JPH09288080A - 遺伝子の電気化学的検出法およびその装置 - Google Patents
遺伝子の電気化学的検出法およびその装置Info
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- JPH09288080A JPH09288080A JP8102957A JP10295796A JPH09288080A JP H09288080 A JPH09288080 A JP H09288080A JP 8102957 A JP8102957 A JP 8102957A JP 10295796 A JP10295796 A JP 10295796A JP H09288080 A JPH09288080 A JP H09288080A
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- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】簡便な感度のよいＤＮＡの検出、測定を行うこ
と 【解決手段】導電性の物質で修飾されたＤＮＡプローブ
が固定された電極と、ＤＮＡを含む試料とをインターカ
レータ存在下に反応させ、該ＤＮＡプローブとＤＮＡと
のハイブリッドＤＮＡを形成させる、該反応後の電極の
電流を検出および／または測定する。
と 【解決手段】導電性の物質で修飾されたＤＮＡプローブ
が固定された電極と、ＤＮＡを含む試料とをインターカ
レータ存在下に反応させ、該ＤＮＡプローブとＤＮＡと
のハイブリッドＤＮＡを形成させる、該反応後の電極の
電流を検出および／または測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明はＤＮＡの検出装
置、および検出方法に関する。
置、および検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物学、医学分野での遺伝子解析におい
ては、特定の配列を有するＤＮＡを検出する手段とし
て、ハイブリダイゼーション方法が用いられている。
ては、特定の配列を有するＤＮＡを検出する手段とし
て、ハイブリダイゼーション方法が用いられている。
【０００３】この中でも、特に、いわゆるサザンハイブ
リダイゼーションが一般的に用いられている。このサザ
ンハイブリダイゼーションは一般的には、まず、被験Ｄ
ＮＡを１種類以上の制限酵素でフラグメントとした後、
ゲル電気泳動にかけてサイズによって分離する。次に被
験ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した後、ナイロン・フィ
ルターまたはニトロセルロース・ぺーパーに固定化す
る。そして、この変性された一本鎖ＤＮＡと、放射性同
位元素（以下、ＲＩという）でラベルされた塩基対を形
成する相補的な一本鎖ＤＮＡ（以下、ＤＮＡプローブと
いう）とをハイブリダイズさせて、フィルター（ニトロ
セルロースペーパー）を洗浄する。洗浄後、上記フィル
ター（ニトロセルロースペーパー）をオートラジオグラ
フにかけ、現像することによって、プローブＤＮＡとハ
イブリダイズする特定の配列を有するＤＮＡが検出され
る。
リダイゼーションが一般的に用いられている。このサザ
ンハイブリダイゼーションは一般的には、まず、被験Ｄ
ＮＡを１種類以上の制限酵素でフラグメントとした後、
ゲル電気泳動にかけてサイズによって分離する。次に被
験ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した後、ナイロン・フィ
ルターまたはニトロセルロース・ぺーパーに固定化す
る。そして、この変性された一本鎖ＤＮＡと、放射性同
位元素（以下、ＲＩという）でラベルされた塩基対を形
成する相補的な一本鎖ＤＮＡ（以下、ＤＮＡプローブと
いう）とをハイブリダイズさせて、フィルター（ニトロ
セルロースペーパー）を洗浄する。洗浄後、上記フィル
ター（ニトロセルロースペーパー）をオートラジオグラ
フにかけ、現像することによって、プローブＤＮＡとハ
イブリダイズする特定の配列を有するＤＮＡが検出され
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のサザンハイブリ
ダイゼーションなどの従来法は、標識として放射性同位
元素用いるため、放射性物質取扱施設とその維持管理に
多大な費用と労力を要するばかりでなく、研究者の健康
上の安全も保証されない。またオートラジオグラフィー
でバンドとして検出するためには24時間以上の時間を要
する。さらに、被験ＤＮＡ量が少ない場合には、フィル
ムを感光させるためには長時間の曝露が必要であり、ま
たバンドの輪郭が不明瞭となる問題点がある。
ダイゼーションなどの従来法は、標識として放射性同位
元素用いるため、放射性物質取扱施設とその維持管理に
多大な費用と労力を要するばかりでなく、研究者の健康
上の安全も保証されない。またオートラジオグラフィー
でバンドとして検出するためには24時間以上の時間を要
する。さらに、被験ＤＮＡ量が少ない場合には、フィル
ムを感光させるためには長時間の曝露が必要であり、ま
たバンドの輪郭が不明瞭となる問題点がある。
【０００５】サザンハイブリダイゼーション法におい
て、ＲＩの代わりに蛍光物質をプローブの標識とする方
法も提案されている。この方法は安全性と迅速さにおい
ては、ＲＩに優るが、励起光による褪色が起こること、
測定には専用の蛍光測定装置が必要であること、さらに
蛍光の内部消光のために一定量以上の蛍光物質をプロー
ブとして導入することは困難であること、などの欠点を
有している。また、近年、発光にてＤＮＡを検出する方
法も実用化されてきたが蛍光法と同様に専用測定装置が
必要である。
