JPH09227408A - インシュリン依存性真性糖尿病処置組成物 - Google Patents
インシュリン依存性真性糖尿病処置組成物Info
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、インシュリン依存性真性糖
尿病処置剤の提供である。 【構成】 インシュリン依存性真性糖尿病処置剤は、GA
D蛋白質又はペプチドを含むことを特徴とする。
尿病処置剤の提供である。 【構成】 インシュリン依存性真性糖尿病処置剤は、GA
D蛋白質又はペプチドを含むことを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】糖尿病は人々の健康の大きな問題
となっている。国立糖尿病諮問委員会の、糖尿病を駆逐
する国の長期計画、1987年リポ−トで報告されるよう
に、米国の600万の人々が糖尿病を有することが知られ
ており、更に500万が診断されていないこの病気を有
し、毎年50万を超える新しい糖尿病患者が見つけられて
いる。1984年には糖尿病は35,000人のアメリカ人の死亡
の直接の原因であり、更に95,000人に対し死亡の要因に
寄与していた。
となっている。国立糖尿病諮問委員会の、糖尿病を駆逐
する国の長期計画、1987年リポ−トで報告されるよう
に、米国の600万の人々が糖尿病を有することが知られ
ており、更に500万が診断されていないこの病気を有
し、毎年50万を超える新しい糖尿病患者が見つけられて
いる。1984年には糖尿病は35,000人のアメリカ人の死亡
の直接の原因であり、更に95,000人に対し死亡の要因に
寄与していた。
【０００２】糖尿病の目の併発症は米国で20〜74才の人
々における法律で定義されている盲目の新しい患者の主
要な原因である。下肢を切断する危険は糖尿病でない個
人よりも糖尿病を有する個人は15倍大きい。この評価は
糖尿病を有する人が米国で毎年実施されているおよそ12
5,000人の足の切断の半分を超える切断を経験している
ことを示唆している。
々における法律で定義されている盲目の新しい患者の主
要な原因である。下肢を切断する危険は糖尿病でない個
人よりも糖尿病を有する個人は15倍大きい。この評価は
糖尿病を有する人が米国で毎年実施されているおよそ12
5,000人の足の切断の半分を超える切断を経験している
ことを示唆している。
【０００３】腎臓病は頻繁に起きる重い糖尿病の併発症
である。末期的な腎臓病に対して処置を受けた米国にお
けるすべての新たな患者のおよそ30%が糖尿病を有して
いる。このパ−セントは毎年およそ2%の速度で増加して
おり、従って次の10年間以内に、糖尿病と関連する腎臓
病は、末期段階の腎臓病のプログラムにおけるすべての
登録者の半分を超えるものとなるであろう。
である。末期的な腎臓病に対して処置を受けた米国にお
けるすべての新たな患者のおよそ30%が糖尿病を有して
いる。このパ−セントは毎年およそ2%の速度で増加して
おり、従って次の10年間以内に、糖尿病と関連する腎臓
病は、末期段階の腎臓病のプログラムにおけるすべての
登録者の半分を超えるものとなるであろう。
【０００４】糖尿病を有する個人はまた、歯周病に対す
る危険も増加している。歯周の感染は急速に進行し、歯
を失うことのみならず妥協的な代謝抑制にもつながる。
糖尿病を有する女性は妊娠の重大な併発症の危険があ
る。現在の統計は糖尿病を有している母親の胎児がおよ
そ7%の死亡率であることを示唆している。
る危険も増加している。歯周の感染は急速に進行し、歯
を失うことのみならず妥協的な代謝抑制にもつながる。
糖尿病を有する女性は妊娠の重大な併発症の危険があ
る。現在の統計は糖尿病を有している母親の胎児がおよ
そ7%の死亡率であることを示唆している。
【０００５】糖尿病に対する経済的な負担も大きい。毎
年糖尿病を有する患者又はその併発症を有する患者は病
院において2400万の患者・日を使い果たしている。糖尿
病に帰因する１年当りの合計コストを控え目に見積って
も少なくとも240億ドル（アメリカ糖尿病協会評価、198
8）であり、この病気の経済全体に対する影響は、追加
的な医療の出費がしばしば糖尿病自体よりも糖尿病の特
定の併発症にかかるので、もっと大きいものとなる。糖
尿病は、体が適正に炭水化物、脂肪及び蛋白質を維持及
び使用することができなくなる慢性の複雑な代謝病であ
る。糖尿病は種々の遺伝的及び環境的な因子の相互作用
から生じ、インシュリン生産ができないか又はその利用
が損われることによって生じる高い血糖水準によって特
徴づけられる。糖尿病の多くのケ−スは2つの臨床的な
種類に当てはまる。インシュリン依存性の真性糖尿病
（IDDM又はIDD）と非インシュリン依存性の真性糖尿病
（NIDDM又はNIDD）である。それぞれのタイプは異なる
予後、処置及び原因を有している。
年糖尿病を有する患者又はその併発症を有する患者は病
院において2400万の患者・日を使い果たしている。糖尿
病に帰因する１年当りの合計コストを控え目に見積って
も少なくとも240億ドル（アメリカ糖尿病協会評価、198
8）であり、この病気の経済全体に対する影響は、追加
的な医療の出費がしばしば糖尿病自体よりも糖尿病の特
定の併発症にかかるので、もっと大きいものとなる。糖
尿病は、体が適正に炭水化物、脂肪及び蛋白質を維持及
び使用することができなくなる慢性の複雑な代謝病であ
る。糖尿病は種々の遺伝的及び環境的な因子の相互作用
から生じ、インシュリン生産ができないか又はその利用
が損われることによって生じる高い血糖水準によって特
徴づけられる。糖尿病の多くのケ−スは2つの臨床的な
種類に当てはまる。インシュリン依存性の真性糖尿病
（IDDM又はIDD）と非インシュリン依存性の真性糖尿病
（NIDDM又はNIDD）である。それぞれのタイプは異なる
予後、処置及び原因を有している。
【０００６】およそ5〜10%の糖尿病患者は、人生の初
期、通常は幼年期又は思春期に現れたために以前は若年
性糖尿病と呼ばれていた、IDDを有している。IDDはイン
シュリンをつくることが部分的又は完全にできないこと
によって特徴づけられる。IDDを有する患者は彼等の病
気を抑制するために毎日インシュリンの注射をしなけれ
ば死んでしまう。
期、通常は幼年期又は思春期に現れたために以前は若年
性糖尿病と呼ばれていた、IDDを有している。IDDはイン
シュリンをつくることが部分的又は完全にできないこと
によって特徴づけられる。IDDを有する患者は彼等の病
気を抑制するために毎日インシュリンの注射をしなけれ
ば死んでしまう。
【０００７】
【従来の技術】糖尿病の病因の解明は1970年代の中頃ま
でほとんど進歩はなされなかったが、その頃になってID
Dが自己免疫的な病因を有することを示唆する証拠が蓄
積し始めた。現在ではIDDがインシュリンを製造してい
る膵臓のβ細胞の慢性的な自己免疫破壊から生じるとい
うことが一般に受け入れられている。リンパ球及び他の
炎症性の細胞が新たに診断されたIDDの患者のランゲル
ハンス島内に観測され、そして他の細胞形態のものより
もβ細胞で構成された再生している（ランゲルハンス）
島中により多く見出される。この活性な免疫過程はβ細
胞の細胞質及び膜抗原、インシュリン及びインシュリン
レセプタ−に対する種々の自己抗体と関連している。
でほとんど進歩はなされなかったが、その頃になってID
Dが自己免疫的な病因を有することを示唆する証拠が蓄
積し始めた。現在ではIDDがインシュリンを製造してい
る膵臓のβ細胞の慢性的な自己免疫破壊から生じるとい
うことが一般に受け入れられている。リンパ球及び他の
炎症性の細胞が新たに診断されたIDDの患者のランゲル
ハンス島内に観測され、そして他の細胞形態のものより
もβ細胞で構成された再生している（ランゲルハンス）
島中により多く見出される。この活性な免疫過程はβ細
胞の細胞質及び膜抗原、インシュリン及びインシュリン
レセプタ−に対する種々の自己抗体と関連している。
【０００８】従ってIDDは自己抗体で充満した病気であ
る。これらには細胞質型の島細胞自己抗体(ICA)(ボッタ
ゾ(Bottazo)，G.F.，A.フロ−リン-クリステンセン(Flo
rin-Cristensen)，及び D.ドニアック(Doniach)[1974]
Lance.2:1279-1283)、島細胞表面自己抗体(ICSA)(マク
ラレン(Maclaren),N.,S.W.フアング(Huang),及びJ.フォ
グ(Fogh)[1975]Lancet.i:997-1000)、インシュリン自己
抗体(IAA)(パルマ−(Palmer),J.P.,C.M.アスプリン(Asp
lin),及びP.クレモンス(Cleamons)[1983] Science 222:
1337-1339)及び可能なアンチ遺伝子型インシュリンレセ
プタ−自己抗体(Ins.R.A.)(マ−ロン(Maron), R., D.エ
リアス(Elias), M.de J.バ−テルト(Bartelt), G.J.ブ
ルイニング(Bruining), J.J.バンロ−ド(Van Rood), Y.
シェヒタ−(Shechter),及び I.R.コ−エン(Cohen) [198
3] Nature 303:817-818)が含まれる。1982年において6
4,000Mr島細胞抗原に対する抗体がIDD患者中で検出され
たことが報告された(ベッケスコフ(Bekkeskov),S.ら [1
982] Nature 298:167-169)。後の刊行物でベッケスコフ
らは64,000Mr抗体がBBラットモデルにおいてIDDと関連
していることを報告した(ベッケスコフ(B kkeskov),S.
ら [1984] Science 224:1348-1350)。後に追跡試験によ
ってIDDを有する、従って病気を生じる危険のあること
が知られている個人と関連している患者が調べられた
(ベッケスコフ(Bekkeskov),S.ら [1987] J.Clin. Inves
t.79:926-934)。この後の研究の結果は64,000Mr抗体が
臨床的な症状の現れの前に幾人かのIDD患者中に存在し
ているかもしれないことを示唆した。しかし同じ研究で
ベッケスコフらは64,000Mr蛋白の機能が未知であり、こ
のデ−タが64,000Mr抗体がβ細胞機能の減少が開始され
る前に存在するかどうかについて結論づけることができ
ないことを報告している。
る。これらには細胞質型の島細胞自己抗体(ICA)(ボッタ
ゾ(Bottazo)，G.F.，A.フロ−リン-クリステンセン(Flo
rin-Cristensen)，及び D.ドニアック(Doniach)[1974]
Lance.2:1279-1283)、島細胞表面自己抗体(ICSA)(マク
ラレン(Maclaren),N.,S.W.フアング(Huang),及びJ.フォ
グ(Fogh)[1975]Lancet.i:997-1000)、インシュリン自己
抗体(IAA)(パルマ−(Palmer),J.P.,C.M.アスプリン(Asp
lin),及びP.クレモンス(Cleamons)[1983] Science 222:
1337-1339)及び可能なアンチ遺伝子型インシュリンレセ
プタ−自己抗体(Ins.R.A.)(マ−ロン(Maron), R., D.エ
リアス(Elias), M.de J.バ−テルト(Bartelt), G.J.ブ
ルイニング(Bruining), J.J.バンロ−ド(Van Rood), Y.
シェヒタ−(Shechter),及び I.R.コ−エン(Cohen) [198
3] Nature 303:817-818)が含まれる。1982年において6
4,000Mr島細胞抗原に対する抗体がIDD患者中で検出され
たことが報告された(ベッケスコフ(Bekkeskov),S.ら [1
982] Nature 298:167-169)。後の刊行物でベッケスコフ
らは64,000Mr抗体がBBラットモデルにおいてIDDと関連
していることを報告した(ベッケスコフ(B kkeskov),S.
ら [1984] Science 224:1348-1350)。後に追跡試験によ
ってIDDを有する、従って病気を生じる危険のあること
が知られている個人と関連している患者が調べられた
(ベッケスコフ(Bekkeskov),S.ら [1987] J.Clin. Inves
t.79:926-934)。この後の研究の結果は64,000Mr抗体が
臨床的な症状の現れの前に幾人かのIDD患者中に存在し
ているかもしれないことを示唆した。しかし同じ研究で
ベッケスコフらは64,000Mr蛋白の機能が未知であり、こ
のデ−タが64,000Mr抗体がβ細胞機能の減少が開始され
る前に存在するかどうかについて結論づけることができ
ないことを報告している。
【０００９】種々のβ細胞に特異的でない分子に対する
他の抗体がIDD患者に増加して存在することが報告され
ている。これらにはツブリン(tubulin)、単一鎖及び二
重鎖DNA、胃壁細胞、固有因子副腎皮質細胞、甲状腺パ
−オキシダ−ゼ酵素及びチログブリンに対する抗体が含
まれる。IDD患者はB-リンパ球のポリクロナル活性化の
徴候を有し、種々の抗原に対する増加した抗体力価はそ
の結果であり得る。
他の抗体がIDD患者に増加して存在することが報告され
ている。これらにはツブリン(tubulin)、単一鎖及び二
重鎖DNA、胃壁細胞、固有因子副腎皮質細胞、甲状腺パ
−オキシダ−ゼ酵素及びチログブリンに対する抗体が含
まれる。IDD患者はB-リンパ球のポリクロナル活性化の
徴候を有し、種々の抗原に対する増加した抗体力価はそ
の結果であり得る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】更に過去10年間の研究
はIDDを有する患者が、IDDに対するかかりやすさと関連
している組織適合性（ヒストコンパチビリティ−）抗原
と呼ばれる遺伝マ−カ−を有していることを示してい
る。これらの遺伝的な感受性マ−カ−はIDDの発生に必
要であるが十分ではないので、いまだ知られていない何
らかの追加的な環境的な因子が、β細胞の破壊の開始及
び糖尿病の発生に必要であるようである。環境因子はウ
イルスであれ化学剤であれ、β細胞に対する免疫応答を
開始し、遺伝的にかかりやすい人のβ細胞の免疫的な破
壊を許してしまう(アトキンソン（Atkinson),M.A., N.
K.マクラレン(Maclaren). [1990] Scientific Amereica
n 7:62-67)。従って、糖尿病患者を糖尿病前の状態で見
つけ出すことは、この病気の発生を予防する努力におい
て必須のものである。おそらく過去20年間の糖尿病研究
における最も重要な単一の進展は、β細胞の自己免疫破
壊が完了するまでに何カ月も何年もかかるということの
認識である。現在糖尿病の臨床的な診断は、破壊過程が
ほとんど完了するまで、そして死亡を防ぐためにインシ
ュリン注射が必要とされるまでほとんどなされないが、
インシュリン生産細胞が非可逆的に破壊されてしまう以
前に干渉することは、糖尿病とその併発症の進行を防止
する方策を与え得る。
はIDDを有する患者が、IDDに対するかかりやすさと関連
している組織適合性（ヒストコンパチビリティ−）抗原
と呼ばれる遺伝マ−カ−を有していることを示してい
る。これらの遺伝的な感受性マ−カ−はIDDの発生に必
要であるが十分ではないので、いまだ知られていない何
らかの追加的な環境的な因子が、β細胞の破壊の開始及
び糖尿病の発生に必要であるようである。環境因子はウ
イルスであれ化学剤であれ、β細胞に対する免疫応答を
開始し、遺伝的にかかりやすい人のβ細胞の免疫的な破
壊を許してしまう(アトキンソン（Atkinson),M.A., N.
K.マクラレン(Maclaren). [1990] Scientific Amereica
n 7:62-67)。従って、糖尿病患者を糖尿病前の状態で見
つけ出すことは、この病気の発生を予防する努力におい
て必須のものである。おそらく過去20年間の糖尿病研究
における最も重要な単一の進展は、β細胞の自己免疫破
壊が完了するまでに何カ月も何年もかかるということの
認識である。現在糖尿病の臨床的な診断は、破壊過程が
ほとんど完了するまで、そして死亡を防ぐためにインシ
ュリン注射が必要とされるまでほとんどなされないが、
インシュリン生産細胞が非可逆的に破壊されてしまう以
前に干渉することは、糖尿病とその併発症の進行を防止
する方策を与え得る。
【００１１】従って病気が臨床段階に進行する前にIDD
の開始を正確に予測する手段を見つけることが必須であ
る。
の開始を正確に予測する手段を見つけることが必須であ
る。
【００１２】多くの生物学的なマ−カ−がIDDと関連し
ているが、現在までこれらのマ−カ−のどれもが病気の
臨床的な徴候の開始前に均一に存在することが示されて
いない(マクラレン(Maclaren),N.K. [1988] Diabetes 3
7:1591-1594)。そのような初期の存在は病気の有用な予
測試験として定性化するためには化合物に対し必須であ
る。しかしながら初期の存在だけでは正確な初期の検出
法に対し十分ではない。特定なマ−カ−の存在又は非存
在に基づく予測試験は、その予測マ−カ−がIDDを有す
ることとなる人にのみ存在し、そうでない人には存在し
ない場合のみ貴重なものである。糖尿病の処置ならびに
その病気の心理的な衝撃は診断される人の健康に対し重
大な影響を有し得るので、特異的であるから間違って陽
性としてしまうことが非常に少ない予測試験を開発する
のが重要である。
ているが、現在までこれらのマ−カ−のどれもが病気の
臨床的な徴候の開始前に均一に存在することが示されて
いない(マクラレン(Maclaren),N.K. [1988] Diabetes 3
7:1591-1594)。そのような初期の存在は病気の有用な予
測試験として定性化するためには化合物に対し必須であ
る。しかしながら初期の存在だけでは正確な初期の検出
法に対し十分ではない。特定なマ−カ−の存在又は非存
在に基づく予測試験は、その予測マ−カ−がIDDを有す
ることとなる人にのみ存在し、そうでない人には存在し
ない場合のみ貴重なものである。糖尿病の処置ならびに
その病気の心理的な衝撃は診断される人の健康に対し重
大な影響を有し得るので、特異的であるから間違って陽
性としてしまうことが非常に少ない予測試験を開発する
のが重要である。
【００１３】臨床的な症状が現れる何年も前に病気の開
始を認識できる予測試験を見つけ出すことも重要であ
る。早期発見は、臨床段階のIDDと関連する重大な健康
問題に対し機先を制し又はこれを予防することができる
処置を行う機会を提供する。例えばシクロスポリンA、
アザチオプリン及びステロイドなどの薬物での非特異的
な免疫抑制試験が新たに診断された患者で実施されてき
た。それらの使用の最初の年にわたっては限られた数の
病気の小康が得られたが、これらの患者はβ細胞が限ら
れた再生能力しか有さなかったので正常には決して戻ら
ず、診断の時に始まる治療はほとんど遅すぎることが多
い。
始を認識できる予測試験を見つけ出すことも重要であ
る。早期発見は、臨床段階のIDDと関連する重大な健康
問題に対し機先を制し又はこれを予防することができる
処置を行う機会を提供する。例えばシクロスポリンA、
アザチオプリン及びステロイドなどの薬物での非特異的
な免疫抑制試験が新たに診断された患者で実施されてき
た。それらの使用の最初の年にわたっては限られた数の
病気の小康が得られたが、これらの患者はβ細胞が限ら
れた再生能力しか有さなかったので正常には決して戻ら
ず、診断の時に始まる治療はほとんど遅すぎることが多
い。
【００１４】現在までこれらの要求を満たすIDDに対す
る適当な予測試験は見つかっていない。多くの自己抗体
がこの病気と関連しているが、むらなく予測させる自己
抗体を同定する研究はうまくいっていない。例えば1976
年も昔に島細胞のグルカゴン分泌(α)細胞の細胞質と反
応する自己抗体(ACA)が記載されている(ボッタゾ(Botta
zo),G.F.,及び R.レンドラム(Lendrum) [1976] Lancet
2:873-876)。内分泌腺に対する自己抗体は、病気の臨床
的な開始の前に生じるか開始に伴うことが見出されてい
るので、ACAが島細胞のホルモンであるグルカゴンの欠
乏に対する予測マ−カ−であり得ると思われた。不幸に
して、後の研究によってACAは欠陥α細胞機能と関連せ
ず、IDDと関連せず、又どんな同定できる膵臓の病理と
も関連しないようであることが明らかにされた(ウィン
タ−(Winter),W.E., N.K.マクラレン(Maclaren), W.J.
リレ−(Riley),R.H.アンガ−(Unger), M.ノイフォルド
(Neufeld),及び P.T.オザンド(Ozand) [1984] Diabetes
33(5):435-437)。
る適当な予測試験は見つかっていない。多くの自己抗体
がこの病気と関連しているが、むらなく予測させる自己
抗体を同定する研究はうまくいっていない。例えば1976
年も昔に島細胞のグルカゴン分泌(α)細胞の細胞質と反
応する自己抗体(ACA)が記載されている(ボッタゾ(Botta
zo),G.F.,及び R.レンドラム(Lendrum) [1976] Lancet
2:873-876)。内分泌腺に対する自己抗体は、病気の臨床
的な開始の前に生じるか開始に伴うことが見出されてい
るので、ACAが島細胞のホルモンであるグルカゴンの欠
乏に対する予測マ−カ−であり得ると思われた。不幸に
して、後の研究によってACAは欠陥α細胞機能と関連せ
ず、IDDと関連せず、又どんな同定できる膵臓の病理と
も関連しないようであることが明らかにされた(ウィン
タ−(Winter),W.E., N.K.マクラレン(Maclaren), W.J.
