JPH093100A

JPH093100A - 毛髪表層認識抗体，毛髪処理剤及び染毛剤並びに毛髪損傷診断剤

Info

Publication number: JPH093100A
Application number: JP11557196A
Authority: JP
Inventors: Kenji Kizawa; 謙司木澤; Junichiro Hiraoka; 淳一郎平岡; Hideyo Uchiwa; 秀世打和; Umeji Murakami; 梅司村上
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1995-04-18
Filing date: 1996-04-11
Publication date: 1997-01-07

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明の目的は、毛髪の表層部分に対して、強
い親和性をもって特異的に結合し、その結果、毛髪の強
度、しなやかさ、風合い等を良好にする特性を備える毛
髪表層認識抗体、および、この抗体を配合した毛髪処理
剤、染毛剤および毛髪診断剤を提供することにある。【構成】本発明は、毛髪表層をチオールプロテアーゼの
一種パパイン等の蛋白質分解酵素または固定化蛋白質分
解酵素で処理して得られるペプチド画分およびＳ１００
蛋白質を抗原として免疫して得られる毛髪表層認識抗
体、および、この抗体を含有する毛髪処理剤、染毛剤お
よび毛髪診断剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、毛髪の表層部分に
対して、強い親和性をもって特異的に結合し、その結
果、毛髪の強度、しなやかさ、風合い等を良好にする特
性を備える毛髪表層認識抗体、および毛髪表層認識抗体
を配合した毛髪処理剤、染毛剤および毛髪損傷診断剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、ヒト毛髪ケラチンに対する抗
体は毛髪の破断強度を強くし、毛髪保護作用を有するこ
とが示されている（日本皮膚科学会雑誌 104巻,855頁，
1994年；日本畜産学会報 65巻,580頁, 1994年参照）。
また、毛髪の構成成分に対する抗体を利用した毛髪改質
剤（特開平４−２９９１２号公報、特開平４−４１４１
３号公報）および、この抗体に着色料を結合させた染毛
剤が開示されている（特開平６−２２７９５５号公
報）。しかし、開示されている抗原は、毛髪の内部を構
成する成分に対する抗体を産生するものの、表層部を認
識する抗体が産生されないかあるいは産生されても極低
い含量であるため、特に毛髪トリートメントまたは染毛
剤等の毛髪表面に結合する必要のある用途に用いた場
合、トリートメントまたは染毛効果等が充分に発揮され
ない。

【０００３】一方、脳や神経等に存在することが知られ
ているＳ１００蛋白質に対する抗体は、組織染色に幅広
く用いられているが、毛髪表層部に発現しているという
報告はなく、毛髪表層認識抗体として用いるという報告
もない。またＳ１００蛋白質の一種Ｓ１００Ａ３蛋白質
についても、遺伝子のクローニングが行われている（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90巻, 6547頁, 1993年参
照）ものの、毛髪表層部に発現しているという報告およ
び毛髪表層認識抗体として用いるという報告はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的と
するところは、毛髪の表層部分に対して、強い親和性を
もって特異的に結合し、その結果、毛髪の強度、しなや
かさ、風合い等を良好にする特性を備える毛髪処理剤、
皮膚を染めないで毛髪を特異的に染めることのできる染
毛剤および目視により簡便に毛髪の損傷を診断すること
のできる毛髪損傷診断剤として有用な毛髪表層認識抗体
を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、毛髪表
層部をチオールプロテアーゼの一種パパイン等の蛋白質
分解酵素または固定化蛋白質分解酵素で処理して得られ
るペプチド画分，その多抗原性ペプチド，若しくはその
担体コンジュゲートを抗原として免疫して得られる毛髪
表層認識抗体，該毛髪表層認識抗体を含有する毛髪処理
剤，毛髪表層認識抗体を結合した着色料を含有する染毛
剤，および該毛髪表層認識抗体を含有する毛髪損傷診断
剤に関する。

【０００６】 H-Ala-Gln-Tyr-Asp-Asp-Ile-Ala-Ser-Arg-OH・・・（Ｉ） H-Ser-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-Tyr-Gln-OH・・・（ＩＩ） H-Ser-Val-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Asp-Cys-Glu-Val-Asp-Phe-Val-Glu-OH・・・（ＩＩＩ） H-Leu-Tyr-Cys-His-Glu-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys-Pro-Ser-Glu-Pro-Pro-Cys-Ser- Gln-OH・・・（ＩＶ）

【０００７】以下、本発明の構成について詳説する。

【０００８】なお、本明細書において、アミノ酸、アミ
ノ酸残基、アミノ酸誘導体、ペプチド、保護基はIUPAC-
IUB 生化学命名委員会で推奨された記号（Biochemistr
y, 11巻, 1726頁, 1972年、IUPAC Appl.,40巻,317頁, 1
974年参照）または、当該分野において慣用される記号
を用い、L-アミノ酸およびその残基のＬ記号は省略す
る。かかる記号は例えば以下の通りである。

【０００９】Ala:アラニン、Asn:アスパラギン、Asp:ア
スパラギン酸、Arg:アルギニン、Cys:システイン、Gln:
グルタミン、Glu:グルタミン酸、Gly:グリシン、His:ヒ
スチジン、Ile:イソロイシン、Leu:ロイシン、Lys:リジ
ンMet:メチオニン、Phe:フェニルアラニン、Pro:プロリ
ン、Ser:セリン、Thr:スレオニン、Trp:トリプトファ
ン、Tyr:チロシン、Val:バリン、Fmoc: 9-フルオレニル
メチルオキシカルボニル、Pmc:2,2,5,7,8-ペンタメチル
クロマン-6- スルホニル、tBu:t-ブチル、OtBu:t-ブチ
ルエステル、Trt:トリチル、Boc:t-ブチルオキシカルボ
ニル