て、ＲＩの代わりに蛍光物質をプローブの標識とする方
法も提案されている。この方法は安全性と迅速さにおい
ては、ＲＩに優るが、励起光による褪色が起こること、
測定には専用の蛍光測定装置が必要であること、さらに
蛍光の内部消光のために一定量以上の蛍光物質をプロー
ブとして導入することは困難であること、などの欠点を
有している。また、近年、発光にてＤＮＡを検出する方
法も実用化されてきたが蛍光法と同様に専用測定装置が
必要である。
【０００６】上記のように、種々の検出方法が検討され
ているが、いずれも、特定の遺伝子配列の有無を検出す
るためには、検体から取り出したＤＮＡを制限酵素でフ
ラグメント化したのち、電気泳動等の手法により、サイ
ズにより分画し、被験ＤＮＡをニトロセルロースペーパ
ー等に固定化せねばならず煩雑であるという問題点は、
未解決である。
ているが、いずれも、特定の遺伝子配列の有無を検出す
るためには、検体から取り出したＤＮＡを制限酵素でフ
ラグメント化したのち、電気泳動等の手法により、サイ
ズにより分画し、被験ＤＮＡをニトロセルロースペーパ
ー等に固定化せねばならず煩雑であるという問題点は、
未解決である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明は、上記の問題
点を解決することを目的としてなされたものであり、検
体のＤＮＡを断片化することなく、特定の配列を有する
ＤＮＡ配列を検出する方法および装置を提供することに
ある。
点を解決することを目的としてなされたものであり、検
体のＤＮＡを断片化することなく、特定の配列を有する
ＤＮＡ配列を検出する方法および装置を提供することに
ある。
【０００８】本願発明は、一本鎖のＤＮＡプローブを電
極表面に固定化し、溶液系でインターカレータの存在
下、被験ＤＮＡとプローブＤＮＡとの相補的二本鎖ＤＮ
Ａを形成させ、形成された二本鎖ＤＮＡの検出を、電極
の電流変化を電気化学的シグナルとして検出および／ま
たは測定する発明に関する。
極表面に固定化し、溶液系でインターカレータの存在
下、被験ＤＮＡとプローブＤＮＡとの相補的二本鎖ＤＮ
Ａを形成させ、形成された二本鎖ＤＮＡの検出を、電極
の電流変化を電気化学的シグナルとして検出および／ま
たは測定する発明に関する。
【０００９】従って、本願発明は、特定の配列を有する
ＤＮＡを検出する方法であって、導電性の物質で修飾さ
れたＤＮＡプローブが固定された電極と、ＤＮＡを含む
試料とをインターカレータ存在下に反応させ、該ＤＮＡ
プローブとＤＮＡとのハイブリッドＤＮＡを形成させる
工程；および、該反応後の電極の電流を検出および／ま
たは測定する工程；を有する、方法に関する。
ＤＮＡを検出する方法であって、導電性の物質で修飾さ
れたＤＮＡプローブが固定された電極と、ＤＮＡを含む
試料とをインターカレータ存在下に反応させ、該ＤＮＡ
プローブとＤＮＡとのハイブリッドＤＮＡを形成させる
工程；および、該反応後の電極の電流を検出および／ま
たは測定する工程；を有する、方法に関する。
【００１０】好適な実施態様においては、反応後に電極
を洗浄する工程を含む。
を洗浄する工程を含む。
【００１１】好適な実施態様においては、前記導電性物
質が酸化還元活性を有する化合物である。さらに好まし
くは、前記化合物がフェロセンである。
質が酸化還元活性を有する化合物である。さらに好まし
くは、前記化合物がフェロセンである。
【００１２】また、好適な実施態様においては、前記イ
ンターカレータが、フェロセン修飾縫い込み型インター
カレータである。縫い込み型インターカレータとは、Ｄ
ＮＡへのインターカレーション時に二つの置換基が主溝
にそれぞれ突き出した複合体を形成する薬剤である。従
って、縫い込み型インターカレータがＤＮＡからはずれ
る時、置換基の一つがストッパーとして働く。これによ
って二本鎖核酸からの解離は極めて遅い。一本鎖ではこ
のようなことが起こらないため素早く解離する。従っ
て、縫い込み型インターカレータが好適に用いられ得
る。
ンターカレータが、フェロセン修飾縫い込み型インター
カレータである。縫い込み型インターカレータとは、Ｄ
ＮＡへのインターカレーション時に二つの置換基が主溝
にそれぞれ突き出した複合体を形成する薬剤である。従
って、縫い込み型インターカレータがＤＮＡからはずれ
る時、置換基の一つがストッパーとして働く。これによ
って二本鎖核酸からの解離は極めて遅い。一本鎖ではこ
のようなことが起こらないため素早く解離する。従っ
て、縫い込み型インターカレータが好適に用いられ得
る。
【００１３】さらに、本願発明は、特定の配列を有する
ＤＮＡを検出する装置に関し、導電性の物質で修飾され
たＤＮＡプローブが固定された電極；該電極に固定され
たＤＮＡプローブとＤＮＡを含む試料とをインターカレ
ータ存在下に反応させ、ハイブリッドＤＮＡを形成させ
る手段；および、該反応後の電極の電流を検出および／
または測定する手段；とを有する、装置に関する。
ＤＮＡを検出する装置に関し、導電性の物質で修飾され
たＤＮＡプローブが固定された電極；該電極に固定され
たＤＮＡプローブとＤＮＡを含む試料とをインターカレ
ータ存在下に反応させ、ハイブリッドＤＮＡを形成させ
る手段；および、該反応後の電極の電流を検出および／
または測定する手段；とを有する、装置に関する。
【００１４】好適な実施態様においては、反応後の電極
を洗浄する手段を有する。
を洗浄する手段を有する。
【００１５】好適な実施態様においては、前記導電性物
質が酸化還元活性を有する化合物であり、好ましくは、
酸化還元活性を有する化合物がフェロセンである。
質が酸化還元活性を有する化合物であり、好ましくは、
酸化還元活性を有する化合物がフェロセンである。
【００１６】好適な実施態様においては、前記インター
カレータがフェロセン修飾縫い込み型インターカレータ
