JPH09274A - ファージ耐性ストレプトコッカス - Google Patents
ファージ耐性ストレプトコッカスInfo
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- JPH09274A JPH09274A JP8154063A JP15406396A JPH09274A JP H09274 A JPH09274 A JP H09274A JP 8154063 A JP8154063 A JP 8154063A JP 15406396 A JP15406396 A JP 15406396A JP H09274 A JPH09274 A JP H09274A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ファージ耐性ストレプトコッカスを提供する
こと。 【解決手段】 ストレプトコッカスに対して毒性である
ファージのＤＮＡフラグメントであって、それを含むス
トレプトコッカスに、少なくとも１種のファージに対す
る耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント、特に
プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、又はプラスミドＣＮ
ＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶ
フラグメントに相同な又はハイブリッド形成するフラグ
メント。少なくとも１種のファージに耐性なストレプト
コッカスの製造方法において、ストレプトコッカスに対
して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであっ
て、ストレプトコッカスに少なくとも１種のファージに
対する耐性を与えることができるＤＮＡフラグメントを
ベクター中にクローン化し、このベクターをストレプト
コッカス中に導入することを特徴とする方法。
こと。 【解決手段】 ストレプトコッカスに対して毒性である
ファージのＤＮＡフラグメントであって、それを含むス
トレプトコッカスに、少なくとも１種のファージに対す
る耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント、特に
プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、又はプラスミドＣＮ
ＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶ
フラグメントに相同な又はハイブリッド形成するフラグ
メント。少なくとも１種のファージに耐性なストレプト
コッカスの製造方法において、ストレプトコッカスに対
して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであっ
て、ストレプトコッカスに少なくとも１種のファージに
対する耐性を与えることができるＤＮＡフラグメントを
ベクター中にクローン化し、このベクターをストレプト
コッカス中に導入することを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、それを含む乳酸菌
をバクテリオファージに対して耐性にする、バクテリオ
ファージＤＮＡフラグメントの使用に関する。
をバクテリオファージに対して耐性にする、バクテリオ
ファージＤＮＡフラグメントの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸菌がファージ攻撃を受け易いこと
は、多量のミルクを処理するヨーグルト産業の重大な問
題である。不衛生のためにヨーグルト製造プロセス中に
バクテリオファージ（又はファージ）が導入される可能
性がある。これらはまた、溶原性ファージ（すなわち、
潜伏した形で細菌のゲノムに組み込まれたファージ）の
溶菌段階にエントリーした後に出現する可能性がある。
これらの攻撃の発生を減ずるために、産業界は一般に、
ある一定のファージに一般的に耐性である乳酸菌の種々
の株の混合物の使用に、又は製造の各段階に順繰りに、
乳酸菌の種々の株を使用することに頼っている。しか
し、これらの系は、乳酸菌の様々な株を使用することを
必要とし、このことが他の使用菌株に比べて有益な菌株
の感覚刺激性(organoleptic)又は構造的(textural)特性
を遮蔽すると言う欠点を有する。それ故、有益な乳酸菌
の株の耐性スペクトルを拡大する手段を有することがで
きるならば、特に有利であると考えられる。
は、多量のミルクを処理するヨーグルト産業の重大な問
題である。不衛生のためにヨーグルト製造プロセス中に
バクテリオファージ（又はファージ）が導入される可能
性がある。これらはまた、溶原性ファージ（すなわち、
潜伏した形で細菌のゲノムに組み込まれたファージ）の
溶菌段階にエントリーした後に出現する可能性がある。
これらの攻撃の発生を減ずるために、産業界は一般に、
ある一定のファージに一般的に耐性である乳酸菌の種々
の株の混合物の使用に、又は製造の各段階に順繰りに、
乳酸菌の種々の株を使用することに頼っている。しか
し、これらの系は、乳酸菌の様々な株を使用することを
必要とし、このことが他の使用菌株に比べて有益な菌株
の感覚刺激性(organoleptic)又は構造的(textural)特性
を遮蔽すると言う欠点を有する。それ故、有益な乳酸菌
の株の耐性スペクトルを拡大する手段を有することがで
きるならば、特に有利であると考えられる。
【０００３】ファージに対する乳酸菌の自然耐性は一般
に細菌に由来し、ファージ粒子の制限／修飾、ファージ
粒子の吸着の妨害及び／又はファージ溶菌段階の不発(a
bortion)の機構に関係する。これらの耐性はより一般的
に細菌プラスミドによってコードされる。したがって、
Ｌａｒｂｉ等はファージに対する耐性の少なくとも３種
類の細菌機構を有するストレプトコッカス サリバリウ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕ
ｓ）亜種サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
の２菌株を開示する（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．，５
９，３４９〜３５７，１９９２）。
に細菌に由来し、ファージ粒子の制限／修飾、ファージ
粒子の吸着の妨害及び／又はファージ溶菌段階の不発(a
bortion)の機構に関係する。これらの耐性はより一般的
に細菌プラスミドによってコードされる。したがって、
Ｌａｒｂｉ等はファージに対する耐性の少なくとも３種
類の細菌機構を有するストレプトコッカス サリバリウ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕ
ｓ）亜種サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
の２菌株を開示する（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．，５
９，３４９〜３５７，１９９２）。
【０００４】ファージに対する耐性のこれらの細菌機構
を利用して、ファージに対する乳酸菌の耐性のスペクト
ルをさらに拡大することができる。かくして、Ｓｉｎｇ
Ｗ．Ｄ．等はファージに対する耐性の細菌機構をコー
ドする異なるプラスミドをそれぞれ含むラクトコッカス
ラクチス亜種ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａ
ｃｔｉｓ）のクローンの産生を記載している（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５９，３６５〜３７２，１９９
３）。
を利用して、ファージに対する乳酸菌の耐性のスペクト
ルをさらに拡大することができる。かくして、Ｓｉｎｇ
Ｗ．Ｄ．等はファージに対する耐性の細菌機構をコー
ドする異なるプラスミドをそれぞれ含むラクトコッカス
ラクチス亜種ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａ
ｃｔｉｓ）のクローンの産生を記載している（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５９，３６５〜３７２，１９９
３）。
【０００５】最後に、ファージに対する乳酸菌の耐性機
構の他の可能性のある起源がＨｉｌｌ Ｃ．等によって
最近、提示されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，６４１９〜６４２６，１
９９０）。ラクトコッカスラクチスに対して毒性である
ファージのＤＮＡフラグメントは、それらを含むラクト
コッカス ラクチスにファージ耐性を実際与えることが
できる。関係する耐性機構はまだ明らかではない。しか
し、ファージの発達に重要な調節シグナルの過剰発生又
は滴定(titration)にこれらのフラグメントが関係して
いると考えることは合理的である。
構の他の可能性のある起源がＨｉｌｌ Ｃ．等によって
最近、提示されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，６４１９〜６４２６，１
９９０）。ラクトコッカスラクチスに対して毒性である
ファージのＤＮＡフラグメントは、それらを含むラクト
コッカス ラクチスにファージ耐性を実際与えることが
できる。関係する耐性機構はまだ明らかではない。しか
し、ファージの発達に重要な調節シグナルの過剰発生又
は滴定(titration)にこれらのフラグメントが関係して
いると考えることは合理的である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、スト
レプトコッカスにファージ耐性を与えることができる、
ファージの新規なＤＮＡフラグメントを提供することで
ある。
レプトコッカスにファージ耐性を与えることができる、
ファージの新規なＤＮＡフラグメントを提供することで
ある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明は、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージ
のＤＮＡフラグメントであって、それを含むストレプト
コッカスに、少なくとも１種のファージに対する耐性を
与えることができるＤＮＡフラグメント、特に、プラス
ミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６キロベー
ス（ｋｂ）ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメント又はプ
ラスミドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ
ＥｃｏＲＶ ＤＮＡフラグメントと相同であるか又は
ハイブリッド形成するフラグメントに関する。本発明は
また、少なくとも１種のファージに対して耐性なストレ
プトコッカスの製造方法であって、ストレプトコッカス
に対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであ
るが、少なくとも１種のファージに対する耐性をストレ
