JPH09294600A - 複数のプロモーター活性の測定法 - Google Patents
複数のプロモーター活性の測定法Info
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- JPH09294600A JPH09294600A JP12929496A JP12929496A JPH09294600A JP H09294600 A JPH09294600 A JP H09294600A JP 12929496 A JP12929496 A JP 12929496A JP 12929496 A JP12929496 A JP 12929496A JP H09294600 A JPH09294600 A JP H09294600A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】異なる色の光を発光する２種以上のルシフ
ェラーゼ遺伝子に、異なるプロモーターを結合させ、こ
れら２種以上のプロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝
子を夫々ベクターに挿入した組み換え体DNAを含む細胞
又は該細胞の抽出物を発光させる複数のプロモーター活
性の測定法。 【効果】本発明によれば、複数のプロモーターの活性を
同時に検出、定量等測定することができる。
ェラーゼ遺伝子に、異なるプロモーターを結合させ、こ
れら２種以上のプロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝
子を夫々ベクターに挿入した組み換え体DNAを含む細胞
又は該細胞の抽出物を発光させる複数のプロモーター活
性の測定法。 【効果】本発明によれば、複数のプロモーターの活性を
同時に検出、定量等測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、複数のプロモータ
ー活性の測定法に関する。
ー活性の測定法に関する。
【従来の技術】従来、複数のプロモーター活性を、発色
法、蛍光法等と比較し、感度において優れた発光法によ
り、検出する方法は、確立されていなかった。
法、蛍光法等と比較し、感度において優れた発光法によ
り、検出する方法は、確立されていなかった。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、異なる色の
光を発光する２種以上のルシフェラーゼ遺伝子に、異な
るプロモーターを結合させ、これら２種以上のプロモー
ター―ルシフェラーゼ融合遺伝子を夫々ベクターに挿入
した組み換え体DNAを含む細胞又は該細胞の抽出物を発
光させる複数のプロモーター活性の測定法を提供するこ
とを目的とするものである。
光を発光する２種以上のルシフェラーゼ遺伝子に、異な
るプロモーターを結合させ、これら２種以上のプロモー
ター―ルシフェラーゼ融合遺伝子を夫々ベクターに挿入
した組み換え体DNAを含む細胞又は該細胞の抽出物を発
光させる複数のプロモーター活性の測定法を提供するこ
とを目的とするものである。
【０００２】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、上
記課題を解決すべく種々検討を行なった結果、発光色が
異なる２種以上のホタルルシフェラーゼ遺伝子に、夫々
異なる大腸菌プロモーターを連結し、これら２種以上の
プロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝子をベクターに
挿入後、大腸菌に導入し、夫々のプロモーターの誘導条
件で大腸菌を培養し、発光基質を添加すれば、夫々の誘
導条件で発現すべきルシフェラーゼの活性が測定できる
こと等の知見を得、本発明を完成した。すなわち本発明
は、異なる色の光を発光する２種以上のルシフェラーゼ
遺伝子に、異なるプロモーターを結合させ、これら２種
以上のプロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝子を夫々
ベクターに挿入した組み換え体DNAを含む細胞又は該細
胞の抽出物を発光させることを特徴とする複数のプロモ
ーター活性の測定法である。
記課題を解決すべく種々検討を行なった結果、発光色が
異なる２種以上のホタルルシフェラーゼ遺伝子に、夫々
異なる大腸菌プロモーターを連結し、これら２種以上の
プロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝子をベクターに
挿入後、大腸菌に導入し、夫々のプロモーターの誘導条
件で大腸菌を培養し、発光基質を添加すれば、夫々の誘
導条件で発現すべきルシフェラーゼの活性が測定できる
こと等の知見を得、本発明を完成した。すなわち本発明
は、異なる色の光を発光する２種以上のルシフェラーゼ
遺伝子に、異なるプロモーターを結合させ、これら２種
以上のプロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝子を夫々
ベクターに挿入した組み換え体DNAを含む細胞又は該細
胞の抽出物を発光させることを特徴とする複数のプロモ
ーター活性の測定法である。
【０００３】以下、本発明を詳細に説明する。異なる色
の光を発光するルシフェラーゼ遺伝子、例えば、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子は、自然界より異なる色の光を発
光するホタルを採取し常法〔例えば、Sambrook J. et a
