JPH09278726A

JPH09278726A - 新規リポソーム

Info

Publication number: JPH09278726A
Application number: JP8924496A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Imanishi; 武今西; Takeshi Doi; 健史土井; Kazuyuki Miyashita; 和之宮下; Satoshi Obika; 聡小比賀
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-04-11
Filing date: 1996-04-11
Publication date: 1997-10-28

Abstract

(57)【要約】【課題】生物活性物質をコードする遺伝子を含む発現
ベクターを効率良く複合体形成あるいは封入でき、また
標的細胞に高い効率でトランスフェクトでき、しかも毒
性の低いリポソームを提供することにある。また、この
ようなリポソームの膜成分を構成する新規な化合物を提
供することにある。【解決手段】下記の式（Ｉ）で表される化合物【化１】及び、これら化合物の１つ又は２以上を膜成分として又
は膜成分の一部として使用するリポソーム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はリポソームの膜成分
としての新規なカチオン性脂質化合物、及びこれを用い
たリポソームに関する。

【０００２】

【従来の技術】リン脂質、グリセロ糖脂質を少なくとも
５０％以上の水に、その脂質固有のゲルー液晶相転移温
度以上で懸濁すると自動的に脂質二重層より成る閉鎖小
胞が形成される。この小胞をリポソームという。

【０００３】リポソームは生体膜との親和性が高いこと
から、内部の水相や膜成分の脂質に種々の薬剤、ホルモ
ン、リンホカインなどの生物活性物質を含有させ、それ
らの安定性の改善、活性の持続性の改善、及び標的組織
への到達性の増大を図る試みが行われている。また最近
では、上記のような生物活性物質をコードする遺伝子を
リポソームと混合して複合体を作り、またはリポソーム
に封入保持し、これを患者に投与することにより標的組
織の細胞内に遺伝子を注入し、生物活性物質をその場で
生産させる遺伝子治療が研究されている。しかしなが
ら、リポソームとの複合体生成効率、リポソーム中への
遺伝子封入効率、また標的組織細胞への遺伝子のトラン
スフェクション効率、リポソームの毒性などの点に問題
があり、未だ実用化されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、生物活性物質の遺伝子を含む発現ベクターと効率良
く複合体を形成し、また標的細胞に高い効率で遺伝子を
トランスフェクトでき、しかも毒性の低いリポソームを
提供することにある。更に、本発明の他の目的は上記の
ようなリポソームの膜成分を構成する新規な化合物を提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】発明者は、所望のリポソ
ームを作ることのできる膜成分化合物として、四級アン
モニウムあるいは三級アミン構造を有する生体分解性グ
リセリド誘導体（Ｉ）を設計した。この設計は、両親媒
性分子の会合、天然型リン脂質の構造及び毒性を考慮し
て行った。

【０００６】両親媒性分子は、分子の形状に応じてエマ
ルション、ミセル、リポソーム等の様々な会合状態をと
るとされている（J. N. Israelachvili et al., Bioche
m. Biophys. Acta, 470. 185-201 (1977) ）。すなわ
ち、親水基と疎水基のバランスが大きく異なるコーン型
や逆コーン型の両親媒性物質はミセルを形成し、親水基
と疎水基とのバランスが比較的よくとれているシリンダ
ー型が水中でラメラー構造を形成する。リポソームを形
成することのできる脂質は、このシリンダー型に属する
ことが多い。

【０００７】生体膜は脂質二重膜から構成されており、
なかでも長鎖脂肪酸を有するホスファチジルコリン類は
シリンダー型の両親媒性分子として知られている。その
ため、天然型リン脂質（ホスファチジルコリン）の構造
を本発明化合物のモデルとした。

【０００８】そこで、化合物（Ｉ）の基本骨格としては
天然型リン脂質と同じグリセリン骨格を選び、その３つ
の水酸基部分にそれぞれ１つのカチオンあるいは中性親
水基部分と２つの脂肪酸からなる疎水基部分を導入する
こととした。また、疎水基である脂肪酸部分が大きな脂
質の場合は、リポソーム間でのリン脂質の転移を避ける
ことができる。また、脂質の相転移温度が必要以上に高
いとリポソームの作製が困難になることから、この長鎖
脂肪酸には例えば、シス型の二重結合を有するオレイン
酸、又トランス型の二重結合を有するエライジン酸等の
不飽和脂肪酸を用いることを試みた。またカチオン性親
水基部分にはホスファチジルコリンにも含まれている四
級アンモニウムカチオンを用いた。さらに、グリセリン
骨格からこのカチオン部分までの距離も天然型脂質をモ
デルとして考慮した。