プトコッカスに与えることができるＤＮＡフラグメント
をベクター中にクローン化し、組換え体ベクターをスト
レプトコッカスに導入する方法にも関する。
明は、ストレプトコッカスに対して毒性であるファージ
のＤＮＡフラグメントであって、それを含むストレプト
コッカスに、少なくとも１種のファージに対する耐性を
与えることができるＤＮＡフラグメント、特に、プラス
ミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６キロベー
ス（ｋｂ）ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメント又はプ
ラスミドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ
ＥｃｏＲＶ ＤＮＡフラグメントと相同であるか又は
ハイブリッド形成するフラグメントに関する。本発明は
また、少なくとも１種のファージに対して耐性なストレ
プトコッカスの製造方法であって、ストレプトコッカス
に対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであ
るが、少なくとも１種のファージに対する耐性をストレ
プトコッカスに与えることができるＤＮＡフラグメント
をベクター中にクローン化し、組換え体ベクターをスト
レプトコッカスに導入する方法にも関する。
【０００８】本発明はまた、ストレプトコッカスに対し
て毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであるが、
ストレプトコッカスに少なくとも１種のファージに対す
る耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント、特に
プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメント又はプラスミ
ドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＶ ＤＮＡフラグメントに相同であるか又はこれと
ハイブリッド形成するフラグメントを、それらのゲノム
中に又は反復可能なプラスミドを用いて、組込んで含む
ストレプトコッカス属の微生物にも関する。
て毒性であるファージのＤＮＡフラグメントであるが、
ストレプトコッカスに少なくとも１種のファージに対す
る耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント、特に
プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメント又はプラスミ
ドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＶ ＤＮＡフラグメントに相同であるか又はこれと
ハイブリッド形成するフラグメントを、それらのゲノム
中に又は反復可能なプラスミドを用いて、組込んで含む
ストレプトコッカス属の微生物にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明によるＤＮＡフラグメント
を含む組換え複製又は組込みベクターも本発明の対象で
ある。本発明によるＤＮＡフラグメントによって形質転
換されたストレプトコッカスは、前記ＤＮＡフラグメン
トが単離されるファージに対してだけでなく、これらの
ファージと相同(homologous)であるファージに対して
も、またこれらのファージとは異種(heterologous)であ
るある種のファージに対してさえも耐性であると言う驚
くべき性質を有する。
を含む組換え複製又は組込みベクターも本発明の対象で
ある。本発明によるＤＮＡフラグメントによって形質転
換されたストレプトコッカスは、前記ＤＮＡフラグメン
トが単離されるファージに対してだけでなく、これらの
ファージと相同(homologous)であるファージに対して
も、またこれらのファージとは異種(heterologous)であ
るある種のファージに対してさえも耐性であると言う驚
くべき性質を有する。
【００１０】それ故、本発明によるＤＮＡフラグメント
は、ストレプトコッカスのファージ耐性スペクトルをか
なり拡大することを可能にする。このために、ストレプ
トコッカスを、様々な耐性機構を有すると考えられる、
本発明による１種以上のフラグメントを含むベクターに
よって形質転換することができる。さらに１種以上の細
菌耐性機構を有する、本発明によるベクターによってス
トレプトコッカスを形質転換することもできる。
は、ストレプトコッカスのファージ耐性スペクトルをか
なり拡大することを可能にする。このために、ストレプ
トコッカスを、様々な耐性機構を有すると考えられる、
本発明による１種以上のフラグメントを含むベクターに
よって形質転換することができる。さらに１種以上の細
菌耐性機構を有する、本発明によるベクターによってス
トレプトコッカスを形質転換することもできる。
【００１１】意外にも、本発明によるフラグメントによ
って与えられる耐性スペクトルは、前記フラグメントを
含むストレプトコッカスの菌株に依存して種々であり得
る。最後に、異なる耐性スペクトルをそれぞれ有する、
有益なストレプトコッカス菌株のクローンの開発を考え
ることもできる。したがって、これらのストレプトコッ
カスクローンを、例えば、ヨーグルト又はチーズを製造
するためのミルクの工業的発酵中に順繰りに用いること
が有利であると考えられる。
って与えられる耐性スペクトルは、前記フラグメントを
含むストレプトコッカスの菌株に依存して種々であり得
る。最後に、異なる耐性スペクトルをそれぞれ有する、
有益なストレプトコッカス菌株のクローンの開発を考え
ることもできる。したがって、これらのストレプトコッ
カスクローンを、例えば、ヨーグルト又はチーズを製造
するためのミルクの工業的発酵中に順繰りに用いること
が有利であると考えられる。
【００１２】以下の説明において、“相同ファージ”と
は、細菌の同じ菌株を攻撃し、同様な溶菌挙動を有する
ファージ群の一部であるファージを意味すると理解され
る。これに反して、上記で定義した２条件を満たさない
ファージは異種ファージである。
は、細菌の同じ菌株を攻撃し、同様な溶菌挙動を有する
ファージ群の一部であるファージを意味すると理解され
る。これに反して、上記で定義した２条件を満たさない
ファージは異種ファージである。
【００１３】本発明の目的のために、“相同配列”と
は、少数の塩基の置換、欠失又は付加においてのみ本発
明による配列から異なる配列を意味すると理解される。
このような関係において、遺伝暗号の縮重のために、同
じポリペプチドをコードする２種類のＤＮＡ配列は、特
に相同であると見なされる。本発明による配列と８０％
より大きい相同を示す配列も相同配列と見なされる。後
者の場合には、本発明による配列の塩基と同じである相
同配列の塩基の数対本発明による前記配列の塩基の総数
の比によって、相同が評価される。
は、少数の塩基の置換、欠失又は付加においてのみ本発
明による配列から異なる配列を意味すると理解される。
このような関係において、遺伝暗号の縮重のために、同
じポリペプチドをコードする２種類のＤＮＡ配列は、特
に相同であると見なされる。本発明による配列と８０％
より大きい相同を示す配列も相同配列と見なされる。後
者の場合には、本発明による配列の塩基と同じである相
同配列の塩基の数対本発明による前記配列の塩基の総数
の比によって、相同が評価される。
【００１４】本発明の目的のために、“ハイブリッド形
成するフラグメント”とは、サザンブロット法（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ等，「分子クローニング，実験室マニュア
ル」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，アメリカ合衆国，１９８
９，９．３１〜９．５８章）によって、本発明によるフ
ラグメントとハイブリッド形成することができるフラグ
メントを意味すると理解される。非特異的又は不安定な
ハイブリッド形成を回避するために、緊縮条件下でハイ
ブリッド形成を実施することが好ましい。
成するフラグメント”とは、サザンブロット法（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ等，「分子クローニング，実験室マニュア
ル」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，アメリカ合衆国，１９８
９，９．３１〜９．５８章）によって、本発明によるフ
ラグメントとハイブリッド形成することができるフラグ
メントを意味すると理解される。非特異的又は不安定な
ハイブリッド形成を回避するために、緊縮条件下でハイ
ブリッド形成を実施することが好ましい。
【００１５】最後に、“フラグメント”又は“ＤＮＡフ
ラグメント”とは、例えば、既知方法“ポリメラーゼ連
鎖反応”によってインビトロで合成、再現されることが
できる、又はインビボで、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）若しくはラクトコッカス ラ
クチス型の細菌において再現されることができる、ファ
ージ起源の二本鎖ＤＮＡフラグメントと理解すべきであ
る。
ラグメント”とは、例えば、既知方法“ポリメラーゼ連
鎖反応”によってインビトロで合成、再現されることが
できる、又はインビボで、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）若しくはラクトコッカス ラ
クチス型の細菌において再現されることができる、ファ
ージ起源の二本鎖ＤＮＡフラグメントと理解すべきであ
る。
【００１６】本発明によるＤＮＡフラグメントの選別プ
ロセスを実施するために、ファージのゲノムの一部又は
全てをカバーするファージＤＮＡフラグメントを含む、
ストレプトコッカスライブラリーを作製することができ
る。このために、ファージＤＮＡを制限酵素によって消
化させ、消化物(digest)をベクター中にクローン化し、
次に、このベクターを例えばストレプトコッカスに導入
する。
ロセスを実施するために、ファージのゲノムの一部又は
全てをカバーするファージＤＮＡフラグメントを含む、
ストレプトコッカスライブラリーを作製することができ
る。このために、ファージＤＮＡを制限酵素によって消
化させ、消化物(digest)をベクター中にクローン化し、
次に、このベクターを例えばストレプトコッカスに導入
する。
【００１７】次に、形質転換されたストレプトコッカス
ライブラリーを、例えば第２ファージ耐性ストレプトコ
ッカスライブラリーを分離するために、ストレプトコッ
カスに対して毒性であるファージを含む培地において培
養する。次に、固形培地上に第２ライブラリーの希釈物
をプレーティングし、次いで、例えば、非形質転換スト
レプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大きい
耐性を有するクローンを単離クローンから選別すること
によって、ファージ耐性クローンを従来法に従って単離
することができる。
ライブラリーを、例えば第２ファージ耐性ストレプトコ
ッカスライブラリーを分離するために、ストレプトコッ
カスに対して毒性であるファージを含む培地において培
養する。次に、固形培地上に第２ライブラリーの希釈物
