JPH09252794A - ポリ−γ−グルタミン酸の単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 菌体を含むポリ−γ−グルタミン酸の水
溶液より、ポリ−γ−グルタミン酸を単離する方法とし
て、従来行なわれていたアルコール沈殿法、塩析法によ
らずに分離膜を用いて効率よくポリ−γ−グルタミン酸
を分離、取得し得る方法を提供する。 【解決手段】 菌体を含むポリ−γ−グルタミン酸の水
溶液に、無機酸を添加し、ｐＨを１．５〜３．５とした
後、精密ろ過膜を用いて菌体を除去し、次いでその透過
液を限外ろ過膜を用いて透析処理することを特徴として
構成されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品、化成品、医
薬等の分野において機能性高分子として有用な高純度の
ポリ−γ−グルタミン酸（以下、単に「γ−ＰＧＡ」と
略記する）を、γ−ＰＧＡ醗酵液から効率よく単離する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】γ−ＰＧＡは微生物を利用した発酵法に
よって産生されることはよく知られており、一般に数万
から数百万の分子量を有している。蓄積量の増大に伴な
い培養後の培養液は粘稠性の帯びたものとなり、γ−Ｐ
ＧＡの単離操作を困難ならしめる要因となっている。

【０００３】従来、γ−ＰＧＡの単離法については、古
くは銅塩として沈澱する方法〔Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ
:Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.,１４５, ４１５(１９４
２)〕，アルコール沈殿法〔藤井久雄；農化, ３７, ４
０７（１９６３）〕，塩類による析出法（永井利影；特
公昭５２−８８７２号公報）等が知られている。

【０００４】しかしながら、いずれの方法に於ても、多
量のアルコール・塩類を必要とすること、回分処理であ
り又、生成するγ−ＰＧＡが粘着性物質のため、器壁等
に付着しやすく、スケール上の制約が生じること、更に
又、微量のアルコール成分や無機物がγ−ＰＧＡポリマ
ー中に取り込まれ、これらの混入のないγ−ＰＧＡを得
ることは難しい等、工業的規模での実施には必ずしも適
した方法とは言えない。

【０００５】最近、分離膜を用いて培養物からγ−ＰＧ
Ａを単離しようとする試みも行われている。例えば、特
開平１−１７４３９７号公報には、先ず、遠心分離また
は微細孔を有するフィルターろ過により菌体を除去し、
３〜４倍量のエタノールなどを添加してγ−ＰＧＡを沈
殿させ、そして沈殿物を水に溶解させ、不溶物を除去
し、低分子物を透析、限外ろ過などにより除去し、有機
溶媒による再沈殿を繰り返してγ−ＰＧＡを単離する方
法が開示されている。又、特開平７−１３５９９１号公
報によれば、共存する糖質の(固定した微生物あるいは
酸素による)除去、エタノールによるγ−ＰＧＡの沈殿
分離、透析あるいは分離膜による低分子物質の除去、分
離γ−ＰＧＡの凍結乾燥を含む方法が提案されている。

【０００６】しかしながら、特開平１−１７４３９７号
公報及び同７−１３５９９１号公報記載の方法でも、や
はりエタノール添加によるγ−ＰＧＡの沈殿分離工程を
経由するものであり、前述したようにアルコール沈殿の
場合には乾燥してもγ−ＰＧＡからアルコールを完全に
除去することは困難であったり、菌体分離は遠心分離で
行うことができたが、菌体含有液の高い粘度のため、分
離膜による菌体分離は困難であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
法のようにアルコール沈澱や塩析法によらずに、分離膜
による効率的なγ−ＰＧＡの単離法を提供することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討した結果、発酵液の如く、菌体や培
地栄養成分の夾雑物を含有するγ−ＰＧＡ水溶液のｐＨ
を酸性にすると、該水溶液の粘度が３００センチポイズ
（ｃｐ）以下になり、精密濾過膜処理が可能になること
を見出した。また、アルコール沈殿法などの沈殿法を用
いなくても、精密濾過膜を用いる除菌工程及び限外濾過
膜を用いる透析処理工程からなる２段階の膜処理のみに
よって、高純度のγ−ＰＧＡを高収率で分離取得し得る
ことも見出した。本発明は、これらの知見に基づいてな
されたものである。

