JPH09234100A

JPH09234100A - 核酸の検出方法

Info

Publication number: JPH09234100A
Application number: JP4265096A
Authority: JP
Inventors: Kojiro Kurisu; 浩二郎栗栖; Youtai Iwamoto; 容泰岩本
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 1997-09-09

Abstract

(57)【要約】【課題】従来のインサイチュー（in situ）ハイブリ
ダイゼーション法の問題を解消した、簡便で応用範囲の
広い核酸の検出方法を提供する。【解決手段】細胞または細胞下生物構造等の生物材料
内における一本鎖または二本鎖核酸中の標的配列の存在
を検出する方法であって、組織、細胞または細胞下生物
構造を薄膜支持体に転写、保持させる工程を含むことを
特徴とする核酸の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、核酸の検出方法、さら
に詳しくは、組織や細胞構造内の一本鎖または二本鎖の
核酸中に存在する標的配列の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の急速な遺伝子クローニング技術の
進歩は、数多くの遺伝子の単離とその解析に貢献し、生
物学的、医学的に重要な成果をもたらした。こうして得
られた遺伝子の機能や発現の制御機構を解明するため
に、現在では遺伝子の発現の状態を組織または細胞のレ
ベルで研究するための手法も開発されてきている。イン
サイチュー（in situ）ハイブリダイゼーション法（Ｉ
ＳＨ法）は、基本的な構造を維持したまま、膜の透過性
を高められた状態で固体支持体上に固定された検体生物
材料からの、例えば、組織、細胞または細胞下構造から
なる試料中に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡと、調べよう
とする目的遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ
プローブとのハイブリダイゼーションによって目的遺伝
子の存在を検出する方法である（例えば、特表平４−５
０２５５３号参照）。また、上記の試料中の目的遺伝子
の存在を目的遺伝子に特異的なプライマーを用いた核酸
増幅法、例えば、ＰＣＲ法によって検出することも可能
であり、この方法はインサイチューＰＣＲ法と呼ばれて
いる（特公平８−７３号参照）。これらの方法は、細胞
工学別冊９、脱アイソトープ実験プロトコール、ＤＩ
Ｇハイブリダイゼーション、第７章および第９章（１９
９４年３月２５日、株式会社秀潤社発行）にもまとめら
れている。これらの方法は遺伝子の存在またはその発現
状態に関する情報を組織、細胞レベルで得ることが可能
であり、生物学や医学の分野において広範に活用されて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ＩＳＨ法およびインサ
イチューＰＣＲ法による遺伝子の検出を行う場合には、
対象となる検体生物材料は支持体上に保持され、生存時
の構造を残した状態で固定されたものを試料として使用
する。通常、この支持体には検出時の試料の観察が容易
であるなどの理由からスライドガラスが用いられるが、
この場合の試料作製には煩雑な操作を要する。また、組
織切片を試料とする場合には、試料作製時および遺伝子
検出操作時に切片の剥離が起こりやすいという問題があ
り、特に、歯学領域で取り扱うことの多い脱灰標本にお
いてその危険が高い。さらに、切片の剥離は試料を高温
で処理した場合に起こりやすいことから、一般には試料
を高温（例えば、６５℃以上）で処理することは望まし
くない。しかし、その一方で不十分な熱処理は試料中の
核酸が十分に変性されないことに伴う検出感度の低下お
よびプローブまたはプライマーが試料中の核酸と非特異
的なアニーリングを起こすことによるバックグラウンド
の上昇を招く。このように、現在用いられているＩＳＨ
法およびインサイチューＰＣＲ法には、なお解決すべき
課題が残されている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】最近、タンパク質の免疫
組織化学的方法の一つとして凍結転移法（McGrath eta
l，Biotechniques，Vol．１１，pp．３５２−３６１，
１９９１）が開発されている。この方法は、凍結切片を
ニトロセルロース膜上で解凍しながら切片中のタンパク
質を膜上に転移した後、免疫化学的にタンパク質の検出
を行う方法である。この方法では膜の持つタンパク質吸
着の許容量が大きいこと、および未変性タンパク質を含
む試料が得られることから目的タンパクの検出を高感度
に行うことができる利点がある。また、通常の組織化学
的染色も可能であり、膜を透明化処理することで光学顕
微鏡を用いた観察も行うことができる。この方法はタン
パク質を対象としたものであるが、本発明者らは、サザ
ンおよびノーザンハイブリダイゼーション法の例に示さ
れるように核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）もニトロセルロース
膜に強く吸着することに着目し、ニトロセルロース膜の
ような薄膜支持体上に保持された試料を用いることによ
り、従来の問題点を克服した新たなＩＳＨ法およびイン
サイチューＰＣＲ法の開発が可能と考え、鋭意研究を重
ねた。その結果、薄膜支持体および凍結転移法を利用す
ることにより、ＩＳＨ法およびインサイチューＰＣＲ法
に適用可能な試料を、従来法に比べて簡便な操作で作製
できること、さらに、得られる実験結果が従来法よりも
優れていることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００５】すなわち、本発明は、検体における核酸中
の標的配列の存在を検出するに際し、検体を薄膜支持体
へ転写、保持させて試料を作製することを特徴とする核
酸の検出方法を提供するものである。また、本発明は、
かかる方法に使用するキットも提供するものである。