l., Molecular Cloning, second edition, 18.60-18.75
(1989)〕により単離することができる。また異なる色
の光を発光するホタルルシフェラーゼ遺伝子は、野生型
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を特開平3-285683号公報記
載の方法と同様にランダム変異することにより得ること
ができる。また、異なる色の光を発光するホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子は、特開平3-285683号公報に記載の発光
色変異ゲンジボタルルシフェラーゼと同等の変異を他の
ホタルルシフェラーゼに部位特異的変異法〔例えば、Ku
nkel, T. A. et al., Methods Enzymol.,154, 367-382
(1987)〕により導入し、得ることができる。
の光を発光するルシフェラーゼ遺伝子、例えば、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子は、自然界より異なる色の光を発
光するホタルを採取し常法〔例えば、Sambrook J. et a
l., Molecular Cloning, second edition, 18.60-18.75
(1989)〕により単離することができる。また異なる色
の光を発光するホタルルシフェラーゼ遺伝子は、野生型
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を特開平3-285683号公報記
載の方法と同様にランダム変異することにより得ること
ができる。また、異なる色の光を発光するホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子は、特開平3-285683号公報に記載の発光
色変異ゲンジボタルルシフェラーゼと同等の変異を他の
ホタルルシフェラーゼに部位特異的変異法〔例えば、Ku
nkel, T. A. et al., Methods Enzymol.,154, 367-382
(1987)〕により導入し、得ることができる。
【０００４】異なる色の光を発光する２種以上のルシフ
ェラーゼ遺伝子に、異なるプロモーター（例えば、大腸
菌由来のラクトースプロモーター、λファージ由来のPL
プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来のCa
MV35Sプロモーター、サイトメガロウイルス由来のCMVプ
ロモーター等）を連結し、これら２種以上のプロモータ
ー―ルシフェラーゼ融合遺伝子を夫々異なるベクター
［例えば、pAG60〔Colbere-Garapin, F. et al., J. Mo
l. Biol., 150, 1 (1981)〕、pBIN19（Bevan M., Nucle
ic Acids Res. 12, 8711）、pUC119（宝酒造社・製）
等］に挿入した組み換え体DNAを、細胞〔例えば、動物
細胞（例えば、COS-7細胞、Hela細胞、CHO細胞等）、植
物細胞（例えば、ナス科植物細胞、セリ科植物細胞
等）、微生物細胞（例えば、細菌、酵母、カビ等）等〕
に導入し、細胞を培養した後、細胞又は該細胞の抽出物
に外部よりルシフェリンを含む発光基質溶液を接触、作
用させて発光させ、発光をそのまま、または顕微鏡等を
用いて観察する。必要によりカメラで撮影するか、ある
いは発光スペクトルを分光測光システム、例えば、浜松
フォトニクス社のPMA-100や大塚電子社のIMUC-7000等、
及び波形解析ソフトにより分析することにより、複数の
プロモーターの活性を検出、定量等測定することができ
る。本システムにより細胞、組織、オルガネラ等での複
数のプロモーターの特異的発現を同時に検出することが
でき、また、複数のプロモーターの誘導物質を同時に検
出することができる。
ェラーゼ遺伝子に、異なるプロモーター（例えば、大腸
菌由来のラクトースプロモーター、λファージ由来のPL
プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来のCa
MV35Sプロモーター、サイトメガロウイルス由来のCMVプ
ロモーター等）を連結し、これら２種以上のプロモータ
ー―ルシフェラーゼ融合遺伝子を夫々異なるベクター
［例えば、pAG60〔Colbere-Garapin, F. et al., J. Mo
l. Biol., 150, 1 (1981)〕、pBIN19（Bevan M., Nucle
ic Acids Res. 12, 8711）、pUC119（宝酒造社・製）
等］に挿入した組み換え体DNAを、細胞〔例えば、動物
細胞（例えば、COS-7細胞、Hela細胞、CHO細胞等）、植
物細胞（例えば、ナス科植物細胞、セリ科植物細胞
等）、微生物細胞（例えば、細菌、酵母、カビ等）等〕
に導入し、細胞を培養した後、細胞又は該細胞の抽出物
に外部よりルシフェリンを含む発光基質溶液を接触、作
用させて発光させ、発光をそのまま、または顕微鏡等を
用いて観察する。必要によりカメラで撮影するか、ある
いは発光スペクトルを分光測光システム、例えば、浜松
フォトニクス社のPMA-100や大塚電子社のIMUC-7000等、
及び波形解析ソフトにより分析することにより、複数の
プロモーターの活性を検出、定量等測定することができ
る。本システムにより細胞、組織、オルガネラ等での複
