JPH09291A - 無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法 - Google Patents
無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法Info
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- JPH09291A JPH09291A JP14854495A JP14854495A JPH09291A JP H09291 A JPH09291 A JP H09291A JP 14854495 A JP14854495 A JP 14854495A JP 14854495 A JP14854495 A JP 14854495A JP H09291 A JPH09291 A JP H09291A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 無細胞系において活性型の蛋白質を合成する
方法を提供する。 【構成】 合成反応液から透析処理あるいは塩析処理ま
たはそれらの組合せによって還元剤を除去し、酸化条件
とすることにより、目的蛋白質に正しい構造を保持さ
せ、比活性を上昇させる。
方法を提供する。 【構成】 合成反応液から透析処理あるいは塩析処理ま
たはそれらの組合せによって還元剤を除去し、酸化条件
とすることにより、目的蛋白質に正しい構造を保持さ
せ、比活性を上昇させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は無細胞蛋白質合成系にお
いて、特に、蛋白質分子内にジスルフィド結合を有する
蛋白質を合成する際に、正しいジスルフィド結合を有す
る活性型蛋白質を合成する方法に関する。
いて、特に、蛋白質分子内にジスルフィド結合を有する
蛋白質を合成する際に、正しいジスルフィド結合を有す
る活性型蛋白質を合成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、無細胞系による蛋白質合成方法
は、主として連続系を用いた大量生産手段、あるいはバ
ッチ法を用いた遺伝子解析の手段として提案されている
（特表平５−５０５０９５号、特表平６−５０３４７７
号）。これらの方法によって、目的の蛋白質を効率的に
得ることが可能になった。
は、主として連続系を用いた大量生産手段、あるいはバ
ッチ法を用いた遺伝子解析の手段として提案されている
（特表平５−５０５０９５号、特表平６−５０３４７７
号）。これらの方法によって、目的の蛋白質を効率的に
得ることが可能になった。
【０００３】しかし、無細胞系において、合成された蛋
白質の種類によっては、活性がないかまたは低いものが
多いという問題点があった。
白質の種類によっては、活性がないかまたは低いものが
多いという問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記の問題点を解決す
るために、無細胞系により合成された蛋白質の形態がど
のようになっているかを３個のジスルフィド結合を有す
るヒト神経成長因子（ｈＮＧＦ）を用いて検討した。合
成されたｈＮＧＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結
果、ｈＮＧＦ蛋白質分子内に６個あるシステインはジス
ルフィド結合を形成しておらず、フリーの状態になって
いることが判明した。
るために、無細胞系により合成された蛋白質の形態がど
のようになっているかを３個のジスルフィド結合を有す
るヒト神経成長因子（ｈＮＧＦ）を用いて検討した。合
成されたｈＮＧＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結
果、ｈＮＧＦ蛋白質分子内に６個あるシステインはジス
ルフィド結合を形成しておらず、フリーの状態になって
いることが判明した。
【０００５】このことは、無細胞蛋白質合成系では、反
応試薬としてＤＴＴ（ジチオトレイトール）等の還元剤
を添加しており、これらによって反応系が還元状態にな
っているため、ジスルフィド結合を形成できないのでは
ないかと考えられた。
応試薬としてＤＴＴ（ジチオトレイトール）等の還元剤
を添加しており、これらによって反応系が還元状態にな
っているため、ジスルフィド結合を形成できないのでは
ないかと考えられた。
【０００６】このような状態の蛋白質は凝集して不溶性
顆粒を形成し易いし、間違ったジスルフィド結合が形成
されることによって比活性が低下する原因となる。つま
り、細胞の蛋白質合成装置であるリボゾームで合成され
た紐状の蛋白質が活性の有る高次構造を形成できるよう
にすることが必要になる。このためには、無細胞蛋白質
合成系に人為的に添加された還元剤を蛋白質合成後、除
去し、正しいジスルフィド結合を形成させるために蛋白
質溶液を酸化条件下に保持する必要がある。
顆粒を形成し易いし、間違ったジスルフィド結合が形成
されることによって比活性が低下する原因となる。つま
り、細胞の蛋白質合成装置であるリボゾームで合成され
た紐状の蛋白質が活性の有る高次構造を形成できるよう
にすることが必要になる。このためには、無細胞蛋白質
合成系に人為的に添加された還元剤を蛋白質合成後、除
去し、正しいジスルフィド結合を形成させるために蛋白
質溶液を酸化条件下に保持する必要がある。
【０００７】本発明は、合成反応後の目的蛋白質を含ん