【０００６】本発明の核酸の検出方法は、特に、検体の
組織切片、細胞または細胞下生物構造等を、好ましくは
凍結転移法を応用して、薄膜支持体へ転移させて試料を
作製し、薄膜上で、好ましくはＩＳＨ法やインサイチュ
ーＰＣＲ法等により、試料中の標的配列の存在を検出す
ることにより特徴づけられる。これにより、本発明の方
法は、従来法の欠点を解消し、従来法よりも簡便な操作
で、より高感度で核酸やその断片の検出が可能になり、
基礎的研究の分野はもとより、臨床医学、歯学の分野で
も広く核酸の検出に応用できる。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の方法を適用する検体は、
特に限定するものではなく、例えば、一本鎖または二本
鎖核酸のごときポリヌクレオチドを含む、基礎的研究分
野、臨床医学分野、歯学分野等における各種の組織、細
胞等の生物材料が包含される。例えば、本発明の方法
は、基礎医学においては、骨格形成の機構を調べる場
合、発生中の動物胎仔の検体における、Ｉ型コラーゲン
遺伝子、ＩＩ型コラーゲン遺伝子、ＩＸ型コラーゲン遺
伝子、Ｘ型コラーゲン遺伝子、アグリカン遺伝子等の種
々のマトリックス（細胞外基質）遺伝子の発現の研究に
使用でき、また、臨床医学においては、生検材料におけ
る種々の疾患マーカーや腫瘍マーカー、ならびに癌遺伝
子などの遺伝子発現部位および発現レベル（量）の検討
に使用できる。

【０００８】薄膜支持体としては、ポリヌクレオチドに
対して親和性を有する可塑性の高分子薄膜、例えば、ニ
トロセルロース膜や、それと同等な性質を有する高分子
膜、例えば、ナイロン膜、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジ
フルオライド）膜等が挙げられ、とりわけ、サザンまた
はノーザンハイブリダイゼーション法やウエスタンブロ
ッティング法に使用されるようなニトロセルロース膜が
好適に使用できる。また、これらの高分子膜について
は、例えば、ドットブロット法のような自体公知の方法
によって、核酸およびタンパクの吸着能を調べることに
より、本発明の方法への使用に適するものであるかどう
かを調べることができる。薄膜支持体の使用により、検
体組織等を支持体に架橋結合させることができ、試料の
支持体からの剥離や、試料成分のロスが防止できる。ま
た、従来のＩＳＨ法で使用されるスライドガラスに比
し、検体試料の保持量を著しく増加でき、さらに、微量
のmＲＮＡの保持が可能となり、リボヌクレアーゼの不
動化により、ハイブリダイゼーション中のＲＮＡの分解
が起こりにくく、大きな切片の保持もよくなり、試料作
製がより容易になり、かつ高感度の検出が可能となる。

【０００９】試料の作製における、検体組織等の薄膜支
持体への転写、保持は、毛細管現象を利用したキャピラ
リーブロッティング（Tissue Printing，pp．１３９−
１５１，１９９２，Academic Press）のような、常法に
よって行うことができるが、本発明においては、特に、
凍結転移法によって行うことが好ましい。例えば、適宜
の大きさに切断した薄膜支持体を、１０分間程度、約９
０℃の蒸留水または塩溶液（例、０.１ＭＣaＣl₂溶
液）に浸漬し、風乾し、クリップ等でスライドガラス上
に固定する。ついで、凍結した検体切片を薄膜支持体上
で、ドライヤー等にて十分に乾燥させる。所望により、
自体公知の方法で紫外線架橋させてもよい。その後、固
定する。ついで、酵素処理（例、プロテイナーゼ処理
等）、洗浄、さらに必要に応じて再固定処理（例、４％
パラホルムアルデヒド処理）などの後処理をし、ドライ
ヤー等で乾燥し、検出操作に付す。