【０００９】一方、現在使われているカチオン性リポソ
ームのほとんどは、細胞内において分解されにくい構造
となっている。本来、生体の成分でないカチオン性脂質
が、高濃度で長期的に存在すると細胞のイオンチャンネ
ル、レセプター、酵素などの活性を阻害し、毒性が発現
すると考えられる。このことから、化合物（Ｉ）には細
胞内で容易に分解されると考えられるエステル結合を持
たせた。

【００１０】参考のため、公知のカチオン性脂質と天然
型脂質のうち代表的なものの幾つかを図１及び図２に示
す。

【００１１】このような観点から、発明者は下記式で表
わされる化合物（Ｉ）を合成した。

【化３】式中、Ｒは炭素数１０〜２２、好ましくは１４〜１８、
更に好ましくは１６〜１８の飽和又は不飽和脂肪族炭化
水素基である。これら脂肪族炭化水素基としてはアルコ
イル、オレイル、エライジルまたはオレオイル等が含ま
れる。また、式中のｎは３以上の整数、好ましくは３〜
５、更に好ましくは３〜４の整数である。Ｚは−Ｎ（Ｒ
¹）₂または−Ｎ⁺（Ｒ¹）₃を表し、ここでＲ¹は炭素数１
〜６のアルキル基、好ましくはメチル、エチル、プロピ
ル等の炭素数１〜３のアルキル基であり、最も好ましく
はメチルである。

【００１２】目的化合物（Ｉ）は、ジヒドロキシアセト
ンを出発原料として、アシル化用脂肪酸と反応させてジ
アセトキシアセトンを得、これを還元して1,3-ジアシル
化グリセロールとし、さらに遊離の水酸基を所望の脂肪
酸ハロゲン化物でエステル化し、エステル化脂肪酸の末
端にアンモニウム基あるいはアミノ基を導入して合成で
きる。

【００１３】この方法で製造した本発明の化合物（Ｉ）
の幾つか及びその化合物番号を図３に示す。本発明で合
成した新規化合物と公知の油脂とを適宜組み合わせて、
常法によりリポソームを調製する。常法としては、特に
制限はなく、超音波法、薄膜振とう法、逆相蒸発法、界
面活性剤除去法等が使用できる。例えば、次のような方
法でリポソームを調製できる。

【００１４】化合物（Ｉ）とＤＯＰＥとの混合脂質をク
ロロホルムに溶解してその溶液を作り、この溶液からク
ロロホルムを例えば減圧下で留去して、脂質薄膜を作成
する。この薄膜に水を加え、穏やかな加温下に撹拌処理
し、更に、超音波処理してリポソーム溶液を得る。必要
に応じてこの溶液を例えば滅菌フィルターに通過させ
て、滅菌及び整粒を行い、目的のリポソーム（ＳＵＶ
型）を得る。調製の条件については、常法にしたがって
適宜選択できる。さらに、本発明で調製されるリポソー
ムは一枚膜でも多重膜のものでも良い。

【００１５】原料脂質としては、本発明の化合物（Ｉ）
の１つ又は２つ以上を膜成分の全部又は一部として使用
する。化合物（Ｉ）と公知の中性リン脂質例えば、ジオ
レオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰ
Ｅ）、ジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰ
Ｃ）、ジラウロイルフォスファチジルコリン（ＤＬＰ
Ｃ）等との混合物としても使用できる。通常モル比で
１：１〜１：１０、好ましくは１：２〜１：７、更に好
ましくは１：３〜１：５の混合物である。

【００１６】また、本発明の構造式（Ｉ）で表される化
合物は、他の公知のカチオン性脂質、例えばＮ−（αー
トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシルーＤ−グル
タメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ−［１−（２，３−
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル
アンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレ
イルオキシーＮ−［２−（スペルミンカルボキシアミ
ド）エチル］ーＮ，Ｎ−ジメチルー１−プロパンアミニ
ウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）等と併用す
ることもできる。