だ反応液から還元剤を除去し、酸化条件下におくことに
より、比活性を上昇させる方法を提供するものである。
だ反応液から還元剤を除去し、酸化条件下におくことに
より、比活性を上昇させる方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】蛋白質合成反応液に含ま
れている還元剤の分子量は、例えばＤＴＴが１５４であ
り、低分子物質であるため、透析処理や塩析処理により
除去することが可能である。
れている還元剤の分子量は、例えばＤＴＴが１５４であ
り、低分子物質であるため、透析処理や塩析処理により
除去することが可能である。
【０００９】透析処理は、半透膜を用いて低分子物質を
蛋白質のような高分子物質溶液から除去する操作であ
り、セロファンチューブやコロジオン膜等が使用でき
る。また、限外濾過によって低分子物質を除去すること
も可能である。
蛋白質のような高分子物質溶液から除去する操作であ
り、セロファンチューブやコロジオン膜等が使用でき
る。また、限外濾過によって低分子物質を除去すること
も可能である。
【００１０】本発明の実施例でも、透析処理はセロファ
ンチューブを用い、セロファンチューブ内に無細胞蛋白
質合成反応液を入れ、透析外液としてｐＨ１−１０の範
囲の緩衝液を用いて、透析処理を行う。緩衝液は通常２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）が用いられるが、特
に、これに限定されるものではない。透析処理時の温度
は、４−６０℃でよいが、望ましくは２５℃が良く、透
析時間は、目的蛋白質の種類や無細胞蛋白質合成反応液
の種類によって異なるが、２−１２０時間、望ましくは
７２時間が良い。この透析中に還元剤が除かれていくに
従って、蛋白質溶液は徐々に酸化状態になり、ジスルフ
ィド結合が形成される。
ンチューブを用い、セロファンチューブ内に無細胞蛋白
質合成反応液を入れ、透析外液としてｐＨ１−１０の範
囲の緩衝液を用いて、透析処理を行う。緩衝液は通常２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）が用いられるが、特
に、これに限定されるものではない。透析処理時の温度
は、４−６０℃でよいが、望ましくは２５℃が良く、透
析時間は、目的蛋白質の種類や無細胞蛋白質合成反応液
の種類によって異なるが、２−１２０時間、望ましくは
７２時間が良い。この透析中に還元剤が除かれていくに
従って、蛋白質溶液は徐々に酸化状態になり、ジスルフ
ィド結合が形成される。
【００１１】塩析処理は、蛋白質等の高分子電解質溶液
に大量の塩類を加えて溶解度を低下させることにより、
目的の蛋白質を沈殿させる操作であり、これによって、
蛋白質の分別ができると共に、還元剤を除去可能であ
る。塩類としては、リン酸塩、硫酸塩が利用できるが、
望ましくは硫酸アンモニウムが良い。硫酸アンモニウム
の最終濃度は、２０−８０％の範囲が用いられるが、目
的の蛋白質の性質によって適切な最終濃度を選択する必
要がある。
に大量の塩類を加えて溶解度を低下させることにより、
目的の蛋白質を沈殿させる操作であり、これによって、
蛋白質の分別ができると共に、還元剤を除去可能であ
る。塩類としては、リン酸塩、硫酸塩が利用できるが、
望ましくは硫酸アンモニウムが良い。硫酸アンモニウム
の最終濃度は、２０−８０％の範囲が用いられるが、目
的の蛋白質の性質によって適切な最終濃度を選択する必
要がある。
【００１２】なお、塩析による蛋白質の沈殿分離後、沈
殿した蛋白質を緩衝液に溶解した後、透析処理によって
塩析に使用した塩類を除去することが必要である。この
際の透析処理は、上記の透析処理と同様に実施できる
が、透析時間の短縮が可能である。ジスルフィド結合の
形成は、塩析による蛋白質沈殿中や塩類除去のための透
析処理中に徐々に行われる。
殿した蛋白質を緩衝液に溶解した後、透析処理によって
塩析に使用した塩類を除去することが必要である。この
際の透析処理は、上記の透析処理と同様に実施できる
が、透析時間の短縮が可能である。ジスルフィド結合の
形成は、塩析による蛋白質沈殿中や塩類除去のための透
析処理中に徐々に行われる。
【００１３】無細胞蛋白質合成反応後に、還元剤を透析
処理または塩析処理によって除去することにより、蛋白
質溶液は酸化状態になり、ジスルフィド結合が形成され
るのであるが、これらの処理を組み合わせることによっ
て、より効率的な還元剤除去と酸化反応が可能である。
また、塩析処理は目的の蛋白質を特異的に沈殿分離する
ことができるため、蛋白質を精製することになり、有利
である。
処理または塩析処理によって除去することにより、蛋白
質溶液は酸化状態になり、ジスルフィド結合が形成され
るのであるが、これらの処理を組み合わせることによっ
て、より効率的な還元剤除去と酸化反応が可能である。
また、塩析処理は目的の蛋白質を特異的に沈殿分離する
ことができるため、蛋白質を精製することになり、有利
である。
【００１４】塩析処理後に透析処理をする組合せの場
合、透析による蛋白質の酸化が主体となるが、後述する
ように、処理に要する時間を短縮する上でのメリットが
大きい。
合、透析による蛋白質の酸化が主体となるが、後述する
ように、処理に要する時間を短縮する上でのメリットが
大きい。
【００１５】本発明は、無細胞蛋白質合成系において、
回分式または連続式いずれの場合においても適用可能で