リレ−(Riley),R.H.アンガ−(Unger), M.ノイフォルド
(Neufeld),及び P.T.オザンド(Ozand) [1984] Diabetes
33(5):435-437)。
【００１５】膵臓及びIDDの臨床段階と関連する他の抗
体の予測価値への研究がこの病気の早期発見の手段をつ
くりだした。例えば、インシュリン自己抗体(IAA)と島
細胞自己抗体(ICA)の両方が多くの新たに診断された患
者に存在することが見出されている。ICAはIDDの臨床段
階の前に存在することが示されており、特にIDDの危険
性のある糖尿病でない親戚に見出されている。しかし、
ICAもIAAもIDDに対するほとんど絶対的な特異性及び感
受性を与えるような予測試験を提供しない。
体の予測価値への研究がこの病気の早期発見の手段をつ
くりだした。例えば、インシュリン自己抗体(IAA)と島
細胞自己抗体(ICA)の両方が多くの新たに診断された患
者に存在することが見出されている。ICAはIDDの臨床段
階の前に存在することが示されており、特にIDDの危険
性のある糖尿病でない親戚に見出されている。しかし、
ICAもIAAもIDDに対するほとんど絶対的な特異性及び感
受性を与えるような予測試験を提供しない。
【００１６】従って臨床症状が開始する前及びインシュ
リン療法が必要となる前に、初期段階においてIDDを検
出し処置するより正確な手段が、実質的に、そして長い
間にわたって必要と感じられてきた。
リン療法が必要となる前に、初期段階においてIDDを検
出し処置するより正確な手段が、実質的に、そして長い
間にわたって必要と感じられてきた。
【００１７】
【課題を解決する手段】本明細書に記載された発明は、
インシュリン依存性の真性糖尿病(IDD)を早い段階で正
確に発見し、より詳しくはIDDはβ細胞機能の有意義な
消失の前に発見し、初期段階においてIDDを治療するた
めの手段に関する。
インシュリン依存性の真性糖尿病(IDD)を早い段階で正
確に発見し、より詳しくはIDDはβ細胞機能の有意義な
消失の前に発見し、初期段階においてIDDを治療するた
めの手段に関する。
【００１８】より詳しくは、島細胞64,000Mr蛋白質に対
する自己抗体は、IDDの臨床的な出現が観測される数年
も前までに存在していることがわかった。この抗体は64
KAと命名される。この体をだめにしてしまう可能性を秘
めた病気の早期発見及び処置は、非可逆的な破壊が広が
りを見せる病気の後の段階において有効ではない干渉的
な治療をすることを容易にする。
する自己抗体は、IDDの臨床的な出現が観測される数年
も前までに存在していることがわかった。この抗体は64
KAと命名される。この体をだめにしてしまう可能性を秘
めた病気の早期発見及び処置は、非可逆的な破壊が広が
りを見せる病気の後の段階において有効ではない干渉的
な治療をすることを容易にする。
【００１９】IDDの開始を検出し予測するために64KAは
単独で使用できるか、又はIDDと関連することが知られ
ているICAやIAAなどの他の自己抗体と組み合わせて使用
することもできる。本明細書に記載される64KAはIDDに
対し高度に病気に特異的である。64KAはIDDの開始に先
立って何カ月も何年も前に試験された子供や若い成人に
おいてむらなく存在することがわかった。この病気と関
連する他の抗体ができないにもかかわらず、64KA試験は
IDDの開始を予測することがわかった。
単独で使用できるか、又はIDDと関連することが知られ
ているICAやIAAなどの他の自己抗体と組み合わせて使用
することもできる。本明細書に記載される64KAはIDDに
対し高度に病気に特異的である。64KAはIDDの開始に先
立って何カ月も何年も前に試験された子供や若い成人に
おいてむらなく存在することがわかった。この病気と関
連する他の抗体ができないにもかかわらず、64KA試験は
IDDの開始を予測することがわかった。
【００２０】64KAと反応性の蛋白質抗原がIDDの治療に
有用であることも見出された。本発明の一部として、ID
Dを治療するか又はIDDの開始を遅らせる新規な手段がこ
こに記載される。治療の新規な手段は、新規なハイブリ
ッドβ細胞64K蛋白質を構築すること、すなわちIDDの病
因に関与している免疫学的な媒介物の能力を奪うことが
できる毒素生成物を構築することである。
有用であることも見出された。本発明の一部として、ID
Dを治療するか又はIDDの開始を遅らせる新規な手段がこ
こに記載される。治療の新規な手段は、新規なハイブリ
ッドβ細胞64K蛋白質を構築すること、すなわちIDDの病
因に関与している免疫学的な媒介物の能力を奪うことが
できる毒素生成物を構築することである。
【００２１】本発明の更に別の面は、64Kハイブリッド
毒素分子を投与することによって、新しい膵臓の、免疫
と関連した破壊及び拒絶反応を最小限にすることによっ
て、膵臓の島細胞移植の切迫した破壊を診断し予防する
ために64KAを使用することである。更に本発明は干渉療
法の手段として64KAに対するアンチ遺伝子型抗体を使用
することに関する。
毒素分子を投与することによって、新しい膵臓の、免疫
と関連した破壊及び拒絶反応を最小限にすることによっ
て、膵臓の島細胞移植の切迫した破壊を診断し予防する
ために64KAを使用することである。更に本発明は干渉療
法の手段として64KAに対するアンチ遺伝子型抗体を使用
することに関する。
【００２２】本発明は更に膵臓の64K蛋白がグルタミン
酸デカルボキシラ−ゼ(GAD)蛋白質と配列の相同性を有
するという発見に更に関している。更に64K蛋白質はGAD
酵素に対する抗体と免疫学的な反応性を有している。従
って本発明の更に別の要素はGAD蛋白質又は免疫学的に
活性のその断片をIDDの診断、予防、及び処置に使用す
ることに関している。
酸デカルボキシラ−ゼ(GAD)蛋白質と配列の相同性を有
するという発見に更に関している。更に64K蛋白質はGAD
酵素に対する抗体と免疫学的な反応性を有している。従
って本発明の更に別の要素はGAD蛋白質又は免疫学的に
活性のその断片をIDDの診断、予防、及び処置に使用す
ることに関している。
【００２３】本発明の詳細な記載
本明細書に記載された発明は、IDDの開始の正確で特異
的な早期指標示として、64K自己抗体を使用して発見し
たIDDを処置する薬剤に関する。IDDに対する有用な予測
マ−カ−としての64KAが見出されたのは、IDDと関連す
る多数の化合物に着目して行った徹底的な生化学的研究
から生じたものである。64KAのIDDに対する高い特異
性、ならびにIDDの開始の何年も前に人中に64KAがしば
しば存在することは、両方とも予想外である。これらの
64KAの性質はIDDの早期発見の手段として64KAを有用な
ものとする。
的な早期指標示として、64K自己抗体を使用して発見し
たIDDを処置する薬剤に関する。IDDに対する有用な予測
マ−カ−としての64KAが見出されたのは、IDDと関連す
る多数の化合物に着目して行った徹底的な生化学的研究
から生じたものである。64KAのIDDに対する高い特異
性、ならびにIDDの開始の何年も前に人中に64KAがしば
しば存在することは、両方とも予想外である。これらの
64KAの性質はIDDの早期発見の手段として64KAを有用な
ものとする。
【００２４】特定の物質がIDDの開始の有効な予測物か
どうかを確かめるために、これらの物質が糖尿病の臨床
的な症状の起きる前に存在するかどうかを決定する必要
がある。この糖尿病前の期間は、病気にかかった発端者
の多数の危険度が高い親戚について、感受性の人を同定
するために循環している自己抗体のスクリ−ニングをし
なければならず、糖尿病のβ細胞不全の自然の歴を文書
化するために長期間の観測が必要であるから、研究する
のが困難である。従って、人の試験に対して得られるデ
−タを増加させ、更に確認するために動物モデルが使用
された。
どうかを確かめるために、これらの物質が糖尿病の臨床
的な症状の起きる前に存在するかどうかを決定する必要
がある。この糖尿病前の期間は、病気にかかった発端者
の多数の危険度が高い親戚について、感受性の人を同定
するために循環している自己抗体のスクリ−ニングをし
なければならず、糖尿病のβ細胞不全の自然の歴を文書
化するために長期間の観測が必要であるから、研究する
のが困難である。従って、人の試験に対して得られるデ
−タを増加させ、更に確認するために動物モデルが使用
された。
【００２５】肥満していない糖尿病(NOD)マウスは人IDD
に対する有用な動物モデルである。NODマウスの研究は
病因事象のシ−ケンスに対し重要な識見を与え、そして
自己免疫過程において関与する標的島細胞自己抗原の性
質の理解につながる。IDDに対する別の重要なモデルは
バイオブリ−ディング(BB)ラットである。本発明は人、
BBラット及びNODマウスを含めた研究及び試験の結果発
見された。
に対する有用な動物モデルである。NODマウスの研究は
病因事象のシ−ケンスに対し重要な識見を与え、そして
自己免疫過程において関与する標的島細胞自己抗原の性
質の理解につながる。IDDに対する別の重要なモデルは
バイオブリ−ディング(BB)ラットである。本発明は人、
BBラット及びNODマウスを含めた研究及び試験の結果発
見された。
【００２６】人及びBBラットモデルにおいて島細胞自己
免疫が相対分子量(Mr)64,000(64K)のβ細胞蛋白質に対
する自己抗体と関連していることが発見された。又、新
たに診断されたNODマウスからの血清は同様に35Sメチオ
ニン標識化ねずみ島細胞の洗剤溶解物からの64K抗原を
免疫沈殿させる自己抗体を含有していることが決定され
た(アトキンス(Atokinson,M.,及び N.K.マクラレン(Mac
laren) [1988] Diabetes 38:1587-1590)。NODマウスに
おいてこの自己抗体は乳離れのときまでに検出可能であ
り、これは糖尿病開始の数週間内に消失し、より年をと
った非糖尿病マウスならびに試験された全ての3つの非
糖尿病体質対照系統において存在しなかった。人におい
ては、後のIDDの開始が35才よりも下であった人のうち
の96％において、臨床的な診断の前に64KAが存在した。
64KAはIDDの臨床的な出現の十分以前に予測可能に存在
することがわかった。又64KAの存在はIDDに対し高度に
特異的であることがわかった。IAA又はICAと異なって64
KAはIDDを生じることについて高い危険性がない、又は
増加した危険性がない個人には観測されなかった。
免疫が相対分子量(Mr)64,000(64K)のβ細胞蛋白質に対
する自己抗体と関連していることが発見された。又、新
たに診断されたNODマウスからの血清は同様に35Sメチオ
ニン標識化ねずみ島細胞の洗剤溶解物からの64K抗原を
免疫沈殿させる自己抗体を含有していることが決定され
た(アトキンス(Atokinson,M.,及び N.K.マクラレン(Mac
laren) [1988] Diabetes 38:1587-1590)。NODマウスに
おいてこの自己抗体は乳離れのときまでに検出可能であ
り、これは糖尿病開始の数週間内に消失し、より年をと
った非糖尿病マウスならびに試験された全ての3つの非
糖尿病体質対照系統において存在しなかった。人におい
ては、後のIDDの開始が35才よりも下であった人のうち
の96％において、臨床的な診断の前に64KAが存在した。
64KAはIDDの臨床的な出現の十分以前に予測可能に存在
することがわかった。又64KAの存在はIDDに対し高度に
特異的であることがわかった。IAA又はICAと異なって64
KAはIDDを生じることについて高い危険性がない、又は
増加した危険性がない個人には観測されなかった。
【００２７】材料と方法 島細胞調製
人の膵臓の島を以前に報告したように死体の膵臓から単
離した(Diabetes 37:413-420,1988)。島の全てのバッチ
を、補充した培地CMRL1066中でインビトロ（試験管内）
で保持した。バッチ当り平均84,946±11,061(x±SEM,n=
12)の単離された人の島が得られ、平均の島純度91.2±
2.3%、そして島当りインシュリン含量0.4±0.1mUインシ
ュリンであった。60mg/dl-300mg/dlの交互のグルコ−ス
濃度でのクレブス(KREBS)の灌流試験によって4.68±0.6
6(G300/G60)の平均インシュリン刺激インデックスが与
えられた。全てのバッチは7日間以内に標識された。
離した(Diabetes 37:413-420,1988)。島の全てのバッチ
を、補充した培地CMRL1066中でインビトロ（試験管内）
で保持した。バッチ当り平均84,946±11,061(x±SEM,n=
12)の単離された人の島が得られ、平均の島純度91.2±
2.3%、そして島当りインシュリン含量0.4±0.1mUインシ
ュリンであった。60mg/dl-300mg/dlの交互のグルコ−ス
濃度でのクレブス(KREBS)の灌流試験によって4.68±0.6
6(G300/G60)の平均インシュリン刺激インデックスが与
えられた。全てのバッチは7日間以内に標識された。
【００２８】島細胞の代謝標識化
最小で36時間のインビトロの培養に続いて(6000島/50ml
RPMI1640培地に16mMのグルコ−ス、20mMのHEPES、100u
U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2%(v/
v)正常な人血清を補充したもの、37℃、95%空気/5%C
O2)、これらの島を再植え付けし、メチオニンが欠けて
いる補充したRPMI1640培地(1000島/ml)中で15分間培養
した。次に細胞を、0.5mCi/1x103島細胞の濃度で35Sメ
チオニン(>500Ci/mmol)を加えておいたメチオニンのな
い培地(1000島/ml)中で37℃で(95%空気/5%CO2)5時間培
養した。細胞を次に補充したメチオニン含有(0.5mM)RPM
I1640培地(1000島/ml)と30分間培養し、2度(200xg,5分
間)20mMトリス(pH7.4)、150mMNacl、100KIE/mlアプロチ
ニン及び2mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PM
SF)を含有している緩衝液で洗浄し、そして次にそれら
の洗剤の抽出までスナップ（一時的急冷却）凍結させた
(-80℃)。
RPMI1640培地に16mMのグルコ−ス、20mMのHEPES、100u
U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2%(v/
v)正常な人血清を補充したもの、37℃、95%空気/5%C
O2)、これらの島を再植え付けし、メチオニンが欠けて
いる補充したRPMI1640培地(1000島/ml)中で15分間培養
した。次に細胞を、0.5mCi/1x103島細胞の濃度で35Sメ
チオニン(>500Ci/mmol)を加えておいたメチオニンのな
い培地(1000島/ml)中で37℃で(95%空気/5%CO2)5時間培
養した。細胞を次に補充したメチオニン含有(0.5mM)RPM
I1640培地(1000島/ml)と30分間培養し、2度(200xg,5分
間)20mMトリス(pH7.4)、150mMNacl、100KIE/mlアプロチ
ニン及び2mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PM
SF)を含有している緩衝液で洗浄し、そして次にそれら
の洗剤の抽出までスナップ（一時的急冷却）凍結させた
(-80℃)。
【００２９】64K自己抗原の免疫沈殿
島細胞は2%トリトン(TRITON)TMX-114を含有している上
記緩衝液中で溶解させた。不要物を超遠心で除去した(1
00,000xg,30分,4℃)。溶解物を次に免疫沈殿に先立って
水相、蔗糖相及び洗剤相に分離した(ボルディア−(Bord
ier),C. [1981]J.Biol.Chem 256:1064-1067)。溶解物を
正常な対照人血清(100μlの上澄み当り10μl、1時間、4
℃）とともに培養し、続いてプロテインAセファロ−スC
L-4Bの過剰に吸着させた(100μlの膨潤プロテインAセフ
ァロ−スを25μlの血清に対し使用）。結合しない（予
備透明化）溶解物のアリコ−ト(5-10x106cpmを含有して
いる100μl)を25μlの試験血清(IDD又は対照のいずれ
か）とともに18時間培養した(4℃)。試験された各々の
血清試料に対する1000個の島からの洗剤抽出物を使用し
た。各検定試験管に対し、予備膨潤化プロテインAセフ
ァロ−スCL-4Bを加え、反応混合物を45分間培養した(4
℃)。プロテインAセファロ−スCL-4Bを次に0.5%トリト
ンTMX-114緩衝液中で遠心させること(200xg,10秒間)に
よって5回洗浄し、氷冷2回蒸留水(200xg,30秒間）中で1
度洗浄した。結合した蛋白質を溶出させ、80mMトリス(p
H6.8)、3.0%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、15%(v
/v)シュ−クロ−ス、0.001%(v/v)ブロムフェニルブル
−、及び5.0%(v/v)β-メルカプトエタノ−ルを含有して
いる試料緩衝液中で3分間沸騰させることによって変性
させた。セファロ−スビ−ズを遠心分離で除去し(200x
g,1分間)、そして上澄み液を不連続SDS10%ポリアクリル
アミド分離ゲルを通して電気泳動させ、続いてクマシ−
ブリリアントブル−染色とエンハンス(Enhance)（ニュ
−イングランドニュ−クリア−、マサチュ−セッツ州、
ボストン）を使用するフルオログラフィ−を行った。
記緩衝液中で溶解させた。不要物を超遠心で除去した(1
00,000xg,30分,4℃)。溶解物を次に免疫沈殿に先立って
水相、蔗糖相及び洗剤相に分離した(ボルディア−(Bord
ier),C. [1981]J.Biol.Chem 256:1064-1067)。溶解物を
正常な対照人血清(100μlの上澄み当り10μl、1時間、4
℃）とともに培養し、続いてプロテインAセファロ−スC
L-4Bの過剰に吸着させた(100μlの膨潤プロテインAセフ
ァロ−スを25μlの血清に対し使用）。結合しない（予
備透明化）溶解物のアリコ−ト(5-10x106cpmを含有して
いる100μl)を25μlの試験血清(IDD又は対照のいずれ
か）とともに18時間培養した(4℃)。試験された各々の
血清試料に対する1000個の島からの洗剤抽出物を使用し
た。各検定試験管に対し、予備膨潤化プロテインAセフ
ァロ−スCL-4Bを加え、反応混合物を45分間培養した(4
℃)。プロテインAセファロ−スCL-4Bを次に0.5%トリト
ンTMX-114緩衝液中で遠心させること(200xg,10秒間)に
よって5回洗浄し、氷冷2回蒸留水(200xg,30秒間）中で1
度洗浄した。結合した蛋白質を溶出させ、80mMトリス(p
H6.8)、3.0%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、15%(v
/v)シュ−クロ−ス、0.001%(v/v)ブロムフェニルブル
−、及び5.0%(v/v)β-メルカプトエタノ−ルを含有して
いる試料緩衝液中で3分間沸騰させることによって変性
させた。セファロ−スビ−ズを遠心分離で除去し(200x
g,1分間)、そして上澄み液を不連続SDS10%ポリアクリル
アミド分離ゲルを通して電気泳動させ、続いてクマシ−
ブリリアントブル−染色とエンハンス(Enhance)（ニュ
−イングランドニュ−クリア−、マサチュ−セッツ州、
ボストン）を使用するフルオログラフィ−を行った。
【００３０】ICA分析
(ノイフェルド(Neufeld), M.N.マクラレン(Maclaren),
W.リレイ(Riley), D.リゾッテ(Lezotte), H.マクロ−リ
ン(McLaughlin), J.シルバ−スタイン(Silverstein),及
び A.ロゼンブル−ム(Rosenbroom) [1980] Diabetes 2
9:589-592)中に記載されるように血液群Ｏ型クリオカッ
ト(cryocut)膵臓切片に対し、間接的な螢光抗体法によ
ってICAを検定した。すべての結果はコ−ド化された試
料に対して読み取られ、各バッチ中で対照陰性及び陽性
血清を用いた。血清は組織の螢光抗体が膵臓の島内で観
測されるときは陽性と考えられた。陽性の結果は、糖尿
病の免疫学研究会(Immunology of Diabetes Workshops)
(IDW)によって定義され、ノエル(Noel) K.マクラレン(M
aclaren)によって管理された世界的なICA熟練者試験プ
ログラムによって標準化された、10若年性糖尿病基金(J
DF)の濃度（又は力価）を、自己抗体が超える場合に陽
性である。
W.リレイ(Riley), D.リゾッテ(Lezotte), H.マクロ−リ
ン(McLaughlin), J.シルバ−スタイン(Silverstein),及
び A.ロゼンブル−ム(Rosenbroom) [1980] Diabetes 2
9:589-592)中に記載されるように血液群Ｏ型クリオカッ
ト(cryocut)膵臓切片に対し、間接的な螢光抗体法によ
ってICAを検定した。すべての結果はコ−ド化された試
料に対して読み取られ、各バッチ中で対照陰性及び陽性
血清を用いた。血清は組織の螢光抗体が膵臓の島内で観
測されるときは陽性と考えられた。陽性の結果は、糖尿
病の免疫学研究会(Immunology of Diabetes Workshops)
(IDW)によって定義され、ノエル(Noel) K.マクラレン(M
aclaren)によって管理された世界的なICA熟練者試験プ
ログラムによって標準化された、10若年性糖尿病基金(J
DF)の濃度（又は力価）を、自己抗体が超える場合に陽
性である。
【００３１】インシュリン自己抗体結合手順
IAAを検出するのに使用されるRIA法をIDDに対する特異
性を失うことなしに感受性を最大にするために変更し
た。平均血清インシュリン結合値はIDDの家族歴がない9
4人の非糖尿病白人子供及び実験室の人員から得られた
血清から計算された（平均年齢13.7±7.7才、51人の男
性/43人の女性）。これらの対照個人は誰もICAに対し陽
性ではなかった。0.15ng/mlの濃度でA14の位置において
125Ｉで放射標識されたモノヨウ素化された人インシュ
リンを使用して最適の結果が見出された。より最近で
は、検定の改良された特異性が、過剰の標識されていな
いインシュリンの添加を通して置き換え可能である、特
定の結合の測定によって達成できた。
性を失うことなしに感受性を最大にするために変更し
た。平均血清インシュリン結合値はIDDの家族歴がない9
4人の非糖尿病白人子供及び実験室の人員から得られた
血清から計算された（平均年齢13.7±7.7才、51人の男
性/43人の女性）。これらの対照個人は誰もICAに対し陽
性ではなかった。0.15ng/mlの濃度でA14の位置において
125Ｉで放射標識されたモノヨウ素化された人インシュ
リンを使用して最適の結果が見出された。より最近で
は、検定の改良された特異性が、過剰の標識されていな
いインシュリンの添加を通して置き換え可能である、特
定の結合の測定によって達成できた。
【００３２】IVGTT手順
グルコ−ス刺激に対するインシュリンの応答を調べるた
めに、静脈内グルコ−ス許容試験(IVGTT)を実施したが
(スリカンタ(Srikanta),S., O.P.ガンダ(Ganda), G.S.
アイゼンバ−ス(Eisenbarth),及び J.S.ソエルドナ−(S
oeldner) [1983]N.Engl.J.Med. 308:322-325)、 投与グ
ルコ−スの量は2〜4分にわたって正確に静脈内に与えら
れた0.5g/Kgである。血清の試料をグルコ−ス注入後-1
0、1、3、5、10、15、30、及び60分において集めた。イ
ンシュリンの欠乏は1分と3分におけるインシュリン水準
がともにICA陰性の非IDDの人の対照個体群に対して、＜
3rd百分位数(percentile)であるときと定義される(n=15
0,年齢20.3±10.2才,範囲2〜59年)。この分析に対し70
μIU/ml(150人の対照に対し、＜3rd百分位数)未満のイ
ンシュリン値をインシュリンノペニック(insulinopeni
c)と考えた。
めに、静脈内グルコ−ス許容試験(IVGTT)を実施したが
(スリカンタ(Srikanta),S., O.P.ガンダ(Ganda), G.S.
アイゼンバ−ス(Eisenbarth),及び J.S.ソエルドナ−(S
oeldner) [1983]N.Engl.J.Med. 308:322-325)、 投与グ
ルコ−スの量は2〜4分にわたって正確に静脈内に与えら
れた0.5g/Kgである。血清の試料をグルコ−ス注入後-1
0、1、3、5、10、15、30、及び60分において集めた。イ
ンシュリンの欠乏は1分と3分におけるインシュリン水準
がともにICA陰性の非IDDの人の対照個体群に対して、＜
3rd百分位数(percentile)であるときと定義される(n=15
0,年齢20.3±10.2才,範囲2〜59年)。この分析に対し70
μIU/ml(150人の対照に対し、＜3rd百分位数)未満のイ
ンシュリン値をインシュリンノペニック(insulinopeni
c)と考えた。
【００３３】HLA DR 血液型判定法
HLA DR 血液型判定法はバンロッド(Van Rood)及びバン
ロウエン(Van Leuwen)(バンロッド(Van Rood),J.J., A.
バンロウエン(Van Leuwen),及び J.S.Ploem [1976] Nat
ure 262:795-797)によって記載される方法から適合化さ
れるように実施した。標準対照抗血清を血液型判定法に
使用した。
ロウエン(Van Leuwen)(バンロッド(Van Rood),J.J., A.
バンロウエン(Van Leuwen),及び J.S.Ploem [1976] Nat
ure 262:795-797)によって記載される方法から適合化さ
れるように実施した。標準対照抗血清を血液型判定法に
使用した。
【００３４】人島cDNAライブラリ−の構築
人島細胞に対するcDNAライブラリ−をラムダgt11ベクタ
−中で構築した(ヤング(Young),R.A.,及びデイビス(Dav
is),R.W. [1983] Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:1194-11
98)。メッセンジャ−RNAを単離し、チルグウィン(Chirg
win)らの方法の変法に従っておよそ200,000の精製した
人の島から単離及び精製した(チルグウィン(Chirgwin),
J.M., A.E.プリジビラ(Przybyla), R.J.マクドナルド(M
acDonald), W.J.ルタ−(Rutter) [1979] Biochemistry
18:5294-5299)。島を1M 2-メルカプトエタノ−ル及び0.
