JPH09248182A - プラスミド包埋多重膜リポソーム - Google Patents
プラスミド包埋多重膜リポソームInfo
- Publication number
- JPH09248182A JPH09248182A JP8058942A JP5894296A JPH09248182A JP H09248182 A JPH09248182 A JP H09248182A JP 8058942 A JP8058942 A JP 8058942A JP 5894296 A JP5894296 A JP 5894296A JP H09248182 A JPH09248182 A JP H09248182A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- liposome
- dopc
- cell
- tmag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title abstract description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims abstract description 14
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 claims abstract description 12
- KVPMQCQOEVMOOK-JSSVAETHSA-N [2-[[(2r)-1,5-didodecoxy-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCOC(=O)CC[C@@H](NC(=O)C[N+](C)(C)C)C(=O)OCCCCCCCCCCCC KVPMQCQOEVMOOK-JSSVAETHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- ZLGYVWRJIZPQMM-HHHXNRCGSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-di(dodecanoyloxy)propyl] phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCC ZLGYVWRJIZPQMM-HHHXNRCGSA-N 0.000 claims description 8
- MLKLDGSYMHFAOC-AREMUKBSSA-N 1,2-dicapryl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCC MLKLDGSYMHFAOC-AREMUKBSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 abstract 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- IJFVSSZAOYLHEE-SSEXGKCCSA-N 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCC IJFVSSZAOYLHEE-SSEXGKCCSA-N 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 4
- KKOSJVWUOHEQKA-HSZRJFAPSA-N PE(10:0/10:0) Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCCCC KKOSJVWUOHEQKA-HSZRJFAPSA-N 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 lipid N- (α-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamate chloride Chemical class 0.000 description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000003074 decanoyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
- Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
- Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
- Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞への遺伝子導入用のプラスミド包埋多重
膜リポソームを提供する。 【解決手段】 構成脂質が TMAG と、DOPC 又は DDPC
と、DOPE 又は DLPE であり且つモル比が TMAG と DOPC
と DOPE との組み合わせの場合には 1 : 2 - 3 :2 - 1
であり、TMAG と DDPC 又は DOPC と DLPE との組み合
わせの場合には 1: 2 : 2 であるプラスミド包埋多重膜
リポソームである。 【効果】 本発明によるプラスミド包埋リポソームは細
胞に遺伝子を効率よく導入し、その結果該形質転換細胞
の産物発現効率が著しく向上する。
膜リポソームを提供する。 【解決手段】 構成脂質が TMAG と、DOPC 又は DDPC
と、DOPE 又は DLPE であり且つモル比が TMAG と DOPC
と DOPE との組み合わせの場合には 1 : 2 - 3 :2 - 1
であり、TMAG と DDPC 又は DOPC と DLPE との組み合
わせの場合には 1: 2 : 2 であるプラスミド包埋多重膜
リポソームである。 【効果】 本発明によるプラスミド包埋リポソームは細
胞に遺伝子を効率よく導入し、その結果該形質転換細胞
の産物発現効率が著しく向上する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はプラスミド包埋多重
膜リポソームに係り、殊に正電荷脂質である N-(α-ト
リメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメ
ートクロライド(TMAG) を含有しており、プラスミドの
捕捉効率が高く、更に細胞による産物の発現効率も高