ある。連続式では連続式の限外濾過を用いることによ
り、効率的な蛋白質合成が可能になる。
回分式または連続式いずれの場合においても適用可能で
ある。連続式では連続式の限外濾過を用いることによ
り、効率的な蛋白質合成が可能になる。
【００１６】
【作用】本発明では、無細胞系による蛋白質合成反応後
の反応液から透析処理あるいは塩析処理後に透析処理を
する組合せによって還元剤を除去し、かつ酸化条件とす
ることができるので、目的蛋白質に正しい構造を保持さ
せることができ、その比活性の上昇が可能になる。
の反応液から透析処理あるいは塩析処理後に透析処理を
する組合せによって還元剤を除去し、かつ酸化条件とす
ることができるので、目的蛋白質に正しい構造を保持さ
せることができ、その比活性の上昇が可能になる。
【００１７】
【実施例】無細胞蛋白質合成系としてはＺｕｂａｙらが
開発した大腸菌のＳ−３０抽出液を用いる転写翻訳共役
系を使用し、ｈＮＧＦを合成した。合成後の反応液、透
析処理、硫安塩析処理後の反応液に含まれるｈＮＧＦの
量は抗ヒト抗体を用いたウエスタンブロッティングの発
色量から換算した。また、比活性はニワトリ胚後根神経
節から単離した培養細胞系の神経突起の伸展によって測
定した。なお、標品として市販のヒト神経成長因子（コ
スモバイオ社）を用いた。
開発した大腸菌のＳ−３０抽出液を用いる転写翻訳共役
系を使用し、ｈＮＧＦを合成した。合成後の反応液、透
析処理、硫安塩析処理後の反応液に含まれるｈＮＧＦの
量は抗ヒト抗体を用いたウエスタンブロッティングの発
色量から換算した。また、比活性はニワトリ胚後根神経
節から単離した培養細胞系の神経突起の伸展によって測
定した。なお、標品として市販のヒト神経成長因子（コ
スモバイオ社）を用いた。
【００１８】（１）大腸菌Ｓ−３０抽出液の調製 Ｚｕｂａｙらの方法によって、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子
を挿入した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）より、Ｓ−３０
抽出液を調製した。
を挿入した大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）より、Ｓ−３０
抽出液を調製した。
【００１９】（２）プラスミドＤＮＡ 高効率で転写を行うＴ７プロモータの下流にｈＮＧＦ遺
伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ、ｐＴ７ＭＮＧＦを
鋳型として用いた。
伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ、ｐＴ７ＭＮＧＦを
鋳型として用いた。
【００２０】（３）合成反応 無細胞蛋白質合成反応は、容量１００μｌ、３７℃，２
時間で行った。反応溶液として、１６．８μｌのＳ−３
０抽出液、２４μｇのプラスミドＤＮＡ、１７μｇのｔ
ＲＮＡ、５６．４ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ
８．４）、２．７５ｍＭのＤＴＴ、１．２２ｍＭのＡＴ
Ｐ、０．７５ｍＭのＣＴＰ・ＧＴＰ・ＵＴＰ、２７．０
ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．６４ｍＭのｃＡ
ＭＰ、３４．６μｇのフォリン酸、１．９％のポリエチ
レングリコール６０００、１１．７ｍＭの酢酸マグネシ
ウム、３６ｍＭの酢酸アンモニウム、７２ｍＭの酢酸カ
リウム、および０．２ｍＭの蛋白質を構成する２０種類
のアミノ酸から成る混合物を用いた。
時間で行った。反応溶液として、１６．８μｌのＳ−３
０抽出液、２４μｇのプラスミドＤＮＡ、１７μｇのｔ
ＲＮＡ、５６．４ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ
８．４）、２．７５ｍＭのＤＴＴ、１．２２ｍＭのＡＴ
Ｐ、０．７５ｍＭのＣＴＰ・ＧＴＰ・ＵＴＰ、２７．０
ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．６４ｍＭのｃＡ
ＭＰ、３４．６μｇのフォリン酸、１．９％のポリエチ
レングリコール６０００、１１．７ｍＭの酢酸マグネシ
ウム、３６ｍＭの酢酸アンモニウム、７２ｍＭの酢酸カ
リウム、および０．２ｍＭの蛋白質を構成する２０種類
のアミノ酸から成る混合物を用いた。
【００２１】（４）透析 合成反応後、ただちに反応液を氷冷し、続いて透析用セ
ロファンチューブに移した。その後、１０００倍の液量
の２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析処理
を２５℃、７２時間行い、ｈＮＧＦ蛋白質を得た。。な
お、透析外液は１２時間ごとに全量交換した。
ロファンチューブに移した。その後、１０００倍の液量
の２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析処理
を２５℃、７２時間行い、ｈＮＧＦ蛋白質を得た。。な
お、透析外液は１２時間ごとに全量交換した。
【００２２】（５）硫安塩析 合成反応後、ただちに反応液を氷冷し、最終濃度４０％
となるように硫酸アンモニウムを加え、１２時間、４℃
にて静置した。塩析した反応液を１５０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間遠心し、沈殿物を回収し、２０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