1Mトリス-HCL(pH7.4)を含有している4Mグアニジンチオ
シアネ−ト中で溶解した。溶解物をCsClの5.7Mクッショ
ン上に層にし、17時間ベックマンSW50.1ロ−タ−中で3
7,000rpmにおいて遠心分離にかけた。RNAペレットを除
去し、滅菌水中に再懸濁し、続いて無水エタノ−ル3容
量で沈殿させた。この最終段階を3回繰り返してRNAのき
れいな調整物を得ることを確実にした。ライブラリ−に
対するcDNAを鋳型として人の島の全RNAを使用し、そし
て人の胎盤のリボヌクリア−ゼ阻害剤、オリゴ(dT)プラ
イマ−、及び4つのデオキシリボヌクレオチドトリフォ
スフェ−トの存在下で酵素リバ−ストランスクリプタ−
ゼ（逆転写酵素）を使用して合成した。混合物を40度で
2時間培養した。cDNAの第2のストランドを第1のストラ
ンドの反応生成物及び酵素大腸菌DNAポリメラ−ゼＩ及
び大腸菌リボヌクレア−ゼHを使用して合成した。混合
物を順次12℃で60分間、次に22℃で60分間で培養し、続
いて65℃で10分間熱不活性化させた。cDNAの末端がフラ
ッシュエンドであることを確実にするために混合物を37
℃で10分間T4 DNAポリメラ−ゼとともに培養した。この
二本鎖cDNA(ds-cDNA)のこの混合物を次に等しい容量の
緩衝液飽和フェノ−ル／クロロホルムでの抽出、続いて
等しい容量のクロロホルムでの抽出を用いて精製した。
取り込まれていないヌクレオチドを等しい容量の4M酢酸
アンモニウムの添加、続いて2容量の無水エタノ−ルの
添加によって除去した。ドライアイス上で15分間冷却
後、混合物を12,000rpmでミクロ遠心機中で10分間遠心
した。この沈殿段階を2回繰り返して、取り込まれてい
ないヌクレオチドの完全な除去を確実にした。
−中で構築した(ヤング(Young),R.A.,及びデイビス(Dav
is),R.W. [1983] Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:1194-11
98)。メッセンジャ−RNAを単離し、チルグウィン(Chirg
win)らの方法の変法に従っておよそ200,000の精製した
人の島から単離及び精製した(チルグウィン(Chirgwin),
J.M., A.E.プリジビラ(Przybyla), R.J.マクドナルド(M
acDonald), W.J.ルタ−(Rutter) [1979] Biochemistry
18:5294-5299)。島を1M 2-メルカプトエタノ−ル及び0.
1Mトリス-HCL(pH7.4)を含有している4Mグアニジンチオ
シアネ−ト中で溶解した。溶解物をCsClの5.7Mクッショ
ン上に層にし、17時間ベックマンSW50.1ロ−タ−中で3
7,000rpmにおいて遠心分離にかけた。RNAペレットを除
去し、滅菌水中に再懸濁し、続いて無水エタノ−ル3容
量で沈殿させた。この最終段階を3回繰り返してRNAのき
れいな調整物を得ることを確実にした。ライブラリ−に
対するcDNAを鋳型として人の島の全RNAを使用し、そし
て人の胎盤のリボヌクリア−ゼ阻害剤、オリゴ(dT)プラ
イマ−、及び4つのデオキシリボヌクレオチドトリフォ
スフェ−トの存在下で酵素リバ−ストランスクリプタ−
ゼ（逆転写酵素）を使用して合成した。混合物を40度で
2時間培養した。cDNAの第2のストランドを第1のストラ
ンドの反応生成物及び酵素大腸菌DNAポリメラ−ゼＩ及
び大腸菌リボヌクレア−ゼHを使用して合成した。混合
物を順次12℃で60分間、次に22℃で60分間で培養し、続
いて65℃で10分間熱不活性化させた。cDNAの末端がフラ
ッシュエンドであることを確実にするために混合物を37
℃で10分間T4 DNAポリメラ−ゼとともに培養した。この
二本鎖cDNA(ds-cDNA)のこの混合物を次に等しい容量の
緩衝液飽和フェノ−ル／クロロホルムでの抽出、続いて
等しい容量のクロロホルムでの抽出を用いて精製した。
取り込まれていないヌクレオチドを等しい容量の4M酢酸
アンモニウムの添加、続いて2容量の無水エタノ−ルの
添加によって除去した。ドライアイス上で15分間冷却
後、混合物を12,000rpmでミクロ遠心機中で10分間遠心
した。この沈殿段階を2回繰り返して、取り込まれてい
ないヌクレオチドの完全な除去を確実にした。
【００３５】s-アデノシル-メチオニンの存在下で酵素E
coRIメチラ−ゼとともに37℃で1時間培養することから
始めて、一連の変更段階によってベクタ−中にクロ−ニ
ングするためにds-cDNAを調製した。このメチレ−ト化c
DNAをT4 DNAリガ−ゼ及びATPの存在下で15℃で一夜合成
EcoRIリンカ−に連結させた。粘着性(cohesive)EcoRI末
端を37℃で5時間EcoRIエンドヌクレア−ゼで消化するこ
とによってリンカ−にしたcDNA上に生じさせた。この段
階に続いて過剰のリンカ−をカラムクロマトグラフィに
よって混合物から除去した。このカラムのボイドボリュ
−ム（空間容量）中で溶離された物質はメチレ−ト化さ
れている、そしてEcoRIリンカ−に連結されそして寸法
が選択されているds-cDNAを表している。
coRIメチラ−ゼとともに37℃で1時間培養することから
始めて、一連の変更段階によってベクタ−中にクロ−ニ
ングするためにds-cDNAを調製した。このメチレ−ト化c
DNAをT4 DNAリガ−ゼ及びATPの存在下で15℃で一夜合成
EcoRIリンカ−に連結させた。粘着性(cohesive)EcoRI末
端を37℃で5時間EcoRIエンドヌクレア−ゼで消化するこ
とによってリンカ−にしたcDNA上に生じさせた。この段
階に続いて過剰のリンカ−をカラムクロマトグラフィに
よって混合物から除去した。このカラムのボイドボリュ
−ム（空間容量）中で溶離された物質はメチレ−ト化さ
れている、そしてEcoRIリンカ−に連結されそして寸法
が選択されているds-cDNAを表している。
【００３６】この材料をEcoRIで消化され、そしてアル
カリフォスパタ−ゼで処理されたラムダgt11ベクタ−に
連結した。連結はT4-DNAリガ−ゼ及びATPの存在下で15
℃で一夜進行した。各連結混合物を市販の抽出物（スト
ラテジ−ン）を使用してファ−ジラムダコ−ト蛋白質中
にパッケ−ジした。パッケ−ジ化されたファ−ジの水準
を大腸菌宿主菌株Y1088上での力価測定によって決定し
た。ライブラリ−の複雑性はおよそ2.0x106pfuと測定さ
れ、ブロモ−クロロ−インドリル−ガラクトシド(BCIG)
指示薬上の色の不存在によって検出されるように、その
うち81%が挿入されたcDNAを含有していた。組み替えラ
イブラリ−をオリゴヌクレオチドプロ−ブでのスクリ−
ニングに先立って増幅させた。
カリフォスパタ−ゼで処理されたラムダgt11ベクタ−に
連結した。連結はT4-DNAリガ−ゼ及びATPの存在下で15
℃で一夜進行した。各連結混合物を市販の抽出物（スト
ラテジ−ン）を使用してファ−ジラムダコ−ト蛋白質中
にパッケ−ジした。パッケ−ジ化されたファ−ジの水準
を大腸菌宿主菌株Y1088上での力価測定によって決定し
た。ライブラリ−の複雑性はおよそ2.0x106pfuと測定さ
れ、ブロモ−クロロ−インドリル−ガラクトシド(BCIG)
指示薬上の色の不存在によって検出されるように、その
うち81%が挿入されたcDNAを含有していた。組み替えラ
イブラリ−をオリゴヌクレオチドプロ−ブでのスクリ−
ニングに先立って増幅させた。
【００３７】以下は本発明を実施するための最良の形態
を含めた手順を説明している。これらの実施例は限定的
には解釈されるべきではない。他に記載されない限りす
べてのパ−セントは重量により、すべての溶媒混合物割
合は容量による。
を含めた手順を説明している。これらの実施例は限定的
には解釈されるべきではない。他に記載されない限りす
べてのパ−セントは重量により、すべての溶媒混合物割
合は容量による。
【００３８】統計分析はヤテ(Yate)の補正因子が適用さ
れた後のカイ二乗分析及びフィッシャ−(Fisher)の正確
な試験(Fisher's exact test)の両方を含む(スネデコル
(Snedecor),T.N.及び W.G.コクラン(Cochran) [1967] S
tatistical Methods. アイオワ州アメスのアイオワステ
−トユニバ−シティ−プレス)。
れた後のカイ二乗分析及びフィッシャ−(Fisher)の正確
な試験(Fisher's exact test)の両方を含む(スネデコル
(Snedecor),T.N.及び W.G.コクラン(Cochran) [1967] S
tatistical Methods. アイオワ州アメスのアイオワステ
−トユニバ−シティ−プレス)。
【００３９】実施例１−64KAのIDDとの関連性
5つの群の人を64KA試験のために選択した。確立された
ナショナル糖尿病デ−タグル−プ(NDDG)基準に従って定
義されたIDDを有する31人の新たに診断された患者が存
在した(National Diabetes Data Group [1979] 『真性
糖尿病の分類と診断及びグルコ−スイントレランス（ブ
ドウ糖不耐性）の他のカテゴリ−』、Diabetes 28:1039
-1057)。又ICAを欠いており、自己免疫病のどんな家族
歴も知られていない26人の糖尿病患者でない対照の人；
前記の新たに診断された患者の、糖尿病でないICAとIAA
を欠いている40人の親戚；36人の非糖尿病ではあるがIC
Aが陽性の人達であって、そのうち28人がIDDを有する発
端者の一親等の親戚で、4人が明らかに健康な正常な対
照であり、4人が自己免疫アジソン病又は甲状腺炎を有
する患者である人達；、IDDを有する発端者のかかって
いない親戚である、ICA陰性であるが高い力価のIAA陽性
の子供５人；及び血清が彼等のIDDの文書化された開始
の前に集められた28人の追加の人達も試験された。
ナショナル糖尿病デ−タグル−プ(NDDG)基準に従って定
義されたIDDを有する31人の新たに診断された患者が存
在した(National Diabetes Data Group [1979] 『真性
糖尿病の分類と診断及びグルコ−スイントレランス（ブ
ドウ糖不耐性）の他のカテゴリ−』、Diabetes 28:1039
-1057)。又ICAを欠いており、自己免疫病のどんな家族
歴も知られていない26人の糖尿病患者でない対照の人；
前記の新たに診断された患者の、糖尿病でないICAとIAA
を欠いている40人の親戚；36人の非糖尿病ではあるがIC
Aが陽性の人達であって、そのうち28人がIDDを有する発
端者の一親等の親戚で、4人が明らかに健康な正常な対
照であり、4人が自己免疫アジソン病又は甲状腺炎を有
する患者である人達；、IDDを有する発端者のかかって
いない親戚である、ICA陰性であるが高い力価のIAA陽性
の子供５人；及び血清が彼等のIDDの文書化された開始
の前に集められた28人の追加の人達も試験された。
【００４０】上記の患者はIDDの発端者の5000人を超え
る一親等の親戚の現在も行われている将来的ICAスクリ
−ニングの母集団研究の2つ、そして8200人の正常な対
照の人を通じて得られ、正常な対照の人のうちおよそ50
00人が学校の生徒であった。すべての血清は20℃で1週
間〜7年間自己抗体分析に先立って貯蔵された。
る一親等の親戚の現在も行われている将来的ICAスクリ
−ニングの母集団研究の2つ、そして8200人の正常な対
照の人を通じて得られ、正常な対照の人のうちおよそ50
00人が学校の生徒であった。すべての血清は20℃で1週
間〜7年間自己抗体分析に先立って貯蔵された。
【００４１】64KAは、新たに診断されたIDD患者の84%に
存在したという点、及び試験された対象の母集団には完
全に存在しなかった(p<0.0001)という点で極めてこの病
気に特異的であることがわかった。
存在したという点、及び試験された対象の母集団には完
全に存在しなかった(p<0.0001)という点で極めてこの病
気に特異的であることがわかった。
【００４２】実施例２−IDDの指標としての64KA
IDDの開始を実際に予測する64KAの能力を分析するため
に28人の個人からの血清試料を64KAについて分析した。
血清試料はIDDのどんな臨床的な出現の開始にも先立っ
て採取された。彼等の人生の後の時点において28人の人
のそれぞれがIDDの臨床的な症状を生じた。これらの28
人のうち25人が35才前に臨床的な症状を生じた。
に28人の個人からの血清試料を64KAについて分析した。
血清試料はIDDのどんな臨床的な出現の開始にも先立っ
て採取された。彼等の人生の後の時点において28人の人
のそれぞれがIDDの臨床的な症状を生じた。これらの28
人のうち25人が35才前に臨床的な症状を生じた。
【００４３】臨床的なIDDの開始において35才以下であ
る人25人のうちの24人中に(96%)に64KAが存在している
ことが見出された。これらの人からの試験された血清試
料はIDDの臨床的な開始の前3ケ月〜7年間（平均27ケ
月）のどこかで採取されている。臨床症状の開始の7年
も前に64KAの存在が生じている。
る人25人のうちの24人中に(96%)に64KAが存在している
ことが見出された。これらの人からの試験された血清試
料はIDDの臨床的な開始の前3ケ月〜7年間（平均27ケ
月）のどこかで採取されている。臨床症状の開始の7年
も前に64KAの存在が生じている。
【００４４】ICAとIAAの存在に対しても同じ血清試料が
試験された。全てのケ−スの82%に存在する64KAと比較
して、ICAは28の試料のうちの22人(78%)に存在し、IAA
は27の試料のうちのたった13(48%)に存在するにすぎな
かった。これらの結果は表1〜4に示される。明らかにID
Dに対する64KAの予測価値はすべての3つの自己抗体のう
ちで最良である。
試験された。全てのケ−スの82%に存在する64KAと比較
して、ICAは28の試料のうちの22人(78%)に存在し、IAA
は27の試料のうちのたった13(48%)に存在するにすぎな
かった。これらの結果は表1〜4に示される。明らかにID
Dに対する64KAの予測価値はすべての3つの自己抗体のう
ちで最良である。
【００４５】病気開始の9人のIDD患者の別の分析におい
て、応答SUSTACALTMの保持対島細胞インシュリンの保存
量の消失はICAよりも64KAとより良い相関を示した。従
って64KAは又、残っているβ細胞の量の指標も提供して
いる。
て、応答SUSTACALTMの保持対島細胞インシュリンの保存
量の消失はICAよりも64KAとより良い相関を示した。従
って64KAは又、残っているβ細胞の量の指標も提供して
いる。
【００４６】
表 １
64,000 Mr 自己抗体の頻度 群
n 64KA ICA
対照 26 0(0) 0(0)
新たに診断したIDD 31 26(84) 25(81)
ICA-/IAA-親戚 40 1(2) 0(0)
ICA+親戚 28 23(82) 28(100)
ICA+その他 8 7(87) 8(100)
ICA-/IAA+<年齢5才 5 4(80) 0(0)
（ICA・・・・島細胞自己抗体、 IAA・・・・インシュリン自己抗体）
【００４７】
表 ２
ICA陽性のためIDDの危険のある非糖尿病患者発見まとめ
IDD関連自己抗体 血漿インシュリンIVGTT性
年齢 HLA-DR 確認 ICA* 64K IAA (1+3分(百分位数))
M 6 3,- IDD家族調査 80 + - 144(40)
M 9 3,1 IDD家族調査 40 + - 57(<1)
F 11 3,4 IDD家族調査 80 + + ND
M 11 3,4 IDD家族調査 80 + + 105(20)
F 12 4,3 IDD家族調査 40 + - 194(60)
F 13 2,4 IDD家族調査 40 + + 62(<3)
M 17 3,4 IDD家族調査 20 + - 67(<3)
M 20 2,4 IDD家族調査 40 + + 58(<1)
F 29 3,4 IDD家族調査 40 + - 57(<1)
F 30 3,- IDD家族調査 160 + - 82(10)
F 33 3,8 IDD家族調査 20 + - 125(30)
F 34 3,4 IDD家族調査 40 + - 167(50)
M 44 4,1 IDD家族調査 20 - - ND
F 10 4,8 IDD家族調査 360 + - 98(20)
F 38 4,- IDD家族調査 20 + + 71(5)
M 7 4,8 IDD家族調査 40 + + 114(25)
M 7 3,4 IDD家族調査 20 + + 116(25)
M 10 4,- IDD家族調査 160 + + 52(<1)
F 10 5.9 IDD家族調査 20 + + 128(30)
F 43 3,1 IDD家族調査 80 - - 293(70)
F 13 1,3 IDD家族調査 80 - - 100(20)
M 5 2,4 IDD家族調査 40 + - 125(30)
F 39 4,- IDD家族調査 80 + + 112(25)
M 11 3,4 IDD家族調査 40 + + 56(<1)
F 35 4,7 IDD家族調査 40 + - 420(90)
M 43 3,7 IDD家族調査 160 - - ND
F 38 3,4 IDD家族調査 20 - - 184(60)
F 26 ND IDD家族調査 40 + + ND
M 8 3,4 学校調査 160 + + 67(<3)
M 10 3,4 学校調査 160 - - 268(75)
F 13 4,6 学校調査 40 + - 67(<3)
M 11 3,4 学校調査 320 + + 124(30)
M 16 3,4 アジソン病/甲状腺炎 160 + - ND
M 32 3,4 アジソン病/甲状腺炎 80 + - 197(60)
F 41 3,4 アジソン病/甲状腺炎 320 + + 69(<3)
M 12 3,4 アジソン病/甲状腺炎 160 + - 149(40)*
JDF 単位
【００４８】
表 ３IDD発生前試験された患者から入手できる最初の血清試料で見られたことのまと め
IDD関連自己抗体 性
HLA-DR 開始年齢 確認 糖尿病前期間(月) ICA* 64K IAA
M 3,3 5 IDD家族調査 9 - + -
M 4,6 10 IDD家族調査 34 20 + +
F 4,7 11 IDD家族調査 34 40 + +
M 3,3 12 IDD家族調査 8 40 + -
F 4,6 15 IDD家族調査 3 80 + -
M 3,4 15 IDD家族調査 19 80 + +
M 3,4 17 IDD家族調査 14 - + -
M 3,4 19 IDD家族調査 3 40 + -
M ND 21 IDD家族調査 32 80 + -
F 4,- 33 IDD家族調査 14 10 + +
F 4,5 38 IDD家族調査 2 80 - -
M 3,4 42 IDD家族調査 42 80 + +
M 4,6 5 IDD家族調査 30 -** -** +
M 3,4 15 IDD家族調査 6 - + +
M 3,4 30 IDD家族調査 13 160 + ND
M ND 4 IDD家族調査 3 20 - -
M 6,1 33 IDD家族調査 14 -** + -
F 4,6 37 IDD家族調査 3 80 - -
F 3,4 7 フ゛ト゛ウ糖不耐性 1 +(NT) + +
M 4,4 15 フ゛ト゛ウ糖不耐性 2 80 + +
F 3,6 17 フ゛ト゛ウ糖不耐性 2 20 + -
M 2,3 18 フ゛ト゛ウ糖不耐性 12 40 + -
M ND 27 フ゛ト゛ウ糖不耐性 6 40 + +
F 2,3 40 フ゛ト゛ウ糖不耐性 19 +(NT) - -
F 1,4 9 学校調査 3 40 + +
F 3,4 12 学校調査 44 320 + +
F 3,3 24 ク゛レ-フ゛ス病 72 -** + -
F 1,4 14 甲状腺炎 75 +(NT) + +
22/28 23/28 13/27
(78%) (82%) (48%)
NT=JDF力価測定せず
ND=測定せず*
=JDF単位**
=後の試料デ−タで自己抗体陽性に変換された
【００４９】
表 ４
IAA陽性のためIDDの危険のある非糖尿病患者発見まとめ
IDD関連自己抗体 血漿インシュリンIVGTT性
年齢 HLA-DR 確認 ICA* 64K IAA (1+3分(百分位数))
F 2 4,5 IDD家族調査 - + + 129(40)
M 3 2,1 IDD家族調査 - + + 27(<1)
F 5 ND IDD家族調査 - + + ND
M 0.5 1,6 IDD家族調査 - + + 342
F 3 ND IDD家族調査 - - + ND
【００５０】実施例３−NODマウスにおける64KAとIDDの
関連 最近2種類の動物（BBラット及びNODマウス）が人IDDの
研究のためのモデルとして役に立つことができるものと
して開発されている。IDDの指標として評価するために
動物モデルを使用することは、感受性のある人を見つけ
るために循環している自己抗体をスクリ−ニングしなけ
ればならない病気の発端者の危険の高い親戚の数が多い
ために、糖尿病前期間は研究困難なため、そして病気に
おけるβ細胞不全の自然の歴を文書化する必要性がある
長期間の観察のため、非常に貴重である。NODマウスとB
Bラットは人IDDにおいて関与する病因事象シ−ケンスに
重要な識見を与える。これらの動物の分析は又、自己免
疫過程において関与する標的島細胞自己抗原の性質の理
解につながる。我々は従ってNODマウスとBBラットをIDD
の開始前及び後の両方においてそれらの存在するかもし
れない64K自己抗体について試験した。
関連 最近2種類の動物（BBラット及びNODマウス）が人IDDの
研究のためのモデルとして役に立つことができるものと
して開発されている。IDDの指標として評価するために
動物モデルを使用することは、感受性のある人を見つけ
るために循環している自己抗体をスクリ−ニングしなけ
ればならない病気の発端者の危険の高い親戚の数が多い
ために、糖尿病前期間は研究困難なため、そして病気に
おけるβ細胞不全の自然の歴を文書化する必要性がある
長期間の観察のため、非常に貴重である。NODマウスとB
Bラットは人IDDにおいて関与する病因事象シ−ケンスに
重要な識見を与える。これらの動物の分析は又、自己免
疫過程において関与する標的島細胞自己抗原の性質の理
解につながる。我々は従ってNODマウスとBBラットをIDD
の開始前及び後の両方においてそれらの存在するかもし
れない64K自己抗体について試験した。
【００５１】種々の年齢の雄及び雌のNOD及び対象(BALB
/c,C57BL/6,C2H/Hej)系統のマウスから血清を得た。NOD
マウスのIDDの診断はそれらののどのかわきと体重減少
及び240mg/dlを超える過血糖症の持続によって特徴づけ
られた。健康の維持のため全ての糖尿病動物は1日当り
0.5〜2.0単位のプロタミン−亜鉛インシュリン（エリリ
リ−(Eli Lilly)、インディアナポリス、インディアナ
州）の毎日のインシュリン投与を受けた。
/c,C57BL/6,C2H/Hej)系統のマウスから血清を得た。NOD