【００１７】このようにして得られるリポソームを、水
に懸濁し、これに所望の遺伝子を含む発現ベクターを添
加混合し、所望の時間放置すればリポソームと遺伝子の
複合体を得ることができる。

【００１８】遺伝子と複合体を形成したリポソームは、
水又は生理食塩水等に懸濁して、例えば静脈内注射する
ことができる。

【００１９】本発明のリポソームには、所望の生理活性
物質等をコードする遺伝子、例えばα−、β−又はγ−
インターフェロン遺伝子、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子、肝炎ウイ
ルスのアンチセンスをコードする遺伝子等の所望の遺伝
子と複合体を形成することができる。

【００２０】本発明のリポソームは、生体に投与した場
合に、従来のリポソームに比較して毒性が低いという利
点がある。また、所望の遺伝子を含む発現ベクターを封
入するのに使用した場合、この発現ベクターを高い効率
で所定細胞へトランスフェクトさせることができる。

【００２１】

【実施例】次に本発明を実施例及び実験例により、更に
詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

【００２２】実施例１：化合物（Ｉａ）の合成１）1,3-Dioleoyloxypropan-2-one (1)の合成文献［R.K. Dharma, A. David, G.R. Trevor and M.S.
Donald, J. lipid Res., 28, 403-413 (1987)］に従
い、以下のように合成した。

【００２３】ジヒドロキシアセトン(0.76 g, 8.4 mmol)
のCCl4(16.8 ml)溶液に、オレイン酸 (4.20 g, 17.64
mmol) とDMAP (2.05 g, 16.8 mmol) を加え、DCC (3.60
g,17.64 mmol)のCCl₄ (8.4 ml) 溶液を室温で 30 分か
けて滴下し、室温で 17 時間撹拌した。沈殿を濾過し
て、濾液を濃縮した後、残渣をヘキサンに溶かし、0℃
で2 時間氷冷した。析出した結晶を濾過して、濾液を濃
縮した後、残渣をMeOHから再結晶することにより無色
結晶1 (4.15 g, 80%)を得た。

【００２４】mp 40-41.5℃ (MeOH). (lit,1) 43-44℃).
IR ν (KBr) : 2999, 2920, 2850, 2305, 2092, 1733,
1654, 1467, 1415, 1174, 886, 722 cm^-1. ¹H-NMR (CD
Cl₃)δ : 0.88 (6H, t, CH₃), 1.27-1.31 (40H, br m,
CH₂), 1.67 (4H, m, OCOCH₂CH₂ ), 2.17, 2.02 (8H, m,
CH₂ CH=CHCH₂ ), 2.42 (4H, t, J= 7.5 Hz, OCOCH₂), 4.7
5 (4H, s, CH₂COCH₂), 5.34 (4H, m, CH₂CH=CHCH₂)

【００２５】２）1,3-Dioleoylglycerol (2)の合成文献［R.K. Dharma, A. David, G.R. Trevor and M.S.
Donald, J. lipid Res., 28, 403-413 (1987)］に従
い、以下のように合成した。

【００２６】化合物１(1.0 g, 1.6 mmol)のTHF−水 (15
: 1) (16 ml)溶液に0℃においてNaBH₄ (100 mg, 1.6 m
mol) を加え、20 分間撹拌した。溶媒を留去した後、残
渣をエーテルで希釈し、水で洗浄、有機層を無水硫酸マ
グネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をペンタン
で洗浄し、無色油状物質2 (0.86 g, 85%) を得た。

【００２７】¹H-NMR (CDCl₃)δ : 0.88 (6H, t, CH₃),
1.27 (40H, m, CH₂), 1.60 (4H, m,OCOCH₂CH₂ ), 2.00,
2.02 (8H, m, CH₂ CH=CHCH₂ ), 2.34 (4H, t, J= 7.6 Hz,
OCOCH₂), 4.14-4.16 (5H, br. m, CH₂CHCH₂), 5.34 (4
H, m, CH₂CH=CHCH₂).