である。
カレータがフェロセン修飾縫い込み型インターカレータ
である。
【００１７】
【発明の実施の形態】本願発明の方法あるいは装置に用
いられる電極としては、核酸を固定できるものであれば
いづれをも使用し得る。好適には金、グラシーカーボ
ン、炭素などが挙げられる。
いられる電極としては、核酸を固定できるものであれば
いづれをも使用し得る。好適には金、グラシーカーボ
ン、炭素などが挙げられる。
【００１８】ＤＮＡを修飾する導電性の物質としては、
導電性を有する物質であればいずれもが用いられ得る。
特に酸化−還元活性を有する物質が好ましい。フェロセ
ン、カテコールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェ
ナンスリン錯体、ビオローゲンが好ましく、特にフェロ
センが好ましい。
導電性を有する物質であればいずれもが用いられ得る。
特に酸化−還元活性を有する物質が好ましい。フェロセ
ン、カテコールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェ
ナンスリン錯体、ビオローゲンが好ましく、特にフェロ
センが好ましい。
【００１９】プローブＤＮＡとしては、生物試料から抽
出したＤＮＡを制限酵素で切断し、電気泳動による分離
などで精製したＤＮＡ、あるいは化学合成したＤＮＡの
いずれもが用いられ得る。プローブＤＮＡの配列はあら
かじめ決定しておくことが好ましい。ＤＮＡ配列決定法
は周知である。
出したＤＮＡを制限酵素で切断し、電気泳動による分離
などで精製したＤＮＡ、あるいは化学合成したＤＮＡの
いずれもが用いられ得る。プローブＤＮＡの配列はあら
かじめ決定しておくことが好ましい。ＤＮＡ配列決定法
は周知である。
【００２０】プローブＤＮＡは、導電性の物質と結合さ
せるために、５’あるいは３’末端が例えばアミノ基で
修飾され得る。導電性の物質とＤＮＡとの結合は、当業
者に公知の方法が用いられ得る。５’末端にアミノ基が
導入されたＤＮＡとフェロセンとを例に挙げて説明する
と、ＤＮＡを適当な緩衝液（例えば、炭酸ナトリウム−
炭酸水素ナトリウム緩衝液）に溶解し、これに例えば、
フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを含む有機溶媒（例えば、DMSO）を加えて反応さ
せ、ＨＰＬＣなどを用いて精製することにより、５’末
端側にフェロセンが結合したＤＮＡが得られ得る。
せるために、５’あるいは３’末端が例えばアミノ基で
修飾され得る。導電性の物質とＤＮＡとの結合は、当業
者に公知の方法が用いられ得る。５’末端にアミノ基が
導入されたＤＮＡとフェロセンとを例に挙げて説明する
と、ＤＮＡを適当な緩衝液（例えば、炭酸ナトリウム−
炭酸水素ナトリウム緩衝液）に溶解し、これに例えば、
フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを含む有機溶媒（例えば、DMSO）を加えて反応さ
せ、ＨＰＬＣなどを用いて精製することにより、５’末
端側にフェロセンが結合したＤＮＡが得られ得る。
【００２１】この導電性物質で修飾されたプローブを電
極に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用い
られ得る。例えば、電極が金である場合、ＤＮＡにチオ
ール基を導入し、金と硫黄との金−硫黄配位結合を介し
てＤＮＡが電極に結合され得る。ＤＮＡにチオール基を
導入する方法は、Mizuo MAEDA, Koji NAKANO, Shinji U
CHIDA, and Makoto TAKAGI, Chemistry Letters, 1805-
1808 (1994) あるいはB.A.Connolly, Nucleic Acids Re
s.,13, 4484 (1985) に記載されている。上記の方法で
得られるチオール基を有するＤＮＡを金電極に滴下し、
低温下（例えば４℃）で、数時間放置することにより、
フェロセンで修飾されたＤＮＡが金電極に固定化され得
る。
極に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用い
られ得る。例えば、電極が金である場合、ＤＮＡにチオ
ール基を導入し、金と硫黄との金−硫黄配位結合を介し
てＤＮＡが電極に結合され得る。ＤＮＡにチオール基を
導入する方法は、Mizuo MAEDA, Koji NAKANO, Shinji U
CHIDA, and Makoto TAKAGI, Chemistry Letters, 1805-
1808 (1994) あるいはB.A.Connolly, Nucleic Acids Re
s.,13, 4484 (1985) に記載されている。上記の方法で
得られるチオール基を有するＤＮＡを金電極に滴下し、
低温下（例えば４℃）で、数時間放置することにより、
フェロセンで修飾されたＤＮＡが金電極に固定化され得
る。
【００２２】他の方法として、グラシーカーボンを過マ
ンガン酸カリウムで酸化することにより電極表面にカル
ボン酸を導入し、核酸のアミノ基とアミド結合形成させ
て固定化し得る。グラシーカーボンへの固定化は、Kell
y M. Millan and Susan R. Mikkelsen, Analitical Che
mistry 65, 2317-2323 (1993) に記載されている。
ンガン酸カリウムで酸化することにより電極表面にカル
ボン酸を導入し、核酸のアミノ基とアミド結合形成させ
て固定化し得る。グラシーカーボンへの固定化は、Kell
y M. Millan and Susan R. Mikkelsen, Analitical Che
mistry 65, 2317-2323 (1993) に記載されている。
