JPH09234074A - アダプター二本鎖ｄｎａ及びそれを用いたｄｎａ増幅方法 - Google Patents
アダプター二本鎖ｄｎａ及びそれを用いたｄｎａ増幅方法Info
- Publication number
- JPH09234074A JPH09234074A JP8045927A JP4592796A JPH09234074A JP H09234074 A JPH09234074 A JP H09234074A JP 8045927 A JP8045927 A JP 8045927A JP 4592796 A JP4592796 A JP 4592796A JP H09234074 A JPH09234074 A JP H09234074A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- stranded dna
- adapter
- stranded
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 248
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 98
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 85
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 101100184148 Xenopus laevis mix-a gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100345673 Xenopus laevis mix-b gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 16
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 15
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- KTTSGZDGPMNDTG-UHFFFAOYSA-N cesium;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound [Cs].OC(=O)C(F)(F)F KTTSGZDGPMNDTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、一度に多種多様なＤＮＡを同時に
短い物から長いものまでを均一に増幅するＤＮＡ増幅方
法及びそのために利用可能なアダプター二本鎖ＤＮＡの
開発を課題とする。 【解決手段】 一方のの末端でのみ増幅されるＤＮＡと
結合できるアダプター二本鎖ＤＮＡを提供し、該アダプ
ター二本鎖ＤＮＡを用いて下記に挙げる条件下でＰＣＲ
を行うことにより、多種類のＤＮＡを同時に均一に増幅
する遺伝子増幅方法。 アダプター二本鎖ＤＮＡを増幅されるＤＮＡと結合さ
せる。 アダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡのうち、
増幅されるＤＮＡに結合しない側の末端が５’末端に当
たる一本鎖ＤＮＡの塩基配列を有するプライマー一本鎖
ＤＮＡを用いる。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップである。
短い物から長いものまでを均一に増幅するＤＮＡ増幅方
法及びそのために利用可能なアダプター二本鎖ＤＮＡの
開発を課題とする。 【解決手段】 一方のの末端でのみ増幅されるＤＮＡと
結合できるアダプター二本鎖ＤＮＡを提供し、該アダプ
ター二本鎖ＤＮＡを用いて下記に挙げる条件下でＰＣＲ
を行うことにより、多種類のＤＮＡを同時に均一に増幅
する遺伝子増幅方法。 アダプター二本鎖ＤＮＡを増幅されるＤＮＡと結合さ
せる。 アダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡのうち、
増幅されるＤＮＡに結合しない側の末端が５’末端に当
たる一本鎖ＤＮＡの塩基配列を有するプライマー一本鎖
ＤＮＡを用いる。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一度に多種多様な
ＤＮＡを同時に短い物から長いものまでを均一に増幅す
る方法に関する。
ＤＮＡを同時に短い物から長いものまでを均一に増幅す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来のＤＮＡ増幅方法は、Ｔａｑポリメ
ラーゼ（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いたポリ
メラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲ））が主に用いられて
きた。この方法は、耐熱性のＤＮＡ複製酵素であるＴａ
ｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることにより、試験管
内（チューブ内）で連続してＤＮＡの変性、プライマー
のアニーリング（結合）、ＤＮＡの合成（伸長反応）を
繰り返し行うものである。まずＤＮＡの変性は９０℃以
上の温度で行い、プライマーのアニーリングは５０〜７
０℃程度の温度で、ＤＮＡの合成は６８〜７５℃程度で
行われる。耐熱性のＤＮＡ複製酵素であるＴａｑ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅはこれらのサイクルにおいても失活し
ない酵素であり、クレノーフラグメント（ｋｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ）等では不可能であった試験管内
（チューブ内）で連続してＤＮＡの変性、プライマーの
アニーリング（結合）、ＤＮＡの合成を繰り返し行うこ
とを可能とするものである。
ラーゼ（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いたポリ
メラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲ））が主に用いられて
きた。この方法は、耐熱性のＤＮＡ複製酵素であるＴａ
ｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることにより、試験管
内（チューブ内）で連続してＤＮＡの変性、プライマー
のアニーリング（結合）、ＤＮＡの合成（伸長反応）を
繰り返し行うものである。まずＤＮＡの変性は９０℃以
上の温度で行い、プライマーのアニーリングは５０〜７
０℃程度の温度で、ＤＮＡの合成は６８〜７５℃程度で
行われる。耐熱性のＤＮＡ複製酵素であるＴａｑ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅはこれらのサイクルにおいても失活し
ない酵素であり、クレノーフラグメント（ｋｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ）等では不可能であった試験管内
（チューブ内）で連続してＤＮＡの変性、プライマーの
アニーリング（結合）、ＤＮＡの合成を繰り返し行うこ
とを可能とするものである。
【０００３】また、最近、ＰＣＲ用の耐熱性酵素として
２０ｋｂ以上のＤＮＡの増幅が可能となる酵素が開発さ
れ利用されてきている。しかし、この酵素を用いたＰＣ
Ｒ方法は、主として目的とする特定のＤＮＡを増幅する
ことを目的としており、多種多様なＤＮＡを一括して増
幅することは困難であった。他方、一度にいくつかのＤ
ＮＡを同時に増幅する試みもなされてはいるが、増幅す
るＤＮＡの種類は５種類程度までと少なく、また、増幅
しているＤＮＡの長さも１ｋｂ程度までである。また、
ＤＮＡの増幅を重ねると、短いＤＮＡが増幅されやすい
が、この点を克服することはほとんどなされていない。
２０ｋｂ以上のＤＮＡの増幅が可能となる酵素が開発さ
れ利用されてきている。しかし、この酵素を用いたＰＣ
Ｒ方法は、主として目的とする特定のＤＮＡを増幅する
ことを目的としており、多種多様なＤＮＡを一括して増
幅することは困難であった。他方、一度にいくつかのＤ
ＮＡを同時に増幅する試みもなされてはいるが、増幅す
るＤＮＡの種類は５種類程度までと少なく、また、増幅
しているＤＮＡの長さも１ｋｂ程度までである。また、
ＤＮＡの増幅を重ねると、短いＤＮＡが増幅されやすい
が、この点を克服することはほとんどなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、一度に
多種類のＤＮＡを同時に短い物から長いものまでを均一
に増幅するＤＮＡ増幅方法は開発がなされていない状況
であり、本発明は、ＤＮＡ増幅方法を開発することを課
題とする。及びそのために好適に用いられるアダプター
二本鎖ＤＮＡの開発を課題とする。より詳細には、ＰＣ
Ｒでは増幅すべきＤＮＡ（増幅されるＤＮＡ）をまずプ
ライマーとハイブリダイズさせるが、一度に多種多様な
ＤＮＡを同時に短い物から長いものまでを均一に増幅す
る場合において、全てのＤＮＡにハイブリダイズするプ
ライマーというのはないので、増幅されるＤＮＡにプラ
イマーを直接ハイブリダイズさせる方法にとらわれない
ＤＮＡ増幅方法を開発することを課題とする。
多種類のＤＮＡを同時に短い物から長いものまでを均一
に増幅するＤＮＡ増幅方法は開発がなされていない状況
であり、本発明は、ＤＮＡ増幅方法を開発することを課
題とする。及びそのために好適に用いられるアダプター
二本鎖ＤＮＡの開発を課題とする。より詳細には、ＰＣ
Ｒでは増幅すべきＤＮＡ（増幅されるＤＮＡ）をまずプ
ライマーとハイブリダイズさせるが、一度に多種多様な
ＤＮＡを同時に短い物から長いものまでを均一に増幅す
る場合において、全てのＤＮＡにハイブリダイズするプ
ライマーというのはないので、増幅されるＤＮＡにプラ
イマーを直接ハイブリダイズさせる方法にとらわれない
ＤＮＡ増幅方法を開発することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、増
幅されるＤＮＡにアダプターＤＮＡ（アダプター二本鎖
ＤＮＡと同意）を結合させ、該アダプターＤＮＡにハイ
ブリダイズするプライマーを用いる方法並びにアダプタ
ーＤＮＡ及びプライマーを開発した。さらに、本発明者
は、長鎖ＤＮＡを増幅するのに用いる酵素（長鎖ＤＮＡ
増幅酵素）、反応温度、反応サイクル、Ｍｇ2+濃度等の
ＰＣＲにおける操作条件や操作方法を検討した結果、前
記アダプターＤＮＡ及びプライマーを用いた多種類のＤ
ＮＡを同時に均一に増幅するＤＮＡ増幅方法を開発し
た。
幅されるＤＮＡにアダプターＤＮＡ（アダプター二本鎖
ＤＮＡと同意）を結合させ、該アダプターＤＮＡにハイ
ブリダイズするプライマーを用いる方法並びにアダプタ
ーＤＮＡ及びプライマーを開発した。さらに、本発明者
は、長鎖ＤＮＡを増幅するのに用いる酵素（長鎖ＤＮＡ
増幅酵素）、反応温度、反応サイクル、Ｍｇ2+濃度等の
ＰＣＲにおける操作条件や操作方法を検討した結果、前
記アダプターＤＮＡ及びプライマーを用いた多種類のＤ
ＮＡを同時に均一に増幅するＤＮＡ増幅方法を開発し
た。
【０００６】まず、本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの
態様を下記に挙げる。なお、本明細書で言う増幅される
ＤＮＡとはＰＣＲの最初に存在するＤＮＡであり、該Ｄ
ＮＡにアダプターが結合する。また、増幅されるＤＮＡ
とアダプターＤＮＡとが結合したものを本明細書では鋳
型ＤＮＡと言う。本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第
１態様は、下記及びの要件をみたすものである。 一方の末端で、アダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖
ＤＮＡのうちいずれか一方が、増幅されるＤＮＡ又は他
のアダプター二本鎖ＤＮＡに結合できないように突出し
ていること。 増幅されるＤＮＡに結合する側の末端では、該アダプ
ター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡのうち、当該末端
が５’末端に当たる一本鎖ＤＮＡがリン酸化されている
こと。この第１態様のアダプター二本鎖ＤＮＡの増幅さ
れるＤＮＡに結合する側の末端は、平滑又はアダプター
同士が結合せず且つ増幅されるＤＮＡに結合するような
突出のいずれでもよい。
態様を下記に挙げる。なお、本明細書で言う増幅される
ＤＮＡとはＰＣＲの最初に存在するＤＮＡであり、該Ｄ
ＮＡにアダプターが結合する。また、増幅されるＤＮＡ
とアダプターＤＮＡとが結合したものを本明細書では鋳
型ＤＮＡと言う。本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第
１態様は、下記及びの要件をみたすものである。 一方の末端で、アダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖
ＤＮＡのうちいずれか一方が、増幅されるＤＮＡ又は他
のアダプター二本鎖ＤＮＡに結合できないように突出し
ていること。 増幅されるＤＮＡに結合する側の末端では、該アダプ
ター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡのうち、当該末端
が５’末端に当たる一本鎖ＤＮＡがリン酸化されている
こと。この第１態様のアダプター二本鎖ＤＮＡの増幅さ
れるＤＮＡに結合する側の末端は、平滑又はアダプター
同士が結合せず且つ増幅されるＤＮＡに結合するような
突出のいずれでもよい。
【０００７】本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第２態
様は、上記及び並びに下記の要件をみたすもので
ある。 粘着末端を生成する制限酵素サイトを、増幅されるＤ
ＮＡに結合しない側の末端以外に含む。本発明のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡの第３態様は、上記及び並びに下
記の要件をみたすものである。 平滑末端を生成する制限酵素サイトを、増幅されるＤ
ＮＡに結合しない側の末端以外に含む。本発明のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡの第４態様は、上記及び並びに上
記及びの要件をみたすものである。本発明のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡの第５態様は、上記及び並びに下
記の要件をみたすものである。 ＥｃｏＲＩ又はＮｏｔＩのいずれか一方又は両方の制
限酵素サイトを、増幅されるＤＮＡに結合しない側の末
端以外に含む。本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第６
態様は、上記及び並びに下記の要件をみたすもの
である。 ＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを、増幅されるＤＮＡに結
合しない側の両末端以外に含む。。本発明のアダプター
二本鎖ＤＮＡの第７態様は、上記及び並びに下記
の要件をみたすものである。 ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶ制限酵素サイト
を、増幅されるＤＮＡに結合しない側の末端以外に含
む。
様は、上記及び並びに下記の要件をみたすもので
ある。 粘着末端を生成する制限酵素サイトを、増幅されるＤ
ＮＡに結合しない側の末端以外に含む。本発明のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡの第３態様は、上記及び並びに下
記の要件をみたすものである。 平滑末端を生成する制限酵素サイトを、増幅されるＤ
ＮＡに結合しない側の末端以外に含む。本発明のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡの第４態様は、上記及び並びに上