【００２８】３）1,3-Dioleoyl-2-(4-chlorobutanoyl)g
lycerol (3)の合成化合物2 (0.45 g, 0.73 mmol) の無水塩化メチレン (5
ml) 溶液に, 2,6-lutidine (5 ml) 及び4-クロロブタノ
イルクロリド (0.31 g, 2.19 mmol) を加え、室温で 17
時間撹拌した。溶媒を留去した後、酢酸エチルで希釈
し、水、飽和重曹水、水、2% 塩酸、水、飽和食塩水で
洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶
媒を留去した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラ
フィー(hexane: AcOEt = 6 : 1) で精製し、無色油状物
質3 (0.45 g, 85%) を得た。

【００２９】IR ν (KBr) : 2930, 2854, 2676, 2031,
1746, 1652, 1456, 1377, 1166, 1049, 877, 788cm^-1.
¹HNMR(CDCl₃)δ : 0.88 (6H, t, CH₃), 1.27, 1.30 (40
H, m,CH₂), 1.61 (4H, m, OCOCH₂CH₂ ), 2.02, 2.00 (8
H, m, CH₂ CH=CHCH₂ ), 2.10 (2H, m, COCH₂CH₂ CH₂Cl),
2.32 (4H, t, J= 7.6 Hz, OCOCH₂), 2.53 (2H, t, J=
7.2 Hz, COCH₂ CH₂CH₂Cl), 3.60 (2H, t, J= 6.4 Hz, CO
CH₂CH₂CH₂ Cl), 4.14, 4.33(4H, A₂B₂, J= 5.9, 4.1 Hz,
CH₂ CHCH₂ ), 5.27 (1H, m, CH₂CHCH₂), 5.34 (4H,m, CH
₂CH=CHCH₂). ¹³C-NMR (CDCl₃)δC : 173.23, 171.73, 1
29.99, 129.69, 69.36, 61.96, 43.79, 33.98, 31.88,
31.09, 29.74, 29.67, 29.51, 29.29, 29.13, 29.06, 2
7.50, 27.19, 27.14, 24.82, 22.66, 14.09. MS (EI) m
/z : 724 (M+, 6.1), 602 (M⁺-ClC₃H₆CO₂, 14.2), 443,
445(M⁺-C₁₇H₃₃CO₂, base, 40.1),339 (C₁₇H₃₃CO⁺+74,
12.8), 265 (C₁₇H₃₃CO⁺, 58.5), 179, 181 (ClC₃H₆CO⁺+
74,43.1, 14.3), 105, 107 (ClC₃H₆CO⁺, 84.3, 31.1).
Anal. Calcd for C₄₃H₇₇ClO₆ : C, 71.19; H, 10.70; C
l, 4.89. Found : C, 71.19; H, 10.65; Cl, 4.83.

【００３０】４）1,3-Dioleoyl-2-(4-iodobutanoyl)gly
cerol (4)の合成ヨウ化ナトリウム (1.29 g, 8.55 mmol) の無水メチル
エチルケトン溶液 (10ml)に、化合物3 (0.62 g, 0.86 m
mol) を加え、室温で 48 時間撹拌した。溶媒を留去し
た後、酢酸エチルで希釈し、水、10%NaHSO₄、水、5%飽
和重曹水、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫
酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。残渣をフラ
ッシュカラムクロマトグラフィー (hexane : AcOEt = 5
0 : 1)により精製し、無色油状物質4 (0.55 g, 78%) を
得た。

