JPH09262085A - 新規酵素及びその製造方法 - Google Patents
新規酵素及びその製造方法Info
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- JPH09262085A JPH09262085A JP8073564A JP7356496A JPH09262085A JP H09262085 A JPH09262085 A JP H09262085A JP 8073564 A JP8073564 A JP 8073564A JP 7356496 A JP7356496 A JP 7356496A JP H09262085 A JPH09262085 A JP H09262085A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は新規な酵素及びその製造方法を提供
する。 【解決手段】 還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる分子量が７６ｋＤａ、等電点４．９−５．０、至適
ｐＨ７．６であり、高分子のタンパク質に作用せず、ア
ミノ酸６残基以上１７残基以下の神経ペプチドを特異的
に加水分解する活性を有する新規な酵素、及びラット肝
臓細胞質を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、
及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製する
ことを特徴とする、本発明新規酵素の製造方法に関す
る。 【効果】 本発明酵素は、その活性より神経ペプチドや
ペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、或いはアル
ツハイマー症などの神経系疾患の治療薬として有用であ
る。
する。 【解決手段】 還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる分子量が７６ｋＤａ、等電点４．９−５．０、至適
ｐＨ７．６であり、高分子のタンパク質に作用せず、ア
ミノ酸６残基以上１７残基以下の神経ペプチドを特異的
に加水分解する活性を有する新規な酵素、及びラット肝
臓細胞質を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、
及びアフィニティークロマトグラフィーにより精製する
ことを特徴とする、本発明新規酵素の製造方法に関す
る。 【効果】 本発明酵素は、その活性より神経ペプチドや
ペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、或いはアル
ツハイマー症などの神経系疾患の治療薬として有用であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な酵素及びそ
の製造方法に関する。詳しくは、還元条件下におけるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６ｋＤａ、等電点４．
９−５．０、至適ｐＨ７．６であり、高分子のタンパク
質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下の神経
ペプチドを特異的に加水分解する活性を有する新規な酵
素、及びラット肝臓細胞質を硫安分画、イオン交換クロ
マトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製することを特徴とする、新規酵素の製造方
法に関する。本発明酵素は、その活性より神経ペプチド
やペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、或いはア
ルツハイマー症などの神経系疾患の治療薬として有用で
ある。
の製造方法に関する。詳しくは、還元条件下におけるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６ｋＤａ、等電点４．
９−５．０、至適ｐＨ７．６であり、高分子のタンパク
質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下の神経
ペプチドを特異的に加水分解する活性を有する新規な酵
素、及びラット肝臓細胞質を硫安分画、イオン交換クロ
マトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製することを特徴とする、新規酵素の製造方
法に関する。本発明酵素は、その活性より神経ペプチド
やペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、或いはア
ルツハイマー症などの神経系疾患の治療薬として有用で
ある。
【０００２】
【従来の技術】種々の生理活性ペプチドは、細胞間のシ
グナル伝達物質として作用していることが明らかにされ
つつあり、ペプチドホルモンとして、内分泌型のシグナ
ル伝達に関与するものや、局所的なケミカルメディエー
ターとして機能するもの、そして神経伝達物質として神
経細胞間の伝達物質として機能するものもある。いずれ
のタイプのペプチドも、ターゲットとする細胞の機能発
現と密接に関わっていることから、ペプチドの代謝回転
も厳密に制御されていると考えられている。特に神経系
など局所での伝達の場合、伝達物質の代謝回転は迅速
で、それに関わる分解酵素の機能を整理することは重要
な課題である。ペプチドホルモンや神経ペプチドの分解
酵素として、プロリルオリゴペプチダーゼ (EC 3.4.21.
26) 、ネプリリシン neprilysin (EC 3.4.24.11)、サイ
メットオリゴペプチダーゼ thimet oligopeptidase (EC
3.4.24.15) 、ニューロリシンneurolysin (EC 3.4.24.
