JPH09238690A - 殺虫性タンパク質を発現する遺伝子、該タンパク質の製法および使用法 - Google Patents

殺虫性タンパク質を発現する遺伝子、該タンパク質の製法および使用法

Info

Publication number
JPH09238690A
JPH09238690A JP8326045A JP32604596A JPH09238690A JP H09238690 A JPH09238690 A JP H09238690A JP 8326045 A JP8326045 A JP 8326045A JP 32604596 A JP32604596 A JP 32604596A JP H09238690 A JPH09238690 A JP H09238690A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
plant
protoplasts
dna
bacillus thuringiensis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8326045A
Other languages
English (en)
Inventor
Douglas Rice
ライス ダグラス
Nadine Carozzi
カロッチ ナダイン
Richard Lotstein
ロットスタイン リチャード
Steven Jay Rothstein
ジェイ ロススタイン スチーブン
Raymond Douglas Shillito
ダグラス シリトー レイモンド
Gleta Carswell
カースウエル グレタ
Christian Harms
ハームス クリスチャン
Cindy Grimmer Bowman
グリマー ボウマン シンディー
Yin Fu Chang
チャン イン−フー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27489482&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH09238690(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of JPH09238690A publication Critical patent/JPH09238690A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8278—Sulfonylurea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】バチルス スリンギエンシス(Bacillus thurin
giensis)により産生される結晶タンパク質である殺虫性
タンパク質を発現する遺伝子、該タンパク質の製法およ
び使用法の提供。 【解決手段】遺伝子のプロモーター、５’および３’非
翻訳領域が植物体または植物ウイルス遺伝子から誘導さ
れ、トウモロコシ植物体においてバチルス スリンギエ
ンシス結晶タンパク質の昆虫毒性を実質的に有するポリ
ペプチドを発現する遺伝子。上記ポリペプチドをトウモ
ロコシ内で製造する方法。上記ポリペプチドを植物内に
発現させてトウモロコシを有害生物から保護する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は殺虫性タンパク質を
発現する遺伝子、該タンパク質の製法および使用法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロトプラストからトウモロコシ植物体の再生 カルスからトウモロコシの再生に関する記載は１９７０
年代半ばから主として始まっている〔例えばGreen およ
びPhillips, Crop Sc., 15 (1975) 417-421; Harms等，
Z. pflanzenzuechtg., 77 (1976) 347-351; 欧州特許出
願EP-0160390，LoweおよびSmith (1985); EP-0176162,
Cheng (1985); およびEP-0177738，Close (1985)〕。ト
ウモロコシのプロトプラストの分裂および引き続く植物
体再生を獲得するための試みが１２年以上の期間にわた
り行われてきた〔Potrykus等，Cell Genetics in Highe
r Plants, Dudits等，Akademiai Kiado 発行，ブダペス
ト(1976) 129-140, およびその中の参考文献；Harms
等，"Maize and Cereal Protoplasts-Facts and Perspe
ctives" Maize for Biological Research, W. F. Sheri
dan 発行 (1982) ；Dale, Protoplasts (1983); Potryk
us等，Lecture Proceedings, Experientia Supplementu
m 46, Potrykus等，Birkhauser発行, バーゼル(1983) 3
1-41 およびそれらの中の参考文献〕。しかしながら、
トウモロコシのプロトプラストは、稔性の植物体を再生
させることのできない培養体のみ常に生じさせていた
〔Potrykus等，Mol. Gen. Genet. 156 (1977) 347-350;
Potrykus等，Theor. Appl. Genet., 59 (1981) 341-34
4; Vasil, Proc. 5th Int. Cong.Plant Tissue and Cel
l Culture, Fujiwara （編），東京 (1982) 101-104; I
mbrie-MilliganおよびHodges, Planta, 168, (1986) 39
5-401; VasilおよびVasil,Theor. Appl. Genet., 73 (1
987) 793-798 〕。しかしながら、これらの文献には稔
性の植物体を再生することのできるプロトプラストを製
造するための操作についての記載がない。そのようなプ
ロトプラストを製造するための能力は、例えば形質転換
または融合によるこの重要な作物の遺伝子操作を可能と
し、また価値のある新しい表現型の選択のための出発材
料としてのプロトプラストの使用を可能にするであろ
う。
【０００３】トウモロコシの遺伝的形質転換には非常に
興味があったが、非再生性カルスの回収を導くトウモロ
コシプロトプラストの形質転換の記載があったけれども
〔Fromm 等, Nature, 319 (1986) 791-793〕、再生され
る形質転換された植物体に導き得る成功した試験管内で
の方法に関する記載はなかった。遺伝子導入トウモロコ
シを製造するための一つの方法は、完全に稔性の植物体
に再生できるプロトプラストを安定に形質転換するため
の方法を発見することであろう。しかしながら、完全に
稔性の植物体へ分化できるトウモロコシプロトプラスト
を製造するための方法の記載は見出されなかった。
【０００４】この目的およびその他の目的は、分裂しカ
ルスコロニーを形成し得るトウモロコシプロトプラスト
を製造するための方法を発見することにより本発明に従
って達成された。プロトプラストは形質転換され得、そ
してカルスは稔性のトウモロコシ植物体を再生すること
ができる。分裂しカルスを形成し得るトウモロコシのプ
ロトプラストを製造するための方法は、次いで完全に稔
性の植物体に再生されるように導入され得、特別なタイ
プのカルスを要求する。そのようなカルスおよびそれを
製造する、および同定する方法は記載されており、そし
て本発明の一部とみなされる。
【０００５】特別なタイプのカルスは、細胞懸濁液を開
始するために使用され、これもまた本発明の一部とみな
される。これらの細胞懸濁液は継代培養（副次培養）に
おいて、プロトプラストを分離するために使用され得る
懸濁液を生じる。これらのプロトプラストは分裂しそし
てカルスを形成し得、次いで植物体を再生するように導
入され得る。細胞分裂またはカルス形成はある種の薬
剤、例えばＯ−低級アルカノイルサリチル酸（Ｏ−アセ
チルサリチル酸およびその類似体）、植物生長調節剤ま
たはＤＭＳＯの存在により、またはこれらの薬剤の組合
せにより促進される。
【０００６】プロトプラスト誘導トウモロコシ細胞から
培養での植物再生は、体細胞雑種形成の施用、ソマクロ
ーナル変異を介して改良されたトウモロコシ変種の製造
および新規トウモロコシ植物体、植物変種、新しい表現
型の特徴を有する栽培品種または同系繁殖体を製造する
ことにおける遺伝子工学の使用のために不可欠である。
【０００７】殺虫性トウモロコシ植物体 バチルス・スリンギエンシス（以後、Ｂｔと略す）は、
デルタエンドトキシンとして記載されもする結晶タンパ
ク質を産生する細菌の一種である。この結晶タンパク質
は技術的には、鱗翅目、甲虫目および双翅目昆虫の幼虫
により摂取されて毒素に変換されるプロトキシンであ
る。
【０００８】Ｂｔからの結晶タンパク質は、ヒト、その
他の哺乳類、鳥類、魚類または鱗翅目、甲虫目および双
翅目昆虫の幼虫以外の昆虫には有害効果が知られていな
い潜在的に重要な殺虫剤である。Ｂｔ毒素の有効性は極
端に高く、その結果、感受性昆虫の幼虫を殺すにはナノ
グラム量必要なだけである。殺虫剤としてＢｔからの結
晶タンパク質を使用するその他の利点は、鱗翅目、甲虫
目および双翅目昆虫の幼虫に対する有効性の広いスペク
トル、およびそのような幼虫が結晶タンパク質に対して
耐性を発現することの明らかな困難さを含む。前記幼虫
は農業および林業、そして特にトウモロコシ栽培におい
て大きな問題である。
【０００９】結晶タンパク質は、鱗翅目、甲虫目および
双翅目昆虫の幼虫の侵入に晒されている植物に施用され
る場合に殺虫剤として有効である。これまでは、Ｂｔ結
晶タンパク質（プロトキシン）は、バチルスから分離さ
れ、そして標準法、例えば散布または噴霧により植物体
に施用していた。Ｂｔ結晶タンパク質を含む調剤は生物
学的除草剤として市販されて使用される。例えばバイオ
ケム・プロダクツ社により提供されるバクトスペイン(B
actospeine) 、アボット・ラボラトリーズ社により提供
されるジペル(Dipel) およびサンド社により提供される
サーサイド(Thurcide)。Ｂｔが胞子形成の間のみ結晶タ
ンパク質を産生するという事実は、この生物学的殺虫剤
の製造および使用との関係で重大な問題点を表す。この
ような成長段階の限定は特に工業工程において、製造に
不便およひ過剰な所要時間をもたらし得る。さらに、前
記の製造に関連する費用は、そのような生物学的殺虫剤
が化学物質に基づいたその他の市販されて利用できる物
質、例えばピレスロイド誘導体と有利に競合することを
困難にした。
【００１０】Ｂｔ毒素の使用に関するその他の問題点
は、例えば該タンパク質は処理された植物体の表面に通
常残存するという事実であり、そこで表面摂取幼虫に対
してのみ有効であり、そして紫外線輻射に延期された暴
露により不活性化されることである。この不活性化は環
境における結晶タンパク質の永続性の一般的な欠乏の少
なくとも１つの原因であり得る。従って、該結晶タンパ
ク質の頻繁な、そして高価な施用が必要である。
【００１１】これらの、およびその他の問題点はＢｔ結
晶タンパク質またはＢｔ結晶タンパク質の昆虫毒性を実
質的に有するタンパク質をコードする遺伝子を植物体に
含み、そして発現することにより解決され得る。Ｂｔ結
晶タンパク質またはＢｔ結晶タンパク質の昆虫毒性を実
質的に有するタンパク質をコードする遺伝子をトウモロ
コシのプロトプラスト内に含み、そして発現することに
より、およびその形質転換されたプロトプラストから稔
性の遺伝子導入トウモロコシ植物体を再生し、そしてこ
れらの昆虫耐性トウモロコシ植物体を栽培することによ
り、上記問題点がどのように解決され得るかを本発明は
記載している。
【００１２】遺伝子工学を利用することにより、有用な
ポリペプチドの産生に関連する遺伝子は、供与細胞から
転移され得、その細胞内で自然に生じている遺伝子が宿
主細胞に移り、その宿主細胞内で該遺伝子は自然には生
じない；Cohen およびBoyer,米国特許第４２３７２２４
号および同第４４６８４６４号。実際にはそのような転
移にはわずかの固有の制限がある。遺伝子はウイルス、
細菌、植物および動物の間を転移され得る。ある場合に
は、宿主細胞内で、転移された遺伝子は機能的である
か、または機能的であるようにされ得る。宿主細胞が植
物細胞である場合、完全な植物体は時々細胞から再生さ
れ得る。
【００１３】遺伝子はプロモーターおよび転写領域を含
むＤＮＡ配列の領域を典型的に含む。該転写領域は５’
非翻訳領域、コード配列およひ３’非翻訳領域を通常含
む。転写領域がｍＲＮＡに変換される間、プロモーター
は転写の開始に必要なＤＮＡ配列を含む。真核細胞にお
いて、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼにより認識さ
れる領域および転写の開始のためにＤＮＡ上にＲＮＡポ
リメラーゼを位置させる領域を含むと考えられている。
後者の領域はＴＡＴＡボックスとして記載され、転写開
始の部位から約３０ヌクレオチド上流に通常生じる。
【００１４】プロモーターに続いている領域はｍＲＮＡ
に転写される配列であるが、ポリペプチドに翻訳されな
い配列である。この配列はいわゆる５’非翻訳領域を構
成し、そして翻訳の開始に関する配列、例えばリボソー
ム結合部位を含むと考えられている。コード領域は、Ｄ
ＮＡまたは相当するＲＮＡ内の５’非翻訳領域からわず
かに下流にある配列である。それは遺伝子コードに従っ
てポリペプチドに翻訳されるコード領域である。Ｂｔは
例えば殺虫性プロトキシン結晶タンパク質のアミノ酸配
列に翻訳されるコード配列を有する遺伝子を有する。
【００１５】コード領域には、ｍＲＮＡに転写されるが
ポリペプチドに転写されない配列が続く。この配列は
３’非翻訳領域と呼ばれ、そして転写の終結を導くシグ
ナルおよび真核細胞のｍＲＮＡにおいて転写されたｍＲ
ＮＡの糸のポリアデニル化を起こすシグナルを含むと考
えられている。ｍＲＮＡのポリアデニル化はプロセシン
グおよび移送機能を有すると考えられている。天然の遺
伝子は供与細胞から宿主細胞にそれらの全体が転移され
得る。しかしながら、プロモーターおよび場合によって
はコード領域と同一な遺伝子が全く存在しない５’およ
び３’非翻訳領域を有する所望のコード領域を含む遺伝
子を構成することがしばしば好ましい。そのような構造
物はキメラ遺伝子として知られている。
【００１６】遺伝子工学の方法は結晶タンパク質を産生
する改良された方法を記載している。例えばSchnepf
等, 米国特許第４４４８８８５号および同第４４６７０
３６号はＢｔ以外の細菌の株内に結晶タンパク質を産生
するプラスミドを記載している。これらの方法は結晶タ
ンパク質の産生を可能としているが、しかし市販の殺虫
剤として結晶タンパク質を使用する問題点を解決するも
のではない。植物が植物自身を保護することを可能とす
るために該植物体内に直接Ｂｔ毒素遺伝子を無性生殖さ
れるという示唆がなされている〔Klausner, A., Biotec
hnology, 2 (1984) 409-413 〕。Adang 等, 欧州特許出
願ＥＰ−０１４２９２４号(Agrigenetics)およびDe Gre
ve, H. M. J., ＥＰ−０１９３２５９号(Plant Genetic
Systems N. V.) はタバコ内にＢｔからの毒素遺伝子を
クローニングする方法を主張している。これらの文献の
中には単子葉植物体の形質転換が例示されていない。
【００１７】トウモロコシ植物体の細胞内にＢｔの結晶
タンパク質を産生する新規な方法を開発するために、お
よびＢｔ結晶タンパク質またはＢｔ結晶タンパク質の昆
虫毒性（殺虫有効性）を実質的に有する類似したポリペ
プチドを含むトウモロコシ植物体を摂取する昆虫の幼虫
を防除する新規な方法のためにある必要性が存在する。
「防除する」とは幼虫を殺すか、または少なくともそれ
らの幼虫の摂食を減少させるかのいずれかに関するもの
と理解すべきである。有害生物または病原体を殺すか防
除するのに十分有効な量の有害生物防除性または抗病原
体性タンパク質を植物細胞および植物体にそれぞれ産生
することからなる有害生物または病原体により引き起こ
される損傷に対してトウモロコシ植物体を保護する方法
のために他の必要性が存在する。Ｂｔ結晶タンパク質ま
たはＢｔ結晶タンパク質の昆虫毒性を実質的に有するタ
ンパク質の殺虫有効量を増殖細胞内に産生することから
なる昆虫損傷に対してトウモロコシ植物体を保護するた
めに他の必要性が好ましくは存在する。化学薬剤例えば
除草剤がトウモロコシ植物体に安全に施用されるため
に、該薬剤による損傷からトウモロコシ植物体を保護す
る方法のために他の必要性が存在する。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明のこのような状
況を考慮してなされたものであり、その課題とするとこ
ろは、バチルス スリンギエンシス(Bacillus thuringi
ensis)により産生される結晶タンパク質である殺虫性タ
ンパク質を発現する遺伝子、該タンパク質の製法および
使用法の提供である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】上記の、およびその他の
課題は、細胞およびカルスコロニーを形成し得るトウモ
ロコシ(Zea mays)のプロトプラストを製造する方法を提
供する本発明に従って達成される。プロトプラストは所
望するならば、形質転換され得、そして生成した細胞お
よびカルスは遺伝子導入トウモロコシ植物体に再生され
得る。分裂し、そしてカルスを形成し、次いで植物体に
再生され得るプロトプラストを製造する方法は、出発材
料として新規な胚形成細胞培養体（懸濁培養体またはカ
ルス培養体）を必要とする。そのような胚形成細胞培養
体並びにそれらを製造および同定する方法は記載され、
そしてまた本発明の一部として見なされるであろう。
【００２０】これらの胚形成懸濁培養体は、完全に稔性
のトウモロコシ植物体に再生され得、そして本発明の好
ましい主題を表す。これらの胚形成培養体は外来ＤＮＡ
で形質転換され得るプロトプラストの源であり、そして
分裂しカルスを形成し次いで土壌に生長し得る完全に稔
性のトウモロコシ植物体を含む植物体に再生され得るプ
ロトプラストの源である。
【００２１】本発明はさらに、Ｂｔ結晶タンパク質の昆
虫毒性を実質的に有するポリペプチドをトウモロコシ細
胞内に発現し得るキメラ遺伝子（以後、キメラＢｔ毒素
遺伝子）を提供する。本発明の付加的な実施態様は、培
養体におけるベクター、細菌、植物細胞内のキメラＢｔ
毒素遺伝子、および生長している植物体内の植物細胞、
並びにトウモロコシ細胞内にＢｔ結晶タンパク質の昆虫
毒性を実質的に有する毒素を産生する方法および該毒素
を発現する遺伝子を含むトウモロコシ細胞を昆虫に摂食
させることにより該昆虫を防除するか、または殺傷する
方法を包含する。
【００２２】本発明はさらに、キチナーゼ活性を有する
ポリペプチドをコード化する遺伝子をトウモロコシ細胞
および植物体内に導入および発現することにより病原菌
からトウモロコシを保護する方法を記載している。本発
明はさらに、トウモロコシ細胞および植物体に除草性化
学物質に対する許容性を与えるポリペプチドをコード化
する遺伝子を前記細胞および植物体に導入および発現す
る方法を記載する。
【００２３】トウモロコシ植物体、特に稔性のトウモロ
コシ植物体がプロトプラストから、プロトプラスト誘導
細胞またはプロトプラスト誘導カルスから再生され得る
ということは、本発明のなされた時点での従来技術から
予測することができなかった。安定に組み入れられた外
来ＤＮＡを含むトウモロコシプロトプラストが遺伝子導
入植物体、特に稔性の遺伝子導入トウモロコシ植物体に
再生され得ることさえも予測できなかった。本発明は、
細胞壁を再生し、分裂しそして稔性のトウモロコシ植物
体を含む植物体に再生され得るカルスを形成するプロト
プラストが分離され得るトウモロコシ植物体から誘導さ
れる胚形成細胞培養体（懸濁培養体またはカルス培養
体）に関する。本発明はまた、好ましくは稔性である植
物体に再生され得るトウモロコシプロトプラストおよび
生成したプロトプラスト誘導植物細胞（細胞壁の再生
後）に関し、好ましくは細胞培養体または胚形成細胞懸
濁液から誘導された前記プロトプラストに関する。
【００２４】本発明はまた、稔性のトウモロコシ植物体
に再生され得る胚形成細胞懸濁培養体にも関する。本発
明はまた、プロトプラストから、形質転換された、また
はさもなければ遺伝学的に変更されたプロトプラストか
ら誘導されたトウモロコシ植物の細胞、カルス、胚形成
懸濁液、胚、小植物体および植物体にも関する。さらに
本発明は胚形成細胞懸濁培養体または培養されたプロト
プラストから誘導される再生されたトウモロコシ植物体
のムカゴ（propagule)および後代(progeny) に関する。
ムカゴは有性的または無性的に増殖させ得る、または生
体内でもしくは試験管内で増殖させ得るあらゆる材料を
含む。この増殖する材料の中で、プロトプラスト、細
胞、カルス、組織または種子が好ましい。前記の再生さ
れたトウモロコシ植物体の後代はそれらの突然変異体お
よび変種を含む。突然変異体および変種は、例えば細胞
融合または突然変異選択から得られたそれらの植物体を
含む。
【００２５】本発明は好ましくは、安定に組み入れられ
た外来ＤＮＡ、好ましくはトウモロコシ内で発現し得る
外来ＤＮＡ、さらに好ましくは貴重な特性を有する形質
転換された植物体を提供するキメラ遺伝子を有する再生
された（プロトプラスト−誘導）遺伝子導入トウモロコ
シ植物体およびそれらのムカゴおよび後代に関する。貴
重な特性は後記する。前記遺伝子導入トウモロコシ植物
体のムカゴは、有性的または無性的に増殖され得る、ま
たは生体内でもしくは試験管内で増殖され得るあらゆる
材料を含む。この増殖する材料の中で、前記遺伝子導入
トウモロコシ植物体から得られるプロトプラスト、細
胞、カルス、組織または種子が好ましい。前記の遺伝子
導入トウモロコシ植物体の後代はそれらのそれらの突然
変異体および変種を含む。突然変異体および変種は、例
えば出発材料の特性を依然有し、外来ＤＮＡの以前の形
質転換により引き起こされる突然変異体およびそれらの
変種を含む。
【００２６】本発明はまた、植物体特に稔性の植物体に
再生され得るトウモロコシプロトプラストおよびトウモ
ロコシ植物細胞を製造する方法にも関し、さらに前記プ
ロトプラストまたはプロトプラスト誘導細胞から誘導さ
れたトウモロコシカルスを製造する方法および植物体、
好ましくは稔性の植物体に再生できる方法にも関する。
加えて、本発明はこれらの細胞（カルスまたは懸濁培養
細胞）からトウモロコシ植物体および遺伝子導入トウモ
ロコシ植物体を再生する方法に関する。
【００２７】これらの方法を以下に詳しく記載する。Ｂ
ｔ結晶タンパク質またはＢｔ結晶タンパク質の昆虫毒性
を実質的に有するタンパク質をトウモロコシ細胞内に産
生する方法を提供することは、本発明の別の目的であ
る。バチルス スリンギエンシス結晶タンパク質の昆虫
毒性を実質的に有するポリペプチドをトウモロコシ内に
産生する方法が特に好ましく、その方法は： （ａ）遺伝子プロモーター、５’非翻訳領域および場合
によっては３’非翻訳領域が植物または植物ウイルス遺
伝子から誘導され、Ｂｔ結晶タンパク質の昆虫毒性を実
質的に有するポリペプチドをコードする遺伝子をトウモ
ロコシ細胞に導入し、そして （ｂ）前記ポリペプチドを発現させることからなる。抗
病原性または病原防除有効性を有するタンパク質の抗病
原性有効量または病原体を防除するのに十分な量を植物
細胞内に産生させることからなるトウモロコシ植物体を
攻撃する病原体により引き起こされる損傷に対してトウ
モロコシ植物体を保護する方法を提供することは本発明
のその他の目的である。
【００２８】殺有害生物性または有害生物防除有効性を
有するタンパク質の殺有害生物有効量または有害生物を
防除するのに十分な量を植物細胞内に産生させることか
らなる有害生物損傷に対してトウモロコシ植物体を保護
する方法を提供することは本発明のその他の目的であ
る。有害生物が昆虫である方法が特に好ましい。Ｂｔ結
晶毒素またはＢｔβ結晶タンパク質の昆虫毒性を実質的
に有する毒素の殺虫量を発現するキメラ遺伝子を含むト
ウモロコシ植物細胞を昆虫の幼虫に摂食させることによ
り該昆虫の幼虫、好ましくは鱗翅目、甲虫目および双翅
目の幼虫を防除する方法を提供することは本発明のその
他の目的である。
【００２９】Ｂｔ結晶タンパク質またはＢｔ結晶タンパ
ク質の昆虫毒性を実質的に有するタンパク質の防除有効
量または殺虫有効量を植物細胞内に産生させることから
なる昆虫損傷に対してトウモロコシ植物体を保護する方
法を提供することは本発明のその他の目的である。殺虫
性トウモロコシ植物細胞は植物全体および一部からのも
の並びに培養されたトウモロコシ細胞を含む。昆虫が植
物体上での摂食を止めるように植物体を昆虫に忌避させ
るのに十分な量でタンパク質が産生される方法を提供す
ることは本発明のその他の目的である。上記の方法に関
連した遺伝子およびその他のＤＮＡ断片並びに細胞およ
び植物体を提供することは本発明のその他の目的であ
る。これらの、およびその他の目的は下記の詳細な記載
から利用できるようになるであろう。
【００３０】定義 トウモロコシ(Zea mays, corn)：本明細書を通してこれ
らの用語はトウモロコシの種に属しているあらゆる植物
体または植物体の部分（プロトプラスト，細胞，組織，
器官，オルガネラ，胚，カルス，ムカゴ，その他）に関
する。ここで使用されている用語はトウモロコシの品
種、栽培品種、変種、近交系および雑種を含む。しか
し、本発明は例えばＦｕｎｋ５Ｎ９８４，Ｆｕｎｋ５Ｎ
９８６，Ｆｕｎｋ２７１７，Ｆｕｎｋ２１１Ｄ，Ｆｕｎ
ｋ２Ｎ２１７Ａ，Ｂ７３，Ａ６３２，ＣＭ１０５，Ｂ３
７，Ｂ８４，Ｂ１４，ＭＯ１７，Ｒ１６８，ＭＳ７１，
Ａ１８８，ＦＡ９１，Ａ６４１およびＷ１１７のような
トウモロコシの近交系に限定されるものではない。全て
の優良遺伝子型（変種，栽培品種，近交系，雑種，その
他）が好ましく、優良近交系はＦｕｎｋ５Ｎ９８４，Ｆ
ｕｎｋ５Ｎ９８６，Ｆｕｎｋ２７１７，Ｆｕｎｋ２１１
ＤおよびＦｕｎｋ２Ｎ２１７Ａを含み、最も好ましくは
優良近交系Ｆｕｎｋ２７１７である。
【００３１】ＢＭＳ：ブラックメキシカンスイートコー
ン(Black Mexican Sweet Corn)。穀粒に「黒色」の外観
を与え、暗黒色の色合いの穀粒の果皮を有する色のくす