【０００９】すなわち、本発明は、菌体を含むγ−ＰＧ
Ａの水溶液に無機酸を添加し、ｐＨを１．５〜３．５と
した後、精密濾過膜を用いて菌体を除去し、次いで得ら
れた透過液を限外濾過膜を用いて透析処理することを特
徴とするγ−ＰＧＡの単離法である。

【００１０】

【発明の実施の形態】菌体を含むγ−ＰＧＡの水溶液と
しては、公知の方法により微生物例えばバチルス・ズブ
チルスに属する納豆菌を培養して得られるγ−ＰＧＡ含
有発酵液が挙げられる。該γ−ＰＧＡ含有発酵液に無機
酸、例えば塩酸、硫酸等を添加し、ｐＨを３．５以下、
好ましくは１．５〜３．５、特に好ましくは２．０〜
２．５に調整する。溶液の粘度が一般に約３００ｃｐ以
下、特に２００ｃｐ以下になるように添加するのが好ま
しい。

【００１１】上記のｐＨに調整した後、精密ろ過膜を用
いて除菌する。この際、菌体以外に菌体由来の蛋白質、
糖類等の凝集沈殿物も同時に除去される。他方、酸性条
件下で溶存するγ−ＰＧＡは無機塩類、単糖、オリゴ糖
等の低分子化合物と共に膜を透過する。精密ろ過膜の材
質は耐酸性のものであればよく、例えばテフロン、ポリ
スルホン、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、ポリアミド、
ポリカーボネート等が好適なものとして挙げられる。ま
た、セラミック膜等の無機材質からなら精密濾過膜も使
用に好適である。精密ろ過膜の膜孔径は一般的に０.０
１〜０.５μｍ、特に０．０５〜０．２μｍであるのが
好ましい。具体例を商品名で示せばグレースジャパン
(株)製 Ｈ１５ＭＰ０１−４３、旭化成工業(株)製 Ｐ
ＳＰ−０１３等が挙げられる。膜の形状は平膜状、管
状、スパイラル状、中空子状等のいずれの形状であって
もよい。装置は通常の膜分離装置を用い、循環液の温度
は１０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃にコントロー
ルし、圧力は特に制限はないが透過速度を上げるために
膜が耐えられるかぎりの圧をかけ膜分離を行う。循環液
量が少量になったところで純水を加え、透過液のホール
ド分を流し出す。次いで、透過液について限外ろ過膜を
用いて透析処理を行なう。

【００１２】限外ろ過膜の材質としては、耐酸性の各種
ポリマー膜であればよく、例えば、ポリアミド、ポリス
ルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ四フッ化エチレ
ン、ポリエーテルサルホン等が用いられる。具体例を商
品名で示せば、ダイセル化学工業(株)製 ＦＵＳ−３０
８１、グレースジャパン(株)製 Ｈ１５Ｐ３０−４３、
日東電工(株)製 ＮＴＵ−３２５０ Ｃ３Ｒ等が挙げられ
る。膜の形状としては、平膜状、管状、スパイラル状、
中空子状等のいずれの形状であってもよい。使用する限
外ろ過膜の分画分子量は一般的に２，０００〜２００，
０００、好ましくは３，０００〜４０，０００である。
装置は通常の膜分離装置を用い、循環液の温度は１０〜
６０℃、好ましくは３０〜５０℃にコントロールし、圧
力は特に制限はないが透過速度を上げるために膜が耐え
られるかぎりの圧をかけ膜分離を行う。透過液量と同量
の純水を循環液に加え、循環液量が常に等量になるよう
コントロールする。透過液の電導度をチェックし、１０
ｍＳ／ｃｍより低くなったところで膜分離を中止する。
無機塩類や単糖類、オリゴ糖等の低分子化合物は膜を透
過するが、他方、γ−ＰＧＡは膜を透過しないで濃縮さ
れて濃縮液として得られる。得られた濃縮液は、充分高
純度であり、エタノール沈殿等の沈殿精製方法を用いる
ことなく、そのまま乾燥することにより、固体化された
高純度のγ−ＰＧＡを得ることができる。乾燥法として
は、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等が適用される。