記及びの要件をみたすものである。本発明のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡの第５態様は、上記及び並びに下
記の要件をみたすものである。 ＥｃｏＲＩ又はＮｏｔＩのいずれか一方又は両方の制
限酵素サイトを、増幅されるＤＮＡに結合しない側の末
端以外に含む。本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第６
態様は、上記及び並びに下記の要件をみたすもの
である。 ＥｃｏＲＶ制限酵素サイトを、増幅されるＤＮＡに結
合しない側の両末端以外に含む。。本発明のアダプター
二本鎖ＤＮＡの第７態様は、上記及び並びに下記
の要件をみたすものである。 ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶ制限酵素サイト
を、増幅されるＤＮＡに結合しない側の末端以外に含
む。
【０００８】本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第８態
様は、下記の要件をみたすものである。 配列表の配列番号１に記載の配列である一本鎖ＤＮＡ
と、配列表の配列番号２に記載の配列でありその５’末
端をリン酸化した一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせ
たものである。
様は、下記の要件をみたすものである。 配列表の配列番号１に記載の配列である一本鎖ＤＮＡ
と、配列表の配列番号２に記載の配列でありその５’末
端をリン酸化した一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせ
たものである。
【０００９】本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡの第９態
様は、上記の各態様のアダプター二本鎖ＤＮＡを化学的
修飾又は酵素的修飾したものである。
様は、上記の各態様のアダプター二本鎖ＤＮＡを化学的
修飾又は酵素的修飾したものである。
【００１０】次に、本発明のプライマー一本鎖ＤＮＡの
態様は、上記の本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡを成す
一本鎖ＤＮＡのうち、増幅されるＤＮＡに結合しない側
の末端が５’末端に当たる一本鎖ＤＮＡの塩基配列を有
することである。例えば、上記第９態様のアダプター二
本鎖ＤＮＡに対しては、配列表の配列番号１の塩基配列
を有するものが、プライマー（プライマー一本鎖ＤＮＡ
と同意）となる。
態様は、上記の本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡを成す
一本鎖ＤＮＡのうち、増幅されるＤＮＡに結合しない側
の末端が５’末端に当たる一本鎖ＤＮＡの塩基配列を有
することである。例えば、上記第９態様のアダプター二
本鎖ＤＮＡに対しては、配列表の配列番号１の塩基配列
を有するものが、プライマー（プライマー一本鎖ＤＮＡ
と同意）となる。
【００１１】次に、本発明のＤＮＡ増幅方法の態様を下
記に挙げる。 上記本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡを増幅されるＤ
ＮＡと連結させる。 上記本発明のプライマー一本鎖ＤＮＡを用いる。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップである。本発明
のＤＮＡ増幅方法の第２の態様は、上記の、、及
び下記のの条件でＤＮＡ増幅反応を行うものである。 変異修飾能力が高い長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。
記に挙げる。 上記本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡを増幅されるＤ
ＮＡと連結させる。 上記本発明のプライマー一本鎖ＤＮＡを用いる。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップである。本発明
のＤＮＡ増幅方法の第２の態様は、上記の、、及
び下記のの条件でＤＮＡ増幅反応を行うものである。 変異修飾能力が高い長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のアダプターＤＮＡは、増
幅されるＤＮＡと、一方の末端でのみ結合できる。具体
的には、該アダプターＤＮＡを成す二本の一本鎖ＤＮＡ
のうち、増幅されるＤＮＡと結合する側の末端（結合側
末端）が５’端に当たる一本鎖ＤＮＡを該末端でリン酸
化しておくことにより、増幅されるＤＮＡの端に該アダ
プターが直接結合出来る。このアダプターＤＮＡの結合
側末端は、平滑であってもよく、アダプター同士が結合
せず且つ増幅されるＤＮＡと結合できるような突出であ
ってもよい。増幅されるＤＮＡの末端は、必要に応じて
修飾酵素により平滑化したり、制限酵素処理により該末
端を制限酵素サイトとして突出させることができるの
で、その操作に合わせて使用するアダプターＤＮＡの結
合側末端を選択すればよい。増幅されるＤＮＡを合成す
る場合には、該ＤＮＡの末端を、平滑、突出いずれにも
合成可能である。いずれか合成した方に合わせてアダプ
ターＤＮＡの結合末端を選択すればよい。
幅されるＤＮＡと、一方の末端でのみ結合できる。具体
的には、該アダプターＤＮＡを成す二本の一本鎖ＤＮＡ
のうち、増幅されるＤＮＡと結合する側の末端（結合側
末端）が５’端に当たる一本鎖ＤＮＡを該末端でリン酸
化しておくことにより、増幅されるＤＮＡの端に該アダ
プターが直接結合出来る。このアダプターＤＮＡの結合
側末端は、平滑であってもよく、アダプター同士が結合
せず且つ増幅されるＤＮＡと結合できるような突出であ
ってもよい。増幅されるＤＮＡの末端は、必要に応じて
修飾酵素により平滑化したり、制限酵素処理により該末
端を制限酵素サイトとして突出させることができるの
で、その操作に合わせて使用するアダプターＤＮＡの結
合側末端を選択すればよい。増幅されるＤＮＡを合成す
る場合には、該ＤＮＡの末端を、平滑、突出いずれにも
合成可能である。いずれか合成した方に合わせてアダプ
ターＤＮＡの結合末端を選択すればよい。
【００１３】また、該アダプターの他端（非結合側末
端）は、該アダプターＤＮＡを成す二本の一本鎖ＤＮＡ
のうちのいずれか一方が突出しており、増幅されるＤＮ
Ａ又は他のアダプター二本鎖末端と結合できない。この
突出については、増幅されるＤＮＡの末端が平滑である
場合は、アダプターＤＮＡの非結合側末端が単に突出し
ていればよい。増幅されるＤＮＡの末端が平滑でない場
合、すなわち酵素処理されている場合は、このＤＮＡの
末端は制限酵素サイトとなっているので、アダプターＤ
ＮＡの非結合側の末端が制限酵素サイトでないように突
出していればよい。アダプターＤＮＡ同士が結合しない
ようにするには、突出した一本鎖部分において、該一本
鎖同士がハイブリダイズしないようような配列であれば
よい。本発明のアダプターにより、増幅されるＤＮＡの
両端それぞれに、正確に一方向で一つだけアダプターを
結合させることが可能となる。またアダプター同士が幾
つもつながるようなことも起こらないため、正確にＰＣ
Ｒが出来るようになる。アダプター二本鎖ＤＮＡの長さ
は、それを成す一本鎖ＤＮＡのうち、増幅されるＤＮＡ
と結合しない末端で突出する方の長さが１６塩基以上の
ものが好ましい。実用上、該一本鎖ＤＮＡが２４塩基以
上のものが特に好ましい。また、該一本鎖ＤＮＡの長さ
の上限は特にないが、実用上４０塩基程度までのものが
好ましい。
端）は、該アダプターＤＮＡを成す二本の一本鎖ＤＮＡ
のうちのいずれか一方が突出しており、増幅されるＤＮ
Ａ又は他のアダプター二本鎖末端と結合できない。この
突出については、増幅されるＤＮＡの末端が平滑である
場合は、アダプターＤＮＡの非結合側末端が単に突出し
ていればよい。増幅されるＤＮＡの末端が平滑でない場
合、すなわち酵素処理されている場合は、このＤＮＡの
末端は制限酵素サイトとなっているので、アダプターＤ
ＮＡの非結合側の末端が制限酵素サイトでないように突
出していればよい。アダプターＤＮＡ同士が結合しない
ようにするには、突出した一本鎖部分において、該一本
鎖同士がハイブリダイズしないようような配列であれば
よい。本発明のアダプターにより、増幅されるＤＮＡの
両端それぞれに、正確に一方向で一つだけアダプターを
結合させることが可能となる。またアダプター同士が幾
つもつながるようなことも起こらないため、正確にＰＣ
Ｒが出来るようになる。アダプター二本鎖ＤＮＡの長さ
は、それを成す一本鎖ＤＮＡのうち、増幅されるＤＮＡ
と結合しない末端で突出する方の長さが１６塩基以上の
ものが好ましい。実用上、該一本鎖ＤＮＡが２４塩基以
上のものが特に好ましい。また、該一本鎖ＤＮＡの長さ
の上限は特にないが、実用上４０塩基程度までのものが
好ましい。
【００１４】また、本発明のアダプターＤＮＡは、その
塩基配列に、粘着末端を生成する制限酵素サイト又は平
滑末端を生成する制限酵素サイトのいずれか一方又は両
方を該アダプターＤＮＡの、増幅されるＤＮＡに結合し
ない側の末端以外に含んでいることが好ましい。ＰＣＲ
後、該制限酵素サイトで処理して、ベクターへのＤＮＡ
導入を行うことが容易になるからである。平滑末端は、
ベクターへのＤＮＡ導入時に導入部分の配列依存性がな
いため、どのようなベクターへもＤＮＡを容易に導入で
きる。したがって、平滑末端を生成する制限酵素サイト
により、どのようなベクターへもＤＮＡを容易に導入す
ることが可能である。平滑末端を生成する制限酵素サイ
トとして、ＥｃｏＲＶサイトが好適に使用可能である。
塩基配列に、粘着末端を生成する制限酵素サイト又は平
滑末端を生成する制限酵素サイトのいずれか一方又は両
方を該アダプターＤＮＡの、増幅されるＤＮＡに結合し
ない側の末端以外に含んでいることが好ましい。ＰＣＲ
後、該制限酵素サイトで処理して、ベクターへのＤＮＡ
導入を行うことが容易になるからである。平滑末端は、
ベクターへのＤＮＡ導入時に導入部分の配列依存性がな
いため、どのようなベクターへもＤＮＡを容易に導入で
きる。したがって、平滑末端を生成する制限酵素サイト
により、どのようなベクターへもＤＮＡを容易に導入す
ることが可能である。平滑末端を生成する制限酵素サイ
トとして、ＥｃｏＲＶサイトが好適に使用可能である。
【００１５】粘着末端は、平滑末端に比べ、ベクターへ
のＤＮＡの導入効率が数倍以上向上する。したがって、
粘着末端を生成する制限酵素サイトにより、どのような
ベクターについても、該ベクターへＤＮＡを導入を効率
よく行うことが可能である。実際にベクターに粘着末端
を有するＤＮＡを導入するに当たっては、必要に応じ
て、ベクターの末端と導入しようとするＤＮＡの末端の
制限酵素サイトとを揃える処理を行えばよい。ＥｃｏＲ
Ｉサイトは、最も汎用な粘着末端を生成する制限酵素サ
イトで、しかも市販のｃＤＮＡライブラリー用ベクター
の殆どがこのサイトで処理されているため、アダプター
二本鎖ＤＮＡがＥｃｏＲＩサイトを含んでいることによ
り、市販のｃＤＮＡライブラリー用ベクターの使用が可
能となり、増幅したＤＮＡのｃＤＮＡライブラリー化等
のＤＮＡ操作が容易となる。したがって、ＥｃｏＲＩサ
イトは好適に使用可能である。ＮｏｔＩサイトは、８塩
基認識の粘着末端を生成する制限酵素であるため、非常
に切断部位が少ない酵素である。このため、増幅したＤ
ＮＡをＮｏｔＩサイトで処理した場合、該ＤＮＡの内部
の配列の切断を最小限度にして該ＤＮＡに粘着末端を作
製できる。したがって、粘着末端を生成する制限酵素サ
イトとして、ＮｏｔＩサイトが好適に使用可能である。
のＤＮＡの導入効率が数倍以上向上する。したがって、
粘着末端を生成する制限酵素サイトにより、どのような
ベクターについても、該ベクターへＤＮＡを導入を効率
よく行うことが可能である。実際にベクターに粘着末端
を有するＤＮＡを導入するに当たっては、必要に応じ
て、ベクターの末端と導入しようとするＤＮＡの末端の
制限酵素サイトとを揃える処理を行えばよい。ＥｃｏＲ
Ｉサイトは、最も汎用な粘着末端を生成する制限酵素サ
イトで、しかも市販のｃＤＮＡライブラリー用ベクター
の殆どがこのサイトで処理されているため、アダプター
二本鎖ＤＮＡがＥｃｏＲＩサイトを含んでいることによ
り、市販のｃＤＮＡライブラリー用ベクターの使用が可
能となり、増幅したＤＮＡのｃＤＮＡライブラリー化等
のＤＮＡ操作が容易となる。したがって、ＥｃｏＲＩサ
イトは好適に使用可能である。ＮｏｔＩサイトは、８塩
基認識の粘着末端を生成する制限酵素であるため、非常
に切断部位が少ない酵素である。このため、増幅したＤ
ＮＡをＮｏｔＩサイトで処理した場合、該ＤＮＡの内部
の配列の切断を最小限度にして該ＤＮＡに粘着末端を作
製できる。したがって、粘着末端を生成する制限酵素サ
イトとして、ＮｏｔＩサイトが好適に使用可能である。
【００１６】制限酵素サイトは、上記以外にも使用する
ｃＤＮＡライブラリー用ベクターにより、適宜選択して
使用可能である。また、アダプターＤＮＡが有する制限
酵素サイトの数については、その長さに応じた範囲内で
特に限定がない。粘着末端を生成する制限酵素サイトと
平滑末端を生成する制限酵素サイトの両方を有するもの
が、好適に使用可能である。
ｃＤＮＡライブラリー用ベクターにより、適宜選択して
使用可能である。また、アダプターＤＮＡが有する制限
酵素サイトの数については、その長さに応じた範囲内で
特に限定がない。粘着末端を生成する制限酵素サイトと
平滑末端を生成する制限酵素サイトの両方を有するもの
が、好適に使用可能である。
【００１７】本発明のプライマー一本鎖ＤＮＡは、上記
の本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡ
のうち、増幅されるＤＮＡに結合しない側の末端が５’
末端に当たる一本鎖ＤＮＡの塩基配列を有する一本鎖Ｄ
ＮＡである。
の本発明のアダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡ
のうち、増幅されるＤＮＡに結合しない側の末端が５’
末端に当たる一本鎖ＤＮＡの塩基配列を有する一本鎖Ｄ
ＮＡである。
【００１８】本発明のアダプターＤＮＡ及びプライマー
ＤＮＡは、その由来を問わず、例えばＤＮＡ合成機で合
成されたものでもよく、また、細胞等より抽出したも
の、該抽出物を加工したものいずれでもよい。また、プ
ライマーの長さは、１６塩基以上のものが好ましい。実
用上、該一本鎖ＤＮＡが２４塩基以上のものが特に好ま
しい。
ＤＮＡは、その由来を問わず、例えばＤＮＡ合成機で合
成されたものでもよく、また、細胞等より抽出したも
の、該抽出物を加工したものいずれでもよい。また、プ
ライマーの長さは、１６塩基以上のものが好ましい。実
用上、該一本鎖ＤＮＡが２４塩基以上のものが特に好ま
しい。
【００１９】ところで、ＤＮＡを化学合成・酵素合成
（天然物の加工を含む）するときに、側鎖をメチル化す
ること、あるいはビオチン化すること、もしくはリン酸
基部分のＯをＳ置換すること等の化学的に修飾すること
はよく知られている。化学合成時に導入できる化学的修
飾として、例えば、１）ビオチン化、２）メチル化、
３）ジコクシゲニン化、４）脱リン酸化、５）蛍光標識
化（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドおよ
びその誘導体）、６）アミノ化、７）リン酸基のＳをＯ
に置換したＤＮＡ、ＲＮＡの合成が主として挙げられ
る。また、酵素的修飾としては、例えば、１）ビオチン
化、２）メチル化、３）ジコクシゲニン化、４）脱リン
酸化、５）蛍光標識化（フルオレセイン、ローダミン、
テキサスレッドおよびその誘導体）、６）酵素標識化
（アルカリフォスファターゼ）が主に挙げられる。した
がって、本発明のアダプターＤＮＡ及びプライマーＤＮ
Ａは、該化学的修飾又は酵素的修飾をされたＤＮＡをそ
の範囲に含むものである。
（天然物の加工を含む）するときに、側鎖をメチル化す
ること、あるいはビオチン化すること、もしくはリン酸
基部分のＯをＳ置換すること等の化学的に修飾すること