んだ小さい穂のスイートコーンの変種。 植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的単位。「植物細胞」という用語は
植物の一部であるか、または植物から誘導されたいずれ
かで、あらゆる細胞に関する。本発明により包含される
細胞のいくつかの例は、生存している植物の部分である
分化した細胞；培養における分化した細胞；培養におけ
る未分化細胞；カルスまたは腫瘍のような未分化組織の
細胞；種子；胚；ムカゴ（零余子）および花粉を含む。 植物組織：構造的および機能的単位の形態に組織化され
た植物細胞の群。プランタまたは培養液におけるあらゆ
る植物の組織。この用語は、完全な植物体、植物細胞、
植物器官、植物種子、プロトプラスト、細胞培養体並び
に構造および／または機能単位内に組織化された植物細
胞のあらゆる群を含むが、しかしこれに限定されるもの
ではない。上記の植物組織の特定のタイプまたはこの定
義に含まれる同様なものと関連した、またはこれらの不
在下でのこの用語の施用は、植物組織の他の他のタイプ
を除外するものではない。 植物器官：明確なおよび可視の構成され、そして分化し
た植物の部分、例えば根、茎、葉、花、芽または胚。
【００３２】プロトプラスト：細胞壁のない分離された
植物細胞。 遺伝子導入植物体：その遺伝子材料内に安定に組み入れ
られた外来ＤＮＡを有する植物体。この用語は種々の形
態にあるプロトプラスト内に導入され得る外来ＤＮＡを
含み、例えば環状、線状または超らせん状の裸のＤＮ
Ａ、ヌクレオソームまたは染色体または核またはそれら
の一部内に含まれるＤＮＡ、その他の分子と複合または
関連したＤＮＡ、リポソーム内に包まれたＤＮＡ、スフ
ェロプラスト、細胞またはプロトプラストを含む。プロ
トプラスト内に外来ＤＮＡを導入する種々の異なった方
法は当該分野において公知であり、そして本発明の遺伝
子導入プロトプラスト、遺伝子導入細胞または遺伝子導
入植物体を製造するために使用し得る。 培養体：未分化または部分的に分化した状態にある細胞
の増殖集合体。「細胞培養体」の用語は、固化された培
地上で増殖する細胞集合体および攪拌された液体培地内
に拡散された状態で増殖する懸濁培養細胞からなるカル
ス培養体を含む。
【００３３】胚：接合体（次いで生殖胚と呼ばれる）ま
たは胚形成体細胞（次いで体細胞胚と呼ばれる）のいず
れかから誘導される植物の微小な早期の生長段階で、識
別できる形態、構造および細胞の球状ないし子葉の段階
からなる細胞器官の段階にあるもの。〔トウモロコシ胚
生長は、例えばRandolph, L. F., J. Agric. Research,
53 (1936) 881-916に記載され；一般的な草の胚生長は
例えばBrown, W. V., Phytomorphology, 10 (1960) 215
-223に記載されている〕 小植物体：小さい植物の形態にある新芽および根からな
る多細胞構造体。 キメラ配列またはキメラ遺伝子：少なくとも２つの非対
応部分、例えば予め存在する状態と関連しない予め存在
するＤＮＡ配列から誘導された、またはそれと実質的に
同一な配列を有する部分を含むＤＮＡ配列。予め存在す
るＤＮＡ配列は天然起源または合成起源であってよい。
【００３４】コードＤＮＡ配列：転写および翻訳された
場合に細胞のポリペプチドの形成を行うＤＮＡ配列。 遺伝子：発現の調節、すなわち転写されそして翻訳され
て明確なポリペプチドを与えるコード配列の転写および
翻訳に関連する調節ＤＮＡ配列を含む明確に区別される
染色体の領域。から誘導される：本明細書において、遺
伝子、遺伝子の部分またはその他のＤＮＡ源「から誘導
される」その他のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ源物質に同一で
あるか、または実質的に相同である遺伝子、遺伝子の部
分またはその他のＤＮＡ配列を含む。 表現型の特徴：１つまたはそれ以上の遺伝子の発現から
生じる可視の特徴。予め存在するＤＮＡ配列：本発明に
係る生成物または方法において、少量あるいはある程度
その使用の前に存在するＤＮＡ配列。そのような予め存
在するものは典型的に天然起源であることを表している
けれども、予め存在する配列は合成またはその他の起源
であってもよい。 十分な配列相同：ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の
間の十分な機能的および／または構造的相同。十分な配
列相同を有する配列間の機能的および／または構造的相
違は相当に小さいであろう。
【００３５】ジカムバ：３，６−ジクロロ−２−メトキ
シ安息香酸。 ＮＥＳ：２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸。 ２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸。 ピクロラム；４−アミノ−３，６，６−トリクロロピコ
リン酸。 トリス塩酸：α，α，α−トリス（ヒドロキシメチル）
メチルアミン塩酸。 ＥＤＴＡ：１−エチレンジアミンＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−
四酢酸。 ＰＥＧ：ポリエチレングリコール。
【００３６】アガロース：アガロースの調製および精製
は、例えばGuiseleyおよびRenn, "TheAgarose Monograp
h", Marine Colloids Division FMC Corp. (1975)に記
載されている。アガロースは寒天の成分の一つである。
市販されて利用できる寒天は通常、多数の側鎖を有する
中性アガロースおよびイオン性アグロペクチンの混合物
からなる。市販のアガロースは通常、慣用の方法で寒天
から得られる。通常かなりの側鎖はそのまま残り、アガ
ロースの物理化学的特性、例えばゲル形成温度および融
点を決定する。低融点アガロース、特にシープラークア
ガロース（登録商標）は後記する方法での好ましい固化
剤である。
【００３７】ＳＨ培地：Schenk, R. U. 等, Can. J. Bo
t., 50 (1972) 199-204 の、生長調節剤のない培地。
（ＳＨ培地は液状であるか、または０．８％（ｗ／ｖ）
寒天もしくは０．５％（ｗ／ｖ）ゲルライト（登録商
標）で固化され得る）培地は当該分野で公知の方法、例
えば約１５ないし２０分間、１２１℃および圧力１５ｌ
ｂ／ｉｎ2 （１．２ｋｇ／ｃｍ2 ）でオートクレーブす
ることによる加熱または殺菌により通常殺菌される。
【００３８】ＭＳ培地：Murashige, T. およびSkoog,
F., Physiol. Plant., 15 (1962) 473。 Ｂ５培地：Gamborg 等，Exp. Cell Res., 50, (1968) 1
51。 Ｎ６培地：Chu 等，Scientia Sinica, 18 (1975) 659。
組成は下の第１表に示す。ＫＭ培地：Kao, K. N.等，Pl
anta, 126 (1975) 105-110。この培地は液状であるか、
または寒天、アガロースもしくはゲルライトで固化され
てもよく、そして同様にアスコルビン酸、ビタミンＤお
よびビタミンＡなしで調製および使用してもよい。固化
剤なしの培地成分は通常０．２μｍフィルターを通して
濾過により滅菌される（組成は第１表に示す）。
【００３９】
【表１】
【表２】
【表３】
【００４０】セルラーゼＲＳ：セルラーゼＲＳ，株式会
社ヤクルト本社，東京都港区東新橋１−１−１９。 ペクトリアーゼＹ−２３：盛進製薬株式会社，東京都日
本橋小網町４−１３。 ナルゲン（登録商標）フィルター：ナルゲン社，シブロ
ン社の一部門，米国ニューヨーク，ロチャスター。 BglII ：制限酵素BglII ；ニューイングランドバイオブ
ラス，米国マサチューセッツ，ビバリー，トザーロード
３２またはその他の市販している提供者。 BamHI ：制限酵素BamHI ；ニューイングランドバイオブ
ラス，米国マサチューセッツ，ビバリー，トザーロード
３２またはその他の市販している提供者。 ハイグロマイシンＢ：サイトトキシン：ハイグロマイシ
ンＢ，精製されたもの；カタログ番号４０００５０カル
ビオケム・ベーリング・タイアグノスチカ社，米国カリ
フォルニア，ラヨーラ，ロット番号７０２２９６。 ゲルライト：ゲルライト・ゲルラン・ガム，スコット・
ラボラトリーズ社，ＲＩフィスカロスビレ。 プライム・タイム・ランダム・プライマー・キットまた
はＩＢＩランダム・プライマー・キット：インターナシ
ョナル・バイオテクノロジー社，米国コネチカット，ニ
ューヘイブン，ピーオー・ボックス１５６５（カタログ
番号７７８００；ロット番号Ｆ６３０−０１）。
【００４１】ＧＡ７（登録商標）容器：半透明のフタを
有する半透明のプラスチックからなる小さな無菌容器
（約７×７×１０ｃｍ）；小植物体、新芽培養体、その
他を生長させるために使用される。供給者：マゼンタ，
米国イリノイ州シカゴ，エヌ．ミルウォーキー・アベニ
ュー３８００。同様の無菌の半透明の容器により代替さ
れ得る（例えばガラスまたはプラスチック）。
【００４２】
【表４】
【００４３】微生物のプラスミドまたは植物細胞の寄
託：本発明に関して下に記載したプラスミドおよび植物
細胞をブダペスト条約の規定に従って寄託した。 （１）Ｆｕｎｋ２７１７のトウモロコシ懸濁細胞培養体
６−２７１７ＣＧは、米国ロックビレのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し
てあり、そしてＡＴＣＣ承認番号第４０３２６号を有す
る〔寄託日：１９８７年５月２０日〕。 （２）プラスミドｐＣＩＢ７１２〔大腸菌ＭＣ１０６１
内〕はＡＴＣＣに寄託してあり、そしてＡＴＣＣ承認番
号第６７４０７号を有する〔寄託日：１９８７年５月１
８日〕。 （３）プラスミドｐＳＣＨ１〔大腸菌株Ｋ１２内〕はド
イツ国ゲッチンゲンにあるドイチェ・ザンムルンク・フ
ォン・ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）に寄託してあ
り、そしてＤＳＭ承認番号第４１２９号を有する〔寄託
日：１９８７年５月２９日〕。 （４）プラスミドｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ〔大腸菌株
ＭＣ１０６１内〕はＡＴＣＣに寄託してあり、そしてＡ
ＴＣＣ承認番号第６７３２９号を有する〔寄託日：１９
８７年２月２７日〕。 （５）プラスミドｐＥ１６／８−ｃ４〔大腸菌株ＨＢ１
０１内〕はＡＴＣＣに寄託してあり、そしてＡＴＣＣ承
認番号第６７４２０号を有する〔寄託日：１９８７年５
月２９日〕。 （６）プラスミドｐＣＩＢ１０／１９ＳＢｔ〔大腸菌株
ＨＢ１０１内〕はＡＴＣＣに寄託してあり、そしてＡＴ
ＣＣ承認番号第６７３３０号を有する〔寄託日：１９８
７年２月２７日〕。
【００４４】プロトプラストからトウモロコシ植物体の
再生 本発明において使用されるカルスはトウモロコシ植物体
のあらゆる組織から生じる。組織は好ましくは未成熟の
組織、例えば未成熟の雄花の穂、未成熟の胚、幼若葉の
基部および原理的にはカルスを形成できるトウモロコシ
のその他の組織である。特に有用な組織は未成熟トウモ
ロコシの胚の胚板である。原理的には全てのトウモロコ
シ遺伝子型（変種，栽培変種，近交系，雑種，その他）
が本発明において有用である。市販のための遺伝子型が
最も重要である。全ての優良遺伝子型、特に全ての近交
系、最も優良近交系が好ましい。適当な近交系は例えば
Ｆｕｎｋ２７１７、Ｆｕｎｋ２１１Ｄ、Ｆｕｎｋ２Ｎ２
１７Ａ、Ｂ７３、Ａ６３２、ＣＭ１０５、Ｂ３７、Ｂ８
４、Ｂ１４、Ｍｏ１７、Ｒ１６８、ＭＳ７１、Ａ１８
８、ＦＡ９１、Ａ６４１およびＷ１１７である。Ｆｕｎ
ｋ５Ｎ９８４およびＦｕｎｋ５Ｎ９８６が有用なトウモ
ロコシ遺伝子型のその他の例である。優良近交系Ｆｕｎ
ｋ２７１７、Ｆｕｎｋ２１１Ｄ、Ｆｕｎｋ５Ｎ９８４ま
たはＦｕｎｋ２Ｎ２１７Ａが特に好ましく、そして優良
遺伝子型Ｆｕｎｋ２７１７が最も好ましい。
【００４５】以下の記載において、それからプロトプラ
ストが分離され得、そして稔性の植物体が再生し得るＦ
ｕｎｋ２７１７の胚形成懸濁液の製造方法が記載される
であろう。その他のトウモロコシの遺伝子型の記載され
た方法を用い得、せいぜい当業者に公知の決まりきった
変法を用い得ることは理解すべきである。
【００４６】工程（ａ）カルス形成 遺伝子型Ｆｕｎｋ２７１７のトウモロコシ植物体を開花
するまで生長させ、そして受粉させる。未成熟の胚を穀
粒から分離し、そして開始培地上に置く。胚は典型的に
は１ｍｍと４ｍｍの間の長さであり、好ましくは１．５
ｍｍと３ｍｍの間、そして最も好ましくは２ｍｍと２．
５ｍｍの間である。開始培地は液状であっても固体であ
ってもよい。カルスを導入し得るあらゆる開始培地が使
用し得る。いくつかの適当な例は適当な濃度の糖および
植物生長調節剤を含む、ＭＳ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培
地、ＳＨ培地またはＫＭ培地をベースとするものである
が、これに限定されない。その他の適当な組成は"Plant
Culture Media", George, E. F.等，Exegetics Ltd.発
行, 英国ビルトシェアー，ウエストバリー，エジトンに
記載されている。カルスを培養した未成熟の胚から除去
し、そして保持培地上に置く。カルス増殖を支え得るあ
らゆる保持培地が使用し得る。いくつかの適当な例は、
適当な濃度の糖および植物生長調節剤を含む、ＭＳ培
地、Ｎ６培地、Ｂ５培地またはＫＭ培地をベースとする
ものであるが、これに限定されない。材料を新鮮な保持
培地に適当な間隔、例えば１ないし１２０日毎、好まし
くは３ないし２１日毎、そして最も好ましくは５ないし
１４日毎に継代培養する。開始および保持は明所または
暗所、好ましくは暗所で行い得る。温度は０℃と５０℃
の間、好ましくは２０℃と３２℃の間、最も好ましくは
２５℃と２８℃の間で行い得る。
【００４７】カルスが特定のタイプのカルスになるま
で、継代培養を同一条件で続ける。本発明に係る開始懸
濁液での使用に適当である前記特定のタイプのカルス
は、比較的に稔性でない、そして粒状および砕けやす
い。図１は本発明に係る開始胚形成懸濁液中での使用に
適当であるカルスを示す。適当なカルスは適当な間隔、
例えば１ないし１２０日毎、好ましくは３ないし２１日
毎、そして最も好ましくは５ないし１４日毎に継代培養
する。稔性のトウモロコシ植物体を再生することがで
き、そして稔性の植物に再生され得るプロトプラストが
分離され得る特定のタイプのカルスは、本発明の好まし
い実施態様の一つを表す。
【００４８】従って、本発明は植物、好ましくは稔性の
植物体が再生され得る、そして植物体好ましくは稔性の
植物体を再生し得るプロトプラストが再生され得る懸濁
培養体を製造し得るトウモロコシカルスに関する。本発
明は、（ａ１）割合に稔性でない、そしてカルス誘導ま
たはカルス保持培地上で粒状または砕けやすいカルスを
得、そして（ａ２）工程（ａ１）のカルスをカルス保持
培地上で生長させる工程からなる、稔性の植物体に再生
させることができるプロトプラストが分離され得るトウ
モロコシのカルス培養体を製造する方法に関する。
【００４９】工程（ｂ）ないし（ｄ）懸濁培養体 工程（ａ）からの特定のタイプのカルスは液体培地中に
置き細胞の懸濁液および細胞集合体を形成する。液体培
地のいくつかの適当な例は、適当な濃度の糖および植物
生長調節剤を含む、ＭＳ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地およ
びＫＭ培地をベースとするものであるが、これに限定さ
れない。好ましくは培地はＮ６培地である。培養体は生
存できる増殖状態にある細胞にある細胞および細胞集合
体を保持するのに十分な頻度で、例えば１ないし１２０
日毎、好ましくは３ないし２１日毎、そして最も好まし
くは５ないし１０日毎に継代培養する。濃密に細胞質の
分裂している細胞の集合体を含む培養体は保持される。
増加した細胞の高い比率を有するものは捨てる。濃密な
細胞質である細胞の比率は時につれて増加し得る；図２
および図３を参照。懸濁培養体の望ましいタイプは、少
なくとも５０％、そして最も好ましくは濃い細胞質の分
裂細胞の集合体中に少なくとも７０％の細胞を含むもの
である。懸濁培養体の望ましいタイプは適当な時間の
後、通常約７日、好ましくは約３０日後に得られる。温
度および光条件は工程（ａ）と同じである。懸濁培養体
は米国メリーランド州ロックビレのＡＴＣＣに寄託し、
そして承認番号第４０３２６号を有する（寄託日：１９
８７年５月２０日）。
【００５０】従って、本発明は、 （ａ）割合に稔性でない、そしてカルス誘導またはカル
ス保持培地上で粒状または砕けやすいカルスを得、 （ｂ）該カルスを液状培地に移し、細胞または細胞集合
体の懸濁液を形成し、 （ｃ）（ｉ）生育できる分裂段階にある、稔性の植物体
に再生させることができるプロトプラストを得るのに十
分な期間（好ましくは約７日間）、および（ｉｉ）生育
段階におけるあらゆる細胞および細胞集合体を維持する
のに十分な頻度で前記懸濁液を継代培養し、そして （ｄ）密集した細胞質の、分裂している細胞の集合体を
含む工程（ｃ）の生成物から培養体を選択および保持す
る工程からなる、稔性の植物体を再生することができる
プロトプラストが分離され得るトウモロコシ細胞および
細胞集合体の懸濁培養体を製造する方法を提供する。
【００５１】工程（ｅ１）プロトプラストの製造 細胞壁を除去する酵素調剤とカルスまたは懸濁培養細胞
および細胞集合体（上記工程（ａ）ないし（ｄ）により
得られる）をインキュベートすることによりプロトプラ
スト分離を行う。適当な酵素調剤は例えば４％ｗ／ｖＲ
Ｓセルラーゼを１％ｗ／ｖローチームと共にＫＭＣ塩水
溶液（ＫＣｌ８．６５ｇ／ｌ；ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
１．２５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ１６．４７ｇ／
ｌ；ＭＥＳ５ｇ／ｌ；ｐＨ５．６）中に含有する調剤で
ある。この消化を０℃と５０℃の間、好ましくは１０℃
と３５℃の間、最も好ましくは２６℃と３２℃の間で行
う。該消化はプロトプラストが分離されるまで行う。消
化に要求される時間は典型的には３０分と５日の間、好
ましくは１時間と１日の間、最も好ましくは３と５時間
の間である。
【００５２】従って、本発明はさらに、 （ａ）割合に稔性でない、そしてカルス誘導またはカル
ス保持培地上で粒状または砕けやすいカルスを得、 （ｂ）該カルスを液状培地に移し、細胞または細胞集合
体の懸濁液を形成し、 （ｃ）（ｉ）生育できる分裂段階にある、稔性の植物体
に再生させることができるプロトプラストを得るのに十
分な期間（好ましくは約７日間）、および（ｉｉ）生育
段階におけるあらゆる細胞および細胞集合体を維持する
のに十分な頻度で前記懸濁液を継代培養し、 （ｄ）密集した細胞質の、分裂している細胞の集合体を
含む工程（ｃ）の生成物から培養体を選択および保持
し、 （ｅ１）適当な酵素で細胞壁を除去し、そして生成した
プロトプラストを分離する工程からなる、稔性の植物体
を再生することができるトウモロコシプロトプラストを
製造する方法にも関するものである。分離されたプロト
プラストは標準法例えば濾過およひ遠心分離により集め
られ、清浄にされる。稔性のトウモロコシ植物体を再生
することのできるこれらのプロトプラストおよびプロト
プラスト誘導細胞（細胞壁再生後）は本発明の好ましい
対象である。
【００５３】工程（ｅ２）プロトプラストの外来ＤＮＡ
での処理 プロトプラストの遺伝物質内に安定に組入れられた外来
ＤＮＡの全部または一部を含む細胞を製造するためにプ
ロトプラストを外来ＤＮＡで処理し得る。外来ＤＮＡは
プロトプラストに添加されるあらゆるＤＮＡである。外
来ＤＮＡはトウモロコシ内で活性なプロモーターを含有
し得る、またはトウモロコシゲノム内に既に存在するプ
ロモーターを利用し得る。外来ＤＮＡはキメラ遺伝子ま
たはそれらの部分であり得る。プロトプラストの外来Ｄ
ＮＡでの処理は下記文献に記載された方法に従って行わ
れ得る：Paszkowski, J.等, The EMBO Journal, 3, No.
12, (1984) 2717-2722；欧州特許出願EP-0164575 (Pasz
kowski, J.等) ； Shillito, R. D.等, Bio/Technolog
y,3 (1985) 1099-1103; Potrykus, I.等, Mol. Gen. Ge
net., 199 (1985) 183-188; Loerz, H. 等, Mol. Gen.
Genet., 199 (1985) 178-182; Fromm, M. E.等, Natur
e, 319 (1986) 791-793; 英国特許出願GB-2140822 (Met
tler, I. J.); Negrutiu, I. 等, Plant Mol. Biology,
8 (1987) 363-373。これらの文献は参照により本明細
書に編入される。
【００５４】外来ＤＮＡはあらゆる形態、例えば裸の線
状または環状ＤＮＡ、リポソーム内に取り囲まれたＤＮ
Ａ、スフェロプラスト内のＤＮＡ、その他の植物プロト
プラストのＤＮＡ、塩と複合したＤＮＡ、ヌクレオソー
ム、染色体または核の形態のＤＮＡ、またはそれらの部
分、その他の形態で添加され得る。外来ＤＮＡの取込み
は、上記の参考文献に記載された方法を含む当該分野で
公知のあらゆる適当な方法により刺激され得る。主とし
て本発明において意図されるキメラ遺伝子は、新しい表
現型の特徴（価値ある特性）例えば有害生物（例えば昆
虫およびダニを含む節足動物、ダニ他）にたいする増加
した耐性；病原体（例えば植物病原菌，バクテリア，ウ
イルス他）に対する増加した耐性；化学物質〔例えば除
草剤（例えばトリアジン，カルバメート，尿素，ジニト
ロアニリド，スルホニル尿素，イミダゾリノン，トリア
ゾロピリミジン，ビアラホス，グリホセート他）、殺虫
剤またはその他の殺生物剤〕に対する増加した耐性；細
胞毒素（例えばハイグロマイシン，カナマイシン，クロ
ラムフェニコール他）に対する増加した耐性；不利な環
境の（土壌のまたは大気の）影響（例えば熱，冷たさ，
風，土壌状態，水分，乾燥他）に対する増加した耐性；
望ましい物質〔例えば葉，種，塊茎，根，茎他におい
て。遺伝子的に変更された植物体により産生される望ま
しい物質はタンパク質，デンプン，糖，アミノ酸，アル
カロイド，芳香剤，色素，脂肪他を含む〕の増加した形
成；望ましくない物質（例えば毒素，プロテアーゼ阻害
剤，望ましくない香り，望ましくないタンパク質，脂
肪，炭水化物または二次代謝物他）の減少した形成；ま
たは変性された形態的なまたは生長の表現型の特徴（例
えば変更された高さ，生長性，形態，色彩，強靱性，開
花時期他）を有する形質転換された植物プロトプラス
ト、プロトプラスト誘導組織および最後にプロトプラス
ト誘導植物体を提供する遺伝子である。
【００５５】細胞毒素に対する耐性は、細胞毒素を解毒
する酵素例えばカナマイシン、ハイグロマイシンおよび
その他のアミノグリコシド抗生物質の解毒のためのネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ型またはアミノ
グリコシドホスホトランスフェラーゼＩＶ型またはグル
タチオンｓ−トランスフェラーゼまたはチトクロームｐ
４５０またはトリアジン、スルホニル尿素またはその他
の除草剤を解毒する公知のその他の代謝酵素を細胞内に
発現する遺伝子により与えられ得る。細胞毒素に対する
耐性は、細胞毒素に耐性である「標的酵素」の形態（細
胞毒素の活性部位）、例えばスルホニル尿素またはイミ
ダゾリノンまたはこの代謝段階で作用するその他の除草
剤による阻害に非感受性であるアセトヒドロキシ酸シン
ターゼの形態、またはグリホセートによる阻害に非感受
性である５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフ
ェート（ＥＰＳＰ）シンターゼの形態を植物体内に発現
する遺伝子によっても与えられ得る。植物細胞内におい
て正しい細胞の区画、すなわち上記の例におけるクロロ
プラストへのそれらの移動を可能にする形態のこれらの
変更された標的酵素を発現することが有利である。
【００５６】ある場合において、遺伝子産物をミトコン
ドリア、液胞内に、原形質小胞またはその他の細胞部分
または細胞間の（アポプラスティック）空間にさえも打
ち込むことは有利である。あるクラスの菌に対する耐性
は植物組織内にキチナーゼを発現する遺伝子の導入によ
り与えられ得る。多くの植物病原菌は菌糸および胞子構
造の必須部分としてキチンを含む、バシジオマイセテス
(basidiomycetes)（黒穂病菌およびさび病菌）およびア
スコマイセテス(ascomycetes) および不完全菌〔アルテ
ルナリア(Alternaria)およびビポラリス(Bipolaris) を
含み、エキセロヒルム・チュルシカム(Exerohilum turc
icum) 、コレトトリクム(Colletotricum) 、グレオセル
コスポラ(Gleocercospora)およびセルコスポラ(Cercosp
ora)〕を含む。キチナーゼはある種の病原体のマイセリ
アの生長を試験管内で阻害し得る。キチナーゼを発現す
る植物の葉または根は多くのタイプの菌の攻撃に対して
保護される。
【００５７】有害生物に対する耐性は、殺有害生物性ポ
リペプチドをコード化する遺伝子により与えられる。節
足動物に対する耐性は、例えば幼虫または成虫段階に毒
性であるか、または植物体を幼虫に忌避させ、その結
果、それらの摂食を減らすポリペプチドをコード化する
遺伝子により与えられ得る。本明細書において適当な遺
伝子はＢｔの結晶タンパク質である。昆虫耐性に関する
であろうタンパク質の第２の類はプロテアーゼ阻害剤で
ある。プロテアーゼ阻害剤は植物貯蔵構造の共通な構造
物である〔Ryan, C., Ann. Rev. Plant Physiol. 24 (1
973) 173-196〕。昆虫成長の阻害はエサ内にトリプシン
阻害剤の存在により起こされた〔Lipke, H., Fraenkel,
G. S. およびLiener, I. E., J. Agr. Food Chem., 2
(1954) 410-414 〕。ダイズから分離された精製ボウマ
ン−バークプロテアーゼ阻害剤はテネブリオ幼虫の消化
管プロテアーゼを阻害することが判明している〔Birk,
Y.,Gertler, A. およびKhalef, S., Biochem. Biophys.