16) などが知られているが、体内に広く分布するもの
や、細胞内に局在するものもあり、明確な結論は出てい
ない。
グナル伝達物質として作用していることが明らかにされ
つつあり、ペプチドホルモンとして、内分泌型のシグナ
ル伝達に関与するものや、局所的なケミカルメディエー
ターとして機能するもの、そして神経伝達物質として神
経細胞間の伝達物質として機能するものもある。いずれ
のタイプのペプチドも、ターゲットとする細胞の機能発
現と密接に関わっていることから、ペプチドの代謝回転
も厳密に制御されていると考えられている。特に神経系
など局所での伝達の場合、伝達物質の代謝回転は迅速
で、それに関わる分解酵素の機能を整理することは重要
な課題である。ペプチドホルモンや神経ペプチドの分解
酵素として、プロリルオリゴペプチダーゼ (EC 3.4.21.
26) 、ネプリリシン neprilysin (EC 3.4.24.11)、サイ
メットオリゴペプチダーゼ thimet oligopeptidase (EC
3.4.24.15) 、ニューロリシンneurolysin (EC 3.4.24.
16) などが知られているが、体内に広く分布するもの
や、細胞内に局在するものもあり、明確な結論は出てい
ない。
【０００３】高齢人口の増加に伴い、神経系の疾患とし
て痴呆症に関心が寄せられている。中でもアルツハイマ
ー症は最も解析の進んだ疾患の一つで、この疾患を誘引
する物質と考えられているβ−アミロイド蛋白質の産生
に、ペプチダーゼが関与している可能性が示唆されてい
る。thimet oligopeptidase はその候補の一つでもあ
り、広く体内に分布し、主に細胞質に存在するメタロエ
ンドペプチダーゼとして発見されたものである。
て痴呆症に関心が寄せられている。中でもアルツハイマ
ー症は最も解析の進んだ疾患の一つで、この疾患を誘引
する物質と考えられているβ−アミロイド蛋白質の産生
に、ペプチダーゼが関与している可能性が示唆されてい
る。thimet oligopeptidase はその候補の一つでもあ
り、広く体内に分布し、主に細胞質に存在するメタロエ
ンドペプチダーゼとして発見されたものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
酵素と同様の活性を有する新規な酵素を求めて鋭意探索
の結果、ラット肝臓細胞質に、同様の活性を有する新規
な酵素を見出した。即ち本発明は、新規な酵素及びその
製造方法を提供することを課題とする。詳しくは、還元
条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６ｋ
Ｄａ、等電点４．９−５．０、至適ｐＨ７．６であり、
高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１
７残基以下の神経ペプチドを特異的に加水分解する活性
を有する新規な酵素、及びその製造方法を提供すること
を課題とする。本発明酵素は、その活性より神経ペプチ
ドやペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、或いは
アルツハイマー症などの神経系疾患の治療薬として有用
である。
酵素と同様の活性を有する新規な酵素を求めて鋭意探索
の結果、ラット肝臓細胞質に、同様の活性を有する新規
な酵素を見出した。即ち本発明は、新規な酵素及びその
製造方法を提供することを課題とする。詳しくは、還元
条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６ｋ
Ｄａ、等電点４．９−５．０、至適ｐＨ７．６であり、
高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１
７残基以下の神経ペプチドを特異的に加水分解する活性
を有する新規な酵素、及びその製造方法を提供すること
を課題とする。本発明酵素は、その活性より神経ペプチ
ドやペプチドホルモンの代謝研究用試薬として、或いは
アルツハイマー症などの神経系疾患の治療薬として有用
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の新規酵素は、還
元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６
ｋＤａであり、等電点４．９−５．０、至適ｐＨ７．６
であり、高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残
基以上１７残基以下の神経ペプチドを特異的に加水分解
する活性を有する。
元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６
ｋＤａであり、等電点４．９−５．０、至適ｐＨ７．６
であり、高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸６残
基以上１７残基以下の神経ペプチドを特異的に加水分解