【００２３】上記で得られた、導電性物質で修飾された
プローブＤＮＡが結合した電極を、ＤＮＡ試料を含む検
体溶液に導入することにより、プローブＤＮＡと相補的
な配列を有するＤＮＡがハイブリダイズし、ハイブリッ
ドＤＮＡが形成される。ＤＮＡをハイブリッドさせる方
法は周知である。
プローブＤＮＡが結合した電極を、ＤＮＡ試料を含む検
体溶液に導入することにより、プローブＤＮＡと相補的
な配列を有するＤＮＡがハイブリダイズし、ハイブリッ
ドＤＮＡが形成される。ＤＮＡをハイブリッドさせる方
法は周知である。
【００２４】本願発明の装置は、好ましくは、反応溶液
を加熱する加熱手段を有する。必要に応じて、冷却手段
を有し得る。加熱により、二本鎖ＤＮＡを解離して一本
鎖とし、プローブとハイブリダイズさせるためである。
を加熱する加熱手段を有する。必要に応じて、冷却手段
を有し得る。加熱により、二本鎖ＤＮＡを解離して一本
鎖とし、プローブとハイブリダイズさせるためである。
【００２５】このハイブリダイゼーションは、インター
カレータの存在下行う。インターカレータが共存する
と、ハイブリダイゼーションの形成が早められると同時
に、生じたハイブリッドＤＮＡを安定化し得る。
カレータの存在下行う。インターカレータが共存する
と、ハイブリダイゼーションの形成が早められると同時
に、生じたハイブリッドＤＮＡを安定化し得る。
【００２６】本願発明に用いられ得るインターカレータ
としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合
物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ビ
オローゲン化合物などが挙げられる。フェロセン、カテ
コールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリ
ン錯体、ビオローゲンなどを導入した縫い込み型インタ
ーカレータなどが好ましく、特に好ましくは、フェロセ
ン修飾縫い込み型インターカレータである。
としては、フェロセン化合物、カテコールアミン化合
物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ビ
オローゲン化合物などが挙げられる。フェロセン、カテ
コールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリ
ン錯体、ビオローゲンなどを導入した縫い込み型インタ
ーカレータなどが好ましく、特に好ましくは、フェロセ
ン修飾縫い込み型インターカレータである。
【００２７】ハイブリダイズ反応液中のインターカレー
タは、数nM〜数mMオーダーの濃度範囲で用いられ得る。
好ましくは0.1mM〜５mMであり、最も好ましくは0.5mMで
ある。
タは、数nM〜数mMオーダーの濃度範囲で用いられ得る。
好ましくは0.1mM〜５mMであり、最も好ましくは0.5mMで
ある。
【００２８】インターカレータは、ハイブリッドＤＮＡ
の層間に侵入し、一種の電荷移動錯体を形成する。ハイ
ブリッドを形成しない場合（つまり一本鎖のままであれ
ば）インターカレーションは起こらない。インターカレ
ーションにより、電極に流れる電流量が変化する。この
電流は（ハイブリダイズにより形成された）二本鎖ＤＮ
Ａにインターカレートしたインターカレータの酸化、還
元によるものである。二本鎖ＤＮＡの形成の程度がイン
ターカレートの程度として検出され得る。従って、この
電流量を検出および／または測定することにより、ハイ
ブリッドＤＮＡの存在が検出され、あるいはハイブリッ
ドＤＮＡの量が測定される。従って、本願発明の装置
は、電流量を検出および／または測定する手段を有す
る。このような手段（装置）としては、サイクリックボ
ルタモグラム、デファレンシャルパルスボルタモグラ
ム、ポテンシオスタットが挙げられる。
の層間に侵入し、一種の電荷移動錯体を形成する。ハイ
ブリッドを形成しない場合（つまり一本鎖のままであれ
ば）インターカレーションは起こらない。インターカレ
ーションにより、電極に流れる電流量が変化する。この
電流は（ハイブリダイズにより形成された）二本鎖ＤＮ
Ａにインターカレートしたインターカレータの酸化、還
元によるものである。二本鎖ＤＮＡの形成の程度がイン
ターカレートの程度として検出され得る。従って、この
電流量を検出および／または測定することにより、ハイ
ブリッドＤＮＡの存在が検出され、あるいはハイブリッ
ドＤＮＡの量が測定される。従って、本願発明の装置
は、電流量を検出および／または測定する手段を有す
る。このような手段（装置）としては、サイクリックボ
ルタモグラム、デファレンシャルパルスボルタモグラ
ム、ポテンシオスタットが挙げられる。
【００２９】電流量の検出／測定に際し、インターカレ
ータ存在下におけるハイブリダイゼーション反応後、電
極を洗浄し、遊離のインターカレータを除いておく。従
って、本願発明の装置は、電極の洗浄手段を有し得る。
ータ存在下におけるハイブリダイゼーション反応後、電
極を洗浄し、遊離のインターカレータを除いておく。従
って、本願発明の装置は、電極の洗浄手段を有し得る。
【００３０】以上のようにして、本願発明の装置に用い
られる、導電性の物質で修飾されたＤＮＡプローブが固
定された電極、該電極に固定されたＤＮＡプローブとＤ
ＮＡを含む試料とをインターカレータ存在下に反応さ
せ、ハイブリッドＤＮＡを形成させる手段、および、該
反応後の電極の電流を検出および／または測定する手段
が提供され、本願発明の装置が作成され得る。
られる、導電性の物質で修飾されたＤＮＡプローブが固
定された電極、該電極に固定されたＤＮＡプローブとＤ
ＮＡを含む試料とをインターカレータ存在下に反応さ
せ、ハイブリッドＤＮＡを形成させる手段、および、該