数のプロモーターの特異的発現を同時に検出することが
でき、また、複数のプロモーターの誘導物質を同時に検
出することができる。
【０００５】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて更に具体的に
説明する。 実施例 １．オレンジ色に発光するホタルルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の取得 黄色に発光する、ヘイケボタル由来の耐熱性ルシフェラ
ーゼ遺伝子に、ゲンジボタルルシフェラーゼの赤色変異
C-M-3（433番目のHis残基がTyr残基に置換されている。
特開平3-285683号公報記載）と同等の変異を以下の方法
により導入した。大腸菌CJ236[pHLf107]〔大腸菌CJ236
はBIO-RAD社・製、pHLf107はpUC119（宝酒造社・製）に
217番目のAlaがLeuに置換されている耐熱性変異ヘイケ
ボタルルシフェラーゼ（LlL-217L）遺伝子が挿入されて
いる（特開平7-289264号公報記載）〕より、ヘルパーフ
ァージM13KO7（宝酒造社・製）を用いて、１本鎖のプラ
スミドpHLf107を調製し、DNA Model 392 シンセサイダ
ー（Applied Biosystems社・製）を用いて合成したオリ
ゴヌクレオチドSLF85 (ATAAAGAAATATTTTTCTTCA)及びMut
a-Gene in vitro Mutagenesis Kit（Bio-Rad社・製）
を用いて、433番目のHis残基がTyr残基に置換された耐
熱性ヘイケボタルルシフェラーゼ（LlL-217L/433Y）を
コードする遺伝子を有する組み換え体プラスミドpHLf20
8DNAを得た（図１）。
説明する。 実施例 １．オレンジ色に発光するホタルルシフェラーゼをコー
ドする遺伝子の取得 黄色に発光する、ヘイケボタル由来の耐熱性ルシフェラ
ーゼ遺伝子に、ゲンジボタルルシフェラーゼの赤色変異
C-M-3（433番目のHis残基がTyr残基に置換されている。
特開平3-285683号公報記載）と同等の変異を以下の方法
により導入した。大腸菌CJ236[pHLf107]〔大腸菌CJ236
はBIO-RAD社・製、pHLf107はpUC119（宝酒造社・製）に
217番目のAlaがLeuに置換されている耐熱性変異ヘイケ
ボタルルシフェラーゼ（LlL-217L）遺伝子が挿入されて
いる（特開平7-289264号公報記載）〕より、ヘルパーフ
ァージM13KO7（宝酒造社・製）を用いて、１本鎖のプラ
スミドpHLf107を調製し、DNA Model 392 シンセサイダ
ー（Applied Biosystems社・製）を用いて合成したオリ
ゴヌクレオチドSLF85 (ATAAAGAAATATTTTTCTTCA)及びMut
a-Gene in vitro Mutagenesis Kit（Bio-Rad社・製）
を用いて、433番目のHis残基がTyr残基に置換された耐
熱性ヘイケボタルルシフェラーゼ（LlL-217L/433Y）を
コードする遺伝子を有する組み換え体プラスミドpHLf20
8DNAを得た（図１）。
【０００６】組み換え体プラスミドpHLf208DNAを保有す
る大腸菌JM101[pHLf208]を、滅菌済みのニトロセルロー
スフィルターに塗布し、50 μg/mlのアンピシリン及び1
mMイソプロピル-β-チオガラクトサイド（IPTG）を添
加したLB寒天培地〔1% Bactotryptone (DIFCO社・製)、
0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、1.4% 寒天〕
上で37℃にて16時間培養した後、発光基質溶液（0.5 mM
ルシフェリン、100 mMクエン酸ナトリウム、pH 5.0）
にニトロセルロースフィルターを浸し、暗所にて発光を
観察した結果、大腸菌JM101[pHLf208]は、オレンジ色に
発光していることを確認した。すなわち赤色変異ゲンジ
ボタルルシフェラーゼC-M-3と同等の変異をLlL-217Lに
導入することにより、オレンジ色に発光するルシフェラ
ーゼLlL-217L/433Yをコードする遺伝子が得られた。
る大腸菌JM101[pHLf208]を、滅菌済みのニトロセルロー
スフィルターに塗布し、50 μg/mlのアンピシリン及び1
mMイソプロピル-β-チオガラクトサイド（IPTG）を添
加したLB寒天培地〔1% Bactotryptone (DIFCO社・製)、
0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、1.4% 寒天〕
上で37℃にて16時間培養した後、発光基質溶液（0.5 mM
ルシフェリン、100 mMクエン酸ナトリウム、pH 5.0）
にニトロセルロースフィルターを浸し、暗所にて発光を
観察した結果、大腸菌JM101[pHLf208]は、オレンジ色に
発光していることを確認した。すなわち赤色変異ゲンジ
ボタルルシフェラーゼC-M-3と同等の変異をLlL-217Lに
導入することにより、オレンジ色に発光するルシフェラ
ーゼLlL-217L/433Yをコードする遺伝子が得られた。
【０００７】２．プラスミドColE1の複製起点を有し、t
rcプロモーター制御下でLlL-217L/433Y遺伝子を発現す
るプラスミドpHLf261の構築 組み換え体プラスミドpHLf208DNAを制限酵素EcoRIで切
断し、LlL-217L/433Y遺伝子を含む断片をアガロースゲ
ル電気泳動及びGENECLEAN２キット（BIO101社・製）に