【００１３】以下、参考例、実施例により具体的に説明
する。 参考例：γ−ＰＧＡの製造 市販の納豆より分離した納豆菌を、３Ｌのミニジャーを
用いて、麦芽エキス０．３％、酵母エキス０．３％、ポ
リペプトン０．５％、グルコース１．０％からなる培養
液（ｐＨ６．０）で３２℃、２４時間シード培養した。
次に５００Ｌのジャーを用いて、グルコース７．５％、
硫安１．５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３５
％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸水素カリウム
０．１５％、グルタミン酸モノナトリウム塩５．０％、
塩化ナトリウム１．０％からなる培養液（ｐＨ６．４）
にシード培養後の培養液を０．５％接種し、３７℃、４
８時間メイン培養した。培養後の培養液についてＧＰＣ
法によりγ−ＰＧＡの含量を測定したところ、０．８０
ｇ／ｄｌであった。

【００１４】

【実施例】

実施例１ 参考例で得た培養液２００ｍｌを濃塩酸でｐＨ２．０に
調整した。精密ろ過膜を内蔵したＭＦモジュールとして
旭化成工業（株）製 ｍｏｄｕｌｅ ＰＳＰ−０１３
(孔径０.１μｍ、膜面積０.０１７ｍ²、モジュール材質
はポリスルホン、スパイラルタイプ）を用い、温度３０
℃、圧力１．０Ｋｇｆ／ｃｍ²、循環線速０．１２ｍ／
ｓｅｃの条件で菌体分離を行った。循環液量が１００ｍ
ｌになったところで水６００ｍｌを加え、再度膜分離を
行い、循環液が１００ｍｌ、透過液が７００ｍｌとなっ
たところで膜処理を終了した。培養液のγ−ＰＧＡの９
４％が透過液側に移行した。この透過液を今度は旭化成
工業(株)製 ＵＦ ｍｏｄｕｌｅ ＳＩＰ−００１３(分子
量分画６０００、膜面積０．０１７ｍ²)を用い、透過液
量と同量の水を循環液側に加えつつ、温度３０℃、圧力
１.０Ｋｇｆ／ｃｍ²、循環線速０．１１ｍ／ｓｅｃの条
件で膜処理を行った。差し水量が６００ｍｌになったと
ころで差し水を終了し、循環液を濃縮した。循環液量が
６５ｍｌになったところで膜処理を終了した。この濃縮
液には培養液のγ−ＰＧＡの９１％が含まれていた。得
られた濃縮液を凍結乾燥することにより総収率８７％で
固体化したγ−ＰＧＡを１．４ｇ得た。このγ−ＰＧＡ
中にはカルシウム０．０４％、糖０．４５％、リン０．
０３％含まれていた。

【００１５】実施例２ 参考例と同様の方法で得た培養液１ＫＬを加熱により蛋
白を変成させた後、塩酸でｐＨ３に調整し、旭化成工業
(株)製 ｍｏｄｕｌｅ ＭＩＣＲＯＺＡＰＶ−３１３
（孔径０．１μｍ、膜面積２．９ｍ²）を用い、温度４
０〜５０℃、圧力１．０〜１．２Ｋｇ／ｃｍ²、循環線
速１.２ｍ／ｓｅｃの条件で菌体分離を行った。次にこ
の透過液を日東電工(株）製 ＵＦ ｍｏｄｕｌｅ ＮＴＵ
−３０００Ｃ３ＲＸ（分子量分画２０，０００、膜面積
３.９ｍ²）を用い、温度４０〜５０℃・圧力１．０〜
１．２Ｋｇ／ｃｍ²、循環線速１.１ｍ／ｓｅｃの条件で
透析処理を行った後、循環液を１８０Ｌまで濃縮した。
得られた濃縮液を凍結乾燥することにより総収率８５％
で固体化したγ−ＰＧＡを６．８Ｋｇ得た。