反応後の電極の電流を検出および／または測定する手段
が提供され、本願発明の装置が作成され得る。
【００３１】特定の配列を有するＤＮＡは、上記の装置
を用いて検出され得る。
を用いて検出され得る。
【００３２】特定の配列を有するＤＮＡを検出する方法
は、例えば上記の作成方法で作成された導電性の物質で
修飾されたＤＮＡプローブが固定された電極と、ＤＮＡ
を含む試料とをインターカレータ存在下に反応させ、該
ＤＮＡプローブとＤＮＡとのハイブリッドＤＮＡを形成
させる。ハイブリダイズの条件は周知である。より厳密
に特定する場合は、用いるプローブの塩基組成あるいは
長さ等によって、ハイブリダイズの条件、適切な塩濃度
と時間などが設定され得る。
は、例えば上記の作成方法で作成された導電性の物質で
修飾されたＤＮＡプローブが固定された電極と、ＤＮＡ
を含む試料とをインターカレータ存在下に反応させ、該
ＤＮＡプローブとＤＮＡとのハイブリッドＤＮＡを形成
させる。ハイブリダイズの条件は周知である。より厳密
に特定する場合は、用いるプローブの塩基組成あるいは
長さ等によって、ハイブリダイズの条件、適切な塩濃度
と時間などが設定され得る。
【００３３】ハイブリダイズ反応後、電極を洗浄し、不
要なインターカレータを洗い流し、電極の電流量を検出
および／または測定することにより、ハイブリダイズし
たＤＮＡを検出および／または測定する。
要なインターカレータを洗い流し、電極の電流量を検出
および／または測定することにより、ハイブリダイズし
たＤＮＡを検出および／または測定する。
【００３４】以下、実施例をあげて説明するが、本願発
明が実施例のみに限定されないことはいうまでもない。
明が実施例のみに限定されないことはいうまでもない。
【００３５】
（Ａ：フェロセンで修飾されたＤＮＡプローブが固定さ
れた電極の作成） （１）フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルの合成 フェロセンカルボン酸0.5g(2.2mM)とＮ−ヒドロキシス
クシンイミド0.29g(2.5mM）の20mlジオキサン溶液に、
撹拌下ジシクロヘキシルカルボジイミド0.5g(2.5mM)の5
mlジオキサン溶液を添加し、２４時間室温で撹拌した。
反応混合物中に析出した成分のうち、シリカゲルクロマ
トグラフィー処理により暗黄色成分を分取した。暗黄色
成分の物性は下記の通りである。
れた電極の作成） （１）フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルの合成 フェロセンカルボン酸0.5g(2.2mM)とＮ−ヒドロキシス
クシンイミド0.29g(2.5mM）の20mlジオキサン溶液に、
撹拌下ジシクロヘキシルカルボジイミド0.5g(2.5mM)の5
mlジオキサン溶液を添加し、２４時間室温で撹拌した。
反応混合物中に析出した成分のうち、シリカゲルクロマ
トグラフィー処理により暗黄色成分を分取した。暗黄色
成分の物性は下記の通りである。
【００３６】
【表１】
【００３７】（２）フェロセン修飾ＤＮＡプローブの合
成 ＤＮＡプローブとして、チミジンの２０マー（Ｔ20Ａ）
成 ＤＮＡプローブとして、チミジンの２０マー（Ｔ20Ａ）
【００３８】
【化１】
【００３９】を合成した。合成は、ＤＮＡ自動合成装置
（アプライドバイオシステムズ社製のModel391 PCR-MAT
ETM/PCR-MATE EP）を用いて行った。Ｔ20Ａ26nmol（Ｅ
260＝8800M-1cm-1として算出）を1.3mM炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH9.0）20μlに溶解し
た。これに上記（１）で得られたフェロセンカルボン酸
N-ヒドロキシスクシンイミドエステル1.3μmolを含む6m
lのＤＭＳＯ溶液を加え、室温で一晩振とうした。反応
混合物をTEAA（triethylamine-acetic acid 緩衝液）
（ｐＨ7.0）で1mlに希釈した後、NAP-10カラム（Pharma
cia Sephadex G-25）によりTEAA緩衝液を溶離液として
保持容量1mlから2.5mlの部分を分取した。これを減圧濃
縮（40℃以下）し、逆相HPLC（LiChrospher 100RP‐18
(e)/Cica-MERCK）で分取した。収量は7.4nmol（29％）
であった。
（アプライドバイオシステムズ社製のModel391 PCR-MAT
ETM/PCR-MATE EP）を用いて行った。Ｔ20Ａ26nmol（Ｅ
260＝8800M-1cm-1として算出）を1.3mM炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH9.0）20μlに溶解し
た。これに上記（１）で得られたフェロセンカルボン酸
N-ヒドロキシスクシンイミドエステル1.3μmolを含む6m
lのＤＭＳＯ溶液を加え、室温で一晩振とうした。反応
混合物をTEAA（triethylamine-acetic acid 緩衝液）
（ｐＨ7.0）で1mlに希釈した後、NAP-10カラム（Pharma
cia Sephadex G-25）によりTEAA緩衝液を溶離液として
保持容量1mlから2.5mlの部分を分取した。これを減圧濃
縮（40℃以下）し、逆相HPLC（LiChrospher 100RP‐18
(e)/Cica-MERCK）で分取した。収量は7.4nmol（29％）
であった。
【００４０】（３）フェロセン修飾ＤＮＡプローブのチ
オール化 フェロセン修飾ＤＮＡのチオール化は、公知の方法、B.
A.Connolly, NucleicAcids Res.,13, 4484 (1985) に従
って行った。
オール化 フェロセン修飾ＤＮＡのチオール化は、公知の方法、B.
