JPH09299092A

JPH09299092A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Info

Publication number: JPH09299092A
Application number: JP8347877A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Oogi; 和宏大儀; Yuugo Hanehata; 祐吾羽畑; Haruo Onda; 治夫音田
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 1997-11-25

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】造血系に関与する新規タンパク質、そのＤＮＡ
および抗体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するｐ２６タンパ
ク質，その部分ペプチドまたはそれらの塩、それらをコ
ードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、ｐ２６
蛋白質の製造法、該ｐ２６タンパク質等または該ＤＮＡ
を含有する医薬、ｐ２６タンパク質に対する抗体、脱リ
ン酸化酵素阻害剤のスクリーニング方法／スクリーニン
グ用キット、該スクリーニング方法で得られる化合物ま
たはその塩、プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニン
グ方法。【効果】ｐ２６タンパク質は、プロテインキナーゼ促進
または阻害活性や脱リン酸化酵素阻害活性を有する化合
物またはその塩をスクリーニングするための試薬として
有用である。また、再生不良性貧血、急性骨髄性白血
病、Ｔ細胞白血病などの造血系に関与する疾病の予防・
治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、造血に関与する細
胞や血球系の細胞が産生する、情報伝達を担う新規ｐ２
６タンパク質およびそれをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、分子生物学の発達とともに、従来
の薬理学のタ−ゲットとなり得なかった、細胞外刺激に
対する細胞内情報伝達系、細胞周期の制御に関わる種々
のタンパク質の存在およびそれらのタンパク質の分子間
相互作用が明らかとなってきた。それに伴って、シグナ
ル伝達系や、細胞周期制御タンパク質に特異的に作用す
る薬剤の研究が進みつつある。免疫抑制作用を持つＦＫ
５０６（落合武徳、メディカル・イミュノロジー(Medic
al Immunol.) 14, 631-636(1987)）は、発見当時どのよ
うな作用機序で免疫抑制作用を発揮するのか全く分から
なかったが、研究が進むにつれ、ＦＫ５０６はＴリンパ
球内に存在するＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）
に結合した後、Ｃａ²⁺／カルモジュリン依存性フォスフ
ァターゼ、カルシニューリンと結合し、その活性を抑制
することがわかってきた。そのために、Ｔリンパ球の活
性化に関わる細胞内情報伝達系のうちＣａ²⁺を介する系
が遮断され、インターロイキン２などの免疫反応に必要
なサイトカインの産生が抑制されることによって、免疫
抑制作用が惹起されることが明らかになった〔Fruman,
D.A. et al., ファセブ・ジャーナル（FASEB J.）8, 39
1-400(1994)〕。さらに、細胞内情報伝達に関与する個
々の分子の同定も急激な速度で進みつつある。特に、受
容体型チロシンキナ−ゼ刺激から発ガン遺伝子Ｒａｓに
まで至る一連のカスケ−ドの解明は、Grb2/Ashの発見が
引き金となって解明され〔Matsuoka, K, et al. プロシ
ージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proceedings of
the Natinal Academy of Sciences of the United Stat
es of America) 89, 9015-9019 (1992)〕、細胞外刺激
から転写因子に至るまでシグナル伝達系の中でも最もよ
く解明された部類に属するものといえるようになった。
また、αβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質に共役
しているＧタンパク質共役型レセプターからＭＡＰキナ
ーゼに至る経路についても明らかになってきた。しかし
ながら、このような例はシグナル伝達系の中でもほんの
一部分にすぎず、現在のところ未だ解明されていないシ
グナル伝達系の数がどのくらいあるのかは全く見当もつ
かない。

【０００３】造血幹細胞、血球系の細胞においても、種
々のペプチドホルモン、サイトカイン、細胞増殖因子、
細胞接着因子からの刺激によって、細胞の増殖・分化が
きめ細かに制御されている。しかしながら、これらの刺
激により惹起される複雑な情報伝達のネットワ−クがめ
ぐらされているにも関わらず、それらを形成する情報伝
達分子の有機的な統合はほとんどなされていないのが現
状である。造血幹細胞は、その表面抗原であるＣＤ３４
を指標に骨髄、末梢血などからも濃縮することができる
が、その含量は微量である。そこで、最近では、造血幹
細胞に特異的に発現している遺伝子をクローニングする
ために、マウスなどの胎児肝細胞から造血幹細胞を表面
抗原によって濃縮し、シグナル伝達因子に保存されてい
る領域をプローブとして用い新規遺伝子を同定すること
が行われている。このような方法によって、造血幹細胞
に特異的に発現している新規受容体型チロシンキナーゼ
ＦＬＫ２がクローニングされている〔Matthew, W. et
al. セル（Cell）65, 1143-1152 (1991)〕。一方、プロ
テインキナーゼＣは、リン脂質、リン脂質代謝産物によ
って活性化され、情報伝達に関与する制御因子をはじ
め、各種核タンパク質、細胞骨格タンパク質などのセリ
ン、スレオニン残基をリン酸化し、細胞の増殖、分化を
制御していることがわかっている。

【０００４】

【本発明が解決しようとする課題】造血系に関与する細
胞および血球系の細胞において、情報伝達を担っている
タンパク質を単離・精製すれば、造血作用を制御する新
しい医薬の開発が可能となる。造血系に関与する細胞お
よび血球系の細胞において情報伝達を担っているタンパ
ク質を見い出し、遺伝子組み換え技術により、これを大
量に産生する方法の開発が望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ラット脳由
来ｃＤＮＡライブラリー、ヒト胸腺由来ｃＤＮＡライブ
ラリーおよびマウス脳由来ｃＤＮＡライブラリーから、
それぞれ新規な塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニン
グすることに成功し、それらにコードされるタンパク質
をｐ２６と命名した。そして、ｐ２６タンパク質の生体
内意義を解明するために、さらに研究を重ねた結果、こ
のｐ２６タンパク質は、１）in vivo では胎児肝臓、末
梢血において最も多く発現しており、しかも胎児肝臓の
造血器官としての役割が骨髄、脾臓に移っていく胎児１
７日以降発現が急激に減少していくこと、２）培養細胞
では、造血幹細胞から分化したＴ細胞白血病の培養細胞
に多く発現していること、３）プロテイン・キナーゼＣ
によってリン酸化される細胞質タンパク質であること等
から、造血幹細胞において、あるいは造血幹細胞からＴ
細胞への分化・増殖に関して、重要な役割を担っている
シグナル伝達因子であることがわかった。したがって、
このｐ２６タンパク質を制御する薬剤の開発は、今まで
のものと全く異なる作用機序を持つ、再生不良性貧血、
急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病などの造血系の疾患に
対する治療薬となる。本発明者らは、これらの知見に基
づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するタンパク質またはその塩、（２）配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列の第５５〜７７番目および
第１３７〜１４９番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸
配列である第（１）項記載のタンパク質、（３）配列番
号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列の第４〜２０番目、第
２２〜２７番目、第２９〜３９番目、第４１〜５２番
目、第５４〜７９番目、第８５〜９１番目、第９３〜９
９番目、第１０１〜１１４番目、第１１６〜１５４番
目、第１５７〜１６３番目および第１６６〜１８１番目
のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列である第（１）項
記載のタンパク質、（４）第（１）項記載のタンパク質
の部分ペプチドまたはその塩、（５）第（１）項記載の
タンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（６）配
列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表され
る塩基配列を有する第（５）項記載のＤＮＡ、（７）第
（５）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（８）第（７）項記載の組換えベクターを保持する形質
転換体、（９）第（８）項記載の形質転換体を培養し、
第（１）項記載のタンパク質またはその塩を生成、蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする第（１）項記
載のタンパク質またはその塩の製造方法、（１０）第
（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプ
チドまたはそれらの塩を含有してなる医薬、（１１）第
（５）項記載のＤＮＡを含有してなる医薬、（１２）再
生不良性貧血、急性骨髄性白血病もしくはＴ細胞白血病
の治療・予防剤または免疫調節剤である第（１０）項ま
たは第（１１）項記載の医薬、

【０００７】（１３）第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する
抗体、（１４）第（１）項記載のタンパク質、第（４）
項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを
特徴とする脱リン酸化酵素阻害活性を有する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（１５）第（１）項記
載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたは
それらの塩を含有する脱リン酸化酵素阻害活性を有する
化合物またはその塩のスクリーニング用キット、（１
６）第（１４）項記載のスクリーニング方法または第
（１５）項記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
れる脱リン酸化酵素阻害活性を有する化合物またはその
塩、（１７）リン酸化された第（１）項記載のタンパク
質、第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の
脱リン酸化酵素による脱リン酸化を阻害する活性を有す
る化合物またはその塩を含有してなる医薬、および（１
８）第（１）項記載のタンパク質、第（４）項記載の部
分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする
プロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物またはその
塩のスクリーニング方法を提供する。

【０００８】さらに、本発明は、（１９）第（１）項記
載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドまたは
それらの塩を含有するプロテインキナーゼ阻害活性を有
する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０）第（１４）項記載のスクリーニング方法または
第（１５）項記載のスクリーニング用キットを用いて得
られるプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物また
はその塩、（２１）プロテインキナーゼによる第（１）
項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩のリン酸化を阻害する活性を有する化合
物またはその塩を含有してなる医薬、（２２）第（１）
項記載のタンパク質、第（４）項記載の部分ペプチドま
たはそれらの塩を用いることを特徴とするプロテインキ
ナーゼ促進活性を有する化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、（２３）第（１）項記載のタンパク質、第
（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有す
るプロテインキナーゼ促進活性を有する化合物またはそ
の塩のスクリーニング用キット、（２４）第（２２）項
記載のスクリーニング方法または第（２３）項記載のス
クリーニング用キットを用いて得られるプロテインキナ
ーゼ促進活性を有する化合物またはその塩、（２５）プ
ロテインキナーゼによる第（１）項記載のタンパク質、
第（４）項記載の部分ペプチドまたはそれらの塩のリン
酸化を促進する活性を有する化合物またはその塩を含有
してなる医薬、（２６）造血に関与する細胞または血球
系の細胞における情報伝達物質である第（１）項記載の
タンパク質、（２７）細胞内リン酸化酵素によってリン
酸化されるタンパク質である第（１）項記載のタンパク
質、（２８）αβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質
のαサブユニット（Ｇαタンパク質）に結合し、Ｇαタ
ンパク質のＧＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進するタ
ンパク質である第（１）項記載のタンパク質、および
（２９）Ｇタンパク質共役型レセプターの脱感作に関与
する情報伝達制御タンパク質である第（１）項記載のタ
ンパク質を提供する。

【０００９】本発明のｐ２６タンパク質は、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するタンパク質であり、さらに好ましくは、配列番
号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わされる
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わ
されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同
質の活性を有するタンパク質である。本発明のｐ２６タ
ンパク質はヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラッ
ト、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、
サルなど）の造血に関与する細胞（例えば、ＰＡ−６，
ＳＴ−２など）もしくは血球系の細胞（例えば、ＭＥ
Ｌ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，Ｈ
Ｌ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬ
Ｔ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ
−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ
−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ
−１，ＣＭＫ，ＫＵ−８１２，ＭＥＧ−０１など）また
はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳お
よび脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海
馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、
下垂体、胃、下垂体、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状
腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、腸管、前立
腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮などに由来するタンパク質
であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わ
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と
は、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列と約４０％以上、好ま
しくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さ
らに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％
以上の相同性を有するアミノ酸配列などを示す。

【００１０】配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列の第５５〜７７番目および第１３
７〜１４９番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列な
どが挙げられる。より好ましい具体例としては、例え
ば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第５４〜
７９番目および第１３１〜１４９番目のアミノ酸配列を
有するアミノ酸配列などが、さらに好ましくは、例え
ば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の第４〜２
０番目、第２２〜２７番目、第２９〜３９番目、第４１
〜５２番目、第５４〜７９番目、第８５〜９１番目、第
９３〜９９番目、第１０１〜１１４番目、第１１６〜１
５４番目、第１５７〜１６３番目および第１６６〜１８
１番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列などが挙げ
られる。実質的に同質の活性としては、例えば、リン酸
化酵素によるリン酸化を受ける作用、前記した造血系に
関与する細胞もしくは血球系の細胞における情報伝達作
用、αβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質のαサブ
ユニット（Ｇαタンパク質）に結合しＧαタンパク質の
ＧＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進する作用、Ｇタン
パク質共役型レセプターの脱感作などが挙げられる。実
質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であるこ
とを示す。したがって、リン酸化酵素によるリン酸化を
受ける作用、前記した造血系に関与する細胞もしくは血
球系の細胞における情報伝達作用、Ｇαタンパク質のＧ
ＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進する作用、Ｇタンパ
ク質共役型レセプターの脱感作などの活性が同等（例、
約０.５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活
性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっ
ていてもよい。

【００１１】また、本発明のｐ２６タンパク質として
は、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例え
ば２個以上２０個程度、好ましくは２〜９個程度、さら
に好ましくは数個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配
列、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３
で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば
２個以上２０個程度、好ましくは２〜９個程度、さらに
好ましくは数個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば２
個以上２０個程度、好ましくは２〜９個程度、さらに好
ましくは数個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列を含有するタンパク質などであってもよ
い。上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されて
いる場合、その欠失または置換の位置としては、特に限
定されないが、例えば、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列の第５５〜７７番目または第１３７〜１４９番
目のアミノ酸配列以外の位置、好ましくは、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列の第５４〜７９番目または
第１３１〜１４９番目のアミノ酸配列以外の位置、さら
に好ましくは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
の第４〜２０番目、第２２〜２７番目、第２９〜３９番
目、第４１〜５２番目、第５４〜７９番目、第８５〜９
１番目、第９３〜９９番目、第１０１〜１１４番目、第
１１６〜１５４番目、第１５７〜１６３番目または第１
６６〜１８１番目のアミノ酸配列以外の位置などが挙げ
られる。なお、この配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列の第４〜２０番目、第２２〜２７番目、第２９〜３
９番目、第４１〜５２番目、第５４〜７９番目、第８５
〜９１番目、第９３〜９９番目、第１０１〜１１４番
目、第１１６〜１５４番目、第１５７〜１６３番目およ
び第１６６〜１８１番目のアミノ酸配列は、配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列および配列番号：３で表わされるアミノ
酸配列に共通する部分アミノ酸配列である。

【００１２】さらに、本発明のｐ２６タンパク質には、
Ｎ末端のメチオニン残基が保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護され
ているもの、グルタミン酸残基のＮ端側が生体内で切断
されピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側
鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基な
どのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、ある
いは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タ
ンパク質なども含まれる。本明細書におけるタンパク質
は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ
末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が
通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレ
ート(−ＣＯＯ^-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮ
Ｈ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチ
ルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、
シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例え
ば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、
例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2
アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフ
チル−Ｃ_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキル基のほ
か、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシ
メチルエステルなどが用いられる。本発明のタンパク質
がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレー
ト）を有している場合、カルボキシル基がアミド化また
はエステル化されているものも本発明のタンパク質に含
まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した
Ｃ末端のエステルなどが用いられる。