【００３１】IR ν (KBr) : 2926, 2854, 1745, 1656,
1462, 1377, 1167, 875, 723 cm^-1.¹H-NMR (CDCl₃)δ :
0.88 (6H, t, CH₃), 1.27, 1.30 (40H, m, CH₂), 1.62
(4H,m, OCOCH₂CH₂ ), 2.00, 2.02 (8H, m, CH₂ CH=CHC
H₂ ), 2.13 (2H, m, COCH₂CH₂ CH₂I), 2.32 (4H, t, J=
7.6 Hz, OCOCH₂), 2.48 (2H, t, J= 7.1 Hz, COCH₂ CH₂C
H₂I), 3.24 (2H, t, J= 6.8 Hz, COCH₂CH₂CH₂ I), 4.16,
4.32 (4H, A₂B₂, J= 5.9,4.3 Hz, CH₂ CHCH₂ ), 5.27 (1
H, m, CH₂CHCH₂), 5.34 (4H, m, CH₂CH=CHCH₂).¹³C-NMR
(CDCl₃)δC : 173.23, 171.41, 130.01, 129.69, 69.4
0, 69.18, 34.70, 34.02, 31.88, 30.30, 29.74, 29.6
9, 29.51, 29.31, 29.15, 29.09, 28.32,27.21, 27.15,
24.82, 22.66, 14.09, 4.94. MS (EI) m/z : 816 (M⁺,
7.5), 798 (M⁺-H₂O, 1.7), 602 (M⁺-IC₃H₆CO₂, 17.5),
535 (M⁺-C₁₇H₃₃CO₂, base), 339(C₁₇H₃₃CO⁺+74, 14.
7), 265 (C₁₇H₃₃CO⁺, 51.9), 271 (IC₃H₆CO⁺+74, 30.
1), 197(IC₃H₆CO⁺, 47.4). Anal. Calcd for C₄₃H₇₇IO₆
: C, 63.21; H, 9.50; I, 15.53. Found : C, 63.27;
H, 9.41; I, 15.31.

【００３２】５）N-[3-[2-(1,3-Dioleoyloxy)propoxyca
rbonyl]propyl]-N,N,N-trimethylammonium iodide （Ｉ
ａ）の合成無水トリメチルアミンを4 (0.51 g, 0.62 mmol) の無水
エーテル (3 ml) 溶液に加え、0℃で 48 時間撹拌し
た。溶媒及び過剰のトリメチルアミンを留去した後、残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHCl₃ : Me
OH = 10 :1) で精製後、白色ワックス状物質Ｉａ (0.38
g, 69%) を得た。

【００３３】mp 47-50℃. IR ν (KBr) : 2924, 2852,
1738, 1466, 1412, 1364, 1252, 1176, 1117, 1067, 10
25, 968, 938, 879, 851, 798, 725 cm^-1. ¹H-NMR (CDC
l₃)δ:0.88 (6H, t, CH₃), 1.27, 1.30 (40H, m, CH₂),
1.61 (4H, m, OCOCH₂CH₂ ), 2.00, 2.22 (8H, m, CH₂ CH
=CHCH₂ ), 2.12 (2H, m, COCH₂CH₂ CH₂N), 2.33 (4H, t,J
= 7.6 Hz, OCOCH₂), 2.54 (2H, t, J= 6.5 Hz, COCH₂ CH
₂CH₂N), 3.48 (9H, s,N(CH₃)₃), 3.75 (2H, m, COCH₂CH
₂CH₂ N), 4.13, 4.40 (4H, A₂B₂, J= 5.4, 4.3 Hz, CH₂
CHCH₂ ), 5.16 (1H, m, CH₂CHCH₂), 5.34 (4H, m, CH₂CH
=CHCH₂). ¹³C-NMR (CDCl₃)δC : 173.40, 171.23, 130.
01, 129.67, 70.39, 61.58, 53.78, 34.00, 31.88, 29.
72, 29.67, 29.49, 29.29, 29.17, 29.09, 29.06, 27.1
9, 27.14, 24.82, 22.66, 18.31, 14.11. MS (EI) m/z
: 733 (M⁺-CH₃I, base), 265 (C₁₇H₃₃CO⁺, 5.7), 142
(CH₃I, 55.8). Anal. Calcd for C₄₆H₈₆INO₆ : C, 63.0
6;H, 9.89; N, 1.60. Found : C, 62.93; H, 9.79; N,
1.57.

【００３４】実施例２〜３：化合物（Ｉｂ）及び化合物
（Ｉｃ）の合成実施例１の３）中の4-クロロブタノイルクロリドに代え
て5-クロロバレリルクロリドを使用する以外は、実施例
１を繰り返して目的の化合物（Ｉｂ）を得た。（ｍｐ＝
46.5-50℃）

【００３５】また、実施例１のオレイン酸に代えてエラ
イジン酸あるいはステアリン酸を使用する以外は、実施
例１を繰り返して化合物(Ｉｃ)(ｍｐ＝74-77℃）あるい
は（Ｉｄ）（ｍｐ＝99.5-101.5℃）を得た。

