＳｐｈＩとＢａｍＨＩにて消化し、プ
ラスミドｐＵＢＴＺ２のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片と置
き換え、大腸菌に形質転換することにより変異体が得ら
れる。この構築方法を図４に示す。
【００２９】以下の実施例及び比較例により本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等
制限されるものではない。
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等
制限されるものではない。
【００３０】
実施例１ 前述したサーモライシンと同一のアミノ酸配列を有する
プロテアーゼの遺伝子ｎｐｒＭを用いた表記プロテアー
ゼの製造方法について説明する。なお、以下、ｎｐｒＭ
遺伝子にコードされたプロテアーゼを野性型酵素と呼
ぶ。即ち、野性型酵素の１４４番目のロイシン残基をフ
ェニルアラニン残基またはチロシン残基に置換する方法
を述べる。
プロテアーゼの遺伝子ｎｐｒＭを用いた表記プロテアー
ゼの製造方法について説明する。なお、以下、ｎｐｒＭ
遺伝子にコードされたプロテアーゼを野性型酵素と呼
ぶ。即ち、野性型酵素の１４４番目のロイシン残基をフ
ェニルアラニン残基またはチロシン残基に置換する方法
を述べる。
【００３１】ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ１の１μ
ｇを２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス
−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）に
於いて、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩの各５ユニットにより３
７℃で２時間分解させた。このサンプルから１％アガロ
ースゲル電気泳動で約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離
し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを
用いて精製した。
ｇを２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス
−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）に
於いて、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩの各５ユニットにより３
７℃で２時間分解させた。このサンプルから１％アガロ
ースゲル電気泳動で約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離
し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キットを
用いて精製した。
【００３２】一方、プラスミドベクターｐＵＣ９の１μ
ｇを含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネ
シウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）に於いて、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩの各５ユニットに
よって３７℃で２時間反応させた。
ｇを含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネ
シウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）に於いて、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩの各５ユニットに
よって３７℃で２時間反応させた。
【００３３】このようにして得られたｐＭＫ１のｎｐｒ
Ｍ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片とｐＵＣ９のＰｓ
ｔＩ−ＢａｍＨＩの消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて反応させ、常法にしたがって大腸
菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ
−ＢａｍＨＩ断片を持つ組換え体プラスミド（ｐＵＣＴ
Ｚ５５）を得た（図１）。
Ｍ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片とｐＵＣ９のＰｓ
ｔＩ−ＢａｍＨＩの消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて反応させ、常法にしたがって大腸
菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ
−ＢａｍＨＩ断片を持つ組換え体プラスミド（ｐＵＣＴ
Ｚ５５）を得た（図１）。
【００３４】さらにプラスミドｐＵＣＴＺ５５の１μｇ
を２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）に
おいて、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニットを加え
て３７℃で２時間分解させた。このサンプルから１％ア
ガロースゲル電気泳動で約７３０ｋｂのＤＮＡ断片を分
離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キット
を用いて精製した。
を２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）に
おいて、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニットを加え
て３７℃で２時間分解させた。このサンプルから１％ア
ガロースゲル電気泳動で約７３０ｋｂのＤＮＡ断片を分
離し、バイオ１０１社ジーンクリーンＤＮＡ精製キット
を用いて精製した。
【００３５】一方、ファージベクターＭ１３ｍｐ１９の
１μｇを、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）に於いて、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニット
を加えて３７℃で２時間分解させた。
１μｇを、２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）に於いて、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩの各５ユニット
を加えて３７℃で２時間分解させた。
【００３６】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＳｐ
ｈＩ及びＢａｍＨＩの分解物とを宝酒造社製ＤＮＡライ
ゲーションキットを用いて連結反応を行った。この反応
混合物を、通常の方法で大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
し、ｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む
組換え体ファージ（Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ）を得た（図
２）。
ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＳｐ
ｈＩ及びＢａｍＨＩの分解物とを宝酒造社製ＤＮＡライ
ゲーションキットを用いて連結反応を行った。この反応
混合物を、通常の方法で大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
し、ｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む
組換え体ファージ（Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ）を得た（図
２）。
【００３７】得られた組換え体ファージ（Ｍ１３ＴＺＢ
ａ−Ｓｐ）から、通常の方法で、１本鎖ＤＮＡを調製
し、アミノ酸置換の導入に用いた。
ａ−Ｓｐ）から、通常の方法で、１本鎖ＤＮＡを調製
し、アミノ酸置換の導入に用いた。
【００３８】第１４４番目のロイシン残基のフェニルア
ラニンへの置換に使用されたアミノ酸置換導入用オリゴ
ヌクレオチドを以下のＳＥＱ ＩＤ：Ｎｏ．２に示し
た。
ラニンへの置換に使用されたアミノ酸置換導入用オリゴ
ヌクレオチドを以下のＳＥＱ ＩＤ：Ｎｏ．２に示し
た。
【００３９】 また、チロシンへの置換に使用されたアミノ酸置換導入
用オリゴヌクレオチドを以下のＳＥＱ ＩＤ：Ｎｏ．３
に示した。
用オリゴヌクレオチドを以下のＳＥＱ ＩＤ：Ｎｏ．３
に示した。
【００４０】 これらのオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステ
ムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて作成した。
以下これらを逆方向合成プライマーと呼ぶ。
ムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて作成した。
以下これらを逆方向合成プライマーと呼ぶ。
【００４１】調製した一本鎖ＤＮＡ０．５μｇをＰＣＲ
反応溶液（６７ｍＭ トリス（ｐＨ８．８）、１６．６
ｍＭ 硫酸アンモニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、 １μＭ 順方向Ｍ１３
ユニバーサルプライマー、１μＭ 逆方向合成プライマ
ー）に溶かして、１ユニットのＴｔｈ ＤＮＡポリメラ
ーゼを加えて、ミネラルオイルを一滴重層し、変性を９
３℃で１分、アニールを４５℃で１分、伸長を７２℃で
４５秒とし、遺伝子の増幅反応を３０サイクル繰り返し
た。反応終了後、水層を回収し、常法に従ってフェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行い、増幅されたＤＮＡを回
収した。このようにして得られたＤＮＡの半分量を含む
２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、
１００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）にＢａ
ｍＨＩ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間
反応させた。このようにして変異の導入されたｎｐｒＭ
遺伝子の約７３０ｂｐ断片を得た。
反応溶液（６７ｍＭ トリス（ｐＨ８．８）、１６．６
ｍＭ 硫酸アンモニウム、６．７ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、 １μＭ 順方向Ｍ１３
ユニバーサルプライマー、１μＭ 逆方向合成プライマ
ー）に溶かして、１ユニットのＴｔｈ ＤＮＡポリメラ
ーゼを加えて、ミネラルオイルを一滴重層し、変性を９
３℃で１分、アニールを４５℃で１分、伸長を７２℃で
４５秒とし、遺伝子の増幅反応を３０サイクル繰り返し
た。反応終了後、水層を回収し、常法に従ってフェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行い、増幅されたＤＮＡを回
収した。このようにして得られたＤＮＡの半分量を含む
２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、
１００ｍＭ 塩化ナトリウム １ｍＭ ＤＴＴ）にＢａ
ｍＨＩ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間
反応させた。このようにして変異の導入されたｎｐｒＭ
遺伝子の約７３０ｂｐ断片を得た。
【００４２】一方、三宅らによって既に構築されいるシ
ャトルベクター、即ち、大腸菌及び枯草菌の両方の宿主
で形質転換が可能であり、双方の宿主に於いてｎｐｒＭ
遺伝子を発現できるすることができるシャトルベクター
ｐＵＢＴＺ２（特開平５−１８４３６３）をＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｈＩで処理した７．４ｋｂ断片を得た。この
７．４ｋｂ断片と変異の導入された７３０ｂｐ断片とを
宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて反応さ
せ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、変異
の導入された組換体プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４
Ｆ）およびｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｙ）を得た（図
３）。
ャトルベクター、即ち、大腸菌及び枯草菌の両方の宿主
で形質転換が可能であり、双方の宿主に於いてｎｐｒＭ
遺伝子を発現できるすることができるシャトルベクター
ｐＵＢＴＺ２（特開平５−１８４３６３）をＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｈＩで処理した７．４ｋｂ断片を得た。この
７．４ｋｂ断片と変異の導入された７３０ｂｐ断片とを
宝酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて反応さ
せ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、変異
の導入された組換体プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４