く、従って遺伝子治療に適 するプラスミド包埋多重膜
リポソームに係る。
膜リポソームに係り、殊に正電荷脂質である N-(α-ト
リメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメ
ートクロライド(TMAG) を含有しており、プラスミドの
捕捉効率が高く、更に細胞による産物の発現効率も高
く、従って遺伝子治療に適 するプラスミド包埋多重膜
リポソームに係る。
【０００２】
【従来の技術】リポソームは脂質の二分子膜により形成
される閉鎖型の小胞体であり、その内水層や膜内に各種
の物質を捕捉することができ、これによって各種物質の
キャリヤーとしての機能を果たすことが可能である。遺
伝子を導入するためのキャリヤーとしてもリポソームを
利用する技術が開発されてきており、本発明者等も特開
平 2 - 135092 及び 4 - 108391 公報に開示されている
ように、リポソームを構成する脂質に第 4 級アミンを
有する正電荷脂質を加えることが遺伝子の導入に効果的
であり、又多重膜リポソーム (MLV)が調製の上で簡便で
あり且つ細胞に対する毒性の低いことを実証している。
される閉鎖型の小胞体であり、その内水層や膜内に各種
の物質を捕捉することができ、これによって各種物質の
キャリヤーとしての機能を果たすことが可能である。遺
伝子を導入するためのキャリヤーとしてもリポソームを
利用する技術が開発されてきており、本発明者等も特開
平 2 - 135092 及び 4 - 108391 公報に開示されている
ように、リポソームを構成する脂質に第 4 級アミンを
有する正電荷脂質を加えることが遺伝子の導入に効果的
であり、又多重膜リポソーム (MLV)が調製の上で簡便で
あり且つ細胞に対する毒性の低いことを実証している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題及び発明の目的】本発明
者等は構成脂質が N-(α-トリメチルアンモニオアセチ
ル)-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (以下「TMA
G」と略記する場合がある)、ジラウロイルホスファチジ
ルコリン (以下「DLPC」と略記する場合がある) 及びジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン (以下「DO
PE」と略記する場合がある) である多重膜リポソーム
(以下「MLV」と略記する場合がある) がヒトインターフ
ェロン遺伝子を組み込んだプラスミドを包埋することが
でき、このインターフェロン包埋リポソームを脳腫瘍細
胞に導入する場合には、当該腫瘍細胞の増殖が抑制さ
れ、又殺腫瘍細胞効果の得られること並びに脳腫瘍細胞
を移植した脳腫瘍モデルマウスに関する試験においては
治療効果の得られることを確認しているが (特願平 7 -
295173 明細書)、更に異なる腫瘍細胞に対して治療効
果が発発揮させるリポソーム製剤や形質転換細胞の産物
発現効率において優れたリポソーム製剤の開発が要望さ
れている。
者等は構成脂質が N-(α-トリメチルアンモニオアセチ
ル)-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (以下「TMA
G」と略記する場合がある)、ジラウロイルホスファチジ
ルコリン (以下「DLPC」と略記する場合がある) 及びジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン (以下「DO
PE」と略記する場合がある) である多重膜リポソーム
(以下「MLV」と略記する場合がある) がヒトインターフ
ェロン遺伝子を組み込んだプラスミドを包埋することが
でき、このインターフェロン包埋リポソームを脳腫瘍細
胞に導入する場合には、当該腫瘍細胞の増殖が抑制さ
れ、又殺腫瘍細胞効果の得られること並びに脳腫瘍細胞
を移植した脳腫瘍モデルマウスに関する試験においては
治療効果の得られることを確認しているが (特願平 7 -
295173 明細書)、更に異なる腫瘍細胞に対して治療効
果が発発揮させるリポソーム製剤や形質転換細胞の産物
発現効率において優れたリポソーム製剤の開発が要望さ
れている。
【０００４】遺伝子を細胞に導入して遺伝子治療を行う
ためには、キャリヤーとしてのリポソームに安定性が要
求される。処で、遺伝子導入に従来用いられてきたリポ
ソームの多くは不飽和脂肪酸を側鎖に有している DOPE
を構成脂質の 1 つとしており、長期保存に関しては安
定化を図ることが要求される。
ためには、キャリヤーとしてのリポソームに安定性が要
求される。処で、遺伝子導入に従来用いられてきたリポ
ソームの多くは不飽和脂肪酸を側鎖に有している DOPE
を構成脂質の 1 つとしており、長期保存に関しては安
定化を図ることが要求される。
【０００５】従って、本発明の目的は正電荷を有する脂
質を構成脂質として含有するプラスミド包埋リポソーム
であって、遺伝子を効率よく細胞に導入して、この形質
転換細胞が高い産物発現効率をもたらす安定なプラスミ
ド包埋リポソームを提供することにある。
質を構成脂質として含有するプラスミド包埋リポソーム
であって、遺伝子を効率よく細胞に導入して、この形質
転換細胞が高い産物発現効率をもたらす安定なプラスミ
ド包埋リポソームを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決する手段】本発明によれば、既述の課題
は、構成脂質が N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)
-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (TMAG)、ジオ
クタノイルホスファチジルコリン (DOPC) 及びジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン(DOPE) であり、
これらの含有率は TMAG が 20% の場合に、DOPC が 40
- 60%であり、残部が DOPE である遺伝子導入用多重膜
リポソームにより、又構成脂質が N-(α-トリメチルア
ンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロラ
イド (TMAG)、ジデカノイルホスファチジルコリン (DDP