【００１３】本発明のｐ２６タンパク質のより好ましい
具体例としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を含有するラット脳由来のｐ２６タンパク質、配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト胸腺由
来のｐ２６タンパク質、配列番号：３で表わされるアミ
ノ酸配列を含有するマウス脳由来のｐ２６タンパク質な
どが挙げられる。本発明のｐ２６タンパク質の塩として
は、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のｐ２６タンパク
質またはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞また
は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製
造することもできるし、後述するｐ２６タンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することに
よっても製造することができる。また、後述のペプチド
合成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物
の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の
組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を
行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合
わせることにより精製単離することができる。本発明の
ｐ２６タンパク質の活性、すなわちリン酸化酵素による
リン酸化を受ける作用、前記した造血系に関与する細胞
もしくは血球系の細胞における情報伝達作用、αβγヘ
テロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質のαサブユニット（Ｇ
αタンパク質）に結合しＧαタンパク質のＧＴＰからＧ
ＤＰへの水解活性を促進する作用、Ｇタンパク質共役型
レセプターの脱感作などは、自体公知の方法に準じて測
定することができる。例えば、リン酸化酵素によるリン
酸化の測定は、後述するプロテアーゼ阻害活性を有する
化合物またはその塩のスクリーニング方法で説明されて
いる、〔³²Ｐ〕の放射活性を測定することによって行な
うことができる。

【００１４】本発明のタンパク質、その塩またはそのア
ミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を
用いることができる。そのような樹脂としては、例え
ば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズ
ヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジル
オキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒド
リルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチ
ルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミ
ド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシ
メチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェ
ニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げる
ことができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と
側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタ
ンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパ
ク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高
希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質またはそれらのアミド体を取得す
る。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク
質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ
るが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド
類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミ
ド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボ
ジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラ
セミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護
アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物
またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあら
かじめ保護アミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加
することができる。保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮
合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使
用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう
る。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸
アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン
化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコー
ル類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピ
リジンなどの３級アミン類、ジオキサン，テトラヒドロ
フランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニ
トリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなど
のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用い
られる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され
得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約
−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化さ
れたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられ
る。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不
十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を
繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反
応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無
水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミ
ノ酸をアセチル化することができる。

【００１５】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキ
シル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、
シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シ
クロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状
もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステ
ル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジル
エステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロ
ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェ
ナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジ
ド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、
トリチルヒドラジド化などによって保護することができ
る。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエー
テル化によって保護することができる。このエステル化
に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl₂
-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチル
などが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基
としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチ
ルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、B
um、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。

【００１６】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシコハク酸イミド、N-ヒドロキシ
フタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられ
る。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例え
ば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去
（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ黒あるいはＰｄ-
炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元
や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフ
ルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこ
れらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチ
ルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン
などによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウム
による還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反
応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれる
が、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオア
ニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチル
スルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオ
ールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。
また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられ
る2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により
除去され、トリプトファンのインドール保護基として用
いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,
4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護
以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどに
よるアルカリ処理によっても除去される。

【００１７】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。

【００１８】本発明のｐ２６タンパク質の部分ペプチド
としては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチド
であればいずれのペプチドであってもよいが、例えば、
配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３で表わ
されるアミノ酸配列の第５５〜７７番目または（およ
び）第１３７〜１４９番目のアミノ酸配列を有するペプ
チドなどが用いられる。より好ましくは、配列番号：
１、配列番号：２または配列番号：３で表わされるアミ
ノ酸配列の第５４番目〜第７９番目のアミノ酸配列また
は（および）第１３１番目〜１４９番目のアミノ酸配列
（好ましくは、第１１６番目〜第１５４番目のアミノ酸
配列）を有するペプチドなどが用いられ、さらに好まし
くは、例えば、配列番号：１、配列番号：２または配列
番号：３で表わされるアミノ酸配列の第４〜２０番目、
第２２〜２７番目、第２９〜３９番目、第４１〜５２番
目、第５４〜７９番目、第８５〜９１番目、第９３〜９
９番目、第１０１〜１１４番目、第１１６〜１５４番
目、第１５７〜１６３番目または（および）第１６６〜
１８１番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用い
られる。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート
(−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明のタンパク質の
ごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステ
ル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明のｐ２６タン
パク質の部分ペプチドの塩としては、前記した本発明の
ｐ２６タンパク質の塩などが用いられる。

【００１９】本発明のｐ２６タンパク質の部分ペプチド
またはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従っ
て、あるいは本発明のｐ２６タンパク質を適当なペプチ
ダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合
成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタン
パク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残
余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保
護基を脱離することにより目的のペプチドを製造するこ
とができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはた
とえば、以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られるタンパク
質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩
に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、
公知の方法によって遊離体に変換することができる。

【００２０】本発明のｐ２６タンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明
のｐ２６タンパク質またはその部分ペプチドをコードす
る塩基配列を含有するものであればいかなるものであっ
てもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラ
リー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細
胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バ
クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミ
ドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組
織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Revers
e Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、
ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する。）によって増幅することも
できる。具体的には、本発明の配列番号：１で表わされ
るアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列
またはそれとハイストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性、例え
ば、リン酸化酵素によるリン酸化を受ける作用、前記し
た造血系に関与する細胞もしくは血球系の細胞における
情報伝達作用、αβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク
質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）に結合しＧαタ
ンパク質のＧＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進する作
用、Ｇタンパク質共役型レセプターの脱感作などの活性
を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤ
ＮＡであれば何れのものでもよい。ハイブリダイズする
塩基配列としては、例えば、配列番号：４で表わされる
塩基配列と約７０〜８０％以上、好ましくは約９０％以
上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩
基配列などが用いられる。本発明の配列番号：２で表わ
されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表わされる塩基
配列またはそれとハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２で表わさ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質と同質の活性、例
えば、リン酸化酵素によるリン酸化を受ける作用、前記
した造血系に関与する細胞もしくは血球系の細胞におけ
る情報伝達作用、αβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパ
ク質のαサブユニット（Ｇαタンパク質）に結合しＧα
タンパク質のＧＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進する
作用、Ｇタンパク質共役型レセプターの脱感作などの活
性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有する
ＤＮＡであれば何れのものでもよい。ハイブリダイズす
る塩基配列としては、例えば、配列番号：５で表わされ
る塩基配列と約７０〜８０％以上、好ましくは約９０％
以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する
塩基配列などが用いられる。

【００２１】本発明の配列番号：３で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：６で表わされる塩基配列または
それとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する塩基配列を有し、配列番号：３で表わされるアミノ
酸配列を有するタンパク質と同質の活性、例えば、リン
酸化酵素によるリン酸化を受ける作用、前記した造血系
に関与する細胞もしくは血球系の細胞における情報伝達
作用、αβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質のαサ
ブユニット（Ｇαタンパク質）に結合しＧαタンパク質
のＧＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進する作用、Ｇタ
ンパク質共役型レセプターの脱感作などの活性を有する
タンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであ
れば何れのものでもよい。ハイブリダイズする塩基配列
としては、例えば、配列番号：６で表わされる塩基配列
と約７０〜８０％以上、好ましくは約９０％以上、さら
に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列な
どが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知
の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことが
できるが、例えば、Molecular Cloning ２nd（ed.；J.
Sambrooket al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ハ
イストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃
度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭ
で、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃
の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温
度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、
配列番号：１のアミノ酸配列を含有するラット脳由来の
ｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番
号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用い
られる。配列番号：２のアミノ酸配列を含有するヒト胸
腺由来のｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
などが用いられる。配列番号：３のアミノ酸配列を含有
するマウス脳由来のｐ２６タンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を有す
るＤＮＡなどが用いられる。

【００２２】配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列の第５５〜７７番目ま
たは（および）第１３７〜１４９番目のアミノ酸配列を
有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で
表わされる塩基配列の第１６３〜２３１番目または（お
よび）第４０９〜４４７番目の塩基配列を有するＤＮＡ
などが用いられる。配列番号：１、配列番号：２または
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第５４〜７９
番目または（および）第１３１〜１４９番目のアミノ酸
配列を有する部分ペプチドをコードするＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：４、配列番号：５または配列番
号：６で表わされる塩基配列の第１６０〜２３７番目ま
たは（および）第３９１〜４４７番目の塩基配列を有す
るＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１、配列番号：
２または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列の第４
〜２０番目、第２２〜２７番目、第２９〜３９番目、第
４１〜５２番目、第５４〜７９番目、第８５〜９１番
目、第９３〜９９番目、第１０１〜１１４番目、第１１
６〜１５４番目、第１５７〜１６３番目または（およ
び）第１６６〜１８１番目のアミノ酸配列を有する部分
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：４、配列番号：５または配列番号：６で表わされる
塩基配列の第１０〜６０番目、第６４〜８１番目、第８
５〜１１７番目、第１２１〜１５６番目、第１６０〜２
３７番目、第２５３〜２７３番目、第２７７〜２９７番
目、第３０１〜３４２番目、第３４６〜４６２番目、第
４６９〜４８９番目または（および）第４９６〜５４３
番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２３】本発明のｐ２６タンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡのクローニングの手段とし
ては、ｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基
配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法
によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮ
Ａを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤ
ＮＡをｐ２６タンパク質の一部あるいは全領域を有する
ＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものと
のハイブリダイゼーションによって選別することができ
る。ハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cl
oning ２nd（ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring H
arbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行
なうことができる。また、市販のライブラリーを使用す
る場合、添付の使用説明書に記載の方法に従ってハイブ
リダイゼーションを行なうことができる。また、ＤＮＡ
の塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、Mutan^TM
−Ｇ（宝酒造（株）、以下、ＴＭは登録商標を意味す
る）、Mutan^TM−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、Gap
ped duplex法やKunkel法などの自体公知の方法あるいは
それに準じる方法に従って行なうことができる。クロー
ン化されたｐ２６タンパク質またはその部分ペプチド
（以下、ｐ２６タンパク質等と略記する場合がある）を
コードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望
により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりし
て使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に
翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側
には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡ
Ｇを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳
終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付
加することもできる。ｐ２６タンパク質等をコードする
ＤＮＡの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のｐ２
６タンパク質等をコードするＤＮＡから目的とするＤＮ
Ａ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベ
クター中のプロモーターの下流に連結することにより製
造することができる。

【００２４】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好
ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐ
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
など、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場
合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター
などが好ましい。

【００２５】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）
等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用
いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場
合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。ま
た、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ｐ２
６タンパク質等のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリ
ヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡシグナル配列、ｏｍｐ
Ａ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場
合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・
シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα
・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が
動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナ
ル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分
子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このよう
にして構築されたｐ２６タンパク質等をコードするＤＮ
Ａを含有するベクターを細胞に導入することによって形
質転換体を製造することができる。

【００２６】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１
〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proceedings of the Natinal Academy of Sciences o
f the United States of America），６０巻，１６０頁
（１９６８年）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッ
ズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３
０９頁（１９８１年）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０
巻，５１７頁（１９７８年）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５
９頁（１９６９年）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０頁（１９５４
年）〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例え
ば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１
１４〔ジーン，２４巻，２５５頁（１９８３年）〕，２
０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry），９５巻，８７頁（１９
８４年）〕などが用いられる。酵母としては、例えば、
サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫ
Ｄ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などや、シゾサッカロマイセス
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９
１３，ＮＣＹＣ２０３６などが用いられる。昆虫細胞と
しては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨト
ウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cel
l；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細
胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、Mame
strabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の
細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合
は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）な
どが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９
細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn,
J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３
−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２頁（１９
８５年）〕。

【００２７】動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯ
Ｓ−７、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄ
ｈｆｒ^-）細胞と略記）、Ｌ細胞、ミエローマ細胞、ヒ
トＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、マウス細胞、
ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ-２／Ｏ細胞などが用いられ
る。これらの中でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞、２９３細胞などが好ましい。エシェリヒア
属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of the N
atinal Academy of Sciences of the United States of
America），６９巻，２１１０頁（１９７２年）やジー
ン（Gene），１７巻，１０７頁（１９８２年）などに記
載の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を
形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General G
enetics），１６８巻，１１１頁（１９７９年）などに
記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転
換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー（Methods in Enzymology)，１９４巻、１８２−１８
７頁（１９９１年）などに記載の方法に従って行なうこ
とができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、
例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology），６
巻，４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従
って行なうことができる。動物細胞を形質転換するに
は、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコ
ール，２６３−２６７頁（１９９５年）（秀潤社発行）
に記載の方法に従って行なうことができる。

【００２８】発現ベクターの細胞への導入方法として
は、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et a
l. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proceedings of the NatinalAcademy of Sciences of
the United States of America），８４巻，７４１３
頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F.
L. and van der Eb, A.J.ヴィロロジー（Virology），
５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔
法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO
J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等が挙
げられる。このようにして、本発明のタンパク質等をコ
ードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換され
た形質転換体が得られる。なお、動物細胞を用いて、本
発明のタンパク質等を安定に発現させる方法としては、
上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組
み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法が
ある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形
質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカー
を用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン
選択を行なうことにより本発明のタンパク質等の高発現
能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。ま
た、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、
ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択するこ
とにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のタンパク
質等をコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに
高発現の動物細胞株を得ることもできる。上記の形質転
換体を本発明のタンパク質等をコードするＤＮＡが発現
可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質等を生成、
蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質等を製
造することができる。

【００２９】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが用いられる。また、
酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒ
ア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコー
ス、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Mo
lecular Genetics），４３１−４３３頁，Cold Spring
Harbor Laboratory, New York （１９７２年）〕が好ま
しい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ
るために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のよ
うな薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属
菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間
行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４
０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。

【００３０】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkho
lder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of
the Natinal Academy of Sciences of the United Sta
tes of America），７７巻，４５０５頁（１９８０
年）〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitte
r, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・
ユーエスエー（Proceedings of the Natinal Academy o
f Sciences of the United States of America），８１
巻，５３３０頁（１９８４年）〕が挙げられる。培地の
ｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約
２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m〔Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature），１９５巻，
７８８頁（１９６２年）〕に非動化した１０％ウシ血清
等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の
ｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養
は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通
気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎
児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），
１２２巻，５０１頁（１９５２年）〕，ＤＭＥＭ培地
〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６頁（１９５
９年）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Th
e Jounal of the American Medical Association）１９
９巻，５１９頁（１９６７年）〕，１９９培地〔プロシ
ージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイ
オロジカル・メディスン（Proceeding of the Society
for the Biological Medicine），７３巻，１頁（１９
５０年）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるの
が好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜７
２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。特
に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を
選択マーカーとして用いる場合、チミジンをほとんど含
まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるの
が好ましい。

【００３１】上記培養物からｐ２６タンパク質等を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。ｐ２６タンパク質等を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
ｐ２６タンパク質等の粗抽出液を得る方法などが適宜用
い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたん
ぱく変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤
が含まれていてもよい。培養液中にｐ２６タンパク質等
が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方
法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集め
る。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液
中に含まれるｐ２６タンパク質等の精製は、自体公知の
分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができ
る。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒
沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。

【００３２】かくして得られるｐ２６タンパク質等が遊
離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩
で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じ
る方法により、遊離体または他の塩に変換することがで
きる。なお、組換え体が産生するｐ２６タンパク質等
を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用さ
せることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチド
を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素として
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ
ーゼなどが用いられる。かくして生成するｐ２６タンパ
ク質等の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノア
ッセイなどにより測定することができる。

【００３３】本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩に対する抗体は、ｐ２６タンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体で
あれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何
れであってもよい。本発明のｐ２６タンパク質、その部
分ペプチドまたはそれらの塩（以下、単にｐ２６タンパ
ク質と略記する場合がある）に対する抗体は、ｐ２６タ
ンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血
清の製造法に従って製造することができる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製ｐ２６タンパク質は、温血動物に対して投与により抗体
産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とと
もに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免
疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産
生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の
抗体価の測定は、例えば後記の標識化ｐ２６タンパク質
と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の
活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の
方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチ
ャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施すること
ができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが用いら
れるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞と
しては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、Ａ
Ｐ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いら
れる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫
細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