Acta, 67 (1963) 326-328〕。ササゲトリプシン阻害剤
をコード化する遺伝子はHilder等, Nature, 330 (1987)
160-163に記載されている。
【００５８】プロテアーゼ阻害剤をコード化する遺伝子
は植物プロモーター、好ましくは構造プロモーター、例
えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ
プロモーターの制御下で、適当なベクター、例えば下記
のｐＣＩＢ７１０ベクター内に挿入され得る。遺伝子、
例えばダイズボウマン−バークプロテアーゼ阻害剤のコ
ード配列はHammond 等, J. Biol. Chem., 259 (1984) 9
883-9890に記載のｃＤＮＡクローニング法を用いて得ら
れ得る。適当なクローンはHammond 等により記載された
雑種選択ｍＲＮＡの免疫沈降によるか、またはアミノ酸
配列から予測されるコード配列の５’末端から５０また
はそれ以上の塩基を含む合成オリゴヌクレオチドでもっ
て低い厳密さでプローブすることにより同定され得る
〔アミノ酸配列はFasman,G. Handbook of Biochemistry
and Molecular Biology, 2 (1976) 611-620 に編集さ
れている〕。例えば、ダイズクニッツトリプシン阻害剤
のための遺伝子をコードするために、プローブとして下
記のオリゴヌクレオチドが使用される：
【化１】
【００５９】クローン化ＤＮＡ断片は例えばMaxam およ
びGilbert, Methods Enzymol., 65(1980) 499-560に記
載の方法を用いて配列決定し、そして翻訳開始部位を同
定し得る。クローン化ＤＮＡ断片がコード配列より長い
場合には、付加的な５’および３’配列がＢａｌ３１で
切断される。クローン化ＤＮＡ断片がコード配列より短
い場合には、クローン化ＤＮＡをｍＲＮＡと共にプライ
マー伸長のためのプライマーとして〔Maniatis等, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), ニュー
ヨーク, コールドスプリングハーバー〕および再クロー
ン化伸長ＤＮＡとして使用される。適当なリンカーはタ
ンパク質をコード化するＤＮＡおよひ選択されたベクタ
ー内に挿入された断片（カセット）例えばｐＣＩＢ７１
０に添加され、その結果、遺伝子は所望のプロモーター
の制御下にある（ｐＣＩＢ７１０内のＣａＭＶ３５
Ｓ）。
【００６０】１００個より少ないアミノ酸を有するプロ
テアーゼ阻害剤、例えばリマビーントリプシン阻害剤の
遺伝子を得るための選択的な方法はそれを合成すること
である。コード配列はバックトランスレーションおよび
各端部で含まれている所望のベクターに適当な制限部位
により予測される。合成遺伝子を３０〜６０個の塩基の
重複オリゴヌクレオチドを合成することにより製造す
る。これらの断片にリン酸を結合し、結合し（Maniatis
等，上掲）、そして適当なベクター内にクローン化す
る。正しい開始部位に挿入されているクローンは配列決
定により同定し得る。プラスミドＤＮＡを分離し、そし
てトウモロコシプロトプラスト内に組み入れるために使
用する。従って本発明は、工程（ａ）ないし（ｇ）に加
えてさらに、 （ｅ２）稔性の植物体に再生され得る工程（ｅ１）のプ
ロトプラストを、それらを遺伝子物質内に安定に組み入
れられる外来ＤＮＡの全部または一部を含む細胞を製造
するために外来ＤＮＡと処理する工程からなる方法も提
供する。
【００６１】稔性の植物体を再生し得るトウモロコシプ
ロトプラストまたはプロトプラスト誘導細胞（細胞壁の
再生後）、特に安定に組み入れられ外来ＤＮＡ、好まし
くはトウモロコシ内に発現される外来ＤＮＡを有するト
ウモロコシプロトプラストおよび細胞がその他の本発明
の好ましい対象である。外来ＤＮＡ、通常はキメラ遺伝
子が、価値ある特性、例えば有害生物（例えば昆虫およ
びダニを含む節足動物、線虫他）にたいする増加した耐
性；病原体（例えば植物病原菌，バクテリア，ウイルス
他）に対する増加した耐性；化学物質〔例えば除草剤
（例えばトリアジン，カルバメート，尿素，ジニトロア
ニリド，スルホニル尿素，イミダゾリノン，トリアゾロ
ピリミジン，ビアラホス，グリホセート他）、殺虫剤ま
たはその他の殺生物剤〕に対する増加した耐性；細胞毒
素（例えばハイグロマイシン，カナマイシン，クロラム
フェニコール他）に対する増加した耐性；不利な環境の
（土壌のまたは大気の）影響（例えば熱，冷たさ，風，
土壌状態，水分，乾燥他）に対する増加した耐性；望ま
しい物質〔例えば葉，種，塊茎，根，茎他において。遺
伝子的に変更された植物体により産生される望ましい物
質はタンパク質，デンプン，糖，アミノ酸，アルカロイ
ド，芳香剤，色素，脂肪他を含む〕の増加した形成；望
ましくない物質（例えば毒素，プロテアーゼ阻害剤，望
ましくない香り，望ましくないタンパク質，脂肪，炭水
化物または二次代謝物他）の減少した形成；または変性
された形態的なまたは生長の表現型の特徴（例えば変更
された高さ，生長性，形態，色彩，強靱性，開花時期
他）を有する形質転換された植物体をその中に提供する
トウモロコシプロトプラストまたはプロトプラスト誘導
組織（細胞壁の再生後）が特に好ましい。安定に組み入
れられた外来ＤＮＡが、Ｂｔ結晶タンパク質の昆虫毒性
（殺虫有効性）を実質的に有するポリペプチドをコード
するキメラ遺伝子が中にあるプロトプラストまたは細胞
が遺伝子導入トウモロコシプロトプラストまたはプロト
プラスト誘導細胞の中でも特に好ましい。
【００６２】工程（ｆ）プロトプラストのプレーティン
グ プロトプラストを培養するためにＤＮＡでの処理をする
か、またはしないで液体培地または固体培地中プレーテ
ィングする。適当な培地の例は、適当な濃度の糖および
植物生長調節剤を含むＫＭ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地お
よびＭＳ培地をベースとするものであるが、これに限定
されない。好ましい培地は固化剤を含むＫＭ培地であ
る。好ましい固化剤はアガロース、特にシープラークア
ガロースである〔欧州特許出願ＥＰ−０１２９６６８号
（Shillito, R. D. 等，1984) 〕。使用の場合、シープ
ラークアガロースの濃度は、０．１％と０．２％ｗ／
ｖ、好ましくは０．６％と１．５％ｗ／ｖの間であり得
る。その他の固化剤の最適濃度は変化してもよいが、容
易に決定され得る。
【００６３】プロトプラストが適当な植物生長調節剤
（例えばオーキシンおよび／またはサイトカイニン他）
の存在下で通常培養される培地はプロトプラストを支持
し、分裂しコロニーを形成する。適当な植物生長調節剤
は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、
３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸（ジカム
バ）、４−アミノ−３，６，６−トリクロロピコリン酸
（ピクロラム）およびパラクロロフェノキシ酢酸（ｐＣ
ＰＡ）を含むが、これに限定されない。生長調節剤の量
が生長調節に有効で非毒性の量である。そのような植物
生長調節剤の濃度は０．０１ないし１００ｍｇ／ｌ、好
ましくは０．１ないし１００ｍｇ／ｌ、より好ましくは
０．１ないし１０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは０．３ない
し３ｍｇ／ｌの範囲が通常である。
【００６４】驚くべきことに、Ｏ−低級アルカノイルサ
リチル酸（Ｏ−アセチルサリチル酸およびその類似体）
単独または植物生長調節剤および／またはＤＭＳＯとの
組合せが植物プロトプラスト、好ましくはトウモロコシ
のプロトプラストの分裂またはそれからのコロニー形成
を促進することを見出した。「低級アルカノイル」とい
う用語は１〜７、好ましくは１〜４、最も好ましくは２
〜３個の炭素原子を有する基を表す。好ましいＯ−低級
アルカノイルサリチル酸はＯ−アセチルサリチル酸およ
びＯ−プロピオニルサリチル酸、最も好ましくはＯ−ア
セチルサリチル酸である。Ｏ−低級アルカノイルサリチ
ル酸の量は細胞分裂およびコロニー形成を促進するのに
十分な量であり、好ましくは生長調節に有効で非毒性の
量である。Ｏ−低級アルカノイルサリチル酸の適当な量
は０．１〜３０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１０〜３００
ｍｇ／ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｌ、そし
て最も好ましくは約１００ｍｇ／ｌである。
【００６５】ＤＭＳＯの量は細胞分裂およびコロニー形
成を促進するのに十分な量である。ＤＭＳＯの適当な量
は０〜３％、好ましくは０．０１〜２％、より好ましく
は０．１〜１％の範囲である。従って本発明は、細胞分
裂およびコロニー形成を促進するのに十分なＯ−低級ア
ルカノイルサリチル酸の生長調節に有効で非毒性の量の
存在下でプロトプラストを培養することからなるプロト
プラスト、好ましくはトウモロコシプロトプラストの分
裂またはそれからのコロニー形成を増加させる方法を提
供する。本発明の好ましい態様において、前記方法はさ
らに、０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜
１００ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／
ｌ、最も好ましくは０．３〜３ｍｇ／ｌの植物生長調節
剤の存在下で行うことからなる。本発明はさらに好まし
い態様において、前記方法はさらに、細胞分裂およびコ
ロニー形成を促進するのに十分な量のＤＭＳＯの存在下
で行うことからなる。好ましいＤＭＳＯの量は０と３
％、好ましくは０．０１と２％、さらに０．１と１％の
間である。
【００６６】プロトプラストの分裂またはコロニー形成
を増加させる方法は全ての植物プロトプラストに適当で
あり、トウモロコシに限定されない。被子植物および裸
子植物、例えば下記の科：ナス科、アブラナ科、キク
科、ユリ科、ブドウ科、アカザ科、ミカン科、パイナッ
プル科、アカネ科、ツバキ科、バショウ科またはイネ
科、およびレグミノセアエ目(Leguminoseae)、特にパリ
オナセアエ科(Papilionaceae) に特に適当である。好ま
しい植物体はナス科、アブラナ科およびイネ科の代表的
なものである。
【００６７】プロトプラストが培養される培地は適当な
細胞、例えばトウモロコシまたはダクチリス・グロメラ
タ(Dactylis glomerata)の生長により予め調整された培
地を含んでいてもよい。プロトプラストは固体または液
体培地中１２週間までの期間、好ましくは６週間、最も
好ましくは３ないし４週間継代培養しないで培養し得
る。選択的に、固体培地は欧州特許出願ＥＰ−０１２９
６６８号（Shillito, R. D. 等，1984) に記載されてい
るように液体培地中に置くか、またはプロトプラストの
分裂および／またはコロニー形成を支持するその他の方
法で処理し得る。一つの適当な培地はShneyour等, Plan
t Science Lett., 33 (1984) 293およびSmith 等, Plan
t Science Lett., 36 (1984) 67 、および実施例８ｓに
記載されているナース細胞と関連した培養である。
【００６８】プロトプラストは明所で、好ましくは暗所
において、０℃と５０℃、好ましくは２０℃と３２℃、
最も好ましくは２５℃と２８℃の間の温度で培養され
る。光強度は典型的には０．１と２００μＥ／ｍ2 ｓｅ
ｃ（マイクロアインシュタイン／ｍ2 秒）、好ましくは
０．１と１００μＥ／ｍ2 ｓｅｃ、より好ましくは３０
と９０μＥ／ｍ2 ｓｅｃ、最も好ましくは１０と４０μ
Ｅ／ｍ2 ｓｅｃの間である。
【００６９】図４は固体培地に培養したプロトプラスト
から生長するカルスを示し、図５は工程（ｆ）によるプ
ロトプラストから誘導されるカルスを示す。このカルス
は保持培地上で、工程（ａ）においてカルスのために記
載されたように継代培養し、そして工程（ｇ）による再
生培地上で継代培養するか、または工程（ｇ）による再
生培地上で直接継代培養することができる。
【００７０】工程（ｇ）小植物体の再生 工程（ｆ）によるプロトプラストから形成されるカルス
を稔性の植物体に再生させるための適当な培地上に１度
またはそれ以上継代培養する。適当な培地のいくつかの
例は、適当な濃度で糖、植物生長調節剤および場合によ
ってはＤＭＳＯを含むＮ６培地、Ｂ５培地、ＭＳ培地ま
たはＫＭ培地をベースとするものであるが、これに限定
されない。好ましくは培地は生長調節剤を含まない、ま
たは小植物体の再生を刺激するサイトカイニンおよび／
またはその他の植物生長調節剤を含むおよび／または工
程（ｆ）に記載されたようなＯ−低級アルカノイルサリ
チル酸、場合によってはＤＭＳＯとさらに組み合わせて
含むＮ６培地である。適当な期間の後、典型的には１週
ないし６ヵ月後、より典型的には１ないし３ヵ月後、カ
ルスは分化細胞および細胞集合体を含むようになる（図
６）。カルスは適当な期間の後、典型的には１週ないし
６ヵ月後、より典型的には１ないし３ヵ月後、小植物体
を形成するようにさらに分化する。カルスはこの段階で
明所で培養される。光強度は典型的には０．１と１００
μＥ／ｍ2 ｓｅｃ、３０と８０μＥ／ｍ2 ｓｅｃの間で
ある。細胞またはカルスが小植物体を再生する前に胚ま
たは後期胚を形成する方法が特に好ましい。
【００７１】工程（ｈ）小植物体から稔性の植物体の製
造 小植物体を適当な培地、例えば植物生長調節剤を含まな
いＮ６培地に移す。選択的に、根または新芽の生長を刺
激する生長調節剤を添加してもよい。小植物体が根を形
成するまでこの培地上で小植物体を培養する。根形成に
要する時間は典型的には１ないし６週間、より典型的に
は約２週間である。根および若芽が十分に生長したら、
植物を土壌に移し、そして穏やかに寒さに晒す。この段
階での十分な長さは１ないし１０ｃｍ、より典型的には
２ないし５ｃｍの範囲であり、そして若芽は１ないし１
５ｃｍ、より典型的には２ないし１０ｃｍの範囲であ
る。
【００７２】植物を開花まで生長させ、そして慣用の方
法で有性の後代または生長するムカゴを得る。外来ＤＮ
Ａを含有する遺伝子導入トウモロコシ植物体を培養体に
維持しても、また植物体に再生させてもよい。外来ＤＮ
Ａを導入し得るトウモロコシ植物細胞は、外来遺伝子を
適当なレベルで受容し、複製し、そして発現し得るあら
ゆるトウモロコシ植物細胞を含む。いくつかの適当なト
ウモロコシ植物細胞は、例えば近交系Ｆｕｎｋ５Ｎ９８
４，Ｆｕｎｋ５Ｎ９８６，Ｆｕｎｋ２７１７，Ｆｕｎｋ
２１１Ｄ，Ｆｕｎｋ２Ｎ２１７Ａ，Ｂ７３，Ａ６３２，
ＣＭ１０５，Ｂ３７，Ｂ８４，Ｂ１４，ＭＯ１７，Ｒ１
６８，ＭＳ７１，Ａ１８８，ＦＡ９１，Ａ６４１および
Ｗ１１７から分離される細胞を含む。全ての優良遺伝子
型が好ましい。全ての近交系がより好ましい。全ての優
良近交系、特に優良近交系Ｆｕｎｋ５Ｎ９８４，Ｆｕｎ
ｋ５Ｎ９８６，Ｆｕｎｋ２７１７，Ｆｕｎｋ２１１Ｄお
よびＦｕｎｋ２Ｎ２１７Ａ、さらに優良近交系Ｆｕｎｋ
２７１７が最も好ましい。培養体において特に植物細胞
を支持し得る培養培地は、使用されるトウモロコシ植物
細胞の遺伝子型に依存し得る。例えばいくつかの適当な
培地は、適当な濃度で糖および植物生長調節剤を含むＭ
Ｓ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地およびＫＭ培地を含むが、
これに限定されない。
【００７３】このように本発明は、（ｅ１）細胞および
工程（ｄ）の細胞集合体から稔性の植物体を再生するこ
とができるプロトプラストを製造し、（ｆ）プロトプラ
ストが分裂し、そして細胞を形成する適当な培地中にプ
ロトプラストをプレーティングし、（ｇ）小植物体を再
生するために工程（ｆ）から生成される細胞を継代培養
し、そして（ｈ）該小植物体を生長培地上で培養し、稔
性の植物体を得る工程からなる、プロトプラストからト
ウモロコシ植物体を再生する方法を提供する。
【００７４】トウモロコシプロトプラストが安定に組み
入れられた外来ＤＮＡを含有し、好ましくは外来ＤＮＡ
がトウモロコシ植物体内で発現され得る方法が好まし
い。トウモロコシプロトプラストが、０．０１ないし１
００ｍｇ／ｌの植物生長調節剤（好ましくは２，４−
Ｄ、ジカムバ、ピクロラムまたはｐＣＰＡ、最も好まし
くは２，４−Ｄ）の存在下で、そして細胞分裂またはコ
ロニー形成を促進するのに十分な量のＯ−低級アルカノ
イルサリチル酸（好ましくはＯ−アセチルサリチル酸ま
たはＯ−プロピオニルサリチル酸、最も好ましくはＯ−
アセチルサリチル酸）の存在下で培養される方法がより
好ましい。さらに、細胞分裂またはコロニー形成を促進
するのに十分な量のＤＭＳＯの存在下で行うことからな
る方法が最も好ましい。
【００７５】本発明は、遺伝子物質内に組み入れられた
外来ＤＮＡの全部または一部を含有する細胞を生成する
ために、稔性の植物体に再生されることができるトウモ
ロコシプロトプラストを外来ＤＮＡで処理することから
なる稔性の遺伝子導入植物体に再生されることができる
遺伝子導入トウモロコシプロトプラストを製造する方法
をも提供する。さらに、本発明はプロトプラストまたは
プロトプラスト誘導細胞から再生されたトウモロコシ植
物体およびそれらのムカゴに関し、そしてそれらの後代
に関する。安定に組み入れられた外来ＤＮＡ、好ましく
はトウモロコシ内に発現され得る外来ＤＮＡを有する再
生植物体、ムカゴおよびそれらの後代が好ましい。適当
な外来ＤＮＡは、例えば以前に記載した、または以後に
記載されるであろうキメラ遺伝子である。「ムカゴ」と
いう用語は有性または無性生殖し得る、または生体内ま
たは試験管内で増殖し得るあらゆる植物材料を含む。そ
のようなムカゴは好ましくは再生植物体のプロトプラス
ト、細胞、カルス、組織、胚または種子からなる。再生
植物体およひ再生遺伝子導入植物体の後代は突然変異体
および変種を含む。
【００７６】殺虫性トウモロコシ植物体 本発明はキメラＢｔ毒素遺伝子の製造に関する。意図さ
れるトウモロコシ植物細胞は、外来ＤＮＡが導入され、
複製され、そして発現されるトウモロコシ植物体の全て
の遺伝子型（変種，栽培変種，近交系，雑種他）からの
細胞を含む。いくつかの適当なトウモロコシ植物遺伝子
型は、例えばＦｕｎｋ５Ｎ９８４，Ｆｕｎｋ５Ｎ９８
６，Ｆｕｎｋ２７１７，Ｆｕｎｋ２１１Ｄ，Ｆｕｎｋ２
Ｎ２１７Ａ，Ｂ７３，Ａ６３２，ＣＭ１０５，Ｂ３７，
Ｂ８４，Ｂ１４，Ｍｏ１７，Ｒ１６８，ＭＳ７１，Ａ１
８８，ＦＡ９１，Ａ６４１およびＷ１１７のような近交
系を含むが、これに限定されない。Ｆｕｎｋ５Ｎ９８４
およびＦｕｎｋ５Ｎ９８６が有用なトウモロコシ遺伝子
型のその他の例である。好ましくは遺伝子型は優良遺伝
子型であり、より好ましくはＦｕｎｋ５Ｎ９８４，Ｆｕ
ｎｋ５Ｎ９８６，Ｆｕｎｋ２７１７，Ｆｕｎｋ２１１Ｄ
およびＦｕｎｋ２Ｎ２１７Ａからなる群から選択される
優良近交系であり、そして最も好ましくは優良近交系Ｆ
ｕｎｋ２７１７である。
【００７７】本発明のキメラ遺伝子はトウモロコシ植物
体内で有効に機能するプロモーター領域およびＢｔから
の結晶タンパク質またはＢｔから結晶タンパク質の殺虫
性を実質的に有するポリペプチドをコードする領域を含
む。キメラ遺伝子のコード配列が、天然の遺伝子におけ
る前記プロモーターと結合しているということは公知で
はない。５’および／または３’非翻訳領域は、独立し
て、本来プロモーターもしくはコード領域に結合し得る
か、またはプロモーターもしくはコード領域のいずれに
も結合し得ないかのいずれかである。好ましくは５’お
よび／または３’非翻訳領域は天然の遺伝子内のプロモ
ーターと結合し、そして最も好ましくは５’および／ま
たは３’非翻訳領域の両方が天然の遺伝子内のプロモー
ターと結合している。
【００７８】トウモロコシ細胞があらゆるレベルで、そ
して特に細胞に殺虫性を付与するのに十分なレベルで、
殺虫性ポリペプチドを発現するということは、本発明が
なされた時点での当該分野の状態に基づいては想到し得
なかった。とりわけ、Ｂｔ結晶タンパク質の昆虫毒性を
有するポリペプチドと同程度の大きさで不溶性のポリペ
プチドが植物細胞内に発現されることは特に困難である
と考えられていた。殺虫性であると見なされるために、
植物細胞はＢｔからの結晶タンパク質の殺虫性を実質的
に有する毒素の殺虫量を含有しなければならない。殺虫
量は、植物細胞内に存在する場合には昆虫の幼虫を殺す
か、または少なくともそれらの摂食を実質的に減少させ
る量である。
【００７９】遺伝子 転写調節配列 本発明のキメラ遺伝子はトウモロコシ植物体内で機能す
るプロモーター並びに５’および／または３’非翻訳領
域からなる転写調節配列を含む。これらの配列は独立し
てあらゆる源、例えばウイルス、植物または細菌の遺伝
子から誘導され得る。使用に適したウイルスのプロモー
ター並びに５’および／または３’非翻訳領域はトウモ
ロコシ植物体内で機能し、そして例えば植物ウイルス例
えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）から得
られる。カリフラワーモザイクウイルスはHohn等により
同定され、Current Topics in Microbiology and Immun
ology,96 (1982) 194-220および補遺ＡないしＧに記載
されている。この記載は参照により本明細書に編入す
る。ＣａＭＶは二重鎖ＤＮＡを含む非典型的な植物ウイ
ルスである。少なくとも２つのＣａＭＶプロモーターが
植物体内で機能するが、ＣａＭＶの遺伝子ＶＩの転写を
生じる、すなわち１９Ｓプロモーターおよび３５Ｓ転写
のプロモーターである。１９Ｓプロモーターおよび３５
Ｓプロモーターは、本発明における使用には好ましい植
物ウイルスのプロモーターである。ＣａＭＶの１９Ｓプ
ロモーターおよび５’非翻訳領域は上記Hohn等の文献の
１９９頁の第４図に示された地図のような制限地図によ
って、またはHohn等の文献の補遺Ｃに示す配列から得ら
れ得る。ＣａＭＶの１９Ｓプロモーターおよび場合によ
っては隣接する５’非翻訳領域を分離するために、所望
の配列を含むＣａＭＶゲノムの制限断片が選択される。
１９Ｓプロモーターおよび５’非翻訳領域を含む適当な
制限断片は上記Hohn等の文献の第４図および補遺Ｃの５
３８６位で始まるPstI部位と５８５０位で始まるHindII
I 部位との間の断片である。類似の方法により、ＣａＭ
Ｖの３５Ｓプロモーターは下記の実施例６のように得ら
れ得る。
【００８０】制限断片における望ましくないヌクレオチ
ドは場合によっては標準法により除去されてもよい。望
ましくないヌクレオチドを除去するいくつかの適当な方
法はヌクレアーゼ〔Maniatis等, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, (1982), 135-138 〕およびオリゴ
ヌクレオチド関連突然変異体〔ZollerおよびSmit, Met
h. Enzymol., 100 (1983) 468-500〕の使用を含む。望
ましい３’非翻訳領域を得るために、同様の方法を用い
てもよい。例えば適当なＣａＭＶ１９Ｓ遺伝子３’非翻
訳領域配列は、上記Hohn等の文献の第４図および補遺Ｃ
のＣａＭＶ遺伝子の７３４２位で始まるEcoRV 部位と７
６４３位のBglII との間の領域を分離することにより得
られ得る。
【００８１】本発明における使用に適した植物遺伝子の
プロモーター並びに５’および３’非翻訳領域の例はま
た、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼおよ
びクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質の小さいサブユニ
ットをコードするそれらの遺伝子を含む。これらの植物
の遺伝子領域は、ＣａＭＶから相当する領域を分離する
ために上記された方法に適合した方法において植物細胞
から分離され得る；Moerlli 等，Nature, 315 (1985) 2
00-204参照。細菌の遺伝子からの適当なプロモーター並
びに５’非翻訳領域および３’非翻訳領域は、アグロバ
クテリウムプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に存在するもの
を含む。適当なアグロバクテリウムプラスミドのいくつ
かの例は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスの
Ｔｉプラスミドおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス
のＲｉプラスミドを含む。本発明において有用なアグロ
バクテリウムのプロモーター並びに５’および３’非翻
訳領域は特にオクトピンシンターゼおよびノパリンシン
ターゼをコードする遺伝子内に存在するものである。こ
れらの配列はＣａＭＶおよび植物プロモーターおよび非
翻訳配列を分離するための上記の類似した方法により得
られ得る；Bevan 等，Nature, 304 (1983) 184-187参
照。
【００８２】コード領域 キメラ遺伝子のコード領域はＢｔδエンドトキシン結晶
タンパク質の毒性を実質的に有するポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含む。本発明の目的のために
ポリペプチドは、それがＢｔの亜種からの結晶タンパク
質と同様に、類似した範囲の昆虫幼虫に対して殺虫性で
ある場合、Ｂｔδエンドトキシン結晶タンパク質の毒性
を実質的に有する。いくつの適当な亜種は、例えばバチ
ルス スリンギエンシス クルスタキ変種(Bt var. kur
staki)；バチルス スリンギエンシス ベルリナー変種
(Bt var. berliner)；バチルス スリンギエンシス ア
レスチ変種(Bt var. alesti) ；バチルス スリンギエ
ンシス トルウオルチ変種(Bt var. tolworthi) ；バチ
ルス スリンギエンシス ソットー変種(Bt var. sott
o) ；バチルス スリンギエンシス デンドロリマス変
種(Bt var. dendrolimus) ；バチルス スリンギエンシ
ス テネブリオニス変種(Bt var. tenebrionis) ；バチ
ルス スリンギエンシス サンジェゴ変種(Bt var. san
diego)；およびバチルス スリンギエンシス アイサワ
イ変種(Bt var. aisawai) を含む。好ましい亜種はＢｔ
クルスタキ変種、そして特にＢｔクルスタキ変種ＨＤ１
である。
【００８３】コード領域はＢｔ内にもともと存在してい
てもよい。選択的に、コード領域はＢｔ内に存在する配
列とは異なるが、しかし遺伝子コードの縮重のために等
価である。キメラ遺伝子のコード配列は天然に生じる結
晶タンパク質δエンドトキシンとは異なるポリペプチド
をコードしてもよいが、しかし結晶タンパク質の昆虫毒
性を実質的に依然として有する。そのようなコード配列
は通常天然のコード領域の異形である。天然のＤＮＡ配
列の「異形」とは、同一機能を示す天然の配列の変更さ
れた形である。異形は突然変異体であってよく、また合
成ＤＮＡ配列であってよく、そして実質的に相当する天
然の配列に類似している。「実質的な配列の類似」は類
似の特性を有するタンパク質を産生する他のＤＮＡ断片
に十分類似したヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片；
または類似の特性を示す他のポリペプチドに十分類似し
たアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかに関す
る。ＤＮＡ配列の有効部分の少なくとも７０％、好まし