する活性を有する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の新規酵素は、ラット肝臓
細胞質から得ることができる。即ち、ラットから肝臓を
摘出し、ホモジナイズしたものを遠心分離する。得られ
た上清を、さらに超遠心分離にかけ、これを細胞質溶液
とする。細胞質溶液を硫安分画し、硫安飽和度３５−６
０％の沈澱画分を得、これを透析する。透析後の粗画分
をＤＥＡＥ−セルロースで分画し、活性画分を得る。次
にこれをハイドロキシアパタイトカラム、セファクリル
カラム、ブルーセファロースカラム、ＭｏｎｏＱカラム
で精製し、画分を回収することにより精製酵素を得るこ
とができる。
細胞質から得ることができる。即ち、ラットから肝臓を
摘出し、ホモジナイズしたものを遠心分離する。得られ
た上清を、さらに超遠心分離にかけ、これを細胞質溶液
とする。細胞質溶液を硫安分画し、硫安飽和度３５−６
０％の沈澱画分を得、これを透析する。透析後の粗画分
をＤＥＡＥ−セルロースで分画し、活性画分を得る。次
にこれをハイドロキシアパタイトカラム、セファクリル
カラム、ブルーセファロースカラム、ＭｏｎｏＱカラム
で精製し、画分を回収することにより精製酵素を得るこ
とができる。
【０００７】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
【０００８】
【実施例１】ラット肝臓細胞質由来メタロエンドペプチダーゼの精製 (1）酵素活性測定 目的酵素の加水分解活性は、 Serizawa 等の方法 (J.Bi
ol.Chem., Vol.270, p2029, 1995）に準じて測定した。
即ち、0.01ｍＭの7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phe
nylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババイオ
ケム社）を基質として分解、生成される7-methoxycouma
rin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-OHの時間変化
を測定した。生成物を１分当たりに１μmol 産生させう
る酵素量を１Ｕと定義した。
ol.Chem., Vol.270, p2029, 1995）に準じて測定した。
即ち、0.01ｍＭの7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-phe
nylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババイオ
ケム社）を基質として分解、生成される7-methoxycouma
rin-3-carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-OHの時間変化
を測定した。生成物を１分当たりに１μmol 産生させう
る酵素量を１Ｕと定義した。
【０００９】(2) 細胞分画と硫安分画 一晩絶食させた８〜１２週齢のＷｉｓｔａｒ系雌ラット
２８匹から肝臓 (410g) を摘出し生理食塩水で濯ぎ、４
倍量の10mM Tris/HCl(pH7.8)、 250mMショ糖、5mM ２
−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF（Phenyl methyl
sulfonyl fluoride;和光純薬社）を加え、ポッター型ホ
モジナイザーでホモジナイズした。次いで、10,000×
ｇ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収し
た上清を更に100,000 ×ｇ、１時間の超遠心分離を行
い、その上清を回収して細胞質溶液とした。細胞質溶液
を硫安分画に付し、硫安飽和度３５−６０％沈殿画分を
回収した。次に、少量の 10mM Tris-HCl(pH 7.8)、 0.1
mM ZnCl2、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0.1mM P
MSF に溶解し、同緩衝液に対して２４時間透析した。
２８匹から肝臓 (410g) を摘出し生理食塩水で濯ぎ、４
倍量の10mM Tris/HCl(pH7.8)、 250mMショ糖、5mM ２
−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF（Phenyl methyl
sulfonyl fluoride;和光純薬社）を加え、ポッター型ホ
モジナイザーでホモジナイズした。次いで、10,000×
ｇ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。回収し
た上清を更に100,000 ×ｇ、１時間の超遠心分離を行
い、その上清を回収して細胞質溶液とした。細胞質溶液
を硫安分画に付し、硫安飽和度３５−６０％沈殿画分を