【００３４】抗ｐ２６タンパク質抗体産生ハイブリドー
マのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例
えば、ｐ２６タンパク質抗原を直接あるいは担体ととも
に吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリ
ドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで
標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる
細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用
いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した
抗ｐ２６タンパク質抗体を検出する方法、抗免疫グロブ
リン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブ
リドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標
識したｐ２６タンパク質を加え、固相に結合した抗ｐ２
６タンパク質モノクローナル抗体を検出する方法などが
用いられる。抗ｐ２６タンパク質モノクローナル抗体の
選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行
なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行
なわれる。選別および育種用培地としては、ハイブリド
ーマが生育できるものならばどのような培地を用いても
良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の
牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％
の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））
あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１
０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培
養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃であ
る。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間
〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なう
ことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上
記の抗血清中の抗ｐ２６タンパク質抗体価の測定と同様
にして測定できる。

【００３５】（ｂ）モノクロナール抗体の精製抗ｐ２６タンパク質モノクローナル抗体の分離精製は、
通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロ
ブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、
等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡ
Ｅ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合
固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの
活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて
抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができ
る。〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のｐ２６タンパク
質に対するポリクローナル抗体は、それ自体公知あるい
はそれに準じる方法にしたがって製造することができ
る。例えば、免疫抗原（ｐ２６タンパク質抗原）とキャ
リアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナ
ル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免
疫動物からｐ２６タンパク質に対する抗体含有物を採取
して、抗体の分離精製を行なうことにより製造すること
ができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗
原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋
白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、
キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体
が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架
橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシ
サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン
１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合
でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いること
ができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マ
レイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基
を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成
物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ
自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に
際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュ
バントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取される。抗血清中の抗ｐ２６タンパク質抗
体価の測定は、上記ハイブリドーマ培養上清の抗体価の
測定と同様にして測定できる。抗体の分離精製は、上記
のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリ
ンの分離精製法に従って行なうことができる。

【００３６】本発明のｐ２６タンパク質は、Ｇタンパク
質共役型レセプター（７回膜貫通型レセプター）に共役
しているαβγヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質のα
サブユニット（Ｇαタンパク質）に結合し、Ｇαタンパ
ク質のＧＴＰからＧＤＰへの水解活性を促進することに
よって、Ｇタンパク質共役型レセプターにリガンドが結
合することによって惹起される情報伝達を負に制御して
いる、いわゆる脱感作に関与する情報伝達制御タンパク
質である。また、このｐ２６タンパク質とＧαタンパク
質の結合にはｐ２６タンパク質のリン酸化が関与してお
り、ｐ２６タンパク質がリン酸化されることによって、
ｐ２６タンパク質とＧαタンパク質との結合が解離し、
Ｇαタンパク質に結合しているＧＴＰのＧＤＰへの水解
活性が抑制されることによって脱感作が解除される。現
在、Ｇタンパク質共役型レセプターの脱感作に関与して
いるタンパク質としては、Ｇタンパク質共役型レセプタ
ーキナーゼ、アレスチン（arrestin）の２種類が知られ
ており、これらのアンタゴニストはＧタンパク質共役型
レセプターの脱感作に関与する疾患の治療薬となると考
えられている。これらのことから、本発明のｐ２６タン
パク質のＧαタンパク質への結合阻害剤、本発明のｐ２
６タンパク質のリン酸化促進剤および本発明のｐ２６タ
ンパク質の脱リン酸化阻害剤は、Ｇタンパク質共役型レ
セプターの脱感作に関与する疾患、例えば、心不全の場
合に投与されるβ−アドレナリンレセプター遮断薬の長
期投与による効果の低下やモルヒネの長期投与による感
受性の低下などの改善剤となると考えられる。したがっ
て、本発明のｐ２６タンパク質は、本発明のｐ２６タン
パク質のＧαタンパク質への結合阻害剤、本発明のｐ２
６タンパク質のリン酸化促進剤および本発明のｐ２６タ
ンパク質の脱リン酸化阻害剤をスクリーニングするため
の試薬として有用である。また、プロテインキナーゼに
よる本発明のｐ２６タンパク質のリン酸化を阻害する化
合物は抗ガン剤などの医薬となる。したがって、本発明
のｐ２６タンパク質は、プロテインキナーゼ阻害剤をス
クリーニングするための試薬としても有用である。

【００３７】さらに、本発明のｐ２６タンパク質は、
１）in vivo では胎児肝臓、末梢血において最も多く発
現しており、しかも胎児肝臓の造血器官としての役割
が、骨髄、脾臓に移っていく胎児１７日以降発現が急激
に減少していくこと、２）培養細胞では、造血幹細胞か
ら分化したＴ細胞白血病の培養細胞に多く発現している
こと、３）プロテイン・キナーゼＣによってリン酸化さ
れる細胞質タンパク質であること等から、造血幹細胞に
おいて、あるいは造血幹細胞からＴ細胞への分化に関し
て、重要な役割を担っている情報伝達物質であることが
わかる。したがって、本発明のｐ２６タンパク質は、造
血系に関与する種々の疾病の治療・予防剤として有用で
ある。また、本発明のｐ２６タンパク質は、造血系に関
与する種々の疾病に対する医薬候補化合物をスクリーニ
ングするための試薬としても有用である。以下に、本発
明のｐ２６タンパク質またはその塩、本発明のｐ２６タ
ンパク質をコードするＤＮＡ、および本発明のｐ２６タ
ンパク質またはその塩に対する抗体の用途をより詳細に
説明する。

【００３８】（１）脱リン酸化酵素阻害活性を有する化
合物またはその塩のスクリーニング上記したとおり、本発明のｐ２６タンパク質またはその
塩は、プロテインキナーゼ（例えば、プロテインキナー
ゼＣなど）によってリン酸化を受ける。したがって、リ
ン酸化された本発明のタンパク質と脱リン酸化酵素を用
いることによって、脱リン酸化酵素の活性を阻害する化
合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
このように、本発明のｐ２６タンパク質は、脱リン酸化
酵素阻害活性を有する化合物またはその塩のスクリーニ
ングのための試薬として有用である。すなわち、本発明
は、（ｉ）リン酸化された本発明のｐ２６タンパク質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とす
るプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物またはそ
の塩（以下、脱リン酸化酵素阻害剤と略記する場合があ
る）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、
例えば、（ii）（ａ）リン酸化された本発明のｐ２６タンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩と脱リン酸化酵
素とを接触させた場合と（ｂ）リン酸化された本発明の
ｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩
と脱リン酸化酵素および試験化合物とを接触させた場合
との比較を行なうことを特徴とする脱リン酸化酵素阻害
剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記
スクリーニング方法においては、例えば、（ａ）と
（ｂ）の場合における、脱リン酸化酵素による、リン酸
化されたｐ２６タンパク質、その部分ペプチドもしくは
それらの塩の脱リン酸化の程度を測定して、比較するこ
とを特徴とするものである。

【００３９】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。脱リン酸化酵素としては、リン酸化さ
れた本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまた
はそれらの塩を脱リン酸化し得るものであれば何れのも
のでもよい。例えば、プロテインホスファターゼ１（Ｐ
Ｐ−１）、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２−
Ａ）などが用いられる。試験化合物としては、例えば、
ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であ
ってもよいし、公知の化合物であってもよい。上記のス
クリーニング方法を実施するには、リン酸化された本発
明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
（以下、リン酸化された本発明のｐ２６タンパク質等と
略記する場合がある）を、スクリーニングに適したバッ
ファーに懸濁することにより、リン酸化された本発明の
ｐ２６タンパク質等の標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のト
リス−塩酸バッファーなどの、リン酸化された本発明の
ｐ２６タンパク質等と脱リン酸化酵素との反応を阻害し
ないバッファーであればいずれでもよい。脱リン酸化酵
素による、リン酸化された本発明のｐ２６タンパク質等
の脱リン酸化の程度の測定は、〔³²Ｐ〕で標識されたｐ
２６タンパク質と目的とするプロテインホスファターゼ
とを上記バッファーに懸濁し、一定時間後に〔³²Ｐ〕標
識されたｐ２６タンパク質の放射活性の減少を測定する
ことによって行なうことができる。例えば、上記（ｂ）
の場合におけるリン酸化された本発明のｐ２６タンパク
質等の脱リン酸化の程度を上記（ａ）の場合に比べて、
約２０％以上、好ましくは５０％以上阻害する試験化合
物を脱リン酸化酵素阻害剤として選択することができ
る。

【００４０】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
を含有するものである。本発明のスクリーニング用キッ
トの例としては、次のものが挙げられる。〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ７.５のトリス−塩酸バッファー（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、０.３１ｍｇ／ｍｌＬ-α-フォスファチ
ジル-Ｌ-セリン、０.０６ｍｇ／ｍｌ１,２−ジオレイ
ン、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）ｐ２６タンパク質標品〔³²Ｐ〕で標識された本発明のｐ２６タンパク質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩脱リン酸化酵素標品プロテインホスファターゼ１１０ｍｇ／ｍｌ検出〔³²Ｐ〕の放射活性の測定〔測定法〕〔³²Ｐ〕で標識された本発明のｐ２６タンパ
ク質等を含有する測定用緩衝液および〔³²Ｐ〕で標識さ
れた本発明のｐ２６タンパク質等と試験化合物とを含有
する測定用緩衝液に、それぞれプロテインホスファター
ゼ１（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３０℃で２時間反応
させる。この反応液をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動（非還元）にかけ、ゲルを乾燥した後、〔³²Ｐ〕の放
射活性を測定し、リン酸化の程度を測定する。

【００４１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれ
た化合物であり、脱リン酸化酵素の活性を阻害して、リ
ン酸化された本発明のｐ２６タンパク質等の脱リン酸化
を阻害する化合物である。該化合物の塩としては、とり
わけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様
な塩としては、前記したｐ２６タンパク質の塩と同様の
ものが用いられる。本発明のスクリーニング方法または
スクリーニング用キットを用いて得られる脱リン酸化酵
素阻害活性を有する化合物またはその塩（脱リン酸化酵
素阻害剤）は、例えば、Ｇタンパク質共役型レセプター
の脱感作に関与する疾患（例、心不全の場合に投与され
るβ−アドレナリンレセプター遮断薬の長期投与による
効果の低下、モルヒネの長期投与による感受性の低下な
ど）に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬と
して有用である。さらには、免疫調節剤（例、免疫抑制
剤）、末期の白血病の予防・治療剤などの医薬としても
有用である。本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる脱リン酸化酵素阻害
剤を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って
実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施
した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセ
ル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外
の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液
剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香
味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤など
とともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用
量形態で混和することによって製造することができる。
これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当
な容量が得られるようにするものである。

【００４２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリ
アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用
してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油
などが用いられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸
ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。

【００４３】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、トリ、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て投与することができる。該タンパク質、その部分ペプ
チドまたはＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はあ
るが、経口投与の場合、一般的に成人（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象組織、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【００４４】（２）プロテインキナーゼ阻害活性を有す
る化合物またはその塩のスクリーニング本発明のｐ２６タンパク質またはその塩は、プロテイン
キナーゼ（例えば、カゼインキナーゼII、プロテインキ
ナーゼＣなど）によってリン酸化を受ける。したがっ
て、本発明のタンパク質と各種プロテインキナーゼを用
いることによって、プロテインキナーゼのリン酸化活性
を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするこ
とができる。このように、本発明のｐ２６タンパク質
は、プロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物または
その塩のスクリーニングのための試薬として有用であ
る。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩を用いることを特徴とするプロテインキ
ナーゼ阻害活性を有する化合物またはその塩（以下、プ
ロテインキナーゼ阻害剤と略記する場合がある）のスク
リーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、（ii）（ａ）本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩とプロテインキナーゼとを接触さ
せた場合と（ｂ）本発明のｐ２６タンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩とプロテインキナーゼおよび
試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを
特徴とするプロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング
方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法
においては、例えば、（ａ）と（ｂ）の場合における、
プロテインキナーゼによる該ｐ２６タンパク質、その部
分ペプチドもしくはそれらの塩のリン酸化の程度を測定
して、比較することを特徴とするものである。

【００４５】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。プロテインキナーゼとしては、本発明
のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩をリン酸化し得るものであれば何れのものでもよい
が、例えば、カゼインキナーゼII、プロテインキナーゼ
Ｃ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼなどが用いられ
る。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。上記のスクリーニング方法
を実施するには、本発明のｐ２６タンパク質、その部分
ペプチドまたはその塩（以下、本発明のｐ２６タンパク
質等と略記する場合がある）を、スクリーニングに適し
たバッファーに懸濁することにより本発明のｐ２６タン
パク質等の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４
〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のトリス−塩酸バ
ッファーなどの、本発明のｐ２６タンパク質等とプロテ
インキナーゼとの反応を阻害しないバッファーであれば
いずれでもよい。プロテインキナーゼによる本発明のｐ
２６タンパク質等のリン酸化の程度の測定は、〔γ-³²
Ｐ〕ＡＴＰと目的とするプロテインキナーゼとを上記バ
ッファーに懸濁し、一定時間後にｐ２６タンパク質に取
り込まれた〔³²Ｐ〕の放射活性を測定することによって
行なうことができる。そして、この系に試験化合物を加
えた時と加えない時のｐ２６タンパク質のリン酸化の程
度によって、プロテインキナーゼ阻害剤を選択する。例
えば、上記（ii）の場合における本発明のｐ２６タンパ
ク質等のリン酸化の程度を、上記（ｉ）の場合に比べ
て、約２０％以上、好ましくは５０％以上阻害する試験
化合物をプロテインキナーゼ阻害剤として選択すること
ができる。

【００４６】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
を含有するものである。本発明のスクリーニング用キッ
トの例としては、次のものが挙げられる。〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ７.５のトリス−塩酸バッファー（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、０.３１ｍｇ／ｍｌＬ-α-フォスファチ
ジル-Ｌ-セリン、０.０６ｍｇ／ｍｌ１,２−ジオレイ
ン、０.０３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）ｐ２６タンパク質標品本発明のｐ２６タンパク質、その本発明の部分ペプチド
またはそれらの塩プロテインキナーゼ標品カゼインキナーゼII １０ｍｇ／ｍｌ基質１００ｎＭＡＴＰ、６.６６ｐｍｏｌ〔γ-³²Ｐ〕ＡＴ
Ｐ検出〔³²Ｐ〕の放射活性の測定〔測定法〕本発明のｐ２６タンパク質等を含有する測定
用緩衝液および本発明のｐ２６タンパク質等と試験化
合物とを含有する測定用緩衝液に、それぞれ１００ｎＭ
ＡＴＰ、６.６６ｐｍｏｌ〔γ-³²Ｐ〕ＡＴＰおよびカ
ゼインキナーゼII（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３０℃
で２時間反応させる。この反応液をＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動（非還元）にかけ、ゲルを乾燥した後、
〔³²Ｐ〕の放射活性を測定し、リン酸化の程度を測定す
る。

【００４７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれ
た化合物であり、プロテインキナーゼの活性を阻害して
本発明のｐ２６タンパク質等のリン酸化を阻害する化合
物である。該化合物の塩としては、とりわけ生理学的に
許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、
前記したｐ２６タンパク質の塩と同様のものが用いられ
る。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング
用キットを用いて得られるプロテインキナーゼ阻害活性
を有する化合物またはその塩（プロテインキナーゼ阻害
剤）は、例えば、安全で低毒性な抗ガン剤などの医薬と
して有用である。本発明のスクリーニング方法またはス
クリーニング用キットを用いて得られるプロテインキナ
ーゼ阻害剤を上述の医薬として使用する場合、上記した
脱リン酸化酵素阻害剤と同様に実施することができる。