【００３６】化合物（Iｂ） IR ν (KBr): 2924, 2853, 1739, 1653, 1457, 1418, 1
373, 1173, 1096, 965,913, 722 cm^-1, ¹H-NMR (CDCl₃)
δ: 0.88 (6H, t, -CH₃), 1.27, 1.30 (40H, m, -CH
₂-), 1.61 (4H, m, -OCOCH₂CH₂ -), 1.78 (2H, m, -COCH
₂CH₂ CH₂)₂N), 1.90(2H, m, -CO(CH₂)₂CH₂ CH₂N), 2.00,
2.33 (8H, m, -CH₂ CH=CHCH₂ -), 2.33 (4H,t, J=7.6 Hz,
-OCOCH₂-), 2.45 (2H, t, J=6.2 Hz, -OCOCH₂CH₂ -),
3.46 (9H,s, -N(CH₃)₃), 3.71 (2H, m, -CO(CH₂)₂CH₂CH
₂ N), 4.11, 4.41 (4H, A₂B₂, J=5.4, 4.6 Hz, -CH₂ CHCH
₂ -), 5.17 (1H, m, -CH₂CHCH₂-), 5.34 (4H, m, -CH₂CH
=CHCH₂-), ¹³C-NMR (CDCl₃)δc:173.39, 171.88, 130.0
1, 129.65, 69.72, 66.51,61.64, 53.80, 34.04, 32.8
0, 31.86, 29.72, 29.67, 29.49, 29.29, 29.15, 29.0
9, 29.06, 27.19, 27.14, 24.85, 22.64, 22.18, 20.9
5, 14.09, MS (EI) m/z: 747 (M⁺-CH₃I, base), 265 (R
^1.3CO, 5.1), 142 (CH₃I, 53.8), 128 (R²CO-CH₃I,64.
3), 58 (C₃H₁₁N, over). Anal Calcd for C₄₇H₈₈INO₆ 1
/2 H₂O: C, 62.78; H, 9.89; I, 14.11; N, 1.56, Foun
d: C, 62.82; H, 9.63; I, 13.89; N, 1.59.

【００３７】化合物（Iｃ） IR ν (KBr): 2920, 2850, 1754, 1465, 1416, 1363, 1
252, 1176, 1116, 1065,1022, 964, 942, 798, 724 cm
^-1, ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88 (6H, t, -CH₃), 1.27,
1.30 (40H, m, -CH₂-), 1.61 (4H, m, -OCOCH₂CH₂-),
1.95, 1.97 (8H, m,-CH₂ CH=CHCH₂ -), 2.14 (2H, m, -CO
CH₂CH₂ CH₂N), 2.33 (4H, t, J=7.6 Hz, -OCOCH₂-), 2.5
4 (2H, t, J=6.8 Hz, -COCH₂ CH₂CH₂N-), 3.49 (9H, s,
-N(CH₃)₃),3.76 (2H, m, -COCH₂CH₂CH₂ N), 4.13, 4.39
(4H, A₂B₂, J=5.1, 4.3 Hz, -CH₂CHCH₂ -), 5.17 (1H,
m, -CH₂CHCH₂-), 5.38 (4H, m, -CH₂CH=CHCH₂-), ¹³C-N
MR (CDCl₃)δc: 173.30, 171.12, 130.39, 130.06, 70.
23, 65.52, 61.55, 53.75, 33.96, 32.51, 32.47, 31.8
1, 29.71, 29.56, 29.40, 29.38, 29.22, 29.09, 29.0
4, 28.99, 28.90, 24.76, 22.57, 18.30, 14,02, MS (E
I) m/z: 733 (M⁺-CH₃I,21.6 ), 265 (R^1.3CO, 1.0 ), 1
42 (CH₃I, 75.9), 58 (C₃H₁₁N, base), Anal Calcd for
C₄₆H₈₆INO₆: C, 63.06; H, 9.89; I, 14.49; N, 1.60,
Found: C, 62.77; H, 9.65; I, 14.52; N, 1.63.