マウスのIDDの診断はそれらののどのかわきと体重減少
及び240mg/dlを超える過血糖症の持続によって特徴づけ
られた。健康の維持のため全ての糖尿病動物は1日当り
0.5〜2.0単位のプロタミン−亜鉛インシュリン（エリリ
リ−(Eli Lilly)、インディアナポリス、インディアナ
州）の毎日のインシュリン投与を受けた。
【００５２】ブルンシュテット（ブルンシュテット(Bru
ndstedt),J.,ニ−ルセン(Nielsen),J.H.,ラ−ンマ−ク
(Lernmark), A.及びハゲドルン(Hagedorn)スタディグル
−プ,Methods in Diabetes Research,J.ラ−ナ−(Larne
r),S.L.ポ−ル(Pohl)編［ジョンウィリ−＆サンズ(John
Willey & Sons),ニュ−ヨ−ク，1987年］）の方法に従
ってBALB/c島を単離し、そして35Sメチオニンでラベル
した。島細胞を補充したRPMI1640(GIBCO,New York)培地
(2.0%牛胎児血清、100単位/mlペニシリン、100μg/mlス
トレプトマイシン）中で2度(4℃)島細胞を洗浄し、続い
て20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1000KIE/mlトレイ
シロ−ル及び2mM PMSFを含有している緩衝液中で1度洗
浄した。細胞を次に1%ノニデット(Nonidet) P-40(NP-4
0)(v/v)を含有している上記緩衝液中で溶解した。不要
物質を超遠心(100,000xg、30分)で除去した。溶解物を正
常なマウス血清(Balb/c)(100μl上澄み当り10μl,1時
間,4℃)とともに培養、続いて過剰のプロテインAセファ
ロ−スCL-4Bに対して吸着された。この培養／吸着手順
は3回繰り返された。アリコ−ト(100μl)の非結合（予
備透明化）溶解物を25μlのNOD血清又は対照の血清のい
ずれかとともに18時間(4℃）培養した。各検定試験管に
100μlの予備膨潤プロテインAセファロ−スCL-4Bを加
え、そして反応混合物を45分間培養した(4℃)。プロテ
インAセファロ−スCL-4Bを次に0.5%NP-40緩衝液中での
遠心(200xg,10秒間)によって5回そして冷たい水中での
遠心(200xg,30秒間)で1回洗浄した。結合した免疫複合
体を80mMトリス(pH6.8)、3.0%(w/v)ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、15%蔗糖、0.001ブロモフェニルブル−及び
(5.0% v/v)β-メルカプトエタノ−ルを含有している試
料緩衝液中で5分間沸騰させることによって、変性させ
た。セファロ−スのビ−ズを遠心分離で除去し(200xg,1
分間)、そして上澄みをSDS12%ポリアクリルアミド分離
ゲルを通して電気泳動させ、続いてクマシ−染色とオ−
トラジオグラフィ−を行った。
ndstedt),J.,ニ−ルセン(Nielsen),J.H.,ラ−ンマ−ク
(Lernmark), A.及びハゲドルン(Hagedorn)スタディグル
−プ,Methods in Diabetes Research,J.ラ−ナ−(Larne
r),S.L.ポ−ル(Pohl)編［ジョンウィリ−＆サンズ(John
Willey & Sons),ニュ−ヨ−ク，1987年］）の方法に従
ってBALB/c島を単離し、そして35Sメチオニンでラベル
した。島細胞を補充したRPMI1640(GIBCO,New York)培地
(2.0%牛胎児血清、100単位/mlペニシリン、100μg/mlス
トレプトマイシン）中で2度(4℃)島細胞を洗浄し、続い
て20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1000KIE/mlトレイ
シロ−ル及び2mM PMSFを含有している緩衝液中で1度洗
浄した。細胞を次に1%ノニデット(Nonidet) P-40(NP-4
0)(v/v)を含有している上記緩衝液中で溶解した。不要
物質を超遠心(100,000xg、30分)で除去した。溶解物を正
常なマウス血清(Balb/c)(100μl上澄み当り10μl,1時
間,4℃)とともに培養、続いて過剰のプロテインAセファ
ロ−スCL-4Bに対して吸着された。この培養／吸着手順
は3回繰り返された。アリコ−ト(100μl)の非結合（予
備透明化）溶解物を25μlのNOD血清又は対照の血清のい
ずれかとともに18時間(4℃）培養した。各検定試験管に
100μlの予備膨潤プロテインAセファロ−スCL-4Bを加
え、そして反応混合物を45分間培養した(4℃)。プロテ
インAセファロ−スCL-4Bを次に0.5%NP-40緩衝液中での
遠心(200xg,10秒間)によって5回そして冷たい水中での
遠心(200xg,30秒間)で1回洗浄した。結合した免疫複合
体を80mMトリス(pH6.8)、3.0%(w/v)ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、15%蔗糖、0.001ブロモフェニルブル−及び
(5.0% v/v)β-メルカプトエタノ−ルを含有している試
料緩衝液中で5分間沸騰させることによって、変性させ
た。セファロ−スのビ−ズを遠心分離で除去し(200xg,1
分間)、そして上澄みをSDS12%ポリアクリルアミド分離
ゲルを通して電気泳動させ、続いてクマシ−染色とオ−
トラジオグラフィ−を行った。
【００５３】最初の試験はNODマウス中で64KAが生じた
かどうかを知るためであった。血清は新たに診断された
IDDを有する8匹の雌のNODマウス（開始における平均年
齢104.5±13.5日、範囲93〜134日）及びBALB/c(n=5)、C
57BL/6(n=4)、C3H/HeJ(n=2)系統の11匹の健康な対照マ
ウス(2匹の雄及び9匹の雌、平均年齢97.7±30.4日、範
囲50〜120日）から血清を得た。
かどうかを知るためであった。血清は新たに診断された
IDDを有する8匹の雌のNODマウス（開始における平均年
齢104.5±13.5日、範囲93〜134日）及びBALB/c(n=5)、C
57BL/6(n=4)、C3H/HeJ(n=2)系統の11匹の健康な対照マ
ウス(2匹の雄及び9匹の雌、平均年齢97.7±30.4日、範
囲50〜120日）から血清を得た。
【００５４】それらの糖尿病の開始において、64KAがNO
Dの87%中で検出されたが、非糖尿病体質の対照系統のい
ずれにも64KAは検出されなかった(P<0.001)。新たに診
断されたIDDを有するNODマウスに高いパ−セントで64K
に対する自己抗体が存在することは、年齢がマッチして
いる非糖尿病体質対照マウス中に64KAが存在しないこと
と合せて、64KAがIDDに対し、そしてその前徴状態に対
し特異的であることを意味する。64KAが存在することは
又、検出可能な最初の事象の一つでもあり、インシュリ
ティス(insulitis)が見つけられる最も早い年齢である
離乳の時又は離乳の前にさえも一般に存在する。
Dの87%中で検出されたが、非糖尿病体質の対照系統のい
ずれにも64KAは検出されなかった(P<0.001)。新たに診
断されたIDDを有するNODマウスに高いパ−セントで64K
に対する自己抗体が存在することは、年齢がマッチして
いる非糖尿病体質対照マウス中に64KAが存在しないこと
と合せて、64KAがIDDに対し、そしてその前徴状態に対
し特異的であることを意味する。64KAが存在することは
又、検出可能な最初の事象の一つでもあり、インシュリ
ティス(insulitis)が見つけられる最も早い年齢である
離乳の時又は離乳の前にさえも一般に存在する。
【００５５】実施例４−NODマウス中のIDDの指標として
の64KA IDDに関して64Kの自己抗体の自然な歴について知るため
に、離乳期において5匹のマウス(2匹の雄及び3匹の雌、
年齢23〜25日)から得た血清試料を分析し、それらの膵
臓をインシュリンについて組織学的に調べた。インシュ
リンは5又はそれ以上の島を含有しているヘマトキシロ
ン及びエオシン染色膵臓セクション上のリンパ球のはっ
きりした島内浸潤として検出された。64KAは既にこれら
のマウスの80%(4/5)中に存在した。同時に初期のインシ
ュリティスもそれらの膵臓の組織が分析された4匹のマ
ウスの3匹中に存在した。対称的にIDDを全く生じなかっ
た190日以上の年齢で試験された2匹の動物（両方とも
雄）は、両方がインシュリティスを有するのに64KAを有
さなかった。
の64KA IDDに関して64Kの自己抗体の自然な歴について知るため
に、離乳期において5匹のマウス(2匹の雄及び3匹の雌、
年齢23〜25日)から得た血清試料を分析し、それらの膵
臓をインシュリンについて組織学的に調べた。インシュ
リンは5又はそれ以上の島を含有しているヘマトキシロ
ン及びエオシン染色膵臓セクション上のリンパ球のはっ
きりした島内浸潤として検出された。64KAは既にこれら
のマウスの80%(4/5)中に存在した。同時に初期のインシ
ュリティスもそれらの膵臓の組織が分析された4匹のマ
ウスの3匹中に存在した。対称的にIDDを全く生じなかっ
た190日以上の年齢で試験された2匹の動物（両方とも
雄）は、両方がインシュリティスを有するのに64KAを有
さなかった。
【００５６】実施例５−BBラット中の64KA
BBラット(n=8)中に見られたIDDの研究において、64K蛋
白質に対する自己抗体は病気の自然の歴の初期に現れ、
かなりの特異性をIDDのマ−カ−として示している（6匹
のリュ−イスラットの対照中に存在しない）。人、NOD
マウス、及びBBラットにおける64KAの発見は、Mr64,000
島細胞蛋白質に対する自己免疫がかなり病因上重要なも
のであって、64K蛋白が正常なβ細胞で重要な生理学的
機能を有し得ることを示唆している。
白質に対する自己抗体は病気の自然の歴の初期に現れ、
かなりの特異性をIDDのマ−カ−として示している（6匹
のリュ−イスラットの対照中に存在しない）。人、NOD
マウス、及びBBラットにおける64KAの発見は、Mr64,000
島細胞蛋白質に対する自己免疫がかなり病因上重要なも
のであって、64K蛋白が正常なβ細胞で重要な生理学的
機能を有し得ることを示唆している。
【００５７】実施例６−64K抗原の生化学的な特性化
生化学的な特性化に関しては、64K蛋白質のゲルのより
高い解像度は、これが2つの成分(63,500及び64,000Mr)
の間でおよそ0.5キロダルトンだけ異なっているダブレ
ットからなり得ることを示唆している。64K成分は還元
性の条件下ではMr64,000範囲に移り、そして非還元性条
件下では二量体（およそ130K）として見出され得る。64
K蛋白質は6.4と6.7の等電点を有するという点で荷電の
不均一性を示している。64K成分は洗剤相抽出物のイム
ノプレシピテ−ション（免疫沈殿）において観測される
疎水性のために一体の島細胞膜蛋白質を表している可能
性が最も強い。この特許出願で使用される「64K抗原」
という用語はここに記載される方法でゲル上で挙動する
化合物、化合物類又は複合体を指している。64K抗原は
又、以下に記載される抗-GAD抗体との免疫的な反応性に
よって同定することもできる。
高い解像度は、これが2つの成分(63,500及び64,000Mr)
の間でおよそ0.5キロダルトンだけ異なっているダブレ
ットからなり得ることを示唆している。64K成分は還元
性の条件下ではMr64,000範囲に移り、そして非還元性条
件下では二量体（およそ130K）として見出され得る。64
K蛋白質は6.4と6.7の等電点を有するという点で荷電の
不均一性を示している。64K成分は洗剤相抽出物のイム
ノプレシピテ−ション（免疫沈殿）において観測される
疎水性のために一体の島細胞膜蛋白質を表している可能
性が最も強い。この特許出願で使用される「64K抗原」
という用語はここに記載される方法でゲル上で挙動する
化合物、化合物類又は複合体を指している。64K抗原は
又、以下に記載される抗-GAD抗体との免疫的な反応性に
よって同定することもできる。
【００５８】我々は又、IDDを有する人から血清によっ
て人島細胞蛋白質から洗剤抽出されたイムノプレシピテ
−ション（免疫沈殿）がしばしばMr67,000蛋白質の同定
を生じることも発見した。我々は米国の学校の生徒及び
IDDを有する発端者の親戚の母集団中でこの67,000Mr抗
原に対する抗体について分析した。67,000Mr蛋白質に対
する自己抗体は、新たに診断されたIDD患者の60%(12/2
0)に観測され、そして18人の対照のたった1人にしか観
測されなかった(5%P<0.001)。このIDD母集団中で67,000
Mrに対する自己抗体はしばしば(73% 11/15) 64KAに対し
て陽性である人で観測されたが、67,000Mr自己抗体陽性
の人は64KAを欠いている患者ではたった1人しか発見さ
れなかった。67,000Mr蛋白質に対する自己抗体は64KA、
島細胞細胞質自己抗体及びインシュリン自己抗体の両方
を欠いている非糖尿病の一等親の親戚34人中のたった1
人（3%）にしか存在しなかった。クマシ−染色SDS-PAGE
ゲルの分析は、67,000Mr蛋白質に対する自己抗体の存在
は70,000Mrの強い染色の蛋白質としばしば関連してい
た。この70,000Mr蛋白質のガス相アミノ酸配列決定は、
これが免疫グロブリンＶ-III領域鎖であり、それによっ
て抗体のIgMクラスに向けられていることを明らかにし
ている。従って、67,000Mr抗原に対する免疫はIgMクラ
ス抗体で増加されるがこれに制限されないかもしれな
い。又、我々はほとんど全ての67,000Mr自己抗体陽性患
者が64KAも含有していることを明らかに示したが、67,0
00Mr自己抗体陽性であるが64KA陰性の人は稀にしかみら
れない。従って我々は64,000及び67,000Mr島細胞抗原の
間の抗原的な交差反応性が存在し得ること、そしてこれ
らの蛋白質に対する自己抗体がこれらの免疫学的な交差
反応性のエピト−プを同定できることを信じている。
て人島細胞蛋白質から洗剤抽出されたイムノプレシピテ
−ション（免疫沈殿）がしばしばMr67,000蛋白質の同定
を生じることも発見した。我々は米国の学校の生徒及び
IDDを有する発端者の親戚の母集団中でこの67,000Mr抗
原に対する抗体について分析した。67,000Mr蛋白質に対
する自己抗体は、新たに診断されたIDD患者の60%(12/2
0)に観測され、そして18人の対照のたった1人にしか観
測されなかった(5%P<0.001)。このIDD母集団中で67,000
Mrに対する自己抗体はしばしば(73% 11/15) 64KAに対し
て陽性である人で観測されたが、67,000Mr自己抗体陽性
の人は64KAを欠いている患者ではたった1人しか発見さ
れなかった。67,000Mr蛋白質に対する自己抗体は64KA、
島細胞細胞質自己抗体及びインシュリン自己抗体の両方
を欠いている非糖尿病の一等親の親戚34人中のたった1
人（3%）にしか存在しなかった。クマシ−染色SDS-PAGE
ゲルの分析は、67,000Mr蛋白質に対する自己抗体の存在
は70,000Mrの強い染色の蛋白質としばしば関連してい
た。この70,000Mr蛋白質のガス相アミノ酸配列決定は、
これが免疫グロブリンＶ-III領域鎖であり、それによっ
て抗体のIgMクラスに向けられていることを明らかにし
ている。従って、67,000Mr抗原に対する免疫はIgMクラ
ス抗体で増加されるがこれに制限されないかもしれな
い。又、我々はほとんど全ての67,000Mr自己抗体陽性患
者が64KAも含有していることを明らかに示したが、67,0
00Mr自己抗体陽性であるが64KA陰性の人は稀にしかみら
れない。従って我々は64,000及び67,000Mr島細胞抗原の
間の抗原的な交差反応性が存在し得ること、そしてこれ
らの蛋白質に対する自己抗体がこれらの免疫学的な交差
反応性のエピト−プを同定できることを信じている。
【００５９】この出願で使用される「免疫学的に64K抗
原と均等なもの」とは64KAと反応するペプチド類を指し
ている。64KA又は64K自己抗体という用語は64K抗原と反
応する化合物又は化合物類を指している。
原と均等なもの」とは64KAと反応するペプチド類を指し
ている。64KA又は64K自己抗体という用語は64K抗原と反
応する化合物又は化合物類を指している。
【００６０】64,000Mr蛋白質が両親媒性を示しているの
で我々は64K蛋白質が本質的に細胞の原形質膜に限定さ
れるかどうかを観測するために、そしてもしもそうであ
れば正常な島細胞中でこの蛋白質の表面表現(surface e
xpression)に対する証拠があるかどうかのための実験を
行った。
で我々は64K蛋白質が本質的に細胞の原形質膜に限定さ
れるかどうかを観測するために、そしてもしもそうであ
れば正常な島細胞中でこの蛋白質の表面表現(surface e
xpression)に対する証拠があるかどうかのための実験を
行った。
【００６１】我々の生化学的な特性決定試験は64K蛋白
質のグリコシル化の証拠すなわち表面表現蛋白質に対す
る共通の特徴を示さなかった。蛋白質炭水化物グリコシ
ル化の共通の形態を検出する一連の幅広い酵素スペクト
ラムを使用した。この分析は酵素N-GLYCANASETM(N-結合
炭水化物に対するもの)、O-結合炭水化物に対する処
置、ニュ−ラミニダ−ゼ(シアル酸基に対するもの)及び
β-エンドガラクトシダ−ゼ（ガラクト−ス基に対する
もの）を使用した。炭水化物基の一つが64K蛋白質上に
存在するならば、酵素はその炭水化物を開裂するであろ
うし、その後のSDS-PAGE分析の時に64K蛋白の易動性が
増加するであろうし、そして減少した分子量の蛋白質を
示すであろう。この特定の一連の酵素での蛋白質の処理
の後に、SDS-PAGEゲル中での64K蛋白質の易動性におけ
る差は検出されなかった。又、我々は一連の19個の幅広
い、そして狭いスペクトラムの炭水化物結合レクチン類
を使用してグリコシル化の存在に対して64K蛋白質を徹
底的に分析した。しかしながら、これらのレクチンのい
ずれも64K蛋白質に結合しなかった。従って64K蛋白質に
グリコシル化は存在しないように見える。
質のグリコシル化の証拠すなわち表面表現蛋白質に対す
る共通の特徴を示さなかった。蛋白質炭水化物グリコシ
ル化の共通の形態を検出する一連の幅広い酵素スペクト
ラムを使用した。この分析は酵素N-GLYCANASETM(N-結合
炭水化物に対するもの)、O-結合炭水化物に対する処
置、ニュ−ラミニダ−ゼ(シアル酸基に対するもの)及び
β-エンドガラクトシダ−ゼ（ガラクト−ス基に対する
もの）を使用した。炭水化物基の一つが64K蛋白質上に
存在するならば、酵素はその炭水化物を開裂するであろ
うし、その後のSDS-PAGE分析の時に64K蛋白の易動性が
増加するであろうし、そして減少した分子量の蛋白質を
示すであろう。この特定の一連の酵素での蛋白質の処理
の後に、SDS-PAGEゲル中での64K蛋白質の易動性におけ
る差は検出されなかった。又、我々は一連の19個の幅広
い、そして狭いスペクトラムの炭水化物結合レクチン類
を使用してグリコシル化の存在に対して64K蛋白質を徹
底的に分析した。しかしながら、これらのレクチンのい
ずれも64K蛋白質に結合しなかった。従って64K蛋白質に
グリコシル化は存在しないように見える。
【００６２】最後に125Iでの放射能標識化細胞表面蛋白
質の標準技術を使用して、64K蛋白のどれもが糖尿病患
者からの血清で表面標識島細胞からイムノプレシピテ−
ション（免疫沈殿）できなかったことが以前に示されて
いる(コルマンダ [1987] Diabetes 36,1432-1440)。表
面表現に対する証拠は従って存在しないことをその研究
は提案した。しかし、その一般の技術はチロシンを標識
しており（その蛋白質の細胞外部分に存在しないかもし
れない比較的稀なアミノ酸である）そして、性質上条件
が苛酷なものであった。従って64K蛋白質の抗原結合位
置を破壊するのに十分苛酷であり得、従って抗体は蛋白
質にもはや結合しないことがあり得る。しかしながら、
我々は新たに記載した技術を使用した（トンプソン J.
ら[1987]Biochemistry 26,743-750）。これは化学的性
質がずっと苛酷でないものであり、リジンか（チロシン
よりずっと一般的なアミノ酸である）又はNH2-末端アミ
ノ酸を放射標識するものであり、コルマン等の文献で使
用した方法よりもずっと高い特異的な活性を有する細胞
表面蛋白質を標識することが示されるものである。細胞
表面アミノ基は125Iスルホサクシミジイル（ヒドロキシ
フェニル）プロビオネ−トによって125I（ヒドロキシフ
ェニル）プロピオニル基で誘導化された。しかし、これ
らの検定改良をもってしても64K蛋白質は無傷の細胞表
面標識化人島細胞からは免疫沈殿されなかった。
質の標準技術を使用して、64K蛋白のどれもが糖尿病患
者からの血清で表面標識島細胞からイムノプレシピテ−
ション（免疫沈殿）できなかったことが以前に示されて
いる(コルマンダ [1987] Diabetes 36,1432-1440)。表
面表現に対する証拠は従って存在しないことをその研究
は提案した。しかし、その一般の技術はチロシンを標識
しており（その蛋白質の細胞外部分に存在しないかもし
れない比較的稀なアミノ酸である）そして、性質上条件
が苛酷なものであった。従って64K蛋白質の抗原結合位
置を破壊するのに十分苛酷であり得、従って抗体は蛋白
質にもはや結合しないことがあり得る。しかしながら、
我々は新たに記載した技術を使用した（トンプソン J.
ら[1987]Biochemistry 26,743-750）。これは化学的性
質がずっと苛酷でないものであり、リジンか（チロシン
よりずっと一般的なアミノ酸である）又はNH2-末端アミ
ノ酸を放射標識するものであり、コルマン等の文献で使
用した方法よりもずっと高い特異的な活性を有する細胞
表面蛋白質を標識することが示されるものである。細胞
表面アミノ基は125Iスルホサクシミジイル（ヒドロキシ
フェニル）プロビオネ−トによって125I（ヒドロキシフ
ェニル）プロピオニル基で誘導化された。しかし、これ
らの検定改良をもってしても64K蛋白質は無傷の細胞表
面標識化人島細胞からは免疫沈殿されなかった。
【００６３】原形質膜内に実際に64K蛋白質が存在する
ことを確認するために、我々は島細胞の粗製膜調製物を
つくり、そして試薬トリトンX-114を使用してIDDを有す
る患者からの血清を使用して64K蛋白質をイムノプレシ
ピテ−ション（免疫沈殿）させた。次に我々は64K蛋白
に対する自己抗体の検出のための改良方法を開発した。
この方法は洗剤を使用せず、そして解釈するのがより容
易であり、そして実施するのがより迅速である結果を生
じた。この方法は35Sメチオニン標識島細胞の粗製膜調
製物をつくり、続いて4℃で60分間トリプシン処理をす
ることを含んでいる(2mg/ml 50mM トリス緩衝液pH7.