【００１０】試料中の標的配列の存在の検出には、自体
公知の方法によるハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法
に代表される核酸増幅法を使用することが可能である。
ＰＣＲ法としては、インサイチューＰＣＲ法が好まし
い。なお、同一検体より得られた材料をニトロセルロー
ス膜に移して目的の核酸を検出するノザン・ハイブリダ
イゼーションを、本発明のハイブリダイゼーションと同
じ条件で並行して行うことにより、非特異的反応を排除
する条件を容易に見いだすことができる。また、インサ
イチューＰＣＲ法では、薄膜支持体上で増幅したmＲＮ
Ａの拡散が最小限に抑えられるので、高い効率と検出感
度が得られ、さらに、微量にしか発現しない遺伝子の検
出も可能となる。

【００１１】ハイブリダイゼーション用のＲＮＡプロー
ブの作製は、自体公知の方法で行うことができ、例え
ば、ＩＩ型コラーゲン遺伝子を検出するためのジゴキシ
ゲニン（ＤＩＧ）標識されたＲＮＡプローブは、つぎの
ようにして作製した。J．Biol．Chem.，Vol．２５９，p
p．１３６６８−１３６７３（１９８９）に記載のラッ
トα１（ＩＩ）コラーゲンのＮ末端部分をコードするc
ＤＮＡを含むプラスミドpＲcol２を調製し、これをＰst
Ｉ消化して得られる約５５０bpのＤＮＡ断片をプラスミ
ドベクターpＧＥＭ（プロメガ社製）に導入した組換え
プラスミドp１３７７（α１ＩＩ）を作製した。このプ
ラスミド１μgを鋳型として含む２０μl反応液［４μl
の５倍濃度ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液、２μlのジチオ
トレイール（ＤＤＴ）、１μlのリボヌクレアーゼ・イ
ンヒビター（４０Ｕ／μl、プロメガ社製）、２μlのＤ
ＩＧＲＮＡラベリングミクスチャー（ベーリンガー・
マンハイム社製）、１μlのＲＮＡポリメラーゼ（２０
μg／μl、プロメガ社製）を含む］を調製した。ＲＮＡ
ポリメラーゼは転写産物としてアンチセンス側のＲＮＡ
が得られるものをＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼから選択して使用し、鋳型となるプ
ラスミドは使用したＲＮＡポリメラーゼによって認識さ
れない側のプロモーター配列と、挿入ＤＮＡ断片の間を
適当な制限酵素で切断し、直鎖状としたものを用いた。
この反応液を３７℃にて６０分間インキュベートした
後、反応液に２μlのＤＤＴ、１μlのリボヌクレアーゼ
・インヒビター、１μlのリボヌクレアーゼ・フリー・
デオキシリボヌクレアーゼ（５０Ｕ／μl、プロメガ社
製）を加え、さらに滅菌蒸留水を加えて全量を５０μl
とした。この反応液を３７℃にて１５分間インキュベー
トして反応液中鋳型ＤＮＡを分解した後、エタノール沈
澱（−８０℃、６０分間）を行って合成されたＤＩＧ標
識ＲＮＡプローブを回収し、５０μlのジエチルピロカ
ーボネート（ＤＥＰＣ）処理蒸留水に溶解してプローブ
溶液とした。

【００１２】Ｉ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型
コラーゲンおよびアグリカンの各遺伝子を検出するため
のプローブは、以下に示す文献記載の遺伝子をもとに、
上記と同様の操作を行って調製できる。Ｉ型コラーゲン：（α１（Ｉ）コラーゲンcＤＮＡ）：B
iochemistry，Vol．２３，pp．６２１０−６２１６（１
９８４）、ＩＸ型コラーゲン（α１（ＩＸ）コラーゲンcＤＮ
Ａ）：J．Bone Miner．Res.，Vol．８，pp．１３７７−
１３８７（１９９３）、Ｘ型コラーゲン（α１（Ｘ）コラーゲンＮＣ１ドメイン
cＤＮＡ）：Dev．Biol.，Vol．１７０，pp．３８７−３
９６（１９９５）、アグリカン（プラスミドpＲＣ１１挿入ＤＮＡ断片）：
J．Biol．Chem.，Vol．２６２，pp．１７７５７−１７
７６７（１９８７）。