Ｆ）およびｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｙ）を得た（図
３）。
【００４３】形質転換体大腸菌の生えている寒天培地上
にアルカリ溶液（０．２Ｎ 水酸化ナトリウム、０．２
％ ＳＤＳ）３ミリリットルを加えて溶菌させ、１ミリ
リットルを回収した。この回収した溶液に１ミリリット
ルの５Ｍ−酢酸カリウムを加えて氷中に１０分間放置し
たのち、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿
物を除去した。得られた上澄みを常法に従ってフェノー
ル処理、エタノール沈殿し、減圧下で乾燥した後、０．
２ミリリットルのＴＥ（１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、プラス
ミドを得た。こうして調製したプラスミドを常法に従っ
て枯草菌ＭＴ−２株に形質転換し、１％カゼインおよび
２０μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む寒天培地
に塗布し、１４０個のハローを形成するコロニーを選択
した。
にアルカリ溶液（０．２Ｎ 水酸化ナトリウム、０．２
％ ＳＤＳ）３ミリリットルを加えて溶菌させ、１ミリ
リットルを回収した。この回収した溶液に１ミリリット
ルの５Ｍ−酢酸カリウムを加えて氷中に１０分間放置し
たのち、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、沈殿
物を除去した。得られた上澄みを常法に従ってフェノー
ル処理、エタノール沈殿し、減圧下で乾燥した後、０．
２ミリリットルのＴＥ（１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、プラス
ミドを得た。こうして調製したプラスミドを常法に従っ
て枯草菌ＭＴ−２株に形質転換し、１％カゼインおよび
２０μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む寒天培地
に塗布し、１４０個のハローを形成するコロニーを選択
した。
【００４４】これらのコロニーを、それぞれ２０μｇ／
ミリリットルのカナマイシンを含むＬＢ培地３ミリリッ
トル中、３７℃で一夜培養し、培養液から常法に従って
プラスミドｐＵＢＴＺ２を抽出し、ＢａｍＨＩ、Ｓｐｈ
Ｉで処理を行い、７３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
回収したＤＮＡ断片の塩基配列をアプライドバイオシス
テムズ社（現在は、パーキンエルマー社）製ＤＮＡシー
ケンサー３７３Ａで分析し、１４４番目のアミノ酸残基
がフェニルアラニン残基である遺伝子ｎｐｒＭ（Ｌ１４
４Ｆ）またはチロシン残基である遺伝子ｎｐｒＭ（Ｌ１
４４Ｙ）を有するコロニーを選択した。
ミリリットルのカナマイシンを含むＬＢ培地３ミリリッ
トル中、３７℃で一夜培養し、培養液から常法に従って
プラスミドｐＵＢＴＺ２を抽出し、ＢａｍＨＩ、Ｓｐｈ
Ｉで処理を行い、７３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
回収したＤＮＡ断片の塩基配列をアプライドバイオシス
テムズ社（現在は、パーキンエルマー社）製ＤＮＡシー
ケンサー３７３Ａで分析し、１４４番目のアミノ酸残基
がフェニルアラニン残基である遺伝子ｎｐｒＭ（Ｌ１４
４Ｆ）またはチロシン残基である遺伝子ｎｐｒＭ（Ｌ１
４４Ｙ）を有するコロニーを選択した。
【００４５】このようにして得られる酵素遺伝子を有す
る菌株から目的の酵素Ｌ１４４Ｆ及びＬ１４４Ｙを以下
の様に得られた。即ち、本発明の遺伝子を有する枯草菌
ＭＴ−２株／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ）又は枯草菌Ｍ
Ｔ−２株／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｙ）を、５μｇ／ミ
リリットルの濃度でカナマイシンを含む５ミリリットル
のＬＢ培地に接種し、培養種として３７℃で８時間培養
した。その培養種を食塩以外はＬＢ培地の２倍の成分を
有する２Ｌ培地に接種して、菌株を３７℃で２０時間培
養した。培養時における培養種の量は、６６０ｎｍでの
培養液の吸光度が０．０２の値となる量とした。培養
後、培養液は、８０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離
し、培養液の上澄を得てから、その上澄に６０％飽和に
なるように硫安を加えた。得られた溶液は、４℃で１６
時間放置し、当該酵素は完全に沈殿した。酵素を含有す
る沈殿は８，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離により
回収した。その沈殿を溶解した緩衝液Ａ（１０ｍＭ ト
リス−塩酸、 ｐＨ９， １０ｍＭ 塩化カルシウム、
０．３Ｍ 硫酸アンモニウム）１００ミリリットルを
２０ミリリットルのブチルトヨパールのカラムに、酵素
を吸着させるために通し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ トリス
−塩酸、 ｐＨ９， １０ｍＭ 塩化カルシウム）を酵
素と不純物を別々に溶離させるために、１．５ミリリッ
トル／分の流速で流した。当該酵素を含有する溶離液を
集め、６０％飽和硫安にて塩析し、その沈殿を４℃で一
夜放置して熟成した。この沈殿を、１０，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、このようにして得られた沈殿を
緩衝液Ｃ（１０ｍＭ トリス−塩酸、 ｐＨ７．０，
１０ｍＭ 塩化カルシウム， １００ｍＭ 塩化ナトリ
ウム）３ミリリットルに溶解し、ゲル濾過カラム（ＴＳ
Ｋ Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷ２１．５×６００ｍｍ）
及び溶離液としてその緩衝液を使用して、Ｌ１４４Ｆ及
びＬ１４４Ｙの精製酵素を得た。
る菌株から目的の酵素Ｌ１４４Ｆ及びＬ１４４Ｙを以下
の様に得られた。即ち、本発明の遺伝子を有する枯草菌
ＭＴ−２株／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ）又は枯草菌Ｍ
Ｔ−２株／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｙ）を、５μｇ／ミ
リリットルの濃度でカナマイシンを含む５ミリリットル
のＬＢ培地に接種し、培養種として３７℃で８時間培養
した。その培養種を食塩以外はＬＢ培地の２倍の成分を
有する２Ｌ培地に接種して、菌株を３７℃で２０時間培
養した。培養時における培養種の量は、６６０ｎｍでの
培養液の吸光度が０．０２の値となる量とした。培養
後、培養液は、８０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離
し、培養液の上澄を得てから、その上澄に６０％飽和に
なるように硫安を加えた。得られた溶液は、４℃で１６