はよく知られている。化学合成時に導入できる化学的修
飾として、例えば、１）ビオチン化、２）メチル化、
３）ジコクシゲニン化、４）脱リン酸化、５）蛍光標識
化（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドおよ
びその誘導体）、６）アミノ化、７）リン酸基のＳをＯ
に置換したＤＮＡ、ＲＮＡの合成が主として挙げられ
る。また、酵素的修飾としては、例えば、１）ビオチン
化、２）メチル化、３）ジコクシゲニン化、４）脱リン
酸化、５）蛍光標識化（フルオレセイン、ローダミン、
テキサスレッドおよびその誘導体）、６）酵素標識化
（アルカリフォスファターゼ）が主に挙げられる。した
がって、本発明のアダプターＤＮＡ及びプライマーＤＮ
Ａは、該化学的修飾又は酵素的修飾をされたＤＮＡをそ
の範囲に含むものである。
【００２０】本発明のＤＮＡ増幅方法は、下記の条件の
ＰＣＲ方法を提供し、多種多様なＤＮＡを均一に増幅す
ることを可能とするものである。特に、従来困難であっ
た１ｋｂ以上の長いＤＮＡを含む多種多様なＤＮＡを同
時に均一に増幅することを可能とする。 本発明のアダプターＤＮＡを増幅されるＤＮＡと連結
する。 本発明のプライマーＤＮＡとして用いる。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップである。
ＰＣＲ方法を提供し、多種多様なＤＮＡを均一に増幅す
ることを可能とするものである。特に、従来困難であっ
た１ｋｂ以上の長いＤＮＡを含む多種多様なＤＮＡを同
時に均一に増幅することを可能とする。 本発明のアダプターＤＮＡを増幅されるＤＮＡと連結
する。 本発明のプライマーＤＮＡとして用いる。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いる。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップである。
【００２１】本発明で用いる長鎖ＤＮＡ増幅酵素は、特
に制限なく使用可能である。実施例で挙げた市販の長鎖
ＤＮＡ増幅酵素はいずれも好適に使用可能である。メー
カーにより若干の差違があり、実施例で示すように特に
パーキンエルマー社製のＴｔｈ ＸＬ（登録商標）が特
に好適に使用可能である。これは、該酵素が、変異修飾
能力が高いことを特長としていることに起因すると考え
られ、したがって変異修飾能力の高い酵素は特に好適に
使用可能であると言える。
に制限なく使用可能である。実施例で挙げた市販の長鎖
ＤＮＡ増幅酵素はいずれも好適に使用可能である。メー
カーにより若干の差違があり、実施例で示すように特に
パーキンエルマー社製のＴｔｈ ＸＬ（登録商標）が特
に好適に使用可能である。これは、該酵素が、変異修飾
能力が高いことを特長としていることに起因すると考え
られ、したがって変異修飾能力の高い酵素は特に好適に
使用可能であると言える。
【００２２】ＰＣＲのサイクルについては、９０℃以上
でのＤＮＡの変性→６８ないし７５℃でのアニーリング
及び伸長反応の２ステップのサイクルの繰り返しであれ
ばよい。伸長反応の反応時間は１０分以上でだんだん長
くしていくのが好ましい。また、上記のサイクルの繰り
返しは、２８回以上であることが好ましい。
でのＤＮＡの変性→６８ないし７５℃でのアニーリング
及び伸長反応の２ステップのサイクルの繰り返しであれ
ばよい。伸長反応の反応時間は１０分以上でだんだん長
くしていくのが好ましい。また、上記のサイクルの繰り
返しは、２８回以上であることが好ましい。
【００２３】また、伸長反応時の温度については、使用
する酵素によりＤＮＡ合成反応が進む温度であればよ
い。反応至適温度で伸長反応することが好ましい。多く
の酵素では、反応至適温度は約７０℃である。
する酵素によりＤＮＡ合成反応が進む温度であればよ
い。反応至適温度で伸長反応することが好ましい。多く
の酵素では、反応至適温度は約７０℃である。
【００２４】また、本発明のＤＮＡ増幅方法の特に望ま
しい態様は、下記のないしの条件でＤＮＡ増幅反応
を行うことである。 アダプター二本鎖ＤＮＡとして、配列表の配列番号１
に記載の配列である一本鎖ＤＮＡと、配列表の配列番号
２に記載の配列でありその５’末端をリン酸化した一本
鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを用いて増幅さ
れるＤＮＡと連結する。 プライマー一本鎖ＤＮＡとして、配列表の配列番号２
に記載の配列である一本鎖ＤＮＡを用いる。 Ｔｔｈ ＸＬをＤＮＡ増幅酵素として用いる。 ＰＣＲの反応を、ｈｏｔ ｓｔａｒｔとし、９４℃で
１分間反応させた後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１
０分間）のサイクルを１６回繰り返して反応させ、続い
て（９４℃で１５秒間→６８℃で１１分間）のサイクル
を４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→
６８℃で１２分間）のサイクルを４回繰り返し反応さ
せ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１３分間）の
サイクルを４回繰り返し反応させることにより行う。 以下の組成の反応液を、最初にｌｏｗ ｍｉｘ加え、
滅菌ワックスが固まった後ｕｐ ｍｉｘ１及びｕｐ ｍ
ｉｘ２を加えて用いる。 ｌｏｗ ｍｉｘ（最初に加える反応液） プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （２５ｍＭ） １．２μｌ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） １．６μｌ ３．３×反応緩衝液 ２．４μｌ 滅菌蒸留水 １．８μｌ 滅菌ワックス ｕｐ ｍｉｘ１（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） ３．３×反応緩衝液 ３．６μｌ 酵素（Ｔｔｈ ＸＬ（登録商標、パーキンエルマー社製）） ０．４μｌ ｕｐ ｍｉｘ２（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） 鋳型ＤＮＡ（１．６ｎｇ／μｌ） ２．０μｌ 滅菌蒸留水 ６．０μｌ
しい態様は、下記のないしの条件でＤＮＡ増幅反応
を行うことである。 アダプター二本鎖ＤＮＡとして、配列表の配列番号１
に記載の配列である一本鎖ＤＮＡと、配列表の配列番号
２に記載の配列でありその５’末端をリン酸化した一本
鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせたものを用いて増幅さ
れるＤＮＡと連結する。 プライマー一本鎖ＤＮＡとして、配列表の配列番号２
に記載の配列である一本鎖ＤＮＡを用いる。 Ｔｔｈ ＸＬをＤＮＡ増幅酵素として用いる。 ＰＣＲの反応を、ｈｏｔ ｓｔａｒｔとし、９４℃で
１分間反応させた後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１
０分間）のサイクルを１６回繰り返して反応させ、続い
て（９４℃で１５秒間→６８℃で１１分間）のサイクル
を４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→
６８℃で１２分間）のサイクルを４回繰り返し反応さ
せ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１３分間）の
サイクルを４回繰り返し反応させることにより行う。 以下の組成の反応液を、最初にｌｏｗ ｍｉｘ加え、
滅菌ワックスが固まった後ｕｐ ｍｉｘ１及びｕｐ ｍ
ｉｘ２を加えて用いる。 ｌｏｗ ｍｉｘ（最初に加える反応液） プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （２５ｍＭ） １．２μｌ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） １．６μｌ ３．３×反応緩衝液 ２．４μｌ 滅菌蒸留水 １．８μｌ 滅菌ワックス ｕｐ ｍｉｘ１（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） ３．３×反応緩衝液 ３．６μｌ 酵素（Ｔｔｈ ＸＬ（登録商標、パーキンエルマー社製）） ０．４μｌ ｕｐ ｍｉｘ２（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） 鋳型ＤＮＡ（１．６ｎｇ／μｌ） ２．０μｌ 滅菌蒸留水 ６．０μｌ
【００２５】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの例に限定されるものではない。 ＜実施例１＞アダプターＤＮＡの合成 １．以下の配列を有するＤＮＡを合成した。（ＢＥＸ社
での合成） 配列１ ５’ AGG AAT TCA GCG GCC GCA GAT ATC ３’ 配列２ ５’ GAT ATC TGC GGC CGC TGA ATT C ３’ また、これらのＤＮＡはＢＥＸ社にて簡易カートリッジ
にて精製を行った。なお、配列１は、配列表の配列番号
１に示す配列であり、配列２は配列表の配列番号２に示
す配列である。これらの配列はアニーリングさせると以
下の式（１）の形で二本鎖になる。 式（１） ５’ AGG AAT TCA GCG GCC GCA GAT ATC ３’ ３’ C TTA AGT CGC CGG CGT CTA TAG ５’ すなわち、配列１の５’末端が突出し、式（１）のアダ
プター二本鎖ＤＮＡは配列１の３’末端側でしか増幅さ
れるＤＮＡと結合できない。実際には、配列２の５’末
端をリン酸化しているので、このアダプターは、該リン
酸化部位で、増幅されるＤＮＡと結合する。また、この
アダプターＤＮＡの制限酵素サイトを図７に示す。
るが、本発明はこの例に限定されるものではない。 ＜実施例１＞アダプターＤＮＡの合成 １．以下の配列を有するＤＮＡを合成した。（ＢＥＸ社
での合成） 配列１ ５’ AGG AAT TCA GCG GCC GCA GAT ATC ３’ 配列２ ５’ GAT ATC TGC GGC CGC TGA ATT C ３’ また、これらのＤＮＡはＢＥＸ社にて簡易カートリッジ
にて精製を行った。なお、配列１は、配列表の配列番号
１に示す配列であり、配列２は配列表の配列番号２に示
す配列である。これらの配列はアニーリングさせると以
下の式（１）の形で二本鎖になる。 式（１） ５’ AGG AAT TCA GCG GCC GCA GAT ATC ３’ ３’ C TTA AGT CGC CGG CGT CTA TAG ５’ すなわち、配列１の５’末端が突出し、式（１）のアダ
プター二本鎖ＤＮＡは配列１の３’末端側でしか増幅さ
れるＤＮＡと結合できない。実際には、配列２の５’末
端をリン酸化しているので、このアダプターは、該リン
酸化部位で、増幅されるＤＮＡと結合する。また、この
アダプターＤＮＡの制限酵素サイトを図７に示す。
【００２６】２．配列２に関しては以下の条件で５’末
端のリン酸化を行った。 １０×ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（日本ジーン製） ５μｌ 配列２のＤＮＡ（２０ｐｍｏｌ／μｌ） ２５μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ ５μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ）（日本ジーン製） ３μｌ 滅菌水 １２μｌ 合計 ５０μｌ ３７℃で６０分間反応させ、その後７５℃で１０分間変
性を行った。 ３．２．でリン酸化した配列２のＤＮＡの溶液に、滅菌
水で２０ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列１のＤＮＡを２
５μｌ加え、９５℃で１０分間ボイルした後、６０分間
室温で放置し、二本鎖にハイブリダイズさせた。これを
アダプターＤＮＡとして以下に用いた。
端のリン酸化を行った。 １０×ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（日本ジーン製） ５μｌ 配列２のＤＮＡ（２０ｐｍｏｌ／μｌ） ２５μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ ５μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ）（日本ジーン製） ３μｌ 滅菌水 １２μｌ 合計 ５０μｌ ３７℃で６０分間反応させ、その後７５℃で１０分間変
性を行った。 ３．２．でリン酸化した配列２のＤＮＡの溶液に、滅菌
水で２０ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列１のＤＮＡを２
５μｌ加え、９５℃で１０分間ボイルした後、６０分間
室温で放置し、二本鎖にハイブリダイズさせた。これを
アダプターＤＮＡとして以下に用いた。
【００２７】＜実施例２＞ＰＣＲによる微量ＤＮＡの増
幅反応 １．増幅されるＤＮＡの作製 １）ＤＮＡの切断及び失活操作 （１）λＤＮＡ（日本ジーン製）１５μｇを以下の条件
で切断した。 λＤＮＡ １５μｇ １０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ２４μｌ（宝酒造製） ＳｔｙＩ（１０Ｕ／μｌ） ３μｌ（宝酒造製） 滅菌水 １９８μｌ 合計 ２４０μｌ ３７℃で８時間切断した。 （２）６５℃で１０分間失活操作を行った。その後滅菌
水で５０ｎｇ／μｌに調製した。
幅反応 １．増幅されるＤＮＡの作製 １）ＤＮＡの切断及び失活操作 （１）λＤＮＡ（日本ジーン製）１５μｇを以下の条件
で切断した。 λＤＮＡ １５μｇ １０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ２４μｌ（宝酒造製） ＳｔｙＩ（１０Ｕ／μｌ） ３μｌ（宝酒造製） 滅菌水 １９８μｌ 合計 ２４０μｌ ３７℃で８時間切断した。 （２）６５℃で１０分間失活操作を行った。その後滅菌
水で５０ｎｇ／μｌに調製した。
【００２８】２）．平滑末端化 １）で調製したＤＮＡを以下の条件で平滑末端化した。 増幅されるＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ） ２０μｌ ０．５ｍＭ ｄＮＴＰ １０μｌ １０×ｋｌｅｎｏｗ Ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（宝酒造製） ２μｌ 滅菌水 ５８μｌ 合計 １００μｌ ３０℃で３０分間反応させた後、６５℃で１５分間変性
操作を行った。
操作を行った。
【００２９】２．増幅されるＤＮＡとアダプターＤＮＡ
の結合 １．で作製した平滑化した増幅されるＤＮＡに実施例１
で作製したアダプターＤＮＡを日本ジーン製ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ ｐａｃｋを用いて連結した。連結条件は該ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ ｐａｃｋの説明書に従った。 平滑化した増幅されるＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ） ２０μｌ アダプターＤＮＡ（６．７ｐｍｏｌ／μｌ） ４．５μｌ ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）（日本ジーン製） ２μｌ ヘキサアミン塩化コバルト（２０ｍＭ）（日本ジーン製） ２μｌ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（２０ｍＭ）（日本ジーン製） ２μｌ １０×ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（日本ジーン製） ４μｌ 滅菌水 ３．５μｌ 合計 ３８μｌ １６℃でオーバーナイト反応させた後、フェノール／ク
ロロフォルム抽出を行い、回収した水相をＴＥ溶液で平