をプレーティングし、次いで、例えば、非形質転換スト
レプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大きい
耐性を有するクローンを単離クローンから選別すること
によって、ファージ耐性クローンを従来法に従って単離
することができる。
【００１８】上記方法の代替手段として、あらかじめフ
ァージＤＮＡ消化物を電気泳動にかけ、次に問題のフラ
グメントを含むゲルバンドを溶離することによって、各
ファージＤＮＡフラグメントを単離することもできる。
次に、各単離フラグメントをベクター中にクローン化
し、各ベクターをストレプトコッカスに導入して、例え
ば、非形質転換ストレプトコッカスの耐性よりも少なく
とも１００倍大きい耐性を有するストレプトコッカスを
選別することも可能である。
ァージＤＮＡ消化物を電気泳動にかけ、次に問題のフラ
グメントを含むゲルバンドを溶離することによって、各
ファージＤＮＡフラグメントを単離することもできる。
次に、各単離フラグメントをベクター中にクローン化
し、各ベクターをストレプトコッカスに導入して、例え
ば、非形質転換ストレプトコッカスの耐性よりも少なく
とも１００倍大きい耐性を有するストレプトコッカスを
選別することも可能である。
【００１９】耐性ストレプトコッカスから、非形質転換
ストレプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大
きい耐性を有するストレプトコッカスを（ファージＤＮ
Ａフラグメントによって）選別するために、毒性ファー
ジの懸濁液の希釈物を、固形培地中のストレプトコッカ
ス（形質転換されたもの又はそうでないもの）の集密的
培養物(confluent culture) 上にプレーティングし、プ
ラーク数を計数し（各プラークは１ファージによる感染
から生ずる）、所定の希釈物に関して、非形質転換スト
レプトコッカスの培養物上に出現するプラーク数対形質
転換されたストレプトコッカスの培養物上に出現するプ
ラーク数の比を算出する。このようにして、少なくとも
１００の比、好ましくは１０3〜１０12の比を有する形
質転換されたストレプトコッカスを選別することができ
る。
ストレプトコッカスの耐性よりも少なくとも１００倍大
きい耐性を有するストレプトコッカスを（ファージＤＮ
Ａフラグメントによって）選別するために、毒性ファー
ジの懸濁液の希釈物を、固形培地中のストレプトコッカ
ス（形質転換されたもの又はそうでないもの）の集密的
培養物(confluent culture) 上にプレーティングし、プ
ラーク数を計数し（各プラークは１ファージによる感染
から生ずる）、所定の希釈物に関して、非形質転換スト
レプトコッカスの培養物上に出現するプラーク数対形質
転換されたストレプトコッカスの培養物上に出現するプ
ラーク数の比を算出する。このようにして、少なくとも
１００の比、好ましくは１０3〜１０12の比を有する形
質転換されたストレプトコッカスを選別することができ
る。
【００２０】したがって、Ｓ．サーモフィルス（Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈ
ｅｒｃｈｅ Ｎｅｓｔｌｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ）に対し
て特に毒性であるファージφＳｆｉ２１から、３．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを単離するこ
とが可能であった。このフラグメントはプラスミドｐＭ
Ｚ２３中に存在し、このプラスミドはこれを含む菌株
Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１として、Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ
ｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．
Ｍ．）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２８ ｒ
ｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ
ｃｅｄｅｘ １５、フランスに１９９５年６月７日に
寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８を与えられ
た。この３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメ
ントは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サ
ーモフィルスに、ＤＮＡフラグメントを選別したファー
ジと相同であるファージに対するのみでなく、異種であ
るファージに対しても耐性を与えることができる。
ｌｅｃｔｉｏｎ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈ
ｅｒｃｈｅ Ｎｅｓｔｌｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ）に対し
て特に毒性であるファージφＳｆｉ２１から、３．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを単離するこ
とが可能であった。このフラグメントはプラスミドｐＭ
Ｚ２３中に存在し、このプラスミドはこれを含む菌株
Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１として、Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄ
ｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．
Ｍ．）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、２８ ｒ
ｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ
ｃｅｄｅｘ １５、フランスに１９９５年６月７日に
寄託され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８を与えられ
た。この３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡフラグメ
ントは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サ
ーモフィルスに、ＤＮＡフラグメントを選別したファー
ジと相同であるファージに対するのみでなく、異種であ
るファージに対しても耐性を与えることができる。
【００２１】Ｓ．サーモフィルス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ
Ｎｅｓｔｌｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ）に対して毒性である
ファージφＳｆｉ２から、６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶ Ｄ
ＮＡフラグメントを単離することも可能であった。この
フラグメントはプラスミドｐＭＺ３１中に存在し、この
プラスミドはこれを含む菌株Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ
１として、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａ
ｓｔｅｕｒ、２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７
５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５、フランスに
１９９５年６月７日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ
−１５８９を与えられた。このフラグメントは、これを
含むストレプトコッカスに、特にＳ．サーモフィルス
に、少なくとも１種のファージに対する耐性を与えるこ
とができる。
ｎ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ
Ｎｅｓｔｌｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ）に対して毒性である
ファージφＳｆｉ２から、６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶ Ｄ
ＮＡフラグメントを単離することも可能であった。この
フラグメントはプラスミドｐＭＺ３１中に存在し、この
プラスミドはこれを含む菌株Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ
１として、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａ
ｓｔｅｕｒ、２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ、７
５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５、フランスに
１９９５年６月７日に寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ
−１５８９を与えられた。このフラグメントは、これを
含むストレプトコッカスに、特にＳ．サーモフィルス
に、少なくとも１種のファージに対する耐性を与えるこ
とができる。
【００２２】特に、上記ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ
フラグメント中に保存される０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを単離することができた。以下の配列表に記
載する配列番号１の配列を有するこのフラグメントは、
ファージφＳｆｉ２１に相同であるファージ中に比較的
良好に保存されると言う特徴を有する。このフラグメン
トは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サー
モフィルスに、少なくとも１種のファージに対する耐性
を与えることを可能にする。
フラグメント中に保存される０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフ
ラグメントを単離することができた。以下の配列表に記
載する配列番号１の配列を有するこのフラグメントは、
ファージφＳｆｉ２１に相同であるファージ中に比較的
良好に保存されると言う特徴を有する。このフラグメン
トは、これを含むストレプトコッカスに、特にＳ．サー
モフィルスに、少なくとも１種のファージに対する耐性
を与えることを可能にする。
【００２３】６．５ｋｂ、３．６ｋｂ及び０．８ｋｂ
ＤＮＡフラグメントによって与えられる利益と、ストレ
プトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラ
グメントがそれを含むストレプトコッカスに耐性を与え
ることが初めてできたと言う事実とを考慮して、本発明