より回収し、EcoRIで切断したプラスミドpTrc99A〔プラ
スミドColE1の複製起点、大腸菌のトリプトファン合成
酵素遺伝子のプロモーターであるtrpとラクトースプロ
モーターであるlacより作成されたtrcプロモーター（IP
TGにより誘導される）及びtrcプロモーターのリプレッ
サーをコードするlacIq遺伝子を有する。Pharmacia Bio
tech社・製〕と連結した。その結果、プラスミドColE1
の複製起点を有し、trcプロモーター制御下でオレンジ
色に発光するルシフェラーゼLlL-217L/433Yをコードす
る遺伝子を発現し、マーカーとしてアンピシリン耐性遺
伝子Apを有する組み換え体プラスミドpHLf261DNAを構築
した（図１）。
rcプロモーター制御下でLlL-217L/433Y遺伝子を発現す
るプラスミドpHLf261の構築 組み換え体プラスミドpHLf208DNAを制限酵素EcoRIで切
断し、LlL-217L/433Y遺伝子を含む断片をアガロースゲ
ル電気泳動及びGENECLEAN２キット（BIO101社・製）に
より回収し、EcoRIで切断したプラスミドpTrc99A〔プラ
スミドColE1の複製起点、大腸菌のトリプトファン合成
酵素遺伝子のプロモーターであるtrpとラクトースプロ
モーターであるlacより作成されたtrcプロモーター（IP
TGにより誘導される）及びtrcプロモーターのリプレッ
サーをコードするlacIq遺伝子を有する。Pharmacia Bio
tech社・製〕と連結した。その結果、プラスミドColE1
の複製起点を有し、trcプロモーター制御下でオレンジ
色に発光するルシフェラーゼLlL-217L/433Yをコードす
る遺伝子を発現し、マーカーとしてアンピシリン耐性遺
伝子Apを有する組み換え体プラスミドpHLf261DNAを構築
した（図１）。
【０００８】３．p15Aの複製起点を有し、PLプロモータ
ー制御下でLlL-217L遺伝子を発現する組み換え体プラス
ミドpHLf265DNAの構築 プラスミドpHLf107を制限酵素EcoRIで切断し、LlL-217L
遺伝子を含む断片を項目２記載の方法で回収した。この
断片の両端をDNA Blunting Kit（宝酒造社・製）を用い
て平滑化し、制限酵素HpaIで切断しAlkaline Phosphata
se（宝酒造社・製）により脱リン酸化したプラスミドpP
L-1ambda〔λファージ由来のPLプロモーター（ナリジキ
シン酸により誘導される）を有する〕と連結し、PLプロ
モーター制御下で黄色に発光するルシフェラーゼLlL-21
7L遺伝子を発現する組み換え体プラスミドpHLf262DNAを
作製した（図２）。組み換え体プラスミドpHLf262DNAを
制限酵素BamHIで切断し、PLプロモーター及びLlL-217L
遺伝子を含む断片を項目２記載の方法で回収し、BamHI
で切断したプラスミドpACYC184（プラスミドp15A由来の
複製起点を有し、プラスミドColE1の複製起点を有する
プラスミドと同じ細胞中で共存可能である。ニッポンジ
ーン社・製）と連結した。その結果、プラスミドp15Aの
複製起点を有し、PLプロモーター制御下で黄色に発光す
るルシフェラーゼLlL-217Lをコードする遺伝子を発現
し、マーカーとしてクロラムフェニコール耐性遺伝子Cm
を有する組み換え体プラスミドpHLf265DNAを構築した
（図２）。
ー制御下でLlL-217L遺伝子を発現する組み換え体プラス
ミドpHLf265DNAの構築 プラスミドpHLf107を制限酵素EcoRIで切断し、LlL-217L
遺伝子を含む断片を項目２記載の方法で回収した。この
断片の両端をDNA Blunting Kit（宝酒造社・製）を用い
て平滑化し、制限酵素HpaIで切断しAlkaline Phosphata
se（宝酒造社・製）により脱リン酸化したプラスミドpP
L-1ambda〔λファージ由来のPLプロモーター（ナリジキ
シン酸により誘導される）を有する〕と連結し、PLプロ
モーター制御下で黄色に発光するルシフェラーゼLlL-21
7L遺伝子を発現する組み換え体プラスミドpHLf262DNAを
作製した（図２）。組み換え体プラスミドpHLf262DNAを
制限酵素BamHIで切断し、PLプロモーター及びLlL-217L
遺伝子を含む断片を項目２記載の方法で回収し、BamHI
で切断したプラスミドpACYC184（プラスミドp15A由来の
複製起点を有し、プラスミドColE1の複製起点を有する
プラスミドと同じ細胞中で共存可能である。ニッポンジ
ーン社・製）と連結した。その結果、プラスミドp15Aの
複製起点を有し、PLプロモーター制御下で黄色に発光す
るルシフェラーゼLlL-217Lをコードする遺伝子を発現
し、マーカーとしてクロラムフェニコール耐性遺伝子Cm
を有する組み換え体プラスミドpHLf265DNAを構築した
（図２）。
【０００９】４．LlL-217L遺伝子及びLlL-217L/433Y遺
伝子の誘導発現 組み換え体プラスミドpHLf261DNA及び組み換え体プラス
ミドpHLf265DNAを用いて、λファージのリプレッサー遺
伝子cIを有する大腸菌N99cI+（Pharmacia Biotech社・
製）を形質転換し、Ap耐性及びCm耐性により両プラスミ
ドを有する大腸菌N99cI+[pHLf261/pHLf265]（工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM P-１５６０２として