【００４８】（３）プロテインキナーゼ促進活性を有す
る化合物またはその塩のスクリーニング本発明のｐ２６タンパク質またはその塩は、プロテイン
キナーゼ（例えば、カゼインキナーゼII、プロテインキ
ナーゼＣなど）によってリン酸化を受ける。したがっ
て、本発明のタンパク質と各種プロテインキナーゼを用
いることによって、プロテインキナーゼのリン酸化活性
を促進する化合物またはその塩をスクリーニングするこ
とができる。このように、本発明のｐ２６タンパク質
は、プロテインキナーゼ促進活性を有する化合物または
その塩のスクリーニングのための試薬として有用であ
る。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドま
たはそれらの塩を用いることを特徴とするプロテインキ
ナーゼ促進活性を有する化合物またはその塩（以下、プ
ロテインキナーゼ促進剤と略記する場合がある）のスク
リーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、（ii）（ａ）本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプ
チドまたはそれらの塩とプロテインキナーゼとを接触さ
せた場合と（ｂ）本発明のｐ２６タンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩とプロテインキナーゼおよび
試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを
特徴とするプロテインキナーゼ促進剤のスクリーニング
方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法
においては、例えば、（ａ）と（ｂ）の場合における、
プロテインキナーゼによる該ｐ２６タンパク質、その部
分ペプチドもしくはそれらの塩のリン酸化の程度を測定
して、比較することを特徴とするものである。

【００４９】本発明のプロテインキナーゼ促進剤のスク
リーニング方法は、前記したプロテインキナーゼ阻害剤
のスクリーニング方法に準じて実施することができる。
プロテインキナーゼとしては、本発明のｐ２６タンパク
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩をリン酸化し得
るものであれば何れのものでもよいが、例えば、カゼイ
ンキナーゼII、プロテインキナーゼＣ、ｃＡＭＰ依存性
プロテインキナーゼなどが用いられる。試験化合物とし
ては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出
液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新
規な化合物であってもよいし、公知の化合物であっても
よい。上記のスクリーニング方法を実施するには、本発
明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
（以下、本発明のｐ２６タンパク質等と略記する場合が
ある）を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁す
ることにより本発明のｐ２６タンパク質等の標品を調製
する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、
ｐＨ約６〜８）のトリス−塩酸バッファーなどの、本発
明のｐ２６タンパク質等とプロテインキナーゼとの反応
を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。プロ
テインキナーゼによる本発明のｐ２６タンパク質等のリ
ン酸化の程度の測定は、〔γ-³²Ｐ〕ＡＴＰと目的とす
るプロテインキナーゼとを上記バッファーに懸濁し、一
定時間後にｐ２６タンパク質に取り込まれた〔³²Ｐ〕の
放射活性を測定することによって行なうことができる。
そして、この系に試験化合物を加えた時と加えない時の
ｐ２６タンパク質のリン酸化の程度によって、プロテイ
ンキナーゼ促進剤を選択する。例えば、上記（ｂ）の場
合における本発明のｐ２６タンパク質等のリン酸化の程
度を、上記（ａ）の場合に比べて、約２０％以上、好ま
しくは５０％以上促進する試験化合物をプロテインキナ
ーゼ促進剤として選択することができる。

【００５０】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはその塩
を含有するものである。本発明のスクリーニング用キッ
トの例としては、次のものが挙げられる。〔スクリーニング用試薬〕測定用緩衝液ｐＨ７.５のトリス−塩酸バッファー（２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、０.３１ｍｇ／ｍｌＬ-α-フォスファチ
ジル-Ｌ-セリン、０.０６ｍｇ／ｍｌ１,２−ジオレイ
ン、０.０３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）ｐ２６タンパク質標品本発明のｐ２６タンパク質、その本発明の部分ペプチド
またはそれらの塩プロテインキナーゼ標品カゼインキナーゼII １０ｍｇ／ｍｌ基質１００ｎＭＡＴＰ、６.６６ｐｍｏｌ〔γ-³²Ｐ〕ＡＴ
Ｐ検出〔³²Ｐ〕の放射活性の測定〔測定法〕本発明のｐ２６タンパク質等を含有する測定
用緩衝液および本発明のｐ２６タンパク質等と試験化
合物とを含有する測定用緩衝液に、それぞれ１００ｎＭ
ＡＴＰ、６.６６ｐｍｏｌ〔γ-³²Ｐ〕ＡＴＰおよびカ
ゼインキナーゼII（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３０℃
で２時間反応させる。この反応液をＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動（非還元）にかけ、ゲルを乾燥した後、
〔³²Ｐ〕の放射活性を測定し、リン酸化の程度を測定す
る。

【００５１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選ばれ
た化合物であり、プロテインキナーゼの活性を促進して
本発明のｐ２６タンパク質等のリン酸化を促進する化合
物である。該化合物の塩としては、とりわけ生理学的に
許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、
前記したｐ２６タンパク質の塩と同様のものが用いられ
る。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング
用キットを用いて得られるプロテインキナーゼ促進活性
を有する化合物またはその塩（プロテインキナーゼ促進
剤）は、例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターの脱感
作に関与する疾患（例、心不全の場合に投与されるβ−
アドレナリンレセプター遮断薬の長期投与による効果の
低下、モルヒネの長期投与による感受性の低下など）に
対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有
用である。本発明のスクリーニング方法またはスクリー
ニング用キットを用いて得られるプロテインキナーゼ促
進剤を上述の医薬として使用する場合、上記した脱リン
酸化酵素阻害剤と同様に実施することができる。

【００５２】（４）造血系に関与する疾病の治療・予防
剤本発明のｐ２６タンパク質は、造血幹細胞において、あ
るいは造血幹細胞からＴ細胞への分化に関して、重要な
役割を担っている情報伝達物質であるため、本発明のｐ
２６タンパク質またはそれをコードするＤＮＡに異常が
あったり、欠損している場合、あるいは発現量が減少も
しくは増加している場合、造血系に関与する種々の疾病
（例えば、再生不良性貧血、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞
白血病など）が発症すると考えられている。したがっ
て、本発明のｐ２６タンパク質およびそれをコードする
ＤＮＡは、例えば、再生不良性貧血、急性骨髄性白血
病、Ｔ細胞白血病などの造血系に関与する疾病の治療・
予防剤などの医薬として使用することができる。例え
ば、生体内においてｐ２６タンパク質が減少あるいは欠
損しているために、造血に関与する細胞、造血幹細胞に
由来する細胞、血液系に関与する細胞などにおける情報
伝達が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる
場合に、（イ）本発明のｐ２６タンパク質をコードする
ＤＮＡを該患者に投与し、生体内で該ｐ２６タンパク質
発現させることによって、または（ロ）造血幹細胞など
に本発明のｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡを挿入
し、該ｐ２６タンパク質を発現させた後に、該細胞を患
者に移植することなどによって、該患者におけるｐ２６
タンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させる
ことができる。さらには、本発明のｐ２６タンパク質お
よびそれをコードするＤＮＡは、例えば、免疫調節剤
（例、免疫抑制剤など）などの医薬として使用すること
もできる。

【００５３】本発明のｐ２６タンパク質をコードするＤ
ＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該Ｄ
ＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイ
ルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套
手段に従って実施することができる。例えば、必要に応
じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マ
イクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もし
くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、
または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき
る。例えば、本発明のＤＮＡを生理学的に認められる担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、
アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのよう
な賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸など
のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤
滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、
ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味
剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場
合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担
体を含有することができる。注射のための無菌組成物は
注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子
油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁さ
せるなどの通常の製剤実施に従って処方することができ
る。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブ
ドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソ
ルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）
などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコー
ル（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非
イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（Ｔ
Ｍ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液と
しては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解
補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルア
ルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例え
ば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調整された注射液は、通常、適当なアンプルに
充填される。

【００５４】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て投与することができる。該ＤＮＡの投与量は、症状な
どにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍ
ｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与
する場合は、その１回投与量は投与対象、対象組織、症
状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤
の形では通常成人（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。

【００５５】（５）ｐ２６タンパク質、その部分ペプチ
ドまたはそれらの塩の定量本発明のｐ２６タンパク質、その部分ペプチドまたはそ
れらの塩に対する抗体は、ｐ２６タンパク質、その部分
ペプチドまたはそれらの塩（以下、単にｐ２６タンパク
質と略記する場合がある）を特異的に認識することがで
きるので、被検液中のｐ２６タンパク質の定量、特にサ
ンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することが
できる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のｐ２６タ
ンパク質に対する抗体と、被検液および標識化ｐ２６タ
ンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識
化ｐ２６タンパク質の割合を測定することを特徴とする
被検液中のｐ２６タンパク質の定量法、および（ii）被
検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体
とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中
のｐ２６タンパク質の定量法を提供する。上記（ii）の
定量法においては、一方の抗体がｐ２６タンパク質のＮ
端部を認識する抗体で、他方の抗体がｐ２６タンパク質
のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。

【００５６】また、本発明のｐ２６タンパク質に対する
モノクローナル抗体（以下、抗ｐ２６タンパク質抗体と
称する場合がある）を用いてｐ２６タンパク質の定量を
行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともで
きる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いても
よく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるい
はＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いるｐ
２６タンパク質の定量法は、特に制限されるべきもの
ではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ｐ２６タンパ
ク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合
体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを
既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線よ
り算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いても
よい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリ
ック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発
光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例
えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕など
が、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシア
ネートなどが、発光物質としては、例えば、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
がそれぞれ用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。

【００５７】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース，デ
キストラン，セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチ
レン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あ
るいはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法において
は不溶化した抗ｐ２６タンパク質抗体に被検液を反応さ
せ（１次反応）、さらに標識化抗ｐ２６タンパク質抗体
を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤
の活性を測定することにより被検液中のｐ２６タンパク
質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆
の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間
をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方
法は前記のそれらに準じることができる。また、サンド
イッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるい
は標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である
必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以
上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッ
チ法によるｐ２６タンパク質の測定法においては、１次
反応と２次反応に用いられる抗ｐ２６タンパク質抗体は
ｐ２６タンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ま
しく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に
用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、ｐ２６タンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。

【００５８】本発明のｐ２６タンパク質抗体をサンドイ
ッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメ
トリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることが
できる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗
体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈
降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する
レーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５９】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてｐ２
６タンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般
的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照
することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノ
アッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編
「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明のｐ２６タン
パク質抗体を用いることによって、本発明のｐ２６タン
パク質を感度良く定量することができる。さらに、本発
明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発
明のｐ２６タンパク質を検出するために使用することが
できる。また、本発明のｐ２６タンパク質を精製するた
めに使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本
発明のｐ２６タンパク質の検出、被検細胞内における本
発明のｐ２６タンパク質の挙動の分析などのために使用
することができる。

【００６０】（６）造血系に関与する疾病に対する医薬
候補化合物のスクリーニング本発明のｐ２６タンパク質は、造血に関与する細胞、血
液系における細胞などにおいて、情報伝達物質としての
役割を有しているため、本発明のｐ２６タンパク質の機
能を促進または阻害する化合物またはその塩は、造血系
に関与する疾病（例えば、再生不良性貧血、急性骨髄性
白血病、Ｔ細胞白血病など）の治療・予防剤などの医薬
として使用できる。さらに、免疫調節剤（例えば、免疫
抑制剤）などの医薬としても使用することもできる。し
たがって、本発明のｐ２６タンパク質は、造血系に関与
する疾病の治療・予防剤または免疫調節剤などの医薬候
補化合物のスクリーニングのための試薬として有用であ
る。

【００６１】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００６２】Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｍｅ：メチル基Ｅｔ：エチル基Ｂｕ：ブチル基Ｐｈ：フェニル基ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基

【００６３】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＢｚｌ：ベンジル Cl₂Ｂｚｌ：２，６−ジクロロベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＺ：ベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェノールＴｒｔ：トリチルＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＨＯＯＢｔ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジンＨＯＮＢ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００６４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕ラット由来ｐ２６タンパク質のアミノ
酸配列を示す。〔配列番号：２〕ヒト由来ｐ２６タンパク質のアミノ酸
配列を示す。〔配列番号：３〕マウス由来ｐ２６タンパク質のアミノ
酸配列を示す。〔配列番号：４〕ラット由来ｐ２６タンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５〕ヒト由来ｐ２６タンパク質をコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：６〕マウス由来ｐ２６タンパク質をコード
するＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：７〕ラットｐ２６タンパク質をコードする
ＤＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩基
配列を示す。〔配列番号：８〕ラットｐ２６タンパク質をコードする
ＤＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩基
配列を示す。〔配列番号：９〕ラットｐ２６タンパク質をコードする
ＤＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩基
配列を示す。〔配列番号：１０〕ラットｐ２６タンパク質をコードす
るＤＮＡのクローニングに使用した合成プライマーの塩
基配列を示す。

【００６５】〔配列番号：１１〕ラットｐ２６タンパク
質をコードするＤＮＡのクローニングに使用した合成An
choredプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１２〕β−ガラクトシダーゼ−ラットｐ２
６融合タンパク質の発現プラスミドの構築を行なうため
に、プラスミドｐＴＳ８２２を鋳型にして開始コドンの
メチオニンを除いた翻訳領域のみを含むように設計した
合成プライマーを示す。〔配列番号：１３〕β−ガラクトシダーゼ−ラットｐ２
６融合タンパク質の発現プラスミドの構築を行なうため
に、プラスミドｐＴＳ８２２を鋳型にして開始コドンの
メチオニンを除いた翻訳領域のみを含むように設計した
合成プライマーを示す。〔配列番号：１４〕ラットｐ２６タンパク質の発現プラ
スミドの構築を行なうために、プラスミドｐＴＳ８２２
を鋳型にして翻訳領域のＮ末端部分のみを含むように設
計した合成プライマーを示す。〔配列番号：１５〕ラットｐ２６タンパク質の発現プラ
スミドの構築を行なうために、プラスミドｐＴＳ８２２
を鋳型にして翻訳領域のＮ末端部分のみを含むように設
計した合成プライマーを示す。〔配列番号：１６〕ｐＴＳ８２５を作製するために、実
施例１で得られたｐＴＳ８２３に挿入した合成ＤＮＡを
示す。〔配列番号：１７〕ｐＴＳ８２５を作製するために、実
施例１で得られたｐＴＳ８２３に挿入した合成ＤＮＡを
示す。

【００６６】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒアコリ（Escherichia coli) ＸＬ１−Blue Ｍ
ＲＦ'／ｐＴＳ８３４は、平成８年３月６日から通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５４４８として寄託されてい
る。後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア
コリ（Escherichia coli) ＸＬ１−Blue ＭＲＦ'／ｐ
ＴＳ８５５は、平成８年３月６日から通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号Ｆ
ＥＲＭＢＰ−５４４９として寄託されている。後述の
実施例７で得られた形質転換体エシェリヒアコリ（Es
cherichia coli) ＤＨ１０Ｂ／ｐＴＳ８４２は、平成８
年３月６日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５４５
０として寄託されている。

【００６７】

【実施例】以下に、参考例および実施例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定され
るものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法
はモレキュラー・クローニング（Molecular cloning）
に記載されている方法に従った。