回収した。次に、少量の 10mM Tris-HCl(pH 7.8)、 0.1
mM ZnCl2、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0.1mM P
MSF に溶解し、同緩衝液に対して２４時間透析した。
【００１０】(3）ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィ
ー 透析後の粗画分を、予め10mM Tris-HCl(pH7.8)、 5mM
２−メルカプトエタノール、 0.1mM ZnCl2、 0. 05% Br
ij-35 （和光純薬社）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス (ワットマン社) 120gと混合し、４℃で２時間攪拌し
た。その後、ＤＥＡＥ−セルロースを分離回収して、平
衡化に用いた緩衝液で洗浄した。次いで、カラム (内径
50mm) に充填した。流量3.0ml/min 、NaCl濃度０−０．
３／６０００mlのグラディエント溶出で分画し、活性画
分を回収した。活性画分は、10mMリン酸ナトリウム(pH
6.8)、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0. 05% Brij
-35 、0.1mM ZnCl2 に対してダイアフィルトレーション
し、最終的に 100mlに濃縮してＤＥプールとした。
ー 透析後の粗画分を、予め10mM Tris-HCl(pH7.8)、 5mM
２−メルカプトエタノール、 0.1mM ZnCl2、 0. 05% Br
ij-35 （和光純薬社）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス (ワットマン社) 120gと混合し、４℃で２時間攪拌し
た。その後、ＤＥＡＥ−セルロースを分離回収して、平
衡化に用いた緩衝液で洗浄した。次いで、カラム (内径
50mm) に充填した。流量3.0ml/min 、NaCl濃度０−０．
３／６０００mlのグラディエント溶出で分画し、活性画
分を回収した。活性画分は、10mMリン酸ナトリウム(pH
6.8)、 5mM ２−メルカプトエタノール、 0. 05% Brij
-35 、0.1mM ZnCl2 に対してダイアフィルトレーション
し、最終的に 100mlに濃縮してＤＥプールとした。
【００１１】(4) ハイドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー ＤＥプールをハイドロキシアパタイトカラム（26mm x 2
0cm 、バイオラッド社）にロードして、流量1.0ml/min
、分画量15mlで、リン酸濃度０．０１−０．３Ｍ／１
５００mlのグラディエント溶出で分画した。画画分の加
水分解活性を測定し、活性画分をまとめＨＡプールとし
た。
フィー ＤＥプールをハイドロキシアパタイトカラム（26mm x 2
0cm 、バイオラッド社）にロードして、流量1.0ml/min
、分画量15mlで、リン酸濃度０．０１−０．３Ｍ／１
５００mlのグラディエント溶出で分画した。画画分の加
水分解活性を測定し、活性画分をまとめＨＡプールとし
た。
【００１２】(5) セファクリルS-200 ゲルフィルトレー
ション ＨＡプールを限外濾過で９mlまで濃縮し、予め10mM Tri
s-HCl(pH7.8)、 5mM 2−メルカプトエタノール、 0.1mM
NaCl2、 0.15M NaCl 、 0.05% Brij-35で平衡化したセ
ファクリルＳ−２００カラム (ファルマシア社) にアプ
ライして、流量0.4ml/min、分画量６mlで分離、分取し
た。各画分の分解活性を測定し、活性画分を合わせてＧ
Ｆプールとした。
ション ＨＡプールを限外濾過で９mlまで濃縮し、予め10mM Tri
s-HCl(pH7.8)、 5mM 2−メルカプトエタノール、 0.1mM
NaCl2、 0.15M NaCl 、 0.05% Brij-35で平衡化したセ
ファクリルＳ−２００カラム (ファルマシア社) にアプ
ライして、流量0.4ml/min、分画量６mlで分離、分取し
た。各画分の分解活性を測定し、活性画分を合わせてＧ
Ｆプールとした。
【００１３】(6) ブルーセファロースクロマトグラフィ
ー GFプールを、 10mM Tris/HCl(pH7. 8)、 5mM ２−メル
カプトエタノール、0.1mM ZnCl2 、 0. 05% Brij-35 、
0.1M NaCl で平衡化した HiTrap Blueカラム (５ml、フ
ァルマシア社) にアプライして、素通り画分を回収し
た。
ー GFプールを、 10mM Tris/HCl(pH7. 8)、 5mM ２−メル
カプトエタノール、0.1mM ZnCl2 、 0. 05% Brij-35 、
0.1M NaCl で平衡化した HiTrap Blueカラム (５ml、フ
ァルマシア社) にアプライして、素通り画分を回収し
た。