【００１３】ＰＣＲ用のプライマーは、検出しようとす
る遺伝子の塩基配列をもとに、該配列またはその一部を
増幅できりるよう、任意に設計して使用することができ
る。その設計に当たり、特に制限はないが、鋳型ＤＮＡ
とプライマーとの融解温度（Ｔm値）が適当な温度とな
り、また、プライマー自体が分子内で二次構造を形成し
ないような配列を選ぶなど、一般的なプライマー設計上
の問題点を考慮することが望ましい。

【００１４】かくして、本発明の方法は、例えば、つぎ
のような工程で実施できる。方法１（１）薄膜支持体を適当な大きさに切る。支持体を９０
℃の蒸留水または０.１ＭＣaＣl₂溶液に１０分間浸漬
し、風乾し、使用時に支持体をクリップでスライドガラ
スに固定する。（２）支持体に検体の凍結切片を載せる。ドライヤー等
で完全に乾燥させる。（３）緩衝液で洗浄する。（４）室温で１０〜６０分間プロテイナーゼＫで処理す
る（pＨ８.０）。（５）４℃にて２０分間、緩衝液中、４％パラホルムア
ルデヒド（pＨ７.２）で処理して固定する。（６）室温にて０.２ＮＨＣlで１０分間処理する。（７）緩衝液で洗浄する。（８）室温にて、０.１Ｍトリエタノールアミン（pＨ
８.０）中、１０分間振盪処理する。（９）室温にて、０.１Ｍトリエタノールアミン（pＨ
８.０）、０.２５％無水酢酸で１０分間室温処理する。（１０）緩衝液で洗浄する。（１１）ドライヤー等で乾燥して試料を調製する。（１２）この支持体を適宜のサイズに切断し、チューブ
（エッペンドルフチューブ等）または密閉できるマルチ
・ウエル・プレート等に入れる。

【００１５】（１３）例えば、６５℃にて３時間以上プ
レハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液：５０％ホルムアミド、１０mＭトリス−Ｈ
Ｃl（pＨ７.６）、１mＭＥＤＴＡ、０.２％ＳＤＳ、１
×デンハルト（Denhardt）溶液、０.６ＭＮaＣl、１０
％デキストラン・サルフェート、２００μg／ml酵母t
ＲＮＡ。（１４）例えば、ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブについて、
６５℃にて一夜、ハイブリダイゼーションを行う。（１５）５０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ［１×Ｓ
ＣＣは０.１５ＭＮaＣl、０.０１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム（pＨ７.０）］で２０分間洗浄する操作を２回繰り
返す。（１６）１０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.６）、５００m
ＭＮaＣlおよび１mＭＥＤＴＡ（ＴＮＥ）で３７℃にて
１０分間処理する。（１７）ＴＮＥ中、リボヌクレアーゼＡ１０〜４０μg
／mlで３７℃にて１０〜３０分間処理する。（１８）ＴＮＥで３７℃にて５分間処理する。（１９）２×ＳＳＣで６０℃にて２０分間処理する。（２０）０.２×ＳＳＣで６０〜６５℃にて１５分間の
処理を２回繰り返す。（２１）ドライヤー等で乾燥する。（２２）アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体でＤ
ＩＧ標識プローブを検出する。

【００１６】このうち、工程（３）、（６）、（７）、
（８）、（９）および（１６）〜（１９）は省略可能で
あり、つぎのような簡略化した方法２を採用することが
できる。方法２（１）薄膜支持体を適当な大きさに切る。支持体を９０
℃の蒸留水または０.１ＭＣaＣl₂溶液に１０分間浸漬
し、風乾し、使用時に支持体をクリップでスライドガラ
スに固定する。（２）支持体に検体の凍結切片を載せる。ドライヤー等
で完全に乾燥させる。（３）室温で１０〜６０分間プロテイナーゼＫで処理す
る（pＨ８.０）。（４）４℃にて１０〜２０分間、緩衝液中、４％パラホ
ルムアルデヒド（pＨ７.２）で処理して固定する。（５）緩衝液で洗浄する。（６）ドライヤー等で乾燥して試料を調製する。（７）この支持体を適宜のサイズに切断し、チューブ
（エッペンドルフチューブ等）または密閉できるマルチ
・ウエル・プレート等に入れる。