【００１６】比較例 参考例で得た培養液２００ｍｌを濃塩酸でｐＨ２．０に
調整し、遠心分離機により菌体を分離した後、得られた
菌体分離液を３倍量のエタノール中に滴下した。生成し
た沈殿をろ過し粗γ−ＰＧＡを得た。これを２００ｍｌ
の水に溶解させ、旭化成工業(株)製 ＵＦ ｍｏｄｕｌｅ
ＳＩＰ−００１３(分子量分画６０００、膜面積０．０
１７ｍ²）を用い、透過液量と同量の水を循環液側に加
えつつ、温度３０℃、圧力１.０Ｋｇｆ／ｃｍ²、循環線
速０．１１ｍ／ｓｅｃの条件で膜処理を行なった。差し
水量が６００ｍｌになったところで差し水を終了し、循
環液を濃縮した。循環液量が６５ｍｌになったところで
膜処理を終了した。次に、循環液を３倍量のエタノール
中に滴下し、精製した沈殿をろ過し、棚段乾燥機で減圧
乾燥することにより、総収率５７％でγ−ＰＧＡを０．
９１ｇ得た。このγ−ＰＧＡ中にカルシューム０．１０
％、糖０．４０％、リン０．１０％が含まれており、ま
た２％の残存エタノールも確認された。

【００１７】

【発明の効果】以上説明したように本発明の方法によ
り、菌体を含むγ−ＰＧＡの水溶液のｐＨを酸性にする
ことで精密ろ過膜による菌体分離を可能にすることがで
きるようになり、結果として精密ろ過膜処理と限外ろ過
膜処理の２段階の膜処理のみによって高純度のγ−ＰＧ
Ａを高収率に得ることができる。また、本発明の分離膜
によるγ−ＰＧＡの単離法は、全ての工程を水媒体で処
理することにより、従来行われていたアルコール沈殿や
塩析工程での煩雑な粘性固体の分離工程を省略し、効率
的でスケールアップが容易であるという利点がある。ま
た単離のために必要な副原料は無機酸のみであり、しか
もアルコール等の可燃性有機溶剤は不必要であることか
ら、防災設備の面でも有利である上に、得られるγ−Ｐ
ＧＡ中にアルコールが残存することもない。本法では、
精製のために膜設備のみで良いため、単離コスト面でも
効果的な方法であるといえる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 種河 鉄男 佐賀県佐賀郡諸富町大字諸富津450番地 味の素株式会社九州工場内 (72)発明者 渡辺 一弘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社川崎工場内 (72)発明者 小川 哲夫 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社川崎工場内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 菌体を含むポリ−γ−グルタミン酸の水
   溶液に無機酸を添加し、ｐＨを１．５〜３．５とした
   後、精密濾過膜を用いて菌体を除去し、次いで得られた
   透過液を限外濾過膜を用いて透析処理することを特徴と
   するポリ−γ−グルタミン酸の単離法。
2. 【請求項２】 限外濾過膜を用いて透析処理して得られ
   た濃縮液をそのまま凍結乾燥または噴霧乾燥することを
   特徴とする請求項１に記載のポリ−γ−グルタミン酸の
   単離法。
3. 【請求項３】 精密濾過膜の膜孔径が０．０５〜０．２
   μｍであり、限外濾過膜の分子量分画が３，０００〜４
   ０、０００であることを特徴とする請求項１または請求
   項２に記載のポリ−γ−グルタミン酸の単離法。