C) 或いはジオクタノイルホスファチジルコリン (DOPC)
及びジラウロイルホスファチジルエタノールアミン (D
LPE) であり、これらの含有率は TMAG が 20% の場合
に、DDPE 又は DOPCが 40% であり、残部が DLPE であ
るプラスミド包埋多重膜リポソームにより解決されると
共に、上記の目的が達成される。
は、構成脂質が N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)
-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (TMAG)、ジオ
クタノイルホスファチジルコリン (DOPC) 及びジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン(DOPE) であり、
これらの含有率は TMAG が 20% の場合に、DOPC が 40
- 60%であり、残部が DOPE である遺伝子導入用多重膜
リポソームにより、又構成脂質が N-(α-トリメチルア
ンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロラ
イド (TMAG)、ジデカノイルホスファチジルコリン (DDP
C) 或いはジオクタノイルホスファチジルコリン (DOPC)
及びジラウロイルホスファチジルエタノールアミン (D
LPE) であり、これらの含有率は TMAG が 20% の場合
に、DDPE 又は DOPCが 40% であり、残部が DLPE であ
るプラスミド包埋多重膜リポソームにより解決されると
共に、上記の目的が達成される。
【０００７】次に、製造例、比較製造例及び試験例によ
り本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。尚、製造
例及び比較製造例において用いられた材料及びリポソー
ム調製法並びに試験例において採用されている試験法は
下記の通りである。 (1) N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル
-D-グルタメートクロライド (TMAG) : 相互薬工株式会
社から市販のもの、 (2) ジラウロイルホスファチジルコリン (DLPC) 及びジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) :
日油リポソーム株式会社から市販のもの、 (3) ジオクタノイルホスファチジルコリン (DOPC)、ジ
デカノイルホスファチジルコリン (DDPC)、ジミリスト
イルホスファチジルコリン (DMPC)、ジヘキサノイルホ
スファチジルコリン (DHPC)、ジブチリルホスファチジ
ルコリン (DBPC)、ジラウロイルホスファチジルエタノ
ールアミン (DLPE) 及びジデカノイルホスファチジルエ
タノールアミン (DDPE) :アバンテイ社から市販のも
の、 (4) pCH110 プラスミド : ファルマシア社から市販のも
の、 (5) COS-1 細胞 (CRL-1650) : 大日本製薬株式会社から
市販のもの、 (6) 多重膜リポソームの調製法 : 文献 "Biochem. Biop
hys. Res. Commun",Vol. 196, page 1042 (1993) に記
載の方法に準拠、 (7) β-ガラクトシダーゼ活性の測定法 : 文献 "Experi
ments in MolecularGenetics", page 352, Cold Spring
Harbor 社 (1972) に記載の方法に準拠、 (8) 細胞抽出液中の蛋白質の定量法 : 文献 "Methods i
n Enzymology", Vol.196, page 1042 (1993) に記載の
方法に準拠。
り本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。尚、製造
例及び比較製造例において用いられた材料及びリポソー
ム調製法並びに試験例において採用されている試験法は
下記の通りである。 (1) N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル
-D-グルタメートクロライド (TMAG) : 相互薬工株式会
社から市販のもの、 (2) ジラウロイルホスファチジルコリン (DLPC) 及びジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) :
日油リポソーム株式会社から市販のもの、 (3) ジオクタノイルホスファチジルコリン (DOPC)、ジ
デカノイルホスファチジルコリン (DDPC)、ジミリスト
イルホスファチジルコリン (DMPC)、ジヘキサノイルホ
スファチジルコリン (DHPC)、ジブチリルホスファチジ
ルコリン (DBPC)、ジラウロイルホスファチジルエタノ
ールアミン (DLPE) 及びジデカノイルホスファチジルエ
タノールアミン (DDPE) :アバンテイ社から市販のも
の、 (4) pCH110 プラスミド : ファルマシア社から市販のも
の、 (5) COS-1 細胞 (CRL-1650) : 大日本製薬株式会社から
市販のもの、 (6) 多重膜リポソームの調製法 : 文献 "Biochem. Biop
hys. Res. Commun",Vol. 196, page 1042 (1993) に記
載の方法に準拠、 (7) β-ガラクトシダーゼ活性の測定法 : 文献 "Experi
ments in MolecularGenetics", page 352, Cold Spring
Harbor 社 (1972) に記載の方法に準拠、 (8) 細胞抽出液中の蛋白質の定量法 : 文献 "Methods i
n Enzymology", Vol.196, page 1042 (1993) に記載の
方法に準拠。
【０００８】製造例 1 構成脂質である TMAG、DOPC 及び DOPE のモル比が 2 :
5 : 3 である脂質薄膜に pCH110 プラスミド含有 PBS
(燐酸緩衝生理食塩水) を添加し、ボルテックス攪拌を
行うことによりプラスミド包埋 MLV を調製した。尚、
この場合に、全脂質 1μmol に対してプラスミド DNA
が 20μg 添加された。
5 : 3 である脂質薄膜に pCH110 プラスミド含有 PBS