【００１７】（８）例えば、６５℃にて３時間以上プレ
ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーショ
ン緩衝液：５０％ホルムアミド、１０mＭトリス−ＨＣ
l（pＨ７.６）、１mＭＥＤＴＡ、０.２％ＳＤＳ、１×
デンハルト（Denhardt）溶液、０.６ＭＮaＣl、１０％
デキストラン・サルフェート、２００μg／ml酵母tＲ
ＮＡ。（９）例えば、ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブについて、６
５℃にて一夜、ハイブリダイゼーションを行う。（１０）２×ＳＳＣ、ついで５０％ホルムアミドで６０
〜６５℃にて１５〜２０分間洗浄する操作を２回繰り返
す。（１１）０.２×ＳＳＣで６０〜６５℃にて１５分間の
処理を２回繰り返す。（１２）ドライヤー等で乾燥する。（１３）アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体でＤ
ＩＧ標識プローブを検出する。

【００１８】これに対し、従来のＩＳＨ法での工程は、
例えば、つぎの方法３のとおりであり、その工程は、い
ずれも省略できない。方法３（１）スライドガラスを中性洗剤で十分に（約６０分
間）洗浄する。１０分間水洗した後、１２０℃で２０分
間オートクレーブし、さらに、１０分間水洗し、つい
で、１８０℃で３時間乾熱する。その後、アセトン中、
２％アミノプロピルトリエトキシシランに１０秒間浸漬
し、ドライヤー等で完全に乾燥させる。（２）スライドガラスに検体の凍結切片を載せる。ドラ
イヤー等で完全に乾燥させる。（３）４℃にて２０分間、緩衝液中、４％パラホルムア
ルデヒド（pＨ７.２）で処理して固定する。（４）緩衝液で洗浄する。（５）室温で１０〜６０分間プロテイナーゼＫで処理す
る（pＨ８.０）。（６）緩衝液で洗浄する。（７）４℃にて５分間、緩衝液中、４％パラホルムアル
デヒド（pＨ７.２）で処理して固定する。（８）緩衝液で洗浄する。（９）室温にて０.２ＮＨＣlで１０分間処理する。（１０）緩衝液で洗浄する。（１１）室温にて、０.１Ｍトリエタノールアミン（pＨ
８.０）中、１０分間振盪処理する。（１２）室温にて、０.１Ｍトリエタノールアミン（pＨ
８.０）、０.２５％無水酢酸で１０分間室温処理する。（１３）緩衝液で洗浄する。（１４）ドライヤー等で乾燥して試料を調製する。

【００１９】（１５）スライドガラス上の切片を保持し
た部分に適当量のハイブリダイゼーション緩衝液を滴下
し、その上をパラフィルム等で覆って、４２〜５０℃で
３時間以上プレハイブリダイゼーションを行う。ハイブ
リダイゼーション緩衝液：５０％ホルムアミド、１０m
Ｍトリス−ＨＣl（pＨ７.６）、１mＭＥＤＴＡ、０.
２％ＳＤＳ、１×デンハルト（Denhardt）溶液、０.６
ＭＮaＣl、１０％デキストラン・サルフェート、２
００μg／ml酵母tＲＮＡ。（１６）例えば、ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブについて、
４２〜５０℃にて一夜、ハイブリダイゼーションを行
う。（１７）５０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣで５０℃
にて２０分間洗浄する操作を２回繰り返す。（１８）１０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.６）、５００m
ＭＮaＣlおよび１mＭＥＤＴＡ（ＴＮＥ）で３７℃にて
１０分間処理する。（１９）ＴＮＥ中、リボヌクレアーゼＡ１０〜４０μg
／mlで３７℃にて１０〜３０分間処理する。（２０）ＴＮＥで３７℃にて５分間処理する。（２１）２×ＳＳＣで５０℃にて２０分間処理する。（２２）０.２×ＳＳＣで５０℃にて１５分間の処理を
２回繰り返す。（２３）ドライヤー等で乾燥する。（２４）アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体でＤ
ＩＧ標識プローブを検出する。

【００２０】核酸増幅法にて検出を行う場合には、上記
と同様にして調製した試料について核酸増幅法を適用す
る。例えば、本発明に使用される核酸増幅法としては、
ＰＣＲ法の他、ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅する方
法（特開平２−５８６４号）や鎖置換増幅法（特公平７
−１１４７１８号）等の方法を使用できる。核酸増幅法
では、例えば、増幅に用いるプライマーを標識しておく
か、標識されたヌクレオチド三リン酸を反応液に加えて
増幅反応を行い、その後、使用した標識化合物に応じた
方法で増幅された核酸を検出することができる。