寄託されている。）を選択した。大腸菌N99cI+[pHLf261
/pHLf265]を10 μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）及
び50 μg/mlのアンピシリン（Ap）を含む２ mlのLB培地
にて30℃、120rpmで一夜浸透培養した。この培養液20
μlを、10 μg/mlのCm、50 μg/mlのAp及びtrcプロモー
ターの活性を抑えるために1%のグルコースを添加したLB
培地２ mlまたは10 μg/mlのCm、50 μg/mlのApを含む
２ mlのLB培地に添加し、30℃、120 rpmにて４時間浸透
培養した。前者に60μg/mlのナリジキシン酸を、後者に
0.2 mMのIPTGを添加し、30℃、120 rpmにて更に４時間
浸透培養した。各々の培養液100 μlを遠心分離し、得
られた菌体を50 μlの発光基質溶液（0.5 mM ルシフェ
リン、100 mMクエン酸ナトリウム、pH 5.0）に懸濁し、
フルオロNuncプレート（Nunc社・製）に移し、発光をエ
クタクロームプロフェッショナルP1600フィルム（KODAK
社・製）を用いて撮影した（図３）。露出はF4.0で20分
とした。図３に示した様に、ナリジキシン酸によりPLプ
ロモーターの誘導を行ない、グルコースによりtrcプロ
モーターの抑制を行なった菌体は、黄色に発光が観察さ
れ、また、IPTGによりtrcプロモーターの誘導を行なっ
た菌体は、オレンジ色の発光が観察された。すなわち発
光色の異なるホタルルシフェラーゼの遺伝子を用いるこ
とにより２種類のプロモーター活性を発光法により検出
するできることが判明した。
伝子の誘導発現 組み換え体プラスミドpHLf261DNA及び組み換え体プラス
ミドpHLf265DNAを用いて、λファージのリプレッサー遺
伝子cIを有する大腸菌N99cI+（Pharmacia Biotech社・
製）を形質転換し、Ap耐性及びCm耐性により両プラスミ
ドを有する大腸菌N99cI+[pHLf261/pHLf265]（工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM P-１５６０２として
寄託されている。）を選択した。大腸菌N99cI+[pHLf261
/pHLf265]を10 μg/mlのクロラムフェニコール（Cm）及
び50 μg/mlのアンピシリン（Ap）を含む２ mlのLB培地
にて30℃、120rpmで一夜浸透培養した。この培養液20
μlを、10 μg/mlのCm、50 μg/mlのAp及びtrcプロモー
ターの活性を抑えるために1%のグルコースを添加したLB
培地２ mlまたは10 μg/mlのCm、50 μg/mlのApを含む
２ mlのLB培地に添加し、30℃、120 rpmにて４時間浸透
培養した。前者に60μg/mlのナリジキシン酸を、後者に
0.2 mMのIPTGを添加し、30℃、120 rpmにて更に４時間
浸透培養した。各々の培養液100 μlを遠心分離し、得
られた菌体を50 μlの発光基質溶液（0.5 mM ルシフェ
リン、100 mMクエン酸ナトリウム、pH 5.0）に懸濁し、
フルオロNuncプレート（Nunc社・製）に移し、発光をエ
クタクロームプロフェッショナルP1600フィルム（KODAK
社・製）を用いて撮影した（図３）。露出はF4.0で20分
とした。図３に示した様に、ナリジキシン酸によりPLプ
ロモーターの誘導を行ない、グルコースによりtrcプロ
モーターの抑制を行なった菌体は、黄色に発光が観察さ
れ、また、IPTGによりtrcプロモーターの誘導を行なっ
た菌体は、オレンジ色の発光が観察された。すなわち発
光色の異なるホタルルシフェラーゼの遺伝子を用いるこ
とにより２種類のプロモーター活性を発光法により検出
するできることが判明した。
【００１０】
【発明の効果】本発明によれば、複数のプロモーターの
活性を同時に検出、定量等測定することができ、本発明
は、極めて有用である。
活性を同時に検出、定量等測定することができ、本発明
は、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】組み換え体プラスミドpHLf261DNAの構築図。
【図２】組み換え体プラスミドpHLf265DNAの構築図。
【図３】ナリジキシン酸またはIPTGで誘導した時の大腸
菌菌体の発光図をコンピュ−ターにより白黒に変換した
図。
菌菌体の発光図をコンピュ−ターにより白黒に変換した
図。
【手続補正書】
【提出日】平成８年８月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】組み換え体プラスミドpHLf261ＤＮＡの構築図
【図２】組み換え体プラスミドpHLf265ＤＮＡの構築図
【図３】ナリジキシン酸またはIPTGで誘導した時の大腸
菌菌体の発光図をコンピューターにより白黒に変換した
中間調画像の図
菌菌体の発光図をコンピューターにより白黒に変換した
中間調画像の図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】異なる色の光を発光する２種以上のルシフ
ェラーゼ遺伝子に、異なるプロモーターを結合させ、こ
れら２種以上のプロモーター―ルシフェラーゼ融合遺伝
子を夫々ベクターに挿入した組み換え体DNAを含む細胞
又は該細胞の抽出物を発光させることを特徴とする複数
のプロモーター活性の測定法。 - 【請求項２】請求項１記載のルシフェラーゼ遺伝子が異