(燐酸緩衝生理食塩水) を添加し、ボルテックス攪拌を
行うことによりプラスミド包埋 MLV を調製した。尚、
この場合に、全脂質 1μmol に対してプラスミド DNA
が 20μg 添加された。
【０００９】比較製造例 1 構成脂質が TMAG、DLPC 及び DOPE (モル比, 1 : 2 :
2) である pCH110 プラスミド包埋 MLV を、製造例 1
と同様にして調製した。尚、この場合にも、全脂質 1μ
mol に対してプラスミド DNA が 20μg 添加された。
2) である pCH110 プラスミド包埋 MLV を、製造例 1
と同様にして調製した。尚、この場合にも、全脂質 1μ
mol に対してプラスミド DNA が 20μg 添加された。
【００１０】比較試験例 1 製造例 1 及び比較製造例 1 により得られた pCH110 プ
ラスミド包埋 MLV をCOS-1 細胞に添加して 16 時間イ
ンキュベーションした後に培地を交換し、2 日間培養
し、次いで細胞中に発現した β-ガラクトシダーゼの活
性を測定した。結果は下記の表 1 に示されている通り
であり、炭素数 10 のオクタノイル基を側鎖として有し
ている DOPC を用いて調製されたリポソーム (製造例
1) を使用する場合には、炭素数 12 のラウロイル基を
側鎖として有している DLPC を用いて調製されたリポソ
ーム (比較製造例 1) を使用する場合よりも形質転換細
胞の産物発現効率において 6 倍程上昇することが判明
した。
ラスミド包埋 MLV をCOS-1 細胞に添加して 16 時間イ
ンキュベーションした後に培地を交換し、2 日間培養
し、次いで細胞中に発現した β-ガラクトシダーゼの活
性を測定した。結果は下記の表 1 に示されている通り
であり、炭素数 10 のオクタノイル基を側鎖として有し
ている DOPC を用いて調製されたリポソーム (製造例
1) を使用する場合には、炭素数 12 のラウロイル基を
側鎖として有している DLPC を用いて調製されたリポソ
ーム (比較製造例 1) を使用する場合よりも形質転換細
胞の産物発現効率において 6 倍程上昇することが判明
した。
【表１】 上記と同様の結果は、X-gal 試薬による細胞の活性染色
によっても得られ、本発明によるリポソームが細胞によ
る産物の発現効率において極めて優れていることが確認
された。
によっても得られ、本発明によるリポソームが細胞によ
る産物の発現効率において極めて優れていることが確認
された。
【００１１】製造例 2 構成脂質である TMAG、炭素数 4、8、10、12 又は 14
の飽和脂肪酸を側鎖として有するホスファチジルコリン
及び炭素数 12 の飽和脂肪酸を側鎖として有する DLPE
のモル比が 1 : 2 : 2 である脂質薄膜に pCH110 プラ
スミド含有PBS を添加し、ボルテックス攪拌を行うこと
によりプラスミド包埋 MLV を調製した。尚、この場合
に、全脂質 1μmol に対してプラスミド DNA が 20μg
添加された。
の飽和脂肪酸を側鎖として有するホスファチジルコリン
及び炭素数 12 の飽和脂肪酸を側鎖として有する DLPE
のモル比が 1 : 2 : 2 である脂質薄膜に pCH110 プラ
スミド含有PBS を添加し、ボルテックス攪拌を行うこと
によりプラスミド包埋 MLV を調製した。尚、この場合
に、全脂質 1μmol に対してプラスミド DNA が 20μg
添加された。
【００１２】比較製造例 2 構成脂質である TMAG、炭素数 4、8、10、12 又は 14
の飽和脂肪酸を側鎖として有するホスファチジルコリン
及び炭素数 10 の飽和脂肪酸を側鎖として有する DDPE
のモル比が 1 : 2 : 2 である脂質薄膜に pCH110 プラ
スミド含有PBS を添加し、ボルテックス攪拌を行うこと
によりプラスミド包埋 MLV を調製した。尚、この場合
にも、全脂質 1μmol に対してプラスミド DNA が 20μ
g 添加された。
の飽和脂肪酸を側鎖として有するホスファチジルコリン
及び炭素数 10 の飽和脂肪酸を側鎖として有する DDPE
のモル比が 1 : 2 : 2 である脂質薄膜に pCH110 プラ
スミド含有PBS を添加し、ボルテックス攪拌を行うこと
によりプラスミド包埋 MLV を調製した。尚、この場合
にも、全脂質 1μmol に対してプラスミド DNA が 20μ
g 添加された。
【００１３】比較試験例 2 製造例 2 及び比較製造例 2 により得られた pCH110 プ
ラスミド包埋 MLVを COS-1 細胞に添加して 16 時間イ
ンキュベーションした後に培地を交換し、2日間培養
し、次いで細胞中に発現した β-ガラクトシダーゼの活
性を測定した。結果は図 1 に示されている通りであ
り、製造例 2 により得られたリポソームの内で炭素数
8 のオクタノイル基を側鎖として有するホスファチジル
コリン(DOPC) 及び炭素数 10 のデカノイル基を側鎖と
して有するホスファチジルコリン (DDPC) を用いて調製
されたリポソームを使用する場合には、比較製造例 2に
よるリポソームを使用する場合と比較して、形質転換細
胞の産物発現効率において 4 倍程度高いことが判明し
た。上記と同様の結果は、X-gal 試薬による細胞の活性
染色によっても得られ、本発明によるリポソームは細胞
による産物の発現効率において極めて優れていることが
確認された。
ラスミド包埋 MLVを COS-1 細胞に添加して 16 時間イ
ンキュベーションした後に培地を交換し、2日間培養
し、次いで細胞中に発現した β-ガラクトシダーゼの活
性を測定した。結果は図 1 に示されている通りであ
り、製造例 2 により得られたリポソームの内で炭素数
8 のオクタノイル基を側鎖として有するホスファチジル
コリン(DOPC) 及び炭素数 10 のデカノイル基を側鎖と
して有するホスファチジルコリン (DDPC) を用いて調製
されたリポソームを使用する場合には、比較製造例 2に
よるリポソームを使用する場合と比較して、形質転換細
胞の産物発現効率において 4 倍程度高いことが判明し
た。上記と同様の結果は、X-gal 試薬による細胞の活性
染色によっても得られ、本発明によるリポソームは細胞
による産物の発現効率において極めて優れていることが
確認された。
【００１４】
【発明の効果】本発明によるプラスミド包埋リポソーム
は細胞に遺伝子を効率よく導入し、その結果として形質