【００６８】

【実施例１】ラットｐ２６タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡのクローニングラット脳由来ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック
社）のλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ^-株に感染させ
た後、軟寒天プレート上に約３×１０⁴プラークづつま
き、４２℃で一晩インキュベートしてプラークを形成さ
せた。プラークをニトロセルロースフィルター（シュラ
イヒャー・アンド・シュエル社）上に移した後、変性溶
液〔0.5N 水酸化ナトリウム, 1.5M 塩化ナトリウム〕、
中和溶液〔0.5M トリス-塩酸（pH.7.0), 1.5M 塩化ナト
リウム〕、３×ＳＳＣ〔20×SSC=3M塩化ナトリウム, 0.
3M クエン酸ナトリウム〕で順次処理し、風乾後８０℃
で３時間焼き付けを行ない、ファージＤＮＡをニトロセ
ルロースフィルター上に固定した。一方、プローブとし
て、２本の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：７、配
列番号：８）をｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
に用いた。プローブの標識は、まず、これらの部分的に
相補的な配列を持つ２本のオリゴヌクレオチドを７０℃
で１０分変性した後、７０℃から室温まで徐々に温度を
下げて２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングを行な
った。次に、〔α-³²P〕ｄＣＴＰ（デュポン/NEN 6000C
i/mmol）、Klenow fragment（宝酒造）を用いて、１本
鎖部分の相補鎖を合成していくプライマーエクステンシ
ョン法によって標識を行ない、最終的に８１merのオリ
ゴヌクレオチドプローブを得た。ハイブリダイゼーショ
ンは、標識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩
衝液〔2×SSPE〔20×SSPE=3.6M塩化ナトリウム, 0.2M
リン酸ナトリウム（pH7.7)，20mM EDTA〕、10×Denhard
t's 液、150μｇ/ml 熱変性サケ精子ＤＮＡ、667μｇ/m
l 酵母ＲＮＡ〕中、５０℃でハイブリダイゼーションを
行なった。フィルターは最終的に２×ＳＳＣ, 0.1% Ｓ
ＤＳ液中４８℃で洗浄後、オートラジオグラムをとっ
て、プローブとハイブリダイゼーションするプラークを
検索した。

【００６９】この方法で得られたファージクローンから
ファージＤＮＡを抽出した後、制限酵素EcoRIで消化し
てｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＵＣ１１８プラスミドの
EcoRI部位に挿入してｐＴＳ８１９を得た。挿入されて
いるｃＤＮＡ断片の塩基配列を〔α-³²P〕ｄＣＴＰを用
いて通常の方法で決定したところ、このｃＤＮＡ断片
は、poly(A)⁺鎖を含む５４５ｂｐから成ることがわかっ
た。しかしながら、このクロ−ンは５'領域がかけたク
ローンであると考えられたので、新たにここで得られた
ｃＤＮＡの Bgl II-Eco47III の３７４ｂｐ断片をプロ
−ブにして、再びラット脳由来ｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行なった。プローブの標識は、前述の
ｃＤＮＡ断片を〔α-³²P〕ｄＣＴＰとランダムプライマ
ーラベリングキット（アマシャム社）を用いて標識し
た。ハイブリダイゼーションは、標識プローブを含むハ
イブリダイゼーション用緩衝液〔5×SSPE、5×Denhard
t's 液、0.1% SDS、100μｇ/ml 熱変性サケ精子ＤＮ
Ａ〕中、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった。
フィルターは、最終的に０.２×ＳＳＣ, 0.1% ＳＤＳ液
中、６５℃で洗浄後、オートラジオグラムをとってプロ
ーブとハイブリダイゼーションするプラークを検索し
た。その結果、５６クローンのポジティブクローンが得
られた。このうち４つのクローンについて、ファージク
ローンからファージＤＮＡを抽出した後、ｐＵＣ１１９
プラスミドのHincII部位に挿入して、〔α-³²P〕ｄＣＴ
Ｐを用いて通常の方法で塩基配列を決定した（ｐＴＳ８
２０〜ｐＴＳ８２３）。ここで得られたｃＤＮＡ断片を
つなぎ合わせてpoly(A)⁺鎖を含む８４２ｂｐが確定し
た。

【００７０】次に、さらに５'末端側の塩基配列を得る
ために、５'ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA E
nd）を行なった。ラット脳からグアニジンチオシアネー
ト法によってtotal ＲＮＡを分画後、このtotal ＲＮＡ
をオリゴ（ｄＴ）スパンカラム（ファルマシア社）にか
けてpoly(A)⁺ RNAを調製した。このpoly(A)⁺RNA １μｇ
をラットｐ２６タンパク質ｃＤＮＡに相補的なプライマ
ー１（配列番号：９）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成
後、ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼ（ＴｄＴ）（ギブコ社）を用いて、合成した一
本鎖ｃＤＮＡの５'末端にpoly(A)を付加した。次に、制
限酵素部位に続くpoly(T)を持つアンカープライマー
（配列番号：１１）と前記プライマー１（配列番号：
９）より少し５'上流側に位置するプライマー２（配列
番号：１０）を用いてＰＣＲを行なった。前出の５'Ｒ
ＡＣＥで得られた８４２ｂｐからなるｃＤＮＡ断片をつ
なぎ合わせて、poly(A)⁺鎖を含む全長８７５ｂｐのｃＤ
ＮＡ断片をｐＵＣ１１９のHincII-SmaI部位に組み込ん
だｐＴＳ８３４を得た。このプラスミドに含まれるｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号：４で
表わされる塩基配列を有することが明らかになった〔図
１〕。このｃＤＮＡには、配列番号：１で表わされる１
８１個のアミノ酸からなるラットｐ２６タンパク質がコ
ードされており、このラットｐ２６タンパク質は既知の
タンパク質のアミノ酸とほとんど相同性がないことがわ
かった〔図１〕。得られたｐＴＳ８３４を大腸菌（Esch
erichia coli）ＸＬ１−Blue ＭＲＦ'に導入して、形質
転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＸＬ１−Blue Ｍ
ＲＦ'／ｐＴＳ８３４を得た。

【００７１】

【実施例２】ヒトｐ２６タンパク質をコードするｃＤＮ
Ａのクローニングヒト胸腺由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）
のλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ^-株に感染させた
後、軟寒天プレート１２０枚にまき、４２℃で一晩イン
キュベートして約１.９×１０⁶のプラークを形成させ
た。プラークをニトロセルロースフィルター上に移した
後、変性溶液〔0.5N 水酸化ナトリウム, 1.5M 塩化ナト
リウム〕、中和溶液〔0.5M トリス-塩酸（pH7.0）, 1.5
M 塩化ナトリウム〕、３×ＳＳＣで順次処理し、風乾後
８０℃で３時間焼き付けを行ない、ファージＤＮＡをニ
トロセルロースフィルター上に固定した。一方、プロー
ブとしてラットｐ２６タンパク質をコードするｃＤＮＡ
（ｐＴＳ８３４）の NotI-Aor51HI ７３２ｂｐ断片をｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プロー
ブの標識は、前述のｃＤＮＡ断片を〔α-³²P〕ｄＣＴＰ
とランダムプライマーラベリングキット（アマシャム
社）を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、標
識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液〔0.
5M リン酸ナトリウム（pH7.4）, 7% SDS, 1% BSA, 1mM
EDTA〕中、６０℃でハイブリダイゼーションを行なっ
た。フィルターは、最終的に２×ＳＳＣ, 0.1% SDS 液
中６５℃で洗浄後、オートラジオグラムをとってプロー
ブとハイブリダイゼーションするプラークを検索した。
その結果、３８クローンがポジティブであることがわか
った。

【００７２】この中でもっとも長いインサートを持って
いると考えられるＮｏ.６のファージクローンよりファ
ージＤＮＡを抽出した後、制限酵素AluI、EcoRIで消化
してｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＧＥＭ９Ｚｆ(-)プラ
スミド（プロメガ社）のSacI-EcoRI部位に挿入してｐＴ
Ｓ８５５を得た。挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配
列を〔α-³²P〕ｄＣＴＰを用いて通常の方法で決定した
ところ、このｃＤＮＡ断片は、poly(A)⁺鎖を含む配列番
号：５で表わされる８８９個の塩基配列を有することが
わかった〔図２〕。このｃＤＮＡ断片には、配列番号：
２で表わされる１８１個のアミノ酸からなるヒトｐ２６
タンパク質がコードされており〔図２〕、ラットｐ２６
タンパク質（配列番号：１）との相同性はアミノ酸レベ
ルで９３％と非常によく保存されていることが分かった
〔図４〕。また、そのアミノ酸配列よりラット、ヒトお
よびマウスのｐ２６タンパク質には、カゼイン・キナー
ゼII、プロテイン・キナーゼＣのリン酸化される可能性
がある部位を複数箇所持つことがわかった〔図４〕。得
られたｐＴＳ８５５を大腸菌（Escherichia coli）ＸＬ
１−BlueＭＲＦ'に導入して、形質転換体：大腸菌（Esc
herichia coli）ＸＬ１−BlueＭＲＦ'／ｐＴＳ８５５を
得た。一方、マウスのｐ２６タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡのクローニングも同様に行なった。該ｃＤＮＡ
は、配列番号：６で表わされる塩基配列を有しており、
該ｃＤＮＡは配列番号：３で表わされる１８１個のアミ
ノ酸をコードしていることが分かった〔図３〕。

【００７３】

【実施例３】ラット脳各部位のノザンハイブリダイゼー
ション８周令（♀）Sprague Dawleyラット（日本Charles Rive
r）の脳の各部位、すなわちolfactory bulb（嗅球）、a
mygdala（扁桃核）、basal gangria（大脳基底核）、hi
ppocampus（海馬）、thalamus（視床）、hypothalamus
（視床下部）、cerebral cortex（大脳皮質）、medulla
（延髄）、cerebellum（小脳）、spinal cord（脊
髄）、pituitary（下垂体）からグアニジンチオシアネ
ート法によって全ＲＮＡを分画後、この全ＲＮＡをオリ
ゴ(dT)スパンカラム（ファルマシア社）にかけて、poly
(A)⁺RNAを調製した。このpoly(A)+RNA ５μｇを１.５%
ホルマリン変性アガロースゲル電気泳動にかけた後、ナ
イロンメンブレンフィルター（日本ポール社, バイオダ
インＡ）にキャピラリーブロッティングにより１６時間
ブロッティングした。このナイロンメンブレンフィルタ
ーを紫外線処理によりブロッティングしたＲＮＡを固定
した後、ハイブリダイゼーション用緩衝液〔50%ホルム
アミド、5×SSPE、5×Denhardt's液、0.1% SDS、100μ
ｇ/ml 熱変性サケ精子ＤＮＡ〕中４２℃でプレハイブ
リダイゼーションを行なった。一方、プローブとしてラ
ットｐ２６をコ−ドするｃＤＮＡ（ｐＴＳ８３４）のEc
oRI-NcoI５１２ｂｐのｃＤＮＡ断片を〔α-³²P〕ｄＣＴ
Ｐとランダムプライマーラベリングキット（アマシャム
社）を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、標
識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液〔50
% ホルムアミド、5×SSPE、5×Denhardt's液、0.1% SD
S、100μｇ/ml 熱変性サケ精子ＤＮＡ〕中，４２℃で１
６時間ハイブリダイゼーションを行なった。フィルター
は、最終的に0.1×SSC, 0.1% SDS液中、５０℃で洗浄
後、オートラジオグラムをとってプローブとハイブリダ
イゼイションするバンドを検出した。その結果、脳内で
は、ラットｐ２６ｍＲＮＡの大きさは約１.１Ｋｂで、
その発現量は海馬、大脳皮質に最も発現が多く、次い
で、嗅球、扁桃核、大脳基底核に発現が見られた。視
床、視床下部、脊髄では発現が弱かった〔図５〕。

【００７４】

【実施例４】ヒト各組織のノザンハイブリダイゼーショ
ンヒト各組織のpoly(A)⁺RNA（クローンテック社）２μｇ
を１.５% ホルマリン変性アガロースゲル電気泳動にか
けた後、ナイロンメンブレンフィルター（日本ポール
社, バイオダインＢ）にキャピラリーブロッティングに
より１６時間ブロッティグした。このナイロンメンブレ
ンフィルターを紫外線処理によりブロッティングしたＲ
ＮＡを固定した後、ハイブリダイゼーション用緩衝液
〔50% ホルムアミド、5×SSPE、5×Denhardt's液、0.1%
SDS、100μｇ/ml 熱変性サケ精子ＤＮＡ〕中、４２℃
でプレハイブリダイゼーションを行なった。一方、プロ
ーブとしてヒトｐ２６タンパク質をコ−ドするｃＤＮＡ
（ｐＴＳ８５５）のBpu1 102I ６８８ｂｐのｃＤＮＡ断
片を〔α-³²P〕ｄＣＴＰとランダムプライマーラベリン
グキット（アマシャム社）を用いて標識した。ハイブリ
ダイゼーションは、標識プローブを含むハイブリダイゼ
ーション用緩衝液〔50% ホルムアミド、5×SSPE、5×De
nhardt's液、0.1% SDS、100μｇ/ml 熱変性サケ精子Ｄ
ＮＡ〕中、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを
行なった。フィルターは、最終的に0.1×SSC, 0.1% SDS
液中、５０℃で洗浄後、オートラジオグラムをとってプ
ローブとハイブリダイゼーションするバンドを検出し
た。その結果、約１.０Ｋｂのヒトｐ２６タンパク質を
コ−ドするｍＲＮＡは、ほとんどの組織で発現が見ら
れ、末梢血、胎児肝臓で最も多く発現が見られた〔図
６〕。

【００７５】

【実施例５】ヒトゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼ
ーションヒトゲノムＤＮＡ８μｇを各種制限酵素（EcoRI、Hind
III、BamHI、PstI、Bgl II）で切断した後、アガロース
ゲル電気泳動にかけた後、ナイロンメンブレンフィルタ
ー（日本ポール社, バイオダインＢ）にキャピラリーブ
ロッティングにより１６時間ブロッティグした。このナ
イロンメンブレンフィルターを紫外線処理によりブロッ
ティングしたＤＮＡを固定した後、ハイブリダイゼーシ
ョン用緩衝液〔0.5M リン酸ナトリウム（pH7.4）, 7% S
DS, 1% BSA, 1mM EDTA〕中、６５℃でプレハイブリダイ
ゼーションを行なった。一方、プローブとして、ヒトｐ
２６タンパク質をコ−ドするｃＤＮＡ（ｐＴＳ８５５）
のBanII-Bpu1102I １６７ｂｐのｃＤＮＡ断片を〔α-³²
P〕ｄＣＴＰとランダムプライマーラベリングキット
（アマシャム社）を用いて標識した。ハイブリダイゼー
ションは、標識プローブを含むハイブリダイゼーション
用緩衝液〔0.5M リン酸ナトリウム（pH7.4）, 7% SDS,
1% BSA, 1mM EDTA〕中、６５℃で１６時間ハイブリダイ
ゼーションを行なった。フィルターは、最終的に0.1×S
SC,0.1% SDS液中、５０℃で洗浄後、オートラジオグラ
ムをとってプローブとハイブリダイゼーションするバン
ドを検出した。その結果、EcoRI、HindIII、BamHI、Pst
I、Bgl IIで切断したレーンで、それぞれ一本ずつのバ
ンドが見られることから、ヒトｐ２６遺伝子は、ハプロ
イドセル当たり１コピー存在することが明らかとなった
〔図７〕。

【００７６】

【実施例６】ヒトｐ２６遺伝子の染色体番号の決定ヒト各種染色体を含む雑種細胞から得たＤＮＡをBamHI
で切断し、アガロースゲル電気泳動で分離したものをあ
らかじめブロッティングして、固定してあるメンブレン
フィルターをハイブリダイゼーション用緩衝液〔0.5M
リン酸ナトリウム（pH7.4）, 7% SDS, 1%BSA, 1mM EDT
A〕中、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行なっ
た。一方、プローブとしてヒトｐ２６タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡ（ｐＴＳ８５５）のBanII-Bpu1102I １
６７ｂｐのｃＤＮＡ断片を〔α-³²P〕ｄＣＴＰとランダ
ムプライマーラベリングキット（アマシャム社）を用い
て標識した。標識プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン用緩衝液〔0.5M リン酸ナトリウム（pH7.4）, 7% SD
S, 1% BSA, 1mM EDTA〕中、６５℃で１６時間ハイブリ
ダイゼーションを行なった。フィルターは、最終的に0.
1×SSC, 0.1% SDS 液中、５０℃で洗浄後、オートラジ
オグラムをとってプローブとハイブリダイゼーションす
るバンドを検出した。その結果、男性ヒトゲノムＤＮ
Ａ，女性ヒトゲノムＤＮＡ，ヒト１０番染色体を含む s
omatic-hybrid cell からとったＤＮＡのレーンのみに
それぞれ一本ずつハイブリダイゼーションするバンドが
見られたことより、ヒトｐ２６遺伝子は、１０番染色体
上に存在することが明らかとなった〔図８〕。