くは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくと
も９０％が類似している場合に、通常ＤＮＡ配列は第二
のＤＮＡ配列に実質的に類似している。あるものの他へ
の置換が不活動突然変異を構成する場合、２つの異なる
ヌクレオチドは、実質的な類似を決定するためのコード
領域のＤＮＡ配列において類似していると見なされる。
【００８４】このように本発明は開示され、そして特許
請求されている要求を満足させる殺虫性を有するアミノ
酸配列をコードするあらゆるキメラ遺伝子を含む。ヌク
レオチド配列が殺虫有効性に関する天然の配列の部分に
少なくとも実質的に類似するものが好ましい。本発明の
キメラ遺伝子により発現されるポリペプチドは、それが
少なくともいくつかの抗原決定基を有するから、一般
に、天然のＢｔ結晶タンパク質の有する少なくともいく
つかの免疫学的特性を有するであろう。従って、本発明
のキメラ遺伝子によりコードされるポリペプチドはＢｔ
により産生される結晶タンパク質のδエンドトキシンに
好ましくは構造的に関連する。Ｂｔは約１３００００な
いし１４００００の分子量を有するプロトキシンである
サブユニットを有する結晶タンパク質を産生する。この
サブユニットをプロテアーゼまたはアルカリにより開裂
し、５００００という低い、そして可能性としてより低
い分子量を有する殺虫性断片を形成する。本発明に係る
プロトキシンのそのような断片またはそれらのより小さ
い部分をコードするキメラ遺伝子は、その断片またはそ
の部分が不可欠の殺虫有効性を有する限りは構成され得
る。プロトキシン、プロトキシンの殺虫性断片およびこ
れら断片の殺虫性部分はその他の分子、例えばポリペプ
チドに融合され得る。
【００８５】本発明における使用に適当なコード領域
は、Ｂｔから分離される結晶タンパク質毒素遺伝子から
得られてもよく、例えばWhiteley等，ＰＣＴ出願ＷＯ８
６−０１５３６号および米国特許第４４４８８８５号お
よび同第４４６７０３６号参照。結晶タンパク質をコー
ドするヌクレオチドの好ましい配列は、配列番号：１の
１５６〜３６２３位のヌクレオチドまたはそのような結
晶タンパク質の殺虫性断片をコードする、より短い配列
として示されるものである；Geiser等, Gene, 48(1986)
109-118 。従って、本発明は配列番号：１のヌクレオ
チド配列を有する遺伝子、該遺伝子に実質的に類似な配
列を有する遺伝子、および配列番号：２の配列および該
配列に実質的に類似な配列を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子に関し、そして好ましくはそれらの中で植
物体、最も好ましくはトウモロコシ内で発現されるもの
に関する。配列番号：１の１５６〜３６２３位のヌクレ
オチドにより規定されるコード領域は、配列番号：２の
配列のポリペプチドをコード化する。
【００８６】配列番号：１はバチルス スリンギエンシ
ス クルスタキ変種ＨＤ１からのエンドトキシン遺伝子
のヌクレオチド配列を示す。結晶タンパク質をコードす
るヌクレオチドの好ましい配列はそのような結晶タンパ
ク質の殺虫性断片をコードする配列において１５６〜３
６２３のヌクレオチドまたはより短い配列として示され
るものである；Geiser等, Gene, 48 (1986) 109-118 。
従って、本発明はさらに、配列番号：２の配列を有する
ポリペプチドまたは該ポリペプチドの殺虫性部分にも関
する。さらに、あるＢｔ株は鱗翅目の昆虫以外のものに
毒性である。特にＢｔテネブリオニス変種は甲虫目の昆
虫に毒性である。Ｂｔサンジェゴ株の甲虫目の昆虫に対
する毒性および関連する毒素遺伝子の配列はHerrnstadt
およびSoaresによりＥＰ−０２０２７３９号および同０
２１３８１８号に記載されている。
【００８７】ベクター 本発明のキメラ遺伝子を植物細胞内に導入するために、
遺伝子を最初にベクター内に挿入する。遺伝子が形質転
換に十分な量で利用できない場合には、ベクター宿主細
胞内での複製により増幅させてもよい。増幅のための最
も慣用の宿主細胞は細菌細胞または酵母細胞である。十
分量のキメラ遺伝子が利用できる場合、それを本発明に
従ってトウモロコシプロトプラスト内に導入する。遺伝
子のトウモロコシ植物体への導入は、複製のために用い
られたのと同じヘクターによっても、また異なるベクタ
ーによってもよい。キメラ遺伝子を複製するのに適当な
細菌の宿主細胞のいくつかの例は、エスケリッチア属の
もの、例えば大腸菌およびアグロバクテリウム属のも
の、例えばアグロバクテリウム チュメファシエンスま
たはアグロバクテリウム リゾゲネスを含む。細菌内で
非相同の遺伝子をクローニングする方法はCohen 等の米
国特許第４２３７２２４号および同第４４６８４６４号
に記載されている。大腸菌内でＢｔの結晶タンパク質を
コードする遺伝子の複製はWong等, J. Biol. Chem., 25
8 (1983) 1960-1967に記載されている。
【００８８】本発明の遺伝子を複製するのに適当な酵母
宿主細胞のいくつかの例は、サッカロミセス属のものを
含む。キメラ遺伝子が挿入され、そして適当な宿主細
胞、例えば細菌または酵母内で複製するベクターは、本
発明の遺伝子を増幅するために使用してもよい。ベクタ
ーは例えばファージまたはプラスミドから誘導され得
る。本発明において有用なファージから誘導されるベク
ターのいくつかの例はＭ１３およびラムダから誘導され
るものを含む。Ｍ１３から誘導されるいくつかの適当な
ベクターはＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９を含
む。ラムダから誘導されるいくつかの適当なベクターは
ラムダｇｔ１１、ラムダｇｔ７およびラムダシャロン４
を含む。
【００８９】細菌内での複製に特に適当であるプラスミ
ドから誘導されるいくつかのベクターはｐＢＲ３２２
〔Bolivar 等, Gene, 2 (1977) 95-113 ；ｐＵＣ１８お
よびｐＵＣ１９〔Narrander 等, Gene, 26 (1983) 101-
104 ；およびＴｉプラスミド〔Bevan 等, Nature, 304
(1983) 184-187〕を含む。細菌内で遺伝子を増幅する好
ましいベクターはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８およびｐＵ
Ｃ１９である。
【００９０】複製のためのベクターの製造 細菌内での複製に適したキメラ遺伝子を製造するため
に、プロモーター配列、５’非翻訳配列、コード配列お
よび３’非翻訳配列を適当なベクター、例えば上記のベ
クター内に挿入し、適当な順序に集める。適当であるな
らば、ベクターは宿主細胞内で複製できなければならな
い。プロモーター、５’非翻訳領域、コード領域および
３’非翻訳領域をは本発明のキメラ遺伝子を構成し、最
初にベクターの外で１つのユニットに結合されて、そし
て次にベクター内に挿入されてもよい。選択的に、キメ
ラ遺伝子の部分はベクター内に別々に挿入され得る。ベ
クターはまた好ましくは、ベクターを含む細胞の選択を
可能にする宿主細胞に特徴を与える遺伝子を含む。好ま
しい特徴は抗生物質耐性である。有用な抗生物質のいく
つかの例はアンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロ
マイシン、Ｇ４１８およびネオマイシンを含む。
【００９１】ベクター内での遺伝子の挿入または集合は
標準法、例えば組換えＤＮＡ〔Maniatis等, (1982)〕お
よび相同組換え〔Hinnen等, Proc. Natl. Acad. Sci.,
75 (1978) 1929-1933 〕の使用により行われる。公知の
組換えＤＮＡ法を使用して、ベクターを切断し、所望の
ＤＮＡ配列をベクターの切片の間に挿入し、そして所望
のＤＮＡ配列の端部をベクターの相当する端部に連結す
る。ベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼにより非
常に便宜的に切断される。いくつかの適当な制限エンド
ヌクレアーゼはブラント末端を形成するもの、例えばSm
aI、HpaIおよびEcoRV 、および粘着端を形成するもの、
例えばEcoRI 、SacIおよびBamHI を含む。所望のＤＮＡ
配列は通常、大きいＤＮＡ分子、例えば染色体、プラス
ミド、トランスポゾンまたはファージの部分として存在
する。所望のＤＮＡ配列はその源から切り出され、そし
て端部が切断されたベクターの端部に結合され得るよう
に、場合によっては修飾される。所望のＤＮＡ配列と切
断されたベクターの端部がブラント末端である場合に
は、それらはブラント末端リガーゼ、例えばＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより結合される。
【００９２】望ましいＤＮＡ配列の末端は粘着端の形態
で切断されたベクターの末端に結合されてもよく、その
場合には粘着端リガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼであって
よい。その他の適当な粘着端リガーゼは例えば大腸菌Ｄ
ＮＡリガーゼを含む。粘着端は所望のＤＮＡ配列および
ベクターを同一の制限エンドヌクレアーゼで切断するこ
とにより非常に便宜的に形成される。そのような場合、
望ましいＤＮＡ配列および切断されるベクターは互いに
相補的な粘着端を有する。粘着端は所望のＤＮＡ配列の
末端および切断されたベクターに相補的なホモポリマー
尾部を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼを使用するか、または特定の制限エンドヌクレアーゼ
により認められる合成オリゴヌクレオチド配列を添加す
ることにより添加し、そしてエンドヌクレアーゼで配列
を開裂することによって製造され得る；例えばManiatis
等, (1982)参照。
【００９３】植物体の形質転換のためのベクターの製造 Ｂｔ毒素またはＢｔ様毒素をコードするキメラ遺伝子に
加えて、ベクターは好ましくはさらに、ベクターを含ま
ない細胞の存在下にベクターを含むトウモロコシ植物細
胞の選択またはスクリーニングを可能にするＤＮＡ配列
からなる。そのような選択できる、またはスクリーニン
グできるマーカーは本発明のキメラ遺伝子が導入される
ベクター内にもともと存在していても、またはキメラ遺
伝子の導入前または導入後にベクター内に導かれてもよ
い。選択的に、選択できる、またはスクリーニングでき
るマーカー遺伝子またはそれらの部分は最初に所望のキ
メラ遺伝子またはそれらのあらゆる部分に結合させ、そ
して再結合された遺伝子または遺伝子断片をベクター内
にユニットとして導入してもよい。選択できる、または
スクリーニングできるマーカーはそれ自身キメラであっ
てよい。
【００９４】好ましい選択できるマーカーは抗生物質耐
性をコードする遺伝子である。遺伝子は細胞内で発現さ
れ得、形質転換されなければならない。細胞を抗生物質
含有培地中で培養し得、そしてその培地中で生存する高
められた能力を有するベクターを含むそれらの細胞が選
択される。トウモロコシ毒素、例えばハイグロマイシン
またはＧ４１８に対する耐性を付与する遺伝子が選択で
きるマーカーとして有用である。抗生物質耐性を与える
遺伝子のいくつかの例は、ネオマインシ、ホスホトラン
スフェラーゼ〔カナマイシンおよびＧ４１８耐性，Velt
en等, The EMBO Journal, 3, (1984) 2723-2730 〕；ハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ〔ハイグロマ
イシン耐性，van den Elzen 等, Plant Molec. Biol.,
5 (1985) 299-302〕を含む。
【００９５】トウモロコシ植物体を形質転換する好まし
いベクターは、Ｂｔ毒素コード領域に機能的に結合した
ＣａＭＶ３５Ｓおよび選択できるマーカー遺伝子、例え
ばＧ４１８耐性およびハイグロマイシン耐性に機能的に
結合したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターからなる。そのよ
うなベクターの例は下記のようなｐＣＩＢ７１０／３５
Ｓ（Ｇ４１８耐性）およびｐＩＲＶ（ハイグロマイシン
耐性）である。本発明はまた稔性の植物体、Ｂｔ結晶毒
素またはＢｔ結晶毒素の昆虫毒性を実質的に有するポリ
ペプチドを発現するキメラ遺伝子を含む細胞をも含む。
【００９６】殺虫剤 本発明の植物細胞はキメラ遺伝子を含み、そしてＢｔ結
晶タンパク質の昆虫毒性を実質的に有するポリペプチド
を製造するために使用し得る。植物細胞それ自身殺虫剤
を構成し得る。殺虫剤として直接使用される植物細胞は
培養された植物細胞であっても、または生存している植
物の部分であってもよい。毒素は植物細胞から公知の方
法、例えば抽出またはクロマトグラフィーにより分離さ
れ得る。抽出物は全体の植物抽出物であっても、また部
分的に精製された抽出物であってもよく、またポリペプ
チドの純粋精製物であってもよい。あらゆるそのような
抽出物またはクロマトグラフ分離物がＢｔからの結晶タ
ンパク質として同様の方法で使用し得る；例えばDeaco
n, Aspects of Microbiology, 7 (1983) Cole等編, ア
メリカン・ソサイアティー・フォー・ミクロバイオロジ
ーおよびMiller等, Science, 219 (1983) 715 参照。
【００９７】本発明の殺虫性細胞は、トウモロコシの細
胞および植物体を攻撃する鱗翅目の昆虫、例えばコーン
・イアーウォーム(corn earworm, Heliothis zea) およ
びヨーロピアン・コーン・ボラー(European corn bore
r, Ostrinia nubilalis) に対して毒性である。さらに
Ｂｔテネブリオニス変種の結晶毒素遺伝子を産生するト
ウモロコシの細胞は甲虫目の害虫に毒性である。甲虫目
に属する重要な害虫は例えばコロラド・ジャガイモ甲虫
(Colorado patato beetle)、ボール・ビービル(boll we
evil) およびコーン・ルート・ウォーム(corn root wor
m)である。従って、本発明は、（ａ）遺伝子のプロモー
ター、５’非翻訳領域および場合によっては３’非翻訳
領域が植物または植物ウイルス遺伝子から誘導され、バ
チルス スリンギエンシス（Ｂｔ）結晶タンパク質の昆
虫毒性を実質的に有するポリペプチドをコードする遺伝
子をトウモロコシ細胞に導入し、そして（ｂ）前記ポリ
ペプチドを発現させることから、バチルス スリンギエ
ンシス結晶タンパク質の昆虫毒性を実質的に有するポリ
ペプチドをトウモロコシ内に導入する方法を提供する。
本発明はまた、バチルス スリンギエンシス結晶タンパ
ク質の昆虫毒性を実質的に有するバチルス スリンギエ
ンシス結晶毒素またはポリペプチドをコードする遺伝子
を含有する遺伝子導入トウモロコシ細胞の殺虫量を幼虫
に与えることからなる昆虫の幼虫を防除する方法を提供
する。
【００９８】本発明はまた、本発明のキメラ遺伝子を含
む遺伝子導入トウモロコシ植物細胞の殺虫量を鱗翅目の
幼虫に与えることからなる該幼虫を殺すか、または防除
する方法を含む。植物細胞は培養された植物細胞であっ
ても、また生存している植物体の部分であってもよい。
さらに本発明はまた、Ｂｔテネブリオニス変種の結晶毒
素のコード配列を有するキメラ遺伝子またはそれらの殺
虫性部分を含む細胞の殺虫量を鱗翅目の昆虫に与えるこ
とによる該幼虫を殺す方法も含む。さらに本発明は、種
子が挿入されたキメラ遺伝子およびそれらから生じる望
ましい特徴を有する限り、本発明に従って遺伝子操作さ
れた植物体のトウモロコシ種子を含む。有性および無性
の後代を含む本発明により製造された植物体の後代はそ
の他の態様である。有性の後代は自家受粉または他家受
粉から生じ得る。
【００９９】
【発明の実施の形態】
有用性 本発明のトウモロコシのプロトプラストを稔性の植物体
に再生させることを可能とする。この可能性は植物体は
ゲノム内に安定に外来ＤＮＡ（例えばＢｔ結晶タンパク
質をコードする遺伝子）を導入することを可能にし、そ
してそれらの植物の表現型を変える。さらに、核ＤＮＡ
の新規な組換え体または核およびオルガネラＤＮＡの新
規な組換え体を製造するために、プロトプラストは同一
または異なる種からのプロトプラストと融合され得る。
この後者の可能性は例えば新規な品種改良目的の雄性無
菌植物体を製造することを可能とする。さらに、プロト
プラストをクローン材料の源として使用することもで
き、突然変異誘導および／または望ましい表現型のため
の選択が行える。望ましい表現型の例は、例えば植物病
原性化学物質、病原体、有害生物、不利な環境条件に対
する増加した耐性、変性された形態的な特徴または生長
の特徴および代謝物質の変更された含量である。
【０１００】
【実施例】
実施例１ａ：トウモロコシ、遺伝子型Ｆｕｎｋ２７１７
のカルスの特定タイプの調製 遺伝子型Ｆｕｎｋ２７１７のトウモロコシ植物体を温室
中で開花するまで生長させ、同じ遺伝子型からの花粉で
受粉させる。長さ１．５ないし２．５ｍｍの胚を含む未
熟な穂軸を植物体から除去し、そして１０％クロロック
ス溶液中２０分間殺菌する。胚を穀粒から除去し、そし
て胚軸を下方に向けて２，４−Ｄ０．１ｍｇ／ｌ、ショ
糖６％ｗ／ｖおよびＬ−プロリン２５ｍＭを含みゲルラ
イト０．２４％ｗ／ｖで固化させたＭＳ培地（開始培
地）上に置く。暗所中２７℃で２週間の培養後、胚盤上
に生長しているカルスを胚から除去し、そしてゲルライ
トで固化させたＢ５培地（２，４−Ｄ０．５ｍｇ／ｌ）
上に置く。材料を２週間毎に新鮮培地に継代培養する。
胚を開始培地上に置いてから約８週間後、カルスの特定
のタイプをその特徴的な形態により同定する。このカル
スを同じ培地上でさらに継代培養する。さらに２ヵ月
後、２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌを含み、そしてゲルライトで
固化させたＮ６培地に移し、そして連続的にカルスを継
代培養する。
【０１０１】実施例１ｂ：トウモロコシ、遺伝子型Ｆｕ
ｎｋ５Ｎ９８４のカルスの特定タイプの調製 遺伝子型Ｆｕｎｋ５Ｎ９８４のトウモロコシ植物体を温
室中で開花するまで生長させ、同じ遺伝子型からの花粉
で受粉させる。長さ１．５ないし２．５ｍｍの胚を含む
未熟な穂軸を植物体から除去し、そして１５％クロロッ
クス溶液中２０分間殺菌する。胚を穀粒から除去し、そ
して胚軸を下方に向けて２，４−Ｄ１．０ｍｇ／ｌ、シ
ョ糖２％ｗ／ｖ、カゼイン加水分解１００ｍｇ／ｌ、ミ
オイノシトール１００ｍｇ／ｌおよびＬ−プロリン２５
ｍＭを含みフィトアガー０．８％ｗ／ｖで固化させたシ
エンクおよびヒルデン培地(Can. J. Bot., 50 (1972) 1
98-204) （開始培地）上に置く。暗所中２７℃で２週間
の培養後、好ましいカルスは、ある種の外植体の胚盤上
に生長している十分に形成された球形の体細胞の胚の存
在により認められる。これらのカルスを除去し、そして
Ｂ５培地（２，４−Ｄ０．５ｍｇ／ｌとショ糖２％ｗ／
ｖ，カゼイン加水分解物１００ｍｇ／ｌ，ミオイノシト
ール１００ｍｇ／ｌとＬ−プロリン２５ｍＭ）またはシ
エンクおよびヒルデン培地（上記と同様）のいずれかの
上に置く。材料を２週間毎に新鮮培地に継代培養する。
胚を開始培地上に置いてから最低８週間後、カルスの特
定のタイプをその特徴的な形態により同定する。このカ
ルスを同じ培地上でさらに継代培養してもよいが、しか
し好ましくは２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌを含み、そしてゲル
ライトで固化させたＮ６培地に移し、そして連続的にカ
ルスを継代培養する。胚形成懸濁培養体は実施例２に概
略を示した方法により、これらのカルスから製造しても
よい。
【０１０２】実施例２：トウモロコシ遺伝子型Ｆｕｎｋ
２７１７の懸濁液の調製 実施例１ａに記載したカルスを全体で少なくとも６ヵ月
間培養液内に保つ。継代培養に選択されたカルスのタイ
プは、割合に稔性でない。そして液体培地内に位置して
いる個々の細胞集合体に分離するように粒状で非常に砕
けやすい。大きな生長した細胞を含む集合体を含有する
培養体は維持されない。上記工程（ａ）に記載したトウ
モロコシの特定のカルス、優良遺伝子型Ｆｕｎｋ２７１
７の一部約５００ｍｇを延長されたフラスコ１２５ｍｌ
中の２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌを含むＮ６培地３０ｍｌ中に
置く。回転攪拌機（１３０ｒｐｍ，２．５ｃｍスロー）
上暗所２６℃での１週間の培養後、培地を新鮮培地に移
す。懸濁液をもう１週間後にこの方法で再び継代培養す
る。この時に培養体を検査し、そして大多数の増大した
細胞を示していないものを保持する。大きい、増大した
細胞を有する集合体を含む懸濁培養体を捨てる。ほとん
どの細胞集合体より特徴的な平滑な表面を有する密集し
た細胞質の分裂している細胞集合体からなる組織が好ま
しい。保持される培養体はそれらの小さな集合体内に表
される少なくとも５０％の細胞を有する。これは望まし
い形態である。これらの懸濁液はまた、１週間より少な
い増殖時間の早い生長速度を有する。０．５ｍｌ充填さ
れた細胞体積（ＰＣＶ：ピペット内に置かれた細胞体
積）を新鮮培地２５ｍｌ内に移すことにより懸濁培養体
を週毎に継代培養する。このように４ないし６週間の継
代培養後、培養体は週毎の継代培養あたり２ないし３倍
増加する。７５％以上の細胞が望ましい形態からなる培
養体をその他の継代培養のために保持する。最良の形態
を示すフラスコの内容物を継代培養のために常に選択す
ることにより培養体を維持する。６３０μｍの孔の大き
さのステンレス鋼の篩を通す断続的な濾過（２週間毎）
を培養体の分散を増やすためにある場合には使用する
が、しかし必要ではない。トウモロコシ懸濁培養体６−
２７１７−ＣＧ（Ｆｕｎｋ２７１７）はＡＴＣＣに寄託
され、承認番号第４０３２６号である。この寄託はブダ
ペスト条約に従ってなされた〔寄託日：１９８７年５月
２０日〕。
【０１０３】実施例３：トウモロコシの懸濁培養体から
プロトプラストの調製 実施例２で調製した懸濁培養細胞のＰＣＶ１〜１．５ｍ
ｌを、ＫＭＣ（８．６５ｇ／ｌＫＣｌ，１６．４７ｇ／
ｌＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏおよび１２．５ｇ／ｌＣａＣｌ
2 ・２Ｈ2 Ｏ，５ｇ／ｌＭＥＳ ｐＨ５．６）塩溶液中
の１％ｗ／ｖロチームと４％ｗ／ｖＲｓセルラーゼとか
らなる混合物１０〜１５ｍｌ中培養する。消化を振動テ
ーブル上３０℃で、３〜４時間行う。調製は倒立顕微鏡
下、プロトプラスト解離を追跡する。解離されたプロト
プラストを以下のように集める：調製物を１００μｍメ
ッシュ、次に５０μｍメッシュの篩を通して濾過する。
酵素溶液の初期容量と同容量のＫＭＣ塩溶液と共に篩を
通して、プロトプラストを洗浄する。０．６Ｍショ糖溶
液（０．１％ｗ／ｖモルホリノエタンスルホン酸〔ＭＥ
Ｓ〕およびＫＯＨでｐＨ５．６に緩衝化した）１．５〜
２ｍｌを底に入れた数個のプラスチック製の使い捨て遠
心管の各々に、プロトプラスト調製物１０ｍｌを入れ
る。この管を６０〜１００ｇで１０分間遠心分離し、そ
して界面に縞状になっているプロトプラストを集め、新
しい管に入れる。このプロトプラスト調製物を新しいＫ
ＭＣ塩溶液１０ｍｌ中に再懸濁し、そして６０〜１００
ｇで５分間遠心分離する。上澄みを除いて捨て、そして
滴が残っている状態でゆるやかにプロトプラストを再懸
濁し、次いで１３／１４強ＫＭＣ溶液１０ｍｌを徐々に
添加する。再び５分間の遠心分離後、上澄みを再び除去
し、そしてプロトプラストを６／７強ＫＭＣ溶液に再懸
濁する。一部を計測のために採取し、そしてプロトプラ
ストを遠心分離により再び沈澱させる。プロトプラスト
をＫＭ培地（第１表）またはＫＭ培地と同じ浸透圧を有
し、そして６ｍＭＭｇＣｌ2 を含有するマンニトール溶
液または下記の実施例に記載したような形質転換におい
て使用に適当なあらゆる他の培地中に１ｍｌあたり１０
7 個で再懸濁する。このプロトプラスト懸濁液を実施例
８ａに記載した培養に使用するか、または実施例８およ
び９に記載したプロトプラストの形質転換を行う場合に
使用する。
【０１０４】実施例４：一般的な組換えＤＮＡ技術 本発明において用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当
業者にとって一般的なものであるので、それらが出現す
る度に記載するよりもむしろ通常用いられる技術に関し
てここで簡潔に記載しておく方がよい。別に特記したこ
とを除いて、これらの全ての操作はManiatis等, (1982)
に記載されている。
【０１０５】Ａ．制限エンドヌクレアーゼでの切断 反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリー
のニュー・イングランド・バイオラブス(New England B
iolabs) により推奨される緩衝溶液中に約５０ないし５
００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む。制限エンドヌクレアー
ゼ２ないし５単位をＤＮＡ１μｇにつき添加し、そして
反応バッチを上記の会社により推奨される温度で１ない
し３時間保温する。６５℃で１０分間加熱するか、また
はフェノールでの抽出により反応を終結させ、エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させる。この方法は文献Maniatis等,
(1982)の第１０４ないし１０６頁にも記載されている。
【０１０６】Ｂ．ブラント末端を製造するためのＤＮＡ
のポリメラーゼでの処理 ＤＮＡ断片５０ないし５００μｇ／ｍｌを、製造会社ニ
ュー・イングランド・バイオラブスにより推奨される緩
衝液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全４種の
デオキシヌクレオチド三リン酸を０．２mMの濃度で含有
する。反応は１５℃で３０分間の期間に起こり、次いで
６５℃で１０分間加熱することにより終結される。５’
突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばEcoR
I およびBamHI で切断することにより得られる断片のた
めには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片またはクレノウ断
片が使用される。３’突出末端を製造するエンドヌクレ
アーゼ例えばPstII およびSacIにより製造される断片の
ためには、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが使用される。これ
らの２つの酵素の使用はManiatis等, (1982)の第１１３
ないし１２１頁に記載されている。
【０１０７】Ｃ．アガロースゲル電気泳動およびゲルか
らのＤＮＡ断片の精製 アガロースゲル電気泳動をManiatis等, (1982)の第１５
０ないし１６３頁に記載のように水平型装置で行う。使
用される緩衝液はその中に記載されているトリス−ホウ
酸塩緩衝液である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲル
またはタンク緩衝液に存在するか、または電気泳動の後
に添加されるいずれかの０．５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウ
ムを用いて染色される。ＤＮＡを長波長の紫外線の照射
により視覚化する。断片をゲルから分離する場合には、
使用されるアガロースは低いゲル化温度のものであり、
これはミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル(Sig
maChemical)から入手できる。電気泳動後、望ましい断
片を削り取り、プラスチック管内に入れ、６５℃で約１
５分間加熱し、次いでフェノールで３回抽出し、そして
エタノールで２回沈澱させる。この操作はManiatis等,
(1982)の第１７０頁の記載とはわずかに異なっている。
【０１０８】Ｄ．ＤＮＡ末端への合成リンカー断片の付
加 ＤＮＡ分子末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を
添加することが望ましい場合、上の項に記載されている
ように、ブラント末端を製造するために、場合によって
はこの分子をまずＤＮＡポリメラーゼで処理する。この
断片約０．１ないし１．０μｇを、ニュー・イングラン
ド・バイオラブスから得られるホスホリル化リンカーＤ
ＮＡ約１０ｎｇに、同社のＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌお
よび同社により推奨される緩衝液中の１mMＡＴＰを含有
する２０ないし３０μｌ容量中で添加する。１５℃で一
晩保温後、６５℃で１０分間加熱することにより反応を
終結させる。反応バッチを次に、合成リンカー配列で切
断する制限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約１
００μｌに希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約５
０ないし２００単位を添加する。混合物を適温で２ない
し６時間保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動に
供し、そして上記Ｃのように断片を精製する。精製した
断片は今では制限エンドヌクレアーゼでの切断により製
造された終端を有するであろう。これらの終端は通常粘
着性であり、その結果、精製断片は同じような粘着端を
有するその他の断片に容易に連結され得る。
【０１０９】Ｅ．ＤＮＡ断片からの５’末端ホスフェー
トの除去 プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミ
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させるManiatis等, (1982)の第１３頁に記載されてい
る）。正しい制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断
の後、ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannhei
m) から得られる子ウシ消化管のアルカリホスファター
ゼ１単位を添加する。ＤＮＡを３７℃で１時間保温し、
次にフェノールで２回抽出し、そしてエタノールで沈澱
させる。
【０１１０】Ｆ．ＤＮＡ断片の連結 相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、
各々の断片約１００ｎｇは、ニュー・イングランド・バ
イオラブスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．２単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する２０ないし
４０μｌの反応混合物中で保温される。保温は１５℃で
１ないし２０時間行われる。ブラント末端を有するＤＮ
Ａ断片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡリガーゼ
の量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。
【０１１１】Ｇ．ＤＮＡの大腸菌内への形質転換 大腸菌ＨＢ１０１株がほとんどの実験において使用され
る。Maniatis等, (1982)の第２５０および２５１頁に記
載されているように、塩化カルシウム法を用いてＤＮＡ
が大腸菌内に導入される。
【０１１２】Ｈ．プラスミドのための大腸菌のスクリー
ニング 形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーは迅速プラ
スミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験され
る。２種の慣用の方法は、Maniatis等, (1982)の第３６
６ないし３６９頁に記載されている。
【０１１３】Ｉ．プラスミドＤＮＡの大規模な分離 大腸菌からプラスミドを大規模に分離する方法はManiat
is等, (1982)の第８８ないし９４頁に記載されている。
【０１１４】Ｊ．Ｍ１３ファージベクターにおけるクロ
ーニング 以下の記載においてファージＭ１３誘導体の二重鎖複製
体は決まりきった操作、例えば制限エンドヌクレアーゼ
での切断、連結その他のために用いられることが理解さ
れるべきである。
【０１１５】実施例５：プラスミドｐＢＲ３２２内のキ
メラ遺伝子の製造 ＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターおよびプロトキシンコ
ード配列を融合するために、ファージベクターｍｐ１９
の誘導体(Yanich-Perron等, (1985)）を製造する。まず
最初に、約１５５ヌクレオチドの５’ないしプロトキシ
ンコード領域および隣接する約１３４６ヌクレオチドの
コード配列を含むＤＮＡ断片をｍｐ１９内に挿入する。
ファージｍｐ１９ｄｓ ｒｆ（２本鎖複製型分子）ＤＮ
Ａを、制限エンドヌクレアーゼSacIとSmaIで消化し、そ
して約７．２ｋｂｐ（キロ塩基対）ベクター断片を、標
準法により低いゲル化温度のアガロースを通す電気泳動
の後に精製する。プロトキシン遺伝子を含む約１０ｋｂ
ｐのバチルス スリンギエンシスＤＮＡを含有するプラ
スミドｐＫＶ２５／４をスイス国バーゼル市のチバ−ガ
イギーのJ. Neusch 博士から入手した。プラスミドｐＫ
Ｖ２５／４に存在するプロトキシン遺伝子のヌクレオチ
ド配列は配列番号：１に示されている。プラスミドｐＫ
Ｖ２５／４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼHpaIとSarIで消
化し、そして１５０３ｂｐ断片（配列番号：１の配列に
おいてヌクレオチド２〜１５０５を含む）を上記のよう
に精製する。（この断片は約１５５ｂｐの細菌のプロモ
ーター配列および約１３４６ｂｐのプロトキシンコード
配列の始まりを含む）各断片約１００ｎｇを次に混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、そして１５℃で一晩培
養する。生成した混合物を大腸菌ＨＢ１０１株に形質転
換させ、インジケーター細菌の大腸菌ＪＭ１０１と混合
し、そしてプレーティングする(Messing, J., Meth.Enz
ymol., 101 (1987) 20)。ｍｐ１９／ｂｔと呼ばれる１
つのファージを以下の他の製造のために使用する。
【０１１６】次にＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターおよ
び遺伝子ＶＩのコード配列のいくつかを含むＤＮＡ断片
をｍｐ１９／ｂｔ内に挿入する。ファージｍｐ１９／ｂ
ｔｄｓ ｒｆ ＤＮＡをBamHI で消化し、ＤＮＡポリメ
ラーゼの大断片で処理しプンブラント末端を製造し、そ
してエンドヌクレアーゼPstIで再び切断する。より大き
なベクター断片を上記の電気泳動により精製する。プラ
スミドｐＡＢＤＩはPaszkowski, J.等, The EMBO Journ
al, 3, No.12, (1984) 2717-2722に記載されている。プ
ラスミドｐＡＢＤＩ ＤＮＡをPstIとHindIII で消化す
る。ＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターおよび約７５ｂｐ
の遺伝子ＶＩのコード配列を含む約４６５ｂｐの長さの
断片を精製する。２つの断片を連結し、そして上記のよ
うにプレーティングする。ｍｐ１９／ｂｔｃａと呼ばれ
る生成した組換えファージの１つを以下の実験に使用す
る：ファージｍｐ１９／ｂｔｃａは、ＣａＭＶ遺伝子Ｖ
Ｉプロモーター配列、遺伝子ＶＩのコード配列の一部、
プロトキシンコード配列の上流のＢｔＤＮＡの約１５５
ｂｐおよびプロトキシンコード配列約１３４６ｂｐを含
む。ＣａＭＶプロモーター配列をプロトキシンコード配
列に正確に結合するために、介在ＤＮＡをｍｐ１９／ｂ
ｔｃａ ＤＮＡのオリゴヌクレオチド関連突然変異誘発
を使用して欠失させる。配列（５’）ＴＴＣＧＧＡＴＴ
ＧＴＴＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡ
（３’）を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、アプラ
イド・バイオシステムズ・ＤＮＡシンセサイザー）を用
いて確立された方法で合成する。このオリゴヌクレオチ
ドは、ファージｍｐ１９／ｂｔｃａ ＤＮＡ内の配列に
対して、ＣａＭＶプロモーター配列の３’末端（Hohnに
おけるヌクレオチド５７６２〜５７７８）と配列番号：
１におけるプロトキシンコード配列の始まり（ヌクレオ
チド１５６〜１７２）とで相補的である。突然変異誘発
の一般的な方法はZollerおよびSmith (1983)に記載され
ている。一本鎖ファージｍｐ１９／ｂｔｃａＤＮＡ約５
μｇを４０μｌの容量中ホスホリル化オリゴヌクレオチ
ド０．３μｇと混合する。混合物を５分間６５℃まで加
熱し、５０℃に冷却し、そして４℃まで徐々に冷却す
る。次に緩衝液、ヌクレオチド三リン酸塩、ＡＴＰ、Ｔ
４リガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの大断片を添加
し、そしてZollerおよびSmith (1983)に記載されている
ように一晩１５℃で培養する。アガロースゲル電気泳動
の後、環状２本鎖ＤＮＡを精製し、そして大腸菌ＪＭ１
０１株にトランスフェクションさせる。生成したプラー
クは32Ｐ標識オリゴヌクレオチドと雑種形成する配列の
ためにスクリーニングされ、ファージをＤＮＡ制限エン
ドヌクレアーゼ分析により分析する。生成したファージ
クローンの中に、ＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターとプ
ロトキシンコード配列との間の望ましくない配列を正確
に欠失させたものがある。このファージをｍｐ１９／ｂ
ｔｃａ／ｄｅｌと呼ぶ。
【０１１７】次に、プロトキシン遺伝子の３’コード領
域をＣａＭＶ転写終結シグナルに結合させたプラスミド
を製造する。最初にプラスミドｐＡＢＤ１をエンドヌク
レアーゼBamHI とBglII とで消化し、そしてＣａＭＶ転
写終結配列を含む０．５ｋｂｐ断片を分離する。次い
で、プラスミドｐＶＣ１９（Yanich-Perron 等, Gene,3
3 (1985) 103-119 ）をBamHI で消化し、０．５ｋｂｐ
断片と混合し、そしてＴ４リガーゼとで培養する。該Ｄ
ＮＡの大腸菌ＨＢ１０１株内に形質転換の後、生成した
クローンの１つ（プラスミドｐ７０２と呼ばれる）が得
られる。次にプラスミドｐ７０２ＤＮＡをエンドヌクレ
アーゼSacIとSmaIとで切断し、そしてより大きい約３．
２ｋｂｐ断片をゲル電気泳動により分離する。プラスミ
ドｐＫＶ２５／４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼAhaIIIと
SacIで消化し、そしてプロトキシンコード配列の３’部
位（配列番号：１のヌクレオチド１５０４〜３７７３
位）を含む２．３ｋｂｐ断片（配列番号：１のヌクレオ
チド１５０２〜３７７３位）をゲル電気泳動後に分離す
る。これら２つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡとで
培養し、そして大腸菌ＨＢ１０１株内に形質転換する。
生成したプラスミドはｐ７０２／ｂｔである。
【０１１８】最終的に、ファージｍｐ１９／ｂｔｃａ／
ｄｅｌ ｄｓ ｒｆ ＤＮＡの一部とプラスミドｐ７０
２／ｂｔを結合し、ＣａＭＶプロモーターおよび終結配
列が両側に連結したプロトキシンコード配列を含むプラ
スミドを製造する。ファージｍｐ１９／ｂｔｃａ／ｄｅ
ｌ ＤＮＡをエンドヌクレアーゼSacIとSphIで消化し、
そして約１．７５ｋｂｐの断片を次にアガロースゲル電
気泳動により精製する。同様に、プラスミドｐ７０２／
ｂｔＤＮＡをエンドヌクレアーゼSacIとSalIで消化し、
そして約２．５ｋｂｐの断片を分離する。最後にプラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Bolivar 等, (1977)）をSalI
とSphIで消化し、そしてより大きな４．２ｋｂｐ断片を
分離する。全ての３種のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼとで培養し、そして大腸菌ＨＢ１０１株内に
形質転換させる。生成したプラスミド、ｐＢＲ３２２／
ｂｔ１４は、ＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターおよびＢ
ｔ結晶タンパク質コード配列に結合した翻訳開始シグナ
ルを含み、ＣａＭＶ転写終結配列が続く、ｐＢＲ３２２
の誘導体である。
【０１１９】実施例６ａ：バチルス スリンギエンシス
テネブリオニス変種の殺虫性毒素遺伝子をコード化す
るキメラ遺伝子を含むｐＴＯＸの製造 バチルス スリンギエンシス テネブリオニス変種の殺
虫性結晶タンパク質をコード化する遺伝子は同定され、
そして配列決定されている(Sekar, V., Proc.Natl. Aca
d. Sci. USA, 84 (1987) 7036-7040)。このコード配列
は慣用の制限断片、例えば約３ｋｂの大きさの大きさの
HindIII 断片に分離され、そして適当な植物発現ベクタ
ー、例えばプラスミドｐＣＩＢ７７０（Rothstein, S.,
Gene, 53 (9187) 153-161）内に挿入される。プラスミ
ドｐＣＩＢ７７０は植物体内での発現のためのキメラカ
ナマイシン遺伝子並びに非反復BamHI 部位により分離さ
れるＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ転写のプロモーターおよび
ターミネーターを含む。毒素コード配列を有する制限断
片は適当な分子アダプターの使用によりｐＣＩＢ７７０
の非反復BamHI 部位に適合しており、そして一緒に連結
する。
【０１２０】実施例６ｂ：バチルス スリンギエンシス
サンジェゴ株の殺虫性毒素遺伝子をコード化するキメ
ラ遺伝子を含むｐＳＡＮの製造 バチルス スリンギエンシス サンジェゴ株の殺虫性結
晶タンパク質をコード化する遺伝子は同定され、そして
配列決定されている(Herrnstadt 等，ＥＰ−０２０２７
３９号およびＥＰ−０２１３８１８号）。このコード配
列は慣用の制限断片に分離され、そして適当な植物発現
ベクター、例えばプラスミドｐＣＩＢ７７０内に挿入さ
れる。プラスミドｐＣＩＢ７７０は植物体内での発現の
ためのキメラカナマイシン遺伝子並びに非反復BamHI 部
位により分離されるＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ転写のプロ
モーターおよびターミネーターを含む。毒素コード配列
を有する制限断片は適当な分子アダプターの使用により
ｐＣＩＢ７７０の非反復BamHI 部位に適合しており、そ
して一緒に連結する。
【０１２１】実施例７ａ：プラスミドｐＣＩＢ７１０の
製造 プラスミドｐＬＷ１１１（サンジェゴのカリフォルニア
大学のS. Howell から入手できる）はｐＭＢ９内にクロ
ーン化された、ＣａＭＶのＢＪＩ株の３種のより小さい
EcoRI 断片(Franck 等, Cell, 21 (1980) 285-294)から
なる。ｐＬＷ１１１をBglII で消化し、そして１１５０
ｂｐ断片（塩基対番号６４９４−７６４３，Hohn等，Cu
rrent Topics in Microbiology and Immunology, 96 (9
182) 193-236) を分離する。この断片をｐＶＣ１９のBa
mHI 部位に連結する。この制限断片はＣａＭＶの３５Ｓ
ＲＮＡのプロモーターおよび転写のためのポリ付加シグ
ナル（すなわち、ターミネーター）の両方をコードす
る。
【０１２２】試験管内での突然変異誘導 非反復BamHI 部位をこのプロモーターとターミネーター
との間での試験管内での突然変異誘導を介して挿入す
る。BamHI 制限部位が配列において塩基対第７４８３位
に挿入されていることを除いてその領域においてはＣａ
ＭＶ配列と同一である。３６塩基オリゴヌクレオチドを
合成する。上で得られた１１５０ｂｐBglII 断片をＭＢ
ｍｐ１９内にクローン化し、そして１本鎖ファージＤＮ
Ａを分離する。この１本鎖ＤＮＡを合成オリゴヌクレオ
チドとアニーリングし、新しい鎖をプライマーとしてオ
リゴヌクレオチドを用いて合成し、そしてそのＤＮＡを
ＪＭ１０１株内にトランスフェクションさせる(Zoller
およびSmit, DNA, 3 (1984) 479-488)。挿入されたBamH
I 部位を有するＭ１３ファージをZollerおよびSmit（上
掲）に記載されたように分離する。
【０１２３】所望の突然変異ファージ選択 ３６塩基オリゴヌクレオチドを32Ｐ−ＡＴＰでリン酸付
加することにより標識する。１組のトランスフェクショ
ンされたＭ１３ファージプラークをニトロセルロースフ
ィルター上に局在化させる。このフィルターを標識され
た３６ｍｅｒでハイブリッド化する。フィルターを高め
た温度で洗浄する。突然変異されたファージより高い洗
浄温度で安定である。より高い温度で安定なこれらのフ
ァージの１つを分離し、BamHI 部位の存在を確認するた
めに配列決定する。
【０１２４】ｐＣＩＢ７１０の最終的アッセンブリー このファージから分離された２本鎖ＤＮＡをHindIII と
EcoRI で消化する。ｐＶＣ１９をHindIII とEcoRI で切
断する。これら２種の消化されたＤＮＡを連結する。形
質転換体をアンピシリン耐性により選択する。この連結
からの１つの形質転換体がｐＣＩＢ７１０である。プラ
スミドｐＣＩＢ７１０は挿入されたこのBamHI 部位と転
写の開始位置との間にＡＴＧ開始コドンを持っていな
い。
【０１２５】実施例７ｂ：ｐＣＩＢ７１２の製造 ハイグロマイシン耐性遺伝子（Gritz, L. およびDavie
s, J., Gene, 25 (1983) 179-188 ）はプラスミドｐＬ
Ｇ９０からの約１１５０塩基対BamHI 断片上に存在す
る。プラスミドｐＬＧ９０はLinda Gritz 博士（Linda
Gritz, Applied Biotechnology, マサチューセッツ州ケ
ンブリッジ, ロジャース・ストリット８０）からのもの
を利用できる。この断片をBglII リンカーで連結し、そ
して次にｐＣＩＢ７１０の非反復BamHI 部位に挿入し、
BamHI 部位を破壊し、そしてプラスミドｐＣＩＢ７１２
を製造する。プラスミドｐＣＩＢ７１２は米国メリーラ
ンド州ロックビレのＡＴＣＣに寄託されており、承認番
号第６７４０７号である。この寄託はブダペスト条約に
従って行われた（寄託日：１９８７年５月１８日）。プ
ラスミドｐＣＩＢ７１２を適当な酵素、例えばSmaIを使
用して直線化する。
【０１２６】実施例７ｃ：ｐＣＩＢ１０／３５ｓＢｔの
製造 プラスミドｐＣＩＢ７１２は上に記載されている。 ｐＣＩＢ１０の製造（図８〜１４参照） １５．ｐＴｉＴ３７からの左側境界を含むＴ−ＤＮＡ断
片をｐＢＲ３２５（ＥｃｏＲＩ２９）から分離する（Ya
dav 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 (1982) 6322
-6326 ）。ｐＢＲ３２５（ＥｃｏＲＩ２９）をEcoRI で
切断し、そして１．１ｋｂ断片をHindIII リンカー（ニ
ューイングランドバイオラブス）で連結する。 １６．プラスミドｐＢＲ３２２（Bolivar 等, Gene, 2
(1977) 95-103 ）をHindIII で切断する。 １７．工程１５に記載した左側境界を含有する断片をプ
ラスミドｐＢＲ３２２のHindIII 消化物内に連結する。 １８．工程１７で製造した左側境界を含有するプラスミ
ドをClaIとHindIII で切断し、そして１．１ｋｂHindII
I ／ClaI断片を分離する（Hepburn 等, J. Mol.Appl. G
enet., 2 (1983) 315-329）。 １９．プラスミドｐＶＣ１８（Norrander 等, Gene, 26
(1983) 101-106 ）をHindIII とEcoRI で切断し；６０
ｂｐポリリンカーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよ
びγ−32Ｐ−ｄＡＴＰを使用して末端標識し、そしてア
クリル・アミドゲルから分離する。 ２０．プラスミドｐＢＲ３２２をEcoRI およびClaIで切
断し、そして大きな断片を分離する。 ２１．６０ｂｐHindIII ／EcoRI ポリリンカーおよびＥ
ｃｏＲＩ２９の１．１ｋｐHindIII ／ClaI断片を、ClaI
とEcoRI で切断したｐＢＲ３２２内に連結し、ｐＣＩＢ
５を製造する。 ２２．カナマイシン耐性（nos-neo ）を与えるキメラ遺
伝子をSalI／EcoRI 断片としてＢｉｎ６（Bevan 等, Nu
c. Acad. Res., 12 (1984) 8711-8721）から採取する。 ２３．プラスミドｐＶＣ１８をEcoRI とSalIで切断す
る。 ２４．工程２２のキメラ遺伝子を含有するSalI／EcoRI
断片をEcoRI とSalIで切断したｐＶＣ１８内に連結す
る。 ２５．このキメラ遺伝子の末端配列内のBamHI 認識部位
をBamHI で切断することにより破壊し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて充填し、そして連結する。 ２６．生成したプラスミドをSST II（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ）とHindIII で切断する。 ２７．ｎｏｓプロモーターの５’部分とｐＴｉＴ３７の
右側境界を含む断片は、ｐＢＲ３２５（Ｈｉｎｄ２３）
をHindIII とSstII で切断することにより分離され、そ
して１．０ｋｂ断片が分離される。 ２８．この１．０ｋｂHindIII ／SstI断片をｐＣＩＢ４
を製造する工程２６のｐＶＣ１８ベクター内に連結す
る。 ２９．左側Ｔ−ＤＮＡ境界を含むｐＣＩＢ５を、AatII
で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用した処理によ
りブラント末端を与えられ、そして次にEcoRI で切断す
る。 ３０．ｐＣＩＢ４をHindIII で切断し、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片を使用した処理によりブラ
ント末端を与えられ、そして次にEcoRI で切断する。 ３１．工程２９のベクターを工程３０の大断片と連結し
てｐＣＩＢ２を製造し、左右のＴ−ＤＮＡ境界を含むＣ
ｏｌＥ１レプリコンはキメラＫｍr 遺伝子およびポリリ
ンカーを傍に持つ。 ３２．プラスミドｐＲＺ１０２（Jorgensen 等, Mol. G
en. Genet., 177 (1979)65-72）をBamHI で消化し、そ
してクレノーを用いて充填する。 ３３．プラスミドｐＡ０３（Oka 等, Nature, 276 (197
8) 845-847およびOka 等, J. Mol. Biol., 147 (1981)
217-226 ）のAluI部分消化物を製造する。 ３４．AluI消化物を工程３２から制限ｐＲＺ１０２内に
連結し、カナマイシンへの耐性により望ましい形質転換
体を選択する。 ３５．生成したプラスミドは１．０５ｋｂBamHI 断片上
に存在するＴｍ９０３のコード配列を有し；この断片を
BamHI 消化およびクレノーでの充填の後に分離する。 ３６．プラスミドｐＲＫ２５２、広い宿主範囲のプラス
ミドｐＲＫ２の誘導体はサンジェゴ・カリフォルニア大
学のDon Helinski博士からのものを利用できる。このプ
ラスミドは親であるｐＲＫ２９０（Ditta 等, Proc. Na
t. Acad. Sci. USA., 77 (1980) 262-269 ）に存在する
BglII 部位がない。ｐＲＫ２５２をSnaIとSalIとで消化
し、クレノーを用いて充填し、そしてこの消化から得ら
れる大断片を分離する。 ３７．工程３５で分離された断片を含有するＴＮ９０３
をｐＲＫ２５２からの大断片内に連結し、ｐＲＫ２５２
Ｋｍを製造する。 ３８．プラスミドｐＲＫ２５２ＫｍをEcoRI で切断し、
クレノーを用いてブラント末端化し、そしてBglII リン
カー（ニューイングランドバイオラブス）で連結する。 ３９．プラスミドｐＣＩＢ２をEcoRV で切断し、そして
BglII リンカー（ニューイングランドバイオラブス）で
連結する。 ４０．工程３９のBglII 連結ｐＣＩＢ２を工程３８のベ
クター内に連結し、ｐＣＩＢ１０を製造する。
【０１２７】実施例７ｄ：ｐＣＩＢ１０ａの製造 プラスミドｐＲＫ２９０をｐＲＫ２５２に置き換えて実
施例７ｃを繰り返す。 ４１．プラスミドｐＲＺ１０２（Jorgensen 等, (1979)
上掲）をBamHI で消化し、そしてクレノーを用いて充填
する。 ４２．プラスミドｐＡ０３（Oka 等, (1978) 845-847上
掲）のAluI部分消化物を製造する。 ４３．AluI消化物を工程３２からの制限ｐＲＺ１０２内
に連結し、カナマイシンへの耐性により望ましい形質転
換体を選択する。 ４４．生成したプラスミドは１．０５ｋｂBamHI 断片上
に存在するＴｍ９０３のコード配列を有し；この断片を
BamHI 消化およびクレノーでの充填の後に分離する。 ４５．プラスミドｐＲＫ２９０、広い宿主範囲のプラス
ミドｐＲＫ２の誘導体はサンジェゴ・カリフォルニア大
学のDon Helinski博士からのものを利用できる。ｐＲＫ
２９０をSnaIとSalIとで消化し、クレノーを用いて充填
し、そしてこの消化から得られる大断片を分離する。 ４６．工程３５で分離された断片を含有するＴＮ９０３
をｐＲＫ２９０からの大断片内に連結し、ｐＲＫ２９０
Ｋｍを製造する。 ４７．工程４６のプラスミドをBglII で消化し、クレノ
ーを用いて充填し、そして連結し、BglII 部位を破壊し
て、ｐＲＫ２９０Ｋｍを製造する。 ４８．プラスミドｐＲＫ２９０ＫｍをEcoRI で切断し、
クレノーを用いてブラント末端化し、そしてBglII リン
カー（ニューイングランドバイオラブス）で連結する。 ４９．プラスミドｐＣＩＢ２をEcoRV で切断し、そして
BglII リンカー（ニューイングランドバイオラブス）で
連結する。 ５０．工程３９のBglII 連結ｐＣＩＢ２を工程４７のベ
クター内に連結し、ｐＣＩＢ１０ａを製造する。
【０１２８】実施例７ｅ：ＣａＭＶ３５Ｓのプロモータ
ーを有するバチルス スリンギエンシスプロトキシンキ
メラ遺伝子の製造 Ａ．ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターカセットの製造 プラスミドｐＣＩＢ７１０を図１７に示すように製造す
る。このプラスミドは３５ＳＲＮＡ転写のためのＣａＭ
Ｖプロモーターおよび転写終結配列を含む（Covey, S.