転換細胞の産物発現効率が著しく向上する。
は細胞に遺伝子を効率よく導入し、その結果として形質
転換細胞の産物発現効率が著しく向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 構成脂質である N-(α-トリメチルアンモニ
オアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (T
MAG)、炭素数 4、8、10、12 又は 14 の飽和脂肪酸を側
鎖として有するホスファチジルコリン及び炭素数 12 又
は 10 の飽和脂肪酸を側鎖として有するホスファチジル
エタノールアミンのモル比が 1 : 2 :2 である脂質薄膜
に pCH110 プラスミドを包埋させた多重膜リポソームを
導入した COS-1 細胞が産生する β-ガラクトシダーゼ
の発現量を酵素の比活性にて調べた結果を示すグラフで
ある。
オアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (T
MAG)、炭素数 4、8、10、12 又は 14 の飽和脂肪酸を側
鎖として有するホスファチジルコリン及び炭素数 12 又
は 10 の飽和脂肪酸を側鎖として有するホスファチジル
エタノールアミンのモル比が 1 : 2 :2 である脂質薄膜
に pCH110 プラスミドを包埋させた多重膜リポソームを
導入した COS-1 細胞が産生する β-ガラクトシダーゼ
の発現量を酵素の比活性にて調べた結果を示すグラフで
ある。
Claims (2)
- 【請求項１】 構成脂質が N-(α-トリメチルアンモニ
オアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (T
MAG)、ジオクタノイルホスファチジルコリン(DOPC) 及
びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOP
E) であり、これらの含有率は TMAG が 20% の場合に、
DOPC が 40 - 60% であり、残部がDOPE であることを特
徴とする、プラスミド包埋多重膜リポソーム。 - 【請求項２】 構成脂質が N-(α-トリメチルアンモニ
オアセチル)-ジドデシル-D-グルタメートクロライド (T
MAG)、ジデカノイルホスファチジルコリン(DDPC) 或い
はジオクタノイルホスファチジルコリン (DOPC) 及びジ
ラウロイルホスファチジルエタノールアミン (DLPE) で
あり、これらの含有率は TMAG が20% の場合に、DDPE
又は DOPC が 40% であり、残部が DLPE であることを
特徴とする、プラスミド包埋多重膜リポソーム。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8058942A JPH09248182A (ja) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | プラスミド包埋多重膜リポソーム |
| US08/818,716 US5744159A (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | Plasmid entrapping multilamellar liposomes |
| CA002200012A CA2200012A1 (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | Plasmid entrapping multilamellar liposomes |
| EP97104431A EP0795325A1 (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | Plasmid entrapping multilamellar liposomes |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8058942A JPH09248182A (ja) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | プラスミド包埋多重膜リポソーム |
| US08/818,716 US5744159A (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | Plasmid entrapping multilamellar liposomes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09248182A true JPH09248182A (ja) | 1997-09-22 |
Family
ID=26399961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8058942A Withdrawn JPH09248182A (ja) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | プラスミド包埋多重膜リポソーム |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5744159A (ja) |
| EP (1) | EP0795325A1 (ja) |
| JP (1) | JPH09248182A (ja) |
| CA (1) | CA2200012A1 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001316297A (ja) * | 2000-02-23 | 2001-11-13 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | 遺伝子包埋リポソーム製剤及びその製法 |
| US8227248B2 (en) | 2006-06-30 | 2012-07-24 | Hokkaido System Science Co., Ltd. | Composition for nucleic-acid transfection |
| JPWO2014178152A1 (ja) * | 2013-04-30 | 2017-02-23 | Ｄｅｌｔａ−Ｆｌｙ Ｐｈａｒｍａ株式会社 | 局所投与用リポソームおよびその用途 |