は少なくとも１種のファージに対する耐性をストレプト
コッカスに与えることができる、ストレプトコッカスに
対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントに関す
る。
ＤＮＡフラグメントによって与えられる利益と、ストレ
プトコッカスに対して毒性であるファージのＤＮＡフラ
グメントがそれを含むストレプトコッカスに耐性を与え
ることが初めてできたと言う事実とを考慮して、本発明
は少なくとも１種のファージに対する耐性をストレプト
コッカスに与えることができる、ストレプトコッカスに
対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントに関す
る。
【００２４】特に、本発明は、第一に３．６ｋｂ Ｈｉ
ｎｄＩＩＩフラグメント、６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶフラ
グメント及び／又は０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメン
トに相同であるか又はこれとハイブリッド形成すること
ができ、第二に少なくとも１種のファージに対する耐性
をストレプトコッカスに与えることができる、任意のＤ
ＮＡフラグメントに関する。特異的にハイブリッド形成
する小フラグメントは一般に長さが１５〜２５塩基対
（ｂｐ）であるので、長さが少なくとも２０ｂｐであ
り、この下限が任意に設定されるフラグメントを選択す
ることが好ましい。
ｎｄＩＩＩフラグメント、６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶフラ
グメント及び／又は０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメン
トに相同であるか又はこれとハイブリッド形成すること
ができ、第二に少なくとも１種のファージに対する耐性
をストレプトコッカスに与えることができる、任意のＤ
ＮＡフラグメントに関する。特異的にハイブリッド形成
する小フラグメントは一般に長さが１５〜２５塩基対
（ｂｐ）であるので、長さが少なくとも２０ｂｐであ
り、この下限が任意に設定されるフラグメントを選択す
ることが好ましい。
【００２５】少なくとも１種のファージに対して耐性で
あるストレプトコッカスの製造方法を実施するために、
プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋ
ｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント又はプラスミドＣＮＣＭ
Ｉ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶフラ
グメントと相同であるか又はハイブリッド形成するフラ
グメントをベクター中にクローン化することが好まし
い。０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを用いること
が好ましい。
あるストレプトコッカスの製造方法を実施するために、
プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋ
ｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント又はプラスミドＣＮＣＭ
Ｉ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶフラ
グメントと相同であるか又はハイブリッド形成するフラ
グメントをベクター中にクローン化することが好まし
い。０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを用いること
が好ましい。
【００２６】ベクターは、例えば大腸菌又はラクトコッ
カス ラクチスのような、他の微生物の複製系又は表現
系を含むことができる、複製可能な表現プラスミドであ
り得る。これはまた、組込みベクター(integrative vec
tor)でもよい。ファージの配列の上流に、この配列の発
現のために重要な配列（例えば、ストレプトコッカスプ
ロモーター）を配置することが有用ではないことにも注
目すべきである。
カス ラクチスのような、他の微生物の複製系又は表現
系を含むことができる、複製可能な表現プラスミドであ
り得る。これはまた、組込みベクター(integrative vec
tor)でもよい。ファージの配列の上流に、この配列の発
現のために重要な配列（例えば、ストレプトコッカスプ
ロモーター）を配置することが有用ではないことにも注
目すべきである。
【００２７】本発明による発現又は選択プロセスでは、
ストレプトコッカス属の細菌、特にＳ．サーモフィルス
中に、例えば、接合(conjugation)、トランスフェクシ
ョン又は形質転換によって導入することができる。この
場合に、このように形質転換された微生物が形質転換さ
れたベクターの幾つかのコピーを含むことが好ましい。
ストレプトコッカス属の細菌、特にＳ．サーモフィルス
中に、例えば、接合(conjugation)、トランスフェクシ
ョン又は形質転換によって導入することができる。この
場合に、このように形質転換された微生物が形質転換さ
れたベクターの幾つかのコピーを含むことが好ましい。
【００２８】本発明によるＤＮＡフラグメント、組換え
プラスミド及び形質転換細菌を得る実施例に関する、以
下に記載の追加の説明によって、本発明をさらに詳述す
る。しかし、これらの実施例が本発明の対象を説明する
ために記載するものであり、いかなる意味でも、それら
への限定を意味するものではないことは、言うまでもな
い。
プラスミド及び形質転換細菌を得る実施例に関する、以
下に記載の追加の説明によって、本発明をさらに詳述す
る。しかし、これらの実施例が本発明の対象を説明する
ために記載するものであり、いかなる意味でも、それら
への限定を意味するものではないことは、言うまでもな
い。
【００２９】ＤＮＡの取扱い、細菌細胞のクローニング
及び形質転換は、他に記載しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ等による上記テキストに記載された操作によって実施
される。％は、他に記載しない限り、重量によるもので
ある。
及び形質転換は、他に記載しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ等による上記テキストに記載された操作によって実施
される。％は、他に記載しない限り、重量によるもので
ある。
【００３０】培地：（固形培地として１．５％Ｂａｃｔ
ｏａｇａｒを添加） −Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，米国）：０．５％トリプトン(t
ryptone)、０．５％ソイトーン(soytone)、０．５％食
肉加水分解物、０．２５％酵母抽出物、０．０５％アス
コルビン酸、０．０２５％硫酸マグネシウム、１．９％
β−グリセロリン酸二ナトリウム及び水。 −ＬＭ１７：０．５％ラクトースを含むＭ１７培地。 −ＬＭ１７／ＣａＣｌ2：０．０５％ＣａＣｌ2を含むＬ
Ｍ１７培地。 −ＭＳＫ：０．１％酵母抽出物を含む脱脂乳（１０％で
再構成する粉末） −ＭＲＳ：１％ペプトン、１％加水分解された食肉，
０．５％酵母抽出物，０．５％酢酸ナトリウム、０．０
１％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸二カリウム、
０．２％クエン酸アンモニウム、０．００５％硫酸マン
ガン、２％デキストロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及
び水。 −ＨＪ：３％トリプトン、０．２％牛肉抽出物、１％酵
母抽出物、０．４％ＫＨ 2ＰＯ4
ｏａｇａｒを添加） −Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，米国）：０．５％トリプトン(t
ryptone)、０．５％ソイトーン(soytone)、０．５％食
肉加水分解物、０．２５％酵母抽出物、０．０５％アス
コルビン酸、０．０２５％硫酸マグネシウム、１．９％
β−グリセロリン酸二ナトリウム及び水。 −ＬＭ１７：０．５％ラクトースを含むＭ１７培地。 −ＬＭ１７／ＣａＣｌ2：０．０５％ＣａＣｌ2を含むＬ
Ｍ１７培地。 −ＭＳＫ：０．１％酵母抽出物を含む脱脂乳（１０％で
再構成する粉末） −ＭＲＳ：１％ペプトン、１％加水分解された食肉，
０．５％酵母抽出物，０．５％酢酸ナトリウム、０．０
１％硫酸マグネシウム、０．２％リン酸二カリウム、
０．２％クエン酸アンモニウム、０．００５％硫酸マン
ガン、２％デキストロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０及
び水。 −ＨＪ：３％トリプトン、０．２％牛肉抽出物、１％酵
母抽出物、０．４％ＫＨ 2ＰＯ4
【００３１】細菌菌株 −１９９４年５月１８日にＣＮＣＭに寄託され、寄託番
号ＣＮＣＭＩ−１４２４を与えられたＳ．サーモフィル
スＳｆｉ２１。この菌株はファージφＳｆｉ２１に敏感
であり、ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ
１９、φＳｆｉ２、φＳｆｉ９及びφＳｆｉｌ８に対し
て本来耐性である。 −φＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＳｆｉ
２及びφＳｆｉ１８に敏感であり、ファージφＳｆｉ９
に本来耐性であるＳ．サーモフィルスＳｆｉ１。プラス
ミドｐＭＺ３１又はｐＭＺ２４を含む、この菌株の２種
のクローンは、上記寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８及び
ＣＮＣＭＩ−１５８９でＣＮＣＭに寄託された。
号ＣＮＣＭＩ−１４２４を与えられたＳ．サーモフィル
スＳｆｉ２１。この菌株はファージφＳｆｉ２１に敏感
であり、ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ
１９、φＳｆｉ２、φＳｆｉ９及びφＳｆｉｌ８に対し
て本来耐性である。 −φＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ１９、φＳｆｉ
２及びφＳｆｉ１８に敏感であり、ファージφＳｆｉ９
に本来耐性であるＳ．サーモフィルスＳｆｉ１。プラス
ミドｐＭＺ３１又はｐＭＺ２４を含む、この菌株の２種
のクローンは、上記寄託番号ＣＮＣＭＩ−１５８８及び
ＣＮＣＭＩ−１５８９でＣＮＣＭに寄託された。
【００３２】−１９９４年５月１８日にＣＮＣＭに寄託
され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１４２１を与えられたＳ．
サーモフィルスＳｆｉ９。この菌株はファージφＳｆｉ
９に敏感であり、ファージφＢａｓ１１、φＢａｓ１
９、φＢａｓ３、φＳｆｉ２、φＳｆｉ１８及びφＳｆ
ｉ２１に対して本来耐性である。これらの３種類のグラ
ム陽性菌株は顕微鏡下で非鞭毛性鎖形成球菌の外観を有
する。これらの菌株は非胞子形成性であり、通性嫌気性
生物である。
され、寄託番号ＣＮＣＭＩ−１４２１を与えられたＳ．