時間放置し、当該酵素は完全に沈殿した。酵素を含有す
る沈殿は８，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離により
回収した。その沈殿を溶解した緩衝液Ａ（１０ｍＭ ト
リス−塩酸、 ｐＨ９， １０ｍＭ 塩化カルシウム、
０．３Ｍ 硫酸アンモニウム）１００ミリリットルを
２０ミリリットルのブチルトヨパールのカラムに、酵素
を吸着させるために通し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ トリス
−塩酸、 ｐＨ９， １０ｍＭ 塩化カルシウム）を酵
素と不純物を別々に溶離させるために、１．５ミリリッ
トル／分の流速で流した。当該酵素を含有する溶離液を
集め、６０％飽和硫安にて塩析し、その沈殿を４℃で一
夜放置して熟成した。この沈殿を、１０，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、このようにして得られた沈殿を
緩衝液Ｃ（１０ｍＭ トリス−塩酸、 ｐＨ７．０，
１０ｍＭ 塩化カルシウム， １００ｍＭ 塩化ナトリ
ウム）３ミリリットルに溶解し、ゲル濾過カラム（ＴＳ
Ｋ Ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷ２１．５×６００ｍｍ）
及び溶離液としてその緩衝液を使用して、Ｌ１４４Ｆ及
びＬ１４４Ｙの精製酵素を得た。
【００４６】実施例２ （新規プロテアーゼの安定性の評価）精製したＬ１４４
Ｆ又はＬ１４４Ｙを０．８ＭのＺ−Ａｓｐと１０ｍＭの
塩化カルシウムを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウムの緩衝
液（ｐＨ５．０）に溶解し、１６時間４０℃に保持した
後にその溶液中に残存する酵素量を高速液体クロマトグ
ラフィーにより定量した。ＴＳＫゲル フェニル−５Ｐ
Ｗ ＲＰ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）を高速液
体クロマトグラフィーのカラムとして使用し、溶離は、
アセトニトリルを含有する１０ｍＭ酢酸カリウムを溶離
液として使用し、１．２ミリリットル／分の流速で実施
した。酵素の検出は、２８０ｎｍでの光吸収により実施
した。溶液の培養後の酵素の残存率は図５に示されてい
る。Ｌ１４４Ｙ酵素とＬ１４４Ｆ酵素は両方共、サーモ
ライシン様のアミノ酸配列と同じ配列を有する野性型酵
素の約２倍の高い残存率を示し、本発明の両方の酵素は
高い安定性を有することが明らかとなった。
Ｆ又はＬ１４４Ｙを０．８ＭのＺ−Ａｓｐと１０ｍＭの
塩化カルシウムを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウムの緩衝
液（ｐＨ５．０）に溶解し、１６時間４０℃に保持した
後にその溶液中に残存する酵素量を高速液体クロマトグ
ラフィーにより定量した。ＴＳＫゲル フェニル−５Ｐ
Ｗ ＲＰ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）を高速液
体クロマトグラフィーのカラムとして使用し、溶離は、
アセトニトリルを含有する１０ｍＭ酢酸カリウムを溶離
液として使用し、１．２ミリリットル／分の流速で実施
した。酵素の検出は、２８０ｎｍでの光吸収により実施
した。溶液の培養後の酵素の残存率は図５に示されてい
る。Ｌ１４４Ｙ酵素とＬ１４４Ｆ酵素は両方共、サーモ
ライシン様のアミノ酸配列と同じ配列を有する野性型酵
素の約２倍の高い残存率を示し、本発明の両方の酵素は
高い安定性を有することが明らかとなった。
【００４７】比較例１ １４４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基及び
チロシン残基以外のアミノ酸残基に置換したサーモライ
シン様プロテアーゼを製造し、実施例２と比較して、そ
れらの安定性を検討した。以下に示す塩基配列で記載さ
れるランダムプライマーを使用する以外は、実施例１と
同様な操作でこれらのプロテアーゼを製造し、プロテア
ーゼの安定性の検討を実施例２と同様の操作で実施し
た。
チロシン残基以外のアミノ酸残基に置換したサーモライ
シン様プロテアーゼを製造し、実施例２と比較して、そ
れらの安定性を検討した。以下に示す塩基配列で記載さ
れるランダムプライマーを使用する以外は、実施例１と
同様な操作でこれらのプロテアーゼを製造し、プロテア
ーゼの安定性の検討を実施例２と同様の操作で実施し
た。
【００４８】 １４４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基及び
チロシン残基以外のアミノ酸残基に置換したプロテアー
ゼはプラスミドの塩基配列の決定により同定した。
チロシン残基以外のアミノ酸残基に置換したプロテアー
ゼはプラスミドの塩基配列の決定により同定した。
【００４９】それらの安定性の結果は図４に示されてい
る。Ｌ１４４Ｔ（ロイシン残基がスレオニン残基に置換
されている。）及びＬ１４４Ｈ（ロイシン残基がヒスチ
ジン残基に置換されている。）は、両方とも野性型酵素
よりも安定性が高いが、Ｌ１４４Ｆ又はＬ１４４Ｙの安
定性よりも低いことが明らかとなった。Ｌ１４４Ｓは野
性型酵素の安定性以下であった。
る。Ｌ１４４Ｔ（ロイシン残基がスレオニン残基に置換
されている。）及びＬ１４４Ｈ（ロイシン残基がヒスチ
ジン残基に置換されている。）は、両方とも野性型酵素
よりも安定性が高いが、Ｌ１４４Ｆ又はＬ１４４Ｙの安
定性よりも低いことが明らかとなった。Ｌ１４４Ｓは野
性型酵素の安定性以下であった。
【００５０】実施例３ Ｚ−ＡＰＭ分解及びＺ−ＡＰＭ合成に対して高い活性を
有する二重変異体プロテアーゼ（１５０番目のアスパラ
ギン酸残基をトリプトファン残基に置換し、２２７番目
のアスパラギン残基をヒシチジン残基で置換したＤ１５
０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を高安定性酵素の製造の出発原料と
して使用した。
有する二重変異体プロテアーゼ（１５０番目のアスパラ
ギン酸残基をトリプトファン残基に置換し、２２７番目
のアスパラギン残基をヒシチジン残基で置換したＤ１５
０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を高安定性酵素の製造の出発原料と
して使用した。
【００５１】形質転換体枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２
（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）から、常法に従ってプラス
ミドを抽出し、この１μｇを含む２０マイクロリットル
の反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．
５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化ナ
トリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）をＡａｔＩ及びＳｐｈＩの
各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、さらに７
０℃で５分間反応させた。このサンプルを１％アガロー
スゲルによる電気泳動により二重の変異を含むＤ１５０
Ｗ−Ｎ２２７Ｈの約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）から、常法に従ってプラス
ミドを抽出し、この１μｇを含む２０マイクロリットル
の反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．
５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 塩化ナ
トリウム、１ｍＭ ＤＴＴ）をＡａｔＩ及びＳｐｈＩの
各５ユニットにより３７℃で２時間消化させ、さらに７
０℃で５分間反応させた。このサンプルを１％アガロー
スゲルによる電気泳動により二重の変異を含むＤ１５０
Ｗ−Ｎ２２７Ｈの約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００５２】一方、実施例１にて作成したＬ１４４Ｆの
変異を含むプラスミドｐＵＢＴＺ２１μｇをＡａｔＩ及
びＳｐｈＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化さ
せ、さらに７０℃で５分間反応させた。このサンプルを
１％アガロースゲルによる電気泳動によりＬ１４４Ｆの
変異を含む約７．６ｋｐのＤＮＡ断片を得た。
変異を含むプラスミドｐＵＢＴＺ２１μｇをＡａｔＩ及
びＳｐｈＩの各５ユニットにより３７℃で２時間消化さ
せ、さらに７０℃で５分間反応させた。このサンプルを
１％アガロースゲルによる電気泳動によりＬ１４４Ｆの
変異を含む約７．６ｋｐのＤＮＡ断片を得た。
【００５３】プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ）か
らこの様にして得られた約７．６ｋｂのＤＮＡ断片及び
プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）か
らこの様にして得られた約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を宝
酒造社製ライゲーションキットを使用して連結させ、こ
の反応混合物を常法に従って、大腸菌ＪＭ１０３に形質
転換し、変異の導入された形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵ
ＢＴＺ２を得た。置換したアミノ酸残基は、プラスミド
のヌクレオチド配列の同定によって確認した。図６に組
換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ
−Ｎ２２７Ｈ）の構築方法を示す。
らこの様にして得られた約７．６ｋｂのＤＮＡ断片及び
プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）か
らこの様にして得られた約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を宝
酒造社製ライゲーションキットを使用して連結させ、こ
の反応混合物を常法に従って、大腸菌ＪＭ１０３に形質
転換し、変異の導入された形質転換体ＪＭ１０３／ｐＵ
ＢＴＺ２を得た。置換したアミノ酸残基は、プラスミド
のヌクレオチド配列の同定によって確認した。図６に組
換えプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ
−Ｎ２２７Ｈ）の構築方法を示す。
【００５４】このプラスミドＤＮＡを使用して実施例１
と同様に形質転換体枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ
１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を作成し、形質転
換体枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｙ−Ｄ１
５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）も作成した。
と同様に形質転換体枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ
１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を作成し、形質転
換体枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｙ−Ｄ１
５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）も作成した。
【００５５】この形質転換体枯草菌からの二種類の変異
体酵素Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ及びＬ１４
４Ｙ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈの精製は、緩衝液Ｂの代
わりに緩衝液Ｄ（１０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ８．
５、０．５Ｍ 塩酸グアニジン、１０ｍＭ 塩化カルシ
ウム）を使用した以外は、実施例１に示した方法に従っ
て精製した。
体酵素Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ及びＬ１４
４Ｙ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈの精製は、緩衝液Ｂの代
わりに緩衝液Ｄ（１０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ８．
５、０．５Ｍ 塩酸グアニジン、１０ｍＭ 塩化カルシ
ウム）を使用した以外は、実施例１に示した方法に従っ
て精製した。
【００５６】以上のようにして作成した酵素の安定性を
実施例２と同様に評価したところ、Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５
０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ及びＬ１４４Ｙ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２
７Ｈは両方共、野性型酵素や元のＤ１５０Ｗ−Ｎ２２７
Ｈに比べて、高い安定性を示した。安定性の評価結果を
図７に示した。
実施例２と同様に評価したところ、Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５