| US9855345B2 (en) | 2014-10-30 | 2018-01-02 | Delta-Fly Pharma, Inc. | Method for producing lipoplex for topical administration and antitumor agent using such lipoplex |
| JP2023163355A (ja) * | 2022-04-28 | 2023-11-10 | プレシエンス バイオテクノロジー インコーポレイテッド | ラパマイシンまたはその誘導体を含むリポソーム、およびそれらの治療における使用 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0975332A1 (en) * | 1997-04-04 | 2000-02-02 | Valentis Inc. | Improved methods of delivery using cationic lipids and helper lipids |
| US6235310B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Valentis, Inc. | Methods of delivery using cationic lipids and helper lipids |
| EP0943680A1 (en) * | 1998-03-17 | 1999-09-22 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Suicide gene therapy system for the treatment of brain tumours |
| JP2008001598A (ja) * | 2004-10-12 | 2008-01-10 | Institute Of Physical & Chemical Research | アポトーシス誘導物質を含む医薬組成物 |
| AU2006291429B2 (en) * | 2005-09-15 | 2013-04-04 | Biontech Delivery Technologies Gmbh | Improvements in or relating to amphoteric liposomes |
| EP1764089A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-21 | Novosom AG | Serum stable liposomes comprising amphoter II lipid mixtures |
| JPWO2007037444A1 (ja) * | 2005-09-30 | 2009-04-16 | 国立大学法人 北海道大学 | 目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクター |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4921706A (en) * | 1984-11-20 | 1990-05-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Unilamellar lipid vesicles and method for their formation |
| JP2923296B2 (ja) * | 1988-11-14 | 1999-07-26 | 株式会社ビタミン研究所 | 細胞への遺伝子導入法 |
| JP2958076B2 (ja) * | 1990-08-27 | 1999-10-06 | 株式会社ビタミン研究所 | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 |
-
1996
- 1996-03-15 JP JP8058942A patent/JPH09248182A/ja not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-03-14 EP EP97104431A patent/EP0795325A1/en not_active Ceased
- 1997-03-14 CA CA002200012A patent/CA2200012A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-14 US US08/818,716 patent/US5744159A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001316297A (ja) * | 2000-02-23 | 2001-11-13 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | 遺伝子包埋リポソーム製剤及びその製法 |
| US8227248B2 (en) | 2006-06-30 | 2012-07-24 | Hokkaido System Science Co., Ltd. | Composition for nucleic-acid transfection |
| JP5325576B2 (ja) * | 2006-06-30 | 2013-10-23 | 北海道システム・サイエンス株式会社 | 核酸導入用組成物 |
| JPWO2014178152A1 (ja) * | 2013-04-30 | 2017-02-23 | Ｄｅｌｔａ−Ｆｌｙ Ｐｈａｒｍａ株式会社 | 局所投与用リポソームおよびその用途 |
| US9745583B2 (en) | 2013-04-30 | 2017-08-29 | Delta-Fly Pharma, Inc. | Liposome for topical administration and application thereof |
| US9855345B2 (en) | 2014-10-30 | 2018-01-02 | Delta-Fly Pharma, Inc. | Method for producing lipoplex for topical administration and antitumor agent using such lipoplex |