4)。この材料を次に遠心分離し、続いて我々の標準のイ
ムノプレシピテ−ション（免疫沈殿）技術を行う。ゲル
電気泳動とオ−トラジオグラフィに続いて40Kバンドが
糖尿病患者の血清からの免疫沈殿物で観測されるが対照
では観測されない。チロシンで処理した単離された64K
蛋白質も40K蛋白を示すことを既に我々は示しているの
で、トリプシン処理島から直接免疫沈殿されたこの40K
のバンドは同じ蛋白質を表している可能性が非常に強
い。40K蛋白質に対する検定は、64KAのより簡単な検出
のための改良であるばかりではなく、イモビロン（immo
bilon）膜を使用するガス相配列分析によりずっとなじ
みやすい生成物を生じる。この改良の理由は40K断片は
アプライドバイオシステムズのガス相セクエンサ−を使
用するイノビロン(IMMOBILON)TM に結合した64K蛋白の
Ｎ末端アミノ酸配列の我々の決定において困難性を生じ
た主要な疎水領域がない可能性が非常に強いからであ
る。強疎水性領域を有する蛋白質がガス相セクエンサ−
において使用される溶媒で可溶化されること、従ってこ
の蛋白質を直接配列決定する技術的に主要なハ−ドルと
なっていることが確立されている。また64,000Ｍr範囲
におけるよりも、40,000Ｍr範囲ではより低いバックグ
ラウンド染色であるため、SDS pageゲルの銀染色におい
ては64K蛋白質よりも、40K蛋白質を見ることができるよ
うにするのがずっと容易である。
ことを確認するために、我々は島細胞の粗製膜調製物を
つくり、そして試薬トリトンX-114を使用してIDDを有す
る患者からの血清を使用して64K蛋白質をイムノプレシ
ピテ−ション（免疫沈殿）させた。次に我々は64K蛋白
に対する自己抗体の検出のための改良方法を開発した。
この方法は洗剤を使用せず、そして解釈するのがより容
易であり、そして実施するのがより迅速である結果を生
じた。この方法は35Sメチオニン標識島細胞の粗製膜調
製物をつくり、続いて4℃で60分間トリプシン処理をす
ることを含んでいる(2mg/ml 50mM トリス緩衝液pH7.
4)。この材料を次に遠心分離し、続いて我々の標準のイ
ムノプレシピテ−ション（免疫沈殿）技術を行う。ゲル
電気泳動とオ−トラジオグラフィに続いて40Kバンドが
糖尿病患者の血清からの免疫沈殿物で観測されるが対照
では観測されない。チロシンで処理した単離された64K
蛋白質も40K蛋白を示すことを既に我々は示しているの
で、トリプシン処理島から直接免疫沈殿されたこの40K
のバンドは同じ蛋白質を表している可能性が非常に強
い。40K蛋白質に対する検定は、64KAのより簡単な検出
のための改良であるばかりではなく、イモビロン（immo
bilon）膜を使用するガス相配列分析によりずっとなじ
みやすい生成物を生じる。この改良の理由は40K断片は
アプライドバイオシステムズのガス相セクエンサ−を使
用するイノビロン(IMMOBILON)TM に結合した64K蛋白の
Ｎ末端アミノ酸配列の我々の決定において困難性を生じ
た主要な疎水領域がない可能性が非常に強いからであ
る。強疎水性領域を有する蛋白質がガス相セクエンサ−
において使用される溶媒で可溶化されること、従ってこ
の蛋白質を直接配列決定する技術的に主要なハ−ドルと
なっていることが確立されている。また64,000Ｍr範囲
におけるよりも、40,000Ｍr範囲ではより低いバックグ
ラウンド染色であるため、SDS pageゲルの銀染色におい
ては64K蛋白質よりも、40K蛋白質を見ることができるよ
うにするのがずっと容易である。
【００６４】無傷の64K蛋白質、又は40Kのチロシン開裂
断片の何れかのガス相アミノ酸配列決定は、NH2−末端
封鎖を明らかにした。この情報は40K断片の可溶性とと
もに、40K蛋白質がそのCOOH末端近くでβ細胞原形質膜
中にとりつけられていることを示唆している。特定して
いうと、我々は３〜４個の一連の高度に荷電したアミノ
酸に続いて、疎水性アミノ酸のストリングがCOOH末端の
最も近くの230個のアミノ酸中に存在することを予言す
るであろう。
断片の何れかのガス相アミノ酸配列決定は、NH2−末端
封鎖を明らかにした。この情報は40K断片の可溶性とと
もに、40K蛋白質がそのCOOH末端近くでβ細胞原形質膜
中にとりつけられていることを示唆している。特定して
いうと、我々は３〜４個の一連の高度に荷電したアミノ
酸に続いて、疎水性アミノ酸のストリングがCOOH末端の
最も近くの230個のアミノ酸中に存在することを予言す
るであろう。
【００６５】実施例７−６４Ｋ蛋白質のホスホリル化
多くの鍵となる制御蛋白質が細胞中にホスホリル化され
た、又は脱ホスホリル化された形態で存在し、それらの
ホスホリル化の定常状態水準が相互変換プロセスを触媒
するプロテインキナ−ゼとプロテインホスファタ−ゼの
相対活性に反映している。ホスホリル化は生化学的及び
生物的な性質を変えるこれらの蛋白質中における小さな
立体配置の変化をトリガ−する。ホルモン及び他の細胞
外シグナルがこのメカニズムを経由して情報を伝達す
る。
た、又は脱ホスホリル化された形態で存在し、それらの
ホスホリル化の定常状態水準が相互変換プロセスを触媒
するプロテインキナ−ゼとプロテインホスファタ−ゼの
相対活性に反映している。ホスホリル化は生化学的及び
生物的な性質を変えるこれらの蛋白質中における小さな
立体配置の変化をトリガ−する。ホルモン及び他の細胞
外シグナルがこのメカニズムを経由して情報を伝達す
る。
【００６６】人の島内のホスホリル化の役割の全容はい
まだ同定されていないが、IDDで生じる自己免疫破壊に
おいて多くが役割を有している全てのホスホリル化蛋白
質を同定する方法として血清及び島細胞蛋白質を使用す
るインビトロ（試験管内）キナ−ゼ検定を適用した。
まだ同定されていないが、IDDで生じる自己免疫破壊に
おいて多くが役割を有している全てのホスホリル化蛋白
質を同定する方法として血清及び島細胞蛋白質を使用す
るインビトロ（試験管内）キナ−ゼ検定を適用した。
【００６７】２群の人（個人）をインビトロホスホリル
化検定試験の為に選んだ。確立されたナショナル糖尿病
デ−タグル−プ（NDDG）基準に従って診断され（ナショ
ナル糖尿病デ−タグル−プ Diabetes. 1979; 28:1039-5
7)、ユニバ−シティ−オブフロリダ糖尿病クリニックス
で参照された７人の新たに開始したIDD患者がいた。我
々はまた、自己免疫病のどんな知られた家族歴も有さな
い８人の非糖尿病対照者を試験した。死体の膵臓から単
離した人の膵臓の島は91.2±2.3％純度であり、そして
島当り0.4±0.1mUのインシュリン含量を有していた。正
常な人血清のみの使用を含めた48時間のインビトロ培養
に続いて島細胞を以下の様に免疫沈殿させた。免疫複合
体をIDDを有する患者又は対照者のいずれかからの血清
で調製したが血清を島細胞洗剤抽出物とともに培養し、
続いてガンマ−32P-ATPとともに培養し、そしてインビ
トロでホスホリル化した生成物をSDS-PAGEゲル上で分析
した。島細胞（1,000／試験血清）を50mMトリス緩衝液
（２％ トリトン Ｘ−114，アプロチニン、PMSF，NaF）
中で溶解した（３時間、４℃）。洗剤溶解物を正常な人
の血清（100μｌ／1,000島）とともに培養し、続いて過
剰のプロテインＡセファロ−ス CL-4Bに対し吸着させら
れた（ファルマシア）。未結合（プレクリア−ド）溶解
物を含有するアリコ−トをIDD又は対照者血清のいずれ
かとともに培養した（25μl，18時間，４℃）。免疫グ
ロブリンのプロテインＡセファロ−スCL-4Bとの培養
（２時間、４℃）に続いて、複合体を次に0.1％SDS, 1.
0％ トリトンＸ−114，及び２mM EDTAを有している50mM
トリス-HCl（pH7.4）で３回、そして50mM トリス−HCl
（pH7.4）で２回洗浄した。キナ−ゼ反応は10mM MnC
l2、10mM MgCl2、１％ トリトン Ｘ−114及び20μCiの
アデノシン（ガンマ−32Ｐ）５'トリホスフェ−ト（ア
メルシャム、＞5,000 Ci/mモル）を含有している50mM H
EPES緩衝液（pH7.4）10μlを加えることによって開始し
た。沈殿物を懸濁し、そして30゜で10分間培養した。反
応を電気泳動試料緩衝液の添加によって停止させ、そし
て95℃で４分間加熱した。32Ｐ標識生成物を不連続SDS
15％ ポリアクリルアミド分離ゲルによって分離し、続
いて増強（インテンシファイイング）スクリ−ン（コダ
ック、Ｘ−omat AR５）で６〜72時間オ−トラジオグラ
フィ−を行なった。IDD患者の血清は特異的にMr64,000
蛋白質を免疫沈殿させ、これは対照血清では観測されな
かった。
化検定試験の為に選んだ。確立されたナショナル糖尿病
デ−タグル−プ（NDDG）基準に従って診断され（ナショ
ナル糖尿病デ−タグル−プ Diabetes. 1979; 28:1039-5
7)、ユニバ−シティ−オブフロリダ糖尿病クリニックス
で参照された７人の新たに開始したIDD患者がいた。我
々はまた、自己免疫病のどんな知られた家族歴も有さな
い８人の非糖尿病対照者を試験した。死体の膵臓から単
離した人の膵臓の島は91.2±2.3％純度であり、そして
島当り0.4±0.1mUのインシュリン含量を有していた。正
常な人血清のみの使用を含めた48時間のインビトロ培養
に続いて島細胞を以下の様に免疫沈殿させた。免疫複合
体をIDDを有する患者又は対照者のいずれかからの血清
で調製したが血清を島細胞洗剤抽出物とともに培養し、
続いてガンマ−32P-ATPとともに培養し、そしてインビ
トロでホスホリル化した生成物をSDS-PAGEゲル上で分析
した。島細胞（1,000／試験血清）を50mMトリス緩衝液
（２％ トリトン Ｘ−114，アプロチニン、PMSF，NaF）
中で溶解した（３時間、４℃）。洗剤溶解物を正常な人
の血清（100μｌ／1,000島）とともに培養し、続いて過
剰のプロテインＡセファロ−ス CL-4Bに対し吸着させら
れた（ファルマシア）。未結合（プレクリア−ド）溶解
物を含有するアリコ−トをIDD又は対照者血清のいずれ
かとともに培養した（25μl，18時間，４℃）。免疫グ
ロブリンのプロテインＡセファロ−スCL-4Bとの培養
（２時間、４℃）に続いて、複合体を次に0.1％SDS, 1.
0％ トリトンＸ−114，及び２mM EDTAを有している50mM
トリス-HCl（pH7.4）で３回、そして50mM トリス−HCl
（pH7.4）で２回洗浄した。キナ−ゼ反応は10mM MnC
l2、10mM MgCl2、１％ トリトン Ｘ−114及び20μCiの
アデノシン（ガンマ−32Ｐ）５'トリホスフェ−ト（ア
メルシャム、＞5,000 Ci/mモル）を含有している50mM H
EPES緩衝液（pH7.4）10μlを加えることによって開始し
た。沈殿物を懸濁し、そして30゜で10分間培養した。反
応を電気泳動試料緩衝液の添加によって停止させ、そし
て95℃で４分間加熱した。32Ｐ標識生成物を不連続SDS
15％ ポリアクリルアミド分離ゲルによって分離し、続
いて増強（インテンシファイイング）スクリ−ン（コダ
ック、Ｘ−omat AR５）で６〜72時間オ−トラジオグラ
フィ−を行なった。IDD患者の血清は特異的にMr64,000
蛋白質を免疫沈殿させ、これは対照血清では観測されな
かった。
【００６８】最後にインビトロのキナ−ゼ反応によって
検出されたMr64,000蛋白質の同定が代謝的に標識された
島細胞の免疫沈殿で観測されたものと同じであるかどう
かを分析するために、トリプチックペプチドマッピング
実験を実施した。IDD血清で免疫沈殿された35Ｓメチオ
ニン標識島細胞Mr64,000蛋白質の処理はインビトロホス
ソリル化Mr64,000蛋白質のもと類似のトリプチックペプ
チドマッピングを示した。
検出されたMr64,000蛋白質の同定が代謝的に標識された
島細胞の免疫沈殿で観測されたものと同じであるかどう
かを分析するために、トリプチックペプチドマッピング
実験を実施した。IDD血清で免疫沈殿された35Ｓメチオ
ニン標識島細胞Mr64,000蛋白質の処理はインビトロホス
ソリル化Mr64,000蛋白質のもと類似のトリプチックペプ
チドマッピングを示した。
【００６９】特定していうと、64,000Mr及び125,000Mr
蛋白質をSDS-PAGEゲルから切取り、そして蛋白質を１mg
／mlのトリプシン（３〜30分、４℃）で処理した。生じ
る蛋白質をSDS-PAGEゲル上で再度走らせた。125,000Mr
蛋白質はこの処理では影響されなかった。しかし、64,0
00Mr蛋白質は易動性を40,000Mr範囲に増加した。従って
この64,000 32Ｐ標識島細胞蛋白質はトリプシンで処理
したときにMr64,000 35Ｓメチオニン標識島細胞蛋白質
で我々が観測したのと同じMr（40,000）を示した。
蛋白質をSDS-PAGEゲルから切取り、そして蛋白質を１mg
／mlのトリプシン（３〜30分、４℃）で処理した。生じ
る蛋白質をSDS-PAGEゲル上で再度走らせた。125,000Mr
蛋白質はこの処理では影響されなかった。しかし、64,0
00Mr蛋白質は易動性を40,000Mr範囲に増加した。従って
この64,000 32Ｐ標識島細胞蛋白質はトリプシンで処理
したときにMr64,000 35Ｓメチオニン標識島細胞蛋白質
で我々が観測したのと同じMr（40,000）を示した。
【００７０】実施例８ ６４Ｋ自己抗原の別の生化学的
な同定 64Ｋ自己抗原がグルタミン酸デカルボキシラ−ゼ（GA
D）と相同性を示すことそして抗−GAD抗体に対し、免疫
反応性であることを我々は確立した。GAD酵素は脳、そ
して膵臓のβ細胞に局在している。文献におけるGADの
生化学的な特徴付けは哺乳類の脳における主要な抑制的
なニュ−ロトランスミッタ−（神経伝達物質）であるガ
ンマ−アミノ酪酸（GABA）の形成における役割に限られ
ていた。コバヤシ等によって公開されているこのGAD配
列もの（コバヤシ Ｙ., D.L. カウフマン及びA.J. トビ
ン[1987]「グルタミン酸デカルボキシラ−ゼ ｃＤＮ
Ａ：酵素的に活性な融合蛋白質をコ−ド化しているヌク
レオチド配列」J.Neuroscience 7(9):2768-2772）が表
６に本明細書に再現されている。
な同定 64Ｋ自己抗原がグルタミン酸デカルボキシラ−ゼ（GA
D）と相同性を示すことそして抗−GAD抗体に対し、免疫
反応性であることを我々は確立した。GAD酵素は脳、そ
して膵臓のβ細胞に局在している。文献におけるGADの
生化学的な特徴付けは哺乳類の脳における主要な抑制的
なニュ−ロトランスミッタ−（神経伝達物質）であるガ
ンマ−アミノ酪酸（GABA）の形成における役割に限られ
ていた。コバヤシ等によって公開されているこのGAD配
列もの（コバヤシ Ｙ., D.L. カウフマン及びA.J. トビ
ン[1987]「グルタミン酸デカルボキシラ−ゼ ｃＤＮ
Ａ：酵素的に活性な融合蛋白質をコ−ド化しているヌク
レオチド配列」J.Neuroscience 7(9):2768-2772）が表
６に本明細書に再現されている。
【００７１】GADと64K蛋白質の間の抗原的な交差反応性
が確認された。64K蛋白質に対する自己抗体及びGADに対
し向けられているモノクロ−ナル抗体を使用する一連の
免疫沈殿は、64K蛋白質に対する結合の競争を確認し
た。GAD蛋白質と反応するモノクロ−ナル抗体は例えば
アメリカンタイプカルチャ−コレクション（ATCC）アメ
リカ合衆国 20852 ミッドランド州ロックビル パ−クロ
−ンドライブ 12301 から当業者に容易に入手できる。
モノクロ−ナル抗血清GAD-１（ATCC HB184）がGADに対
する結合に特異的である。
が確認された。64K蛋白質に対する自己抗体及びGADに対
し向けられているモノクロ−ナル抗体を使用する一連の
免疫沈殿は、64K蛋白質に対する結合の競争を確認し
た。GAD蛋白質と反応するモノクロ−ナル抗体は例えば
アメリカンタイプカルチャ−コレクション（ATCC）アメ
リカ合衆国 20852 ミッドランド州ロックビル パ−クロ
−ンドライブ 12301 から当業者に容易に入手できる。
モノクロ−ナル抗血清GAD-１（ATCC HB184）がGADに対
する結合に特異的である。
【００７２】これらの研究の為に人の島細胞を35Ｓメチ
オニンで代謝的に標識し、そして前記の様に洗剤相は分
離した。次に島細胞抽出物を同じ容量の２つの試料に分
割した。各試料をいずれかの対照（64K自己抗体のない
もの）又はIDD（64K自己抗体含有物）血清のいずれかで
２度プレクリヤ−した。このIDD血清でのプレクリヤ−
段階は、島細胞蛋白質調製物からの64K蛋白質の量を除
去するか又は著しく減少させる一方、対照血清でのプレ
クリヤ−は64K蛋白質の量にいちじるしく影響しない。
両方のプレクリヤ−した試料（対照及びIDD）をGADに対
するモノクロ−ナル抗体で個々に免疫沈殿させた。結果
は対照（64K自己抗体陰性）の血清でプレクリヤ−する
ことは島細胞の64K蛋白質を免疫沈殿するモノクロ−ナ
ル抗−GAD抗体の能力に影響を与えなかった。しかしプ
レクリア−剤として64K自己抗体含有のIDD血清は島細胞
の64K蛋白質を免疫沈殿させるモノクロ−ナル抗GAD抗体
の能力を著しく減少した。このことは64K自己抗原とGAD
の間の抗原的な交差反応性を実証している。
オニンで代謝的に標識し、そして前記の様に洗剤相は分
離した。次に島細胞抽出物を同じ容量の２つの試料に分
割した。各試料をいずれかの対照（64K自己抗体のない
もの）又はIDD（64K自己抗体含有物）血清のいずれかで
２度プレクリヤ−した。このIDD血清でのプレクリヤ−
段階は、島細胞蛋白質調製物からの64K蛋白質の量を除
去するか又は著しく減少させる一方、対照血清でのプレ
クリヤ−は64K蛋白質の量にいちじるしく影響しない。
両方のプレクリヤ−した試料（対照及びIDD）をGADに対
するモノクロ−ナル抗体で個々に免疫沈殿させた。結果
は対照（64K自己抗体陰性）の血清でプレクリヤ−する
ことは島細胞の64K蛋白質を免疫沈殿するモノクロ−ナ
ル抗−GAD抗体の能力に影響を与えなかった。しかしプ
レクリア−剤として64K自己抗体含有のIDD血清は島細胞
の64K蛋白質を免疫沈殿させるモノクロ−ナル抗GAD抗体
の能力を著しく減少した。このことは64K自己抗原とGAD
の間の抗原的な交差反応性を実証している。
【００７３】15人の新たな開始したIDD患者、及びIDD開
始２〜３年後に得られたサンプルの個人からの血清、５
〜10年間の持続期間のIDDを有する10人の個人、20人の
対照個人及びIDDの高い危険性がある５人の個人を含め
た65人の個人からの血清を抗GAD活性について試験し
た。GADに対する自己抗体の形態の免疫は明らかにIDDと
関連していた。
始２〜３年後に得られたサンプルの個人からの血清、５
〜10年間の持続期間のIDDを有する10人の個人、20人の
対照個人及びIDDの高い危険性がある５人の個人を含め
た65人の個人からの血清を抗GAD活性について試験し
た。GADに対する自己抗体の形態の免疫は明らかにIDDと
関連していた。
【００７４】上の実施例６に記載するように、IDD血清
で島細胞を免疫沈殿させることは、ときには64K蛋白の
同定を生じるのみならず、幾人かは67,000Mrの蛋白質を
免疫沈殿させた。この観測は、洗剤相の調製物が水性
（主として細胞質ゾル）及び洗剤相（膜関連）蛋白の間
のはっきりした分離を生じない時に特に認められた。従
って64K蛋白質は２つの形態で島細胞内に見出すことが
出来る。即ち67,000Mr可溶性（細胞質ゾル）型並びに6
4,000Mr疎水性（膜）型である。IDD中の主要な自己抗原
は64,000Mr型のものであるが、67,000型に対する自己免
疫も存在する。
で島細胞を免疫沈殿させることは、ときには64K蛋白の
同定を生じるのみならず、幾人かは67,000Mrの蛋白質を
免疫沈殿させた。この観測は、洗剤相の調製物が水性
（主として細胞質ゾル）及び洗剤相（膜関連）蛋白の間
のはっきりした分離を生じない時に特に認められた。従
って64K蛋白質は２つの形態で島細胞内に見出すことが
出来る。即ち67,000Mr可溶性（細胞質ゾル）型並びに6
4,000Mr疎水性（膜）型である。IDD中の主要な自己抗原
は64,000Mr型のものであるが、67,000型に対する自己免
疫も存在する。
【００７５】35S-標識化人島細胞から単離された64K自
己抗原のガス相アミノ酸配列決定は、表６に示される64
K蛋白質及びGAD配列の間に相同性を示している。この相
同性は以下のようにして発見された。
己抗原のガス相アミノ酸配列決定は、表６に示される64
K蛋白質及びGAD配列の間に相同性を示している。この相
同性は以下のようにして発見された。
【００７６】64K自己抗原を前記の様に35S-標識人島細
胞から単離した。SDS-PAGEの後、ゲルからの蛋白質をイ
モビロン(IMOBILON)-PTM膜に移し、オ−トラジオグラフ
ィ−で見ることが出来るようにした。64Kバンドを局在
化し、切取り、そしてメチオニン残基でペプチド鎖を開
裂するシアノゲンブロマイドで処理した。生じるペプチ
ド断片をPBDF膜から溶出し、そしてSDS-PAGE上で再度走
らせたのち、イモビロン(IMOBILON)-PTMに移した。バン
ドをオ−トラジオグラフィ−で見ることが出来るように
し、そしてMr33,000における断片を切り取り、そしてガ
ス相ペプチド配列決定にかけた。例えば次の配列プロフ
ィ−ルが得られた。 MET-ILE-PRO-GLU-VAL-LYS
胞から単離した。SDS-PAGEの後、ゲルからの蛋白質をイ
モビロン(IMOBILON)-PTM膜に移し、オ−トラジオグラフ
ィ−で見ることが出来るようにした。64Kバンドを局在
化し、切取り、そしてメチオニン残基でペプチド鎖を開
裂するシアノゲンブロマイドで処理した。生じるペプチ
ド断片をPBDF膜から溶出し、そしてSDS-PAGE上で再度走
らせたのち、イモビロン(IMOBILON)-PTMに移した。バン
ドをオ−トラジオグラフィ−で見ることが出来るように
し、そしてMr33,000における断片を切り取り、そしてガ
ス相ペプチド配列決定にかけた。例えば次の配列プロフ
ィ−ルが得られた。 MET-ILE-PRO-GLU-VAL-LYS
【００７７】我々は64Kアミノ酸配列とGADの間に２つの
水準で高度の類似性を見つけだした。第１に前に述べた
ように、我々の64K蛋白質をシアノゲンブロマイドで処
理すると、33,000Mrのペプチド断片を生じる。人はこの
断片がおよそ300コドン（900ヌクレオチド）からなるこ
とを予測するであろう。表６に示されたGAD配列を調べ
ると、全蛋白質中に625のコドン、そして1875のヌクレ
オチドのオ−プンリ−ディングフレ−ムが示される。そ
の配列のヌクレオチド位置 916〜933は次のアミノ酸に
対しコ−ドしている。 PHE-PHE-PRO-GLU-VAL-LYS
水準で高度の類似性を見つけだした。第１に前に述べた
ように、我々の64K蛋白質をシアノゲンブロマイドで処
理すると、33,000Mrのペプチド断片を生じる。人はこの
断片がおよそ300コドン（900ヌクレオチド）からなるこ
とを予測するであろう。表６に示されたGAD配列を調べ
ると、全蛋白質中に625のコドン、そして1875のヌクレ
オチドのオ−プンリ−ディングフレ−ムが示される。そ
の配列のヌクレオチド位置 916〜933は次のアミノ酸に
対しコ−ドしている。 PHE-PHE-PRO-GLU-VAL-LYS
【００７８】従って64Kペプチド配列は、アミノ酸配列
においてGAD配列と高い類似性を示す。さらにこのGADペ
プチド配列は、PHEないしMETアミノ酸置換がその部分で
なされたならば、シアノゲンブロマイドで開裂すると、
33,000Mrペプチドを観測することが期待される蛋白質の
領域に位置している。第２にヌクレオチドは解明された
アミノ酸配列（MET-PHE-PRO-GLU-VAL-LYS）の間に違い
を有し、そしてヌクレオチド配列916〜933は単にわずか
なヌクレオチド置換を伴うに過ぎない。事実フェニルア
ラニンでなくてメチオニンがこの蛋白質の64K配列の第
１の位置にあるようであり、なぜならばこのペプチド
は、メチオニンに対し特異性を示すシアノゲンブロマイ
ドで開裂されるからである。従って我々は、我々のDNA
ライブラリ−からの人の膵臓細胞64K蛋白質に対してコ
−ドしている遺伝子を同定する為のプロ−ブを構築する
為に、上記の配列情報を使用した。
においてGAD配列と高い類似性を示す。さらにこのGADペ
プチド配列は、PHEないしMETアミノ酸置換がその部分で
なされたならば、シアノゲンブロマイドで開裂すると、
33,000Mrペプチドを観測することが期待される蛋白質の
領域に位置している。第２にヌクレオチドは解明された
アミノ酸配列（MET-PHE-PRO-GLU-VAL-LYS）の間に違い
を有し、そしてヌクレオチド配列916〜933は単にわずか
なヌクレオチド置換を伴うに過ぎない。事実フェニルア
ラニンでなくてメチオニンがこの蛋白質の64K配列の第
１の位置にあるようであり、なぜならばこのペプチド
は、メチオニンに対し特異性を示すシアノゲンブロマイ
ドで開裂されるからである。従って我々は、我々のDNA
ライブラリ−からの人の膵臓細胞64K蛋白質に対してコ
−ドしている遺伝子を同定する為のプロ−ブを構築する
為に、上記の配列情報を使用した。
【００７９】次の配列の混合オリゴヌクレオチドが合成
された。 この合成オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナ−ゼとガンマ−32P-ATPを使用して放射性標識がさ
れ、そして人島cDNAライブラリ−のプロ−ブとして使用
された。およそ120,000のクロ−ンがスクリ−ニングさ
れ、そして３つの陽性のプラ−クが検出された。このよ
うにして64K蛋白質に対しコ−ドしているDNAが同定さ
れ、単離された。
された。 この合成オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナ−ゼとガンマ−32P-ATPを使用して放射性標識がさ
れ、そして人島cDNAライブラリ−のプロ−ブとして使用
された。およそ120,000のクロ−ンがスクリ−ニングさ
れ、そして３つの陽性のプラ−クが検出された。このよ
うにして64K蛋白質に対しコ−ドしているDNAが同定さ
れ、単離された。
【００８０】64K蛋白質に対しコ−ドしているDNAは、多
量の組替え蛋白質を製造する為の適当な原核表現ベクタ
−中に導入することができる。この生成物は糖尿病前の
患者における抗64K抗体の水準の決定のため、又は糖尿
病前の個人を診断するため、検定法（例えばELISA，RIA
など）の開発の為に使用することができる。適当な真核
表現ベクタ−もネイティブな64Kの真核細胞中での製造
の為に用いることができる。これは細菌が64K前駆体を
適正に処理することができないので、自己抗体で認識さ
れるという可能性を克服している。
量の組替え蛋白質を製造する為の適当な原核表現ベクタ
−中に導入することができる。この生成物は糖尿病前の
患者における抗64K抗体の水準の決定のため、又は糖尿
病前の個人を診断するため、検定法（例えばELISA，RIA
など）の開発の為に使用することができる。適当な真核
表現ベクタ−もネイティブな64Kの真核細胞中での製造
の為に用いることができる。これは細菌が64K前駆体を
適正に処理することができないので、自己抗体で認識さ
れるという可能性を克服している。
【００８１】免疫系のエフェクタ−によって認識される
蛋白質に最近、かなりの興味が集中してきた（ベンジャ
ミン D.、 J. ベンゾフスキ−、I. イ−スト、F. ガ−
ド、C.ハンナム、S. リ−チ[1984]「Ｔ細胞によって認
識される蛋白質抗原構造：蛋白質の抗原構造；再評価」
Ann. Rev. Immunol. 2:67-101）。Ｔ及びβ細胞エピト
−プを予測しているアルゴリズムに基づいて、多量の知
識がＴ細胞と抗体の結合エピト−プについて入手できる
（デ リシ、S. 及びJ. A. ベルゾフスキ−[1985]「Ｔ
細胞抗原場所は、両親媒性の構造の傾向がある」 Proc.
