JPH09236580A - キャピラリー電気泳動用媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】キャピラリーに吸着しやすい試料の吸着を抑
え、分離能、再現性、信頼性を向上させるための、キャ
ピラリー電気泳動用媒体を提供する。 【解決手段】ポリビニルアミンを含むことを特徴とする
キャピラリー電気泳動用媒体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、キャピラリー電気
泳動法にて光学異性体、血清、タンパク質、アミノ酸、
糖、核酸等の分離・分析を行う際のキャピラリー内充填
液及び試料の調製液として用いるキャピラリー電気泳動
用媒体に関する。

【０００２】

【従来の技術】キャピラリー電気泳動法は、電気泳動を
直径２００μｍ以下の溶融シリカキャャピラリー内等の
ミクロな領域で行うために、従来から広く用いられてき
たスラブ電気泳動法等に比べ、ジュール熱、拡散及び対
流の発生が非常に小さい。したがって短時間で高分解能
の分離を行うことができ、さらに必要とされる試料も数
百ｎｌ以下と極少量であるため、光学異性体、血清、タ
ンパク質、アミノ酸、糖、核酸等の新しい分離・分析技
術として注目されている。

【０００３】また、これらの測定対象物を的確に分離す
るために、キャピラリー内部に、メチルセルロース（M.
Strege and A. Lagu, Anal. Chem., 63,1233(1991))、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（H. E. Schwartz
et al., J. Chromatogr., 559,267(1991))、アガロー
ス（P. Bocek and A. Chrambach, Electrophoresis, 1
2,1059(1991))等の水溶性高分子や界面活性剤等を添加
した緩衝液を用いることや、ポリアクリルアミド等のハ
イドロゲルを充填したキャピラリー（A. S. Cohen et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,9660(1988))を用
いることが広く行われている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしタンパク質の分
離・分析においては、キャピラリーの素材がシリカであ
るためキャピラリーの内壁に試料が吸着しやすく、分離
能、再現性が悪く信頼性に劣るという問題点がある。そ
こで、キャピラリーの内壁をシランカップリング−ポリ
アクリルアミドでコーティングしタンパク質等の吸着を
抑制する技術が提案されている。しかしこの方法では、
コーティング操作が煩雑であり、またシャープなピーク
を得るのに十分均一なコーティングを得ることが困難で
あるという問題がある。

【０００５】従って、本発明の目的は、キャピラリーに
吸着しやすい試料の吸着を抑え、分離能、再現性、信頼
性を向上させるための、キャピラリー電気泳動用媒体を
提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ポリビ
ニルアミンを含むことを特徴とするキャピラリー電気泳
動用媒体が提供される。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のキャピラリー電気泳動用
媒体は、ポリビニルアミンを含む。本発明でいうポリビ
ニルアミンとは、ビニルアミンが重合した下記一般式
（１）で表される重合単位（以下重合単位Ａと略す）を
含む重合体であり、下記一般式（２）で表される重合単
位（以下重合単位Ｂと略す）をも有する重合体であって
もよい。具体的にはポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）
の一部分又は全てを加水分解して得られる重合体を挙げ
ることができる。

【０００８】

【化１】

【０００９】Ｒはメチル基、エチル基、イソプロピル
基、又はｔ−ブチル基等のアルキル基を表す。ポリビニ
ルアミン中の重合単位Ａの数は、１０〜１００００が好
ましく、重合単位Ｂの数は０〜１００００が好ましい。

【００１０】重合単位Ｂを有する場合の重合単位Ｂの
数：重合単位Ａの数は１：０．０００１〜１：１０，０
００、好ましくは１：０．１〜１：１００、さらに好ま
しくは１：１〜１：１００である。

【００１１】前記ポリビニルアミンの分子量は、５００
〜１，０００，０００、好ましくは、１，０００〜５０
０，０００、特に好ましくは１００００〜１０００００
が望ましい。

【００１２】ポリビニルアミンは、例えば、まずＮ−ビ
ニルアセチルアミド、Ｎ−ビニルイソプロピルアミド等
のＮ−ビニルアルキルアミド類をラジカル重合、イオン
重合、光重合、放射線重合等の方法により重合して、ポ
リ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）を得、さらにこれらを
加水分解すること等により、容易に得ることができる。