【００１０】本発明の毛髪表層認識抗体は、毛髪表層に
由来する成分を蛋白質分解酵素で処理して得られる反応
液即ちペプチド画分をそのまま免疫するか、得られた成
分のアミノ酸配列を分析しこの一次構造に基づき化学合
成したものを抗原として用いることにより得られる。

【００１１】本発明で用いられる抗原の取得方法として
は、例えば、毛髪の表層成分を効率よく取得できる蛋白
質分解酵素または固定化蛋白質分解酵素で毛髪を処理す
ることによって得られる。また、該反応液を遠心して毛
髪、固定化蛋白質分解酵素等を除き、得られた反応液を
抗原として用いることもできる。

【００１２】本発明に用いられる蛋白質分解酵素として
は、周知公用の蛋白質分解酵素が用いられるが、固定化
した蛋白質分解酵素が、毛髪内部に浸透しにくく、毛髪
内部の目的外の蛋白質分解物をほとんど溶出させること
がないため、毛髪表層を特異的に認識する抗体を容易に
得られる抗原を得ることができるという点で好ましい。

【００１３】本発明に用いる蛋白質分解酵素としてはト
リプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カテ
プシンＢ１等が挙げられ、還元剤の存在下で活性化され
るパパイン、カテプシンＢ１等のチオールプロテアーゼ
を用いることが好ましく、特にパパインが望ましい。

【００１４】酵素処理を還元剤とパパイン、カテプシン
Ｂ１等のチオールプロテアーゼを併用する場合に用いら
れる還元剤としてはジチオスレイトール、２−メルカプ
トエタノール、システイン、亜硫酸ナトリウム等が挙げ
られる。

【００１５】本発明に用いられる固定化蛋白質分解酵素
の担体としては、アガロースゲル、ポリスチレン等の高
分子ポリマー、カルボキシ変性ポリスチレンラテックス
等のラテックス、リポソーム等の不溶性担体およびアミ
ロース、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリリ
ジン等の水溶性高分子等が挙げられる。

【００１６】毛髪表層の処理は、例えば、数ｃｍに細断
した毛髪を還元剤の存在下、蛋白質分解酵素または固定
化蛋白質分解酵素で行う。還元剤としてジチオスレイト
ールを使用する場合、通常0.05〜１％（Ｗ／Ｖ）が好ま
しく、例えば 0.2％（Ｗ／Ｖ）を含有した緩衝液に毛髪
１ｇ当たり10〜50ユニットのアガロース−パパインを加
え25℃、24時間反応させる。

【００１７】また、本発明で用いられる抗原の取得方法
としては、毛髪を蛋白質分解酵素で処理し、得られる反
応液より公知の方法で個々のペプチド成分を精製し、単
離する方法等が挙げられるが、単離したペプチドのアミ
ノ酸配列を決定し、その配列に基づきペプチドを合成し
て抗原を提供することもできる。更にまた、合成したペ
プチドの抗原性を高めるため、ペプチドを担体と結合さ
せた担体コンジュゲ−トとしたり、このペプチドを複数
結合させてペプチドの抗原性を高めた多抗原性ペプチド
等の形態に合成した上で、抗原として提供することもで
きる。

【００１８】本発明で用いられる担体コンジュゲ−トの
製造方法としては、単離または合成して得たペプチド
を、牛血清アルブミン、ヘモシアニン等のキャリア蛋白
質に架橋剤を用いて結合する方法等が挙げられる。用い
られる架橋剤としてはm-マレイミドベンゾイル -N-ヒド
ロキシスクシミドエステル、ジメチルアジピミデート、
ジメチルスベリミデート等が挙げられる。

【００１９】本発明で用いられる多抗原性ペプチドとし
ては、具体的には例えば、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）で表さ
れるペプチドを用いた下式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩ
Ｉ）、（ＶＩＩＩ）で表される多抗原性ペプチドの他、
（Ｉ）〜（ＩＶ）で表されるペプチドを２種以上用いた
多抗原性ペプチド等が挙げられる。

【００２０】

【化１】

【００２１】

【化２】

【００２２】

【化３】

【００２３】

【化４】

【００２４】本発明で用いられる多抗原性ペプチドの製
造方法としては、リジン等のような、１分子中に２つ以
上のアミノ基またはカルボキシル基を有するアミノ酸等
を用いて、１分子の中に複数のペプチドを並列につなげ
る方法（J.Biol.Chem. 263巻、1719頁、1988年参照．）
等が挙げられるが、アミノ酸配列に基づき合成すること
もできる。

【００２５】多抗原性ペプチドの合成方法としては、例
えば、固相法（ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫
ら、丸善株式会社、1985年出版、194 頁参照) により、
保護アミノ酸を縮合して合成する方法等が挙げられる。
固相担体には、例えば4-（ヒドロキシメチル）フェニル
アセトアミドメチルポリ（スチレン−コージビニルベン
ゼン）（J.Amer.Chem.Soc.98巻, 7357頁, 1976年参照）
が好ましい。

【００２６】アミノ酸のα−アミノ基の保護には、ピペ
リジンで切断され易い保護基、例えばFmoc基が用いられ
る。アミノ酸の側鎖官能基にはピペリジンで切断され難
い保護基を用いる。すなわち、Arg のグアニジル基はPm
c 基で、Ser, ThrおよびTyrの水酸基はtBu 基、Asp お
よびGlu のカルボキシル基はOtBu基で、Asn およびGln
のカルバミド基、Cys のチオール基、His のイミダゾー
ル基はTrt 基、Lys のε−アミノ基はBoc 基で保護する
のが好ましい。