となるように硫酸アンモニウムを加え、１２時間、４℃
にて静置した。塩析した反応液を１５０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間遠心し、沈殿物を回収し、２０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
【００２３】（６）硫安塩析後に透析 合成反応後、ただちに反応液を氷冷し、最終濃度４０％
となるように硫酸アンモニウムを加え、１２時間、４℃
にて静置した。塩析した反応液を１５０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間遠心し、沈殿物を回収し、２０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。さらに１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清液を回収した。回収
した上清液を１０００倍の液量の２０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に対して２５℃、１２時間、透析処理し
てｈＮＧＦ蛋白質を得た。
となるように硫酸アンモニウムを加え、１２時間、４℃
にて静置した。塩析した反応液を１５０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間遠心し、沈殿物を回収し、２０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。さらに１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清液を回収した。回収
した上清液を１０００倍の液量の２０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に対して２５℃、１２時間、透析処理し
てｈＮＧＦ蛋白質を得た。
【００２４】（７）生物活性 ニワトリ８日胚の後根神経節由来の神経細胞の初代培養
系を用いて、無細胞系によって合成されたｈＮＧＦの生
物活性を測定した。神経細胞に対し、標品、一定液量の
反応液、透析処理後の反応液、硫安塩析処理後の反応液
を投与し、投与から７２時間後の神経線維の突起を有す
る細胞数を計数し、該当する標品濃度から各反応液中の
活性を有するｈＮＧＦ量を算出した。この際、投与した
反応液中に含まれるｈＮＧＦの全量は抗ｈＮＧＦ抗体を
用いたウエスタンブロッテイングの発色量から算出し
た。反応液中のｈＮＧＦの全量と活性を有するｈＮＧＦ
量の比から、未処理、硫安塩析処理、透析処理および硫
安塩析処理後に透析処理を施す処理のそれぞれによる還
元剤の除去および酸化反応の進行の効果を図１に比較し
て示す。この結果、未処理のものあるいは硫安塩析処理
と比較して、透析処理または硫安塩析処理後に透析処理
を施したものは、比活性は格段に向上していることが分
かった。これらのデータからも分かるように、硫安塩析
処理後に透析処理を施す場合は、比活性において透析処
理を施したものに遜色が無く、処理時間が１／３で済む
というメリットがある。
系を用いて、無細胞系によって合成されたｈＮＧＦの生
物活性を測定した。神経細胞に対し、標品、一定液量の
反応液、透析処理後の反応液、硫安塩析処理後の反応液
を投与し、投与から７２時間後の神経線維の突起を有す
る細胞数を計数し、該当する標品濃度から各反応液中の
活性を有するｈＮＧＦ量を算出した。この際、投与した
反応液中に含まれるｈＮＧＦの全量は抗ｈＮＧＦ抗体を
用いたウエスタンブロッテイングの発色量から算出し
た。反応液中のｈＮＧＦの全量と活性を有するｈＮＧＦ
量の比から、未処理、硫安塩析処理、透析処理および硫
安塩析処理後に透析処理を施す処理のそれぞれによる還
元剤の除去および酸化反応の進行の効果を図１に比較し
て示す。この結果、未処理のものあるいは硫安塩析処理
と比較して、透析処理または硫安塩析処理後に透析処理
を施したものは、比活性は格段に向上していることが分
かった。これらのデータからも分かるように、硫安塩析
処理後に透析処理を施す場合は、比活性において透析処
理を施したものに遜色が無く、処理時間が１／３で済む
というメリットがある。
【００２５】
【発明の効果】本発明では、蛋白質合成反応後に、目的
蛋白質を含んだ反応液に対し、透析処理あるいは塩析処
理、またはそれらの組み合わせによって、反応液から還
元剤を除去し、酸化反応を進行させることにより、目的
蛋白質に正しい構造を保持させ、比活性を上昇させるこ
とができる。
蛋白質を含んだ反応液に対し、透析処理あるいは塩析処
理、またはそれらの組み合わせによって、反応液から還
元剤を除去し、酸化反応を進行させることにより、目的
蛋白質に正しい構造を保持させ、比活性を上昇させるこ
とができる。
【図１】本発明の無細胞蛋白質合成系により合成された
ｈＮＧＦの比活性を示す図。
ｈＮＧＦの比活性を示す図。
Claims (6)
- 【請求項１】無細胞蛋白質合成系の合成反応液から還元
剤を除去し、かつ酸化条件にすることを特徴とする無細
胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法。 - 【請求項２】還元剤を除去する方法が透析処理である請