サーモフィルスＳｆｉ９。この菌株はファージφＳｆｉ
９に敏感であり、ファージφＢａｓ１１、φＢａｓ１
９、φＢａｓ３、φＳｆｉ２、φＳｆｉ１８及びφＳｆ
ｉ２１に対して本来耐性である。これらの３種類のグラ
ム陽性菌株は顕微鏡下で非鞭毛性鎖形成球菌の外観を有
する。これらの菌株は非胞子形成性であり、通性嫌気性
生物である。
【００３３】
【実施例】例１：ファージφＳｆｉ２１からのＤＮＡフラグメント
のクローニング Ｉ．１．ファージφＳｆｉ２１からのＤＮＡフラグメン
トの作製 ：液体培地ＬＭ１７／ＣａＣｌ2 ２００ｍｌ
に、Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ２１の定常期培養物１
％と、約１０8粒子／ｍｌを含むファージ懸濁液（Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｅｓｔｌｅ）５００μｌとを接種
する。この培地を４２℃において、溶菌が終了するまで
（約２時間）インキュベートし、培地をＳｏｒｖａｌＳ
Ｓ−３４ローターにおいて８０００ｒｐｍ及び４℃にお
いて３０分間遠心分離し、上澄み液を回収し、これを同
じローターにおいて１２，０００ｒｐｍ、４℃において
６時間再び遠心分離し、次に、ファージ粒子のペレット
を緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、１０ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む）０．５ｍｌ
中に再懸濁させる。次に、ファージ粒子のこの懸濁液を
−２０℃において保存する（この方法は他のファージの
懸濁液の製造にも適用可能である）。
のクローニング Ｉ．１．ファージφＳｆｉ２１からのＤＮＡフラグメン
トの作製 ：液体培地ＬＭ１７／ＣａＣｌ2 ２００ｍｌ
に、Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ２１の定常期培養物１
％と、約１０8粒子／ｍｌを含むファージ懸濁液（Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｅｓｔｌｅ）５００μｌとを接種
する。この培地を４２℃において、溶菌が終了するまで
（約２時間）インキュベートし、培地をＳｏｒｖａｌＳ
Ｓ−３４ローターにおいて８０００ｒｐｍ及び４℃にお
いて３０分間遠心分離し、上澄み液を回収し、これを同
じローターにおいて１２，０００ｒｐｍ、４℃において
６時間再び遠心分離し、次に、ファージ粒子のペレット
を緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、１０ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む）０．５ｍｌ
中に再懸濁させる。次に、ファージ粒子のこの懸濁液を
−２０℃において保存する（この方法は他のファージの
懸濁液の製造にも適用可能である）。
【００３４】ファージ懸濁液をデオキシリボヌクレアー
ゼ ５μｇ／ｍｌとリボヌクレアーゼ １μｇ／ｍｌと
によって３７℃において３０分間処理し、５０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡと０．８％ＳＤＳとを加えて、混合物を３７℃に
おいて５分間インキュベートし、次に、プロテイナーゼ
Ｋ １００μｇ／ｍｌを加え、混合物を５６℃において
１時間インキュベートする。ＴＥ（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ７．５と１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェ
ノール溶液の１倍量によって、続いてクロロホルムの１
倍量によって、タンパク質を抽出する。次に、水相中に
存在するファージＤＮＡをエタノール（０．３Ｍ 酢酸
ナトリウムを含む、ｐＨ５．２）の２倍量中で−７０℃
において少なくとも３０分間沈殿させる。混合物を１
３，０００ｒｐｍで遠心分離し、ファージＤＮＡのペレ
ットを水０．４ｍｌ中に再懸濁させる。
ゼ ５μｇ／ｍｌとリボヌクレアーゼ １μｇ／ｍｌと
によって３７℃において３０分間処理し、５０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡと０．８％ＳＤＳとを加えて、混合物を３７℃に
おいて５分間インキュベートし、次に、プロテイナーゼ
Ｋ １００μｇ／ｍｌを加え、混合物を５６℃において
１時間インキュベートする。ＴＥ（１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ７．５と１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェ
ノール溶液の１倍量によって、続いてクロロホルムの１
倍量によって、タンパク質を抽出する。次に、水相中に
存在するファージＤＮＡをエタノール（０．３Ｍ 酢酸
ナトリウムを含む、ｐＨ５．２）の２倍量中で−７０℃
において少なくとも３０分間沈殿させる。混合物を１
３，０００ｒｐｍで遠心分離し、ファージＤＮＡのペレ
ットを水０．４ｍｌ中に再懸濁させる。
【００３５】ファージＤＮＡの溶液の一部を次に緩衝液
（２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ及びＢＳ
Ａ０．１ｍｇ／ｍｌを含む）中で制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイ
ツ）によって従来通り消化させる。次に、上記条件下で
タンパク質をフェノールで抽出し、ＤＮＡを沈殿させ、
ファージＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含む溶液を得るよう
に、ＴＥ溶液中に再懸濁させる。
（２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＤＴＴ及びＢＳ
Ａ０．１ｍｇ／ｍｌを含む）中で制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイ
ツ）によって従来通り消化させる。次に、上記条件下で
タンパク質をフェノールで抽出し、ＤＮＡを沈殿させ、
ファージＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含む溶液を得るよう
に、ＴＥ溶液中に再懸濁させる。
【００３６】Ｉ．２．ファージφＳｆｉ２１のゲノムの
大部分をカバーするＤＮＡフラグメントを含むストレプ
トコッカスライブラリーの作製： 上記条件下で、ベク
ターｐＮＺ１２４（Ｍ．Ｄｅ ＶＯＳ、Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎ
ｉｎｇｅｎ，オランダ）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによ
って従来法に従って消化させる。この反応の終了時に、
タンパク質をフェノールで抽出し、ＤＮＡを沈殿させ、
プラスミドＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含む溶液を得るよ
うに、ＴＥ溶液中に再懸濁させる。
大部分をカバーするＤＮＡフラグメントを含むストレプ
トコッカスライブラリーの作製： 上記条件下で、ベク
ターｐＮＺ１２４（Ｍ．Ｄｅ ＶＯＳ、Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｇｅｎ
ｉｎｇｅｎ，オランダ）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによ
って従来法に従って消化させる。この反応の終了時に、
タンパク質をフェノールで抽出し、ＤＮＡを沈殿させ、
プラスミドＤＮＡ１００ｎｇ／μｌを含む溶液を得るよ
うに、ＴＥ溶液中に再懸濁させる。
【００３７】ベクターｐＮＺ１２４（１００ｎｇ）の溶
液の若干量と、ＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）の溶
液の別の若干量と、水 １７μｌまでとを混合する。混
合物を５６℃において２〜５分間加熱し、次に、通常の
連結反応用緩衝液２μｌとＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）の溶液
１μｌとを加える。この反応の終了時に、タンパク質を
フェノールによって抽出し、ＤＮＡを従来法に従って沈
殿させる。
液の若干量と、ＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）の溶
液の別の若干量と、水 １７μｌまでとを混合する。混
合物を５６℃において２〜５分間加熱し、次に、通常の
連結反応用緩衝液２μｌとＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）の溶液
１μｌとを加える。この反応の終了時に、タンパク質を
フェノールによって抽出し、ＤＮＡを従来法に従って沈
殿させる。
【００３８】図１と図２に挙げたファージの全てに感受
性であるＳ．サーモフィルスＳｆｉ１菌株のコンピテン
ト細胞をＭａｒｃｉｓｅｔ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
４３，４９０〜４９６，１９９４）によって作製する。
性であるＳ．サーモフィルスＳｆｉ１菌株のコンピテン
ト細胞をＭａｒｃｉｓｅｔ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
４３，４９０〜４９６，１９９４）によって作製する。
【００３９】コンピテント細胞を形質転換されたベクタ
ーによるエレクトロポレーションによって形質転換する
（Ｍａｒｃｉｓｅｔ等）。このために、解凍したコンピ
テント細胞の懸濁液２００μｌを組換えベクターの沈殿
ペレットと混合し、混合物をエレクトロポレーション装
置（Ｇｅｎ Ｐｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ）のキュベッ
トに入れ、このキュベットを２０００Ｖ，２５μＦ及び
４００Ωにさらし、液体培地ＨＪ（さらに、０．５％ラ
クトースを含む）１ｍｌを加え、混合物を４２℃におい
て４時間インキュベートする。培養物を固形ＬＭ１７培
地（さらに、クロラムフェニコール ４μｇ／ｍｌを含
む）上に置く。生き残る細菌がファージφＳｆｉ２１の
全ゲノムをカバーするＤＮＡフラグメントを含むストレ
プトコッカスライブラリーを構成する。しかし、１個以
上のファージフラグメントを組込まずに再循環されるベ
クターｐＮＺ１２４を含むストレプトコッカスも存在す
ることに注目すべきである。
ーによるエレクトロポレーションによって形質転換する
（Ｍａｒｃｉｓｅｔ等）。このために、解凍したコンピ
テント細胞の懸濁液２００μｌを組換えベクターの沈殿
ペレットと混合し、混合物をエレクトロポレーション装
置（Ｇｅｎ Ｐｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ）のキュベッ
トに入れ、このキュベットを２０００Ｖ，２５μＦ及び
４００Ωにさらし、液体培地ＨＪ（さらに、０．５％ラ
クトースを含む）１ｍｌを加え、混合物を４２℃におい
て４時間インキュベートする。培養物を固形ＬＭ１７培