Natl. Acad. Sci.82:7048-7052; Hopp, T. P. 及び K.
R. ウッズ[1981]「アミノ酸配列からの蛋白質抗原性デ
タ−ミナントの予測」Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824
-3828）。さらにチトクロ−ムＣ等のモデル蛋白質抗原
に対する実験的な研究がＴ及びＢ細胞場所の厳密な局在
化を可能とし、そして認識に重要な臨界的なアミノ酸残
基の特性化を可能とした（ミリチ、D. R. [1989]「合成
Ｔ及びＢ細胞認識位置；ワクチン開発の為の示唆」ディ
クソン、F. J. 編、Advances in Immunology.45巻 アカ
デミックプレス、ロンドン1989；195-282）。しかし、
人の臓器に特異的な自己免疫病において、自己抗原の性
質とその入手可能性についての知識の不足はエピト−プ
の研究を制限している（マッケイ、I. R. 及びM. E. ゲ
ルシュウィン[1989]「原発性の担嚢の硬変中でのミトコ
ンドリア自己反応性の分子的基礎」Immunol. Today 10:
315-318）。臓器特異的な自己免疫病において、Ｔ細胞
と自己抗体によって認識される自己抗原領域の性質の決
定は、組織損傷病を駆遂するために拮抗剤及び免疫調整
化合物の設計を可能とする。
蛋白質に最近、かなりの興味が集中してきた（ベンジャ
ミン D.、 J. ベンゾフスキ−、I. イ−スト、F. ガ−
ド、C.ハンナム、S. リ−チ[1984]「Ｔ細胞によって認
識される蛋白質抗原構造：蛋白質の抗原構造；再評価」
Ann. Rev. Immunol. 2:67-101）。Ｔ及びβ細胞エピト
−プを予測しているアルゴリズムに基づいて、多量の知
識がＴ細胞と抗体の結合エピト−プについて入手できる
（デ リシ、S. 及びJ. A. ベルゾフスキ−[1985]「Ｔ
細胞抗原場所は、両親媒性の構造の傾向がある」 Proc.
Natl. Acad. Sci.82:7048-7052; Hopp, T. P. 及び K.
R. ウッズ[1981]「アミノ酸配列からの蛋白質抗原性デ
タ−ミナントの予測」Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824
-3828）。さらにチトクロ−ムＣ等のモデル蛋白質抗原
に対する実験的な研究がＴ及びＢ細胞場所の厳密な局在
化を可能とし、そして認識に重要な臨界的なアミノ酸残
基の特性化を可能とした（ミリチ、D. R. [1989]「合成
Ｔ及びＢ細胞認識位置；ワクチン開発の為の示唆」ディ
クソン、F. J. 編、Advances in Immunology.45巻 アカ
デミックプレス、ロンドン1989；195-282）。しかし、
人の臓器に特異的な自己免疫病において、自己抗原の性
質とその入手可能性についての知識の不足はエピト−プ
の研究を制限している（マッケイ、I. R. 及びM. E. ゲ
ルシュウィン[1989]「原発性の担嚢の硬変中でのミトコ
ンドリア自己反応性の分子的基礎」Immunol. Today 10:
315-318）。臓器特異的な自己免疫病において、Ｔ細胞
と自己抗体によって認識される自己抗原領域の性質の決
定は、組織損傷病を駆遂するために拮抗剤及び免疫調整
化合物の設計を可能とする。
【００８２】本発明の一つの面は、64K蛋白質のエピト
−プからなる免疫反応性ペプチドの同定である。これら
の研究について、大腸菌中の組替え蛋白質として64K抗
原の選択されたセグメントを表現するためにGADのクロ
−ン化されたcDNA鋳型をDNA増幅技術と連係させて使用
することができる。平均すると80個のアミノ酸残基の、
複数のオ−バ−ラップした異なる組替え断片、及び分子
の全体の細胞外領域を包含している、より大きな断片を
製造することができ、そして自己抗体結合位置が、放射
性同位元素で標識された前駆体の存在下で成育する表現
された細菌の生成物の免疫沈殿によって分析される。こ
れらの手順を使用することは、GAD分子の正確な抗原ア
ミノ酸配列のエピト−プマッピングを可能にする。64K
蛋白の抗原エピト−プからなる合成ペプチドは、本明細
書に記載するように診断的、及び治療的な目的のための
両方に使用できる。
−プからなる免疫反応性ペプチドの同定である。これら
の研究について、大腸菌中の組替え蛋白質として64K抗
原の選択されたセグメントを表現するためにGADのクロ
−ン化されたcDNA鋳型をDNA増幅技術と連係させて使用
することができる。平均すると80個のアミノ酸残基の、
複数のオ−バ−ラップした異なる組替え断片、及び分子
の全体の細胞外領域を包含している、より大きな断片を
製造することができ、そして自己抗体結合位置が、放射
性同位元素で標識された前駆体の存在下で成育する表現
された細菌の生成物の免疫沈殿によって分析される。こ
れらの手順を使用することは、GAD分子の正確な抗原ア
ミノ酸配列のエピト−プマッピングを可能にする。64K
蛋白の抗原エピト−プからなる合成ペプチドは、本明細
書に記載するように診断的、及び治療的な目的のための
両方に使用できる。
【００８３】本発明の一つのそのようなペプチドは、上
に記載したPRO-GLU-VAL-LYS配列からなっている。従っ
て診断又は治療目的の為にここに記載されるように使用
できる一つのペプチドは、PRO-GLU-VAL-LYS配列を含ん
でいる約８〜約30のアミノ酸を含みうる。最も有利には
そのようなペプチドは約10〜約20のアミノ酸でありう
る。ペプチドは、GAD蛋白質の一つの配列又は64K島細胞
蛋質白自身を有しうる。正確なアミノ酸配列が異なりう
るGADのいくつかの形態が存在することが良く知られて
いる。ラット、豚、牛、猫及び人からのGADの単離は全
て報告されている。例えばクラム,D. S.、L. D. バ−ネ
ット、J. L. ジョセフ、L. C. ハリソン(1991)「脳及び
膵臓の島からの人のグルタミン酸デカルボキシラ−ゼcD
NAのクロ−ニングと部分的なヌクレオチド配列」Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 176(3):1239-1244; スピンク
D. C.、T. G. ポ−タ−、S. ウ、D. L. マ−チン(1987)
「ラット脳中の反応速度論的に異なる複数型のグルタメ
−トデカルボキシラ−ゼ Brain Res. 421:235-244; デ
ンナ− L. A.、S. C. ウェイ、H. S. リン、C. T. リ
ン、J. Y. ウ（1987)「脳Ｌグルタメ−トデカルボキシ
ラ−ゼ、精製とサブユニット構造」Proc. Natl. Acad,
Sci. USA84:668-672; チャン Y. C.、D. I. ゴットリ−
ブ（1988）「グルタミン酸デカルボキシラ−ゼに対する
モノクロ−ナル抗体で精製された蛋白質の特性決定」J.
Neurosci. 88:2123-2130; スピンク D. C.、T. G. ポ
−タ−、S. J. ウ、D. L. マ−チン(1985)「豚の脳から
のグルタメ−トデカルボキシラ−ゼの３つの反応速度論
的に区別される形態の特性決定」Biochem. J. 231:695-
703; ブリンダ−マン J. M.、M. マイットレ、L. オソ
ラ、P. マンデル(1978)「人の脳からのＬ−グルタメ−
トデカルボキシラ−ゼの精製と幾つかの性質」Eur. J.
Biochem. 86:143-152; 及びファンW. M.、L. リ−ドホ
−クウェト、E. ウ、J. Y. ウ(1990)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:8491-8495。これらのGAD配列の各々は、6
4K自己抗体と免疫反応性であるエピト−プを含みうる。
従って本発明に従ってこれらの種々の形態のGADからの
ペプチド類は、治療的又は診断的な目的に使用できる、
またこれらの種々のGAD配列は臨界的な免疫反応性を維
持しながら64K配列において造られることができるアミ
ノ酸置換の種類についての情報を提供するのに使用する
ことができる。本発明の合成ペプチドは、以下の様に表
わすことができる。 A-Pro-Glu-Val-Lys-B
に記載したPRO-GLU-VAL-LYS配列からなっている。従っ
て診断又は治療目的の為にここに記載されるように使用
できる一つのペプチドは、PRO-GLU-VAL-LYS配列を含ん
でいる約８〜約30のアミノ酸を含みうる。最も有利には
そのようなペプチドは約10〜約20のアミノ酸でありう
る。ペプチドは、GAD蛋白質の一つの配列又は64K島細胞
蛋質白自身を有しうる。正確なアミノ酸配列が異なりう
るGADのいくつかの形態が存在することが良く知られて
いる。ラット、豚、牛、猫及び人からのGADの単離は全
て報告されている。例えばクラム,D. S.、L. D. バ−ネ
ット、J. L. ジョセフ、L. C. ハリソン(1991)「脳及び
膵臓の島からの人のグルタミン酸デカルボキシラ−ゼcD
NAのクロ−ニングと部分的なヌクレオチド配列」Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 176(3):1239-1244; スピンク
D. C.、T. G. ポ−タ−、S. ウ、D. L. マ−チン(1987)
「ラット脳中の反応速度論的に異なる複数型のグルタメ
−トデカルボキシラ−ゼ Brain Res. 421:235-244; デ
ンナ− L. A.、S. C. ウェイ、H. S. リン、C. T. リ
ン、J. Y. ウ（1987)「脳Ｌグルタメ−トデカルボキシ
ラ−ゼ、精製とサブユニット構造」Proc. Natl. Acad,
Sci. USA84:668-672; チャン Y. C.、D. I. ゴットリ−
ブ（1988）「グルタミン酸デカルボキシラ−ゼに対する
モノクロ−ナル抗体で精製された蛋白質の特性決定」J.
Neurosci. 88:2123-2130; スピンク D. C.、T. G. ポ
−タ−、S. J. ウ、D. L. マ−チン(1985)「豚の脳から
のグルタメ−トデカルボキシラ−ゼの３つの反応速度論
的に区別される形態の特性決定」Biochem. J. 231:695-
703; ブリンダ−マン J. M.、M. マイットレ、L. オソ
ラ、P. マンデル(1978)「人の脳からのＬ−グルタメ−
トデカルボキシラ−ゼの精製と幾つかの性質」Eur. J.
Biochem. 86:143-152; 及びファンW. M.、L. リ−ドホ
−クウェト、E. ウ、J. Y. ウ(1990)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:8491-8495。これらのGAD配列の各々は、6
4K自己抗体と免疫反応性であるエピト−プを含みうる。
従って本発明に従ってこれらの種々の形態のGADからの
ペプチド類は、治療的又は診断的な目的に使用できる、
またこれらの種々のGAD配列は臨界的な免疫反応性を維
持しながら64K配列において造られることができるアミ
ノ酸置換の種類についての情報を提供するのに使用する
ことができる。本発明の合成ペプチドは、以下の様に表
わすことができる。 A-Pro-Glu-Val-Lys-B
【００８４】式中ＡとＢの両方は、両方とも長さが０〜
約20のアミノ酸の配列からなり、ここでＡ及びＢは合成
ペプチドが全体として64K自己抗体と免疫反応性である
か、又はＴ細胞又はβ細胞によって認識されるように、
64Kと十分な相同性を有している。この相同性は例え
ば、64K又はGAD蛋白質と約90％でありうる。本明細書に
記載した合成ペプチドは、典型的には約50未満のアミノ
酸であり、いかなることがあてもGAD又は64K蛋白質の完
全な長さ未満である
約20のアミノ酸の配列からなり、ここでＡ及びＢは合成
ペプチドが全体として64K自己抗体と免疫反応性である
か、又はＴ細胞又はβ細胞によって認識されるように、
64Kと十分な相同性を有している。この相同性は例え
ば、64K又はGAD蛋白質と約90％でありうる。本明細書に
記載した合成ペプチドは、典型的には約50未満のアミノ
酸であり、いかなることがあてもGAD又は64K蛋白質の完
全な長さ未満である
【００８５】我々がここに記載した64K蛋白質は、少な
くとも２つの形態で存在する。即ち約63〜65Kの大きさ
を有する形態又は複数の形態、及び約67Kの大きさを有
する形態。これらの形態は明らかに区別される。上に記
載したようにより小さな分子量の形態がダブレットとし
て観測された。上に記載したように64Kの複数形態の存
在は、糖尿病にかかる危険性のある人が何らかの形態の
64K抗原に対する抗体を有するかどうかを決定するの
に、64Kを診断目的のために有利なものとしている。種
々の形態の64Kが相同性を共有しているが、これらはま
た異なる免疫反応性を生じ得る非相同領域も有してい
る。従ってほとんどの十分な診断、又は治療計画は、64
Kに対する自己抗体の各形態と免疫反応性である配列か
らなる、複数のペプチド（又はハイブリッドペプチド）
の使用を含むであろう。本発明に従って、ペプチドを診
断又は治療用途のために作るに当って、当業者は種々の
形態のGAD又は64Kからの配列を使用することが出来る
か、又は種々のアミノ酸置換で修飾された配列も使用で
きる。本発明の範囲に入る為には、これらのペプチドは
64K蛋白質に対する抗体に対し免疫反応性である。
くとも２つの形態で存在する。即ち約63〜65Kの大きさ
を有する形態又は複数の形態、及び約67Kの大きさを有
する形態。これらの形態は明らかに区別される。上に記
載したようにより小さな分子量の形態がダブレットとし
て観測された。上に記載したように64Kの複数形態の存
在は、糖尿病にかかる危険性のある人が何らかの形態の
64K抗原に対する抗体を有するかどうかを決定するの
に、64Kを診断目的のために有利なものとしている。種
々の形態の64Kが相同性を共有しているが、これらはま
た異なる免疫反応性を生じ得る非相同領域も有してい
る。従ってほとんどの十分な診断、又は治療計画は、64
Kに対する自己抗体の各形態と免疫反応性である配列か
らなる、複数のペプチド（又はハイブリッドペプチド）
の使用を含むであろう。本発明に従って、ペプチドを診
断又は治療用途のために作るに当って、当業者は種々の
形態のGAD又は64Kからの配列を使用することが出来る
か、又は種々のアミノ酸置換で修飾された配列も使用で
きる。本発明の範囲に入る為には、これらのペプチドは
64K蛋白質に対する抗体に対し免疫反応性である。
【００８６】この出願で使用する類似体という用語は、
別の化合物と実質的に同じであるが、例えば追加のアミ
ノ酸又は側鎖を加えることによって修飾されている化合
物をさしている。本明細書で使用される突然変異体(mut
ants)及び変異体（variants）という用語は、別の配列
と実質的に同じであるが、アミノ酸配列においてある場
所でアミノ酸置換を有しているアミノ酸配列をさしてい
る。断片とは、より長いアミノ酸配列の部分をさしてい
る。
別の化合物と実質的に同じであるが、例えば追加のアミ
ノ酸又は側鎖を加えることによって修飾されている化合
物をさしている。本明細書で使用される突然変異体(mut
ants)及び変異体（variants）という用語は、別の配列
と実質的に同じであるが、アミノ酸配列においてある場
所でアミノ酸置換を有しているアミノ酸配列をさしてい
る。断片とは、より長いアミノ酸配列の部分をさしてい
る。
【００８７】本発明は特定のGAD及び64Kアミノ酸配列の
使用を包含している。本発明はさらにこれらの配列の類
似体及び突然変異体、並びに配列の断片及び断片の類似
体及び突然変異体をさらに包含している。これらの類似
体、突然変異体、及び断片は、類似体、断片又は突然変
異体が64Kに対する抗体と同じ免疫反応性を実質的に保
持しているかぎり、本発明の範囲内に包含される。例え
ば、コンサ−アバティブなアミノ酸置換を行なうこと
は、当業者の技術の範囲内である。例えばアミノ酸は次
のクラスに分類できる：塩基性、疎水性、酸性、極性、
及びアミド。一つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別の
アミノ酸で置き換えられる置換はその置換が実質的に化
合物の生物的な活性を変更しないかぎり、本発明の範囲
内に含まれる。次の表は各クラスに属するアミノ酸の例
をリストしている。
使用を包含している。本発明はさらにこれらの配列の類
似体及び突然変異体、並びに配列の断片及び断片の類似
体及び突然変異体をさらに包含している。これらの類似
体、突然変異体、及び断片は、類似体、断片又は突然変
異体が64Kに対する抗体と同じ免疫反応性を実質的に保
持しているかぎり、本発明の範囲内に包含される。例え
ば、コンサ−アバティブなアミノ酸置換を行なうこと
は、当業者の技術の範囲内である。例えばアミノ酸は次
のクラスに分類できる：塩基性、疎水性、酸性、極性、
及びアミド。一つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別の
アミノ酸で置き換えられる置換はその置換が実質的に化
合物の生物的な活性を変更しないかぎり、本発明の範囲
内に含まれる。次の表は各クラスに属するアミノ酸の例
をリストしている。
【００８８】
表 ５ アミノ酸のクラス
アミノ酸の例
非極性 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
極性 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
マイナスに荷電しているもの Asp, Glu
プラスに荷電しているもの Lys, Arg, His
【００８９】ある場合には非コンザバティブな置換も行
ないうる。種々の突然変異体の構築が合成遺伝子のカセ
ット突然変異誘発によって発生できる。この工程はどん
な当業者にも知られている。これらの置換が64Kに対す
る抗体との免疫学的な反応性を実質的に変更しないとい
う範囲内で、生じる化合物は、本発明の範囲内に含まれ
る。コンザバティブなアミノ酸置換は、本発明の主題の
範囲内である単に一つの修飾の種類の例に過ぎない。
ないうる。種々の突然変異体の構築が合成遺伝子のカセ
ット突然変異誘発によって発生できる。この工程はどん
な当業者にも知られている。これらの置換が64Kに対す
る抗体との免疫学的な反応性を実質的に変更しないとい
う範囲内で、生じる化合物は、本発明の範囲内に含まれ
る。コンザバティブなアミノ酸置換は、本発明の主題の
範囲内である単に一つの修飾の種類の例に過ぎない。
【００９０】こらの合成ペプチドは、上に記載した組替
え蛋白質で開発された類似の検定法で使用されるべき診
断試薬の開発に使用されるであろう。合成ペプチドはま
た、ワクチン開発一般のためのその目的と類似のIDDの
予防の為のワクチンを作るのに使用することもできる
（ミリチ[1989]、上記参照）。
え蛋白質で開発された類似の検定法で使用されるべき診
断試薬の開発に使用されるであろう。合成ペプチドはま
た、ワクチン開発一般のためのその目的と類似のIDDの
予防の為のワクチンを作るのに使用することもできる
（ミリチ[1989]、上記参照）。
【００９１】実施例９ インシュリン依存性糖尿病にお
けるグルタメ−トデカルボキシラ−ゼに対する抹消血液
Ｔリンパ球応答の同定 インシュリン依存性糖尿病（IDD）はインシュリンを生
産する膵臓のβ細胞の自己免疫破壊から生じるようであ
る。グルタメ−トデカルボキシラ−ゼ（GAD）と免疫反
応性である抗体が早期に出現し高い頻度であることは、
この蛋白質が糖尿病のなかにおいて、標的抗原でありう
ることを示唆している。しかしながら、この病気はＴリ
ンパ球に依存していると信じられているので、我々は新
たに診断されたIDDを有する子供、及びIDDを生じる高い
危険及び低い危険の人からの組替えGADに対する抹消血
液単核細胞応答を分析した。
けるグルタメ−トデカルボキシラ−ゼに対する抹消血液
Ｔリンパ球応答の同定 インシュリン依存性糖尿病（IDD）はインシュリンを生
産する膵臓のβ細胞の自己免疫破壊から生じるようであ
る。グルタメ−トデカルボキシラ−ゼ（GAD）と免疫反
応性である抗体が早期に出現し高い頻度であることは、
この蛋白質が糖尿病のなかにおいて、標的抗原でありう
ることを示唆している。しかしながら、この病気はＴリ
ンパ球に依存していると信じられているので、我々は新
たに診断されたIDDを有する子供、及びIDDを生じる高い
危険及び低い危険の人からの組替えGADに対する抹消血
液単核細胞応答を分析した。
【００９２】IDDの臨床的な開始における膵臓島細胞の
単核細胞浸潤（インシュリティス）は病気の病理学的な
品質証明である。この病巣は主としてT-リンパ球が提案
されており、IDDの病気の発生におけるピボット的な役