A.Connolly, NucleicAcids Res.,13, 4484 (1985) に従
って行った。
【００４１】（４）フェロセン修飾プローブＤＮＡの電
極表面への固定化 （３）で得られたチオール基を導入したｄＴ20量体溶液
1μl（3.4X10-10mol）を、金電極（0.79mm2）に滴下
し、４℃で１時間放置した。その後電極を水で洗浄し、
洗浄水からチオール基導入ｄＴ20量体を回収した。HPLC
にて、反応しなかったチオール基導入ｄＴ20量体を測定
して、電極に固定されたｄＴ20量体量を算出すると2.9X
10-11mol（29pmol）であった。これをトリス塩酸−EDTA
（pH7.0）緩衝液中にて保存した。
極表面への固定化 （３）で得られたチオール基を導入したｄＴ20量体溶液
1μl（3.4X10-10mol）を、金電極（0.79mm2）に滴下
し、４℃で１時間放置した。その後電極を水で洗浄し、
洗浄水からチオール基導入ｄＴ20量体を回収した。HPLC
にて、反応しなかったチオール基導入ｄＴ20量体を測定
して、電極に固定されたｄＴ20量体量を算出すると2.9X
10-11mol（29pmol）であった。これをトリス塩酸−EDTA
（pH7.0）緩衝液中にて保存した。
【００４２】（Ｂ：フェロセン修飾縫い込み型インター
カレータの調製）フェロセン修飾縫い込み型インターカ
レータは、上記Ａ（１）で調製したフェロセンカルボン
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、下記の方
法により作成したアミン体とを用いて合成した。
カレータの調製）フェロセン修飾縫い込み型インターカ
レータは、上記Ａ（１）で調製したフェロセンカルボン
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、下記の方
法により作成したアミン体とを用いて合成した。
【００４３】（１）アミン体の合成 1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物2g（7.45
mol）と１，４−（３−アミノプロピル）ピペラジン40m
l（0.194mmol）をTHF30ml中で８時間還流した。室温ま
で冷やした後それをそのまま、へキサンに再沈澱させ、
結晶を濃過により回収した。さらに最少量のクロロフォ
ルムに溶解させ工一テルに再沈澱させた。沈澱物を除去
後、エーテルを減圧除去する。クロロフォルムに再溶解
させ、ヘキサンによる再沈澱後、結晶を回収した。収量
は330mg、収率52％であった。
mol）と１，４−（３−アミノプロピル）ピペラジン40m
l（0.194mmol）をTHF30ml中で８時間還流した。室温ま
で冷やした後それをそのまま、へキサンに再沈澱させ、
結晶を濃過により回収した。さらに最少量のクロロフォ
ルムに溶解させ工一テルに再沈澱させた。沈澱物を除去
後、エーテルを減圧除去する。クロロフォルムに再溶解
させ、ヘキサンによる再沈澱後、結晶を回収した。収量
は330mg、収率52％であった。
【００４４】
【表２】
【００４５】（２）フェロセン修飾縫い込み型インター
カレータの合成 上記Ａ（１）で調製したフェロセンカルボン酸Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルと、Ｂ（１）の方法で調
製したアミン体（NaDI）とを反応させて合成した。
カレータの合成 上記Ａ（１）で調製したフェロセンカルボン酸Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルと、Ｂ（１）の方法で調
製したアミン体（NaDI）とを反応させて合成した。
【００４６】アミン体300mg（0.474mol）と上記Ａ
（１）で調製したエステル600mg（1.8mmole）とをクロ
ロフォルム30mlに溶解した。これを室温で５０時間撹拌
した。これをシリカゲルのTLCにかけメタノールを溶媒
として展開した。原点にNaDI、Rf値0.8にフェロセンカル
ボン酸N-ヒドロキシンイミドエステル、Rf値0.2にブロ
ードな目的物と思われるスポットが確認された。反応溶
液を減圧留去した後、メタノールに溶かし、展開溶媒に
メタノールを用いてシリカゲルカラムで展開し、目的物
と思われる画分を得た。メタノールを減圧留去し、クロ
ロフォルムに溶かした。ろ過後、ろ液を濃縮し、水で再
沈澱させ、アセトンて再結晶し、結晶を回収した。アセ
トンで再結晶した後のTLC(MeOH)はRf値0.2のスポットの
みであった。
（１）で調製したエステル600mg（1.8mmole）とをクロ
ロフォルム30mlに溶解した。これを室温で５０時間撹拌
した。これをシリカゲルのTLCにかけメタノールを溶媒
として展開した。原点にNaDI、Rf値0.8にフェロセンカル
ボン酸N-ヒドロキシンイミドエステル、Rf値0.2にブロ
ードな目的物と思われるスポットが確認された。反応溶
液を減圧留去した後、メタノールに溶かし、展開溶媒に
メタノールを用いてシリカゲルカラムで展開し、目的物
と思われる画分を得た。メタノールを減圧留去し、クロ
ロフォルムに溶かした。ろ過後、ろ液を濃縮し、水で再
沈澱させ、アセトンて再結晶し、結晶を回収した。アセ
トンで再結晶した後のTLC(MeOH)はRf値0.2のスポットの
みであった。
【００４７】
【表３】
【００４８】上記回収物質の収量は33mgで収率は7％で
あった。得られたインターカレータは382nmに吸収極大
を有していた。
あった。得られたインターカレータは382nmに吸収極大
を有していた。
【００４９】（Ｃ：電極の性能評価）プローブＤＮＡに
相補的に結合するＤＮＡフラグメントとしては合成オリ
ゴヌクレオチドｄＡ20を用いた。ｄＡ2029pmolと上記
(B)で作成したインターカレーター0.5mMとを含む30％DM
SO-41mM（AcOK-AcOH）緩衝液（pH5.2）に、フェロセン
修飾プローブＤＮＡ（ｄＴ20）が表面に固定化された電
極を浸した。反応は、40℃、10分間行った。
相補的に結合するＤＮＡフラグメントとしては合成オリ
ゴヌクレオチドｄＡ20を用いた。ｄＡ2029pmolと上記
(B)で作成したインターカレーター0.5mMとを含む30％DM
SO-41mM（AcOK-AcOH）緩衝液（pH5.2）に、フェロセン
修飾プローブＤＮＡ（ｄＴ20）が表面に固定化された電
極を浸した。反応は、40℃、10分間行った。
【００５０】反応終了後電極を引き上げ、電極を5秒間
30％DMSO-41mM（AcOK-ACOH）緩衝液（pH 5.2）で洗浄
し、遊離インターカレーターを除去した。
30％DMSO-41mM（AcOK-ACOH）緩衝液（pH 5.2）で洗浄
し、遊離インターカレーターを除去した。
【００５１】この電極のサイクリックボルタモグラムを
測定したのが、図１である。測定は、41mM酢酸カリウム
−酢酸緩衝液（pH 5.2）、30％DMSO、スキャン速度100m
V/secの条件で行った。
測定したのが、図１である。測定は、41mM酢酸カリウム
−酢酸緩衝液（pH 5.2）、30％DMSO、スキャン速度100m
V/secの条件で行った。