衡化されたＳ３００ ｓｐｕｎ ｃｌｕｍｎ（ファルマ
シア製）に取扱説明書に従った条件でかけて未反応のア
ダプターＤＮＡの除去を行った。その後、回収した溶出
液をＴＥ溶液にて１２５μｌに調製した（１．６ｎｇ／
μｌ）。
の結合 １．で作製した平滑化した増幅されるＤＮＡに実施例１
で作製したアダプターＤＮＡを日本ジーン製ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ ｐａｃｋを用いて連結した。連結条件は該ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ ｐａｃｋの説明書に従った。 平滑化した増幅されるＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ） ２０μｌ アダプターＤＮＡ（６．７ｐｍｏｌ／μｌ） ４．５μｌ ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）（日本ジーン製） ２μｌ ヘキサアミン塩化コバルト（２０ｍＭ）（日本ジーン製） ２μｌ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（２０ｍＭ）（日本ジーン製） ２μｌ １０×ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（日本ジーン製） ４μｌ 滅菌水 ３．５μｌ 合計 ３８μｌ １６℃でオーバーナイト反応させた後、フェノール／ク
ロロフォルム抽出を行い、回収した水相をＴＥ溶液で平
衡化されたＳ３００ ｓｐｕｎ ｃｌｕｍｎ（ファルマ
シア製）に取扱説明書に従った条件でかけて未反応のア
ダプターＤＮＡの除去を行った。その後、回収した溶出
液をＴＥ溶液にて１２５μｌに調製した（１．６ｎｇ／
μｌ）。
【００３０】３．ＰＣＲ ２．でアダプターを結合させた鋳型ＤＮＡを用いて、Ｐ
ＣＲによる微量ＤＮＡの増幅反応を行った。なお、伸長
反応時の温度は、プライマーのアニーリングと同時に反
応が進行する６８℃が好ましい。 １）酵素選択のための実験 ＰＣＲのための酵素は、Ｓｔｏｆｆｅｌ（登録商標、パ
ーキンエルマー製）、Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標、宝酒造
製）及びＴａｋａｒａ Ｔａｑ（登録商標、宝酒造製）
の３種類を用いた。ＳｔｏｆｆｅｌはＤＮＡ増幅に適し
た酵素であり、Ｅｘ Ｔａｑは長鎖ＤＮＡ増幅酵素であ
る。Ｔａｋａｒａ Ｔａｑは通常のＰＣＲに用いられる
酵素である。ＰＣＲに用いた反応液の組成を表１（Ａ）
及び（Ｂ）に示す。表中、チューブナンバーを除いて各
数値の単位はμｌである。プライマーは配列１のＤＮＡ
であり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂは反応緩衝液である。各
反応溶液を分注後、ミネラルオイルを重層し、ＰＣＲを
行った。チューブナンバー１ないし１６の反応液は下記
のサイクル１で反応させ、チューブナンバー１７ないし
２８の反応液は下記のサイクル２で反応させた。
ＣＲによる微量ＤＮＡの増幅反応を行った。なお、伸長
反応時の温度は、プライマーのアニーリングと同時に反
応が進行する６８℃が好ましい。 １）酵素選択のための実験 ＰＣＲのための酵素は、Ｓｔｏｆｆｅｌ（登録商標、パ
ーキンエルマー製）、Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標、宝酒造
製）及びＴａｋａｒａ Ｔａｑ（登録商標、宝酒造製）
の３種類を用いた。ＳｔｏｆｆｅｌはＤＮＡ増幅に適し
た酵素であり、Ｅｘ Ｔａｑは長鎖ＤＮＡ増幅酵素であ
る。Ｔａｋａｒａ Ｔａｑは通常のＰＣＲに用いられる
酵素である。ＰＣＲに用いた反応液の組成を表１（Ａ）
及び（Ｂ）に示す。表中、チューブナンバーを除いて各
数値の単位はμｌである。プライマーは配列１のＤＮＡ
であり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂは反応緩衝液である。各
反応溶液を分注後、ミネラルオイルを重層し、ＰＣＲを
行った。チューブナンバー１ないし１６の反応液は下記
のサイクル１で反応させ、チューブナンバー１７ないし
２８の反応液は下記のサイクル２で反応させた。
【表１】
【００３１】サイクル１：９４℃で５分間反応させた
後、（９４℃で１分間→５５℃で１分間→７２℃で１０
分間）のサイクルを３０回繰り返して反応させた。 サイクル２：９４℃で１分間反応させた後、（９８℃で
２０秒間→６８℃で１５分間）のサイクルを３０回繰り
返して反応させた。
後、（９４℃で１分間→５５℃で１分間→７２℃で１０
分間）のサイクルを３０回繰り返して反応させた。 サイクル２：９４℃で１分間反応させた後、（９８℃で
２０秒間→６８℃で１５分間）のサイクルを３０回繰り
返して反応させた。
【００３２】反応後、各反応液から５μｌの反応液をと
り、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析した。これ
を、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した。結果を
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示す。図中に示した各レー
ンの数字は、各反応液のチューブナンバーに対応してい
る。また、各レーンにおいて、各レーン中の各バンドの
現れ方が、マーカーのバンドの現れ方と似ているほど、
ＤＮＡ増幅がうまく行われていることを表す。この図か
ら、短いＤＮＡから長いＤＮＡまで均一に増幅させるた
めには、チューブナンバー１７ないし２０又は２２ない
し２７の条件で反応させるのが適していることが分か
る。これより、用いる酵素はＳｔｏｆｆｅｌ又はＥｘ
Ｔａｑを用いるのが適していること、すなわち、ＤＮＡ
増幅酵素又は長鎖ＤＮＡ増幅酵素が適していることが分
かる。特にＥｘ Ｔａｑすなわち、長鎖ＤＮＡ増幅酵素
が適していることが分かる。また、サイクル２で反応さ
せるのが適していること、すなわち、伸長反応をプライ
マーのアニリーングを同時に行うことができる６８℃で
１５分間行うのが適していることが分かる。
り、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析した。これ
を、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した。結果を
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示す。図中に示した各レー
ンの数字は、各反応液のチューブナンバーに対応してい
る。また、各レーンにおいて、各レーン中の各バンドの
現れ方が、マーカーのバンドの現れ方と似ているほど、
ＤＮＡ増幅がうまく行われていることを表す。この図か
ら、短いＤＮＡから長いＤＮＡまで均一に増幅させるた
めには、チューブナンバー１７ないし２０又は２２ない
し２７の条件で反応させるのが適していることが分か
る。これより、用いる酵素はＳｔｏｆｆｅｌ又はＥｘ
Ｔａｑを用いるのが適していること、すなわち、ＤＮＡ
増幅酵素又は長鎖ＤＮＡ増幅酵素が適していることが分
かる。特にＥｘ Ｔａｑすなわち、長鎖ＤＮＡ増幅酵素
が適していることが分かる。また、サイクル２で反応さ
せるのが適していること、すなわち、伸長反応をプライ
マーのアニリーングを同時に行うことができる６８℃で
１５分間行うのが適していることが分かる。
【００３３】２）酵素選択、均一増幅の条件設定のため
の実験 ＰＣＲのための酵素は、前出のＳｔｏｆｆｅｌ、Ｅｘ
Ｔａｑ及びＴｔｈ ＸＬ（登録商標、パーキンエルマー
製）の３種類を用いた。ＰＣＲに用いた反応液の組成を
表２及び表３に示す。表中、チューブナンバーを除いて
各数値の単位はμｌである。プライマーは配列１のＤＮ
Ａであり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂは反応緩衝液である。
チューブナンバー２９ないし３１の反応液は下記のサイ
クル３で反応させ、チューブナンバー３２ないし４４の
反応液は下記のサイクル４で反応させた。
の実験 ＰＣＲのための酵素は、前出のＳｔｏｆｆｅｌ、Ｅｘ
Ｔａｑ及びＴｔｈ ＸＬ（登録商標、パーキンエルマー
製）の３種類を用いた。ＰＣＲに用いた反応液の組成を
表２及び表３に示す。表中、チューブナンバーを除いて
各数値の単位はμｌである。プライマーは配列１のＤＮ
Ａであり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂは反応緩衝液である。
チューブナンバー２９ないし３１の反応液は下記のサイ
クル３で反応させ、チューブナンバー３２ないし４４の
反応液は下記のサイクル４で反応させた。
【表２】
【表３】
【００３４】サイクル３：９４℃で１分間反応させた
後、（９４℃で２０秒間→６８℃で１５分間）のサイク
ルを３０回繰り返して反応させた。 サイクル４：９４℃で１分間反応させた後、（９４℃で
１５秒間→６８℃で１０分間）のサイクルを１６回繰り
返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１
１分間）のサイクルを４回繰り返し反応させ、続いて
（９４℃で１５秒間→６８℃で１２分間）のサイクルを
４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６
８℃で１３分間）のサイクルを４回繰り返して反応させ
た。
後、（９４℃で２０秒間→６８℃で１５分間）のサイク
ルを３０回繰り返して反応させた。 サイクル４：９４℃で１分間反応させた後、（９４℃で
１５秒間→６８℃で１０分間）のサイクルを１６回繰り
返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１
１分間）のサイクルを４回繰り返し反応させ、続いて
（９４℃で１５秒間→６８℃で１２分間）のサイクルを
４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６
８℃で１３分間）のサイクルを４回繰り返して反応させ
た。
【００３５】なお、チューブナンバー３５ないし３９の
反応液についてはｈｏｔ ｓｔａｒｔとし、チューブナ
ンバー４０ないし４４の反応液については通常の方法で
反応を開始した。ｈｏｔ ｓｔａｒｔとは、まず、表３
の反応液中、ｌｏｗ ｍｉｘのみを反応液として分注
し、これに滅菌ワックス（使用したものはＡｍｐｌｉＷ
ａｘ（登録商標、パーキンエルマー社製））を加え、７
５℃で５分間、続いて４℃で１０分間置いた後、表３中
のｕｐ ｍｉｘ１及びｕｐ ｍｉｘ２を反応液として加
えて、ＰＣＲを行うものである。実際のＰＣＲでは装置
のブロックを予め９５℃にした後チューブをセットし反
応を開始させた。
反応液についてはｈｏｔ ｓｔａｒｔとし、チューブナ
ンバー４０ないし４４の反応液については通常の方法で
反応を開始した。ｈｏｔ ｓｔａｒｔとは、まず、表３
の反応液中、ｌｏｗ ｍｉｘのみを反応液として分注
し、これに滅菌ワックス（使用したものはＡｍｐｌｉＷ
ａｘ（登録商標、パーキンエルマー社製））を加え、７
５℃で５分間、続いて４℃で１０分間置いた後、表３中
のｕｐ ｍｉｘ１及びｕｐ ｍｉｘ２を反応液として加
えて、ＰＣＲを行うものである。実際のＰＣＲでは装置
のブロックを予め９５℃にした後チューブをセットし反
応を開始させた。
【００３６】反応後、各反応液から６μｌの反応液をと
り、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析した。これ
を、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した。結果を
図３に示す。図中に示した各レーンの数字は、各反応液
のチューブナンバーに対応している。また、各レーンに
おいて、各レーン中の各バンドの現れ方が、マーカーの
バンドの現れ方と似ているほど、ＤＮＡ増幅が均一に行
われており好ましいことを表す。
り、０．７％アガロースゲル電気泳動で分析した。これ
を、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した。結果を
図３に示す。図中に示した各レーンの数字は、各反応液
のチューブナンバーに対応している。また、各レーンに
おいて、各レーン中の各バンドの現れ方が、マーカーの
バンドの現れ方と似ているほど、ＤＮＡ増幅が均一に行
われており好ましいことを表す。
【００３７】この図から、以下のことが分かる。 チューブナンバー２９ないし３１に比しチューブナン
バー３２ないし３の方がＤＮＡが均一に増幅されている
こと。すなわち、サイクル４が好ましく、伸長反応時間
が順次長くなる方がよいこと。 チューブナンバー２９及び３２、チューブナンバー３
０、３１、３３及び３４、チューブナンバー３５ないし
４４の各群間では、順にＤＮＡ増幅がうまく行われてい
ると認められること。すなわち、使用する酵素は、Ｓｔ
ｏｆｆｅｌ＜ＥｘＴａｑ＜Ｔｔｈ ＸＬの順で各ＤＮＡ
増幅が均一に行われること。すなわち、長鎖ＤＮＡ増幅
酵素がより適していること。 チューブナンバー３０と３１の間又はチューブナンバ
ー３３と３４の間では、ＤＮＡの増幅に差が見られない
こと。すなわち、Ｅｘ Ｔａｑに関しては、酵素量によ
る差は見られないこと。 チューブナンバー３５及び３６とチューブナンバー３
７ないし３９の両群間又はチューブナンバー４０及び４
１とチューブナンバー４２ないし４４の両群間では、い
ずれも後者がＤＮＡ増幅がうまく行われていること。す
なわち、Ｍｇ2+濃度によりＤＮＡ増幅に変化が見られ、
１．１ないし１．５ｍＭの濃度で各ＤＮＡの増幅が均一
に行われること。したがって、ＤＮＡの均一な増幅のた
めには、Ｔｔｈ ＸＬを用いて、伸長反応時間を順次長
くし、Ｍｇ2+を適量加える条件が適していることが分か
る。
バー３２ないし３の方がＤＮＡが均一に増幅されている
こと。すなわち、サイクル４が好ましく、伸長反応時間
が順次長くなる方がよいこと。 チューブナンバー２９及び３２、チューブナンバー３
０、３１、３３及び３４、チューブナンバー３５ないし
４４の各群間では、順にＤＮＡ増幅がうまく行われてい
ると認められること。すなわち、使用する酵素は、Ｓｔ
ｏｆｆｅｌ＜ＥｘＴａｑ＜Ｔｔｈ ＸＬの順で各ＤＮＡ
増幅が均一に行われること。すなわち、長鎖ＤＮＡ増幅
酵素がより適していること。 チューブナンバー３０と３１の間又はチューブナンバ
ー３３と３４の間では、ＤＮＡの増幅に差が見られない
こと。すなわち、Ｅｘ Ｔａｑに関しては、酵素量によ
る差は見られないこと。 チューブナンバー３５及び３６とチューブナンバー３
７ないし３９の両群間又はチューブナンバー４０及び４
１とチューブナンバー４２ないし４４の両群間では、い
ずれも後者がＤＮＡ増幅がうまく行われていること。す
なわち、Ｍｇ2+濃度によりＤＮＡ増幅に変化が見られ、
１．１ないし１．５ｍＭの濃度で各ＤＮＡの増幅が均一
に行われること。したがって、ＤＮＡの均一な増幅のた
めには、Ｔｔｈ ＸＬを用いて、伸長反応時間を順次長
くし、Ｍｇ2+を適量加える条件が適していることが分か
る。
【００３８】３）反応最適化のための実験 ＰＣＲのための酵素は、Ｔｔｈ ＸＬを用いた。ＰＣＲ
に用いた反応液の組成を表４に示す。表中、チューブナ
ンバーを除いて各数値の単位はμｌである。プライマー
は配列１のＤＮＡであり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂは反応
緩衝液である。チューブナンバー４５ないし４８の反応
液は下記のサイクル５で反応させ、チューブナンバー４
９ないし５４の反応液は下記のサイクル６で反応させ
た。全てのサンプルについてｈｏｔ ｓｔａｒｔとし
た。実際のＰＣＲでは装置のブロックを予め９５℃にし
た後チューブをセットし反応を開始させた。
に用いた反応液の組成を表４に示す。表中、チューブナ
ンバーを除いて各数値の単位はμｌである。プライマー
は配列１のＤＮＡであり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂは反応