【００２７】固相担体の水酸基にβ−Ala(Fmoc) を導入
し、ついでα-,ε-(Fmoc)Lys(Fmoc)を結合させ、そのα
とεのアミノ基の両方にさらにα-,ε-(Fmoc)Lys(Fmoc)
を導入するということを繰り返して通常β−Ala １分子
当たり４、８または16個のアミノ基を持つ多抗原性ペプ
チド骨格を合成する。担体上でのペプチド鎖の延長は、
通常の固相法に従い行うことが出来る。すなわち、Ｎ端
アミノ基の脱保護と保護アミノ酸との縮合反応を繰り返
し、担体上にＣ端から順次ペプチド鎖を延長させ保護ペ
プチド−樹脂を得る。

【００２８】縮合反応は、活性エステル法、特に保護ア
ミノ酸の2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-
テトラメチルロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBT
U)エステルを用いる活性エステル法が、反応性が高く望
ましい。担体からのペプチドの切断および保護基の除去
は、トリフルオロ酢酸で行うことが出来るが、必要に応
じてエタンジチオール、チオアニソール、フェノール等
の共存下で行うこともできる。担体からのペプチドの切
断および脱保護により得られた粗ペプチドまたはその塩
は、カラムクロマトグラフィーあるいは高速液体クロマ
トグラフィー等により精製することが出来る。

【００２９】なお、本発明において抗原として用いられ
るペプチドおよび蛋白質画分の各種分析は、下記の方法
で実施した。

【００３０】アミノ酸配列分析：気相プロテインシーク
エンサー（アプライドバイオシステムズ社製 477A)で行
った。酸加水分解物のアミノ酸分析：6N塩酸で加水分解(110
℃、24時間）して得た加水分解物をアミノ酸分析機で行
った。

【００３１】質量分析値：飛行時間型質量分析装置(Las
ermat 2000、フィニガン社製）で、α- シアノ -4-ヒド
ロキシシナミックアシッドをマトリクスとして用いて測
定した。

【００３２】更に、本発明に利用される抗原として、Ｓ
１００蛋白質が挙げられるが、Ｓ１００蛋白質は、神経
組織、脂肪組織等に存在する酸性可溶性蛋白質で、カル
シウムイオン結合部位を持つ多数の蛋白質ファミリーの
総称である。

【００３３】Ｓ１００蛋白質としてはシステインを１０
％近く含有するＳ１００Ａ３蛋白質，アミノ酸残基数９
１と９３のα、β等が挙げられるが、毛髪に対してより
強い選択性を有する抗体を生産するためには、Ｓ１００
Ａ３蛋白質が好ましい。

【００３４】Ｓ１００蛋白質は、公知の方法で牛脳等か
ら抽出して得ることもできるが、毛髪に対してより選択
性を有する抗体を生産するためには、毛髪、望ましくは
キューティクルより抽出することが好ましい。

【００３５】次に、以上のようにして得られた抗原を免
疫して毛髪表層認識抗体を産生する方法について説明す
る。

【００３６】本発明の毛髪表層認識抗体は、公知の方法
により哺乳動物や鳥類等を免疫することによって得るこ
とができる。該抗体の製造に供せられる動物としては、
牛、馬、羊、山羊、兎、鶏等適当な家畜を選ぶことがで
きる。

【００３７】免疫方法としては、皮下注射、腹腔内注
射、筋肉注射、静脈注射等による通常の方法や、点鼻、
点眼等の方法によって行うことができる。必要に応じて
フロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ）、フロイント不
完全アジュバンド（ＦＩＡ）等のアジュバンドを抗原と
併用してもよい。

【００３８】該抗体は、動物の血清の他、常乳あるいは
初乳、もしくは卵黄より得ることができる。

【００３９】本発明の毛髪処理剤の剤形としてはトリー
トメント、リンス、シャンプー，ヘアークリーム、ヘア
ーローション，ヘアーパック，パーマネント用剤等、毛
髪に対して用いる各種のものが挙げられる。

【００４０】本発明の毛髪処理剤中の、毛髪表層認識抗
体の含有量は、組成物の総量を基準として0.01重量％〜
５重量％が好ましく、0.1 重量％〜１重量％が特に好ま
しい。

【００４１】本発明の染毛剤の剤形としてはトリートメ
ント、リンス、シャンプー，ヘアークリーム、ヘアーロ
ーションが挙げられる。

【００４２】本発明の染毛剤中の、毛髪表層認識抗体を
結合した着色料の含有量は、組成物の総量を基準として
0.01重量％〜５重量％が好ましく、0.1 重量％〜１重量
％が特に好ましい。

【００４３】本発明の毛髪表層認識抗体へ結合する着色
料としては、色素、顔料、高分子化合物に包接された色
素等が挙げられ、高分子化合物としては、ポリスチレン
等の合成高分子ポリマー、リポソーム等が挙げられる。

【００４４】毛髪表層認識抗体と着色料との結合量の重
量比としては、1:100 〜10:1が好ましく、1:10〜1:1 が
特に好ましい。

【００４５】本発明の毛髪損傷診断剤は生理等張緩衝液
（ＰＢＳ）等に毛髪表層認識抗体または毛髪表層認識抗
体を含む抗血清を溶解したもの等が挙げられる。

【００４６】本発明の毛髪損傷診断剤中の、毛髪表層認
識抗体の含有量としては、0.0001重量％〜１重量％が好
ましく、0.001 重量％〜0.1 重量％が特に好ましい。

【００４７】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に詳細に説
明する。

【００４８】実施例１（毛髪をアガロース−パパインで
処理して得られるペプチド画分を抗原として得られる毛
髪表層認識抗体）

【００４９】１．抗原の調製細断した健常毛髪10ｇを洗浄後、ジチオスレイトール
0.2％を含有した 0.1Ｎリン酸緩衝液(pH 6.7) 200mlに
加え、200 ユニットのアガロース−パパイン(8.5ユニッ
ト/mg,Elastin Products社製）を予め緩衝液に分散した
後遠心して上清を捨て、沈殿したアガロース−パパイン
を加えて25℃、24時間回転させ反応させた。