| JP2023163355A (ja) * | 2022-04-28 | 2023-11-10 | プレシエンス バイオテクノロジー インコーポレイテッド | ラパマイシンまたはその誘導体を含むリポソーム、およびそれらの治療における使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2200012A1 (en) | 1997-09-15 |
| EP0795325A1 (en) | 1997-09-17 |
| US5744159A (en) | 1998-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Papahadjopoulos et al. | Incorporation of lipid vesicles by mammalian cells provides a potential method for modifying cell behaviour | |
| Raz et al. | Biochemical, morphological, and ultrastructural studies on the uptake of liposomes by murine macrophages | |
| US4235871A (en) | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles | |
| US4241046A (en) | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles | |
| JP2958076B2 (ja) | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 | |
| US4078052A (en) | Large unilamellar vesicles (LUV) and method of preparing same | |
| CA1261751A (en) | Fused liposome and acid induced method for liposome fusion | |
| Gregoriadis | Drug entrapment in liposomes | |
| US4774085A (en) | Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators | |
| Konopka et al. | Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection increases the sensitivity of macrophages and THP-1 cells to cytotoxicity by cationic liposomes | |
| JPH09248182A (ja) | プラスミド包埋多重膜リポソーム | |
| WO1991017424A1 (en) | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes | |
| US20130149374A1 (en) | Asymmetric Liposomes for the Highly Efficient Encapsulation of Nucleic Acids and Hydrophilic Anionic Compounds, and Method for Preparing Same | |
| US6245427B1 (en) | Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles | |
| Dancey et al. | Effect of liposomal model membrane composition on immunogenicity | |
| AU660288B2 (en) | Accumulation of amino acids and peptides into liposomes | |
| Tolson et al. | Uptake of archaeobacterial liposomes and conventional liposomes by phagocytic cells | |
| US20100298420A1 (en) | Compositions and Methods for Intracellular Delivery | |
| US20090305409A1 (en) | Liposome Capable of Effective Delivery of Given Substance Into Nucleus | |
| Pappalardo et al. | Improved transfection of spleen-derived antigen-presenting cells in culture using TATp-liposomes | |
| Bloj et al. | Lipid transfer proteins in the study of artificial and natural membranes | |
| GB2140822A (en) | Transformation of plant cells | |
| US6316260B1 (en) | Tetraether lipid derivatives and liposomes and lipid agglomerates containing tetraether lipid derivatives, and use thereof | |
| Škalko et al. | pH-sensitive liposomes for receptor-mediated delivery to chicken hepatoma (LMH) cells | |
| CA2269502C (en) | Tetraether lipid derivatives and liposomes and lipid agglomerates containing tetraetherlipid derivatives, and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20030603 |