N., Lomonossoff, G. P.およびHull, R., Nucleic Acid
s Research, 9(1981) 6735-6747）。ＣａＭＶＤＮＡの
１１４９ｂｐBglII 制限断片（Hohn等,(1982)）に記載
されているｂｐ７６４３−６４９４）を、上記の調製ア
ガロースゲルによりプラスミドｐＬＶ１１１（サンジェ
ゴのカリフォルニア大学のS. Howell から入手でき、ま
たその断片ＣａＭＶＤＮＡから直接分離し得る）から分
離し、そしてBamHI 開裂プラスミドｐＶＣ１９ＤＮＡと
混合し、Ｔ４ＤＮＡで処理し、そして大腸菌内で形質転
換させる（生成したプラスミドのBamHI 部位はBglII 粘
着端のBamHI 粘着端への連結により破壊されたことに注
意）。生成したプラスミドをｐＶＣ１９／３５Ｓと呼
び、これを次にオリゴヌクレオチド関連の試験管内での
突然変異誘導において使用し、BamHI 認識配列ＧＧＡＴ
ＣＣ、同時に続くHohn等の記載のＣａＭＶヌクレオチド
７４８３を挿入する。生成したプラスミドｐＣＩＢ７１
０はＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域およびBamHI 認識
部位により分離される転写終結領域を含む。このBamHI
認識部位内で挿入されたＤＮＡ配列は、これらのＣａＭ
Ｖ転写調節配列により植物体内に発現されるであろう
（ｐＣＩＢ７１０は転写の開始部位とBamHI 部位との間
にＡＴＧ翻訳開始コドンを含有していないことにも注
意）。
【０１２９】Ｂ．ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／ターミ
ネーターカセットのｐＣＩＢ１０内への挿入 下記工程は図１８に概略的に示す。プラスミドｐＣＩＢ
１０およびｐＣＩＢＤＮＡをEcoRI とSalIで消化、混合
および連結する。生成したプラスミドｐＣＩＢ／７１０
は植物形質転換ベクターｐＣＩＢ１０内に挿入されたＣ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター／ターミネーターカセットを
有する。ＣａＭＶ３５Ｓ配列はｐＣＩＢ１０のＴ−ＤＮ
Ａ境界の間にあり、そしてこうして植物形質転換実験物
内の植物ゲノム内に挿入されるであろう。
【０１３０】Ｃ．バチルス スリンギエンシスプロトキ
シン遺伝子のｐＣＩＢ１０／７１０への挿入 下記工程を図１９に概略的に示す。プロトキシン遺伝子
の源として、プラスミドｐＣＩＢ１０／１９ＳｂｔをBa
mHI とNcoIで消化し、そしてプロトキシン遺伝子を含む
３．６ｋｂ断片を調製ゲル電気泳動により分離する。断
片を次に配列５’−ＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣ
−３’を有する合成NcoI−BamHI アダプターと混合し、
次にBamHI で消化する。この工程はプロトキシン断片の
両末端でBamHI 粘着端を形成する。この断片を次にBamH
I 開裂ｐＣＩＢ１０／７１０内に挿入する。この生成し
たプラスミド、図１９に示すｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ
はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと転写終結配列の間にプ
ロトキシン遺伝子を含む。プラスミドｐＣＩＢ１０／１
９ＳＢｔ（大腸菌ＨＢ１０１株）はＡＴＣＣに寄託され
ており、ＡＴＣＣ承認番号第６７３３０号を有する（寄
託日：１９８７年２月２７日）。ＭＣ１０６１株内のｐ
ＣＩＢ／３５ＳＢｔはＡＴＣＣに寄託されており、ＡＴ
ＣＣ承認番号第６７３２９号である。この寄託はブダペ
スト条約に従って行われた（寄託日：１９８７年２月２
７日）。
【０１３１】実施例８ａ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 熱ショックを除く全工程は室温で行う。プロトプラスト
を実施例３の最終工程において、０．１％ｗ／ｖＭＥＳ
および６ｍＭ ＭｇＣｌ2 を含む０．５Ｍマンニトール
内に再懸濁する。この懸濁液の抵抗をダイアログ・エレ
クトロポレーターのチャンバー内で測定し、３００ｍＭ
ＭｇＣｌ2 溶液を用いて１〜１．２ｋオームに調節す
る。試料を含むチューブを水浴中４５℃で５分間浸漬
し、続いて氷上で室温まで冷却することによる熱ショッ
クをプロトプラストに与える。この懸濁液の０．２５ｍ
ｌを分取し、これにハイグロマイシン耐性遺伝子を含む
線状ｐＣＩＢ７１２プラスミド４μｇおよびウシ胸腺キ
ャリアーＤＮＡ２０μｇを添加する。３０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 を含む０．５Ｍマンニトール中の２４％ｗ／ｖポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（ＰＥＧの分子量８
０００）０．１２５ｍｌをプロトプラストに添加する。
混合物を十分にしかし緩やかに混合し、そして１０分間
培養する。試料をエレクトロポレーターのチャンバー内
に移し、そして１０秒の間隔で３回、開始電圧１００
０、１２００、１５００、１８００、２３００および２
８００Ｖｃｍ-1並びに１０マイクロ秒（μ秒）のパルス
の対数減衰時間で振動させる。プロトプラストを以下の
ように培養する：試料を６ｃｍの直径のペトリ皿に室温
でプレーティングする。さらに５〜１５分後、１．２％
ｗ／ｖシープラークアガロース、１ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ
および１００ｍｇ／ｌＯ−アセチルサリチル酸を含むＫ
Ｍ培地を加える。アガロースおよびプロトプラストを十
分に混合し、培地をゲル化する。
【０１３２】実施例８ｂ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａを繰り返すが、プロトプラスト調製の抵抗は
０．５〜０．７ｋオームに調整する。
【０１３３】実施例８ｃ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａを繰り返すが、使用されるＰＥＧは分子量４
０００のものである。
【０１３４】実施例８ｄ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ｃを繰り返すが、プロトプラスト調製の抵抗は
０．５〜０．７ｋオームに調整する。
【０１３５】実施例８ｅ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａを繰り返すが、ＰＥＧを使用しない。
【０１３６】実施例８ｆ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ｂを繰り返すが、ＰＥＧを使用しない。
【０１３７】実施例８ｇ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａを繰り返すが、１２％ｗ／ｖＰＥＧの１／２
容量を添加する。
【０１３８】実施例８ｈ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ｂを繰り返すが、１２％ｗ／ｖＰＥＧの１／２
容量を添加する。
【０１３９】実施例８ｉ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ｃを繰り返すが、１２％ｗ／ｖＰＥＧの１／２
容量を添加する。
【０１４０】実施例８ｊ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ｄを繰り返すが、１２％ｗ／ｖＰＥＧの１／２
容量を添加する。
【０１４１】実施例８ｋ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｊを繰り返すが、パルスは３秒間隔で与
える。
【０１４２】実施例８ｌ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｋを繰り返すが、プロトプラストを１６
℃に冷却した皿内のエレクトロポレーション後に置く
【０１４３】実施例８ｍ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｌを繰り返すが、プロトプラストをエレ
クトロポレーション工程後にチューブ内に入れ、そして
６／７強度のＫＭＣ溶液で洗浄し、６０ｇ１０分間の遠
心分離により集め、ＫＭ培地に再懸濁し、そして実施例
８ａのようにプレーティングする。
【０１４４】実施例８ｎ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ｍを繰り返すが、プロトプラストを洗浄するた
めに使用する培地はＷ５溶液（３８０ｍｇ／ｌＫＣｌ；
１８．３７５ｇ／ｌＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ；９ｇ／ｌＮ
ａＣｌ；９ｇ／ｌグルコース；ｐＨ６．０）である。
【０１４５】実施例８ｏ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｎを繰り返すが、プロトプラストをプレ
ーティングするための培地はその中でダクチリス・グロ
メラタ（Dactylis glomerata）の細胞懸濁液を予め増殖
させたジカムバ３０μＭを含有するシエンクおよびヒル
デブラント培地を３０％容量含むＫＭ培地である。
【０１４６】実施例８ｐ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｎを繰り返すが、プロトプラストをプレ
ーティングするための培地はその中でダクチリス・グロ
メラタ（Dactylis glomerata）の細胞懸濁液を予め増殖
させたジカムバ３０μＭを含有するシエンクおよびヒル
デブラント培地を１５％容量含むＫＭ培地である。
【０１４７】実施例８ｑ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｎを繰り返すが、プロトプラストをプレ
ーティングするための培地はその中で実施例３に記載し
た細胞懸濁液を予め増殖させたＮ６培地を３０％容量含
むＫＭ培地である。
【０１４８】実施例８ｒ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｎを繰り返すが、プロトプラストをプレ
ーティングするための培地はその中で実施例３に記載し
た細胞懸濁液を予め増殖させたＮ６培地を１５％容量含
むＫＭ培地である。
【０１４９】実施例８ｓ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｒを繰り返すが、プロトプラストをナー
ス培地フィルター上の培地（０．５ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ
および１００ｍｇ／ｌＯ−アセチルサリチル酸を含むＫ
Ｍ培地、および１．２％ｗ／ｖシープラークアガロー
ス）内に、０．５ミリオンプロトプラスト／ｍｌの濃度
で採取する。この態様において、デュラポアフィルター
（カタログ番号ＧＶＷＰ０４７００，孔サイズ０．２２
μｍ，直径２７ｍｍ）はそれらが容器から分離されると
き上面のリードペンシルと共に角部に数えられる。これ
らは上面がナース培地上を覆っていることを保証し、そ
して唯一のフィルターをそれぞれに設置する。フィルタ
ーを滅菌した脱イオン水中、半透明の容器（ＧＡ７また
はあらゆる同様の容器）中で２０分間加圧滅菌する。そ
れを冷却した後、水を上記のＫＭ培地であるが、しかし
ナース培地上にフィルターを設置する前の少なくとも３
時間はゲル化剤なしの培地で置換する。ナース培地をブ
ラック・メキシカン・スイートコーン懸濁培養体（ＢＭ
Ｓ）（Green, Hort. Sci., 12 (1977) 131; Smith 等,
Plant Sci. Lett., 36 (1984)67）または実施例３に記
載した胚形成懸濁液から調製する。ＢＭＳをナースとし
て使用する場合、０．５ｍｇ／ｌ２，４−Ｄおよび１０
０ｍｇ／ｌＯ−アセチルサリチル酸（０．１％ｗ／ｖＭ
ＥＳを含有する２％ｗ／ｖＤＭＳＯ中）を含有する無菌
ＫＭ培地を無菌シープラークアガロースに添加し、１．
２％ｗ／ｖのアガロースの最終濃度を得る。アガロース
を融解するために加熱した後、培地を水浴中４４℃に冷
却し、ＢＭＳ懸濁液のＰＶＣ１ｍｌを培地１０ｍｌあた
り添加し、そして分取した５ｍｌを６０ｍｍの直径のペ
トリ皿内に分ける。培地を固化させた後、無菌デュラポ
アフィルターを横に並べた表面上に設置する。
【０１５０】胚形成トウモロコシ懸濁培養体をナースと
して使用する場合、Ｎ６培地はグルコースを用いて約５
３０〜５４０ｍＯｓ／ｋｇ・Ｈ2 Ｏまで浸透圧を増加さ
せる。ｐＨを６．０に再調整し、そして培地は０．２μ
ｍフィルターを通してフィルター滅菌する。０．５ｍｇ
／ｌ２，４−Ｄおよび１００ｍｇ／ｌＯ−アセチルサリ
チル酸（０．１％ｗ／ｖＭＥＳを含有する２％ｖ／ｖＤ
ＭＳＯ中）を添加する。培地を無菌シープラークアガロ
ースに添加し、１．２％ｗ／ｖのアガロースの最終濃度
を得る。アガロースを融解するために加熱した後、培地
を水浴中４４℃に冷却し、胚形成懸濁培養体のＰＶＣ１
ｍｌを培地１０ｍｌあたり添加し、そして分取した５ｍ
ｌを６０ｍｍの直径のペトリ皿内に分ける。培地を固化
させた後、無菌デュラポアフィルターを横に並べた表面
上に設置する。０．５ｍｇ／ｌ２，４−Ｄおよび１００
ｍｇ／ｌＯ−アセチルサリチル酸を含有する１．２％ｗ
／ｖシープラークアガロースを有する。冷却（４４℃）
されたＫＭ培地で、プロトプラスト調製液を希釈し、
０．５ミリオンプロトプラスト／ｍｌの濃度とする。こ
の調製液０．５ｍｌをフィルターの各々の表面上に徐々
にピペットで移す。
【０１５１】実施例８ｔ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｓを繰り返すが、ウシ胸腺キャリアーＤ
ＮＡを添加しない。
【０１５２】実施例８ｕ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｔを繰り返すが、線状化ｐＣＩＢ７１２
プラスミド５０μｇを添加する。
【０１５３】実施例８ｖ：エレクトロポレーションによ
るトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例８ａ−８ｕを繰り返すが、プラスミドｐＣＩＢ７
１２は線状化されていない。
【０１５４】実施例９ａ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 プロトプラストを実施例３の最終段階で１２〜３０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 を含有する０．５Ｍマンニトール溶液中に再
懸濁する。４５℃、５分間の熱ショックを実施例８ａに
記載されているように与える。プロトプラストの遠心管
内での形質転換のためにいくつかに分ける（チューブ１
本あたり懸濁プロトプラスト０．３ｍｌ）。次の１０分
間に下記のものを添加して：ＤＮＡ（実施例８ａ−８ｖ
のもの）およびＰＥＧ溶液（ＰＥＧ６０００ ４０％ｗ
／ｖ；Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ０．１Ｍ；マンニトール０．４
Ｍ；ＫＯＨでｐＨ８〜９）、最終濃度２０％ｗ／ｖ。一
部を３０分間、時々ゆっくりと震盪しながら培養し、そ
して次にプロトプラストをペトリ皿上に置き（直径６ｃ
ｍの皿あたり初期プロトプラスト懸濁液０．３ｍｌ）、
そして実施例８ａまたは８ｏ−８ｒに記載したように培
養する。
【０１５５】実施例９ｂ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 プロトプラストを実施例３の最終段階で１２〜３０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 を含有する０．５Ｍマンニトール溶液中に２
０ミリオンプロトプラスト／ｍｌの濃度で再懸濁する。
４５℃、５分間の熱ショックを実施例８ａに記載されて
いるように与える。プロトプラストの遠心管内での形質
転換のためにいくつかに分ける（チューブ１本あたり懸
濁プロトプラスト０．５ｍｌ）。次の１０分間に下記の
ものを添加して：ＤＮＡ（実施例５ａのもの）およびＰ
ＥＧ溶液〔ＰＥＧ８０００（シグマまたはその他の同等
の製品）〕３６％ｗ／ｖ；Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ０．１Ｍ；
マンニトール０．４Ｍ；０．１％ＭＥＳ；０．２μｍフ
ィルターを通した滅菌ＫＯＨフィルターでｐＨ７〜８に
３時間かけて調整）、最終濃度１８％ｗ／ｖ。一部を３
０分間、時々ゆっくりと震盪しながら培養し、そして次
にプロトプラストをペトリ皿上に置き、そして実施例８
ａ−８ｓに記載したように培養する。
【０１５６】実施例９ｃ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例９ａおよび９ｂを繰り返し、そして２〜３分間隔
で５回実施例８ｎのＷ５溶液０．３ｍｌを添加すること
によりＰＥＧ中の培養３０分後に、プロトプラストを洗
浄し、それらを次に遠心分離し、上澄みを除去し、そし
てプロトプラストを実施例８ａ−８ｓに記載したように
培養する。
【０１５７】実施例９ｄ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 また、５分間隔で実施例８ｎのＷ５溶液１ｍｌ、２ｍｌ
および５ｍｌを連続的に添加することによりプロトプラ
ストを洗浄する。それらを次に遠心分離し、上澄みを除
去し、そしてプロトプラストを実施例８ａ−８ｓに記載
したように培養する。
【０１５８】実施例９ｅ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例９ａおよび９ｅを繰り返すが、ＰＥＧの最終濃度
は１５％ｗ／ｖである。
【０１５９】実施例９ｆ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例９ａおよび９ｅを繰り返すが、ＰＥＧの最終濃度
は２５％ｗ／ｖである。
【０１６０】実施例９ｇ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例９ａおよび９ｄを繰り返すが、ＰＥＧの最終濃度
は１２％ｗ／ｖである。
【０１６１】実施例９ｈ：ポリエチレングリコールでの
処理によるトウモロコシプロトプラストの形質転換 実施例９ａおよび９ｆを繰り返すが、プロトプラストは
実施例８ｎに従いＫＭＣ塩溶液で洗浄する。
【０１６２】実施例１０ａ：プロトプラストからカルス
の再生 アガロース内 ｕロトプラストを含むプレートを暗所に
２６℃で置く。１４日以内に細胞コロニーがプロトプラ
ストから生じる。コロニーを含むアガロースを０．２４
％ｗ／ｖゲルライトで固化させ、２，４−Ｄを有するＮ
６培地（２Ｎ６）３０ｍｌを含有する直径９ｃｍのペト
リ皿の表面に移す。コロニーを培養し、カルスを得る。
カルスをさらに暗所中２６℃で培養し、そして２ｍｇ／
ｌ２，４−Ｄを含有する新鮮なＮ６培地（０．２４％ｗ
／ｖゲルライトで固化）上に２週間毎にカルス片を継代
培養する。
【０１６３】実施例１０ｂ：プロトプラストからカルス
の再生 ナース培地上にプロトプラストを含むプレートを暗所に
２６℃で置く。約２週間でコロニーが現れる。フィルタ
ー全体を含むアガロースを０．２４％ｗ／ｖゲルライト
で固化させ、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄを有するＮ６培地
（２Ｎ６）を含有する直径９ｃｍのペトリ皿の表面に移
すか、またはコロニーを採取し、そしてこの培地に個々
に移す。生じるカルスをさらに暗所中２６℃で培養し、
そして２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄを含有する新鮮なＮ６培地
（０．２４％ｗ／ｖゲルライトで固化）上に２週間毎に
カルス片を継代培養する。
【０１６４】実施例１１ａ：トウモロコシの形質転換さ
れたカルスの選択 実施例１０ａおよび１０ｂを繰り返すが、形質転換され
た細胞を選択するために、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイ
シンＢを２Ｎ６培地に添加する。
【０１６５】実施例１１ｂ：トウモロコシの形質転換さ
れたカルスの選択 実施例１０ａおよび１０ｂを繰り返すが、形質転換され
た細胞を選択するために、１００ｍｇ／ｌのハイグロマ
イシンＢを２Ｎ６培地に添加する。
【０１６６】実施例１１ｃ：トウモロコシの形質転換さ
れたカルスの選択 実施例１０ａおよび１０ｂを繰り返すが、形質転換され
た細胞を選択するために、２００ｍｇ／ｌのハイグロマ
イシンＢを２Ｎ６培地に添加する。
【０１６７】実施例１２ａ：植物体の再生 カルスを維持するための２Ｎ６上およびＯＮ６（ホルモ
ンを含まないＮ６培地）上およびＮ６１（０．２５ｍｇ
／ｌ２，４−Ｄ＋１０ｍｇ／ｌカイネチン）上に置き、
再生を開始させる。ＯＮ６およびＮ６１培地に生長して
いる材料を光（白色蛍光ランプから１０〜３０μＥ／ｍ
2 秒の１６時間／日光）の中で生長させる。Ｎ６１プレ
ート上での延長された時間は不利であるので、Ｎ６１上
で生長しているカルスを２週間後ＯＮ６に移す。カルス
が同じ培地組成上に再び移される場合でも、カルスを２
週間毎に継代培養する。小植物体は４〜８週間で現れ
る。小植物体が少なくとも２ｃｍの高さになったら、そ
れらをＧＡ７容器またはその他の適当な容器中のＯＮ６
培地に移す。根は２〜４週間で形成する。根が生長を支
持するのに十分に形成されたように見えたら、小植物体
をピートボット内の土壌に移し、最初の４〜７日間は遮
光する。数日間の移植で透明プラスチックカップをひっ
くり返すことは有効である。植物体が形成されたら、そ
れらを通常のトウモロコシ植物体として扱い、稔性およ
び導入された遺伝子の性質を試験するために成熟するま
で温室中で生長させる。
【０１６８】実施例１２ｂ：植物体の再生 実施例１２ａを繰り返すが、カルスを維持するための培
地に５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢを添加する。
【０１６９】実施例１２ｃ：植物体の再生 実施例１２ａを繰り返すが、カルスを維持するための培
地に１００ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢを添加する。
【０１７０】実施例１２ｄ：植物体の再生 実施例１２ａを繰り返すが、カルスを維持するための培
地に２００ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢを添加する。
【０１７１】実施例１３：形質転換および再生 実施例８、９、１０および１１を繰り返すが、プラスミ
ドＤＮＡとしてプラスミドｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔを
用い、そして選択段階でハイグロマイシンの代わりに抗
生物質Ｇ４１８を使用する。
【０１７２】実施例１４：キメラハイグロマイシン耐性
およびキメラＢｔ遺伝子の両方を含有するｐＩＲＶの製
造 プラスミドｐＣＩＢ７１２をSmaIで消化する。プラスミ
ドｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔをSphIで消化し、ＤＮＡポ
リメラーゼ（クレノー酵素）の大断片で処理してブラン
ト末端を得、次いでSmaIで消化する。キメラＢｔ遺伝子
を含む約４．８ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動によ
り精製し、そしてSmaI開裂ｐＣＩＢ７１２ＤＮＡに連結
する。生成したプラスミドｐＩＲＶはキメラハイグロマ
イシン耐性遺伝子とキメラＢｔ遺伝子の両方を含む。エ
レクトロポレーションに先立って、キメラ遺伝子の末端
の適当な部位でｐＩＲＶを線状化する。
【０１７３】実施例１５：形質転換および再生 実施例８、９、１０および１１を繰り返すが、プラスミ
ドＤＮＡとしてプラスミドｐＩＲＶを用い、そしてハイ
グロマイシンを選択の際に使用する。
【０１７４】実施例１６：キメラキチナーゼおよびキメ
ラハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドの製
造 ｃＤＮＡクローン、タバコキチナーゼ遺伝子のコード領
域を含むｐＳＣＨ１を、ｐＢＲ３３のPstI内にクローン
化させたタバコｃＤＮＡのライブラリィ内で同定する。
雑種の選択された翻訳はマメのキチナーゼに対してもた
らされた抗体と交差反応するタンパク質を与える（Shin
shi 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84 (1987) 89-93
）。タバコＤＮＡのランダムライブラリィから、相当
するゲノムクローンを、プローブとしてｃＤＮＡクロー
ンを用いて同定する（Maniatis等）。雑種形成および制
限地図の研究はｃＤＮＡクローンとゲノムクローンに共
通なPstI部位を同定するために利用される。この共通な
PstI部位から上流のゲノムＤＮＡの配列決定は、キチナ
ーゼ構造遺伝子の読み枠の開始、並びに開始部位から−
３５位のSphI認識部位を明らかにする。下記の工程は、
この上流のゲノムＤＮＡ断片を下流のｃＤＮＡ断片に結
合させ、キチナーゼの全長コード領域を形成するために
用いられる。
【０１７５】ａ．全長遺伝子をプラスミドベクターｐＧ
Ｙ１内に製造するが、これはＣａＭＶ３５プロモーター
断片、ＣａＭＶからの終結／ポリアデニル化シグナルお
よびこれら２つの間のポリリンカーを含む。ポリリンカ
ーの極性は下流の断片の配向を促し；下流の断片の配向
は配列分析により決定される。ゲノムクローンから上流
のSphI／PstI断片を分離し精製し；それを次にSphIとPs
tIで消化されたプラスミドｐＧＹ１内に連結する。 ｂ．生成した介在プラスミドをPstIで消化する。下流の
PstI断片をクローンｐＳＣＨ１から分離し、そしてこの
消化介在ベクター内に連結する。 ｃ．正しい配向および上流のゲノムＤＮＡ断片の枠内融
合を有するクローンをＤＮＡ配列分析により確認する。
生成したプラスミドをｐＳＣＨ１と命名する。プラスミ
ドｐＳＣＨ１（大腸菌Ｋ１２株内）はドイツ国ゲッチン
ゲンにあるドイチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオ
ルガニスメン（ＤＳＭ）に寄託してあり、そしてＤＳＭ
承認番号第４１２９号を有する〔寄託日：１９８７年５
月２９日〕。Ｃａｍｖ３５Ｓプロモーターおよびターミ
ネーター領域により挟まれた完全なキチナーゼ遺伝子
は、EcoRI 消化によりｐＳＣＨ１から切り出される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩの大断片を用いて断片をブラント末
端化する（Maniatis等）。レセプタープラスミドｐＣＩ
Ｂ７には植物細胞内に発現するキメラハイグロマイシン
耐性遺伝子を含むが、このプラスミドをSmaIで消化す
る。SmaI消化ｐＣＩＢ７１２とキメラキチナーゼ遺伝子
を含むブラント末端化断片をＴ４リガーゼを使用して連
結する（Maniatis等）。生成したプラスミドをｐＣＩＢ
ｃｈｔと命名する。プロトプラスト形質転換に先立って
ｐＣＩＢｃｈｔをキメラ遺伝子の末端の部位で線状化す
る。
【０１７６】実施例１７：スルホニル尿素耐性に関する
キメラＡＨＡＳ遺伝子を有するベクターの製造 ａ．スルホニル尿素耐性（ＳＵ−Ｒ）アラビドプシス植
物体の分離 エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）突然変異誘導Ｍ２
アラビドプシスタリアナ（Arabidopsisthaliana ）（コ
ロンビア種）の種子をHaughnおよびSomerville, Mol. G
en. Genet., 204 (1986) 430-434およびSomervilleおよ
びOgren, Methods in Chloroplast Molecular Biology,
Edelman等（編）(1982) 129-138の方法に従って製造す
る。ＥＭＳを０．３％濃度で１４〜１６時間使用し、そ
してＭ１種子を蒔き、１ｃｍ2 あたり２〜３個の植物体
の濃度に生長させる。スルホニル尿素耐性（ＳＵ−Ｒ）
アラビドプシス植物体をHaughnおよびSomervilleの方法
に従って選択し、そしてＭ２種子貯蔵体から生長させ
る。
【０１７７】ｂ．ＳＵ−ＲアラビドプシスＤＮＡの組換
えラムダファージライブラリィの製造 Jen およびChilton, J. Bacteriol., 166 (1986) 491-4
99に従ってＳＵ−Ｒアラビドプシス植物体から分離す
る。アラビドプシスＤＮＡをXbaI（ニューイングランド
バイオラブス）で完全に消化する。大きさ４〜８ｋｂの
長さのＤＮＡ断片をＮＡ４５ＤＥＡＥ膜（Schleicherお
よびSchuell, Keene, N. H., カタログ番号０３４３
１）を使用してアガロースゲルから分離し、そしてラム
ダ−ｏｎｇＣ−Ｘベクター（カリフォルニア州サンジェ
ゴ，タンシーストリートのストラタジーン）内に業者の
推奨する組換え方法を用いてクローン化する。組換えフ
ァージＤＮＡをストラタジーンからのギガパック−プラ
スキットを用いてエンカプシドする。
【０１７８】ｃ．ＳＵ−Ｒアラビドプシス植物体からＳ
Ｕ−Ｒアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）のク
ローニング サッカロマイセス・セレビシアエのＩＬＶ２遺伝子座を
含むプラスミドｐＥ１６／８−ｃ４（J. Polaina, Carl
sberg Res. Comm. 49 (1984) 577-584）をJ. Polainaか
ら入手し、そして大腸菌ＨＢ１３１内に形質転換し、そ
して大規模なプラスミド調製を行う。プラスミドｐＥ１
６／８−ｃ４はＡＴＣＣに寄託してあり、承認番号は６
７４２０であるこの寄託はブダペスト条約に従って行わ
れた（寄託日：１９８７年５月２９日）。プラスミドｐ
Ｅ１６／８−ｃ４ＤＮＡをEcoRIで消化し、そしてＡＨ
ＡＳコード配列を含む２．１ｋｂｐ（Ｅｃｏ２．１）断
片（Falco 等, Nucl. Acid. Res. 13 (1985) 4011-402
7）をアガロースゲルから分離する。Ｅｃｏ２．１断片
をプライムタイムキット（インターナショナルバイオテ
クノロジー社）で５〜８×１０8 ｃｐｍ／μｇの放射活
性に32Ｐで放射標識する。アラビドプシスXbaI断片を含
む組換えファージを（Maniatis等, (1982) ニューヨー
ク・コールドスプリングハーバー）およびストラタジー
ンの使用者の方法に従って大腸菌ＶＣＳ２５７上にプレ
ーティングする。複製ラムダプラーク・リフトをコロニ
ー／プラークスクリーン膜（ニューイングランドヌクレ
アリサーチプロダクツ）で業者の使用書に従って各々の
ファージプラークから製造する。
【０１７９】プラークソフトを下記のように処理する： ｉ．５×ＳＳＣ、２％ＳＤＳ中６５℃６時間洗浄する
（全ての方法はManiatis等の方法による）。 ii. ハイブリッド化混合物（５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，
５×デンハルト溶液，２００μｇ／ｍｌ変性および切断
サケＤＮＡ，２５％ホルムアミド，１０％硫酸デキスト
ラン；１５０ｍｍ膜あたり混合物１０ｍｌ）中４２℃で
１６〜２０時間プレハイブリット化する。 iii.変性放射標識Ｅｃｏ２．１断片を含むハイブリッド
化混合物（１５０ｍｍ膜あたり混合物１０ｍｌ）中４２
℃で１６〜２０時間プレハイブリット化する。 iv. ２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中室温で３０分間洗浄す
る。 ｖ. ５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、２５％ホルムアミド中４
２℃６〜８時間、洗浄溶液を４回交換して洗浄する。膜
をＸ線フィルム（コダックＸ−ＯｍａｔＡＲ）に晒す。
二重線上に一致したハイブリッド化を示すファージプラ
ークを示す第２ラウンドのラムダプラークリフトで精製
し、Ｅｃｏ２．１プローブでハイブリッド化する。酵母
ＡＨＡＳ配列へ同一な挿入を含む組換えファージのプレ
ート溶解物をManiatis等，(1982)の方法に従い調製す
る。ファージＤＮＡをプレート溶解物からラムダソルブ
（プロメガ）で業者の推奨する方法に従って調製する。
【０１８０】ｄ．ＳＵ−ＲアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝
子を含む形質転換ベクターｐＣＩＢ８０３の製造および
確認 組換えファージＤＮＡをXbaIで消化し、そして５．８ｋ
ｂｐ挿入断片をXbaI消化ｐＣＩＢ１０形質転換ベクター
内にクローン化し、ｐＣＩＢ８０３を得る。プラスミド
ｐＣＩＢ８０３大腸菌ＨＢ１０１宿主からアグロバクテ
リウム チュメファシエンスＣＩＢ５４２に三親交雑
（Ditta 等, Proc. Acad. Sci. USA., 77(1980) 262-26
9）により移動させる。アグロバクテリウム チュメフ
ァシエンスｐＣＩＢ８０３／ＣＩＢ５４２をLloyd 等,
Science, 234 (1980) 464-466 およびSheikholeslam お
よびWeeks, Plant Molec. Biol., 8 (1987) 291-298 に
従ってアラビドプシスタリアナ葉を形質転換するために
使用する。形質転換組織を植物体にLloyd 等およびFeld