【００５０】得られた反応液を遠心して毛髪とアガロー
ス−パパインを除き、上清を一部凍結乾燥した。残りの
上清をSep-Pak C₁₈(Waters社製）に流し、吸着したペプ
チドをメタノールで溶出させ凍結乾燥し、ペプチド画分
を得た。得られたペプチド画分を分析し、下記の分析結
果を得た。

【００５１】酸加水分解物のアミノ酸分析値（モル％）ペプチド画分：Asx,5.42;Thr,4.18;Ser,9.42;Glx,10.6
4;Pro,10.51;Gly,6.67;Ala,5.20;Val,8.55;Cys-Cys/2,1
0.17;Met,1.09;Ile,7.08;Leu,7.70;Tyr,2.84;Phe,3.05;
Lys,3.86;His,0.83;Arg,2.77

【００５２】２．抗血清および抗体の調製得られた抗原１mgをＰＢＳ１mlに溶解しＦＣＡ１mlと1:
1 の比で混合して油中水型のエマルジョンとした。これ
をウサギ（日本白色種、生後９週齢、Kbl:JW、雌）の背
中数箇所に皮下注射した。３、６、９週間後に抗原と混
合するアジュバントをＦＩＡに変え皮下注射した。最終
追加免疫１週間経過後（10週目）、頸動脈より全採血を
行い、遠心分離して血清を採取した。

【００５３】得られた抗血清60mlにＰＢＳ60mlを加え、
これに飽和硫安ナトリウム溶液(pH7.0)80mlを攪拌しな
がら徐々に添加し、氷冷下１時間攪拌した。10,000ｇで
10分間遠心した後、沈殿物を集めて60mlＰＢＳに溶解
し、上記硫安分画を繰り返した。得られた沈殿物を約12
0ml のＰＢＳに溶解し、0.2 μｍのフィルターで濾過し
抗体を得た。

【００５４】実施例２（H-Ala-Gln-Tyr-Asp-Asp-Ile-Al
a-Ser-Arg-OHを認識する毛髪表層認識抗体）１．抗原の調製（１）H-Ala-Gln-Tyr-Asp-Asp-Ile-Ala-Ser-Arg-OHの精
製実施例１と同様の方法で得たSep-Pak C₁₈(Waters社製）
吸着したペプチド成分の減圧乾固物の 1/5ずつを、下記
条件の陰イオン交換液体クロマトグラフィーに付し、保
持時間約15.1分の画分を分取した。

【００５５】カラム：TSKgel DEAE-5PW (8.0×75mm，東
ソー社製）溶出：10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 9.6）から0.7M NaC
l を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 9.6）の直線的濃
度勾配（70分間かけて濃度勾配をかける）流速：0.5ml/min 検出：220nm における吸光度

【００５６】得られた画分を減圧乾固後、その 1/2を下
記条件の逆相液体クロマトグラフィーに付し、保持時間
約 4.4分の画分を分取した。

【００５７】カラム：A-312 ODS (6.0× 150mm，ＹＭＣ
社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（90:10:
0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（30:7
0:0.1)の直線的濃度勾配（60分間かけて濃度勾配をかけ
る）流速：2.0ml/min 検出：220nm における吸光度

【００５８】得られた画分を減圧乾固後、さらに、下記
条件のゲル濾過液体クロマトグラフィーに付し、保持時
間約 3.5分の画分を分取した。

【００５９】カラム：G2000SWXL (7.8× 300mm，東ソー
社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（55:45:
0.1) 流速：0.5ml/min 検出：220nm における吸光度

【００６０】得られた画分を減圧乾固後、下記の分析結
果を得た。アミノ酸配列分析結果：H-Ala-Gln-Tyr-Asp-Asp-Ile-Al
a-Ser-Arg-OH 酸加水分解物のアミノ酸分析値（モル比）：Asx,1.71;S
er,1.15;Glx,1.49;Ala,2.26;Ile,0.91;Tyr,0.80;Arg,0.
67 質量分析値：1039.1（計算値1038.02)

【００６１】（２）(H-Ala-Gln-Tyr-Asp-Asp-Ile-Ala-S
er-Arg)₈-Lys₄-Lys₂-Lys- βAla-OHの合成アプライド・バイオシステム社製モデル431Aペプチド合
成機を用い、固相法にて室温で合成した。

【００６２】Fmoc₈-Lys₄-Lys₂-Lys-βAla-樹脂（アプラ
イド・バイオシステム社製）0.125mmol(0.30g)を出発原
料とし、Fmoc-Arg(Pmc) 、Fmoc-Ser(tBu) 、Fmoc-Ala、
Fmoc-Ile、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Tyr(tBu) 、Fmoc-Gln
(Trt) の各保護アミノ酸を使用し、Ｎ端Fmocの脱保護
洗浄縮合反応洗浄、の各工程を繰り返してＣ端部
から樹脂上にペプチド鎖を延長させた。

【００６３】Ｎ端Fmocの脱保護は、20％ピペリジン−
N-メチルピロリドンで１分間、ついで 7.6分間処理する
ことにより行った。洗浄は、N-メチルピロリドンで４
回行った。縮合反応は、１mmolの保護アミノ酸と 0.9
mmolのHBTUのN-メチルピロリドン溶液に2.0Mジイソプロ
ピルエチルアミン／N-メチルピロリドン1 mlを加えた溶
液で行った。洗浄はN-メチルピロリドンで行った。