【００２１】また、本発明は上記の方法によって標的配
列の存在を検出するためのキットも提供する。該キット
は、必須の構成員として、本発明の方法に使用する薄膜
支持体を含むものであればいずれでもよく、例えば、検
体の種類、検出の目的等に応じて、これと、試料作製に
使用する固定用試薬、ハイブリダイゼーション用試薬、
ＰＣＲ用試薬、検出試薬等から選ばれる少なくとも１種
の試薬とを組み合わせてよい。また、これらの試薬は固
体でも、液体でもよい。

【００２２】

【実施例】つぎに、試験例および実施例を挙げて本発明
をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に
よって限定されるものではない。試験例１ポリＬ−リジンコートスライドガラス、シランコートス
ライドガラスおよびニトロセルロース膜への検体試料の
結合性の比較従来のＩＳＨ法ではスライドガラス上に生体試料を保持
する手段としてポリＬ−リジンコート（Huang，W．H.，
et al，（１９８３）Histochemistry，７７，２７５−
２７９）またはシランコート（Burns et al，（１９８
７）J．Clin．Pathol.，４０，８５８−８６４）が汎用
されている。これらをコートしたスライドガラスとニト
ロセルロース膜への検体試料の結合性を比較した。

【００２３】マウス１４日齢胎仔の後肢の凍結切片（５
μm厚）を、各々、ポリＬ−リジンコートスライドガラ
ス、シランコートスライドガラスまたは０.０５μm孔径
のニトロセルロース膜（ＢＡ８５−ＰＨ７５ニトロセル
ロースメンブレン、Ｓ＆Ｓ社製）上に載せ、ドライヤー
で乾燥させて切片を転写した後、５５℃、６５℃および
７５℃にて５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中で１２時
間インキュベートした。ついで、切片をニュークリア・
ファスト・レッドで染色し、試料（各１０切片）の剥離
状態を調べた。結果を表１に示す。結果は、各条件にお
いて、１０切片の試料中で剥離（完全剥離ないし７０％
以上剥離）したものの枚数で示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】表１に示すごとく、ニトロセルロース膜は
スライドガラスに比べて、切片の保持が著しく良好であ
り、より高い温度でハイブリダイゼーションを行えるこ
とが判明した。

【００２６】試験例２ＩＳＨ法の簡略化の検討従来のＩＳＨ法では、プローブの非特異的吸着によるバ
ックグラウンドのシグナルを減少させるために、上記方
法３に示すごとく、切片のＨＣl処理（前出、細胞工学
別冊９、第７章）、アセチレーシヨン（Hayashi et a
l，（１９７８）J．Histochem.，Cytochem.，２６
（８），pp．６７７−６７９）や、ハイブリダイゼーシ
ョン後のリボヌクレアーゼ処理（Takabayashi et al，
（１９９５）J．Cell Biol.，１２９（５），pp．１４
１１−１４１９）などを行っている。一方、ＲＮＡを電
気泳動した後に、ニトロセルロース膜やナイロン膜に転
写して、プローブとハイブリダイズさせることにより目
的とするmＲＮＡを検出するノーザンハイブリダイゼー
ション法では、高ストリンジェンシーでハイブリダイズ
および洗浄できるので、このような操作は不要である。
そこで、ニトロセルロース膜に転写した組織のＩＳＨに
おいて、これらの処理の必要性を検討した。

【００２７】上記方法１に従い、マウス１４日齢胎仔の
後肢芽の凍結切片（５μm厚）を０.０５μm孔径のニト
ロセルロース膜（ＢＡ８５−ＰＨ７５ニトロセルロース
メンブレン）に転写し、ＤＩＧ標識したラットＩＩ型コ
ラーゲンＲＮＡプローブ（０.１μg／ml）とハイブリダ
イズさせた。ただし、緩衝液としては、ＰＢＴ緩衝液
［０.１％ツゥイーン（Tween）２０を含む、０.１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ＮaＰＢ）、pＨ７.２］を用
い、アルカリホスファターゼ結合ＤＩＧ抗体と４−ニト
ロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）および５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩ
Ｐ）を用いてプローブを検出した。また、上記試料の作
製においては、Ａ：方法１における工程（６）のＨＣl
処理を実施しなかった場合、Ｂ：方法１における工程
（６）のＨＣl処理および工程（７）〜（９）のアセチ
レーションを実施しなかった場合、Ｃ：方法１における
工程（６）のＨＣl処理、工程（７）〜（９）のアセチ
レーションおよび工程（１６）〜（１９）のリボヌクレ
アーゼ処理を実施しなかった場合、Ｄ：方法１の全工程
を実施した場合の４通りの方法で試料を作製した。