地（さらに、クロラムフェニコール ４μｇ／ｍｌを含
む）上に置く。生き残る細菌がファージφＳｆｉ２１の
全ゲノムをカバーするＤＮＡフラグメントを含むストレ
プトコッカスライブラリーを構成する。しかし、１個以
上のファージフラグメントを組込まずに再循環されるベ
クターｐＮＺ１２４を含むストレプトコッカスも存在す
ることに注目すべきである。
【００４０】Ｉ．３．ファージ耐性ストレプトコッカス
のライブラリーの作製： 上記ストレプトコッカスライ
ブラリーをＬＭ１７液体培地（さらに、クロラムフェニ
コール４μｇ／ｍｌと、ファージφＳｆｉ２１粒子懸濁
液 １００μｌとを含む）中で培養する（上記Ｉ．１
項）。生き残る細菌がファージ耐性ストレプトコッカス
のライブラリーを構成する。
のライブラリーの作製： 上記ストレプトコッカスライ
ブラリーをＬＭ１７液体培地（さらに、クロラムフェニ
コール４μｇ／ｍｌと、ファージφＳｆｉ２１粒子懸濁
液 １００μｌとを含む）中で培養する（上記Ｉ．１
項）。生き残る細菌がファージ耐性ストレプトコッカス
のライブラリーを構成する。
【００４１】Ｉ．４．プラスミドｐＭＺ２３の分析 ファージ耐性Ｓ．サーモフィルスから、寄託番号ＣＮＣ
ＭＩ−１５８８を与えられ、３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ
ＩファージＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＭＺ
２３を含むクローンを単離することができた。プラスミ
ドｐＭＺ２３によって与えられるファージ耐性をマイク
ロタイタープレート試験によって評価することができ
る。このために、プラスミドｐＭＺ２３を含むＳ．サー
モフィルスＳｆｉｌクローンをＭＳＫ培地（クロラムフ
ェニコール４μｇ／ｍｌを補充）で培養する。定常期培
養物１００μｌをＬＭ１７／ＣａＣｌ2培地（クロラム
フェニコール４μｇ／ｍｌを補充）０．９ｍｌで希釈す
る。上記培地２００μｌと、希釈培養物２２μｌと、上
記ファージφＳｆｉ２１懸濁液２．５μｌ／ｍｌとをマ
イクロタイタープレートの孔に分配する（３通りに；１
／１００希釈）。このプレートを４２℃においてインキ
ュベートし、１５分毎に光学密度を６２０〜６３０ｎｍ
において７．５時間測定する（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｒ
ｅａｄｅｒ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）。
ＭＩ−１５８８を与えられ、３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ
ＩファージＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＭＺ
２３を含むクローンを単離することができた。プラスミ
ドｐＭＺ２３によって与えられるファージ耐性をマイク
ロタイタープレート試験によって評価することができ
る。このために、プラスミドｐＭＺ２３を含むＳ．サー
モフィルスＳｆｉｌクローンをＭＳＫ培地（クロラムフ
ェニコール４μｇ／ｍｌを補充）で培養する。定常期培
養物１００μｌをＬＭ１７／ＣａＣｌ2培地（クロラム
フェニコール４μｇ／ｍｌを補充）０．９ｍｌで希釈す
る。上記培地２００μｌと、希釈培養物２２μｌと、上
記ファージφＳｆｉ２１懸濁液２．５μｌ／ｍｌとをマ
イクロタイタープレートの孔に分配する（３通りに；１
／１００希釈）。このプレートを４２℃においてインキ
ュベートし、１５分毎に光学密度を６２０〜６３０ｎｍ
において７．５時間測定する（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｒ
ｅａｄｅｒ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ）。
【００４２】同じ試験をファージφＳｆｉ２１と相同な
ファージ、すなわち、ファージφＳｆｉ２、φＳｆｉ１
８及びφＢａｓ３と、ファージφＳｆｉ２１とは異種の
ファージ、すなわち、ファージφＢａｓ１１及びφＢａ
ｓ１９によって実施した。このために、これらのファー
ジの懸濁液を上記Ｉ．１項に記載したように製造した。
ファージ、すなわち、ファージφＳｆｉ２、φＳｆｉ１
８及びφＢａｓ３と、ファージφＳｆｉ２１とは異種の
ファージ、すなわち、ファージφＢａｓ１１及びφＢａ
ｓ１９によって実施した。このために、これらのファー
ジの懸濁液を上記Ｉ．１項に記載したように製造した。
【００４３】比較のために、ファージの不存在下で形質
転換したＳ．サーモフィルス Ｓｆｉ１株によって、同
じ試験を平行して実施する。同じ試験をプラスミドｐＮ
Ｚ１２４によって形質転換したＳ．サーモフィルス菌株
によっても実施する。図１に示す試験結果は、プラスミ
ドｐＮＺ１２４によって形質転換したＳ．サーモフィル
スＳｆｉ１株が全ての使用ファージに感受性であること
を実証する。それ故、プラスミドｐＮＺ１２４は耐性の
原因ではない。
転換したＳ．サーモフィルス Ｓｆｉ１株によって、同
じ試験を平行して実施する。同じ試験をプラスミドｐＮ
Ｚ１２４によって形質転換したＳ．サーモフィルス菌株
によっても実施する。図１に示す試験結果は、プラスミ
ドｐＮＺ１２４によって形質転換したＳ．サーモフィル
スＳｆｉ１株が全ての使用ファージに感受性であること
を実証する。それ故、プラスミドｐＮＺ１２４は耐性の
原因ではない。
【００４４】図２に示す試験結果は、プラスミドｐＭＺ
２３によって形質転換したＳ．サーモフィルスＳｆｉ１
株が全ての使用ファージに耐性であることを実証する。
それ故、３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩファージフラグメ
ントが実際にこの耐性の原因である。このフラグメント
はファージφＳｆｉ２１と相同なファージ及び異種なフ
ァージに対する耐性を与えることができる。
２３によって形質転換したＳ．サーモフィルスＳｆｉ１
株が全ての使用ファージに耐性であることを実証する。
それ故、３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩファージフラグメ
ントが実際にこの耐性の原因である。このフラグメント
はファージφＳｆｉ２１と相同なファージ及び異種なフ
ァージに対する耐性を与えることができる。
【００４５】Ｉ．５．耐性度の評価： プラスミドｐＮ
Ｚ１２４又はｐＭＺ２３によって形質転換したＳ．サー
モフィルスＳｆｉ１株のＭＳＫ（クロラムフェニコール
４μｇ／ｍｌを補充）中の新鮮な培養物０．３ｍｌと、
ＭＲＳアガール培地（０．７％Ｂａｃｔｏａｇａｒ）
（５２℃）２．５ｍｌと、評価すべき各ファージの懸濁
液の希釈物０．１ｍｌとを混合する（ファージ懸濁液は
Ｉ．１項の記載の通りに調製）。混合物をＬＭ１７固形
培地（クロラムフェニコール補充）上でプレーティング
し、プレートを嫌気性条件下で４２℃においてインキュ
ベートし、感染病巣の数を固形培地上で（プラークとし
て）計数する。次に、一定の希釈に関して、ｐＮＺ１２
４による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラーク
数対ｐＭＺ２３による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養
物上プラーク数の比によって、ｐＮＺ１２４／ｐＭＺ２
３比を算出する。
Ｚ１２４又はｐＭＺ２３によって形質転換したＳ．サー
モフィルスＳｆｉ１株のＭＳＫ（クロラムフェニコール
４μｇ／ｍｌを補充）中の新鮮な培養物０．３ｍｌと、
ＭＲＳアガール培地（０．７％Ｂａｃｔｏａｇａｒ）
（５２℃）２．５ｍｌと、評価すべき各ファージの懸濁
液の希釈物０．１ｍｌとを混合する（ファージ懸濁液は
Ｉ．１項の記載の通りに調製）。混合物をＬＭ１７固形
培地（クロラムフェニコール補充）上でプレーティング
し、プレートを嫌気性条件下で４２℃においてインキュ
ベートし、感染病巣の数を固形培地上で（プラークとし
て）計数する。次に、一定の希釈に関して、ｐＮＺ１２
４による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラーク
数対ｐＭＺ２３による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養
物上プラーク数の比によって、ｐＮＺ１２４／ｐＭＺ２
３比を算出する。
【００４６】以下の表１に示す結果は、ファージφＳｆ
ｉ２１ゲノムの３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トが、ファージφＳｆｉ２１と相同であるファージに対
する耐性を与えることができることを実証する。
ｉ２１ゲノムの３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トが、ファージφＳｆｉ２１と相同であるファージに対
する耐性を与えることができることを実証する。
【００４７】
【表１】
【００４８】Ｉ．６．３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントの分析： ３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントの一部もファージに対する耐性を与えることがで
きるか否かを判断するために、３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩのＥｃｏＲＩ１フラグメントをｐＮＺ１２４中にク
ローン化し、このプラスミドをＳ．サーモフィルスＳｆ
ｉ１に形質転換する。
グメントの分析： ３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントの一部もファージに対する耐性を与えることがで
きるか否かを判断するために、３．６ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩのＥｃｏＲＩ１フラグメントをｐＮＺ１２４中にク
ローン化し、このプラスミドをＳ．サーモフィルスＳｆ
ｉ１に形質転換する。
【００４９】このために、プラスミドｐＭＺ２３を精製
し、これを当業者に周知の方法によって制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断して、フラグメントにする。次に、ＤＮ
Ａフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離
する。３．６ｋｂフラグメントを含むバンドをゲルから
切断し、このバンドを０．４５μｍ遠心分離膜（ＭＣウ
ルトラフリー フィルター）上に付着させ、これを−２
０℃に１０分間貯蔵し、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇ
ｅ Ａ遠心機中、全体を１０，０００ｒｐｍで室温下２
０分間遠心分離する。濾液をＴＥ飽和フェノールによっ
て抽出し、水相を酢酸エチルとエタノールとによって−
７０℃において少なくとも３０分間沈殿させる。混合物
を１３，０００ｒｐｍにおいて遠心分離し、ペレットを
７０％エタノール溶液０．５ｍｌ中に再懸濁させ、懸濁
液を１３，０００ｒｐｍにおいて再遠心分離し、次に、
３．６ｋｂ ＤＮＡフラグメントを水１０μｌ中に再懸