求項１記載の無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質
の合成方法。 - 【請求項３】還元剤を除去する方法が塩析処理後に透析
処理をするものである請求項１記載の無細胞蛋白質合成
系における活性型蛋白質の合成方法。 - 【請求項４】無細胞蛋白質合成系の蛋白質合成反応後の
反応液から還元剤を除去し、かつ酸化条件にすることを
特徴とする無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の
合成方法。 - 【請求項５】還元剤を除去する方法が透析処理である請
求項４記載の無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質
の合成方法。 - 【請求項６】還元剤を除去する方法が塩析処理後に透析
処理をするものである請求項４記載の無細胞蛋白質合成
系における活性型蛋白質の合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14854495A JPH09291A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | 無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14854495A JPH09291A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | 無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09291A true JPH09291A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=15455149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14854495A Pending JPH09291A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | 無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09291A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1143009A4 (en) * | 1998-12-14 | 2002-03-27 | Riken | METHOD FOR PRODUCING A POLYPETIDE IN CELL-FREE PROTEIN SYNTHESIS SYSTEMS |
| US6702487B2 (en) | 2001-03-30 | 2004-03-09 | Konica Corporation | Photographic processor for silver halide photographic material and remote control system for the processor |
| US6987174B2 (en) | 2003-04-01 | 2006-01-17 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Azo compound, colorant-containing curable composition, color filter and color filter production method |
| US8734856B2 (en) * | 2002-01-31 | 2014-05-27 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Cell extract for cell-free protein synthesis and process for producing the same |
-
1995
- 1995-06-15 JP JP14854495A patent/JPH09291A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1143009A4 (en) * | 1998-12-14 | 2002-03-27 | Riken | METHOD FOR PRODUCING A POLYPETIDE IN CELL-FREE PROTEIN SYNTHESIS SYSTEMS |
| US6702487B2 (en) | 2001-03-30 | 2004-03-09 | Konica Corporation | Photographic processor for silver halide photographic material and remote control system for the processor |
| US8734856B2 (en) * | 2002-01-31 | 2014-05-27 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Cell extract for cell-free protein synthesis and process for producing the same |
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