【００２８】その結果、１時間の発色による検出で、Ａ
〜Ｄの全ての群で軟骨組織に強いシグナルが認められ
た。特に、リボヌクレアーゼ処理を実施しなかったＣで
は、１０分で十分なシグナルが得られた。また、いずれ
の群においても、バックグラウンドはほとんど認められ
なかった。したがって、本発明の方法では、従来必要と
されていたＨＣl処理、アセチレーションおよびリボヌ
クレアーゼ処理を行う必要がなく、ＩＳＨ法に要する時
間を短縮できることが判明した。

【００２９】試験例３ニトロセルロース膜を用いたＩＳＨ法におけるプローブ
の至適濃度の検討一般に、ＩＳＨ法において、ハイブリダイゼーションに
用いるプローブの濃度は、検出方法の成否を左右する重
要なファクターの１つである。プローブの濃度が低すぎ
ると、目的の遺伝子が検出できないことがあり、また、
多すぎると高いバックグラウンドシグナルのために特異
的シグナルが検出できなくなる。例えば、ＤＩＧ標識し
たＲＮＡプローブの場合、通常、０.１〜１μg／mlの濃
度で使用されるが、至適濃度は個々のプローブで相違
し、ハイブリダイゼーションの条件によっても変わる。
そこで、本発明の方法におけるＩＩ型コラーゲンＲＮＡ
プローブの至適濃度を検討した。

【００３０】試験例２のＣと同じ方法で、ただし、プロ
ーブの濃度を０.３μg／ml、０.１μg／ml、３０ng／m
l、１０ng／mlまたは３ng／mlとしてハイブリダイゼー
ションを行った。試料を洗浄後、アルカリホスファター
ゼ結合抗ＤＩＧ抗体と反応させ、ＮＢＴおよびＢＣＩＰ
で最大９時間反応させた。この時のバックグラウンドお
よびシグナルの強さを、２人の観察者が実体顕微鏡下で
観察して評価した。試料の観察は１０分おきに行い、明
らかなシグナルが得られた時間を計測した。結果を表２
に示す。表２中、バックグラウンドおよびシグナルの強
さの評価は、以下のとおりである。バックグラウンド＋＋＋：軟骨以外の組織全域に強い発色を認める。＋＋：軟骨以外の組織全域に発色を認める。＋：軟骨以外の一部の組織に発色を認める。 − ：発色を認めない。シグナル＋＋＋：軟骨組織全域に強い発色を認める。＋＋：軟骨組織全域に発色を認める。＋：一部の軟骨組織に発色を認める。 − ：発色を認めない。

【００３１】

【表２】

【００３２】表２に示すごとく、１０ng／ml〜０.１μg
／mlの広い範囲で特異的シグナルが観察できた。しか
し、０.３μg／ml以上の濃度では、長時間の反応により
バックグラウンドも上昇したところから、本発明の方法
におけるＩＩ型コラーゲンＲＮＡプローブの至適濃度は
３ng／ml〜１００ng／mlであると考えられる、この濃度
は従来法におけるこのプローブの至適濃度の１／１０〜
１／１００である。

【００３３】試験例４従来法と本発明の方法の検出感度の比較ラットアグリカンおよびＩＩ型コラーゲンのＤＩＧ標識
したＲＮＡプローブを用いて、従来法と、本発明の方法
の検出感度を比較した。シランコートしたスライドガラ
スまたは孔径０.０５μmのニトロセルロース膜に、１６
日齢のラット胎仔の顔面の凍結切片（８μm厚）または
後肢芽の凍結切片（８μm厚）を載せ、従来法は、上記
方法３により、また、本発明の方法は上記方法２により
ＩＳＨを行った。ただし、顔面由来の切片に対してはＩ
Ｉ型コラーゲンプローブ、後肢芽由来の切片に対しては
アグリカンプローブをそれぞれ使用し、緩衝液は試験例
２に示したとおりである。ついで、同一条件で発色を行
い、５分おきに観察を行ってＩＩ型コラーゲンおよびア
グリカンを発現する軟骨全域に明らかなシグナルが検出
された時間を測定した。結果を表３に示す。

【００３４】

【表３】

【００３５】表３から明らかなごとく、ＩＩ型コラーゲ
ンプローブ、アグリカンプローブのどちらの場合も、本
発明の方法では従来法に比べて短時間でシグナルが確認
できた。また、アグリカンプローブの場合には、発色か
ら８時間後の観察においても、本発明の方法で得られる
シグナルの方が従来法に比べて強かった。このように、
本発明の方法は、従来法より感度た高く、かつ必要とす
るプローブの量も少ないことが判明した。