【００６４】最後のFmoc-Alaの縮合反応終了後、Ｎ端
Fmocの脱保護および洗浄、操作を行い乾燥後保護ペプ
チド−樹脂 0.42gを得た。

【００６５】得られた保護ペプチド−樹脂0.1gに対し氷
冷下で結晶フェノール／エタンジチオール／チオアニソ
ール／水／トリフルオロ酢酸（3:1:2:2:40 w/v/v/v/v）
混合溶液 6mlを加え室温で５時間攪拌した。反応液をポ
リフロンフィルターPF060(アドバンテック製）で濾過し
トリフルオロ酢酸１mlついでジクロロメタン10mlで洗い
込みろ液を40℃以下で約１mlまで減圧濃縮した。これに
冷エーテル50mlを加えペプチドを沈殿させた。これを３
μｍ孔PTFE膜（アドバンテック製）で濾取し酢酸：水
（1:1)に溶解した。

【００６６】得られた粗ペプチドを下記条件の逆相液体
クロマトグラフィーに付し、保持時間約 9〜20分に溶出
する画分を分取した。

【００６７】カラム：RESOURCE RPC 3ml（6.4 ×100 m
m、ファルマシア・バイオテック社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（90:10:
0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（50:5
0:0.1)の直線的濃度勾配（40分間かけて濃度勾配をかけ
る）流速：2.0ml/min 検出：220nm における吸光度

【００６８】得られた画分を凍結乾燥して18.0mgの標記
ペプチドを得た。このペプチドについて、下記の分析結
果を得た。

【００６９】酸加水分解物のアミノ酸分析値（モル
比）：Asx,18.7;Ser,10.1;Glx,9.9;Ala,20.9;Ile,10.9;
Tyr,11.6;Arg,7.7;Lys,8.2; β-Ala,1.0

【００７０】２．抗血清および抗体の調製得られた抗原 250μｇを実施例１と同様の方法でウサギ
に免疫し、抗血清および抗体を得た。得られた抗血清を
以下の試験に用いた。

【００７１】多抗原性ペプチドに対する抗体価の測定は
ＥＬＩＳＡ法によって行った。すなわち、96穴プレート
（イムロン２、ダイナテック社製）の各ウェルに多抗原
性ペプチド１μｇを含む50mM炭酸緩衝液(pH 9.6) 100μ
ｌずつ入れ、４℃で一晩放置し、プレートに吸着させ
た。プレートを0.05％Tween 20含有生理食塩水で６回洗
浄した後、１％牛血清アルブミンおよび0.05％Tween 20
を含むＰＢＳで希釈した抗血清 100μl を各ウェルに加
えた。37℃で１時間反応を行わせた後、プレートを６回
洗浄した。

【００７２】二次抗体として、ペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗ウサギIgＧ Fc フラグメント抗体（カペル社製）を
0.05％Tween 20を含むＰＢＳで7000倍に希釈した溶液 1
00μl を各ウェルに加え、25℃で30分間反応させた後、
６回洗浄した。次に、0.2Mリン酸二ナトリウム−0.1Mク
エン酸緩衝液(pH 5.0)50mlにオルトフェニレンジアミン
20mgおよび31％過酸化水素水10μｌを溶解した基質溶液
を調製し、各ウェルに100μｌずつ加え、遮光下25℃で2
0分間発色させた。3N硫酸 100μｌを加えることで反応
を停止させた。発色終了後、各ウェルの 492nmの吸光度
を測定した。抗体価は、吸光度が 0.2となる希釈倍率と
した。免疫過程における抗体価の推移を表１に示した。

【００７３】

【表１】

【００７４】実施例３（H-Ser-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Al
a-Trp-Tyr-Gln-OHを認識する毛髪表層認識抗体）１．抗原の調製（１）H-Ser-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-Tyr-Gln-OH
の精製実施例１と同様の方法で得たSep-Pak C₁₈(Waters社製）
吸着したペプチド成分の減圧乾固物の 1/5ずつを、下記
条件の陰イオン交換液体クロマトグラフィーに付し、保
持時間約24.3分の画分を分取した。

【００７５】カラム：TSKgel DEAE-5PW (8.0×75mm，東
ソー社製）溶出：10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 9.6）から0.7M NaC
l を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 9.6）の直線的濃
度勾配（70分間かけて濃度勾配をかける）流速：0.5ml/min 検出：220nm における吸光度

【００７６】得られた画分を減圧乾固後、その 1/2を下
記条件の逆相液体クロマトグラフィーに付し、保持時間
約 9.3分の画分を分取した。

【００７７】カラム：A-312 ODS (6.0× 150mm，ＹＭＣ
社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（90:10:
0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（30:7
0:0.1)の直線的濃度勾配（60分間かけて濃度勾配をかけ
る）流速：2.0ml/min 検出：220nm における吸光度

【００７８】得られた画分を減圧乾固後、さらに、下記
条件のゲル濾過液体クロマトグラフィーに付し、保持時
間約 3.4分の画分を分取した。

【００７９】カラム：G2000SWXL (7.8× 300mm，東ソー
社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（55:45:
0.1) 流速：0.5ml/min 検出：220nm における吸光度

【００８０】得られた画分を減圧乾固後、下記の分析結
果を得た。アミノ酸配列分析結果：H-Ser-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Al
a-Trp-Tyr-Gln-OH 質量分析値：1183.3（計算値1182.19)

【００８１】（２）(H-Ser-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-T
rp-Tyr-Gln)₈-Lys₄-Lys₂-Lys- βAla-OHの合成 Fmoc₈-Lys₄-Lys₂-Lys-βAla-樹脂（アプライド・バイオ
システム社製）0.125mmol(0.30g)を出発原料とし、Fmoc
-Gln(Trt) 、Fmoc-Tyr(tBu) 、Fmoc-Trp、Fmoc-Ala、Fm
oc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc) 、Fmoc-Ser(tBu) 、の各
保護アミノ酸を使用し、実施例２と同様にして固相法に
て合成し、保護ペプチド−樹脂 0.39gを得た。