【００５２】本願発明の29pmolのdT20が結合した電極の
フェロセンインターカレータに由来する619mVの増加電
流は0.15μAであった。従って、dA20がdT20に結合する
ことにより、つまり、電極に固定化されたプローブＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡが結合することにより、特定の配列
が検出できることがわかる。
フェロセンインターカレータに由来する619mVの増加電
流は0.15μAであった。従って、dA20がdT20に結合する
ことにより、つまり、電極に固定化されたプローブＤＮ
Ａに相補的なＤＮＡが結合することにより、特定の配列
が検出できることがわかる。
【００５３】この電極を用い、種々の濃度のｄＡ20と上
記(B)で作成したインターカレーター0.5mMとを含む30％
DMSO-41mM（AcOK-AcOH）緩衝液（pH5.2）に、フェロセ
ン修飾プローブＤＮＡ（ｄＴ20）が表面に固定化された
電極を浸した。反応は、40℃、10分間行った。
記(B)で作成したインターカレーター0.5mMとを含む30％
DMSO-41mM（AcOK-AcOH）緩衝液（pH5.2）に、フェロセ
ン修飾プローブＤＮＡ（ｄＴ20）が表面に固定化された
電極を浸した。反応は、40℃、10分間行った。
【００５４】反応終了後電極を引き上げ、電極を5秒間
30％DMSO-41mM（AcOK-ACOH）緩衝液（pH 5.2）で洗浄
し、遊離インターカレーターを除去した。
30％DMSO-41mM（AcOK-ACOH）緩衝液（pH 5.2）で洗浄
し、遊離インターカレーターを除去した。
【００５５】この電極のサイクリックボルタモグラムを
測定した結果を図２に示す。増加電流の検出限界から、
上記電極により検出可能なＤＮＡの検出限界は、数fmol
と推定された。この図から、特定の配列を有するＤＮＡ
の検出および定量が可能であることがわかる。
測定した結果を図２に示す。増加電流の検出限界から、
上記電極により検出可能なＤＮＡの検出限界は、数fmol
と推定された。この図から、特定の配列を有するＤＮＡ
の検出および定量が可能であることがわかる。
【００５６】このＤＮＡ検出限界は現行のＲＩ法、蛍光
ラベル法、発光法と比較して同等あるいはより高感度で
ある。
ラベル法、発光法と比較して同等あるいはより高感度で
ある。
【００５７】
【発明の効果】導電性を有する物質で修飾されたプロー
ブＤＮＡを電極に固定化し、インターカレータ存在下、
ＤＮＡ試料と反応させた後、電極の電流を検出および／
または測定することにより、特定の配列を有するＤＮＡ
が検出および／または測定される。この方法により、従
来のＲＩを用いるオートラジオグラフィーのように数日
を要せず、リアルタイムで検出することが可能となる。
そしてオートラジオグラフィーで必須の、現像の手間が
不要である。さらに、オートラジオグラフィーては感光
度不足が現像によって初めて確認され、感光度が不足す
る時には再度フィルムを感光させる必要があり、時間的
ロスが生じる。本発明では、このような時間的ロスが皆
無となる。さらに、被験ＤＮＡを制限酵素処理、電気泳
動による分画処理などが不要になるため、分画装置など
を要せず、簡便に特定の配列を有するＤＮＡが検出、測
定され得る。
ブＤＮＡを電極に固定化し、インターカレータ存在下、
ＤＮＡ試料と反応させた後、電極の電流を検出および／
または測定することにより、特定の配列を有するＤＮＡ
が検出および／または測定される。この方法により、従
来のＲＩを用いるオートラジオグラフィーのように数日
を要せず、リアルタイムで検出することが可能となる。
そしてオートラジオグラフィーで必須の、現像の手間が
不要である。さらに、オートラジオグラフィーては感光
度不足が現像によって初めて確認され、感光度が不足す
る時には再度フィルムを感光させる必要があり、時間的
ロスが生じる。本発明では、このような時間的ロスが皆
無となる。さらに、被験ＤＮＡを制限酵素処理、電気泳
動による分画処理などが不要になるため、分画装置など
を要せず、簡便に特定の配列を有するＤＮＡが検出、測
定され得る。
【図１】本願発明の電極のサイクリックボルタモグラム
を測定した図である。
を測定した図である。
【図２】本願発明の電極の性能を示す図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 特定の配列を有するＤＮＡを検出する方
法であって、該方法は、導電性の物質で修飾されたＤＮ
Ａプローブが固定された電極と、ＤＮＡを含む試料とを
インターカレータ存在下に反応させ、該ＤＮＡプローブ
とＤＮＡとのハイブリッドＤＮＡを形成させる工程；お
よび、該反応後の電極の電流を検出および／または測定
する工程；を有する、方法。 - 【請求項２】 前記導電性物質が酸化還元活性を有する
化合物である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記インターカレータが、フェロセン修
飾縫い込み型インターカレータである、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項４】 特定の配列を有するＤＮＡを検出する装
置であって、該装置は、導電性の物質で修飾されたＤＮ
Ａプローブが固定された電極；該電極に固定されたＤＮ
ＡプローブとＤＮＡを含む試料とをインターカレータ存
在下に反応させ、ハイブリッドＤＮＡを形成させる手
段；および、 該反応後の電極の電流を検出および／または測定する手
段；を有する、装置。 - 【請求項５】 前記導電性物質が酸化還元活性を有する
化合物である、請求項４に記載の装置。 - 【請求項６】 前記インターカレータがフェロセン修飾
縫い込み型インターカレータである、請求項４に記載の
装置。 - 【請求項７】 導電性の物質で修飾されたＤＮＡプロー
ブが電極に固定されている、特定のＤＮＡ配列を検出す
るための電極。
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|---|---|---|---|
| JP10295796A JP3233851B2 (ja) | 1996-04-24 | 1996-04-24 | 遺伝子の電気化学的検出法およびその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09288080A true JPH09288080A (ja) | 1997-11-04 |
| JP3233851B2 JP3233851B2 (ja) | 2001-12-04 |
Family
ID=14341288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP10295796A Expired - Fee Related JP3233851B2 (ja) | 1996-04-24 | 1996-04-24 | 遺伝子の電気化学的検出法およびその装置 |