【００３６】種々のプローブを用いた検討ラットＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラ
ーゲンおよびＸ型コラーゲンのＤＩＧ標識プローブを用
いて本発明の方法の有効性を検討した。試料としてマウ
ス１４日齢胎仔の後肢を用い、プローブは全て１００ng
／mlの濃度で用いて、上記方法２によりＩＳＨを行っ
た。この結果、Ｉ型コラーゲンについては、骨端軟骨以
外の組織全域、特に骨組織に強いシグナルが認められ、
ＩＩ型コラーゲンについては、軟骨組織のほぼ全域でシ
グナルが認められ、ＩＸ型コラーゲンについては、骨端
軟骨全域に特異的なシグナルが認められ、Ｘ型コラーゲ
ンについては、軟骨の中でも骨に近接した、いわゆる肥
大軟骨細胞層に強いシグナルが認められた。このように
各種のプローブで、それぞれ特異的なシグナルが得られ
たことは、本発明の方法が有効であることを示してい
る。

【００３７】実施例１ニトロセルロース膜への生体試料の転写０.０５μm孔径のニトロセルロース膜を適当な大きさに
切断した後、９０℃の蒸留水、または０.１ＭＣaＣl₂
溶液に１０分間浸した後、風乾した。使用時にクリップ
を用いてスライドグラスに固定した。生体試料として例
えば、生後４週令のラットの四肢をＯＣＴコンパウンド
に包埋し、８μm厚の凍結切片を作製した。作製した凍
結切片をニトロセルロース膜に載せた後、ドライヤーで
完全に乾燥させることで転写を完成させた。その後、１
０μg／mlプロテイナーゼＫで処理し、ＰＢＴ緩衝液
中、４％パラホルムアルデヒドで４℃、２０分再固定
した後、ハイブリダイゼーションに用いた。ＩＩ型コラーゲンのＩＳＨ調製した生体試料を転写したニトロセルロース膜を適当
な大きさに切断した後、チューブもしくは密閉できるマ
ルチ・ウエル・プレートに入れた。ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液（５０％ホルムアミド、１０mＭトリス−
ＨＣl、pＨ７.６、１mＭＥＤＴＡ、０.２％ＳＤＳ、
１×デンハルト液、０.６ＭＮaＣl、１０％デキストラ
ン・サルフェート、２００μg／ml酵母tＲＮＡ）を加え
て６５℃で３時間以上プレハイブリダイゼーションを行
った後、ジゴキシゲニン標識したＩＩ型コラーゲンのＲ
ＮＡプローブを加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳ
Ｃ、５０％ホルムアミドを用いて６０〜６５℃で洗浄を
行った。２０分の洗浄を２回行った後、さらに０.２×
ＳＳＣを用いて６０〜６５℃で１５分間２回洗浄を行っ
た。その後、アルカリホスファターゼ結合した抗ジゴキ
シゲニン抗体を反応させ、ＮＢＴおよびＢＣＩＰを用い
て発色を行い、検出を行った。本実験ではプローブ量を
従来法の１／５０量用い、検出時間１０分で低バックグ
ラウンドでかつ十分な強度のシグナルを得ることができ
た。また、６時間発色反応をさせたままでも、バックグ
ラウンドが高くなることはなかった。

【００３８】

【発明の効果】以上記載したごとく、本発明によれば、
従来のＩＳＨ法の問題を解消した、簡便で、高感度の応
用範囲の広い改良された核酸の検出方法が提供できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体における核酸中の標的配列の存在を
検出するに際し、検体を薄膜支持体へ転写、保持させて
試料を作製することを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項２】薄膜支持体が高分子膜である請求項１に
記載の方法。
【請求項３】薄膜支持体がニトロセルロース膜である
請求項２に記載の方法。
【請求項４】薄膜支持体がニトロセルロース膜と同等
な高分子膜である請求項２に記載の方法。
【請求項５】薄膜支持体への転写を凍結転移法によっ
て行う請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】標的配列の存在の検出をハイブリダイゼ
ーションによって行う請求項１〜５いずれか１項に記載
の方法。
【請求項７】標的配列の存在の検出を核酸増幅法によ
って行う請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】標的配列の存在の検出をＰＣＲ法によっ
て行う請求項７に記載の方法。
【請求項９】薄膜支持体を構成員としてなる請求項１
に記載の方法のための核酸検出用キット。