濁させる。
し、これを当業者に周知の方法によって制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断して、フラグメントにする。次に、ＤＮ
Ａフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離
する。３．６ｋｂフラグメントを含むバンドをゲルから
切断し、このバンドを０．４５μｍ遠心分離膜（ＭＣウ
ルトラフリー フィルター）上に付着させ、これを−２
０℃に１０分間貯蔵し、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇ
ｅ Ａ遠心機中、全体を１０，０００ｒｐｍで室温下２
０分間遠心分離する。濾液をＴＥ飽和フェノールによっ
て抽出し、水相を酢酸エチルとエタノールとによって−
７０℃において少なくとも３０分間沈殿させる。混合物
を１３，０００ｒｐｍにおいて遠心分離し、ペレットを
７０％エタノール溶液０．５ｍｌ中に再懸濁させ、懸濁
液を１３，０００ｒｐｍにおいて再遠心分離し、次に、
３．６ｋｂ ＤＮＡフラグメントを水１０μｌ中に再懸
濁させる。
【００５０】３．６ｋｂ フラグメントを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩによって切断し、切断フラグメントを、予めＥｃ
ｏＲＩによって切断したプラスミドｐＮＺ１２４に連結
し、組換えプラスミドをＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株
に形質転換する。実験条件は上記Ｉ．１項及びＩ．２項
に記載の条件と同様である。次に、ファージφＳｆｉ２
１に耐性の細菌を上記Ｉ．３項に記載の条件と同様の条
件下で選択し、０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩファージＤＮＡ
フラグメント含有プラスミドｐＭＺ２３ｃを含む、特に
耐性のクローンを単離する。
ｏＲＩによって切断し、切断フラグメントを、予めＥｃ
ｏＲＩによって切断したプラスミドｐＮＺ１２４に連結
し、組換えプラスミドをＳ．サーモフィルスＳｆｉ１株
に形質転換する。実験条件は上記Ｉ．１項及びＩ．２項
に記載の条件と同様である。次に、ファージφＳｆｉ２
１に耐性の細菌を上記Ｉ．３項に記載の条件と同様の条
件下で選択し、０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩファージＤＮＡ
フラグメント含有プラスミドｐＭＺ２３ｃを含む、特に
耐性のクローンを単離する。
【００５１】このフラグメントによってストレプトコッ
カスに与えられた耐性を上記Ｉ．４項に記載の条件下で
評価する。以下の表２に示す結果は、ファージφＳｆｉ
２１のゲノムの０．８ｋｂフラグメントがファージφＳ
ｆｉ２１に相同であるファージに対する耐性を与えるこ
とができることを実証する。
カスに与えられた耐性を上記Ｉ．４項に記載の条件下で
評価する。以下の表２に示す結果は、ファージφＳｆｉ
２１のゲノムの０．８ｋｂフラグメントがファージφＳ
ｆｉ２１に相同であるファージに対する耐性を与えるこ
とができることを実証する。
【００５２】
【表２】
【００５３】Ｉ．７．０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメ
ントの配列決定： プラスミドｐＭＺ２３ｃを当業者に
周知の方法によって精製し、次に、０．８ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントをジデオキシヌクレオチドを用いる既
知の方法（Ｓａｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３〜５４６７，１９７
７）によって配列決定する。このために、プライマーと
して役立つオリゴヌクレオチドを用いて、これをファー
ジ配列のいずれかの側で、プラスミドｐＮＺ１２４に由
来する配列とハイブリッド形成させる。結果は、０．８
ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントが以下の配列表に示す配
列番号１の配列を有することを実証する。
ントの配列決定： プラスミドｐＭＺ２３ｃを当業者に
周知の方法によって精製し、次に、０．８ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントをジデオキシヌクレオチドを用いる既
知の方法（Ｓａｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３〜５４６７，１９７
７）によって配列決定する。このために、プライマーと
して役立つオリゴヌクレオチドを用いて、これをファー
ジ配列のいずれかの側で、プラスミドｐＮＺ１２４に由
来する配列とハイブリッド形成させる。結果は、０．８
ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントが以下の配列表に示す配
列番号１の配列を有することを実証する。
【００５４】例２：ファージφＳｆｉ２からの６．５ｋ
ｂ ＥｃｏＲＶ ＤＮＡフラグメントのクローニング ファージφＳｆｉ２のゲノムからのＥｃｏＲＶフラグメ
ントを含有する組換え体プラスミドｐＮＺ１２４を含む
Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１菌株のライブラリーを作製
する。このために、上記Ｉ．１項及びＩ．２項に記載の
方法と同じ方法を用いる。次に、ファージ耐性のＳ．サ
ーモフィルスＳｆｉ１株のライブラリーを上記Ｉ．３項
に記載のように作製する。ファージ耐性のＳ．サーモフ
ィルスから、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５８９を与えら
れ、６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶファージＤＮＡフラグメン
トを含むプラスミドｐＭＺ３１を含むクローンを単離す
ることができた。
ｂ ＥｃｏＲＶ ＤＮＡフラグメントのクローニング ファージφＳｆｉ２のゲノムからのＥｃｏＲＶフラグメ
ントを含有する組換え体プラスミドｐＮＺ１２４を含む
Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１菌株のライブラリーを作製
する。このために、上記Ｉ．１項及びＩ．２項に記載の
方法と同じ方法を用いる。次に、ファージ耐性のＳ．サ
ーモフィルスＳｆｉ１株のライブラリーを上記Ｉ．３項
に記載のように作製する。ファージ耐性のＳ．サーモフ
ィルスから、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５８９を与えら
れ、６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶファージＤＮＡフラグメン
トを含むプラスミドｐＭＺ３１を含むクローンを単離す
ることができた。
【００５５】プラスミドｐＭＺ３１によって与えられる
ファージ耐性を上記Ｉ．４項及びＩ．５項に記載の試験
と同様の試験によって評価することもできる。６．５ｋ
ｂ ＥｃｏＲＶフラグメントの一部も、これを含むスト
レプトコッカスにこのファージに対する耐性を与えるこ
とができる。このために、上記Ｉ．６項に記載の方法と
同様の方法によって、プラスミドｐＭＺ３１を精製し、
種々の制限酵素によって切断して、フラグメントにし、
これらのフラグメントをプラスミドｐＮＺ１２４中にサ
ブクローン化し、Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１を組換え
ベクター（ｐＭＺ３１フラグメントという）によって形
質転換する。最後に、ファージ耐性を示す形質転換細菌
を上記Ｉ．５項に記載の試験によって選択する。特に、
１００より大きい“ｐＮＺ１２４／ｐＭＺ３１−フラグ
メント”比を有する細菌を選択する。この比は、ｐＮＺ
１２４による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラ
ーク数とｐＭＺ３１フラグメントによる形質転換Ｓ．サ
ーモフィルス培養物上プラーク数とによって、算出す
る。
ファージ耐性を上記Ｉ．４項及びＩ．５項に記載の試験
と同様の試験によって評価することもできる。６．５ｋ
ｂ ＥｃｏＲＶフラグメントの一部も、これを含むスト
レプトコッカスにこのファージに対する耐性を与えるこ
とができる。このために、上記Ｉ．６項に記載の方法と
同様の方法によって、プラスミドｐＭＺ３１を精製し、
種々の制限酵素によって切断して、フラグメントにし、
これらのフラグメントをプラスミドｐＮＺ１２４中にサ
ブクローン化し、Ｓ．サーモフィルスＳｆｉ１を組換え
ベクター（ｐＭＺ３１フラグメントという）によって形
質転換する。最後に、ファージ耐性を示す形質転換細菌
を上記Ｉ．５項に記載の試験によって選択する。特に、
１００より大きい“ｐＮＺ１２４／ｐＭＺ３１−フラグ
メント”比を有する細菌を選択する。この比は、ｐＮＺ
１２４による形質転換Ｓ．サーモフィルス培養物上プラ
ーク数とｐＭＺ３１フラグメントによる形質転換Ｓ．サ
ーモフィルス培養物上プラーク数とによって、算出す
る。
【００５６】以下の表３に示す結果は、６．５ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＶフラグメントに由来する４種のフラグメント
（すなわち、３ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ、２ｋｂ
ＢｇｌＩＩ−ＨＩＩＩ、３．５ｋｂ ＢｇｌＩＩ−Ｅ
ｃｏＲＶ及び０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラ
グメント）がストレプトコッカスに非常に良好な耐性を
与えることができることを実証する。
ｃｏＲＶフラグメントに由来する４種のフラグメント
（すなわち、３ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ、２ｋｂ
ＢｇｌＩＩ−ＨＩＩＩ、３．５ｋｂ ＢｇｌＩＩ−Ｅ
ｃｏＲＶ及び０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラ
グメント）がストレプトコッカスに非常に良好な耐性を
与えることができることを実証する。
【００５７】
【表３】
【００５８】Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌに与えられる
耐性が、たとえフラグメントが核酸配列の同じ部分を有
するとしても、フラグメントによって異なることを観察
することができる。実際に、３．５ｋｂ ＢｇｌＩＩ−
ＥｃｏＲＶフラグメントは２ｋｂ ＢｇｌＩＩ−ＨＩＩ
Ｉフラグメントを含み、３ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩ
Ｉフラグメントは０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントを含む。
耐性が、たとえフラグメントが核酸配列の同じ部分を有
するとしても、フラグメントによって異なることを観察
することができる。実際に、３．５ｋｂ ＢｇｌＩＩ−