【００７７】

【実施例７】ラットｐ２６タンパク質の大腸菌中での発
現プラスミドの構築ラットｐ２６タンパク質を大腸菌中で大量に発現させる
ために、まずラットｐ２６タンパク質をβ−ガラクトシ
ダーゼとの融合タンパク質の形で発現させ、ラットｐ２
６タンパク質の部分のみを切り出すことを考えた。実施
例１で得たラットｐ２６ｃＤＮＡ断片を含むプラスミド
ｐＴＳ８２２を鋳型にして開始コドンのメチオニンを除
いた翻訳領域のみを含むように設計した２本のプライマ
−を用いてＰＣＲを行なった。この際に用いたプライマ
ーのうち順方向のプライマーは、Sal I部位に続いて、
血液凝固因子Ｘの認識部位であるIle-Glu-Gly-Argの４
アミノ酸に相当する塩基配列を持ち、ラットｐ２６の２
番目のアミノ酸：フェニルアラニンから１０番目のアミ
ノ酸：アルギニンに相当する塩基配列を持っている５０
merであり（配列番号：１２）、逆方向のプライマーは
１７３番目のアルギニンから終始コドンTAAまでの塩基
配列のうち１７７番目のアルギニンのコドンAGA→CGT、
181番目のスレオニンのコドンACA→ACCとなるようにコ
ドンを改変し、また終始コドンTAA の次にもう一つの終
始コドンTGAを導入し、末端にHindIII部位を持つように
した４６merである（配列番号：１３）。ＰＣＲで得ら
れたＤＮＡ断片をSal I, HindIIIで二重消化した後、ｐ
ＵＣ１１９のSalI-HindIII部位に導入し（ｐＴＳ８３
２）、ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片の塩基配列を
〔α-³²P〕ｄＣＴＰを用いて通常の方法で確認を行なっ
た。次に、この断片をlacプロモーターを持つβ−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク発現ベクターｐＵＲ２９０の
Sal I-Hind III部位に導入し、β−ガラクトシダーゼ−
ラットｐ２６タンパク質融合タンパク質の発現プラスミ
ドｐＴＳ８３３を得た〔図９〕。

【００７８】次に、ラットｐ２６タンパク質を大腸菌中
で直接発現させるための発現ベクターの構築を行なっ
た。実施例１で得た新規ｃＤＮＡ断片を含むプラスミド
ｐＴＳ８２２を鋳型にして翻訳領域のＮ末端部分のみを
含むように設計した２本のプライマー用いてＰＣＲを行
なった。この際に用いたプライマーのうち順方向のプラ
イマーはXbaI、NdeI部位（開始コドンのメチオニンに相
当する）に続いて１０番目のアミノ酸：セリンにまで相
当する塩基配列を大腸菌の至適コドンに変更した４３me
rであり（配列番号：１４）、逆方向のプライマーは７
３番目のアラニンから８２番目のアスパラギン酸に相当
する塩基配列を持つ２７merである（配列番号：１
５）。ここで得られたＤＮＡ断片をXbaI, NheIで二重消
化した後、先にβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパ
ク質を発現させる際に構築したｐＴＳ８３２のXbaI, Nh
eIに挿入して（ｐＴＳ８４１）、ＰＣＲによって得られ
たＤＮＡ部分の塩基配列を〔α-³²P〕ｄＣＴＰを用いて
通常の方法で確認を行なった。次に、ｐＴＳ８４１をNd
eI, HindIIIで二重消化した断片をＴ７プロモーターを
持つ発現ベクターｐＲＳＥＴＢのNdeI-HindIII部位に導
入し、ラットｐ２６タンパク質発現プラスミドｐＴＳ８
４２〔図１０〕を得た。

【００７９】

【実施例８】ラットｐ２６タンパク質の動物細胞中での
発現ベクターの構築ラットｐ２６タンパク質を動物細胞中で一過性で発現さ
せるための発現ベクターを構築した。まず、実施例１で
得たラットｐ２６ｃＤＮＡ断片を含むｐＴＳ８２３のNo
tI部位から上流領域を制限酵素XbaI、 NotIで二重消化
し、この部分に翻訳開始コドンのATGの直前にXbaI、Hin
dIII、SfiIの制限酵素部位がくるようにした合成ＤＮＡ
（配列番号：１６および１７）を導入し、ｐＴＳ８２５
を得た。このｐＴＳ８２５を制限酵素HindIII、Aor51HI
で二重消化し、得られた７８０ｂｐ断片をｐｃＤＮＡの
HindIII、EcoRI部位に導入し、動物細胞中の一過性発現
ベクターｐＴＳ８２９を得た。

【００８０】

【実施例９】β-ガラクトシダ−ゼ-ラットｐ２６融合タ
ンパク質を発現している大腸菌からの組換え体ラットｐ
２６タンパク質の精製およびそのタンパク質を用いた抗
ラットｐ２６タンパク質抗体の作製実施例７で得たβ−ガラクトシダーゼ−ラットｐ２６融
合タンパク発現プラスミドｐＴＳ８３３を用いて形質転
換した大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株を５０
μｇ/mlのビクシリン（明治製菓）を含むＬＢ培地中で
３７℃で培養し、O.D.₆₀₀≒0.6となったところで、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）１ｍＭ（最終濃度）を加えて発現を誘導し、さらに
６時間培養を続けた後、菌体を集菌した。この菌体をリ
ゾチ−ム、超音波で破砕した後、超遠心をかけて可溶画
分を得た。この可溶画分を抗β−ガラクトシダーゼモ
ノクローナル抗体カラム（プロメガ社）にかけ、β−ガ
ラクトシダーゼ−ラットｐ２６融合タンパク質を精製し
た。次に、精製したβ-ガラクトシダーゼ−ラットｐ２
６融合タンパク質を活性型血液凝固因子Ｘ（ニューイン
グランドバイオラブ社）で処理して、ラットｐ２６タン
パク質を切り出した。切り出されたラットｐ２６タンパ
ク質は、順次、陽イオン交換カラム（S-sepharose FF ;
ファルマシア）、疎水性カラム（Phenyl-superose ;
ファルマシア社）、ハイドロキシアパタイトカラム（三
井東圧化学）、陽イオン交換カラム（MONO S ; ファル
マシア社）を用いて、SDS-PAGE／クマシーブリリアント
ブルー染色でほぼ単一にまで精製した〔図１１〕。

【００８１】ここで得られた組み換え体ラットｐ２６タ
ンパク質をニュージーランドホワイトラビット（北山ラ
ベス社）に免疫して、抗ラットｐ２６タンパク質血清を
作製した。免疫は一回目は５０μｇの組み換え体ラット
ｐ２６タンパク質をフロイント完全アジュバント（ディ
フコ社）と混合して、２回目から５回目までは５０μｇ
の組み換え体ラットｐ２６タンパク質をフロイント不完
全アジュバント（ディフコ社）と混合して、皮下注射を
行うことにより計５回行なった。得られた抗血清を用い
てβ−ガラクトシダーゼ−ラットｐ２６融合タンパク
質、融合タンパク質から活性型血液凝固因子Ｘ（ニュー
イングランドバイオラブ社）で切り出した後、精製を行
なったラットｐ２６タンパク質および大腸菌中で直接発
現系で発現させたラットｐ２６タンパク質に対してウエ
スタンブロッティングを行なったところ、得られた抗血
清はこれらのタンパク質を特異的に認識することがわか
った〔図１２〕。ウエスタンブロッティングは、まずサ
ンプルバッファーに懸濁した試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥに
かけ、セミドライブロットシステム（バイオメトラ社）
によりＰＶＤＦメンブレン（Trans-Blot Transfer Memb
rane，バイオラド社）に転写した。このメンブレンを5%
BSAでブロッキングを行ない、２００倍稀釈した抗血清
で処理した後、金コロイド染色（アマシャム社）により
発色を行なった。β-ガラクトシダーゼ−ラットｐ２６
融合タンパク質から精製したラットｐ２６タンパク質と
大腸菌中で直接発現系で発現させたラットｐ２６タンパ
ク質の分子量に差が見られるのは、大腸菌中の直接発現
系で発現させたラットｐ２６タンパク質の開始コドンメ
チオニンの付加によるものと考えられる。

【００８２】

【実施例１０】直接発現系で大腸菌中で発現させた組換
え体ラットｐ２６タンパク質の精製およびそのタンパク
質を用いた抗ラットｐ２６タンパク質抗体の作製実施例７で得たラットｐ２６タンパク質発現プラスミド
ｐＴＳ８４２を用いて形質転換した大腸菌（Escherichi
a coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株を1.0M ソ
ルビトール（和光純薬）、2.5mM ベタイン（和光純
薬）、50μｇ/mlのビクシリン（明治製菓）、２５μｇ/
mlをクロラムフェニコール（和光純薬）含むＬＢ培地中
で２０℃で培養し、O.D.₆₀₀≒0.6となったところで、IP
TG 0.4mM（最終濃度）を加えて発現を誘導した。発現誘
導後、さらに４時間培養を続けた後、菌体を集菌し、50
mM MES（pH6.0）, 10mM EDTA, 1mM APMSFを含むバッフ
ァーに懸濁した。この懸濁液を凍結融解、超音波破砕を
行なって菌体を破砕した後、超遠心を行なって可溶画分
を調製した。ここで得られた可溶画分を順次、陽イオン
交換カラム（SP-sepharose FF；ファルマシア）、疎水
性カラム（Phenyl-Sepharose HP ; ファルマシア）、フ
ルオロアパタイトカラム（ペンタックス社））、陽イ
オン交換カラム（MONO S;ファルマシア）用いて、組み
換え体ラットｐ２６タンパク質をSDS-PAGE／クマシーブ
リリアントブルー染色でほぼ単一にまで精製した〔図１
３〕。精製した組み換え体ラットｐ２６タンパク質のＮ
末端のアミノ酸配列、および組換え体ラットｐ２６タン
パク質を種々のエンドペプチダーゼ（例、臭化シアンな
ど）で切断して得られたフラグメントペプチドのアミノ
酸配列を質量分析法とエドマン分解配列分析法を組み合
わせて決定したところ、ＤＮＡから予想されるアミノ酸
配列と全く同一であった。

【００８３】ここで得られた組み換え体ラットｐ２６タ
ンパク質をニュージーランドホワイトラビット（北山ラ
ベス）に免疫して、抗ラットｐ２６タンパク質血清を作
製した。免疫は一回目は２００μｇの組み換え体ラット
ｐ２６タンパク質をフロイント完全アジュバントと混合
して、２回目から５回目までは１００μｇの組み換え体
ラットｐ２６タンパク質をフロイント不完全アジュバン
トと混合して、皮下注射を行うことにより計５回行っ
た。この抗血清を抗原カラム（組み換え体ラットｐ２６
タンパク質を結合させた CNBr-Sepharose CL-4B（ファ
ルマシア社））を用いて精製し、抗原特異的な抗ラット
ｐ２６タンパク質抗体を精製した。この精製抗体と免疫
前にうさぎから採取した血清を用いて、実施例５で得た
ｐＴＳ８２９およびｐｃＤＮＡをトランスフェクション
したＣＯＳ-７細胞に対してウエスタンブロッティング
を行なった。その結果、ｐＴＳ８２９をトランスフェク
ションしたＣＯＳ-７細胞に対して、精製した抗ラット
ｐ２６タンパク質抗体を用いたときのみ、約２６ｋＤａ
のところに特異的なバンドが得られ、この抗体は特異的
にラットｐ２６タンパク質を認識することがわかった
〔図１４〕。そこで、この抗体を用いて８周令 Sprague
Dawley ラット（日本チャールズリバー社）の組織にお
けるｐ２６タンパク質の分布を見るためにウエスタンブ
ロッティングを行なったところ、おもに海馬、胸腺、脾
臓でｐ２６タンパク質の発現が確認された〔図１５〕。
ウエスタンブロッティングは、まずサンプルバッファー
に懸濁した試料をSDS-PAGEにかけ、セミドライブロット
システム（バイオメトラ社）によりニトロセルロースメ
ンブレン（シュライヒャー・アンド・シュエル社）に転
写した。このメンブレンを5% BSAでブロッキングを行な
い、２００倍稀釈した抗血清で処理した後、ECL ウエス
タンブロッティングシステム（アマシャム社）により検
出を行なった。

【００８４】

【実施例１１】ｐ２６タンパク質を発現しているヒト培
養細胞の探索ｐ２６タンパク質の機能を調べる上で必要なヒト培養細
胞の探索を実施例１０で得た抗ｐ２６抗体を用いてウエ
スタンブッロッティングを行なって調べた。実施例１０
と同様の方法で種々の血球系、グリア系の細胞について
ウエスタンブッロッティングを行なった結果、血球系の
細胞のうちＨＬ-６０、ＴＨＰ-１での発現は少なく、ヒ
トＴ細胞白血病細胞（MOLT-4, Jurkat, CCRF-HSB-2, H
9）に顕著なｐ２６タンパク質の発現が観察された〔図
１６〕。次に、この抗体を用いてヒトＴ細胞白血病細胞
Jurkatからヒトｐ２６タンパク質を免疫沈降することを
試みた。RPMI 1640 培地＋10% FBS培地（ハイクロン
社）でコンフルエント（約2.4×10⁶cell/ml）にまで培
養したヒトＴ細胞白血病細胞Jurkatを前日に、７０％コ
ンフルエントになるように同じ培地で継代した。次の
日、細胞をメチオニンを含まないRPMI1640培地で洗った
後、メチオニンを含まないRPMI1640培地＋10% 透析FBS
（ハイクロン社）に培地交換した後、６-wellプレ−ト
にまき、〔³⁵S〕−メチオニン（アマシャム社，10mCi/m
l）を最終濃度１００μCi/mlとなるように加え、CO₂ in
cubatorで３時間培養した。メタボリックラベルされた
細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＴＳＥバッファー〔50mM
トリス-塩酸（pH8.0）、0.1% Softes-12（ライオン
社）、1mM EDTA、150mM 塩化ナトリウム〕に溶解した。
これを遠心して得られた上清に実施例１０で得た抗ｐ２
６精製抗体を結合させたProtein A-Sepharose CL-4B、
もしくは免疫前の抗体を結合させたProtein A- Sepharo
se CL-4B加え、４℃、２時間反応させた。そして、それ
ぞれの抗体を結合させたProtein A-Sepharose CL-4Bを
ＴＳＥバッファーで洗浄した後、サンプルバッファーに
懸濁し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた。泳動後、ゲルを乾
燥させ、BAS2000（富士フィルム）を用いてオートラジ
オグラムをとった。その結果、抗ラットｐ２６精製抗体
を結合させたProtein A-Sepharose CL-4Bのレーンのみ
約２６ｋＤａのところに特異的にバンドが得られ、この
抗体は特異的にヒトp２６タンパク質を免疫沈降できる
ことがわかった〔図１７〕。