【００１４】(7) MonoQ FPLC ブルーカラムの素通り画分を MonoQカラム (ファルマシ
ア社) でさらに分画した。分離条件は、流量0.5ml/min
、 NaCl 濃度０．１−０．２Ｍ／３０分のグラディエ
ント溶出で、分画量0.5ml とした。活性画分をあわせ、
精製酵素とした。精製過程の収率を表１に示す。最終的
には、比活性 4.7U/mgの精製酵素が 0.8mg回収された。
ア社) でさらに分画した。分離条件は、流量0.5ml/min
、 NaCl 濃度０．１−０．２Ｍ／３０分のグラディエ
ント溶出で、分画量0.5ml とした。活性画分をあわせ、
精製酵素とした。精製過程の収率を表１に示す。最終的
には、比活性 4.7U/mgの精製酵素が 0.8mg回収された。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【実施例２】本発明酵素の特性 (1) 分子量と等電点 本発明酵素の最終精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件
下）の結果を、図１に示す。最終的に MonoQで分画して
回収した画分は単一バンドを示し、本法で単離出来るこ
とが確認された。単離した酵素の分子量は、７６ｋＤａ
であった。又、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、
精製酵素はほぼ同一の移動度で単一バンドを示したこと
から、本酵素は単一のペプチド鎖であることが確認され
た。さらに、等電点をファーストシステム（ファルマシ
ア社）を用いて分析した結果、本酵素の等電点は４．９
−５．０であった。
下）の結果を、図１に示す。最終的に MonoQで分画して
回収した画分は単一バンドを示し、本法で単離出来るこ
とが確認された。単離した酵素の分子量は、７６ｋＤａ
であった。又、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、
精製酵素はほぼ同一の移動度で単一バンドを示したこと
から、本酵素は単一のペプチド鎖であることが確認され
た。さらに、等電点をファーストシステム（ファルマシ
ア社）を用いて分析した結果、本酵素の等電点は４．９
−５．０であった。
【００１７】(2) 至適ｐＨ 10mM Tris-塩酸緩衝液及び10mMリン酸緩衝液を、ｐＨ
６．６から８．０まで０．１刻みに調整し、各ｐＨにお
ける活性を測定した。結果を図２に示す。この結果、両
緩衝液中とも至適ｐＨは７．６を示した。
６．６から８．０まで０．１刻みに調整し、各ｐＨにお
ける活性を測定した。結果を図２に示す。この結果、両
緩衝液中とも至適ｐＨは７．６を示した。
【００１８】(3) 本酵素に対する阻害剤 本酵素に対する各種プロテアーゼ阻害剤の影響を調べ
た。プロテアーゼ阻害剤として、Ｅ−64（ペプチド研究
所社）、ＰＭＳＦ、Pepstain、O-Phenanthrolin、ＥＤ
ＴＡ、Ｎ−エチルマレイミド（全て和光純薬社）を用い
た。尚、ＥＤＴＡのみ添加後１時間インキュベートした
後、測定した。結果を表２に示す。
た。プロテアーゼ阻害剤として、Ｅ−64（ペプチド研究
所社）、ＰＭＳＦ、Pepstain、O-Phenanthrolin、ＥＤ
ＴＡ、Ｎ−エチルマレイミド（全て和光純薬社）を用い
た。尚、ＥＤＴＡのみ添加後１時間インキュベートした
後、測定した。結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】この結果、単離した本発明酵素はＰＭＳ
Ｆ、ペプスタチンには全く阻害されなかったことから、
セリンプロテアーゼやアスパラギン酸プロテアーゼでは
ないことが確認された。一方、ＥＤＴＡやＯ−フェナン
トロリン等のキレート試薬で阻害されたことから、本発
明酵素は金属プロテアーゼであることが確認された。但
し、Ｅ−６４に阻害されず、Ｎ−エチルマレイミドに阻
害されたことから、本酵素に含まれるシステイン残基が
活性発現に何らかの関与をしていることが示唆された。
Ｆ、ペプスタチンには全く阻害されなかったことから、
セリンプロテアーゼやアスパラギン酸プロテアーゼでは
ないことが確認された。一方、ＥＤＴＡやＯ−フェナン
トロリン等のキレート試薬で阻害されたことから、本発
明酵素は金属プロテアーゼであることが確認された。但
し、Ｅ−６４に阻害されず、Ｎ−エチルマレイミドに阻
害されたことから、本酵素に含まれるシステイン残基が
活性発現に何らかの関与をしていることが示唆された。
【００２１】(4) 合成ペプチドに対するKm値とKi値 単離した本発明酵素の特性として、合成基質である 7-m
ethoxycoumarin-3- carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-
Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババイオケム社）に対するＫ
m 値を測定した。その結果、Ｋｍ値は24. 3 μＭを示し