【００１３】前記ラジカル重合は、水あるいはメタノー
ル、エタノール等のアルコール類、クロロホルム、塩化
メチレン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、アセトニトリル等の有機溶媒あるいは水とこれらの
有機溶媒との混合溶媒中で、脱気条件下、あるいは窒
素、アルゴン、二酸化炭素等の不活性ガス雰囲気下で、
ラジカル重合開始剤の存在下、−５０〜２００℃、好ま
しくは、０〜１２０℃で、１０分間〜２００時間、好ま
しくは、１〜２４時間反応させることによって行なうこ
とができる。

【００１４】ラジカル重合開始剤としては、１０時間半
減期温度が１６０℃以下のアゾ系化合物及び／又は有機
過酸化物を用いるのが好ましい。具体的には、アゾ系化
合物としては、２−シアノ−２−プロピルアゾホルムア
ミド、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カル
ボニトリル）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロ
パン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス（２−メチルブチ
ロニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリ
ル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニト
リル）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−
ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−
シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビスイソ酪酸ジメチ
ル、２，２’−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミ
ダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２’−
アゾビス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパ
ン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス（２−（２−イミダ
ゾリン−２−イル）プロパン）、２，２’−アゾビス
（２−メチル−Ｎ−（１，１−ビス（ヒドロキシメチ
ル）エチル）プロピオンアミド）、２，２’−アゾビス
（２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオ
ンアミド）、２，２’−アゾビスブチリルアミド二水和
物、２，２’−アゾビス（２−（ヒドロキシメチル）プ
ロピオニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４，４−
トリメチルペンタン）等が挙げられる。有機過酸化物と
しては、過酸化ベンゾイル、ジイソプロオイルオキシジ
カーボネート、ターシャリブチルペルオキシ−２−エチ
ルヘキサノエート、ターシャリブチルペルオキシピバレ
ート、ターシャリブチルペルオキシジイソブチレート、
過酸化ラウロイル、ｔ−ブチルペルオキシアセテート、
ターシャリペルオキシオクトエイト、ターシャリブチル
ペルオキシベンゾエイト等を挙げることができる。これ
らは混合物として用いることもできる。前記ラジカル重
合開始剤の使用量は、原料の重合性単量体１００重量部
に対し１０重量部以下が好ましく、特に５重量部以下が
望ましい。

【００１５】前記ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）の
加水分解は、触媒として塩酸、硫酸、トシル酸、陽イオ
ン交換樹脂等の酸触媒；アンモニア、トリエチルアミ
ン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナト
リウム、陰イオン交換樹脂等の塩基触媒等を用いて、
水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル等のアルコール類；アセトニトリル、テトラヒドロフ
ラン、１，４−ジオキサン等の有機溶媒あるいはこれら
の混合溶媒中で、０〜１２０℃、好ましくは２０〜１０
０℃で、１分間〜２００時間、好ましくは１０分間〜２
４時間反応させることにより行うことができる。また、
触媒にヒドラジンを用いて、５０〜１００℃、１〜４８
時間撹拌してもよい。また、（Ｃ₂Ｈ₅）₃Ｏ⁺ＢＦ₄ ^-をク
ロロホルム、塩化メチレン、ベンゼン等の有機溶媒中、
０〜６０℃で、３０分間〜６時間ポリ（Ｎ−ビニルアル
キルアミド）に作用させ、さらに炭酸水素ナトリウム等
の弱塩基を作用させることによっても行うことができ
る。

【００１６】本発明のキャピラリー電気泳動用媒体中の
ポリビニルアミンの含有量は、その分子量や加水分解率
により様々であり特に限定されないが、一般的には０．
０００１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１〜
０．１ｍｇ／ｍｌであることが望ましい。この範囲内で
添加量を変化させることにより所望の電気浸透流を得る
ことができる。

【００１７】本発明のキャピラリー電気泳動用媒体に含
まれるポリビニルアミン以外の成分としては、本発明の
効果を損なわない限り、キャピラリー電気泳動用媒体に
適用しうる各種緩衝液等を制限なく使用できる。一般的
には、ｐＨ１〜１２、好ましくは３〜１０のリン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸
緩衝液、トリス緩衝液等のｐＨ緩衝液を併せて用いるこ
とができる。また、デキストラン、ヒアルロン酸、ヒド
ロキシメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルアルコ
ール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン
等の合成高分子類等を含有してもよい。