【００８２】得られた保護ペプチド−樹脂0.1gに対し氷
冷下でエタンジチオール／水／トリフルオロ酢酸（1:1:
38 v/v/v）混合溶液 5mlを加え室温で３時間攪拌した。
反応液を実施例２と同様にして担体からのペプチドの切
断保護基の除去を施し粗ペプチドを得た。

【００８３】得られた粗ペプチドを下記条件の逆相液体
クロマトグラフィーに付し、保持時間約15〜25分に溶出
する画分を分取した。

【００８４】カラム：RESOURCE RPC 3ml（6.4 ×100 m
m、ファルマシア・バイオテック社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（90:10:
0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（50:5
0:0.1)の直線的濃度勾配（40分間かけて濃度勾配をかけ
る）流速：2.0ml/min 検出：220nm における吸光度

【００８５】得られた画分を凍結乾燥して17.5mgの標記
ペプチドを得た。このペプチドについて、下記の分析結
果を得た。

【００８６】酸加水分解物のアミノ酸分析値（モル
比）：Ser,7.6;Glx,29.4;Ala,30.6;Tyr,11.4;Lys,13.1;
β-Ala,1.0

【００８７】２．毛髪表層認識抗血清および抗体の調製得られた抗原 250μｇを実施例１と同様の方法でウサギ
に免疫し、抗血清および抗体を得た。得られた抗血清を
以下の試験に用いた。

【００８８】多抗原性ペプチドに対する抗体価の測定は
実施例２と同様の方法でＥＬＩＳＡ法によって行った。
免疫過程における抗体価の推移を表２に示した。

【００８９】

【表２】

【００９０】実施例４（H-Ser-Val-Leu-Asp-Thr-Asn-Ly
s-Asp-Cys-Glu-Val-Asp-Phe-Val-Glu-OH を認識する毛
髪表層認識抗体）

【００９１】１．抗原の調製（１）H-Ser-Val-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Asp-Cys-Glu-Va
l-Asp-Phe-Val-Glu-OHの精製実施例１と同様の方法で得たSep-Pak C₁₈(Waters社製）
吸着したペプチド成分の減圧乾固物の 1/5ずつを、下記
条件の陰イオン交換液体クロマトグラフィーに付し、保
持時間約27.6分の画分を分取した。

【００９２】カラム：TSKgel DEAE-5PW (8.0×75mm，東
ソー社製）溶出：10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 9.6）から0.7M NaC
l を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH 9.6）の直線的濃
度勾配（70分間かけて濃度勾配をかける）流速：0.5ml/min 検出：220nm における吸光度

【００９３】得られた画分を減圧乾固後、その 1/2を下
記条件の逆相液体クロマトグラフィーに付し、保持時間
約14.5分の画分を分取した。カラム：A-312 ODS (6.0× 150mm，ＹＭＣ社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（90:10:
0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（30:7
0:0.1)の直線的濃度勾配（60分間かけて濃度勾配をかけ
る）流速：2.0ml/min 検出：220nm における吸光度

【００９４】得られた画分を減圧乾固後、さらに、下記
条件のゲル濾過液体クロマトグラフィーに付し、保持時
間約 2.8分の画分を分取した。

【００９５】カラム：G2000SWXL (7.8× 300mm，東ソー
社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（55:45:
0.1) 流速：0.5ml/min 検出：220nm における吸光度

【００９６】得られた画分を減圧乾固後、下記の分析結
果を得た。アミノ酸配列分析結果：H-Ser-Val-Leu-Asp-Thr-Asn-Ly
s-Asp-Cys-Glu-Val-Asp-Phe-Val-Glu-OH

【００９７】（２）(H-Ser-Val-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-A
sp-Cys-Glu-Val-Asp-Phe-Val-Glu-OH)₈-Lys₄-Lys₂-Lys-
βAla-OHの合成 Fmoc₈-Lys₄-Lys₂-Lys-βAla-樹脂（アプライド・バイオ
システム社製）0.125mmol(0.30g)を出発原料とし、Fmoc
-Glu(OtBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Phe、Fmoc-Asp(OtBu)、Fm
oc-Cys、Fmoc-Lys(Boc) 、Fmoc-Asn(OtBu)、Fmoc-Thr、
Fmoc-Leu、Fmoc-Ser(tBu) 、の各保護アミノ酸を使用
し、実施例２と同様にして固相法にて合成し、保護ペプ
チド−樹脂 0.40gを得た。

【００９８】得られた保護ペプチド−樹脂0.1gに対し氷
冷下でエタンジチオール／水／トリフルオロ酢酸（1:1:
38 v/v/v）混合溶液 5mlを加え室温で３時間攪拌した。
反応液を実施例２と同様にして担体からのペプチドの切
断保護基の除去を施し粗ペプチドを得た。

【００９９】得られた粗ペプチドを下記条件の逆相液体
クロマトグラフィーに付し、保持時間約10〜26分に溶出
する画分を分取した。

【０１００】カラム：RESOURCE RPC 3ml（6.4 ×100 m
m、ファルマシア・バイオテック社製）溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（90:10:
0.1)から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（30:7
0:0.1)の直線的濃度勾配（40分間かけて濃度勾配をかけ
る）流速：2.0ml/min 検出：220nm における吸光度

【０１０１】得られた画分を凍結乾燥して37.8mgの標記
ペプチドを得た。このペプチドについて、下記の分析結
果を得た。

【０１０２】酸加水分解物のアミノ酸分析値（モル
比）：Ser,5.7;Val,22.1;Leu,5.9;Asx,22.8;Thr,5.2;Gl
x,16.6;Lys,11.5;β-Ala,1.0