【００８５】

【実施例１２】ｐ２６タンパク質の細胞内局在ヒトＴ細胞白血病細胞Jurkat４×１０⁷細胞を０.２５M
しょ糖（和光純薬）を含む低濃度バッファー〔10mM MES
(pH6.0), 1mM EDTA〕でホモジナイズし、段階的な遠心
を行なって、細胞内小器官を５段階分画した各画分を実
施例１０と同様の方法でウエスタンブロットを行なった
ところ、ｐ２６タンパク質は細胞質に局在することが確
認された〔図１８〕。

【００８６】

【実施例１３】ｐ２６タンパク質の in vitro りん酸化リン酸化されると推定されるアミノ酸部位を持つｐ２６
タンパク質が細胞内で実際にリン酸化されているかどう
か調べるために、ヒトＴ細胞白血病細胞Jurkat細胞を〔
³²P〕-オルトリン酸でメタボリックラベルし、抗ラット
ｐ２６タンパク質抗体を用いて免疫沈降を行なった。RP
MI 1640培地＋10% FBS培地（ハイクロン社）でコンフル
エント（約2.4×10⁶cell/ml）にまで培養したヒトＴ細
胞白血病細胞Jurkatを前日に、７．0％コンフルエント
になるように同じ培地で継代する。次の日、細胞をリン
酸を含まないRPMI1640培地で洗った後、リン酸を含まな
いRPMI1640培地＋10% 透析FBS（ハイクロン社）に培地
交換した後、６-wellプレ−トにまき、〔³²P〕-オルソ
リン酸（デュポン/NEN, 150mCi/ml）を最終濃度１mCi/m
lとなるように加え、CO₂インキュベーターで４時間培養
した。Phorbol 12-Myristate 13-Acetate（ＴＰＡ）
（和光純薬）を加えて細胞を刺激する場合は、〔³²P〕-
オルソリン酸を加えて２時間培養後に、最終濃度１０ｎ
ｇ/mlとなるようにＴＰＡを加え、さらに２時間培養を
続けた。メタボリックラベルされた細胞をPBSで洗浄し
た後、TSEバッファー〔50mM トリス-塩酸（pH8.0）、0.
1% Softes-12（ライオン）、1mM EDTA、150mM 塩化ナト
リウム〕に溶解した。これを遠心して得られた上清に実
施例１０で得た抗ラットｐ２６精製抗体を結合させたpr
oteinA-Sepharose CL-4Bを加え、４℃、２時間反応させ
た。そして、抗ラットｐ２６精製抗体を結合させたProt
ein A-Sepharose CL-4BをTSEバッファーで洗浄した後、
サンプルバッファ−に懸濁し、SDS-PAGEにかけた。泳動
後、ゲルを乾燥させ、BAS2000（富士フィルム）を用い
てオートラジオグラムをとった。その結果、ヒトＴ細胞
白血病細胞Jurkatでは、ｐ２６タンパク質は、無刺激の
状態でもリン酸化されていることが判明した。また、Ｔ
ＰＡ刺激によって、さらにリン酸化が進むことから、ｐ
２６タンパク質はプロテインキナーゼＣによってリン酸
化されていることが分かった〔図１９〕。

【００８７】

【実施例１４】ラットｐ２６タンパク質発現の肝臓にお
ける加齢変化ラットｐ２６タンパク質発現の肝臓における加齢変化を
見るために、ノザンブロッティングとウエスタンブロッ
ティングを行なって、ｐ２６タンパク質をコードするｍ
ＲＮＡの変化と、ｐ２６タンパク質の両方の変化を見
た。まず、Sprague Dawleyラット（日本チャールズリバ
ー社）の１７.５日胎児、新生児、生後２周令、８周令
の肝臓からグアニジンチオシアネート法によって、全Ｒ
ＮＡを分画後、この全ＲＮＡをオリゴ（dT）スパンカラ
ム（ファルマシア社）にかけてpoly(A)⁺RNAを調製し
た。このpoly(A)⁺RNA２μｇを 1.5% ホルマリン変性ア
ガロ−スゲル電気泳動にかけた後、ナイロンメンブレン
フィルター（日本ポール社、バイオダインＢ）にキャピ
ラリーブロッティングにより１６時間ブロッティングし
た。このナイロンメンブレンフィルターを紫外線処理に
よりブロッティングしたＲＮＡを固定した後、ハイブリ
ダイゼーション用緩衝液〔50% ホルムアミド、5×SSP
E、5×Denhardt's液、0.1% SDS、100μｇ/ml 熱変性サ
ケ精子ＤＮＡ〕中、４２℃でプレハイブリダイゼーショ
ンを行なった。プローブとして、ラットｐ２６をコード
するｃＤＮＡ（ｐＴＳ８３４）の SacII-Aor51HI ７７
５ｂｐのｃＤＮＡ断片を〔α-³²P〕ｄＣＴＰとランダム
プライマ-ラベリングキット（アマシャム社）を用いて
標識した。ハイブリダイゼーションは、標識プローブを
含むハイブリダイゼーション用緩衝液〔50% ホルムアミ
ド、5×SSPE、5×Denhardt's液、0.1% SDS、100μｇ/ml
熱変性サケ精子ＤＮＡ〕中、４２℃で１６時間ハイブ
リダイゼーションを行なった。フィルターは、最終的に
0.1×SSC, 0.1% SDS液中、６０℃で洗浄後、オートラジ
オグラムをとってプローブとハイブリダイゼーションす
るバンドを検出した。その結果、ｐ２６タンパク質をコ
ードするｍＲＮＡは、１７.５日胎児で最も多く発現し
ており、発生とともに発現量は徐々に減少し、生後２周
令、８周令ではごくわずかに発現が見られるだけであっ
た〔図２０〕。次に、同じラットの肝臓を経時的に摘出
し、クマシーブリリアントブルー染色および実施例１０
に記載した方法と同様の方法で抗ラットｐ２６タンパク
質抗体を用いてウエスタンブロットを行ない、タンパク
量の変化を見た。その結果、ｐ２６タンパク質の量は加
齢とともに減少してきており、８周令の肝臓ではほとん
ど発現は認められなかった〔図２１〕。これは、ノザン
ブロット解析によるｐ２６タンパク質をコードするｍＲ
ＮＡの発現パターンとも相関し、肝臓が造血器官として
機能している胎児期にｐ２６タンパク質が多く発現して
いることが示された。

【００８８】

【実施例１５】ラットｐ２６タンパク質のカゼインキナ
ーゼIIによるin vitroリン酸化リン酸化されると推定されるアミノ酸部位を持つｐ２６
タンパク質がカゼインキナーゼIIによってリン酸化され
ているかどうか確認するために、in vitroでカゼインキ
ナーゼIIによるリン酸化を調べた。実施例１０で得た組
換えラットｐ２６タンパク質２３８ｐｍｏｌに１００ｎ
ＭＡＴＰ、６.６６ｐｍｏｌ〔γ-³²Ｐ〕ＡＴＰ（Dupon
t/NEN，3000Ci/mmol，10mCi/ml）、組換えカゼインキナ
ーゼII１０００units（New England Biolabs（英国））
を加え、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂液中で、それぞれ０.１，
２.５，１０，３０，６０，１２０分間、３０℃で反応
させた。反応は、サンプル緩衝液に懸濁することによっ
て停止させ、この反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
泳動後、クマシーブリリアントブルー染色して各レーン
にほぼ等量のｐ２６タンパク質がのっていることを確認
した後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラムをとって
ｐ２６タンパク質のリン酸化を確認した。その結果、
〔図２２〕に示したとおり、反応時間が経過するごとに
オートラジオグラムのバンドが濃くなっていることか
ら、ラットｐ２６タンパク質はin vitroでカゼインキナ
ーゼIIの基質となることがわかった。

【００８９】

【発明の効果】本発明のｐ２６タンパク質は、プロテイ
ンキナーゼを促進もしくは阻害する活性や脱リン酸化酵
素を阻害する活性を有する化合物またはその塩をスクリ
ーニングするための試薬として有用である。また、本発
明のｐ２６タンパク質およびそれをコードするＤＮＡ
は、例えば、再生不良性貧血、急性骨髄性白血病、Ｔ細
胞白血病などの造血系に関与する疾病の予防・治療剤と
して有用である。さらに、本発明のｐ２６タンパク質に
対する抗体は、ｐ２６タンパク質を特異的に認識するこ
とができるので、被検液中のｐ２６タンパク質の定量な
どに使用することができる。

【００９０】

【配列表】

【配列番号：１】配列の長さ：１８１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Phe Thr Arg Ala Val Ser Arg Leu Ser Arg Lys Arg Pro Pro Ser 1 5 10 15 Asp Ile His Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Gly His Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ser Thr Ala Lys Trp Ala Ser Ser Leu Glu Asn Leu Leu Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Gly Val Lys Arg Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys Glu Phe Ser 50 55 60 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Asp Phe Lys Lys Thr 65 70 75 80 Glu Asp Lys Lys Gln Met Gln Glu Lys Ala Lys Lys Ile Tyr Met Thr 85 90 95 Phe Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ser Gln Val Asn Val Glu Gly Gln Ser 100 105 110 Arg Leu Thr Glu Lys Ile Leu Glu Glu Pro His Pro Leu Met Phe Gln 115 120 125 Lys Leu Gln Asp Gln Ile Phe Asn Leu Met Lys Tyr Asp Ser Tyr Ser 130 135 140 Arg Phe Leu Lys Ser Asp Leu Phe Leu Lys His Arg Arg Thr Glu Glu 145 150 155 160 Glu Glu Glu Asp Pro Pro Asp Ala Gln Thr Ala Ala Lys Arg Ala Ser 165 170 175 Arg Ile Tyr Asn Thr 180

【００９１】

【配列番号：２】配列の長さ：１８１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Phe Asn Arg Ala Val Ser Arg Leu Ser Arg Lys Arg Pro Pro Ser 1 5 10 15 Asp Ile His Asp Ser Asp Gly Ser Ser Ser Ser Ser His Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ser Thr Ala Lys Trp Ala Ala Ser Leu Glu Asn Leu Leu Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Gly Val Lys Arg Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys Glu Phe Ser 50 55 60 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Asp Phe Lys Lys Met 65 70 75 80 Gln Asp Lys Thr Gln Met Gln Glu Lys Ala Lys Glu Ile Tyr Met Thr 85 90 95 Phe Leu Ser Ser Lys Ala Ser Ser Gln Val Asn Val Glu Gly Gln Ser 100 105 110 Arg Leu Asn Glu Lys Ile Leu Glu Glu Pro His Pro Leu Met Phe Gln 115 120 125 Lys Leu Gln Asp Gln Ile Phe Asn Leu Met Lys Tyr Asp Ser Tyr Ser 130 135 140 Arg Phe Leu Lys Ser Asp Leu Phe Leu Lys His Lys Arg Thr Glu Glu 145 150 155 160 Glu Glu Glu Asp Leu Pro Asp Ala Gln Thr Ala Ala Lys Arg Ala Ser 165 170 175 Arg Ile Tyr Asn Thr 180

【００９２】

【配列番号：３】配列の長さ：１８１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Phe Thr Arg Ala Val Ser Arg Leu Ser Arg Lys Arg Pro Pro Ser 1 5 10 15 Asp Ile His Asp Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Gly His Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ser Thr Ala Lys Trp Ala Ser Ser Leu Glu Asn Leu Leu Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Gly Val Gln Arg Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys Glu Phe Ser 50 55 60 Glu Glu Asn Val Leu Phe Trp Leu Ala Cys Glu Asp Phe Lys Lys Thr 65 70 75 80 Glu Asp Arg Lys Gln Met Gln Glu Lys Ala Lys Lys Ile Tyr Met Thr 85 90 95 Phe Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ser Gln Val Asn Val Glu Gly Gln Ser 100 105 110 Arg Leu Thr Glu Lys Ile Leu Glu Glu Pro His Pro Leu Met Phe Gln 115 120 125 Lys Leu Gln Asp Gln Ile Phe Asn Leu Met Lys Tyr Asp Ser Tyr Ser 130 135 140 Arg Phe Leu Lys Ser Asp Leu Phe Leu Lys Pro Arg Arg Thr Glu Glu 145 150 155 160 Glu Glu Glu Glu Pro Pro Asp Ala Gln Thr Ala Ala Lys Arg Ala Ser 165 170 175 Arg Ile Tyr Asn Thr 180

【００９３】

【配列番号：４】配列の長さ：５４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGTTCACCC GCGCCGTGAG CCGACTGAGC AGGAAGCGGC CGCCGTCTGA TATCCACGAC 60 GGCGATGGGA GCTCAAGCAG CGGCCACCAG AGCCTCAAGA GCACAGCCAA GTGGGCGTCC 120 TCCCTGGAGA ATCTTCTGGA AGATCCAGAG GGCGTGAAGA GATTCAGGGA ATTTCTGAAA 180 AAGGAATTCA GTGAGGAAAA CGTCTTGTTT TGGCTAGCGT GTGAAGATTT CAAGAAAACG 240 GAGGACAAGA AGCAGATGCA GGAAAAGGCC AAGAAGATCT ACATGACCTT CCTGTCCAAT 300 AAGGCCTCTT CACAAGTCAA TGTGGAGGGG CAGTCTCGGC TCACTGAAAA GATTCTGGAA 360 GAACCACACC CTCTGATGTT CCAAAAGCTC CAGGACCAGA TCTTCAATCT CATGAAGTAT 420 GACAGCTACA GCCGCTTCTT GAAGTCTGAC TTGTTTCTGA AGCACCGGCG GACTGAGGAA 480 GAGGAAGAGG ATCCTCCGGA CGCTCAAACT GCAGCTAAGC GAGCTTCCAG AATCTACAAC 540 ACA 543

【００９４】

【配列番号：５】配列の長さ：５４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGTTCAACC GCGCCGTGAG CCGGCTGAGC AGGAAGCGGC CGCCGTCAGA CATCCACGAC 60 AGCGATGGCA GTTCCAGCAG CAGCCACCAG AGCCTCAAGA GCACAGCCAA ATGGGCGGCA 120 TCCCTGGAGA ATCTGCTGGA AGACCCAGAA GGCGTGAAAA GATTTAGGGA ATTTTTAAAA 180 AAGGAATTCA GTGAAGAAAA TGTTTTGTTT TGGCTAGCAT GTGAAGATTT TAAGAAAATG 240 CAAGATAAGA CGCAGATGCA GGAAAAGGCA AAGGAGATCT ACATGACCTT TCTGTCCAGC 300 AAGGCCTCAT CACAGGTCAA CGTGGAGGGG CAGTCTCGGC TCAACGAGAA GATCCTGGAA 360 GAACCGCACC CTCTGATGTT CCAGAAACTC CAGGACCAGA TCTTTAATCT CATGAAGTAC 420 GACAGCTACA GCCGCTTCTT AAAGTCTGAC TTGTTTTTAA AACACAAGCG AACCGAGGAA 480 GAGGAAGAAG ATTTGCCTGA TGCTCAAACT GCAGCTAAAA GAGCTTCCAG AATTTATAAC 540 ACA 543

【００９５】

【配列番号：６】配列の長さ：５４３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATGTTCACCC GCGCCGTGAG CCGACTGAGC AGGAAGCGGC CGCCGTCTGA TATCCATGAC 60 GGAGATGGGA GCTCAAGCAG CGGCCACCAG AGCCTTAAGA GCACAGCCAA GTGGGCATCC 120 TCCCTGGAGA ATCTTCTGGA AGACCCAGAA GGGGTGCAGA GATTCAGGGA GTTTCTGAAG 180 AAGGAATTCA GCGAAGAGAA TGTCTTGTTT TGGCTAGCGT GTGAAGATTT CAAGAAAACG 240 GAGGACAGGA AGCAGATGCA GGAAAAGGCC AAGGAGATCT ACATGACCTT CCTGTCCAAT 300 AAGGCCTCTT CACAAGTCAA CGTGGAGGGG CAGTCTCGGC TCACTGAAAA GATTCTGGAA 360 GAGCCACACC CTCTGATGTT CCAAAAGCTC CAGGACCAGA TCTTCAATCT CATGAAGTAT 420 GACAGCTACA GCCGCTTCTT GAAGTCTGAC TTGTTTCTGA AACCCAAGCG AACTGAGGAA 480 GAGGAAGAAG AGCCCCCGGA TGCTCAGACC GCAGCTAAGC GAGCCTCCAG AATTTACAAC 540 ACA 543