緩衝液である。チューブナンバー４５ないし４８の反応
液は下記のサイクル５で反応させ、チューブナンバー４
９ないし５４の反応液は下記のサイクル６で反応させ
た。全てのサンプルについてｈｏｔ ｓｔａｒｔとし
た。実際のＰＣＲでは装置のブロックを予め９５℃にし
た後チューブをセットし反応を開始させた。
【表４】
【００３９】サイクル５：９４℃で１分間反応させた
後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１０分間）のサイク
ルを１６回繰り返して反応させ、続いて（９４℃で１５
秒間→６８℃で１１分間）のサイクルを４回繰り返し反
応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１２分
間）のサイクルを４回繰り返し反応させ、続いて（９４
℃で１５秒間→６８℃で１３分間）のサイクルを４回繰
り返し反応させた。 サイクル６：９４℃で１分間反応させた後、（９４℃で
１５秒間→６８℃で１０分間）のサイクルを１６回繰り
返し反応させ、続いて２５℃で２０分間置き、続いて９
４℃で１分間反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６
８℃で１１分間）のサイクルを４回繰り返し反応させ、
続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１２分間）のサイ
クルを４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒
間→６８℃で１３分間）のサイクルを４回繰り返して反
応させた。
後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１０分間）のサイク
ルを１６回繰り返して反応させ、続いて（９４℃で１５
秒間→６８℃で１１分間）のサイクルを４回繰り返し反
応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１２分
間）のサイクルを４回繰り返し反応させ、続いて（９４
℃で１５秒間→６８℃で１３分間）のサイクルを４回繰
り返し反応させた。 サイクル６：９４℃で１分間反応させた後、（９４℃で
１５秒間→６８℃で１０分間）のサイクルを１６回繰り
返し反応させ、続いて２５℃で２０分間置き、続いて９
４℃で１分間反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→６
８℃で１１分間）のサイクルを４回繰り返し反応させ、
続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１２分間）のサイ
クルを４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒
間→６８℃で１３分間）のサイクルを４回繰り返して反
応させた。
【００４０】なお、チューブナンバー５３及び５４の反
応液については（９４℃で１５秒間→６８℃で１０分
間）のサイクルを１６回繰り返した後、Ａｍｐｌｉ ｗ
ａｘが固まった後であり且つ２５℃で放置中に下記の組
成の液を３．５μｌ加えて、続けて以降の反応をさせ
た。加えた液の各成分は、最初に加えたものと同じであ
る。 酵素液 ０．０７μｌ ３．３×Ｂ １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 ０．１５μｌ ｄＮＴＰ ０．２８μｌ プライマー ０．４μｌ ＳＰ １．６μｌ 合計 ３μｌ
応液については（９４℃で１５秒間→６８℃で１０分
間）のサイクルを１６回繰り返した後、Ａｍｐｌｉ ｗ
ａｘが固まった後であり且つ２５℃で放置中に下記の組
成の液を３．５μｌ加えて、続けて以降の反応をさせ
た。加えた液の各成分は、最初に加えたものと同じであ
る。 酵素液 ０．０７μｌ ３．３×Ｂ １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 ０．１５μｌ ｄＮＴＰ ０．２８μｌ プライマー ０．４μｌ ＳＰ １．６μｌ 合計 ３μｌ
【００４１】反応後、各反応液から１μｌずつ及び５μ
ｌずつ反応液を取り、それぞれ０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析した。これを、蛍光色素エチジウムブロ
マイドで染色した。反応液を１μｌずつ取った場合の結
果を図１に、また、反応液を５μｌずつ取った場合の結
果を図４に示す。図中に示した各レーンの数字は、各反
応液のチューブナンバーに対応している。また、各レー
ンにおいて、各レーン中の各バンドの現れ方が、マーカ
ーのバンドの現れ方と似ているほど、ＤＮＡ増幅がうま
く行われていることを表す。
ｌずつ反応液を取り、それぞれ０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析した。これを、蛍光色素エチジウムブロ
マイドで染色した。反応液を１μｌずつ取った場合の結
果を図１に、また、反応液を５μｌずつ取った場合の結
果を図４に示す。図中に示した各レーンの数字は、各反
応液のチューブナンバーに対応している。また、各レー
ンにおいて、各レーン中の各バンドの現れ方が、マーカ
ーのバンドの現れ方と似ているほど、ＤＮＡ増幅がうま
く行われていることを表す。
【００４２】これらの図から反応最適化のためには、チ
ューブナンバー４５又は４６の条件が適していること、
特にチューブナンバー４６の条件が適していることが分
かる。これより、以下のことが分かる。 チューブナンバー４５及び４６に比し、チューブナン
バー４７及び４８は短いＤＮＡがよく増幅されている。
すなわち、プライマー濃度が高いと、短いＤＮＡが増幅
量され易いこと。 Ｍｇ2+濃度は、１．１ｍＭよりも１．５ｍＭの方が、
各ＤＮＡを均一に増幅できること。すなわち、Ｍｇ2+濃
度によって各ＤＮＡの増幅量に差を生じ、１．５ｍＭの
方が好ましいこと。 チューブナンバー４５ないし４８とチューブナンバー
４９ないし５２の両群間での差はみられないこと。すな
わち、途中で反応を２０分間止めても、各ＤＮＡの増幅
量に明らかな差は生じないこと。 チューブナンバー５１及び５２とチューブナンバー５
３及び５４の両群間のでの差がみられないこと。すなわ
ち、途中で酵素を加えても、各ＤＮＡの増幅量に明らか
な差は生じないこと。
ューブナンバー４５又は４６の条件が適していること、
特にチューブナンバー４６の条件が適していることが分
かる。これより、以下のことが分かる。 チューブナンバー４５及び４６に比し、チューブナン
バー４７及び４８は短いＤＮＡがよく増幅されている。
すなわち、プライマー濃度が高いと、短いＤＮＡが増幅
量され易いこと。 Ｍｇ2+濃度は、１．１ｍＭよりも１．５ｍＭの方が、
各ＤＮＡを均一に増幅できること。すなわち、Ｍｇ2+濃
度によって各ＤＮＡの増幅量に差を生じ、１．５ｍＭの
方が好ましいこと。 チューブナンバー４５ないし４８とチューブナンバー
４９ないし５２の両群間での差はみられないこと。すな
わち、途中で反応を２０分間止めても、各ＤＮＡの増幅
量に明らかな差は生じないこと。 チューブナンバー５１及び５２とチューブナンバー５
３及び５４の両群間のでの差がみられないこと。すなわ
ち、途中で酵素を加えても、各ＤＮＡの増幅量に明らか
な差は生じないこと。
【００４３】すなわち、下記に示すチューブナンバー４
６の条件でＰＣＲを行えば、一度に多種多様なＤＮＡを
同時に短い物から長いものまでを均一に増幅することが
可能である。 アダプター二本鎖ＤＮＡとして、配列１の一本鎖ＤＮ
Ａと、配列２の５’末端をリン酸化した一本鎖ＤＮＡと
をハイブリダイズさせたものを用いて増幅されるＤＮＡ
と連結する。 プライマー一本鎖ＤＮＡとして、配列１の一本鎖ＤＮ
Ａを用いる。 Ｔｔｈ ＸＬをＤＮＡ増幅酵素として用いる。 ＰＣＲの反応を、ｈｏｔ ｓｔａｒｔとし、９４℃で
１分間反応させた後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１
０分間）のサイクルを１６回繰り返して反応させ、続い
て（９４℃で１５秒間→６８℃で１１分間）のサイクル
を４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→
６８℃で１２分間）のサイクルを４回繰り返し反応さ
せ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１３分間）の
サイクルを４回繰り返し反応させることにより行う。 以下の組成の反応液を用いる。 ｌｏｗ ｍｉｘ（最初に加える反応液） プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （２５ｍＭ） １．２μｌ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） １．６μｌ ３．３×反応緩衝液 ２．４μｌ 滅菌蒸留水 １．８μｌ 滅菌ワックス ｕｐ ｍｉｘ１（滅菌ワックスが固まってから加える反
応液） ３．３×反応緩衝液 ３．６μｌ 酵素（Ｔｔｈ ＸＬ） ０．４μｌ ｕｐ ｍｉｘ２（滅菌ワックスが固まってから加える反
応液） 鋳型ＤＮＡ（１．６ｎｇ／μｌ） ２．０μｌ 滅菌蒸留水 ６．０μｌ
６の条件でＰＣＲを行えば、一度に多種多様なＤＮＡを
同時に短い物から長いものまでを均一に増幅することが
可能である。 アダプター二本鎖ＤＮＡとして、配列１の一本鎖ＤＮ
Ａと、配列２の５’末端をリン酸化した一本鎖ＤＮＡと
をハイブリダイズさせたものを用いて増幅されるＤＮＡ
と連結する。 プライマー一本鎖ＤＮＡとして、配列１の一本鎖ＤＮ
Ａを用いる。 Ｔｔｈ ＸＬをＤＮＡ増幅酵素として用いる。 ＰＣＲの反応を、ｈｏｔ ｓｔａｒｔとし、９４℃で
１分間反応させた後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１
０分間）のサイクルを１６回繰り返して反応させ、続い
て（９４℃で１５秒間→６８℃で１１分間）のサイクル
を４回繰り返し反応させ、続いて（９４℃で１５秒間→
６８℃で１２分間）のサイクルを４回繰り返し反応さ
せ、続いて（９４℃で１５秒間→６８℃で１３分間）の
サイクルを４回繰り返し反応させることにより行う。 以下の組成の反応液を用いる。 ｌｏｗ ｍｉｘ（最初に加える反応液） プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） １．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （２５ｍＭ） １．２μｌ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） １．６μｌ ３．３×反応緩衝液 ２．４μｌ 滅菌蒸留水 １．８μｌ 滅菌ワックス ｕｐ ｍｉｘ１（滅菌ワックスが固まってから加える反
応液） ３．３×反応緩衝液 ３．６μｌ 酵素（Ｔｔｈ ＸＬ） ０．４μｌ ｕｐ ｍｉｘ２（滅菌ワックスが固まってから加える反
応液） 鋳型ＤＮＡ（１．６ｎｇ／μｌ） ２．０μｌ 滅菌蒸留水 ６．０μｌ
【００４４】＜実施例３＞プライマーの取り込みの確認 １．末端ラベル化プライマーの作製 ＰＣＲに用いるプライマーは、メガラベル（登録商標、
宝酒造製）を用いその説明書に基本的に従い、合成ＤＮ
Ａ（配列１）を末端放射能ラベル化したものを用いた。
末端放射能ラベル化は以下のように行った。 合成ＤＮＡ（配列１）（１９３ｐｍｏｌ／μｌ） ３μｌ γ−メガラベル32Ｐ ＡＴＰ（アマシャム製） ５μｌ １０×ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（キット添付品） １μｌ Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（キット添付品） １μｌ 上記組成の反応液を３７℃で ３０分間反応させた後、
７０℃で１０分間置き酵素反応を停止させ、滅菌蒸留水
で５ｐｍｏｌ／μｌにプライマー液を調製した。
宝酒造製）を用いその説明書に基本的に従い、合成ＤＮ
Ａ（配列１）を末端放射能ラベル化したものを用いた。
末端放射能ラベル化は以下のように行った。 合成ＤＮＡ（配列１）（１９３ｐｍｏｌ／μｌ） ３μｌ γ−メガラベル32Ｐ ＡＴＰ（アマシャム製） ５μｌ １０×ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（キット添付品） １μｌ Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（キット添付品） １μｌ 上記組成の反応液を３７℃で ３０分間反応させた後、
７０℃で１０分間置き酵素反応を停止させ、滅菌蒸留水
で５ｐｍｏｌ／μｌにプライマー液を調製した。
【００４５】２．ＰＣＲ １）このプライマー液を用いて、上述のサイクル１〜４
の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の各反応溶液を滅菌
水で１０倍希釈した後、各１μｌを４０Ｖ２時間０．７
％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー使用）に
かけ、その後１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、１０ｍ
Ｍ ピロリン酸ナトリウム溶液に２０分間浸し、その後
バイオラッド社のゲルドライアーモデル５８３を用いて
乾燥させた。 ２）この乾燥させたアガロースゲルをオートラジオグラ
フィーした。結果を図５に示す。図中各レーンの番号
は、ＰＣＲのサイクルの番号に対応している。結果よ
り、サイクル２の反応で約８ｋｂの部分までほぼ均一に
プライマーが取り込まれていることが判明した。このこ
とは従来では難しいとされていた複数の長さの異なるＤ
ＮＡ群の同時増幅において、ＤＮＡの長さに関わらず、
ほぼ均一に増幅が可能であることを示している。
の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の各反応溶液を滅菌
水で１０倍希釈した後、各１μｌを４０Ｖ２時間０．７
％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー使用）に
かけ、その後１０％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、１０ｍ
Ｍ ピロリン酸ナトリウム溶液に２０分間浸し、その後
バイオラッド社のゲルドライアーモデル５８３を用いて
乾燥させた。 ２）この乾燥させたアガロースゲルをオートラジオグラ
フィーした。結果を図５に示す。図中各レーンの番号
は、ＰＣＲのサイクルの番号に対応している。結果よ
り、サイクル２の反応で約８ｋｂの部分までほぼ均一に
プライマーが取り込まれていることが判明した。このこ
とは従来では難しいとされていた複数の長さの異なるＤ
ＮＡ群の同時増幅において、ＤＮＡの長さに関わらず、
ほぼ均一に増幅が可能であることを示している。
【００４６】＜実施例４＞ｃＤＮＡの増幅 １．ｃＤＮＡの合成 １）ＲＮＡの調製 全ＲＮＡは、『Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ』Ｖｏｌ．１５４（ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｉｎｃ．、１９８７年）ｐｐ３〜２８に記載の方法
を基として調製した。 （１）実際には、ラットより摘出した肝臓を３ｇを液体
窒素中で粉砕し、１００ｍｌの５．５Ｍ ＧＴＣ溶液
（グアニジンチオシアネート５．５ｍＭ、Ｎ−ラウロニ
ルサルコシン０．５％、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０）に加え、ポッター型ホモジナイザーでホモ
ジネートした。 （２）溶液を、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した
後、上清液をＳＷ２８スイングローター用遠心管（ベッ
クマン製）に加えておいた比重１．６ｇ／ｍｌのセシウ
ムトリフルオロ酢酸溶液（セシウムトリフルオロ酢酸