０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ及びＬ１４４Ｙ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２
７Ｈは両方共、野性型酵素や元のＤ１５０Ｗ−Ｎ２２７
Ｈに比べて、高い安定性を示した。安定性の評価結果を
図７に示した。
【００５７】実施例４ 実施例３の方法で作成したＬ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ
２２７Ｈを使用して実際のＺ−ＡＰＭ合成を実施した。
Ｌ−ＰＭ（１８９ｇ；７１２．６ｍｍｏｌ）及びＺ−Ａ
ｓｐ（１１３ｇ：６３３．３ｍｍｏｌ）を水に溶解して
懸濁液を製造した。溶液のｐＨを２２％の水酸化ナトリ
ウム溶液で５．３に調整し、１５５ｇの塩化ナトリウム
を添加した。この調製した溶液は透明であった。同時に
酵素液を２．５ｇの酵素と３．３６ｇのＣａＣｌ2を水
に添加して調製した。
２２７Ｈを使用して実際のＺ−ＡＰＭ合成を実施した。
Ｌ−ＰＭ（１８９ｇ；７１２．６ｍｍｏｌ）及びＺ−Ａ
ｓｐ（１１３ｇ：６３３．３ｍｍｏｌ）を水に溶解して
懸濁液を製造した。溶液のｐＨを２２％の水酸化ナトリ
ウム溶液で５．３に調整し、１５５ｇの塩化ナトリウム
を添加した。この調製した溶液は透明であった。同時に
酵素液を２．５ｇの酵素と３．３６ｇのＣａＣｌ2を水
に添加して調製した。
【００５８】この両方の溶液を混合して、酵素カップリ
ング反応を開始した。この混合後の溶液は以下の表２に
示される組成となった。
ング反応を開始した。この混合後の溶液は以下の表２に
示される組成となった。
【００５９】
【表２】
【００６０】酵素反応は約１３ｃｍの直径を有し、４０
℃に保温されたガラス製反応容器中で実施された。この
反応器には、底部から０．５ｃｍの所で、液面から２ｃ
ｍの深さに長さ１１ｃｍの羽根を有する可変速度式の攪
拌機が設置された。攪拌速度は反応開始後５０分間は１
分間１５０回転に調節され、それ以降は１分間３００回
転に調節された。反応混合物のｐＨは反応中連続的に測
定され、ｐＨが５．３以上になったら１６％の塩酸を添
加して、５．３に調整された。ある時間の後、サンプル
を反応容器から取り出し、以下のＨＰＬＣ操作によりＺ
−Ａｓｐ，Ｌ−ＰＭ及び残存している酵素の濃度を分析
した。
℃に保温されたガラス製反応容器中で実施された。この
反応器には、底部から０．５ｃｍの所で、液面から２ｃ
ｍの深さに長さ１１ｃｍの羽根を有する可変速度式の攪
拌機が設置された。攪拌速度は反応開始後５０分間は１
分間１５０回転に調節され、それ以降は１分間３００回
転に調節された。反応混合物のｐＨは反応中連続的に測
定され、ｐＨが５．３以上になったら１６％の塩酸を添
加して、５．３に調整された。ある時間の後、サンプル
を反応容器から取り出し、以下のＨＰＬＣ操作によりＺ
−Ａｓｐ，Ｌ−ＰＭ及び残存している酵素の濃度を分析
した。
【００６１】Ｚ−ＡｓｐとＬ−ＰＭを、Ｇ２０００ＳＷ
ＸＬ（ＴＳＫ−ＧＥＬ）カラムを使用するＨＰＬＣシ
ステムにより、１ミリリットル／分の流速、２５℃で定
量した。溶離液として、ｐＨ＝５．６の０．１５Ｍ酢酸
緩衝液を含む７０／３０のアセトニトリル／水混合液を
使用した。溶離成分の検出は２５４ｎｍで実施した。残
存している酵素の濃度もまた、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ
ＲＰ（ＴＳＫ−ＧＥＬ）カラムを使用するＨＰＬＣシス
テムにより、１．２ミリリットル／分の流速、２５℃で
定量した。この分析においては、溶離液Ａ（ｐＨ＝６の
酢酸カルシウム緩衝液を含有する５／９５のアセトニト
リル／水混合液）及び溶離液Ｂ（ｐＨ＝６の酢酸カルシ
ウム緩衝液を含有する６０／４０のアセトニトリル／水
混合液）から成る傾斜溶離液を使用した。以下の様な傾
斜を使用した：０〜４分、Ａ／Ｂ＝９０／１０，４〜１
０分、６分間でＡ／Ｂ＝９０／１０から４０／６０に変
化させた。溶離した酵素は２８０ｎｍの吸収で検知し
た。
ＸＬ（ＴＳＫ−ＧＥＬ）カラムを使用するＨＰＬＣシ
ステムにより、１ミリリットル／分の流速、２５℃で定
量した。溶離液として、ｐＨ＝５．６の０．１５Ｍ酢酸
緩衝液を含む７０／３０のアセトニトリル／水混合液を
使用した。溶離成分の検出は２５４ｎｍで実施した。残
存している酵素の濃度もまた、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ
ＲＰ（ＴＳＫ−ＧＥＬ）カラムを使用するＨＰＬＣシス
テムにより、１．２ミリリットル／分の流速、２５℃で
定量した。この分析においては、溶離液Ａ（ｐＨ＝６の
酢酸カルシウム緩衝液を含有する５／９５のアセトニト
リル／水混合液）及び溶離液Ｂ（ｐＨ＝６の酢酸カルシ
ウム緩衝液を含有する６０／４０のアセトニトリル／水
混合液）から成る傾斜溶離液を使用した。以下の様な傾
斜を使用した：０〜４分、Ａ／Ｂ＝９０／１０，４〜１
０分、６分間でＡ／Ｂ＝９０／１０から４０／６０に変
化させた。溶離した酵素は２８０ｎｍの吸収で検知し
た。
【００６２】Ｚ−ＡｓｐからのＺ−ＡＰＭへの転換率と
酵素残存率の関係を表３に示す。
酵素残存率の関係を表３に示す。
【００６３】
【表３】
【００６４】比較例２〜３ 野生型酵素及び実施例３で得られたＤ１５０Ｗ−Ｎ２２
７Ｈを使用し、以下の表４に示される若干異なる組成の
溶液を使用して実施例４と同様の操作を実施した。
７Ｈを使用し、以下の表４に示される若干異なる組成の
溶液を使用して実施例４と同様の操作を実施した。
【００６５】
【表４】
【００６６】得られた結果を以下の表５に示す。
【００６７】
【表５】
【００６８】この表から明らかな様に、本発明の三重変
異体酵素（Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）は、
従来の野性型酵素、二重変異体酵素（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２
２７Ｈ）と比較して安定性が優れていることが明らかと
なった。
異体酵素（Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）は、
従来の野性型酵素、二重変異体酵素（Ｄ１５０Ｗ−Ｎ２
２７Ｈ）と比較して安定性が優れていることが明らかと
なった。
【００６９】
【発明の効果】本発明の新規なサーモライシン様プロテ
アーゼは、野性型サーモリシや他の変異導入サーモライ
シン様プロテアーゼ（例えば、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をトリプトファン残基に置換し、２２７番目の
アスパラギン残基をヒスチジン残基に置換したサーモリ
シン様プロテアーゼ）よりも安定性に優れ、特に、ｐＨ
＝５付近での溶液中でも安定である。また、このサーモ
ライシン様プロテアーゼは、出発物質Ｚ−ＡｓｐとＬ−
ＰＭのモル比が０．８〜１．７（通常は２）及び反応液
のｐＨが４．３〜３．８（通常は７）のような従来のサ
ーモライシン様プロテアーゼでは使用不可能な新しいＺ
−ＡＰＭ合成系でも使用が可能である。このような効果