man およびMarks, Plant Sci., 47 (1986) 63-69に従い
再生させる。培地の形質転換された組織の生長は３〜１
０ｎｇ／ｍｌクロロスルフロンに耐性であることを示
す。寒天培地内の遺伝子導入アラビドプシス植物体の発
芽および生長は１０〜３０ｎｇ／ｍｌクロロスルフロン
に耐性であることを示す。
【０１８１】ｅ．キメラＳＵ−Ｒ ＡＨＡＳ遺伝子を含
む形質転換ベクターｐＣＩＢ８０４の製造 Ｘｂａ５．８断片のＡＨＡＳコード配列の位置をヌクレ
アーゼＳ１マッピング（Maniatis等）、プライマー伸長
（Maknight等, Cell, 25 (1981) 385-398 ）により決定
し、そしてＤＮＡ配列決定（Sanger等, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA,74 (1977) 5463-5467 ）により確認し、
そしてタンパク質配列を細菌および酵母ＡＨＡＳ配列
（Falco 等, Nucl. Acid Res., 13 (1985) 4011-4027）
と比較する。５．８ｋｂXbaI断片をブルースクリプト
（ストラタジーン）内にクローン化し、そしてＡＨＡＳ
コード配列の上流の配列をＥｘｏ／Ｍｕｎｇディレーシ
ョンキット（ストラタジーン）を用いてＡＨＡＳ開始コ
ドンの上流１０〜２０ｂｐ以内で切断する。適当なリン
カーを切断の終末点に付着させる。再び分かれたＡＨＡ
Ｓ遺伝子を適当な制限部位、ＡＨＡＳ終結コドンの少な
くとも１０６ｂｐ下流で切断し、そして遺伝子の５’末
端に使用されたのと同じリンカーを遺伝子の３’末端に
付着させる。ＡＨＡＳコード配列を含む断片をベクター
からリンカー部位での切断により切出し、そしてｐＣＩ
Ｂ７１０のBamHI 部位にクローン化する。結合されたＳ
Ｕ−Ｒ ＡＨＡＳ遺伝子を受け取るために、ｐＣＩＢ７
１０のBamHI 部位を上に使用したリンカーと一致する部
位に適合させるか、または変換させる。ｐＣＩＢ７１０
内のＡＨＡＳ遺伝子挿入の配向は適当な制限酵素により
決定する。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写方向に関
して正しく配向されているＡＨＡＳコード配列を含むク
ローンはｐＣＩＢ８０４と命名されたものである。
【０１８２】実施例１８：２，４−Ｄおよびアセチルサ
リチル酸によるトウモロコシのプロトプラストからカル
ス形成の開始 プロトプラストを実施例３の最終段階で６／７強度ＫＭ
Ｃ溶液中に７．５ミリオン／ｍｌで再懸濁する。ＫＭ培
地中２．５ｍｇ／ｍｌでＯ−アセチルサリチル酸を溶解
する。溶液をフィルター殺菌する。次いでＯ−アセチル
サリチル酸を使用直前に培地に添加する。プロトプラス
ト懸濁液の一部を直径６ｃｍのペトリ皿に室温で設置す
る。２，４−Ｄおよびアセチルサリチル酸を正しい濃度
とし、そしてプロトプラスト濃度を０．５ミリオン／ｍ
ｌとするために、１．２％ｗ／ｖシープラークアガロー
ス、２，４−ＤおよびＯ−アセチルサリチル酸を含有す
るＫＭ培地３ｍｌを添加する。アガロースおよびプロト
プラストを十分に混ぜ培地をゲル化する。上記皿を実施
例７に記載したように培養する。３週間後、皿内に生成
する顕微鏡的コロニーを数える。結果を第２表および第
３表に示すが、これに各々異なって独立に得られた２種
の胚形成懸濁培養体からのプロトプラストのものを示し
ている。
【０１８３】
【表５】
【表６】
【０１８４】図７：２，４−Ｄおよびアセチルサリチル
酸の存在下および不在下でのＫＭ培地にプレーティング
したトウモロコシプロトプラストから生じるコロニー。 左上：１ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ，アセチルサリチル酸なし 右上：１ｍｇ／ｌアセチルサリチル酸，２，４−Ｄなし 左下：１００ｍｇ／ｌアセチルサリチル酸，２，４−Ｄ
なし 右下：１００ｍｇ／ｌアセチルサリチル酸，２ｍｇ／ｌ
２，４−Ｄ
【０１８５】実施例１９：Ｏ−アセチルサリチル酸およ
び２，４−Ｄの添加によるトウモロコシのプロトプラス
トから増加したコロニー形成 直径６ｃｍのペトリ皿の培地２ｍｌ中に、プロトプラス
トを実施例１８に記載したように培養のために調製およ
びプレーティングする。上記皿を実施例１０に記載した
ように培養する。３週間後、皿内に生成する顕微鏡的コ
ロニーを数える。結果を第４表に示す。Ｏ−アセチルサ
リチル酸はコロニー形成を刺激することが再び見出され
た。しかしながら、３００ｍｇ／ｌおよひそれ以上では
毒性効果が見出された。これはｐＨによるものと推測さ
れ、培地の適当な緩衝化により克服できるものと考えら
れる。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】実施例２０：２，４−Ｄの存在下でのＤＭ
ＳＯおよびＯ−アセチルサリチル酸によるトウモロコシ
プロトプラストからのコロニー形成開始 プロトプラストを実施例１８のように調製し、０．７５
ミリオン／ｍｌでプレーティングするが、このとき直径
３．５ｃｍのペトリ皿あたり１ｍｌの培地を用いる。Ｏ
−アセチルサリチル酸を培地に添加する。Ｏ−アセチル
サリチル酸をＤＭＳＯ中に添加し、そして次にプロトプ
ラストをプレーティグ前に培地に添加する。ＤＭＳＯ中
の溶液を得るために、Ｏ−アセチルサリチル酸１ｇをＤ
ＭＳＯ１０ｍｌ中に溶解し、そして蒸留水９０ｍｌに添
加する。溶液を次に使用前にフィルター滅菌する。上記
皿を実施例１０に記載したように培養する。３週間後、
皿内に生成する顕微鏡的コロニーを数える。結果を第５
表に示す。ＤＭＳＯ（１％ｗ／ｖ）のみではトウモロコ
シプロトプラストのコロニー形成は効率よく増加されな
いか、または減少させ、そしてＯ−アセチルサリチル酸
の刺激の有効性を明らかに示唆する。
【０１８８】
【表８】
【０１８９】実施例２１：２，４−Ｄおよび関連植物生
長調節剤（オーキシン）の添加によるトウモロコシプロ
トプラストからのコロニー形成の増加 プロトプラストを実施例３の最終段階で６／７強度ＫＭ
Ｃ溶液中に５ミリオン／ｍｌで再懸濁する。プロトプラ
スト懸濁液の一部を直径６ｃｍのペトリ皿に室温で設置
する。植物生長調節剤を正しい濃度とし、１．２％ｗ／
ｖシープラークアガロース、２，４−Ｄ、ピクロラム、
ジカムバまたはパラクロロフェノキシ酢酸（ｐＣＰＡ）
を含有するＫＭ培地２ｍｌを添加する。使用される最終
プロトプラスト濃度は０．５４ミリオン／ｍｌである。
アガロースおよびプロトプラストを十分に混ぜ培地をゲ
ル化する。上記皿を実施例１０に記載したように培養す
る。３週間後、皿内に生成する顕微鏡的コロニーを数え
る。結果を第６表に示す。
【０１９０】
【表９】
【０１９１】実施例２２：約７２５個のアミノ酸を含む
欠失Ｂｔプロトキシン遺伝子の製造、およびこの欠失遺
伝子とＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとを含むキメラ遺伝
子の製造 約７２５個のアミノ酸を含む欠失Ｂｔプロトキシン遺伝
子は配列番号：１における２３２５位のKnpI制限エンド
ヌクレアーゼ部位で切断することによる遺伝子のＣＯＯ
Ｈ末端部を除去することにより製造される。プラスミド
ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（図１９）をBamHI とKnpIで
消化し、そして欠失プロトキシン遺伝子を含む約２．２
ｋｂｐBamHI ／KpnI断片を、調製アガロースゲル電気泳
動により分離する。３’末端でのKpnI部分をBamHI 部位
への変換のために、この断片をKnpI／BamHI アダプター
オリゴヌクレオチドと混ぜ、そして連結する。この断片
を次にBamHI 開裂ｐＣＩＢ１０／７１０と混合する（図
１８）。生成した形質転換体、消化ｐＣＩＢ１０／３５
ＳＢｔ（ＫｎｐＩ）（図２１に示す）は約７２５個のア
ミノ酸の欠失プロトキシン遺伝子を含む。これらの形質
転換体をカナマイシン上で選択する。
【０１９２】実施例２３：約６４５個のアミノ酸を含む
欠失Ｂｔプロトキシン遺伝子の製造、およびこの欠失遺
伝子とＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとを含むキメラ遺伝
子の製造 約６４５個のアミノ酸を含む欠失Ｂｔプロトキシン遺伝
子は配列番号：１における２０９０位のBclI制限エンド
ヌクレアーゼ部位で切断することによる遺伝子のＣＯＯ
Ｈ末端部を除去することにより製造される。プラスミド
ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（図１９）をBamHI とBclIで
消化し、そして欠失プロトキシン遺伝子を含む約１．９
ｋｂｐBamHI ／BclI断片を、調製アガロースゲル電気泳
動により分離する。BclIはBamHI と一致する粘着端を生
じるため、この断片をBamHI 開裂ｐＣＩＢ１０／７１０
に連結する前に他の操作が必要である（図１８）。生成
したプラスミドは図２３に示すｐＣＩＢ１０／３５ＳＢ
ｔ（ＢｃｌＩ）の構造を有し、カナマイシンで選択され
る。
【０１９３】実施例２４：約６０７個のアミノ酸を含む
欠失Ｂｔプロトキシン遺伝子の製造、およびこの欠失遺
伝子とＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとを含むキメラ遺伝
子の製造 欠失プロトプラスト遺伝子は配列番号：１におけるヌク
レオチド１９７６位に続くBamHI 開裂部位（ＧＧＡＴＣ
Ｃ）を導入することにより製造される。これは上記の標
準オリゴヌクレオチド突然変異誘導法を用いることによ
り、ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔからのプロトキシン配列
を含むBamHI 断片をｍｐ１８内にクローニングすること
により行われる。突然変異誘導後、２本鎖複製ＤＮＡを
Ｍ１３クローンから準備し、次いでこれをBamHI で消化
する。欠失プロトキシン遺伝子を含む約１．９ｋｂｐ断
片をBamHI 開裂ｐＣＩＢ１０／７１０内に挿入する。生
成したプラスミドは図２３に示されるような構造ｐＣＩ
Ｂ１０／３５ＳＢｔ（６０７）を有し、カナマイシンで
選択される。
【０１９４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：４３５１ 配列の型：核酸 配列
【表１０】
【表１１】
【表１２】 配列番号：２ 配列の長さ：１１５６ 配列の型：アミノ酸 配列
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】トウモロコシの開始胚形成懸濁液中での使用に
適当であるカルスを示す図面である（約７倍に拡大，工
程ａ）。
【図２】工程ｂ〜ｄの培養体に保有される密集した細胞
質の分裂細胞を示す図面である（約２０倍に拡大）。
【図３】工程ｂ〜ｄの培養体に保有される密集した細胞
質の分裂細胞を示す図面である（約２０倍に拡大）。
【図４】固体培地中に培養されたプロトプラストから発
育するカルスを示す図面である（約７倍に拡大）。
【図５】工程ｆによりプロトプラストから誘導されたカ
ルスを示す図面である（約７倍に拡大）。
【図６】工程ｇにより小植物体を形成するカルスのさら
に分化したものを示す図面である（約７倍に拡大）。
【図７】２，４−Ｄおよびアセチルサリチル酸を有す
る、および有しないＫＭ培地中にプレーティングされた
トウモロコシプロトプラストから生じるコロニーを示す
図面である。
【図８】ｐＣＩＢ５の製造を示す図面である。
【図９】ｐＣＩＢ４の製造を示す図面である。
【図１０】ｐＣＩＢ２の製造を示す図面である。
【図１１】ｐＰＫ２５２Ｋｍの製造を示す図面である。
【図１２】ｐＣＩＢ１０の製造を示す図面である。
【図１３】ｐＲＫ２９０Ｋｍの製造を示す図面である。
【図１４】ｐＣＩＢ１０ａの製造を示す図面である。
【図１５】トウモロコシのプロトプラスト誘導カルスか
ら再生された小植物体を示す図面である。
【図１６】プロトプラスト誘導カルスから再生されたト
ウモロコシ小植物体を示す図面である。
【図１７】ｐＣＩＢ７１０の製造を示す図面である。
【図１８】ｐＣＩＢ１０／７１０の製造を示す図面であ
る。
【図１９】ｐＣＩＢ／３５ＳＢｔの製造を示す図面であ
る。
【図２０】トウモロコシプロトプラストをｐＣＩＢ７１
２で形質転換した後に回収される異なるトウモロコシカ
ルスのｐＣＩＢ７１２のEcoRI 断片で試験されたサザン
ブロット分析の結果を示す図面である。 １〜４列：制限エンドヌクレアーゼEcoRI で切断された
ｐＣＩＢ７１２のゲノム再結合物（それぞれ０．５，
１，２および５コピー）。 ５〜２５列：ｐＣＩＢ７１２でプロトプラストの形質転
換の後に回収されたトウモロコシのカルス培養体からの
ＤＮＡであり、制限エンドヌクレアーゼEcoRI で切断し
たもの。１０列にあるＤＮＡはフィルムの暗色化により
明らかになったようにトウモロコシ細胞のゲノム内に組
み入れられた外来ＤＮＡの存在を明示する。矢印は遺伝
子導入細胞にハイグロマイシン耐性を与えるｐＣＩＢ７
１２の組み入れられたＡＰＨ ＩＶ遺伝子のEcoRI 消化
から予測される９７５ｂｐ断片を示している。
【図２１】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（ＫｐｎＩ）の製
造を示す図面である。
【図２２】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（ＢｃｌＩ）の製
造を示す図面である。
【図２３】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（６０７）の製造
を示す図面である。
【手続補正書】
【提出日】平成９年３月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】トウモロコシの開始胚形成懸濁液中での使用に
適当なカルスである生物の形態を示す写真である（約７
倍に拡大，工程ａ）。
【図２】工程ｂ〜ｄの培養体に保有される密集した細胞
質の分裂細胞である生物の形態を示す写真である（約２
０倍に拡大）。
【図３】工程ｂ〜ｄの培養体に保有される密集した細胞
質の分裂細胞である生物の形態を示す写真である（約２
０倍に拡大）。
【図４】固体培地中に培養されたプロトプラストから発
育するカルスである生物の形態を示す写真である（約７
倍に拡大）。
【図５】工程ｆによりプロトプラストから誘導されたカ
ルスである生物の形態を示す写真である（約７倍に拡
大）。
【図６】工程ｇにより小植物体を形成するカルスのさら
に分化したものである生物の形態を示す写真である（約
７倍に拡大）。
【図７】２，４−Ｄおよびアセチルサリチル酸を有す
る、および有しないＫＭ培地中にプレーティングされた
トウモロコシプロトプラストから生じるコロニーである
生物の形態を示す写真である。
【図８】ｐＣＩＢ５の製造を示す図面である。
【図９】ｐＣＩＢ４の製造を示す図面である。
【図１０】ｐＣＩＢ２の製造を示す図面である。
【図１１】ｐＰＫ２５２Ｋｍの製造を示す図面である。
【図１２】ｐＣＩＢ１０の製造を示す図面である。
【図１３】ｐＲＫ２９０Ｋｍの製造を示す図面である。
【図１４】ｐＣＩＢ１０ａの製造を示す図面である。
【図１５】トウモロコシのプロトプラスト誘導カルスか
ら再生された小植物体である生物の形態を示す写真であ
る。
【図１６】プロトプラスト誘導カルスから再生されたト
ウモロコシ小植物体である生物の形態を示す写真であ
る。
【図１７】ｐＣＩＢ７１０の製造を示す図面である。
【図１８】ｐＣＩＢ１０／７１０の製造を示す図面であ
る。
【図１９】ｐＣＩＢ／３５ＳＢｔの製造を示す図面であ
る。
【図２０】トウモロコシプロトプラストをｐＣＩＢ７１
２で形質転換した後に回収される異なるトウモロコシカ
ルスのｐＣＩＢ７１２のＥｃｏＲＩ断片で試験されたサ
ザンブロット分析の結果であるクロマトグラフを示す写
真である。 １〜４列：制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断さ
れたｐＣＩＢ７１２のゲノム再結合物（それぞれ０．
５，１，２および５コピー）。 ５〜２５列：ｐＣＩＢ７１２でプロトプラストの形質転
換の後に回収されたトウモロコシのカルス培養体からの
ＤＮＡであり、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切
断したもの。１０列にあるＤＮＡはフィルムの暗色化に
より明らかになったようにトウモロコシ細胞のゲノム内
に組み入れられた外来ＤＮＡの存在を明示する。矢印は
遺伝子導入細胞にハイグロマイシン耐性を与えるｐＣＩ
Ｂ７１２の組み入れられたＡＰＨ ＩＶ遺伝子のＥｃｏ
ＲＩ消化から予測される９７５ｂｐ断片を示している。
【図２１】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（ＫｐｎＩ）の製
造を示す図面である。
【図２２】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（Ｂｃ１Ｉ）の製
造を示す図面である。
【図２３】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（６０７）の製造
を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ５６５５２ (32)優先日 1987年５月29日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 リチャード ロットスタイン アメリカ合衆国，ノースカロライナ27705, ダーラム，デラウエア ストリート 1619 (72)発明者 スチーブン ジェイ ロススタイン アメリカ合衆国，ノースカロライナ27514, チャペル ヒル，オーバーランド ドライ ブ 417 (72)発明者 レイモンド ダグラス シリトー アメリカ合衆国，ノースカロライナ27514, チャペル ヒル，ローレル リッジ アパ ーツメンツ 58 (72)発明者 グレタ カースウエル アメリカ合衆国，ノースカロライナ27511, カリー，ウエスト パーク ストリート 215 (72)発明者 クリスチャン ハームス アメリカ合衆国，ノースカロライナ27514, チャペル ヒル，グレイ ブラッフ トレ イル 1412 (72)発明者 シンディー グリマー ボウマン アメリカ合衆国，ノースカロライナ27511, カリー，ペニー レーン 100 (72)発明者 イン−フー チャン アメリカ合衆国，カリフォルニア94545, ヘイワード，25800 インダストリアル ボウルバード−アパートメント エックス −2288

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子のプロモーター、５’非翻訳領域
    および場合によっては３’非翻訳領域が植物体または植
    物ウイルス遺伝子から誘導され、トウモロコシ植物体に
    おいてバチルス スリンギエンシス結晶タンパク質の昆
    虫毒性を実質的に有するポリペプチドを発現する遺伝
    子。
  2. 【請求項２】 遺伝子のプロモーター、５’非翻訳領域
    または３’非翻訳領域が（ａ）リブロースビスホスフェ
    ートカルボキシラーゼもしくはクロロフィルａ／ｂ−結
    合タンパク質の小さいサブユニットをコードする植物遺
    伝子、または（ｂ）植物ＤＮＡウイルスから誘導される
    請求項１記載の遺伝子。
  3. 【請求項３】 植物ウイルスがカリフラワーモザイクウ
    イルスである請求項２記載の遺伝子。
  4. 【請求項４】 カリフラワーモザイクウイルスプロモー
    ターが（ａ）遺伝子ＶＩのプロモーター、または（ｂ）
    ３５Ｓ転写のプロモーターである請求項３記載の遺伝
    子。
  5. 【請求項５】 プロモーター、５’非翻訳領域または
    ３’非翻訳領域が、アグロバクテリウムプラスミドに存
    在し、そして植物体において発現を起こすＤＮＡ配列か
    ら誘導される請求項１記載の遺伝子。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡ配列が（ａ）オクトピンシンター
    ゼ、または（ｂ）ノパリンシンターゼをコードする遺伝
    子から誘導される請求項５記載の遺伝子。
  7. 【請求項７】 ポリペプチドが約１３００００ないし約
    １４００００の分子量を有するか、またはその殺虫性断
    片を有する請求項１記載の遺伝子。
  8. 【請求項８】 ポリペプチドが他の分子に融合されてい
    る請求項７記載の遺伝子。
  9. 【請求項９】 バチルス スリンギエンシス内の結晶タ
    ンパク質デルタエンドトキシンをコードするヌクレオチ
    ド配列に実質的に相同である請求項１記載の遺伝子。
  10. 【請求項１０】 バチルス スリンギエンシス内の結晶
    タンパク質エンドトキシンをコードする遺伝子のコード
    領域に対してハイブリッド形成できる請求項１記載の遺
    伝子。
  11. 【請求項１１】 ポリペプチドがバチルス スリンギエ
    ンシスからの結晶タンパク質の免疫学的特性を実質的に
    有する請求項１記載の遺伝子。
  12. 【請求項１２】 バチルス スリンギエンシスの亜種
    が、バチルス スリンギエンシス クルスタキ変種；バ
    チルス スリンギエンシス ベルリナー変種；バチルス
    スリンギエンシス アレスチ変種；バチルス スリン
    ギエンシス トルウオルチ変種；バチルス スリンギエ
    ンシス ソットー変種；バチルス スリンギエンシス
    デンドロリマス変種；バチルス スリンギエンシス テ
    ネブリオニス変種；バチルス スリンギエンシス サン
    ジェゴ変種；およびバチルス スリンギエンシス アイ
    サワィ変種からなる群から選択される請求項１ないし１
    １のいずれか１項に記載の遺伝子。
  13. 【請求項１３】 バチルス スリンギエンシス クルス
    タキ変種がバチルススリンギエンシス クルスタキ変種
    ＨＤ１である請求項１２記載の遺伝子。
  14. 【請求項１４】 配列番号：１のヌクレオチド配列を有
    する請求項１３記載の遺伝子。
  15. 【請求項１５】 配列番号：２のアミノ酸配列からなる
    ポリペプチドまたは該ポリペプチドの殺虫性部分をコー
    ドする請求項１記載の遺伝子。
  16. 【請求項１６】 請求項１５記載のアミノ酸配列に実質
    的な配列相同性を有する殺虫性ポリペプチドをコードす
    る請求項１記載の遺伝子。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載の遺伝子からなる細菌ま
    たは酵母内で複製できるベクター。
  18. 【請求項１８】 （ａ）ファージまたは（ｂ）プラスミ
    ドから誘導される請求項１７記載のベクター。
  19. 【請求項１９】 （ａ）遺伝子のプロモーター、５’非
    翻訳領域および場合によっては３’非翻訳領域が植物ま
    たは植物ウイルス遺伝子から誘導され、バチルス スリ
    ンギエンシス結晶タンパク質の昆虫毒性を実質的に有す
    るポリペプチドをコードする遺伝子をトウモロコシ細胞
    に導入し、そして（ｂ）前記ポリペプチドを発現させる
    ことからなる、バチルス スリンギエンシス結晶タンパ
    ク質の昆虫毒性を実質的に有するポリペプチドをトウモ
    ロコシ内で製造する方法。
  20. 【請求項２０】 トウモロコシ細胞が（ａ）培養細胞で
    あるか、または（ｂ）生長している植物体の部分からな
    る請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 トウモロコシ細胞が（ａ）トウモロコ
    シ近交系、または（ｂ）優良トウモロコシ近交系の細胞
    である請求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 優良トウモロコシがアメリカン タイ
    プ カルチャー コレクションに寄託されたＡＴＣＣ承
    認番号第４０３２６号を有するＦｕｎｋ２７１７である
    請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 バチルス スリンギエンシス結晶毒素
    またはバチルス スリンギエンシス結晶タンパク質の昆
    虫毒性を実質的に有するポリペプチドをコードする遺伝
    子を含有するトランスジェニックトウモロコシ細胞の殺
    虫量を昆虫の幼虫に与えることからなる昆虫の幼虫を防
    除する方法。
  24. 【請求項２４】 植物細胞が生長しているトウモロコシ
    植物体の部分からなる請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 抗病原性または病原防除有効性を有す
    るタンパク質の抗病原性有効量または病原体を防除する
    のに十分な量を植物細胞内に産生させることからなるト
    ウモロコシ植物体を攻撃する病原体により引き起こされ
    る損傷に対してトウモロコシ植物体を保護する方法。
  26. 【請求項２６】 殺有害生物性または有害生物防除有効
    性を有するタンパク質の殺有害生物性有効量または有害
    生物を防除するのに十分な量を植物細胞内に産生させる
    ことからなる有害生物損傷に対してトウモロコシ植物体
    を保護する方法。
  27. 【請求項２７】 有害生物が昆虫である請求項２６記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 タンパク質がバチルス スリンギエン
    シス結晶タンパク質またはバチルス スリンギエンシス
    結晶タンパク質の昆虫毒性を実質的に有するタンパク質
    である請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 タンパク質が植物体を昆虫に忌避させ
    るのに十分な量産生される請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 細胞分裂またはコロニー形成を促進す
    るのに十分なある量のＯ−低級アルカノイル−サリチル
    酸の存在下でプロトプラストまたは細胞を培養すること
    からなる植物プロトプラストまたは植物細胞の分裂また
    はコロニー形成を増加させる方法。
  31. 【請求項３１】 Ｏ−低級アルカノイル−サリチル酸が
    Ｏ−アセチルサリチル酸またはＯ−プロピオニルサリチ
    ル酸である請求項２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 さらに、生長調節有効で非毒性の量の
    植物生長調節剤の存在下で行われる請求項２９記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 さらに、細胞分裂またはコロニー形成
    を促進するのに十分なある量のＤＭＳＯの存在下で行わ
    れる請求項３０記載の方法。
  34. 【請求項３４】 プロトプラストまたは植物細胞がトウ
    モロコシのプロトプラストまたは細胞である請求項３０
    記載の方法。
JP8326045A 1987-05-20 1996-11-21 殺虫性タンパク質を発現する遺伝子、該タンパク質の製法および使用法 Pending JPH09238690A (ja)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5244087A 1987-05-20 1987-05-20
US5324187A 1987-05-22 1987-05-22
US5650687A 1987-05-29 1987-05-29
US5655287A 1987-05-29 1987-05-29
US52440 1987-05-29
US53241 1987-05-29
US56552 1987-05-29
US56506 1987-05-29

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP12373988A Division JP3227574B2 (ja) 1987-05-20 1988-05-20 プロトプラストまたはプロトプラスト誘導細胞から再生されたトウモロコシ植物体および遺伝子導入トウモロコシ植物体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH09238690A true JPH09238690A (ja) 1997-09-16

Family

ID=27489482

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP12373988A Expired - Fee Related JP3227574B2 (ja) 1987-05-20 1988-05-20 プロトプラストまたはプロトプラスト誘導細胞から再生されたトウモロコシ植物体および遺伝子導入トウモロコシ植物体
JP8326045A Pending JPH09238690A (ja) 1987-05-20 1996-11-21 殺虫性タンパク質を発現する遺伝子、該タンパク質の製法および使用法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP12373988A Expired - Fee Related JP3227574B2 (ja) 1987-05-20 1988-05-20 プロトプラストまたはプロトプラスト誘導細胞から再生されたトウモロコシ植物体および遺伝子導入トウモロコシ植物体

Country Status (8)

Country Link
EP (3) EP0846771A1 (ja)
JP (2) JP3227574B2 (ja)
AT (2) ATE125418T1 (ja)
BR (1) BR8802487A (ja)
DE (2) DE3854210T2 (ja)
ES (2) ES2121803T3 (ja)
HU (1) HU216536B (ja)
IL (1) IL86419A0 (ja)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL83348A (en) * 1986-08-26 1995-12-08 Du Pont Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
EP0275069A3 (en) * 1987-01-13 1990-04-25 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Pollen-mediated gene transformation in plants
TR27832A (tr) * 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
JPH02500566A (ja) * 1987-08-17 1990-03-01 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ バチルス・スリンギエンシスからのｄｎａ配列で形質転換された植物
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
WO1990007001A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Overexpression of chitinase in transgenic plants
DK0392225T3 (da) * 1989-03-24 2003-09-22 Syngenta Participations Ag Sygdomsresistente transgene planter
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
WO1991002071A2 (en) * 1989-08-09 1991-02-21 Dekalb Plant Genetics Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
WO1991010725A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US6777589B1 (en) * 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6066491A (en) * 1990-01-30 2000-05-23 Zeneca Mogen B.V. Process for obtaining fungal resistant plants with recombinant polynucleotides encoding β-1,3-glucanase modified for apoplast targeting
IL97020A (en) * 1990-01-30 2000-12-06 Mogen Int Recombinant polynucleotides comprising a chitinase gene and a glucanase gene
ES2104628T3 (es) * 1990-05-09 1997-10-16 American Cyanamid Co Metodo para evitar daños a los cultivos en presencia de combinaciones pesticidas sinergeticas.