ＥｃｏＲＶフラグメントは２ｋｂ ＢｇｌＩＩ−ＨＩＩ
Ｉフラグメントを含み、３ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩ
Ｉフラグメントは０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントを含む。
【００５９】さらに、ジデオキシヌクレオチド法による
０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの配
列決定は配列番号１と同じ配列を示す。プラスミドｐＭ
Ｚ３１−［０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ］を含
むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌ株は、図２に示すファー
ジによる攻撃を受けたときに、同じ条件下でプラスミド
ｐＭＺ２３ｃを含むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌ株に関
して得られる成長曲線と非常に類似した成長曲線を示
す。
０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの配
列決定は配列番号１と同じ配列を示す。プラスミドｐＭ
Ｚ３１−［０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ］を含
むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌ株は、図２に示すファー
ジによる攻撃を受けたときに、同じ条件下でプラスミド
ｐＭＺ２３ｃを含むＳ．サーモフィルスＳｆｉｌ株に関
して得られる成長曲線と非常に類似した成長曲線を示
す。
【００６０】例３ プラスミドｐＭＺ２３をエレクトロポレーションによっ
てＳ．サーモフィルスＳｆｉ９株に形質転換する。この
ために、上記Ｉ．２項に記載の方法と同様の方法を用い
る。上記Ｉ．５項に記載の試験と同様の試験による、形
質転換菌株の耐性スペクトルの評価は、形質転換Ｓ．サ
ーモフィルスＳｆｉ９株がファージφＳｆｉ２１及びφ
Ｓｆｉ２とは異種のファージであるファージφＳｆｉ９
に耐性であることを示す。
てＳ．サーモフィルスＳｆｉ９株に形質転換する。この
ために、上記Ｉ．２項に記載の方法と同様の方法を用い
る。上記Ｉ．５項に記載の試験と同様の試験による、形
質転換菌株の耐性スペクトルの評価は、形質転換Ｓ．サ
ーモフィルスＳｆｉ９株がファージφＳｆｉ２１及びφ
Ｓｆｉ２とは異種のファージであるファージφＳｆｉ９
に耐性であることを示す。
【００６１】例４ 無菌再構成ミルクに培地の凝固の段階で採取した各菌株
の予備培養物（ＭＳＫ培地中）を１％の割合で接種し、
このミルクを約４２℃の温度においてｐＨ５．１に達す
るまでインキュベートし、これを４℃の温度にまで冷却
し、次にこれを−７５℃において凍結することによっ
て、Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌ株とｐＭＺ２３形質転
換Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌ株の凍結スターターを調
製する。凍結スターターの混合物としての直接接種によ
って所定ヨーグルトを調製する。このために、低温殺菌
済み再構成ミルク（３．７％脂肪、２．５％脱脂乳粉
末）に各凍結スターター６ｍｌを接種し、混合物をｐＨ
約４．６５に達するまでインキュベートし、次に、これ
を４℃の温度にまで冷却する。
の予備培養物（ＭＳＫ培地中）を１％の割合で接種し、
このミルクを約４２℃の温度においてｐＨ５．１に達す
るまでインキュベートし、これを４℃の温度にまで冷却
し、次にこれを−７５℃において凍結することによっ
て、Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌ株とｐＭＺ２３形質転
換Ｓ．サーモフィルスＳｆｉｌ株の凍結スターターを調
製する。凍結スターターの混合物としての直接接種によ
って所定ヨーグルトを調製する。このために、低温殺菌
済み再構成ミルク（３．７％脂肪、２．５％脱脂乳粉
末）に各凍結スターター６ｍｌを接種し、混合物をｐＨ
約４．６５に達するまでインキュベートし、次に、これ
を４℃の温度にまで冷却する。
【００６２】
（１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ＳＯＣＩＥＴＥ ＤＥＳ ＰＲＯＤＵＩＴ
Ｓ ＮＥＳＴＬＥ （Ｂ）街：ＡＶＥＮＵＥ ＮＥＳＴＬＥ５５ （Ｃ）市：ＶＥＶＥＹ （Ｄ）州又は区：ＣＡＮＴＯＮ ＤＥ ＶＡＵＤ （Ｅ）国：スイス （Ｆ）郵便番号：１８００ （Ｇ）電話：（４１）２１ ９２４ ４７ ６０ （Ｈ）テレックス：（４１）２１ ９２４ ２８ ８０ （ｉｉ）発明の名称：ファージ耐性ストレプトコッカス （ｉｉｉ）配列の数：１ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）メディウム型式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性 （Ｃ）操作系：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．３０（ＥＰＯ）
Ｓ ＮＥＳＴＬＥ （Ｂ）街：ＡＶＥＮＵＥ ＮＥＳＴＬＥ５５ （Ｃ）市：ＶＥＶＥＹ （Ｄ）州又は区：ＣＡＮＴＯＮ ＤＥ ＶＡＵＤ （Ｅ）国：スイス （Ｆ）郵便番号：１８００ （Ｇ）電話：（４１）２１ ９２４ ４７ ６０ （Ｈ）テレックス：（４１）２１ ９２４ ２８ ８０ （ｉｉ）発明の名称：ファージ耐性ストレプトコッカス （ｉｉｉ）配列の数：１ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）メディウム型式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性 （Ｃ）操作系：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．３０（ＥＰＯ）
【００６３】（２）配列番号ＮＯ：１に関する情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：８５６塩基対 （Ｂ）種類：ヌクレオチド （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列：配列番号１
【図１】ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ
１９、φＳｆｉ２１、φＳｆｉ２及びφＳｆｉ１８の存
在下及び不存在下でのプラスミドｐＮＺ１２４形質転換
Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ１のマイクロタイタープレ
ート中での成長曲線（時間の関数としての光学密度）。
１９、φＳｆｉ２１、φＳｆｉ２及びφＳｆｉ１８の存
在下及び不存在下でのプラスミドｐＮＺ１２４形質転換
Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ１のマイクロタイタープレ
ート中での成長曲線（時間の関数としての光学密度）。
【図２】ファージφＢａｓ３、φＢａｓ１１、φＢａｓ
１９、φＢａｓ３、φＳｆｉ２１、φＳｆｉ２及びφＳ
ｆｉ１８の存在下及び不存在下でのプラスミドｐＭＺ２
３形質転換Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ１のマイクロタ
イタープレート中での成長曲線（時間の関数としての光
学密度）。
１９、φＢａｓ３、φＳｆｉ２１、φＳｆｉ２及びφＳ
ｆｉ１８の存在下及び不存在下でのプラスミドｐＭＺ２
３形質転換Ｓ．サーモフィルス株Ｓｆｉ１のマイクロタ
イタープレート中での成長曲線（時間の関数としての光
学密度）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マリー カミル ズワーレン スイス国ローザンヌ，アブニュ ドゥ フ ランス 12
Claims (9)
- 【請求項１】 ストレプトコッカスに対して毒性である
ファージのＤＮＡフラグメントであって、それを含むス
トレプトコッカスに、少なくとも１種のファージに対す
る耐性を与えることができるＤＮＡフラグメント。 - 【請求項２】 プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存
在する３．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント又はプラ
スミドＣＮＣＭＩ−１５８９中に存在する６．５ｋｂ
ＥｃｏＲＶフラグメントと相同であるか又はハイブリッ
ド形成する、請求項１記載のＤＮＡフラグメント。 - 【請求項３】 配列番号１の配列を有するフラグメント
と相同であるか又はハイブリッド形成する、請求項２記
載のＤＮＡフラグメント。 - 【請求項４】 プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８中に存
在する３．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、又はプ
ラスミドＣＮＣＭ１−１５８９中に存在する６．５ｋｂ
ＥｃｏＲＶフラグメント、又は配列番号１の配列を有
するフラグメントから成る、請求項１又は２のいずれか
に記載のＤＮＡフラグメント。 - 【請求項５】 少なくとも１種のファージに耐性なスト
レプトコッカスの製造方法において、ストレプトコッカ
スに対して毒性であるファージのＤＮＡフラグメントで
あって、ストレプトコッカスに少なくとも１種のファー
ジに対する耐性を与えることができるＤＮＡフラグメン
トをベクター中にクローン化し、このベクターをストレ
プトコッカス中に導入することを特徴とする方法。 - 【請求項６】 請求項２〜４のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡフラグメントをベクター中にクローン化することを
特徴とする請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 ストレプトコッカスに対して毒性である
ファージのＤＮＡフラグメントであって、ストレプトコ
ッカスに少なくとも１種のファージに対する耐性を与え
ることができるＤＮＡフラグメント、特にプラスミドＣ
ＮＣＭＩ−１５８８中に存在する３．６ｋｂ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメント又はプラスミドＣＮＣＭＩ−１５８
９中に存在する６．５ｋｂ ＥｃｏＲＶフラグメントと
相同であるか又はハイブリッド形成するフラグメント
を、そのゲノム中に又は複製可能なプラスミドを用い
て、組込んだストレプトコッカス。 - 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡフラグメントを含む組換え複製又は組込みベクタ
ー。 - 【請求項９】 プラスミドＣＮＣＭＩ−１５８８又はプ
ラスミドＣＮＣＭＩ−１５８９から成る請求項８記載の
ベクター。
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