た。また、同じ合成ペプチドを基質としてダイノルフィ
ンＡ (1-13) および N-[1-(RS)-carboxyl-3-phenylprop
yl]-Ala-Ala-Phe-pAb に対するＫｉ値を測定した。その
結果、Ｋｉ値はそれぞれ0.327 μＭおよび4.07μＭを示
した。
ethoxycoumarin-3- carboxyl-3-phenylpropyl-Pro-Leu-
Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 （ノババイオケム社）に対するＫ
m 値を測定した。その結果、Ｋｍ値は24. 3 μＭを示し
た。また、同じ合成ペプチドを基質としてダイノルフィ
ンＡ (1-13) および N-[1-(RS)-carboxyl-3-phenylprop
yl]-Ala-Ala-Phe-pAb に対するＫｉ値を測定した。その
結果、Ｋｉ値はそれぞれ0.327 μＭおよび4.07μＭを示
した。
【００２２】(5) 基質特異性 本酵素の合成或いは天然ペプチドに対する基質特異性を
測定した。即ち、合成或いは天然ペプチドを基質とし、
その分解物をＨＰＬＣで分析した。尚、基質としてＱＦ
０１（Dnp-Pro-Leu-Gly-Pro-Trp-D-Lys 、ノババイオケ
ム社）、ＱＦ０２（7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-p
henylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 、ノババイ
オケム社）、ブラジキニン、ニューロテンシン、サブス
タンスＰ、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲ
Ｈ）、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンII、ダイ
ノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ 1-13 、ダイノルフィ
ンＡ 1-8、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）
（全てシグマ社）を用いた。分離、分取後、アミノ酸分
析により切断位置を同定した。結果を表３に示す。
測定した。即ち、合成或いは天然ペプチドを基質とし、
その分解物をＨＰＬＣで分析した。尚、基質としてＱＦ
０１（Dnp-Pro-Leu-Gly-Pro-Trp-D-Lys 、ノババイオケ
ム社）、ＱＦ０２（7-methoxycoumarin-3-carboxyl-3-p
henylpropyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Lys(DNP)NH2 、ノババイ
オケム社）、ブラジキニン、ニューロテンシン、サブス
タンスＰ、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲ
Ｈ）、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンII、ダイ
ノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ 1-13 、ダイノルフィ
ンＡ 1-8、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）
（全てシグマ社）を用いた。分離、分取後、アミノ酸分
析により切断位置を同定した。結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
【００２４】この結果、本発明酵素はコラーゲン、ウシ
血清アルブミン、カゼイン、ヒツジＩｇＧ、ミオグロビ
ン、トランスフェリン、オボアルブミン等の高分子タン
パク質を、全く分解しなかった。これに対し、合成の低
分子ペプチド類や神経ペプチドは、本発明酵素により分
解された。これを解析した結果、基質と成り得るペプチ
ド鎖は６残基から１７残基であったことから、本酵素は
神経ペプチドを特異的に分解するオリゴエンドペプチダ
ーゼ活性を有することが確認された。
血清アルブミン、カゼイン、ヒツジＩｇＧ、ミオグロビ
ン、トランスフェリン、オボアルブミン等の高分子タン
パク質を、全く分解しなかった。これに対し、合成の低
分子ペプチド類や神経ペプチドは、本発明酵素により分
解された。これを解析した結果、基質と成り得るペプチ
ド鎖は６残基から１７残基であったことから、本酵素は
神経ペプチドを特異的に分解するオリゴエンドペプチダ
ーゼ活性を有することが確認された。
【００２５】(6) Ｎ末端アミノ酸配列 単離したメタロエンドペプチダーゼのＮ末端アミノ酸配
列分析を、自動アミノ酸配列分析装置 (Ａ４７７型、ア
プライドバイオシステムズ社）を用いて、そのプロトコ
ールに従い実施した。得られたＮ末端アミノ酸配列を、
配列表配列番号１に示す。
列分析を、自動アミノ酸配列分析装置 (Ａ４７７型、ア