【００９６】

【配列番号：７】配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CACTCGGACG GCATCTTCAC TGACAGCTAC AGCCGCTACC GGAAGCAAAT G 51

【００９７】

【配列番号：８】配列の長さ：５１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TAGGACAGCC GCCAAGTATT TCTTAACAGC CATTTGCTTC CGGTAGCGGC T 51

【００９８】

【配列番号：９】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AGATTCTCCA GGGAGGACGC CCAC 24

【００９９】

【配列番号：１０】配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTGTGCTCTT GAGGCTCTGG TGGC 24

【０１００】

【配列番号：１１】配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTGACTCGAG GTCGACAAGC TTTTTTTTTT TTTTTTT 37

【０１０１】

【配列番号：１２】配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ATCCGTCGAC CATCGAAGGT CGTTTCACCC GCGCTGTGAG CCGACTGAGC 50

【０１０２】

【配列番号：１３】配列の長さ：４６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＧＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＴＡＡＴＧＡＴＣ
ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＣ４６

【０１０３】

【配列番号：１４】配列の長さ：４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＣＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＡＣＣＣＧＣＧＣＴＧＴＧＡＧ
ＣＣＧＴＣＴＧＡＧＣ４３

【０１０４】

【配列番号：１５】配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCGTGTGAAG ATTTCAAGAA AACGGAGGAC 30

【０１０５】

【配列番号：１６】配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡ
ＣＣＣＧＣＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡ６０ＡＧＣ
６３

【０１０６】

【配列番号：１７】配列の長さ：６３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣＧＣＧＧ
ＧＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＴＡＡＧＣ６０ＴＴＴ
６３

【０１０７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列とそれにコードされるラットｐ２６タンパク質
のアミノ酸配列を示す。

【図２】ヒトｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡの塩
基配列とそれにコードされるヒトｐ２６タンパク質のア
ミノ酸配列を示す。

【図３】マウスｐ２６タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列とそれにコードされるヒトｐ２６タンパク質の
アミノ酸配列を示す。

【図４】ヒトｐ２６タンパク質（HUMAN p26）、ラット
ｐ２６タンパク質（RAT p26）およびマウスｐ２６タン
パク質（MOUSE p26）のアミノ酸配列の比較表を示す。
影になっている所は相同なアミノ酸であることを示す。

【図５】ラットｐ２６タンパク質をコードするｍＲＮＡ
のラット脳の各部位における発現量をノザンハイブリダ
イゼーションで調べた結果を示す。Olfactory bulbは嗅
球を、Amygdalaは扁桃核を、Basal gangriaは大脳基底
核を、Hippocampusは海馬を、Thalamusは視床を、Hypot
halamusは視床下部を、Cerebral cortexは大脳皮質を、
Medullaは延髄を、Cerebellumは小脳を、Spinal cordは
脊髄を、Pituitaryは下垂体を示す。左側の数字（ｋ
ｂ）はＲＮＡ分子量マーカーの大きさを示す。Ｇ３ＰＤ
Ｈは内部マーカーとしてとったグリセルアルデヒド３−
リン酸デヒドロゲナーゼのハイブリダイゼーションのパ
ターンを示す。

【図６】ヒトｐ２６タンパク質をコードするｍＲＮＡの
ヒトの各組織における発現量をノザンハイブリダイゼー
ションで調べた結果を示す。Heartは心臓を、Brainは脳
を、Placentaは胎盤を、Lungは肺を、Liverは肝臓を、S
keltal Muscleは骨格筋を、Kindneyは腎臓を、Pancreas
は膵臓を、Spleenは脾臓を、Thymusは胸腺を、Prostate
は前立腺を、Testisは精巣を、Ovaryは卵巣、Small Int
estineは小腸を、Colonは大腸を、Peripheral Bloodは
末梢血を、Fetal Heartは胎児心臓を、Fetal Brainは胎
児脳を、Fetal Lungは胎児肺を、Fetal Liverは胎児肝
臓を、Fetal Kindneyは胎児腎臓を示す。左側の数字
（ｋｂ）はＲＮＡ分子量マーカーの大きさを示す。

【図７】ヒトゲノムＤＮＡとヒトｐ２６タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡ断片を用いてサザンハイブリダイゼー
ションを行なった結果を示す。各レーンは、ヒトゲノム
ＤＮＡを切断した制限酵素の種類を示す。左側の数字
（ｋｂｐ）はＤＮＡ分子量マーカーの大きさを示す。

【図８】ヒトｐ２６タンパク質をコードするｃＤＮＡ断
片を用いて、ヒトの各種染色体を有する雑種細胞から得
たＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションを行な
い、ヒトｐ２６遺伝子が存在する染色体番号を決定した
結果を示す。Malehuman genomic DNAは女性ヒトゲノム
ＤＮＡを、Male human genomic DNAは男性ヒトゲノムＤ
ＮＡを、Mouse genomic DNAマウスゲノムＤＮＡを、Ham
ster genomic DNAはハムスターゲノムＤＮＡを、chromo
some１は１番染色体を、chromosome２は２番染色体を、
chromosome３は３番染色体を、chromosome４は４番染色
体を、chromosome５は５番染色体を、chromosome６は６
番染色体を、chromosome７は７番染色体を、chromosome
８は８番染色体を、chromosome９は９番染色体を、chro
mosome１０は１０番染色体を、chromosome１１は１１番
染色体を、chromosome１２は１２番染色体を、chromoso
me１３は１３番染色体を、chromosome１４は１４番染色
体を、chromosome１５は１５番染色体を、chromosome１
６は１６番染色体を、chromosome１７は１７番染色体
を、chromosome１８は１８番染色体を、chromosome１９
は１９番染色体を、chromosome２０は２０番染色体を、
chromosome２１は２１番染色体を、chromosome２２は２
２番染色体を、chromosomeＸはＸ染色体を、chromosome
ＹはＹ染色体を示す。左側の数字（ｋｂ）は分子量マー
カーの大きさを示す。

【図９】β−ガラクトシダーゼ−ラットｐ２６融合タン
パク質の発現プラスミドｐＴＳ８３３の構築図を示す。
ｌａｃＺはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、Ｒａｔｐ
２６はラットｐ２６タンパク質ＤＮＡを、lac promoter
はlacプロモーターを、Ａｍｐ^rはアンピシリン耐性遺伝
子を示す。

【図１０】ラットｐ２６タンパク質の発現プラスミドｐ
ＴＳ８４２の構築図を示す。Ｒａｔｐ２６はラットｐ
２６タンパク質ＤＮＡを、T7 promoterはＴ７プロモー
ターを、Ａｍｐ^rはアンピシリン耐性遺伝子を示す。

【図１１】実施例９で得られたラットｐ２６タンパク質
の各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブリ
リアントブルー染色の結果を示す。横軸は各精製段階に
おけるタンパク質画分を、縦軸はタンパク質の分子量マ
ーカーの大きさをＫＤａで示す。矢印はラットｐ２６タ
ンパク質のバンドを示す。

【図１２】実施例９で得られた抗ラットｐ２６タンパク
質血清を用いて、大腸菌で発現させた種々のラットｐ２
６タンパク質に対してウエスタンブロティングを行なっ
た結果を示す。ＣＢＢＲ stainはクマシーブリリアント
ブルー染色の結果を、Immunoblotはウエスタンブロティ
ングの結果を示す。左側の数字（ＫＤａ）はタンパク質
の分子量マーカーの大きさを示す。

【図１３】実施例１０で得られたラットｐ２６タンパク
質の各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブ
リリアントブルー染色の結果を示す。横軸は各精製段階
におけるタンパク質画分を、縦軸はタンパク質の分子量
マーカーの大きさを示す。矢印はラットｐ２６タンパク
質のバンドを示す。

【図１４】実施例１０で得られた抗ラットｐ２６タンパ
ク質抗体が、ウエスタンブロッティングにおいて、ＣＯ
Ｓ−７細胞に発現したラットｐ２６タンパク質を特異的
に認識することを示す。ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡＩはｐ
ｃＤＮＡＩをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、
ＣＯＳ−７／ｐＴＳ８２９はｐＴＳ８２９をトランスフ
ェクトしたＣＯＳ−７細胞を示す。Pre-immuneは免疫沈
降前の試料を、immuneは免疫沈降後の試料を示す。左側
の数字（ＫＤａ）はタンパク質の分子量マーカーを示
す。

【図１５】実施例１０で得られた抗ラットｐ２６タンパ
ク質抗体を用いて、ラットの各組織におけるｐ２６タン
パク質の分布を調べた結果を示す。brainは脳を、hippo
campusは海馬を、thymusは胸腺を、spleenは脾臓を、li
verは肝臓を、testisは精巣を示す。左側の数字（ＫＤ
ａ）はタンパク質の分子量マーカーを示す。

【図１６】実施例１０で得られた抗ラットｐ２６タンパ
ク質抗体を用いて、ヒトの各種細胞におけるｐ２６タン
パク質の分布を調べた結果を示す。横軸は細胞の種類
を、縦軸はタンパク質の分子量を示す。MOLT-4、Jurka
t、CCRF-HSB-2、H9、HL-60、THP-1、MEG-01、U251、KNS
42はそれぞれヒト細胞株を示す。

【図１７】実施例１０で得られた抗ラットｐ２６タンパ
ク質抗体を用いて、〔³⁵Ｓ〕メチオニンでラベルしたヒ
トＴ細胞白血病細胞Jurkatからｐ２６タンパク質を免疫
沈降させた結果を示す。Pre-immuneは免疫沈降前の試料
を、immuneは免疫沈降後の試料を示す。左側の数字（Ｋ
Ｄａ）はタンパク質の分子量マーカーの大きさを示す。

【図１８】実施例１０で得られた抗ラットｐ２６タンパ
ク質抗体を用いて、ｐ２６タンパク質の細胞内における
局在性を調べた結果を示す。レーン１はヒトＴ細胞白血
病細胞の全タンパク質（whole cell）を、レーン２はヒ
トＴ細胞白血病細胞のホモジネート画分（homogenate）
を、レーン３はヒトＴ細胞白血病細胞のホモジネート画
分を９００ｇで遠心した沈降画分（900g pellet(nucl
i)）、レーン４はヒトＴ細胞白血病細胞のホモジネート
画分を５０００ｇで遠心した沈降画分（5000g pellet(m
itochondria)）、レーン５はヒトＴ細胞白血病細胞のホ
モジネート画分を８０００ｇで遠心した沈降画分（8000
g pellet(lysosome)）、レーン６はヒトＴ細胞白血病細
胞のホモジネート画分を１００００ｇで遠心した沈降画
分（10000g pellet(Microsome)）、レーン７はヒトＴ細
胞白血病細胞のホモジネート画分を１００００ｇで遠心
した上清画分（10000g SUP(cytosol)）を示す。

【図１９】ヒトＴ細胞白血病細胞JurkatをＴＰＡ（Phor
bol 12-Myristate 13-Acetate）で刺激した時の、ｐ２
６タンパク質のリン酸化を調べた結果を示す。Control
はＴＰＡ処理していない場合を、TPA-treatmentはＴＰ
Ａ処理した場合を示す。左側の数字（ＫＤａ）はタンパ
ク質の分子量マーカーの大きさを示す。

【図２０】ラットｐ２６タンパク質をコードするｍＲＮ
Ａの肝臓における発現量の加齢変化をノーザンブロッテ
ィングで調べた結果を示す。17.5day embryoは１７．５
日胎児を、New bornは新生児を、2-weekは生後２周令
を、8-weekは生後８周令を示す。左側の数字（Ｋｂ）は
ＲＮＡ分子量マーカーの大きさを示す。Ｇ３ＰＤＨは内
部マーカーとしてとったグリセルアルデヒド３−リン酸
デヒドロゲナーゼのハイブリダイゼーションのパターン
を示す。

【図２１】ラットｐ２６タンパク質の肝臓における発現
量の加齢変化をウエスタンブロッティングで調べた結果
を示す。17.5day embryoは１７．５日胎児を、New born
は新生児を、2-weekは生後２周令を、8-weekは生後８周
令を示す。Coomassie Stainはクマシーブリリアントブ
ルー染色の結果を、Western Blottingはウエスタンブロ
ッティングの結果を示す。左側の数字（ＫＤａ）はタン
パク質の分子量マーカーの大きさを示す。

【図２２】in vitroでのカゼインキナーゼIIによるｐ２
６タンパク質のリン酸化を調べた結果を示す。Ａは〔³²
Ｐ〕でリン酸化されたｐ２６タンパク質のオートラジオ
グラムをとった結果を示し、上の数字は反応時間を示
し、Ａの左側の数字（ＫＤａ）はタンパク質の分子量マ
ーカーの大きさを示す。ＢはＡと同じゲルをクマシーブ
リリアントブルーで染色した結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/52 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ 16/24 ＡＣＣＣ１２Ｎ 1/21 ＡＤＶＣ１２Ｐ 21/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその
塩。
【請求項２】配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
第５５〜７７番目および第１３７〜１４９番目のアミノ
酸配列を有するアミノ酸配列である請求項１記載のタン
パク質。
【請求項３】配列番号：１、配列番号：２または配列番
号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の
第４〜２０番目、第２２〜２７番目、第２９〜３９番
目、第４１〜５２番目、第５４〜７９番目、第８５〜９
１番目、第９３〜９９番目、第１０１〜１１４番目、第
１１６〜１５４番目、第１５７〜１６３番目および第１
６６〜１８１番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
である請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】請求項１記載のタンパク質の部分ペプチド
またはその塩。
【請求項５】請求項１記載のタンパク質または請求項４
記載の部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮ
Ａを含有するＤＮＡ。
【請求項６】配列番号：４、配列番号：５または配列番
号：６で表される塩基配列を有する請求項５記載のＤＮ
Ａ。
【請求項７】請求項５記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター。
【請求項８】請求項７記載の組換えベクターを保持する
形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換体を培養し、請求
項１記載のタンパク質またはその塩を生成、蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタ
ンパク質またはその塩の製造方法。
【請求項１０】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有してなる医
薬。
【請求項１１】請求項５記載のＤＮＡを含有してなる医
薬。
【請求項１２】再生不良性貧血、急性骨髄性白血病もし
くはＴ細胞白血病の治療・予防剤または免疫調節剤であ
る請求項１０または１１記載の医薬。
【請求項１３】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体。
【請求項１４】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とする脱リン酸化酵素阻害活性を有する化合物またはそ
の塩のスクリーニング方法。
【請求項１５】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する脱リン酸
化酵素阻害活性を有する化合物またはその塩のスクリー
ニング用キット。
【請求項１６】請求項１４記載のスクリーニング方法ま
たは請求項１５記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる脱リン酸化酵素阻害活性を有する化合物または
その塩。
【請求項１７】リン酸化された請求項１記載のタンパク
質、請求項４記載の部分ペプチドまたはそれらの塩の脱
リン酸化酵素による脱リン酸化を阻害する活性を有する
化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１８】請求項１記載のタンパク質、請求項４記
載の部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴
とするプロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物また
はその塩のスクリーニング方法。