【００１８】本発明のキャピラリー電気泳動用媒体を充
填するキャピラリーとしては、キャピラリー電気泳動用
あるいはガスクロマトグラフィー用に市販されているも
のを制限なく使用できる。前記キャピラリーの寸法とし
ては、内径が通常１〜２００μｍ、好ましくは５０〜１
００μｍ、長さが通常１ｃｍ〜１０ｍ、好ましくは１０
ｃｍ〜１ｍのものを好ましく使用することができる。長
さが１ｃｍ未満の場合、十分な分離が行えず、また１０
ｍを超える場合、分離に長時間が必要となるため好まし
くない。

【００１９】本発明のキャピラリー電気泳動用媒体の使
用方法としては、キャピラリー内及び電極槽及び試料槽
を該媒体で満たした後、従来から知られている操作・条
件によって電気泳動を行うことができる。

【００２０】前記電気泳動の際の電圧は、１〜３０ｋ
Ｖ、好ましくは５〜２０ｋＶであることが望ましい。試
料の注入方法としては、重力法、泳動法等従来から知ら
れている方法で行うことができる。また電気泳動の際の
温度は、特に管理する必要はないが、より高い再現性を
得るために恒温条件を保つことが好ましく、さらに分離
能の向上及び測定時間の短縮のために泳動中に昇温ある
いは降温してもよい。

【００２１】本発明のキャピラリー電気泳動用媒体を用
いて泳動することができる物質としては、水溶性あるい
は水分散性の物質であり、特に限定されないが、中で
も、優れた効果が発揮される物質としては、水性環境下
においてｐＫａの高い化合物、あるいはｐＩ値の高いタ
ンパク質等が挙げられる。これらｐＫａ又はｐＩの高い
物質は、従来の技術では、キャピラリー内壁が負に帯電
しているため吸着されやすく、測定結果における再現性
・信頼性が低下してしまっていた。

【００２２】

【発明の効果】本発明のキャピラリー電気泳動用媒体
は、ポリビニルアミンを含むので、キャピラリーに吸着
しやすく従来キャピラリー電気泳動による分離が困難で
あった試料についても、キャピラリー内壁への吸着を抑
制し、優れた再現性を与える。また、ポリビニルアミン
が被検試料と電気的相互作用、疎水的相互作用、水素結
合あるいは分子ふるい効果等の種々の相互作用を発現す
ることにより、優れた分離能をも与えることができる。
従って、信頼性の高い電気泳動を行うことができる。

【００２３】

【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２４】

【合成例１−１〜１−４】Ｎ−ビニルアセチルアミド
（以下ＮＶＡと略す）５ｇ（５８．８ｍｍｏｌ）を蒸留
水４５ｍｌに溶解し、これに表１に示す量のＶＡ−０４
４（商品名、和光純薬工業（株）製、２，２’−アゾビ
ス（２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン））
を加え、脱気封管した後、６０℃で２４時間重合させ
た。反応終了後、メタノール中に再沈殿しポリＮＶＡを
得た。ＧＰＣ（展開溶媒；ＴＨＦ、標準サンプル；ポリ
メチルメタクリレート）を用いて分子量を求めた。結果
を表１に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】

【合成例２−１〜２−４】合成例１−４で得られたポリ
ＮＶＡ（分子量１００，０００）３ｇを２Ｎ−ＨＣｌ水
溶液１００ｍｌに溶解し、加熱還流下、加水分解処理を
行った。表２に示す所定時間毎に２０ｍｌをサンプリン
グし、限外濾過の後、凍結乾燥し粉末状の試料を得た。
得られた試料の加水分解率を¹Ｈ−ＮＭＲより求めた。
結果を表２に示す。

【００２７】

【表２】

【００２８】

【合成例３−１〜３−３】合成例１−１〜１−３で得ら
れたポリＮＶＡ１ｇをそれぞれ２Ｎ−ＨＣｌ水溶液３０
ｍｌに溶解し、４０時間還流した。限外濾過の後、凍結
乾燥し粉末状のポリビニルアミンを得た。