プライドバイオシステムズ社）を用いて、そのプロトコ
ールに従い実施した。得られたＮ末端アミノ酸配列を、
配列表配列番号１に示す。
【００２６】
【発明の効果】以上の結果より、本発明によって新規な
酵素が提供される。本発明酵素は、還元条件下における
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６ｋＤａ、等電点
４．９−５．０、至適ｐＨ７．６であり、高分子のタン
パク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下の
神経ペプチドを特異的に加水分解する活性を有する。本
発明酵素は、その活性より神経ペプチドやペプチドホル
モンの代謝研究用試薬として、或いはアルツハイマー症
などの神経系疾患の治療薬として有用である。
酵素が提供される。本発明酵素は、還元条件下における
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が７６ｋＤａ、等電点
４．９−５．０、至適ｐＨ７．６であり、高分子のタン
パク質に作用せず、アミノ酸６残基以上１７残基以下の
神経ペプチドを特異的に加水分解する活性を有する。本
発明酵素は、その活性より神経ペプチドやペプチドホル
モンの代謝研究用試薬として、或いはアルツハイマー症
などの神経系疾患の治療薬として有用である。
【００２７】
配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Thr Leu Gly Lys Glu Leu Ala Ser Pro Leu Gln Ala Met Ser Ser Try 1 5 10 15
【図１】 本発明酵素の還元条件下におけるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる泳動パターンを示す。
ＡＧＥによる泳動パターンを示す。
分子量マーカー蛋白質 ９７ｋＤ ： ホスホリラーゼ ７８ｋＤ ： トランスフェリン ６８ｋＤ ： ウシ血清アルブミン ５５ｋＤ ： グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ３５ｋＤ ： グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ ２９ｋＤ ： カルボニックアンヒドラーゼ ２２ｋＤ ： 大豆トリプシンインヒビター １２．５ｋＤ ： シトクロムＣ
【図２】 本発明酵素の各緩衝液における至適ｐＨを示
す。
す。
● ： 10mM リン酸緩衝液 ○ ： 10mM Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の特性を有する酵素。 (1)活性１：高分子のタンパク質に作用せず、アミノ酸
６残基以上１７残基以下のペプチドを特異的に加水分解
する。 (2)活性２：キレート剤の存在下で失活する。 (3)分子量：７６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；還元条件
下） (4)ＰＡＳ染色：陰性 (5)等電点：４．９−５．０ (6)至適ｐＨ：７．６ (7)Ｎ末端アミノ酸配列：配列表配列番号１に示す配列
を有する。 - 【請求項２】 ラット肝臓細胞質を硫安分画、イオン交
換クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製することを特徴とする、請求項１記
載の酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8073564A JPH09262085A (ja) | 1996-03-28 | 1996-03-28 | 新規酵素及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8073564A JPH09262085A (ja) | 1996-03-28 | 1996-03-28 | 新規酵素及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09262085A true JPH09262085A (ja) | 1997-10-07 |
Family
ID=13521895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8073564A Pending JPH09262085A (ja) | 1996-03-28 | 1996-03-28 | 新規酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09262085A (ja) |
-
1996
- 1996-03-28 JP JP8073564A patent/JPH09262085A/ja active Pending
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