【０１０３】２．抗血清および抗体の調製得られた抗原 250μｇを実施例１と同様の方法でウサギ
に免疫し、抗血清および抗体を得た。得られた抗血清を
以下の試験に用いた。

【０１０４】多抗原性ペプチドに対する抗体価の測定は
実施例２と同様の方法でＥＬＩＳＡ法によって行った。
免疫過程における抗体価の推移を表３に示した。

【０１０５】

【表３】

【０１０６】実施例５（H-Leu-Tyr-Cys-His-Glu-Tyr-Ph
e-Lys-Asp-Cys-Pro-Ser-Glu-Pro-Pro-Cys-Ser-Gln-OHを
認識する毛髪表層認識抗体）１．抗原の調製(H-Leu-Tyr-Cys-His-Glu-Tyr-Phe-Lys-A
sp-Cys-Pro-Ser-Glu-Pro-Pro-Cys-Ser-Gln-OH)₄-Lys₂-L
ys- βAla-OHの合成

【０１０７】Fmoc₄-Lys₂-Lys- βAla-樹脂（アプライド
・バイオシステム社製）0.125mmol(0.29g)を出発原料と
し、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu) 、Fmoc-Cys(Trt) 、Fmoc
-His(Trt) 、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Lys(Bo
c) 、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu) 、Fmo
c-Gln(Trt) 、の各保護アミノ酸を使用し、実施例２と
同様にして固相法にて合成し、保護ペプチド−樹脂 0.4
9gを得た。

【０１０８】得られた保護ペプチド−樹脂0.2gに対し氷
冷下でエタンジチオール／水／トリフルオロ酢酸（1:1:
38 v/v/v）混合溶液 5mlを加え室温で３時間攪拌した。
反応液を実施例２と同様にして担体からのペプチドの切
断保護基の除去を施し粗ペプチドを得た。

【０１０９】得られた粗ペプチドを0.2M酢酸に対し透析
し、凍結乾燥して57.2mgの標記ペプチドを得た。

【０１１０】２．抗血清および抗体の調製得られた抗原 250μｇを実施例１と同様の方法でウサギ
に免疫し、抗血清および抗体を得た。得られた抗血清を
以下の試験に用いた。

【０１１１】多抗原性ペプチドに対する抗体価の測定は
実施例２と同様の方法でＥＬＩＳＡ法によって行った。
免疫過程における抗体価の推移を表４に示した。

【０１１２】

【表４】

【０１１３】実施例６（抗Ｓ１００Ａ３蛋白質抗体の作
製）１．抗原の調製（毛上皮からのＳ１００Ａ３蛋白質画分
の製造）毛上皮800 mgを、 0.2M 2-メルカプトエタノールを含む
0.2Mトリス（pH 9.5)3ml に加え、50℃１時間インキュ
ベートした後、ガラスホモジナイザーを用いて擦り潰し
た。更に50℃１時間インキュベートした後、遠心分離
（10,000 g）して上清を収集した。残渣をガラスホモジ
ナイザーを用いて擦り潰し、50℃１時間インキュベート
した後、遠心分離（10,000 g）し上清を収集する操作
を、計６回繰り返し、得られた上清を集めて、毛上皮特
異蛋白質画分（蛋白質量として8.9 mg）を得た。

【０１１４】２．抗血清および抗体の調製得られた毛上皮蛋白質画分を用いて、実施例１と同様に
して抗血清および抗体を得た。得られた抗血清を以下の
試験に用いた。

【０１１５】毛上皮蛋白質画分に対する抗血清の抗体価
の測定は実施例２と同様の方法でＥＬＩＳＡ法によって
行った。ただし、96穴プレートの各ウェルに毛上皮蛋白
質画分10ngを吸着させた。初回免疫より10週後に全採血
して得た血清の抗体価は約6900であった。

【０１１６】試験例１（抗血清の毛髪結合性）多抗原性ペプチドおよび抗毛髪抽出物に対する10週目の
全採血して得た抗血清の毛髪結合性の評価はＥＬＩＳＡ
法によって行った。

【０１１７】96穴マルチスクリーンDVフィルタープレー
ト（0.65μｍ、ミリポア社製）の各ウェルに健常毛髪，
または損傷毛髪として実施例２で得られるアガロース−
パパイン処理毛髪を１mgずつ入れ、１％牛血清アルブミ
ンおよび0.05％Tween 20を含むＰＢＳで希釈した抗血清
100μl を各ウェルに加えた。37℃で１時間反応を行わ
せた後、プレートを６回洗浄した。二次抗体として、ペ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgＧ Fc フラグメント
抗体（カペル社製）を0.05％Tween 20を含むＰＢＳで 1
4000倍に希釈した溶液 100μl を各ウェルに加え、25℃
で30分間反応させた後、６回洗浄した。

【０１１８】次に、0.2Mリン酸二ナトリウム−0.1Mクエ
ン酸緩衝液(pH 5.0)50mlにオルトフェニレンジアミン20
mgおよび31％過酸化水素水10μｌを溶解した基質溶液を
調製し、各ウェルに 100μｌずつ加え、遮光下25℃で30
分間発色させた。3N硫酸 100μｌを加えることで反応を
停止させた。発色終了後、発色液を96穴プレート（イム
ロン２、ダイナテック社製）に移し、各ウェルの 492nm
の吸光度を測定した。実施例１〜６の抗血清の毛髪結合
量を表５に示した。