なる色の光を発光する変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝
子より選ばれたものである請求項１記載の複数のプロモ
ーター活性の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12929496A JPH09294600A (ja) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | 複数のプロモーター活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12929496A JPH09294600A (ja) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | 複数のプロモーター活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH09294600A true JPH09294600A (ja) | 1997-11-18 |
Family
ID=15006021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12929496A Pending JPH09294600A (ja) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | 複数のプロモーター活性の測定法 |
Country Status (1)
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| JP (1) | JPH09294600A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001027316A1 (fr) * | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd. | Systeme de test de luminescence |
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-
1996
- 1996-04-26 JP JP12929496A patent/JPH09294600A/ja active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6602677B1 (en) | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
| US7241584B2 (en) | 1997-09-19 | 2007-07-10 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
| US8822170B2 (en) | 1997-09-19 | 2014-09-02 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
| US8030017B2 (en) | 1997-09-19 | 2011-10-04 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
| US8652794B2 (en) | 1998-10-28 | 2014-02-18 | Promega Corporation | Mutant luciferase |
| US7906298B1 (en) | 1998-10-28 | 2011-03-15 | Promega Corporation | Thermostable Photinus pyralis luciferase mutant |
| WO2001027316A1 (fr) * | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd. | Systeme de test de luminescence |
| US8669087B1 (en) | 1999-10-26 | 2014-03-11 | Promega Corporation | Luciferase mutant |
| US7879540B1 (en) | 2000-08-24 | 2011-02-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US7906282B2 (en) | 2000-08-24 | 2011-03-15 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
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| US10550420B2 (en) | 2014-09-11 | 2020-02-04 | Promega Corporation | Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence |
| US11293047B2 (en) | 2014-09-11 | 2022-04-05 | Promega Corporation | Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence |
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