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| WO1999067425A3 (en) * | 1998-06-23 | 2000-02-03 | Clinical Micro Sensors Inc | Binding acceleration techniques for the detection of analytes |
| US6294670B1 (en) | 1998-08-11 | 2001-09-25 | Kyushu University | Probe for detecting a highly ordered structural site of a single stranded nucleic acid of a gene, and a method and a device for detecting the same |
| WO2002053571A1 (fr) * | 2000-12-28 | 2002-07-11 | Tum Gene, Inc. | Derives hydrocarbones polycycliques de type ferrocene, derives naphtalenediimide de type ferrocene, procede de production correspondant, agents intercalants comprenant ces derives et procede de detection electrochimique de gene |
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| US6916614B1 (en) | 1999-10-20 | 2005-07-12 | Tum Gene, Inc. | Gene detecting chip, detector, and detecting method |
| JP2006506644A (ja) * | 2002-11-15 | 2006-02-23 | アプレラ コーポレイション | 核酸配列検出 |
| US7097974B1 (en) | 1998-08-28 | 2006-08-29 | Febit Biotech Gmbh | Support for a method for determining an analyte and a method for producing the support |
| EP1120646A4 (en) * | 1999-08-06 | 2006-09-06 | Toppan Printing Co Ltd | Method for detecting single nucleotide polymorphisms (SNP) and point mutations in genes, detection device and detection chip |
| JP2007218875A (ja) * | 2006-02-20 | 2007-08-30 | Shimadzu Corp | 反応キット処理装置 |
| JP2008151800A (ja) * | 2008-01-21 | 2008-07-03 | Toshiba Corp | 塩基配列判定方法及び塩基配列判定システム |
| JP2008157959A (ja) * | 2008-01-21 | 2008-07-10 | Toshiba Corp | 塩基配列判定方法及び塩基配列判定プログラム |
| US7470540B2 (en) | 2000-10-17 | 2008-12-30 | Febit Ag | Method and device for the integrated synthesis and analysis of analytes on a support |
| US7491492B2 (en) | 2002-07-30 | 2009-02-17 | Toppan Printing Co., Ltd. | Method of detecting nucleotide mutations |
| WO2009128346A1 (ja) | 2008-04-18 | 2009-10-22 | 国立大学法人九州工業大学 | 電極モジュール |
| US8150635B2 (en) | 2005-03-18 | 2012-04-03 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Method and an apparatus for determining nucleotide sequence, and a computer program product to be executed by the apparatus |
| US8404441B2 (en) | 2010-04-19 | 2013-03-26 | Empire Technology Development Llc | DNA intercalator detection |
| CN109136336A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-04 | 青岛农业大学 | 一种纸基miRNA电化学传感器的制备方法及应用 |
| JPWO2020066474A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2021-09-09 | 株式会社ヨコオ | 核酸のハイブリダイゼーション度合を検出する方法、装置及びプログラム |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006003991A1 (ja) | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | 遺伝子検出方法、及び挿入剤 |
| CN104237354B (zh) * | 2014-10-20 | 2016-08-31 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | Ndm-1 dna探针修饰的电极及其制备方法和应用 |
-
1996
- 1996-04-24 JP JP10295796A patent/JP3233851B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| US7737088B1 (en) | 1998-08-28 | 2010-06-15 | Febit Holding Gmbh | Method and device for producing biochemical reaction supporting materials |
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| CN100402661C (zh) * | 1999-08-06 | 2008-07-16 | 内田和彦 | 基因的一个碱基置换snp与点突变的检测方法、检测装置及其检测芯片 |
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