【０１１９】

【表５】

【０１２０】実施例１〜６の抗血清に含まれる抗体はい
ずれも健常毛髪およびアガロース−パパインで処理した
損傷毛髪に結合することが明らかである。

【０１２１】実施例７〜１２（抗体含有毛髪トリートメ
ント剤）下記に示す組成の実施例１〜６で得た抗体を配合した抗
体含有毛髪トリートメント剤を作製した。

【０１２２】

【表６】

【０１２３】試験例２（抗体含有毛髪トリートメント剤
の毛髪トリートメント効果）ヒト毛束（黒髪5g）を実施例７〜１２各々の抗体含有毛
髪トリートメント剤に１時間浸漬後、流水で10分間水洗
して風乾した。処理後毛束のくし通り、しなやかさ、風
合について処理前の毛束とどちらがよいか官能評価を行
った結果、抗体含有毛髪トリートメント剤で処理した毛
束の方が、処理前に比べてくし通り、しなやかさ、風合
が良好であった。

【０１２４】実施例１３〜１８（抗体結合着色剤含有染
毛剤）赤色色素を吸着させたカルボキシ変性ポリスチレンラテ
ックス（粒径0.19μm,日本合成ゴム社製) を固体分濃度
１重量％で精製水に分散した。実施例１〜６で得た抗体
を各々抗原を固定化したカラムにかけて精製して得たア
フィニティ精製抗体１mgを生理リン酸緩衝液１mlに溶解
したものを、前述のラテックス分散液１ｃｃに加え、４
℃で一晩攪拌した。遠心して上清を除き0.1%牛血清アル
ブミンを含む生理リン酸緩衝液に分散した。再び遠心し
0.1%牛血清アルブミンを含む生理リン酸緩衝液に再分散
し、0.1%牛血清アルブミンおよび0.1%ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート(Tween 20)を含む生理リン
酸緩衝液に分散して抗体結合着色剤含有染毛剤（実施例
１３〜１８）を得た。この場合の、抗体結合着色剤の含
有量は、染毛剤を総量として０．０１重量％であった。

【０１２５】試験例３（抗体結合着色剤含有染毛剤の染
毛試験）実施例１３〜１８の抗体結合着色剤含有染毛剤を毛束
（ヒト白髪、50mg）に加え１時間回転させた。ついで0.
05%Tween20を含む生理食塩水で洗浄し乾燥後、目視によ
り着色度を、判定した。

【０１２６】

【表７】

【０１２７】実施例１９〜２４（抗体含有毛髪損傷診断
剤を利用した毛髪診断キット）以下に記載した４種の溶液よりなる毛髪診断キットを作
製し、ヒト毛髪で損傷度を診断した。

【０１２８】Ａ液：実施例１〜６で得た抗血清を、各々
0.05%Tween 20 を含むPBS で1,000倍希釈して毛髪損傷
診断剤を作製した。Ｂ液：ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG 抗体（カ
ッペル社製）を、0.05%Tween20を含むPBS で7,000 倍希
釈して作製した。Ｃ液：オルトフェニレンジアミン20mg及び過酸化水素10
μｌを含む0.2Mリン酸二ナトリウム−0.1Mクエン酸緩衝
液, pH 5.0（ペルオキシダーゼの基質溶液）Ｄ液：生理食塩水

【０１２９】髪の傷んだ人と健常な人の毛髪各々10mg
に、実施例１〜６の抗血清を含むＡ液を加え37℃、１時
間インキュベートした。Ｄ液で６回洗浄した後、Ｂ液と
室温、30分間インキュベートした。Ｄ液で６回洗浄した
後、Ｃ液を加えると、実施例１〜６の抗血清のいずれの
場合でも、傷んだ人の毛髪を入れた試験管が発色した。

【０１３０】以上の結果から、毛上皮特異蛋白質を抗原
として得た抗体を含有する本発明の毛髪損傷診断剤で、
毛髪の損傷状態あるいは健康状態を知ることができるこ
とは明らかである。

【０１３１】

【発明の効果】以上の如く、本発明により，毛髪の表層
部分に対して、強い親和性をもって特異的に結合し、そ
の結果、毛髪の強度、しなやかさ、風合い等を良好にす
る特性を備える毛髪処理剤、染毛剤、毛髪損傷診断剤お
よびこれらの成分として有用な毛髪表層認識抗体を提供
できることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 (72)発明者村上梅司神奈川県小田原市寿町５丁目３番28号鐘紡株式会社生化学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】毛髪表層部を蛋白質分解酵素または固定
化蛋白質分解酵素で処理して得られるペプチド画分を抗
原として免疫して得られる毛髪表層認識抗体。
【請求項２】蛋白質分解酵素がチオールプロテアーゼ
である請求項１記載の毛髪表層認識抗体。
【請求項３】蛋白質分解酵素がパパインである請求項
１記載の毛髪表層認識抗体。
【請求項４】下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか
で表されるペプチド、その多抗原性ペプチドまたはその
担体コンジュゲートを抗原として免疫して得られる毛髪
表層認識抗体。 H-Ala-Gln-Tyr-Asp-Asp-Ile-Ala-Ser-Arg-OH・・・（Ｉ） H-Ser-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-Tyr-Gln-OH・・・（ＩＩ） H-Ser-Val-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Asp-Cys-Glu-Val-Asp-Phe-Val-Glu-OH・・・（ＩＩＩ） H-Leu-Tyr-Cys-His-Glu-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys-Pro-Ser-Glu-Pro-Pro-Cys-Ser- Gln-OH・・・（ＩＶ）
【請求項５】Ｓ１００蛋白質を抗原として免疫して得
られる毛髪表層認識抗体。
【請求項６】Ｓ１００蛋白質がＳ１００Ａ３蛋白質で
あることを特徴とする請求項６記載の毛髪表層認識抗
体。
【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の毛髪表
層認識抗体を含むことを特徴とする毛髪処理剤。
【請求項８】請求項１〜６のいずれかに記載の毛髪表
層認識抗体を結合した着色料を含むことを特徴とする染
毛剤。
【請求項９】請求項１〜６のいずれかに記載の毛髪表
層認識抗体を含むことを特徴とする毛髪損傷診断剤。