により、反応を長時間継続できることや反応後の酵素の
回収量が向上することなどの点で優れた効果が発揮され
る。
アーゼは、野性型サーモリシや他の変異導入サーモライ
シン様プロテアーゼ（例えば、１５０番目のアスパラギ
ン酸残基をトリプトファン残基に置換し、２２７番目の
アスパラギン残基をヒスチジン残基に置換したサーモリ
シン様プロテアーゼ）よりも安定性に優れ、特に、ｐＨ
＝５付近での溶液中でも安定である。また、このサーモ
ライシン様プロテアーゼは、出発物質Ｚ−ＡｓｐとＬ−
ＰＭのモル比が０．８〜１．７（通常は２）及び反応液
のｐＨが４．３〜３．８（通常は７）のような従来のサ
ーモライシン様プロテアーゼでは使用不可能な新しいＺ
−ＡＰＭ合成系でも使用が可能である。このような効果
により、反応を長時間継続できることや反応後の酵素の
回収量が向上することなどの点で優れた効果が発揮され
る。
【００７０】尚、本発明における配列表１は以下のよう
に示される。
に示される。
【００７１】［配列表］ 配列番号：１ 配列の長さ：３１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 配列 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＵＣＴＺ
５５を構築する工程図である。
５５を構築する工程図である。
【図２】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファージ
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する工程図である。
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する工程図である。
【図３】Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを用いてプラスミドｐＵ
ＢＴＺ２上にクローンされたｎｐｒＭ遺伝子に変異を導
入する工程図である。
ＢＴＺ２上にクローンされたｎｐｒＭ遺伝子に変異を導
入する工程図である。
【図４】ＰＣＲ法による変異導入方法を示す図である。
【図５】１４４番目のロイシン残基を他のアミノ酸残基
で置換したサーモライシン様プロテアーゼの安定性を検
討した結果を示す図である。
で置換したサーモライシン様プロテアーゼの安定性を検
討した結果を示す図である。
Ｓ：セリン Ｑ：グルタミン Ｃ：システイン Ｗ：トリプトファン Ｅ：グルタミン酸 Ａ：アラニン Ｌ：ロイシン Ｎ：アスパラギン Ｈ：ヒスチジン Ｔ：スレオニン Ｆ：フェニルアラニン Ｙ：チロシン
【図６】１４４番目のロイシン残基をフェニルアラニン
残基に置換したｎｐｒＭ遺伝子をクローニングしたプラ
スミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ）と二重変異体酵素を
クローニングしたプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ
−Ｎ２２７Ｈ）からプラスミド（Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０
Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を構築する工程図である。
残基に置換したｎｐｒＭ遺伝子をクローニングしたプラ
スミドｐＵＢＴＺ２（Ｌ１４４Ｆ）と二重変異体酵素を
クローニングしたプラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｄ１５０Ｗ
−Ｎ２２７Ｈ）からプラスミド（Ｌ１４４Ｆ−Ｄ１５０
Ｗ−Ｎ２２７Ｈ）を構築する工程図である。
【図７】サーモライシン様プロテアーゼの安定性を測定
した結果を示す図である。
した結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 城所 俊一 神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者 遠藤 きみ子 東京都町田市金森1733−10 (72)発明者 和田 昭允 東京都赤坂８−11−４
Claims (13)
- 【請求項１】水溶性媒体中で、Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニルアスパラギン酸及びフェニルアラニンメチルエス
テルとのカップリングにサーモライシン様プロテアーゼ
を使用する酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルの合成方法において、配列表１のアミノ酸配列を
有するサーモライシン中に存在し、少なくとも１４４番
目のロイシン残基、１４９番目のスレオニン残基、２４
０番目のアラニン残基、２７０番目のアラニン残基、２
８８番目のアラニン残基により囲まれている電子密度に
おける空孔の容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上
のアミノ酸残基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及び
かさの大きいアミノ酸残基により置換している、又は、
電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与えられて
いることにより、その空孔の少なくとも一部が埋められ
ており、その空孔の容積が減少していることを特徴とす
る新規なサーモライシン様プロテアーゼを使用すること
を特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル
−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルの合成方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の合成方法において、電子
密度における空孔の容積が、１４４番目、１４９番目、
２４０番目、２７０番目及び２８８番目のアミノ酸残基
が、その残基よりも大きなモル容積を有し、ヒスチジ
ン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、スレ
オニン、チロシン及びバリンの群から選ばれるアミノ酸
残基により置換されており、その空孔の容積が減少して
いることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカ
ルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニ
ンメチルエステルの合成方法。 - 【請求項３】請求項２に記載の合成方法において、１４
４番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基又はチロ
シン残基で置換していることを特徴とする酵素反応によ
るベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の合成方法