（ファルマシア製）５０％、１００ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０））１
２ｍｌに重層し、ＳＷ２８スイングローターを用いて２
５０００ｒｐｍ、２４時間、１５℃で分離を行った。
ｏｇｙ』Ｖｏｌ．１５４（ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ Ｉｎｃ．、１９８７年）ｐｐ３〜２８に記載の方法
を基として調製した。 （１）実際には、ラットより摘出した肝臓を３ｇを液体
窒素中で粉砕し、１００ｍｌの５．５Ｍ ＧＴＣ溶液
（グアニジンチオシアネート５．５ｍＭ、Ｎ−ラウロニ
ルサルコシン０．５％、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０）に加え、ポッター型ホモジナイザーでホモ
ジネートした。 （２）溶液を、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した
後、上清液をＳＷ２８スイングローター用遠心管（ベッ
クマン製）に加えておいた比重１．６ｇ／ｍｌのセシウ
ムトリフルオロ酢酸溶液（セシウムトリフルオロ酢酸
（ファルマシア製）５０％、１００ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．０））１
２ｍｌに重層し、ＳＷ２８スイングローターを用いて２
５０００ｒｐｍ、２４時間、１５℃で分離を行った。
【００４７】（３）沈殿物を、６００μｌの４Ｍ ＧＴ
Ｃ溶液に溶かし、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、溶液
部分を回収した。１Ｍ酢酸を１５μｌ、エタノール４５
０μｌを加え、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
し、沈殿を回収した。 （４）この沈殿を、適当量（約３ｍｌ）のＴＥ溶液（１
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶かし（溶けるまでＴＥ溶液を加えた）、１５０
００ｒｐｍで遠心分離し、溶液部分を回収した。 （５）溶液と同量のフェノール／クロロホルムを混合
し、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、溶液部分
を回収した。 （６）溶液に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）を加え、２．５倍量のエタノールを加え、−２
０℃で２０分間放置後、１５０００ｒｐｍで遠心分離
し、沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、適当
量のＴＥ溶液に溶かし、−８０℃で保存した。肝臓から
７ｍｇの全ＲＮＡが得られた。 （７）ｐｏｌｙＡ ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｄＴ
３０ ｓｕｐｅｒ（登録商標、日本ロッシュ製）を用い
て、取扱い説明書の通りに行った。用いた全ＲＮＡの量
は一回当たり１ｍｇで、ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｄＴ３０
ｓｕｐｅｒを７５０μｌを用いてｐｏｌｙＡ ＲＮＡの
精製を行った。１ｍｇの全ＲＮＡから約２０μｇのｐｏ
ｌｙＡ ＲＮＡが得られた。
Ｃ溶液に溶かし、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、溶液
部分を回収した。１Ｍ酢酸を１５μｌ、エタノール４５
０μｌを加え、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
し、沈殿を回収した。 （４）この沈殿を、適当量（約３ｍｌ）のＴＥ溶液（１
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）に溶かし（溶けるまでＴＥ溶液を加えた）、１５０
００ｒｐｍで遠心分離し、溶液部分を回収した。 （５）溶液と同量のフェノール／クロロホルムを混合
し、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、溶液部分
を回収した。 （６）溶液に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．２）を加え、２．５倍量のエタノールを加え、−２
０℃で２０分間放置後、１５０００ｒｐｍで遠心分離
し、沈殿を７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、適当
量のＴＥ溶液に溶かし、−８０℃で保存した。肝臓から
７ｍｇの全ＲＮＡが得られた。 （７）ｐｏｌｙＡ ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｄＴ
３０ ｓｕｐｅｒ（登録商標、日本ロッシュ製）を用い
て、取扱い説明書の通りに行った。用いた全ＲＮＡの量
は一回当たり１ｍｇで、ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｄＴ３０
ｓｕｐｅｒを７５０μｌを用いてｐｏｌｙＡ ＲＮＡの
精製を行った。１ｍｇの全ＲＮＡから約２０μｇのｐｏ
ｌｙＡ ＲＮＡが得られた。
【００４８】２）ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成は、ファルマシア社のｃＤＮＡ ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて、その取り扱い説明書に
従い行った。 （１）１）で得られたｐｏｌｙＡ ＲＮＡ ２μｇを用
いて、Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ及びＳｅｃ
ｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。酵素反応
は、キットのｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ処理まで
を行った後、取り扱い説明に記載のスパンカラム精製ま
でを行った。 （２）得られたｃＤＮＡ溶液に２．で作製したＰＣＲ用
アダプターを１８．８μｌ（６．７ｐｍｏｌ／μｌ）加
え、キットに添付されている、ＡＴＰ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ １μｌ及びＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ３μｌを
加え、１２℃で１６時間ライゲーション反応を行った。 （３）６５℃で１０分間置き酵素反応を失活させた後、
溶液に１００μｌのＰｈｅｎｏｌ／ＣＨＣｌ3溶液を加
え、撹拌した後、水溶液相を回収した。 （４）この溶液を、ＳＴＥ溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含むＴＥ溶液）で平衡化したスパンカラム（キット取
扱説明書に記載の方法にて平衡化）を用いて、キット取
り扱い説明書に記載の方法で精製を行った。溶出された
溶液をＳＴＥ溶液にて１５０μｌに調製した。この溶液
を以下のＰＣＲに使用した。
ｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて、その取り扱い説明書に
従い行った。 （１）１）で得られたｐｏｌｙＡ ＲＮＡ ２μｇを用
いて、Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ及びＳｅｃ
ｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。酵素反応
は、キットのｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ処理まで
を行った後、取り扱い説明に記載のスパンカラム精製ま
でを行った。 （２）得られたｃＤＮＡ溶液に２．で作製したＰＣＲ用
アダプターを１８．８μｌ（６．７ｐｍｏｌ／μｌ）加
え、キットに添付されている、ＡＴＰ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ １μｌ及びＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ３μｌを
加え、１２℃で１６時間ライゲーション反応を行った。 （３）６５℃で１０分間置き酵素反応を失活させた後、
溶液に１００μｌのＰｈｅｎｏｌ／ＣＨＣｌ3溶液を加
え、撹拌した後、水溶液相を回収した。 （４）この溶液を、ＳＴＥ溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含むＴＥ溶液）で平衡化したスパンカラム（キット取
扱説明書に記載の方法にて平衡化）を用いて、キット取
り扱い説明書に記載の方法で精製を行った。溶出された
溶液をＳＴＥ溶液にて１５０μｌに調製した。この溶液
を以下のＰＣＲに使用した。
【００４９】２．ｃＤＮＡのＰＣＲ ＰＣＲに用いた反応液の組成を表５に示す。表中、チュ
ーブナンバーを除いて各数値の単位はμｌである。プラ
イマーは配列１のＤＮＡであり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂ
は反応緩衝液である。チューブナンバー５５及び５６の
サンプルは、鋳型ＤＮＡとして実施例３の１．で作製し
たＤＮＡを用い、チューブナンバー５７ないし６３のサ
ンプルについては、鋳型ＤＮＡとして実施例４の１．で
作製したｃＤＮＡ（アダプターＤＮＡを結合させたも
の）を用いた。全てのサンプルについて反応液は下記の
サイクル７で反応させ、また、ｈｏｔ ｓｔａｒｔとし
た。実際のＰＣＲでは装置のブロックを予め９５℃にし
た後チューブをセットし反応を開始させた。
ーブナンバーを除いて各数値の単位はμｌである。プラ
イマーは配列１のＤＮＡであり、ＳＰは滅菌蒸留水、Ｂ
は反応緩衝液である。チューブナンバー５５及び５６の
サンプルは、鋳型ＤＮＡとして実施例３の１．で作製し
たＤＮＡを用い、チューブナンバー５７ないし６３のサ
ンプルについては、鋳型ＤＮＡとして実施例４の１．で
作製したｃＤＮＡ（アダプターＤＮＡを結合させたも
の）を用いた。全てのサンプルについて反応液は下記の
サイクル７で反応させ、また、ｈｏｔ ｓｔａｒｔとし
た。実際のＰＣＲでは装置のブロックを予め９５℃にし
た後チューブをセットし反応を開始させた。
【表５】
【００５０】サイクル７：９４℃で１分間反応させた
後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１０分間）のサイク
ルを１６回繰り返して反応させ、続いて（９４℃で１５
秒間→６８℃で１０分間＋各サイクルごとに１５秒増
加）のサイクルを１２回繰り返して反応させ、７２℃で
１０分間反応させ、４℃で放置した。反応終了後、各チ
ューブの反応液１μｌについて０．７％アガロース電気
泳動を行い、エチジウムブロマイド染色により検出を行
った。
後、（９４℃で１５秒間→６８℃で１０分間）のサイク
ルを１６回繰り返して反応させ、続いて（９４℃で１５
秒間→６８℃で１０分間＋各サイクルごとに１５秒増
加）のサイクルを１２回繰り返して反応させ、７２℃で
１０分間反応させ、４℃で放置した。反応終了後、各チ
ューブの反応液１μｌについて０．７％アガロース電気
泳動を行い、エチジウムブロマイド染色により検出を行
った。
【００５１】結果を図６に示す。図中、各レーンの番号
はサンプルのチューブナンバーに対応している。図から
分かるように、実施例１で作製したＤＮＡを増幅させた
ものでは２０ｋｂまでの増幅が認められ、これまでの実
験結果で増幅が確認されたＤＮＡよりも長いＤＮＡを増
幅することが達成された。また、ｃＤＮＡの増幅におい
ては、０．５ないし８ｋｂ程度までの連続的な増幅が確
認され、生体由来のｃＤＮＡライブラリーの増幅が可能
であることが確認された。
はサンプルのチューブナンバーに対応している。図から
分かるように、実施例１で作製したＤＮＡを増幅させた
ものでは２０ｋｂまでの増幅が認められ、これまでの実
験結果で増幅が確認されたＤＮＡよりも長いＤＮＡを増
幅することが達成された。また、ｃＤＮＡの増幅におい
ては、０．５ないし８ｋｂ程度までの連続的な増幅が確
認され、生体由来のｃＤＮＡライブラリーの増幅が可能
であることが確認された。
【００５２】
【発明の効果】本発明のアダプターＤＮＡにより、増幅
されるＤＮＡの両端それぞれに、正確に一方向で一つだ
け該アダプターＤＮＡを結合させることが可能となる。
またアダプター同士が幾つもつながることなく、正確に
ＰＣＲを行うことが可能となる。また、本発明のアダプ
ターＤＮＡにより、市販のｃＤＮＡライブラリー用ベク
ターの使用及び、どのようなベクターへもＤＮＡを容易
に且つ効率的に導入することが可能となる。従来、多種
多様なＤＮＡを同時に増幅する場合には、長くても１ｋ
ｂ程度までのＤＮＡしか均一に増幅できなかったが、本
発明により、より長いＤＮＡであっても均一に増幅でき
るという従来にない効果が得られる。一例として、０．
５ないし８ｋｂの長さのＤＮＡを同時に均一に増幅でき
る。また、本発明により、１ｋｂ以上のを多種多様なＤ
ＮＡ含む生体由来のｃＤＮＡライブラリーを同時に均一
に増幅することが可能となる。
されるＤＮＡの両端それぞれに、正確に一方向で一つだ
け該アダプターＤＮＡを結合させることが可能となる。
またアダプター同士が幾つもつながることなく、正確に
ＰＣＲを行うことが可能となる。また、本発明のアダプ
ターＤＮＡにより、市販のｃＤＮＡライブラリー用ベク
ターの使用及び、どのようなベクターへもＤＮＡを容易
に且つ効率的に導入することが可能となる。従来、多種
多様なＤＮＡを同時に増幅する場合には、長くても１ｋ
ｂ程度までのＤＮＡしか均一に増幅できなかったが、本
発明により、より長いＤＮＡであっても均一に増幅でき
るという従来にない効果が得られる。一例として、０．
５ないし８ｋｂの長さのＤＮＡを同時に均一に増幅でき
る。また、本発明により、１ｋｂ以上のを多種多様なＤ
ＮＡ含む生体由来のｃＤＮＡライブラリーを同時に均一
に増幅することが可能となる。
【００５３】
配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 AGG AAT TCA GCG GCC GCA GAT ATC 24
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 配列 GAT ATC TGC GGC CGC TGA ATT C 22
【図１】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
【図２】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
【図３】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
【図４】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図である。
【図５】末端をラベル化したプライマーを用いてＰＣＲ
後の各反応溶液を０．７％アガロースゲル電気泳動で分
析し、オートラジオグラフィーした結果表す図である。
後の各反応溶液を０．７％アガロースゲル電気泳動で分
析し、オートラジオグラフィーした結果表す図である。
【図６】ラット肝臓由来のｃＤＮＡについてＰＣＲを行
った後、各反応液を０．７％アガロースゲル電気泳動で
分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した結果
を表す図である。
った後、各反応液を０．７％アガロースゲル電気泳動で
分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した結果
を表す図である。
【図７】実施例２で作製したアダプターＤＮＡの制限酵
素サイトを示す図である。