【００２９】

【実施例１】合成例２−４で得られたポリビニルアミン
（分子量約５０，１００）を２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ３．７）に０．０１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解し、キ
ャピラリー電気泳動用媒体とした。この媒体を用い下記
の条件でキャピラリー電気泳動を行った。得られた結果
を図１に示す。なお、試料注入は、２５ｍＶで３秒間行
った。

【００３０】検体試料；リボヌクレアーゼ、ミオグロビ
ン、チトクロームＣ、リゾチームの混合物 泳動条件； 装置；日本分光（株）製 ＣＥ−９００ キャピラリー内径；１００μｍ キャピラリー外径；３７５μｍ キャピラリー長；６５ｃｍ 有効キャピラリー長；５０ｃｍ 印加電圧；２６ｋＶ（４００Ｖ／ｃｍ） 温度；３０±０．５℃ 検出器；ＵＶ（２００ｎｍ）

【００３１】

【比較例１】２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．７）のみ
を用い、実施例１と同様の条件でキャピラリー電気泳動
を行った。得られた結果を図１に併記する。

【００３２】

【比較例２】実施例１と同様にして、ただし合成例１−
４で得られたポリＮＶＡを用いてキャピラリー電気泳動
を行った。得られた結果を図１に併記する。

【００３３】以上の結果（図１）より、 １．従来の緩衝液のみでは検体（蛋白質）がキャピラリ
ー内壁に吸着してしまい、ピークは検出されなかった。
（比較例１）。 ２．ポリＮＶＡを用いた場合、検体の吸着は抑制される
ものの検体の分離は不十分であった。 ３．一方、本発明のポリビニルアミンを添加した系で
は、検体の吸着が抑制されると同時に、高い分離能も得
られた。ことが明らかである。

【００３４】

【参考例１】合成例１−４及び２−１〜２−４で得られ
たポリＮＶＡ又はポリビニルアミンを、それぞれ酢酸緩
衝液（２０ｍＭ，ｐＨ３．７）に０．１ｍｇ／ｍｌとな
るよう溶解し、測定マーカーに１％フェノール溶液を用
いて電気浸透流を測定した。結果を図２に示す。なお、
試料注入は、１０ｋＶで３秒間行った。図２に示される
ようにポリＮＶＡの加水分解率を変化させることで所望
の電気浸透流が得られることが明らかである。

【００３５】

【参考例２】合成例３−１〜３−３及び２−４で得られ
たポリビニルアミンを酢酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ３．
７）に、図中に示す種々の濃度で溶解したものを用い、
測定マーカーに１％フェノール溶液を用いて電気浸透流
を測定した。結果を図３に示す。図３に示されるように
ポリＮＶＡの濃度及び分子量を変化させることで所望の
電気浸透流が得られることが明らかである。

【００３６】

【参考例３】ｐＨ３．７及びｐＨ８．６の緩衝液に、合
成例２−３で得られたポリビニルアミンを図中に示す種
々の濃度で溶解したものについて、電気浸透流を測定し
た。結果を図４に示す。濃度が増加するにつれ電気浸透
流は減少し、ｐＨ３．７〜８．６の広い範囲で電気浸透
流を逆転させることができた。図４の結果から、濃度を
変化させることで所望の電気浸透流が得られることが明
らかである。

【００３７】参考例１〜３の結果から、本発明のキャピ
ラリー電気泳動用媒体を用いると、電気浸透流を所望の
値とすることができることが分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（ａ）、図１（ｂ）及び図１（ｃ）は、そ
れぞれ実施例１、比較例１及び比較例２でのキャピラリ
ー電気泳動チャートを示す図である。

【図２】図２は、参考例１の結果を示す図である。

【図３】図３は、参考例２の結果を示す図である。

【図４】図４は、参考例３の結果を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者 明石 満 鹿児島県鹿児島市皇徳寺台２−14−６ (72)発明者 岸田 晶夫 鹿児島県鹿児島市皇徳寺台３−８−２ (72)発明者 馬場 嘉信 兵庫県神戸市垂水区多聞１−１−18−402 (72)発明者 伊藤 健一 鹿児島県鹿児島市荒田２−45−16−301 (72)発明者 木村 志緒 鹿児島県鹿児島市唐湊３−３−１ (72)発明者 稲見 康彦 宮崎県宮崎市清武町大字船引631−１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリビニルアミンを含むことを特徴とす
   るキャピラリー電気泳動用媒体。