において、１５０番目のアスパラギン酸残基、１８７番
目のグルタミン酸残基及び２２７番目のアスパラギン残
基の少なくとも一つが他のアミノ酸で置換していること
を特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル
−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチル
エステルの合成方法。 - 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の合成方法
において、酵素カップリング反応をｐＨが４．３〜８．
０の範囲にあることを特徴とする酵素反応によるベンジ
ルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
ニルアラニンメチルエステルの合成方法。 - 【請求項６】請求項５に記載の合成方法において、Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸及びＬ
−フェニルアラニンメチルエステルを酵素カップリング
の基質として使用することを特徴とする酵素反応による
ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 - 【請求項７】請求項６に記載の合成方法において、Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルに
対するＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギ
ン酸のモル比が０．８〜１．７の範囲にあることを特徴
とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルの合成方法。 - 【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の合成方法
において、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパ
ラギン酸の濃度が０．２モル／ｋｇ以上であることを特
徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テルの合成方法。 - 【請求項９】配列表１のアミノ酸配列を有するサーモラ
イシン中に存在し、少なくとも１４４番目のロイシン残
基、１４９番目のスレオニン残基、２４０番目のアラニ
ン残基、２７０番目のアラニン残基、２８８番目のアラ
ニン残基により囲まれている電子密度における空孔の容
積が、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基
が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及びかさの大きいア
ミノ酸残基により置換していることにより、又は、電子
密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響していることによ
り、その空孔の少なくとも一部を埋められ、その空孔の
容積が減少していることを特徴とする新規なサーモライ
シン様プロテアーゼ。 - 【請求項１０】請求項９に記載の新規なサーモライシン
様プロテアーゼにおいて、電子密度における空孔の容積
が、１４４番目、１４９番目、２４０番目、２７０番目
及び２８８番目のアミノ酸残基が、その残基よりも大き
なモル容積を有し、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシ
ン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン及びバリ
ンの群から選ばれるアミノ酸残基に置換していることに
より、その空孔の容積が減少していることを特徴とする
新規なサーモライシン様プロテアーゼ。 - 【請求項１１】請求項９に記載の新規なサーモライシン
様プロテアーゼにおいて、１４４番目のロイシン残基が
チロシン残基で置換していることを特徴とする新規なサ
ーモライシン様プロテアーゼ。 - 【請求項１２】請求項９に記載の新規なサーモライシン
様プロテアーゼにおいて、１５０番目のアスパラギン酸
残基、１８７番目のグルタミン酸残基及び２２７番目の
アスパラギン残基の少なくとも一つが他のアミノ酸で置
換していることを特徴とする新規なサーモライシン様プ
ロテアーゼ。 - 【請求項１３】明細書及び実施例に実質的に記載されて
いる酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
の合成方法及び高度に安定化されたサーモライシン様プ
ロテアーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33093896A JPH09220090A (ja) | 1995-12-11 | 1996-12-11 | 新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32181495 | 1995-12-11 | ||
| JP7-321814 | 1995-12-11 | ||
| JP33093896A JPH09220090A (ja) | 1995-12-11 | 1996-12-11 | 新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09220090A true JPH09220090A (ja) | 1997-08-26 |
Family
ID=26570605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33093896A Pending JPH09220090A (ja) | 1995-12-11 | 1996-12-11 | 新規なサーモライシン様プロテアーゼ及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09220090A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2536255C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2014-12-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах |
-
1996
- 1996-12-11 JP JP33093896A patent/JPH09220090A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2536255C2 (ru) * | 2007-11-01 | 2014-12-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах |
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