割を果たすと考えられているのはこれらの細胞である。
この考えを支持する証拠には、ICAの力価は上昇しない
が、すい臓の移植を受けた長期間の糖尿病患者内にイン
シュリティスが再発するという観測が含まれる。又、免
疫抑制剤はIDDを有する人の代謝の可能性を改良するの
に有効であることが示されている。IDDの自発的な動物
モデルにおいて（NODマウス）、糖尿病はCD4及びCD8Tリ
ンパ球の変換を通じて非糖尿病体質のマウスに導入でき
る。NODマウス中で病気は抗-CD4療法の使用を通じても
予防できる。しかしながら、この自己免疫現象に対し役
割を担っている標的抗原の性質は不明確なままである。
単核細胞浸潤（インシュリティス）は病気の病理学的な
品質証明である。この病巣は主としてT-リンパ球が提案
されており、IDDの病気の発生におけるピボット的な役
割を果たすと考えられているのはこれらの細胞である。
この考えを支持する証拠には、ICAの力価は上昇しない
が、すい臓の移植を受けた長期間の糖尿病患者内にイン
シュリティスが再発するという観測が含まれる。又、免
疫抑制剤はIDDを有する人の代謝の可能性を改良するの
に有効であることが示されている。IDDの自発的な動物
モデルにおいて（NODマウス）、糖尿病はCD4及びCD8Tリ
ンパ球の変換を通じて非糖尿病体質のマウスに導入でき
る。NODマウス中で病気は抗-CD4療法の使用を通じても
予防できる。しかしながら、この自己免疫現象に対し役
割を担っている標的抗原の性質は不明確なままである。
【００９３】我々はここでIDDの開始の時期において、
ならびに病気の危険が増大している母集団内で、T-リン
パ球の反応性が特徴的かどうかを試験した。
ならびに病気の危険が増大している母集団内で、T-リン
パ球の反応性が特徴的かどうかを試験した。
【００９４】組み替えGAD抗原をラットの脳GAD65のPET
表現から製造した。末梢血液単核細胞を『フィコ−ル-
ハイパク(Ficoll-Hypaque)』密度遠心によって単離した
(シグマ、ミズ−リ州、セントルイス）。1x106の単核細
胞を24個のウェルの組織培養トレ−中で10μg/mlの抗原
の存在下で7日間培養した。培養6日後に1.0μCi3Hチミ
ジン（デラウェア州、ウィルミントンのNEN）を各ウェ
ルに加えた。培養基を18時間後に半自動的に収穫し、チ
ミジン取込みを液体シンチレ−ション計数によって評価
した。細胞増殖は刺激インデックス(SI)から抗原の非存
在下（培地のみ）で取込まれたcpmによって抗原の存在
下で取込まれたcpmを割ったものを引いたものとして表
現した。3以上(≧3)のSIは統計的に陽性の応答と決定さ
れた。
表現から製造した。末梢血液単核細胞を『フィコ−ル-
ハイパク(Ficoll-Hypaque)』密度遠心によって単離した
(シグマ、ミズ−リ州、セントルイス）。1x106の単核細
胞を24個のウェルの組織培養トレ−中で10μg/mlの抗原
の存在下で7日間培養した。培養6日後に1.0μCi3Hチミ
ジン（デラウェア州、ウィルミントンのNEN）を各ウェ
ルに加えた。培養基を18時間後に半自動的に収穫し、チ
ミジン取込みを液体シンチレ−ション計数によって評価
した。細胞増殖は刺激インデックス(SI)から抗原の非存
在下（培地のみ）で取込まれたcpmによって抗原の存在
下で取込まれたcpmを割ったものを引いたものとして表
現した。3以上(≧3)のSIは統計的に陽性の応答と決定さ
れた。
【００９５】我々の試験はGADに対するT-リンパ球の反
応性がIDDの開始において起こり、そしてIDDの増加した
危険性を有する人において起きることを示した。GADに
対するこのT細胞の反応性は健康な人には存在しない。
これらの発見はGADがT-リンパ球の抗原エピト−プを含
んでいて、従ってIDDの病気の原因に関与し得るという
仮説を支持している。新たに開始したIDDの患者内でT-
リンパ球の応答の程度とICA力価、病気の開始における
年齢、性又はHLA型の間に相関関係はない。従って、こ
のGADに対するT-リンパ球の反応性は追加的な情報を与
えることに貢献し、病気を診断する別の方法を提供す
る。
応性がIDDの開始において起こり、そしてIDDの増加した
危険性を有する人において起きることを示した。GADに
対するこのT細胞の反応性は健康な人には存在しない。
これらの発見はGADがT-リンパ球の抗原エピト−プを含
んでいて、従ってIDDの病気の原因に関与し得るという
仮説を支持している。新たに開始したIDDの患者内でT-
リンパ球の応答の程度とICA力価、病気の開始における
年齢、性又はHLA型の間に相関関係はない。従って、こ
のGADに対するT-リンパ球の反応性は追加的な情報を与
えることに貢献し、病気を診断する別の方法を提供す
る。
【００９６】実施例10-64K自己抗体の検出のための生物
体液の収集 500マイクロリットルよりも多くの容量の
全血を64KA自己抗体の試験をするために人から集めた。
血液を直接ガラスの真空容器中に引き込むか、又は注射
に引き込み、続いてガラス真空容器管に移した。血清を
得るために（凝結因子がない血液）、使用した共通の真
空容器管をレッドトップ管（ナトリウムヘパリンが存在
しない）、又は血清セパレ−タ−(STS)管と呼ぶ。共通
のレッドトップ管が使用されたときはこの管は凝固させ
られ(10分より長い期間）、そして凝固は除去された。
この期間にいずれかの試料の管を室温で1000rpmにおい
て5分間遠心分離できる。試料内の血清を除去し、プラ
スチック貯蔵ビンに入れ、そしてしっかりと封をした。
試料を-20℃で64K自己抗体分析まで凍結することができ
る。
体液の収集 500マイクロリットルよりも多くの容量の
全血を64KA自己抗体の試験をするために人から集めた。
血液を直接ガラスの真空容器中に引き込むか、又は注射
に引き込み、続いてガラス真空容器管に移した。血清を
得るために（凝結因子がない血液）、使用した共通の真
空容器管をレッドトップ管（ナトリウムヘパリンが存在
しない）、又は血清セパレ−タ−(STS)管と呼ぶ。共通
のレッドトップ管が使用されたときはこの管は凝固させ
られ(10分より長い期間）、そして凝固は除去された。
この期間にいずれかの試料の管を室温で1000rpmにおい
て5分間遠心分離できる。試料内の血清を除去し、プラ
スチック貯蔵ビンに入れ、そしてしっかりと封をした。
試料を-20℃で64K自己抗体分析まで凍結することができ
る。
【００９７】実施例11-生物体液を試験するのに使用す
るための64K抗原の調製 試料が64K自己抗体に対し試験できる前に人の島細胞調
製物は、64K抗原の給源を提供するために、単離されて
代謝的に標識されなければならない。人の島細胞調製物
はリコ−ディらの方法（リコ−ディ(Ricordi),C.,レ−
シ−(Lacy),P.E.,フィンケ(Finke),E.H.,オラック(Olac
k),B.J.,及びシャ−プ(Scharp),D.W.[1988]『人膵臓島
の単離のための自動化方法』Diabetes37:413-420）に従
って詳細に概略が示されるように、死体の人の膵臓提供
物から単離できる。島細胞は50mlのCMRL培地中で6,000
島/T-150フラスコの濃度でT-150プラスチック組織培養
基フラスコ中に貯蔵できる。
るための64K抗原の調製 試料が64K自己抗体に対し試験できる前に人の島細胞調
製物は、64K抗原の給源を提供するために、単離されて
代謝的に標識されなければならない。人の島細胞調製物
はリコ−ディらの方法（リコ−ディ(Ricordi),C.,レ−
シ−(Lacy),P.E.,フィンケ(Finke),E.H.,オラック(Olac
k),B.J.,及びシャ−プ(Scharp),D.W.[1988]『人膵臓島
の単離のための自動化方法』Diabetes37:413-420）に従
って詳細に概略が示されるように、死体の人の膵臓提供
物から単離できる。島細胞は50mlのCMRL培地中で6,000
島/T-150フラスコの濃度でT-150プラスチック組織培養
基フラスコ中に貯蔵できる。
【００９８】試験前にCMRL培地を除去し捨てる。各フラ
スコに50mlのRPMI1640培地（16mMグルコ−ス、100μU/m
lペニシリン、100μG/mlストレプトマイシン及び2%v/v
正常な人血清を補充）を加え、そして37℃で培養基中で
一夜、95%空気/5%CO2の雰囲気中で培養した。島は試験
管当り50mlの培地の濃度で遠心管中に集められた。
スコに50mlのRPMI1640培地（16mMグルコ−ス、100μU/m
lペニシリン、100μG/mlストレプトマイシン及び2%v/v
正常な人血清を補充）を加え、そして37℃で培養基中で
一夜、95%空気/5%CO2の雰囲気中で培養した。島は試験
管当り50mlの培地の濃度で遠心管中に集められた。
【００９９】試験管にキャップをし、室温で1000rpmで3
分間遠心した。上澄みを除去し、捨てた。少量（およそ
4ml）のRPMI標識培地（16mMグルコ−ス、20mM HEPES、2
%正常な人血清を補充しており、アミノ酸メチオニンが
存在しない）を各試験管に、穏やかな混合をしながら試
験管当りおよそ30秒間加えた。全ての島細胞を次に50ml
のポリプロピレン遠心試験管に集め、そして1000rpmで5
分間遠心した。上澄みを除去し、捨てた。島細胞を次に
RPMI標識培地（1000島/ml培地）中に再懸濁し、100mmプ
ラスチック組織培養基ペトリ皿に移した。島を15分間37
℃で培養し（95%空気/5%CO2）、その後35Sメチオニンを
0.5mCi/1x104細胞の濃度で培地に加えた。島細胞を再度
5時間37℃で培養した（95%空気/5%CO2）。ペトリ皿内の
培地を島細胞を攪拌（又は収集）することなしに吸引
し、そして培地を処分した。
分間遠心した。上澄みを除去し、捨てた。少量（およそ
4ml）のRPMI標識培地（16mMグルコ−ス、20mM HEPES、2
%正常な人血清を補充しており、アミノ酸メチオニンが
存在しない）を各試験管に、穏やかな混合をしながら試
験管当りおよそ30秒間加えた。全ての島細胞を次に50ml
のポリプロピレン遠心試験管に集め、そして1000rpmで5
分間遠心した。上澄みを除去し、捨てた。島細胞を次に
RPMI標識培地（1000島/ml培地）中に再懸濁し、100mmプ
ラスチック組織培養基ペトリ皿に移した。島を15分間37
℃で培養し（95%空気/5%CO2）、その後35Sメチオニンを
0.5mCi/1x104細胞の濃度で培地に加えた。島細胞を再度
5時間37℃で培養した（95%空気/5%CO2）。ペトリ皿内の
培地を島細胞を攪拌（又は収集）することなしに吸引
し、そして培地を処分した。
【０１００】細胞に次に1000島/mlの濃度で等しい容量
のRPMI1640培地を加え、そして37℃（95%空気/5%CO2）
で30分間培養した。島細胞とそれらの培地を15mlの円錐
形のポリプロピレン遠心管中に集めた。試験管を15mlの
マ−キングまで20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1000K
IE/mlアプロチン及び2mMフェニルメチルスルホニルフル
オライドで満たし、蓋をし、遠心し(1000rpm、5分間)、
そして上澄みを捨てた。ペレットを含有している試験管
を次に凍結させた(-80℃)。
のRPMI1640培地を加え、そして37℃（95%空気/5%CO2）
で30分間培養した。島細胞とそれらの培地を15mlの円錐
形のポリプロピレン遠心管中に集めた。試験管を15mlの
マ−キングまで20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1000K
IE/mlアプロチン及び2mMフェニルメチルスルホニルフル
オライドで満たし、蓋をし、遠心し(1000rpm、5分間)、
そして上澄みを捨てた。ペレットを含有している試験管
を次に凍結させた(-80℃)。
【０１０１】実施例12-64K抗原の洗剤抽出及び64K自己
抗体に対する生物体液の試験 試験血清を使用する64K抗原の免疫沈殿（イムノプレシ
ピテ−ション）を実施するために島細胞を氷上の試験管
内でゆっくりと解凍した。一旦解凍されたら洗剤抽出緩
衝液（20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1000KIE/mlア
プロチン及び2mMフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド及び2%トリトンTMX-114）を試験管に加え、島を氷上
で3時間溶解した。更に合計で60秒間（各超音波処理の
間に氷上で15秒間の間隔で1分間の休憩をおいて4回）、
洗剤抽出物中に挿入された超音波プロ−ブを使用して、
試験管内で島細胞を超音波処理した。15分の間隔で島は
又機械的にも破壊された。
抗体に対する生物体液の試験 試験血清を使用する64K抗原の免疫沈殿（イムノプレシ
ピテ−ション）を実施するために島細胞を氷上の試験管
内でゆっくりと解凍した。一旦解凍されたら洗剤抽出緩
衝液（20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、1000KIE/mlア
プロチン及び2mMフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド及び2%トリトンTMX-114）を試験管に加え、島を氷上
で3時間溶解した。更に合計で60秒間（各超音波処理の
間に氷上で15秒間の間隔で1分間の休憩をおいて4回）、
洗剤抽出物中に挿入された超音波プロ−ブを使用して、
試験管内で島細胞を超音波処理した。15分の間隔で島は
又機械的にも破壊された。
【０１０２】等しい容量の抽出物を遠心管にピペットで
取り、バランスのとれた試験管をベックマン型50ロ−タ
−に入れ、そして試験管を超遠心（100,000xg、30分、4
℃）することによって洗剤抽出された島から不溶材料を
除去した。上澄みを除き、新たなポリプロピレン試験管
に入れた。ペレットは捨てることができる。島細胞溶解
物（上澄み）を次に免疫沈殿試験の前に水相、蔗糖相及
び洗剤相に分離できる。
取り、バランスのとれた試験管をベックマン型50ロ−タ
−に入れ、そして試験管を超遠心（100,000xg、30分、4
℃）することによって洗剤抽出された島から不溶材料を
除去した。上澄みを除き、新たなポリプロピレン試験管
に入れた。ペレットは捨てることができる。島細胞溶解
物（上澄み）を次に免疫沈殿試験の前に水相、蔗糖相及
び洗剤相に分離できる。
【０１０３】洗剤相の抽出のための方法がボ−ディ−ル
（ボ−ディ−ル(Bordier),,C.[1981] 『トリトンTMX-11
4溶液中で一体の膜蛋白質の相分離』J.Biol.Chem.256:1
604-07）の方法にそのまま従って行った。
（ボ−ディ−ル(Bordier),,C.[1981] 『トリトンTMX-11
4溶液中で一体の膜蛋白質の相分離』J.Biol.Chem.256:1
604-07）の方法にそのまま従って行った。
【０１０４】抽出の後、島細胞溶解物の洗剤相を次に蓋
をした1.5mlエピンドルフ管中で正常な人血清（10μlの
試験血清を100μlの洗剤相上澄み当り含有、1時間、4℃
［氷浴］）とともに培養し、続いて予備膨張したプロテ
インAセファロ−スCL-4Bに吸着させた（スウェ−デンの
ファルマシアから購入することができる）。100μlの膨
潤したプロテインAセファロ−スCL-4Bが、蓋をした15ml
の円錐形の遠心管中で、各々の400μl試験血清／洗剤相
混合物に加えられ、そして４℃で振盪プラットホ−ム上
に保たれた（300rpmで2時間）。その時に試験管は1000r
pmで1分間遠心分離することができ、上澄みを除去す
る。プロテインAセファロ−スペレットを捨てることが
できる。非結合（プレクリア−された）溶解物（上澄
み）のアリコ−ト（5-10x106cpmを含有している100μ
l）を1.5mlのエピンドルフ遠心管に分配し、そして64K
自己抗体の存在について試験されるべき25μlの血清と
ともに培養した。次に試験管に蓋をし、4℃で18時間培
養した（氷浴中）。各検定試験管に予備膨潤したプロテ
インAセファロ−スCL-4B100μlを加え、そして反応混合
物を4℃で300rpmの振盪プラットホ−ム上で2時間培養し
た。 試験管にプロテインAセファロ−スCL-4Bを洗うた
めに900μlの0.5%トリトンTMX-114緩衝液を加えた。試
験管を各々について10秒間渦巻かせ、続いて10秒間1000
rpmで遠心分離した。上澄みを吸引で捨て、ペレットは
試験管に残したままとした。別の900μlの0.5%トリトン
TM洗浄緩衝液を試験管に加え、洗浄手順を更に5回繰り
返した。1回の最後の洗浄段階は0.5%トリトンTM緩衝液
の代りに氷冷水の洗液に置き換えて行われた。この時点
で試験管はプロテインAセファロ−スCL-4B及び抗体及び
／又は島蛋白質の間で形成された任意の免疫複合体のみ
を含有するはずである。結合した免疫複合体は除去で
き、80mMトリス(pH6.8)、3.0%(w/v)ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、15%蔗糖、0.001ブロモフェニルブル−及び
(5.0% v/v)β-メルカプトエタノ−ルを同じ栓をした1.5
mlエピンドルフ試験管中に含有している100μlの試料緩
衝液中で3分間沸騰させることによって変性させること
ができる。セファロ−スのビ−ズを次に試験管の遠心で
除去し（1000rpm、1分間）、そして上澄みを注意深く除
去する。50μlの試料を次に不連続なSDS10%ポリアクリ
ルアミド分離ゲルを通して電気泳動させ、続いてラエム
リの方法［ラエムリ(Laemmli),U.K.1970.バクテリオフ
ァ−ジT4の頭の組み立ての間構造蛋白質の開裂 Nature.
227:680-85］に従って、クマシ−ブリリアントブル−染
色を行い、続いて市販製品のエンハンス(Enhance)中に
詳細に記載されている方法を使用してフルオログラフィ
−を行う（ニュ−イングランドニュ−クリア−）。
をした1.5mlエピンドルフ管中で正常な人血清（10μlの
試験血清を100μlの洗剤相上澄み当り含有、1時間、4℃
［氷浴］）とともに培養し、続いて予備膨張したプロテ
インAセファロ−スCL-4Bに吸着させた（スウェ−デンの
ファルマシアから購入することができる）。100μlの膨
潤したプロテインAセファロ−スCL-4Bが、蓋をした15ml
の円錐形の遠心管中で、各々の400μl試験血清／洗剤相
混合物に加えられ、そして４℃で振盪プラットホ−ム上
に保たれた（300rpmで2時間）。その時に試験管は1000r
pmで1分間遠心分離することができ、上澄みを除去す
る。プロテインAセファロ−スペレットを捨てることが
できる。非結合（プレクリア−された）溶解物（上澄
み）のアリコ−ト（5-10x106cpmを含有している100μ
l）を1.5mlのエピンドルフ遠心管に分配し、そして64K
自己抗体の存在について試験されるべき25μlの血清と
ともに培養した。次に試験管に蓋をし、4℃で18時間培
養した（氷浴中）。各検定試験管に予備膨潤したプロテ
インAセファロ−スCL-4B100μlを加え、そして反応混合
物を4℃で300rpmの振盪プラットホ−ム上で2時間培養し
た。 試験管にプロテインAセファロ−スCL-4Bを洗うた
めに900μlの0.5%トリトンTMX-114緩衝液を加えた。試
験管を各々について10秒間渦巻かせ、続いて10秒間1000
rpmで遠心分離した。上澄みを吸引で捨て、ペレットは
試験管に残したままとした。別の900μlの0.5%トリトン
TM洗浄緩衝液を試験管に加え、洗浄手順を更に5回繰り
返した。1回の最後の洗浄段階は0.5%トリトンTM緩衝液
の代りに氷冷水の洗液に置き換えて行われた。この時点
で試験管はプロテインAセファロ−スCL-4B及び抗体及び
／又は島蛋白質の間で形成された任意の免疫複合体のみ
を含有するはずである。結合した免疫複合体は除去で
き、80mMトリス(pH6.8)、3.0%(w/v)ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、15%蔗糖、0.001ブロモフェニルブル−及び
(5.0% v/v)β-メルカプトエタノ−ルを同じ栓をした1.5
mlエピンドルフ試験管中に含有している100μlの試料緩
衝液中で3分間沸騰させることによって変性させること
ができる。セファロ−スのビ−ズを次に試験管の遠心で
除去し（1000rpm、1分間）、そして上澄みを注意深く除
去する。50μlの試料を次に不連続なSDS10%ポリアクリ
ルアミド分離ゲルを通して電気泳動させ、続いてラエム
リの方法［ラエムリ(Laemmli),U.K.1970.バクテリオフ
ァ−ジT4の頭の組み立ての間構造蛋白質の開裂 Nature.