PT97826B (pt) * 1990-06-07 1998-10-30 Mogem International N V Processo para a preparacao de purificacao de uma proteina a partir de uma planta com um efeito inibidor num patogenio ou peste e de composicoes anti-fungos que as contem
EP0535060B1 (de) * 1990-06-15 1995-02-22 Hoechst Schering AgrEvo GmbH Antifungisches polypeptid, verfahren zu seiner herstellung
DK0469273T3 (da) * 1990-06-23 2004-04-13 Bayer Cropscience Gmbh Fertile transgene majsplanter med artsfremmed gen samt fremgangsmåde til deres fremstilling
US5767367A (en) * 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
FR2665177B1 (fr) * 1990-07-24 1994-09-02 Sanofi Sa Gene recombinant codant pour une proteine a activite endochitinase et/ou lysozyme.
US6395966B1 (en) * 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5168035A (en) * 1990-12-27 1992-12-01 Eastman Kodak Company Process for making a pressure fog-resistant photographic element
US5384253A (en) * 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US6087560A (en) * 1991-01-29 2000-07-11 Rijksuniversiteit Te Leiden Transgenic fungal resistant plants expressing chitinase and glucanase, process for obtaining, and recombinant polynucleotides for uses therein
DK0526397T3 (da) * 1991-07-25 1996-02-12 Ciba Geigy Ag Immunologisk påvisningsfremgangsmåde
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US6350934B1 (en) 1994-09-02 2002-02-26 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid encoding delta-9 desaturase
US6114608A (en) 1997-03-14 2000-09-05 Novartis Ag Nucleic acid construct comprising bacillus thuringiensis cry1Ab gene
US5851766A (en) * 1995-05-31 1998-12-22 Novartis Finance Corporation Process for isolating chemically regulatable DNA sequences
CA2234656C (en) * 1995-10-13 2008-01-08 Dow Agrosciences Llc Modified bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
DE19621572A1 (de) * 1996-05-29 1997-12-04 Max Planck Gesellschaft Lokalisierter Zelltod in Pflanzen
PT942985E (pt) 1996-11-20 2004-12-31 Monsanto Technology Llc Delta-endotoxinas de largo espectro
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6573438B1 (en) 1997-03-14 2003-06-03 Syngenta Participations Ag Inbred Maize line 2044BT
US6183959B1 (en) 1997-07-03 2001-02-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method for target site selection and discovery
DE19741375C2 (de) * 1997-09-19 1999-10-21 Max Planck Gesellschaft Transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher reifen und vollständig absterben
DE19836098A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
AR022383A1 (es) 1998-09-18 2002-09-04 Univ Kentucky Res Found Sintasas
DK1117802T3 (da) 1998-10-09 2010-05-25 Bayer Bioscience Gmbh Nukleinsyremolekyler, der koder for et forgreningsenzym fra bakterier af slægten Neisseria samt fremgangsmåde til fremstilling af alfa-1,6-forgrenede alfa-1,4-glucaner
US20020144310A1 (en) 2000-01-28 2002-10-03 Lightfoot David A. Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same
EP1349946B1 (en) 2000-08-25 2011-01-26 BASF Plant Science GmbH Plant polynucleotides encoding prenyl proteases
US6734340B2 (en) 2000-10-23 2004-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Monocotyledon plant cells and plants which synthesise modified starch
HU230318B1 (hu) 2001-02-05 2016-01-28 The University Of South Carolina Arundo donax fenntartható totipotens tenyészete
AU2002236234B2 (en) 2001-03-06 2007-12-20 Phyton Holdings, LLC. Plant cell having animal-type sugar chain adding function
WO2002096923A1 (en) 2001-05-30 2002-12-05 Chromos Molecular Systems, Inc. Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
CA2462615C (en) 2001-11-07 2012-06-26 Syngenta Participations Ag Promoters for regulation of gene expression in plant roots
US7812227B2 (en) 2001-11-13 2010-10-12 U.S. Smokeless Tobacco Company Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana
US7700834B2 (en) 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokless Tobacco Company Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
US7700851B2 (en) 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokeless Tobacco Company Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
US8592663B2 (en) 2001-11-13 2013-11-26 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
US10266836B2 (en) 2001-11-13 2019-04-23 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof
AU2003247582A1 (en) 2002-06-20 2004-01-06 Board Of Trustees Operating Michigan State University Plastid division and related genes and proteins, and methods of use
US20040110184A1 (en) 2002-06-28 2004-06-10 Dow Agrosciences Llc Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from Paenibacillus species
JP2006519590A (ja) 2002-10-16 2006-08-31 ユーエス スモークレス タバコ カンパニー タバコ属由来のシトクロムｐ４５０遺伝子のクローニング
DK1578973T3 (da) 2002-12-19 2008-11-24 Bayer Cropscience Ag Planteceller og planter, der syntetiserer en stivelse med foröget slutviskositet
EP1576178A4 (en) 2002-12-26 2008-03-05 Syngenta Participations Ag COMPOUNDS WITH CELL PROPERATION AND POLYPEPTIDE USES DAF R
US7655833B2 (en) 2003-05-29 2010-02-02 Brookhaven Science Associates, Llc ADS genes for reducing saturated fatty acid levels in seed oils
CN1836047B (zh) 2003-06-17 2010-12-22 赛姆生物系统遗传公司 在植物中生产胰岛素的方法
US8193409B2 (en) 2003-08-18 2012-06-05 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for increasing plant size and increasing the number and size of leaves
CN1867674B (zh) 2003-10-16 2011-11-09 美国无烟烟草有限责任公司 从烟草克隆细胞色素p450基因
US8637731B2 (en) 2003-10-16 2014-01-28 U.S. Smokeless Tobacco Company Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
ATE440947T1 (de) 2003-12-02 2009-09-15 Basf Se 2-methyl-6-solanylbenzochinon-methyltransferase als ziel für herbizide
EP1723245A4 (en) 2004-03-08 2010-03-03 Syngenta Participations Ag GLUTINAUTIC MAIZE PROTEIN AND PROMOTER
CN101023175B (zh) 2004-04-20 2012-02-29 辛根塔参与股份公司 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列
US8586837B2 (en) 2004-04-29 2013-11-19 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
EP1751278B1 (en) 2004-04-29 2015-03-18 U.S. Smokeless Tobacco Company LLC Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
PT2308977E (pt) 2004-04-30 2013-05-13 Dow Agrosciences Llc Novo gene de resistência a herbicida
AU2005261871B2 (en) 2004-07-08 2011-05-26 Dlf Seeds A/S Means and methods for controlling flowering in plants
CN100362104C (zh) 2004-12-21 2008-01-16 华中农业大学 利用水稻转录因子基因OsNACx提高植物抗旱耐盐能力
US7335760B2 (en) 2004-12-22 2008-02-26 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins
EP2338905B1 (en) 2005-02-23 2017-11-29 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
EP1707632A1 (de) 2005-04-01 2006-10-04 Bayer CropScience GmbH Phosphorylierte waxy-Kartoffelstärke
JP5210165B2 (ja) 2005-10-05 2013-06-12 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 増加したアミノ糖含量を有する植物
EP1772052A1 (de) 2005-10-05 2007-04-11 Bayer CropScience GmbH Verbesserte Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan
CN101553111B (zh) 2005-10-28 2013-06-26 美国陶氏益农公司 新除草剂抗性基因
US8222482B2 (en) 2006-01-26 2012-07-17 Ceres, Inc. Modulating plant oil levels
US7977535B2 (en) 2006-07-12 2011-07-12 Board Of Trustees Of Michigan State University DNA encoding ring zinc-finger protein and the use of the DNA in vectors and bacteria and in plants
EP2102349B1 (en) 2006-12-07 2017-09-13 Kansas State University Research Foundation Acetolactate synthase herbicide resistant sorghum
US11332753B2 (en) 2006-12-15 2022-05-17 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
US8319011B2 (en) 2006-12-15 2012-11-27 U.S. Smokeless Tobacco Company Llc Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity
US9370160B2 (en) 2006-12-15 2016-06-21 Altria Client Services Llc Tobacco inbred plants ALBEX1F and ALBEX1MS
ES2443118T3 (es) 2007-01-12 2014-02-17 Kansas State University Research Foundation Sorgo resistente a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
CA2686835C (en) 2007-05-09 2020-04-21 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
EP2390335A3 (en) 2007-05-23 2012-03-21 Syngenta Participations AG Polynucleotide markers
ATE528317T1 (de) 2007-06-08 2011-10-15 Univ Mexico Nacional Autonoma Unterdrückung der resistenz von insekten gegen bacillus thuringiensis-cry-toxine unter verwendung von toxinen, die nicht den cadherin- rezeptor benötigen
EP2036983A1 (de) 2007-09-12 2009-03-18 Bayer CropScience AG Pflanzen, die erhöhte Mengen an Glucosaminglycanen synthetisieren
RU2351120C1 (ru) * 2007-09-17 2009-04-10 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук Способ получения трансгенных растений кукурузы
RU2351121C1 (ru) * 2007-09-17 2009-04-10 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук Способ получения трансгенных однодольных растений
US8124851B2 (en) 2007-11-12 2012-02-28 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome P450 genes
CA2704271C (en) 2007-12-03 2016-07-19 Syngenta Participations Ag Engineering enzymatically susceptible phytases
US8344209B2 (en) 2008-07-14 2013-01-01 Syngenta Participations Ag Plant regulatory sequences
EP2184351A1 (en) 2008-10-30 2010-05-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Polynucleotides encoding caryophyllene synthase and uses thereof
US8362318B2 (en) 2008-12-18 2013-01-29 Board Of Trustees Of Michigan State University Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae
US8269068B2 (en) 2009-01-22 2012-09-18 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
AR075240A1 (es) 2009-02-06 2011-03-16 Syngenta Participations Ag Modificacion de enzima multidominio para la expresion en plantas
US8373025B2 (en) 2009-02-09 2013-02-12 Chromatin Germplasm, Llc Herbicide resistant sorghum
US8940884B2 (en) 2009-03-19 2015-01-27 Dsm Ip Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
KR20140014371A (ko) 2009-04-17 2014-02-06 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 살충성 ｄｉｇ-3 ｃｒｙ 독소
CA2764503A1 (en) 2009-06-05 2010-12-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Isolation and targeted suppression of lignin biosynthetic genes from sugarcane
EP2451946B2 (en) 2009-07-10 2018-08-29 Syngenta Participations AG Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CN102498125A (zh) 2009-07-16 2012-06-13 瓦赫宁恩大学 植物中锌缺乏及耐受性的调控
WO2011074959A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Edwin Henricus Antonius Holman Transgenic ozone-resistant plants
EP2336310A1 (en) 2009-12-16 2011-06-22 Isobionics B.V. Valencene synthase
US9328335B2 (en) 2009-12-30 2016-05-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Method to produce acetyldiacylglycerols (ac-TAGs) by expression of an acetyltransferase gene isolated from Euonymus alatus (burning bush)
US9247706B2 (en) 2010-01-15 2016-02-02 North Carolina State University Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco
CN103108540A (zh) 2010-04-23 2013-05-15 陶氏益农公司 防止在玉米根虫（根萤叶甲）中形成抗性的包括Cry34Ab/35Ab和Cry3Aa蛋白的组合
US9234208B1 (en) 2010-05-10 2016-01-12 Dow Agrosciences Llc DIG-13 insecticidal cry toxins
CA2805263A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 Dow Agrosciences Llc Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency
CA2809644C (en) 2010-08-30 2020-06-30 Agrigenetics, Inc. Activation tagging platform for maize, and resultant tagged populations and plants
JP2014515596A (ja) 2011-02-28 2014-07-03 ノース カロライナ ステイト ユニヴァーシティ タバコ近交系植物ｎｃｂｅｘ１ｆ、ｎｃｂｅｘ１ｍｓ、及びｎｃｅｘ９０
UY34014A (es) 2011-04-15 2012-11-30 Dow Agrosciences Llc Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
US9365862B1 (en) 2011-05-26 2016-06-14 Nutech Ventures Herbicide resistant sorghum mutants
EP2537926A1 (en) 2011-06-21 2012-12-26 Isobionics B.V. Valencene synthase
WO2013005211A2 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Boron complexing plant materials and uses thereof cross-reference to related applications
US20140251317A1 (en) 2011-10-12 2014-09-11 Bayer Cropscience Ag Plants with decreased activity of a starch dephosphorylating enzyme
BR112014008723A2 (pt) 2011-10-12 2019-09-24 Bayer Cropscience Ag plantas com diminuição da atividade de uma enzima de desforilação de àmido
AU2013254857B2 (en) 2012-04-23 2018-04-26 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
IN2015DN00512A (ja) 2012-08-17 2015-06-26 Dow Agrosciences Llc
US20140075593A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Dow Agrosciences Llc Fluorescence activated cell sorting (facs) enrichment to generate plants
US9816102B2 (en) 2012-09-13 2017-11-14 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
CN105517430A (zh) 2013-01-11 2016-04-20 北卡罗莱纳州立大学 烟草近交植物k326 src、cms k326 src、k346 src、cms k346 src、nc1562-1 src、nctg-61 src、cms nctg-61 src和杂交种nc196 src
EP2964016A1 (en) 2013-03-05 2016-01-13 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and uses thereof
US10392629B2 (en) 2014-01-17 2019-08-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Increased caloric and nutritional content of plant biomass
US9596822B2 (en) 2014-03-03 2017-03-21 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof
WO2015134423A1 (en) 2014-03-03 2015-09-11 North Carolina State University Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof
JP2017508462A (ja) 2014-03-03 2017-03-30 ノース カロライナ ステイト ユニヴァーシティ タバコ近交系植物およびハイブリッド植物ならびにそれらから作られたタバコ製品
TW201542093A (zh) 2014-03-21 2015-11-16 艾格里遺傳學股份有限公司 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ
WO2016039961A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Marrone Bio Innovations, Inc Chromobacterium subtsugae genome
BR112017013514A2 (pt) 2014-12-30 2018-01-02 Dow Agrosciences Llc toxinas cry1ca modificadas úteis para o controle de pragas de insetos
US10612036B2 (en) 2015-08-17 2020-04-07 Dow Agrosciences Llc Engineered Cry6A insecticidal proteins
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
BR112018074101A2 (pt) 2016-05-26 2019-03-06 Nunhems Bv plantas produtoras de fruto sem semente
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
WO2018101824A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Universiteit Van Amsterdam Plants comprising pathogen effector constructs
NL2019473B1 (en) 2017-09-01 2019-03-11 Isobionics B V Terpene Synthase producing patchoulol and elemol, and preferably also pogostol
WO2019157522A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Curators Of The University Of Missouri Small auxin upregulated (saur) gene for the improvement of plant root system architecture, waterlogging tolerance, drought resistance and yield
US11291176B2 (en) 2018-06-15 2022-04-05 Nunhems B.V. Seedless watermelon plants comprising modifications in an ABC transporter gene
CN109182370B (zh) * 2018-08-03 2022-06-17 浙江大学 一种植物多基因表达载体、转化子及其应用
US11946057B2 (en) 2018-12-20 2024-04-02 Benson Hill, Inc. Pre-conditioning treatments to improve plant transformation
EP4172339A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Benson Hill, Inc. Plant cell treatments to improve plant transformation
CN115399237A (zh) * 2022-08-16 2022-11-29 安徽荃银高科种业股份有限公司 一种高抗茎腐病玉米的育种方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983001176A1 (en) * 1981-10-01 1983-04-14 Int Plant Research Inst Process for the genetic modification of cereals with transformation vectors
NL8200523A (nl) * 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
JPS5912453U (ja) * 1982-07-14 1984-01-25 富士電機株式会社 電磁継電器
BR8404834A (pt) * 1983-09-26 1985-08-13 Agrigenetics Res Ass Metodo para modificar geneticamente uma celula vegetal
EP0160692A1 (en) * 1983-11-03 1985-11-13 DE WET, Johannes Martenis Jacob Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
ATE73845T1 (de) * 1984-05-11 1992-04-15 Ciba Geigy Ag Transformation von pflanzenerbgut.
US4581847A (en) * 1984-09-04 1986-04-15 Molecular Genetics Research And Development Tryptophan overproducer mutants of cereal crops
FI864720A7 (fi) * 1985-11-22 1987-05-23 Ciba Geigy Ag Suora geeninsiirto plastideihin ja mitokondrioihin.
JPS63123325A (ja) * 1986-08-14 1988-05-27 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エ−・ファウ トランスジェニック単子葉植物、その種子および植物の調製方法
EP0267159A3 (de) * 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
ATE87032T1 (de) * 1986-12-05 1993-04-15 Ciba Geigy Ag Verbessertes verfahren zur transformation von pflanzlichen protoplasten.
IL84459A (en) * 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
EP0275069A3 (en) * 1987-01-13 1990-04-25 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Pollen-mediated gene transformation in plants
NZ224470A (en) * 1987-05-05 1991-06-25 Sandoz Ltd Method of transforming plant cell material; plant cell material and plants
EP0331083A3 (de) * 1988-03-02 1990-11-28 Schweizerische Eidgenossenschaft Eidgenössische Technische Hochschule (Eth) Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
GB8806643D0 (en) * 1988-03-21 1988-04-20 Ici Plc Genetic manipulation
NL8801444A (nl) * 1988-06-06 1990-01-02 Solvay Werkwijze voor het genetisch transformeren van cellen van een multicellulair eukaryotisch organisme.

Also Published As

Publication number Publication date
HK1013666A1 (en) 1999-09-03
DE3856241T2 (de) 1999-03-25
JP3227574B2 (ja) 2001-11-12
DE3854210T2 (de) 1996-02-15
ES2074999T3 (es) 1995-10-01
ES2121803T3 (es) 1998-12-16
ATE125418T1 (de) 1995-08-15
HU216536B (hu) 1999-07-28
IL86419A0 (en) 1988-11-15
DE3854210D1 (de) 1995-08-31
EP0292435B1 (en) 1995-07-26
EP0513849A2 (en) 1992-11-19
ATE169955T1 (de) 1998-09-15
DE3856241D1 (de) 1998-09-24
EP0513849A3 (en) 1992-12-02
JPS6463373A (en) 1989-03-09
HUT50491A (en) 1990-02-28
BR8802487A (pt) 1988-12-20
EP0846771A1 (en) 1998-06-10
EP0513849B1 (en) 1998-08-19
EP0292435A1 (en) 1988-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3227574B2 (ja) プロトプラストまたはプロトプラスト誘導細胞から再生されたトウモロコシ植物体および遺伝子導入トウモロコシ植物体
US5350689A (en) Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
EP0348348B1 (de) Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen Proteinase-Inhibitoren
US5508184A (en) Process for transforming plant protoplast
US5668298A (en) Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants
US6603065B2 (en) Transformation of hereditary material of plants
US5569597A (en) Methods of inserting viral DNA into plant material
US6037526A (en) Method of inserting viral DNA into plant material
DD283646A5 (de) Verfahren zur herstellung transgener pflanzen
AU620039B2 (en) Inducible virus resistance in plants
GB2183660A (en) Direct insertion of DNA into plastids and mitochondria
KR970010757B1 (ko) 면화의 재생 방법
US6048730A (en) Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants
AU616444B2 (en) Insecticidal cotton plant cells
IL95334A (en) Process for production of transgenic plants which belong to the species cucumis melo
RU2126047C1 (ru) Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми
EP0400553A1 (de) Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
US5215903A (en) Process for the maintenance and proliferation of defective non-infectious virus genomes in proliferating plant materials
HK1013666B (en) Method of preparing transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US6262338B1 (en) Resistance genes
HU225775B1 (en) Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells, and transgenic zea mays plants
Hope THE DEVELOPMENT OF REGENERATION AND TRANSFORMATION SYSTEMS
Banerjee In vitro regeneration and genetic transformation studies in indian cultivars of cotton (Gossypium hirsutum L.)
Dhillon STUDIES ON SOMATIC EMBRYOGENESIS AND GENETIC TRANSFORMATION IN MAIZE