【００３８】化合物（Iｄ） IR ν (KBr): 2915, 2849, 1733, 1471, 1417, 1254, 1
175, 1115, 962, 719 cm^-1, ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0.88
(6H, t, -CH₃), 1.25, (56H, m, -CH₂-), 1.61 (4H, m,
-OCOCH₂CH₂ -), 2.12 (2H, m, -COCH₂CH₂ CH₂N), 2.33
(4H, t, J=7.7 Hz,-OCOCH₂-), 2.54 (2H, t, J=6.4 Hz,
-COCH₂ CH₂CH₂N-), 3.47 (9H, s, -N(CH₃)₃), 3.73 (2
H, m, -COCH₂CH₂CH₂ N), 4.12, 4.41 (4H, A₂B₂, J=5.3,
3.9 Hz, -CH₂ CHCH₂ -), 5.16 (1H, m, -CH₂CHCH₂-), ¹³
C-NMR (CDCl₃)δc: 173.40, 171.19,96.07, 70.33, 65.
54, 61.57, 53.77, 34.00, 31.88, 29.67, 29.45, 29.3
3, 29.24, 29.08, 24.84, 22.64, 18.30, 14.09, MS (E
I) m/z: 737 (M⁺-CH₃I, 4.4), 265 (R^1.3CO, 2.2 ), 14
2 (CH₃I, 23.06), 114 (R²CO-CH₃I,14.9), 58 (C₃H₁₁N,
base). Anal Calcd for C₄₆H₉₀INO₆: C, 62.78; H, 1
0.30; I, 14.41; N, 1.59. Found: C, 62.49; H,10.03;
I, 14.48; N, 1.63.

【００３９】実施例４：ＳＵＶ型のリポソームの調製化合物（Ｉ）とＤＯＰＥとの混合脂質（合計１μｍｏ
ｌ）をクロロホルムに溶解してその溶液（０．５ｍｌ）
を作り、これを試験管にとり、ロータリーエバポレータ
ーでクロロホルムを減圧留去して、脂質薄膜を作成し
た。この薄膜に水（０．５ｍｌ）を加え、４５℃に加温
し、２分間ボルテックス処理した。更に、窒素ガス気流
下、プロープ型ソニケーターで５分間超音波処理してリ
ポソーム液を得た。得られたリポソーム液を０．２μｍ
の滅菌フィルターに通して、滅菌及び整粒を行い、目的
のリポソーム（ＳＵＶ型）を得た。

【００４０】得られたリポソームは、次の実験例のトラ
ンスフェクションアッセイに使用して、その特性を試験
した。

【００４１】実験例１：トランスフェクションアッセイ実施例４で調製したＳＵＶ型リポソーム（２０ｎｍｏ
ｌ）とプラスミドＤＮＡ（０．５μｇ）を混合し、クリ
ーンベンチ内で１５分静置した。このプラスミドＤＮＡ
は、東洋インキ製造（株）で製造され、和光純薬工業
（株）より販売されているピッカジーンベクターのコン
トロールベクター（製品番号：ＰＧＶ−Ｃ）を用いた。
このベクターはルシフェラーゼ遺伝子をコードしてお
り、さらに、ＳＶ４０由来のプロモーター、エンハンサ
ーを含む全長６０４６ｂｐのプラスミドである。

【００４２】一方、１×１０⁵／ウエルのＣＨＯ細胞
（６ウエル）をＰＢＳで洗い、１．９ｍｌのＯｐｔｉ−
ＭＥＭＩを加えた。これに、先に調製したリポソームと
プラスミドの混合液を加え、３７℃、５％ＣＯ₂で２４
時間培養した。

【００４３】培養後、細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄
し、細胞内に発現しているルシフェラーゼの活性を市販
のルシフェラーゼアッセイキット（東洋インキ（株）
製）を用いて測定した。

【００４４】使用したリポソーム及び使用濃度を次の表
１に、測定したルシフェラーゼ活性を表２及び表３に示
す。

【００４５】また、プラスミドＤＮＡの量０．５μｇで
一定とし、脂質の濃度を１μＭから８０μＭまで変化さ
せて、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を図４に示
す。活性値はリポフェクチンの活性を１とした場合の相
対比で示した。