素サイトを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年６月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
【図２】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
【図３】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
【図４】ＰＣＲ後の各反応液を０．７％アガロースゲル
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
電気泳動で分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染
色した結果を表す図面に代わる写真である。
【図５】末端をラベル化したプライマーを用いてＰＣＲ
後の各反応溶液を０．７％アガロースゲル電気泳動で分
析し、オートラジオグラフィーした結果を表す図面に代
わる写真である。
後の各反応溶液を０．７％アガロースゲル電気泳動で分
析し、オートラジオグラフィーした結果を表す図面に代
わる写真である。
【図６】ラット肝臓由来のｃＤＮＡについてＰＣＲを行
った後、各反応液を０．７％アガロースゲル電気泳動で
分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した結果
を表す図面に代わる写真である。
った後、各反応液を０．７％アガロースゲル電気泳動で
分析し、蛍光色素エチジウムブロマイドで染色した結果
を表す図面に代わる写真である。
【図７】実施例２で作製したアダプターＤＮＡの制限酵
素サイトを示す図である。
素サイトを示す図である。
Claims (12)
- 【請求項１】 下記の特徴を持つアダプター二本鎖ＤＮ
Ａ。 一方の末端で、該アダプター二本鎖ＤＮＡを成す一本
鎖ＤＮＡのうちいずれか一方が、増幅されるＤＮＡ又は
他のアダプター二本鎖ＤＮＡに結合できないように突出
していること。 増幅されるＤＮＡに結合する側の末端では、該アダプ
ター二本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡのうち当該末端が
５’末端に当たる一本鎖ＤＮＡがリン酸化されているこ
と。 - 【請求項２】 粘着末端を生成する制限酵素サイト又は
平滑末端を生成する制限酵素サイトを、増幅されるＤＮ
Ａに結合しない側の末端以外に含む請求項１に記載のア
ダプター二本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項３】 粘着末端を生成する制限酵素サイトと平
滑末端を生成する制限酵素サイトを合わせて３カ所以上
有する請求項２に記載のアダプター二本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項４】 粘着末端を生成する制限酵素サイトがＥ
ｃｏＲＩ又はＮｏｔＩであり、平滑末端を生成する制限
酵素サイトがＥｃｏＲＶである請求項３に記載のアダプ
ター二本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１に記載の配列である
一本鎖ＤＮＡと、配列表の配列番号２に記載の配列であ
りその５’末端をリン酸化した一本鎖ＤＮＡとをハイブ
リダイズさせたものであるアダプター二本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項６】 化学的修飾又は酵素的修飾したものであ
る請求項１ないし５のいずれか一項に記載のアダプター
二本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１ないし６に記載のアダプター二
本鎖ＤＮＡを成す一本鎖ＤＮＡのうち、増幅されるＤＮ
Ａに結合しない側の末端が５’末端に当たる一本鎖ＤＮ
Ａの塩基配列を有するプライマー一本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項８】 配列表の配列番号１の塩基配列を有する
プライマー一本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項９】 下記のないしの条件でＤＮＡ増幅反
応を行うことを特徴とするＤＮＡ増幅方法。 請求項１ないし６のいずれかに記載の二本鎖ＤＮＡを
アダプターＤＮＡとして用いて増幅されるＤＮＡと連結
すること。 請求項７又は８に記載の一本鎖ＤＮＡをプライマーと
して用いて鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせること。 長鎖ＤＮＡ増幅酵素を用いて伸長反応させること。 ＰＣＲのサイクルが二段階のステップであること。 - 【請求項１０】 長鎖ＤＮＡ増幅酵素が、変異修飾能力
が高いことを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ増幅方
法。 - 【請求項１１】 以下の組成の反応液を、最初にｌｏｗ
ｍｉｘ加え、滅菌ワックスが固まった後ｕｐ ｍｉｘ
１及びｕｐ ｍｉｘ２を加えて用いることを特徴とする
請求項９に記載のＤＮＡ増幅方法。 ｌｏｗ ｍｉｘ（最初に加える反応液） プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） ０．１〜１．０μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （２５ｍＭ） ０．８８〜１．２μｌ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） １．２〜１．６μｌ ３．３×反応緩衝液 ２．４μｌ 滅菌蒸留水で８μｌに調製する。 滅菌ワックス（上記に加える。） ｕｐ ｍｉｘ１（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） ３．３×反応緩衝液 ３．６μｌ 酵素（Ｔｔｈ ＸＬ（登録商標、パーキンエルマー社製）） ０．４μｌ ｕｐ ｍｉｘ２（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） 鋳型ＤＮＡ ２．０μｌ 滅菌蒸留水 ６．０μｌ - 【請求項１２】 反応液の組成が以下のものであること
を特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ増幅方法。 ｌｏｗ ｍｉｘ（最初に加える反応液） プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）2 （２５ｍＭ） １．２μｌ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） １．６μｌ ３．３×反応緩衝液 ２．４μｌ 滅菌蒸留水 １．８μｌ 滅菌ワックス ｕｐ ｍｉｘ１（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） ３．３×反応緩衝液 ３．６μｌ 酵素（Ｔｔｈ ＸＬ（登録商標、パーキンエルマー社製）） ０．４μｌ ｕｐ ｍｉｘ２（滅菌ワックスが固まってから加える反応液） 鋳型ＤＮＡ ２．０μｌ 滅菌蒸留水 ６．０μｌ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8045927A JPH09234074A (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | アダプター二本鎖ｄｎａ及びそれを用いたｄｎａ増幅方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8045927A JPH09234074A (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | アダプター二本鎖ｄｎａ及びそれを用いたｄｎａ増幅方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234074A true JPH09234074A (ja) | 1997-09-09 |
Family
ID=12732900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8045927A Pending JPH09234074A (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | アダプター二本鎖ｄｎａ及びそれを用いたｄｎａ増幅方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09234074A (ja) |
Cited By (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103007A1 (en) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Eisai C0. Ltd. | Method of uniformizing dna fragment contents and subtraction method |
| WO2003004703A1 (fr) * | 2001-07-02 | 2003-01-16 | Riken | Processus de production de matrice d'adn et processus de production de proteine dans un systeme de synthese de proteine sans cellule a l'aide du premier processus |
| US7994159B2 (en) | 2003-03-10 | 2011-08-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | c-Kit kinase inhibitor |
| US8226976B2 (en) | 2007-11-05 | 2012-07-24 | Riken | Method of using cell-free protein synthesis to produce a membrane protein |
| US8445232B2 (en) | 2004-11-17 | 2013-05-21 | Riken | Cell-free system for synthesis of proteins derived from cultured mammalian cells |
| US8603774B2 (en) | 2002-11-28 | 2013-12-10 | National Food Research Institute | Extract of E. coli cells having mutation in ribosomal protein S12, and method for producing protein in cell-free system using the extract |
| US8664355B2 (en) | 2004-11-19 | 2014-03-04 | Riken | Cell-free protein synthesis method with the use of linear template DNA and cell extract therefor |
| US8865737B2 (en) | 2006-08-28 | 2014-10-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer |
| US8952035B2 (en) | 2007-11-09 | 2015-02-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex |
| US8962655B2 (en) | 2007-01-29 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer |
| US8962650B2 (en) | 2011-04-18 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Therapeutic agent for tumor |
| US8969344B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US8969379B2 (en) | 2004-09-17 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions of 4-(3-chloro-4-(cyclopropylaminocarbonyl)aminophenoxy)-7=methoxy-6-quinolinecarboxide |
| US9006256B2 (en) | 2006-05-18 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for thyroid cancer |
| US9012458B2 (en) | 2010-06-25 | 2015-04-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination |
| US9334239B2 (en) | 2012-12-21 | 2016-05-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same |
| US9945862B2 (en) | 2011-06-03 | 2018-04-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US10259791B2 (en) | 2014-08-28 | 2019-04-16 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US10517861B2 (en) | 2013-05-14 | 2019-12-31 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US11090386B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-08-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for suppressing bitterness of quinoline derivative |
| US11369623B2 (en) | 2015-06-16 | 2022-06-28 | Prism Pharma Co., Ltd. | Anticancer combination of a CBP/catenin inhibitor and an immune checkpoint inhibitor |
| US11547705B2 (en) | 2015-03-04 | 2023-01-10 | Merck Sharp & Dohme Llc | Combination of a PD-1 antagonist and a VEGF-R/FGFR/RET tyrosine kinase inhibitor for treating cancer |
| US11618777B2 (en) | 2015-07-31 | 2023-04-04 | Shigeyuki Yokoyama | Method of manufacturing membrane protein and utilization thereof |
| US12220398B2 (en) | 2015-08-20 | 2025-02-11 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Tumor therapeutic agent |
| US12226409B2 (en) | 2017-05-16 | 2025-02-18 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Treatment of hepatocellular carcinoma |