227:680-85］に従って、クマシ−ブリリアントブル−染
色を行い、続いて市販製品のエンハンス(Enhance)中に
詳細に記載されている方法を使用してフルオログラフィ
−を行う（ニュ−イングランドニュ−クリア−）。
【０１０５】電気泳動に続いてゲルをろ紙上に置き、2
時間60℃で電気泳動ゲルドライヤ−中で乾燥させる。一
旦乾燥したらゲルを除いて、増強スクリ−ンを有するフ
ィルムカセット中のX線フィルム（コダックXR OMAT）上
に置き、そして-80℃で3週間置く。フィルム（フルオロ
ラジオグラムと呼ぶ）を標準のX線フィルム写真加工を
使用して処理する。試験試料はそれらのそれぞれの陽性
及び陰性対照と比較した後に陽性か又は陰性として採点
する。
時間60℃で電気泳動ゲルドライヤ−中で乾燥させる。一
旦乾燥したらゲルを除いて、増強スクリ−ンを有するフ
ィルムカセット中のX線フィルム（コダックXR OMAT）上
に置き、そして-80℃で3週間置く。フィルム（フルオロ
ラジオグラムと呼ぶ）を標準のX線フィルム写真加工を
使用して処理する。試験試料はそれらのそれぞれの陽性
及び陰性対照と比較した後に陽性か又は陰性として採点
する。
【０１０６】実施例13-64KAを検出する方法
実施例11に概略を示した免疫沈殿技術を使用する他に本
発明は64KAの存在の検出を促進する任意の手順を使用し
て実施できる。例えば、使用することができる他の免疫
学的な方法には酵素結合イミュノソルベント検定(ELIS
A)及びラジオイミュノアッセイ(RIA)が含まれる。これ
らの手順の原理と実験方法は当業者によく知られてい
る。この検定は64KAと結合する天然又は組み替え蛋白質
を使用することによって迅速かつ効率的に実施できる。
全体の細胞及び細胞溶解物の両方の手順はこの分野で研
究を行っている人によく知られ、そして本発明の64KAを
検出するのに容易に用い得る。
発明は64KAの存在の検出を促進する任意の手順を使用し
て実施できる。例えば、使用することができる他の免疫
学的な方法には酵素結合イミュノソルベント検定(ELIS
A)及びラジオイミュノアッセイ(RIA)が含まれる。これ
らの手順の原理と実験方法は当業者によく知られてい
る。この検定は64KAと結合する天然又は組み替え蛋白質
を使用することによって迅速かつ効率的に実施できる。
全体の細胞及び細胞溶解物の両方の手順はこの分野で研
究を行っている人によく知られ、そして本発明の64KAを
検出するのに容易に用い得る。
【０１０７】例えば実施例8に記載されるように、表6に
示されるアミノ酸配列は免疫学的に反応性のエピト−プ
を確認するために分析できる。これらのエピト−プは64
KAと免疫学的に反応するであろうアミノ酸配列である。
これらの手順に従って使用できる合成ペプチドは実施例
8に詳細に記載されている。これらの配列は次に組み替
えにより製造することができる。組み替え製造について
はエピト−プをコ−ドしているDNAをベクタ−に挿入
し、ベクタ−を次に適当な宿主細胞を形質転換するため
に使用し、宿主細胞は次に所望のアミノ酸配列を表現さ
せられる。細菌、昆虫、酵母及び哺乳類の細胞はすべて
適当な宿主として役立ち得るが、エピト−プの反応性に
おいて蛋白質の折畳みが重要な因子であるならば、真核
細胞が好ましい宿主である。
示されるアミノ酸配列は免疫学的に反応性のエピト−プ
を確認するために分析できる。これらのエピト−プは64
KAと免疫学的に反応するであろうアミノ酸配列である。
これらの手順に従って使用できる合成ペプチドは実施例
8に詳細に記載されている。これらの配列は次に組み替
えにより製造することができる。組み替え製造について
はエピト−プをコ−ドしているDNAをベクタ−に挿入
し、ベクタ−を次に適当な宿主細胞を形質転換するため
に使用し、宿主細胞は次に所望のアミノ酸配列を表現さ
せられる。細菌、昆虫、酵母及び哺乳類の細胞はすべて
適当な宿主として役立ち得るが、エピト−プの反応性に
おいて蛋白質の折畳みが重要な因子であるならば、真核
細胞が好ましい宿主である。
【０１０８】精製された蛋白質、又は蛋白質を製造して
いる細胞の溶解物を検定に使用することができる。
いる細胞の溶解物を検定に使用することができる。
【０１０９】又、64KAを検出するために64K抗原を使用
する別の方法として、それ以外については抗64KA抗体と
して知られている64KAに対し生じた抗体を使用すること
である。この抗体は64KAと免疫沈殿し、そして検出は上
記の様に実施できる。
する別の方法として、それ以外については抗64KA抗体と
して知られている64KAに対し生じた抗体を使用すること
である。この抗体は64KAと免疫沈殿し、そして検出は上
記の様に実施できる。
【０１１０】実施例14-免疫複合体中の64K自己抗原-自
己抗体を検出するための検定法 IDDを有する患者又はこの病気を生じる過程にある患者
は、彼等の血清中に64K抗原を含む免疫複合体を有する
ことが予測できる。これらの免疫複合体は典型的にはい
くつかの免疫グロブリンで囲まれている64K自己抗原か
らなっている。この病気を有しない個人、又はこの病気
を生じようとしていない人はこれらの免疫複合体を有さ
ないであろうから、これらの複合体を検出することはこ
の病気の検出のための検定の基礎を提供する。
己抗体を検出するための検定法 IDDを有する患者又はこの病気を生じる過程にある患者
は、彼等の血清中に64K抗原を含む免疫複合体を有する
ことが予測できる。これらの免疫複合体は典型的にはい
くつかの免疫グロブリンで囲まれている64K自己抗原か
らなっている。この病気を有しない個人、又はこの病気
を生じようとしていない人はこれらの免疫複合体を有さ
ないであろうから、これらの複合体を検出することはこ
の病気の検出のための検定の基礎を提供する。
【０１１１】最初にIDD試験がされる患者又は対照から
採血される。血液試料から赤血球細胞をスピニングアウ
ト（遠心分離）させることによって血清が得られる。ID
Dを有する患者又はこの病気を生じようとしている患者
については、この血清は64K抗原を含む免疫複合体を含
有していることが予測できる。次に血清の試料はプロテ
インAセファロ−スと培養できる。血清と共に培養され
る試料の容量は少量であり、例えば25μlである。プロ
テインAセファロ−スCL-4Bと免疫グロブリンの培養に続
いて（2時間、4℃）、複合体を次に0.1%SDS、1.0%トリ
トンX-114、及び2mM EDTAを有する50mMトリス-HCl(pH7.
4)で3回、そして50mMトリス-HCl(pH7.4)で2回洗浄でき
る。上記の様にセファロ−スを洗浄することによって外
の血清蛋白質が洗い去られ、プロテインAセファロ−ス
に結合した免疫グロブリンのみが残る。次に64K自己抗
原の放射能活性ホスホニル化をキナ−ゼ反応を利用して
達成できる。キナ−ゼ反応は10mM MnCl2、10mM MgCl2、
1%トリトンX-114、及び20μCiのアデノシン(γ-32P)5'
三燐酸(アメルシャム＞5000Ci/mmol)を含有している50m
M HEPES緩衝液(pH7.4)10μlを添加することによって開
始できる。沈殿物は懸濁され、そして30℃で10分間培養
できる。反応を次に電気泳動試料緩衝液の添加により停
止でき、95℃で4分間加熱される。32P標識生成物は不連
続SDS15%ポリアクリルアミド分離ゲルによって分離で
き、続いて増強スクリ−ンで6〜72時間オ−トラジオグ
ラフィ−を行う（コダック、X-omat AR5）。IDD患者の
血清は特異的にMr64,000蛋白質を免疫沈殿させ、これは
対照の血清では観測されない。
採血される。血液試料から赤血球細胞をスピニングアウ
ト（遠心分離）させることによって血清が得られる。ID
Dを有する患者又はこの病気を生じようとしている患者
については、この血清は64K抗原を含む免疫複合体を含
有していることが予測できる。次に血清の試料はプロテ
インAセファロ−スと培養できる。血清と共に培養され
る試料の容量は少量であり、例えば25μlである。プロ
テインAセファロ−スCL-4Bと免疫グロブリンの培養に続
いて（2時間、4℃）、複合体を次に0.1%SDS、1.0%トリ
トンX-114、及び2mM EDTAを有する50mMトリス-HCl(pH7.
4)で3回、そして50mMトリス-HCl(pH7.4)で2回洗浄でき
る。上記の様にセファロ−スを洗浄することによって外
の血清蛋白質が洗い去られ、プロテインAセファロ−ス
に結合した免疫グロブリンのみが残る。次に64K自己抗
原の放射能活性ホスホニル化をキナ−ゼ反応を利用して
達成できる。キナ−ゼ反応は10mM MnCl2、10mM MgCl2、
1%トリトンX-114、及び20μCiのアデノシン(γ-32P)5'
三燐酸(アメルシャム＞5000Ci/mmol)を含有している50m
M HEPES緩衝液(pH7.4)10μlを添加することによって開
始できる。沈殿物は懸濁され、そして30℃で10分間培養
できる。反応を次に電気泳動試料緩衝液の添加により停
止でき、95℃で4分間加熱される。32P標識生成物は不連
続SDS15%ポリアクリルアミド分離ゲルによって分離で
き、続いて増強スクリ−ンで6〜72時間オ−トラジオグ
ラフィ−を行う（コダック、X-omat AR5）。IDD患者の
血清は特異的にMr64,000蛋白質を免疫沈殿させ、これは
対照の血清では観測されない。
【０１１２】実施例15-ハイブリッド蛋白質ワクチンを
使用するIDDの処置 糖尿病の開始の引金を引く特定の事象又は試薬は解明さ
れていない。64K抗原と類似の抗原を有しているウィル
スはウィルスに対する正常な免疫応答と、ウィルスとの
分子的な模倣を通じての64K抗原に対する、異常な自己
免疫応答との両方を生じ得る。従って遺伝的な感受性
は、病気の行程を開始する環境的な因子に対する誇張さ
れた、又は長引かされた免疫応答によって表現される。
又、64K蛋白質が個体発生において島細胞の発達におけ
る遅れた表現を有する可能性もあり、生命の初期の段階
ではそれに対する耐性が発達していないので、それを抗
原とすることが可能であり得る。
使用するIDDの処置 糖尿病の開始の引金を引く特定の事象又は試薬は解明さ
れていない。64K抗原と類似の抗原を有しているウィル
スはウィルスに対する正常な免疫応答と、ウィルスとの
分子的な模倣を通じての64K抗原に対する、異常な自己
免疫応答との両方を生じ得る。従って遺伝的な感受性
は、病気の行程を開始する環境的な因子に対する誇張さ
れた、又は長引かされた免疫応答によって表現される。
又、64K蛋白質が個体発生において島細胞の発達におけ
る遅れた表現を有する可能性もあり、生命の初期の段階
ではそれに対する耐性が発達していないので、それを抗
原とすることが可能であり得る。
【０１１３】病気の開始の機構と関わりなく、β細胞の
破壊は少なくとも2つの方法で進行し得る。64KAが開始
する外来の抗原に結合し、そして免疫系の他の化合物を
刺激し、抗体結合β細胞を破壊する。又はT-リンパ球が
64K抗原を認識し、細胞を直接殺す。いずれの場合も64K
蛋白質を使用して破壊行程に干渉し、それによってIDD
を遅らせ又は防止することが可能である。
破壊は少なくとも2つの方法で進行し得る。64KAが開始
する外来の抗原に結合し、そして免疫系の他の化合物を
刺激し、抗体結合β細胞を破壊する。又はT-リンパ球が
64K抗原を認識し、細胞を直接殺す。いずれの場合も64K
蛋白質を使用して破壊行程に干渉し、それによってIDD
を遅らせ又は防止することが可能である。
【０１１４】本発明の新規な治療法は、64K抗原の精製
された形態に結合した毒素の血流への注射を含む。抗原
毒素複合体は迅速にリンパ節に到達し、そこで複合体は
通常は64KAをつくり出す免疫細胞によって取り上げられ
る。又、抗原毒素複合体はβ細胞上で64K抗原を認識す
るT-リンパ球によって結合されるであろう。従って、β
細胞破壊に関与する特定の免疫細胞は毒が与えられて不
活性化され、非破壊性の免疫細胞は無害のままに残す。
された形態に結合した毒素の血流への注射を含む。抗原
毒素複合体は迅速にリンパ節に到達し、そこで複合体は
通常は64KAをつくり出す免疫細胞によって取り上げられ
る。又、抗原毒素複合体はβ細胞上で64K抗原を認識す
るT-リンパ球によって結合されるであろう。従って、β
細胞破壊に関与する特定の免疫細胞は毒が与えられて不
活性化され、非破壊性の免疫細胞は無害のままに残す。
【０１１５】ハイブリッド蛋白は例えば64K抗原と一緒
になったジフテリア毒素からなるものであり得る。その
様なハイブリッド毒素の構築は例えば、米国特許第4,67
5,382（マ−フィ−）のハイブリッド蛋白質についての
開示に従って進行させることができる。
になったジフテリア毒素からなるものであり得る。その
様なハイブリッド毒素の構築は例えば、米国特許第4,67
5,382（マ−フィ−）のハイブリッド蛋白質についての
開示に従って進行させることができる。
【０１１６】別の方法は64K様の蛋白質の表現を欠いて
いるが、感染性を保有している変更されたウィルス（ウ
ィルスの病気開始クラスからのもの）をつくり出すこと
を含んでいる。この弱毒化されたウィルスはIDDに対し
て高い遺伝的な危険のある人、すなわちHLAが相同の兄
弟姉妹又はIDDの初期段階にある人に対してワクチン注
射するために使用できる。64K蛋白質を模倣するウィル
スの候補、従って病気の行程を開始する候補にはコクサ
キウィルス、風疹ウィルス及びEMCウィルスが含まれ
る。ワクチン組成物は64K蛋白質と共通したエピト−プ
に対し非弱毒化ウィルスが免疫応答を生じるような弱毒
化したウィルスからなるものとしてつくることができ
る。弱毒化した形態ではワクチンウィルスはウィルスに
対する免疫応答を生じるが64K蛋白質に対しては生じな
い。
いるが、感染性を保有している変更されたウィルス（ウ
ィルスの病気開始クラスからのもの）をつくり出すこと
を含んでいる。この弱毒化されたウィルスはIDDに対し
て高い遺伝的な危険のある人、すなわちHLAが相同の兄
弟姉妹又はIDDの初期段階にある人に対してワクチン注
射するために使用できる。64K蛋白質を模倣するウィル
スの候補、従って病気の行程を開始する候補にはコクサ
キウィルス、風疹ウィルス及びEMCウィルスが含まれ
る。ワクチン組成物は64K蛋白質と共通したエピト−プ
に対し非弱毒化ウィルスが免疫応答を生じるような弱毒
化したウィルスからなるものとしてつくることができ
る。弱毒化した形態ではワクチンウィルスはウィルスに
対する免疫応答を生じるが64K蛋白質に対しては生じな
い。
【０１１７】実施例16-膵臓移植と関連した64KAの使用
IDDを有する患者の処置の好ましい方法は、損なわれた
又は破壊されたβ細胞に対する置き換え物としての正常
な島を移植することである。糖尿病を有する多くの患者
において部分的及び全膵臓の移植がうまく実施されてい
る。しかし、移植を維持し、拒絶を防止するために永久
的な免疫抑制療法が常に必要とされる。連続的な免疫抑
制療法のもとでの部分的又は全体の膵臓移植は、糖尿病
を有するいく人かの患者で正常な水準の血液グルコ−ス
を生じている。膵臓の移植は糖尿病の過程で遅い時期に
行われ、おそらく腎臓病などの併発症を逆転させず、事
実網膜症を悪化させるであろう。
又は破壊されたβ細胞に対する置き換え物としての正常
な島を移植することである。糖尿病を有する多くの患者
において部分的及び全膵臓の移植がうまく実施されてい
る。しかし、移植を維持し、拒絶を防止するために永久
的な免疫抑制療法が常に必要とされる。連続的な免疫抑
制療法のもとでの部分的又は全体の膵臓移植は、糖尿病
を有するいく人かの患者で正常な水準の血液グルコ−ス
を生じている。膵臓の移植は糖尿病の過程で遅い時期に
行われ、おそらく腎臓病などの併発症を逆転させず、事
実網膜症を悪化させるであろう。
【０１１８】重要なことは、一卵性双生児の間の膵臓の
移植の成功は免疫抑制なしに維持されてきたが、自己免
疫島細胞破壊が生じて糖尿病が再発した。従って、移植
が拒絶されないときも、病気の再発を予防するために免
疫療法が必須である。移植された島の破壊（拒絶）は少
なくとも部分的には自己免疫破壊の原因となっている自
己抗原の再出現のためである。自己免疫破壊（移植され
た島／すい臓の拒絶）を予防する特定の免疫療法は現在
存在しない。移植された島細胞又はすい臓の自己免疫破
壊を予防するために実施例11に詳細に記載したようなハ
イブリッド毒素を使用して、特異的な免疫療法を島細胞
破壊を予防するのに使用できる。免疫療法の組合せ使用
は島細胞／膵臓移植をIDDの処置の治療の道具にする。
移植の成功は免疫抑制なしに維持されてきたが、自己免
疫島細胞破壊が生じて糖尿病が再発した。従って、移植
が拒絶されないときも、病気の再発を予防するために免
疫療法が必須である。移植された島の破壊（拒絶）は少
なくとも部分的には自己免疫破壊の原因となっている自
己抗原の再出現のためである。自己免疫破壊（移植され
た島／すい臓の拒絶）を予防する特定の免疫療法は現在
存在しない。移植された島細胞又はすい臓の自己免疫破
壊を予防するために実施例11に詳細に記載したようなハ
イブリッド毒素を使用して、特異的な免疫療法を島細胞
破壊を予防するのに使用できる。免疫療法の組合せ使用
は島細胞／膵臓移植をIDDの処置の治療の道具にする。
【０１１９】実施例17-64KAの検定のためのキット
本明細書に使用した新規な手順を使用して、血清試料の
便利な分析法を促進する試薬キットが提供できる。キッ
トは64KA検出のための抗原としての役目をする組み替え
又は合成的につくられた無傷の64K蛋白質又は免疫反応
性のペプチドを使用するようにつくることができる。別
の方法として、64KAを検出するために特に開発された抗
体も有用である。抗体を検出するためのELISA及びRIA技
術の原理と方法は十分に確立されている。
便利な分析法を促進する試薬キットが提供できる。キッ
トは64KA検出のための抗原としての役目をする組み替え
又は合成的につくられた無傷の64K蛋白質又は免疫反応
性のペプチドを使用するようにつくることができる。別
の方法として、64KAを検出するために特に開発された抗
体も有用である。抗体を検出するためのELISA及びRIA技
術の原理と方法は十分に確立されている。
【０１２０】例として、ELISA検定のためには、その様
なキットは次の成分からなる。 1.64K蛋白質、ペプチド又は抗-64KA抗体 2.酵素（例えばパ−オキシダ−ゼ） 3.コンジュゲイト（複合化）した動物の抗人免疫グロブ
リン、及び 4.陽性及び陰性の対照 上記のキットは、96個のウェルのプラスチックプレ−
ト、比色試薬、ELISAリ−ダ−、封鎖試薬及び洗浄緩衝
液を含むように変更することができる。
なキットは次の成分からなる。 1.64K蛋白質、ペプチド又は抗-64KA抗体 2.酵素（例えばパ−オキシダ−ゼ） 3.コンジュゲイト（複合化）した動物の抗人免疫グロブ
リン、及び 4.陽性及び陰性の対照 上記のキットは、96個のウェルのプラスチックプレ−
ト、比色試薬、ELISAリ−ダ−、封鎖試薬及び洗浄緩衝
液を含むように変更することができる。
【０１２１】又、例としてRIAのためにはその様なキッ
トは次の成分からなるものであり得る。 1.放射標識64K蛋白質、ペプチド又は抗-64KA抗体 2.洗浄緩衝液 3.ポリエチレングリコ−ル 4.ヤギ又は羊の抗人沈殿（第2）抗体、及び 5.陽性及び陰性対照 上記キットのいずれかは適当な実験備品の任意のものを
含めるように変更できる。
トは次の成分からなるものであり得る。 1.放射標識64K蛋白質、ペプチド又は抗-64KA抗体 2.洗浄緩衝液 3.ポリエチレングリコ−ル 4.ヤギ又は羊の抗人沈殿（第2）抗体、及び 5.陽性及び陰性対照 上記キットのいずれかは適当な実験備品の任意のものを
含めるように変更できる。
【０１２２】本明細書に記載した実施例及び具体例は説
明目的のみのものであり、上記に照して種々の変更又は
変化が当業者に示唆され、本出願の精神と範囲内に含ま
れるべきであり、添付の特許請求の範囲に含まれるべき
である。
明目的のみのものであり、上記に照して種々の変更又は
変化が当業者に示唆され、本出願の精神と範囲内に含ま
れるべきであり、添付の特許請求の範囲に含まれるべき
である。
【０１２３】表6.猫のグルタミン酸デカルボキシラ−ゼ
mRNAのヌクレオチド及び誘導された配列
mRNAのヌクレオチド及び誘導された配列
【表１】
【表１】
【表１】
【表１】
フロントページの続き
(72)発明者 ノエル ケイ． マクラレン
アメリカ合衆国 32618 フロリダ州 ア
ーチャー ボックス 10 ルート ２
(72)発明者 ウィリアム カスターン
アメリカ合衆国 32608 フロリダ州 ゲ
インスビル 47ス ロード エス．ダブリ
ュ． 8123
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １． IDDの治療又は予防において使用するための又は
その医薬の製造のためのGAD蛋白質又はペプチドを含む
薬剤。 ２．該薬剤が免疫系活性化断片を含んでおり、該免疫系
活性化断片が、アミノ酸配列 Pro-Glu-Val-Lys を含んでいる、請求項１に記載の薬剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8297038A JP2928176B2 (ja) | 1996-10-21 | 1996-10-21 | インシュリン依存性真性糖尿病処置組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8297038A JP2928176B2 (ja) | 1996-10-21 | 1996-10-21 | インシュリン依存性真性糖尿病処置組成物 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3515651A Division JP2649103B2 (ja) | 1990-08-17 | 1991-08-16 | インシュリン依存性真性糖尿病の早期検出及び処置のための方法及び組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09227408A true JPH09227408A (ja) | 1997-09-02 |
| JP2928176B2 JP2928176B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=17841421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8297038A Expired - Lifetime JP2928176B2 (ja) | 1996-10-21 | 1996-10-21 | インシュリン依存性真性糖尿病処置組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2928176B2 (ja) |
-
1996
- 1996-10-21 JP JP8297038A patent/JP2928176B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2928176B2 (ja) | 1999-08-03 |
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