【００４６】

【表１】（トランスフェクションに用いたリポソーム及び使用濃
度）

【００４７】

【表２】（ＳＵＶ型リポソームを用いたトランスフェクションア
ッセイ）（化合物（Ｉ）：ＤＯＰＥ：ＤＬＰＣの組成変化）

【００４８】

【表３】（ＳＵＶ型をリポソームを用いたトランスフェクション
アッセイ）（化合物（Ｉ）の種類変化）

【００４９】実験例２：化合物（Ｉａ）を含むＳＵＶリ
ポソームの細胞毒性ＳＵＶリポソームの細胞毒性を検討するために、リポソ
ームを添加して７２時間後の細胞の蛋白量を定量した。

【００５０】アッセイの１８時間前に継代した４×１０
⁴／ウエルのＣＨＯ細胞（１２ウエル）をＰＢＳで洗浄
し、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩを加えた。リポソーム
を各濃度にて加え、３７℃、５％ＣＯ₂で７２時間培養
した。ブラッドフォード法にて蛋白量の定量を行った。

【００５１】結果を図５に示す。図５のグラフは、各リ
ポソーム添加時の蛋白量とリポソーム非添加時の蛋白量
との比を表しており、数値が大きいほどリポソーム添加
時の蛋白量が多く、毒性が低いとみなすことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】公知のカチオン性脂質の代表的化合物の化学構
造を示す。

【図２】公知の天然型脂質の代表的化合物の化学構造を
示す。

【図３】本発明で製造されたカチオン性脂質の化学構造
を示す。

【図４】本発明のＳＵＶ型リポソームを用いたトランス
フェクションアッセイにおける、脂質量とルシフェラー
ゼ活性との相関性を示すグラフである。

【図５】本発明のリポソームの細胞毒性を示すグラフで
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造式（Ｉ）【化１】［式中、Ｒは炭素数１０〜２２の飽和又は不飽和脂肪族
炭化水素基を表し、ｎは３以上の整数、Ｚは−Ｎ
（Ｒ¹）_２または−Ｎ⁺（Ｒ¹）₃を表し、Ｒ¹は炭素数１
〜６のアルキル基である] の化合物。
【請求項２】ｎが３〜５の整数である請求項１記載の
化合物。
【請求項３】ｎが３〜４の整数で、Ｒ¹は炭素数１〜
３のアルキル基である請求項１記載の化合物。
【請求項４】Ｒは炭素数１４〜１８の飽和又は不飽和
脂肪族炭化水素基である請求項１、２又は３記載の化合
物。
【請求項５】Ｒはアルコイル、エライジル及びオレオ
イルからなる群から選択される請求項４記載の化合物。
【請求項６】下記の構造式（Ｉ）【化２】［式中、Ｒは炭素数１０〜２２の飽和又は不飽和脂肪族
炭化水素基を表し、ｎは３以上の整数、Ｚは−Ｎ
（Ｒ¹）_２または−Ｎ⁺（Ｒ¹）₃を表し、（ここでＲ¹は
炭素数１〜６のアルキル基である）] の化合物の１つ又
は２つ以上を、全脂質に対して少なくとも１モル％以上
含有するリポソーム。
【請求項７】前記化合物の１つ又は２つ以上を、全脂
質に対して５〜５０モル％含有する請求項６記載のリポ
ソーム。
【請求項８】前記化合物とジオレオイルフォスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とからなる請求
項６記載のリポソーム。
【請求項９】前記化合物とＤＯＰＥとの配合比率が
１：１〜１：１０である請求項８記載のリポソーム。
【請求項１０】前記化合物とＤＯＰＥとの配合比率が
１：３〜１：５である請求項９記載のリポソーム。
【請求項１１】前記化合物とＤＯＰＥとの配合比率が
１：４である請求項１０記載のリポソーム。
【請求項１２】前記化合物が、ｎが３〜５の整数であ
る構造式（Ｉ）で表される化合物である請求項６〜１１
の何れかの項記載のリポソーム。
【請求項１３】ｎが３〜４の整数で、Ｒ¹は炭素数１
〜３のアルキル基である請求項１２記載のリポソーム。
【請求項１４】Ｒは炭素数１４〜１８の飽和又は不飽
和脂肪族炭化水素基である請求項６〜１３のいずれかの
項に記載のリポソーム。
【請求項１５】Ｒがアルコイル、エライジル及びオレ
オイルからなる群から選択される請求項１４記載のリポ
ソーム。