| US12303505B2 (en) | 2017-02-08 | 2025-05-20 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Tumor-treating pharmaceutical composition |
| US12508313B2 (en) | 2009-08-19 | 2025-12-30 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Quinoline derivative-containing pharmaceutical composition |
-
1996
- 1996-03-04 JP JP8045927A patent/JPH09234074A/ja active Pending
Cited By (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103007A1 (en) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Eisai C0. Ltd. | Method of uniformizing dna fragment contents and subtraction method |
| WO2003004703A1 (fr) * | 2001-07-02 | 2003-01-16 | Riken | Processus de production de matrice d'adn et processus de production de proteine dans un systeme de synthese de proteine sans cellule a l'aide du premier processus |
| US7195895B2 (en) | 2001-07-02 | 2007-03-27 | Riken | Method of producing template DNA and method of producing protein in cell-free protein synthesis system using the same |
| US7846694B2 (en) | 2001-07-02 | 2010-12-07 | Riken | Process for producing template DNA and process for producing protein in cell-free protein synthesis system with the use of the same |
| US8603774B2 (en) | 2002-11-28 | 2013-12-10 | National Food Research Institute | Extract of E. coli cells having mutation in ribosomal protein S12, and method for producing protein in cell-free system using the extract |
| US7994159B2 (en) | 2003-03-10 | 2011-08-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | c-Kit kinase inhibitor |
| US9504746B2 (en) | 2004-09-17 | 2016-11-29 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions of 4-(3-chloro-4-(cyclopropylaminocarbonyl)aminophenoxy)-7-methoxy-6-quinolinecarboxamide |
| US8969379B2 (en) | 2004-09-17 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions of 4-(3-chloro-4-(cyclopropylaminocarbonyl)aminophenoxy)-7=methoxy-6-quinolinecarboxide |
| US8445232B2 (en) | 2004-11-17 | 2013-05-21 | Riken | Cell-free system for synthesis of proteins derived from cultured mammalian cells |
| US8664355B2 (en) | 2004-11-19 | 2014-03-04 | Riken | Cell-free protein synthesis method with the use of linear template DNA and cell extract therefor |
| US9006240B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US8969344B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US9006256B2 (en) | 2006-05-18 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for thyroid cancer |
| US8865737B2 (en) | 2006-08-28 | 2014-10-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer |
| US8962655B2 (en) | 2007-01-29 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer |
| US8226976B2 (en) | 2007-11-05 | 2012-07-24 | Riken | Method of using cell-free protein synthesis to produce a membrane protein |
| US8952035B2 (en) | 2007-11-09 | 2015-02-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex |
| US12508313B2 (en) | 2009-08-19 | 2025-12-30 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Quinoline derivative-containing pharmaceutical composition |
| US9012458B2 (en) | 2010-06-25 | 2015-04-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination |
| US8962650B2 (en) | 2011-04-18 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Therapeutic agent for tumor |
| US11598776B2 (en) | 2011-06-03 | 2023-03-07 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US9945862B2 (en) | 2011-06-03 | 2018-04-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US9334239B2 (en) | 2012-12-21 | 2016-05-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same |
| US10517861B2 (en) | 2013-05-14 | 2019-12-31 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US10407393B2 (en) | 2014-08-28 | 2019-09-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US11186547B2 (en) | 2014-08-28 | 2021-11-30 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US10822307B2 (en) | 2014-08-28 | 2020-11-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US10259791B2 (en) | 2014-08-28 | 2019-04-16 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US11090386B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-08-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for suppressing bitterness of quinoline derivative |
| US11547705B2 (en) | 2015-03-04 | 2023-01-10 | Merck Sharp & Dohme Llc | Combination of a PD-1 antagonist and a VEGF-R/FGFR/RET tyrosine kinase inhibitor for treating cancer |
| US12083112B2 (en) | 2015-03-04 | 2024-09-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of a PD-1 antagonist and a VEGFR/FGFR/RET tyrosine kinase inhibitor for treating cancer |
| US11369623B2 (en) | 2015-06-16 | 2022-06-28 | Prism Pharma Co., Ltd. | Anticancer combination of a CBP/catenin inhibitor and an immune checkpoint inhibitor |
| US11618777B2 (en) | 2015-07-31 | 2023-04-04 | Shigeyuki Yokoyama | Method of manufacturing membrane protein and utilization thereof |
| US12220398B2 (en) | 2015-08-20 | 2025-02-11 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Tumor therapeutic agent |
| US12303505B2 (en) | 2017-02-08 | 2025-05-20 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Tumor-treating pharmaceutical composition |
| US12226409B2 (en) | 2017-05-16 | 2025-02-18 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Treatment of hepatocellular carcinoma |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5487993A (en) | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids | |
| US20260117285A1 (en) | Compositions and methods for improving library enrichment | |
| US20260002198A1 (en) | Normalization of ngs library concentration | |
| JPH0670772A (ja) | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ | |
| WO1998038299A1 (en) | Single step assembly of multiple dna fragments | |
| CA2080305A1 (en) | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification | |
| AU2020410970B2 (en) | Method of amplifying mRNAs and for preparing full length mRNA libraries | |
| JP6876785B2 (ja) | 単分子配列決定のための一本鎖環状ｄｎａライブラリーを生成するための方法 | |
| AU2017265723A1 (en) | Method of amplifying circular dna | |
| EP4110914A1 (en) | Method and products for producing single stranded dna polynucleotides | |
| GB2700205A (en) | Base editing enzymes | |
| Sekiua et al. | The nucleotide sequence in the promoter region of the fene for an Escherichia coli tyrosine transfer ribonucleic acid. | |
| JPWO2002036822A1 (ja) | 核酸塩基配列決定方法 | |
| JPWO2002034907A1 (ja) | １本鎖核酸の合成方法 | |
| Gaastra et al. | Ligation of DNA with T4 DNA ligase | |
| EP3252168B1 (en) | Pcr primer linked to complementary nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence including mis-matched nucleotides and method for amplifying nucleic acid using same | |
| WO2024215891A1 (en) | Methods for nucleic acid labeling | |
| WO2017217444A1 (ja) | 二本鎖ｄｎａ末端の加工方法 | |
| CN113795594B (zh) | 核酸扩增和识别方法 | |
| WO2001004286A1 (fr) | PROCEDE DE CREATION D'UNE BANQUE D'ADNc PLEINE LONGUEUR | |
| JP2022519684A (ja) | 官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する方法及び産物 | |
| JPWO2018147070A1 (ja) | 所望の塩基配列を有するｄｎａ断片を製造する方法 | |
| JP3623791B1 (ja) | プライマー伸長法における非特異的ハイブリッド形成抑制法 | |
| TW202540416A (zh) | 建構標的核酸之多核苷酸庫的方法 | |
| CN119654454A (zh) | 用于下一代测序分析等的片段化及标签片段化方法 |