JPH09313183A - ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素発現ミエローマ株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】大量のＧＡを生産し、抗ＧＡＤ抗体の測定法を
提供する。 【解決手段】組換えＧＡＤを発現するミエローマ細胞株
ＳＰＧ１４を培養し、組換えＧＡＤを回収する。このＧ
ＡＤを水不溶性担体に結合し分析検体と接触させ、ＧＡ
Ｄに結合した試料中の抗ＧＡＤ抗体を特異的に検出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は組換えヒトグルタミ
ン酸脱炭酸酵素を発現するミエロ−マ細胞株、組換えヒ
トグルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法、抗ヒトグルタミ
ン酸脱炭酸酵素抗体の測定方法及び抗ヒトグルタミン酸
脱炭酸酵素抗体測定用の試薬キットに関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】グルタミン酸脱炭酸酵素（Ｇｌｕｔａｍ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；以下Ｇ
ＡＤとする）は、抑制性神経伝達物質であるγアミノ酪
酸をグルタミンから合成する酵素で、脳や膵臓ランゲル
ハンス島に存在する。近年ＧＡＤがインスリン依存型糖
尿病（ＩＤＤＭ）の主要自己抗原であることが発見され
た（Ｂｅａｋｋｅｓｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ，３４７，
ｐ１５１，１９９０年参照）。現在、抗ＧＡＤ自己抗体
はＩＤＤＭの血中に高率に存在し、ＩＤＤＭの診断や発
症の予知マ−カ−として臨床の場で利用されており、放
射免疫測定法（ＲＩＡ）のキットが市販されている（ヘ
キスト社、製品名はリップＡｎｔｉ−ＧＡＤヘキス
ト）。しかしながら、これまでの測定法には２つの問題
点がある。

【０００３】ひとつは、放射性物質を用いることであ
る。本来、放射性物質を用いるＲＩＡより、用いない酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）の方が取扱いが容易であること
は自明である。しかしながら、測定系を構成する成分の
濃度が低い場合は、ＥＩＡでは十分な感度を得ることが
できず、ＲＩＡを用いざるを得ない。抗ＧＡＤ自己抗体
と結合しうるＧＡＤは、天然型はブタの脳、組換え型は
組換えＧＡＤ発現ＣＨＯ細胞から調製しうることが報告
されてきたが、いずれも生産性が低いことが知られてい
る。例えば、ブタの脳の場合は１匹の脳から２０μｇか
ら１００μｇのＧＡＤしか調製しえないと推測される。
一方、大腸菌等や昆虫細胞で組換えＧＡＤを大量に発現
させた例は報告されているが、抗ＧＡＤ自己抗体との結
合性に問題があり、測定系を構成できなかった。即ち、
大腸菌や昆虫細胞で発現させた組換えＧＡＤは、発現量
は多いものの、リフォールディングを行っても天然型の
ＧＡＤの構造を取りえないため、抗ＧＡＤ自己抗体との
反応性に劣るという問題点があった。通常、容易な方法
で、患者血清中の抗ＧＡＤ自己抗体と反応するのに必要
な最低約１ｍｇのＧＡＤが得られなければ、十分な性能
をもつＥＩＡを樹立することは不可能である。

【０００４】もうひとつの問題点は、これまで入手でき
るＧＡＤが少量だったため、測定においてＧＡＤを水不
溶性担体に結合させる方法が用いられていないことであ
る。この方法が用いられれば、ＧＡＤが結合した水不溶
性担体と分析検体とを接触させた後、非結合成分を除去
し、ＧＡＤを介して水不溶性担体に結合した抗ＧＡＤ自
己抗体を特異的に検出する方法が用いることができる。
該方法は、自動化が容易なことが知られており、また複
数の項目が測定できる免疫自動測定装置の１項目に組み
入れることが可能となる。一方、これまでの測定系で
は、放射性物質で標識したＧＡＤと分析検体を接触せし
めた後、分析検体中の抗体を、抗ヒト免疫グロブリン抗
体含有ヤギ血清、及び抗体と特異的に結合することが知
られているプロテインＡが結合した樹脂と混合及び遠心
操作を行うことにより沈殿させ、沈殿中の放射能を測定
することで分析検体中の抗ＧＡＤ自己抗体を測定してい
る。この方法では自動化がきわめて困難である。また一
方で、抗ＧＡＤ自己抗体とＧＡＤの結合性が解析されて
おらず、組換えＧＡＤを用いた抗ＧＡＤ抗体の測定が原
理上可能かどうか知られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ひとつは、ミリグラム
レベルでのＧＡＤの生産が容易であるような製造法を提
供し、放射性物質を用いない抗ＧＡＤ抗体測定法を提供
することである。もうひとつは、抗ＧＡＤ自己抗体とＧ
ＡＤの結合性を解析することにより、ＧＡＤが結合した
水不溶性担体と分析検体とを接触せしめた後、ＧＡＤを
介して水不溶性担体に結合した抗ＧＡＤ自己抗体と、非
結合成分とを分離し、ＧＡＤを介して水不溶性担体に結
合した抗ＧＡＤ自己抗体を特異的に検出する方法を提供
することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
め、本発明者らは、ＧＡＤの発現等について鋭意研究を
行った結果、効率的に細胞を培養し更に回収してＧＡＤ
を調製することが可能な組換えＧＡＤを発現するミエロ
−マ細胞株を樹立し、これを培養して細胞成分からＧＡ
Ｄを精製し、併せて精製ＧＡＤを用いる抗ＧＡＤ抗体の
免疫化学測定法を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、組換えヒトグルタミン酸
脱炭酸酵素を発現することを特徴とするミエロ−マ細胞
株である。また本発明は、そのようなミエローマ細胞株
を培養し組換えヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を回収する
ことを特徴とする、組換えヒトグルタミン酸脱炭酸酵素
の製造方法である。さらに本発明は、このような方法に
より製造されたヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を分析検体
と接触させ、ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素と結合した抗
ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体を検出することを特徴
とする、抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体の測定方法
である。さらに本発明は、このような測定方法に用いる
ための、前述の方法により製造されたヒトグルタミン酸
脱炭酸酵素を含有することを特徴とする試薬キットであ
る。ところで本発明は、前述の方法で製造されたヒトグ
ルタミン酸脱炭酸酵素を動物種に免疫することを特徴と
する、抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体の製造法であ
る。

【０００８】一方、本発明はヒトグルタミン酸脱炭酸酵
素を水不溶性担体に結合させ、分析検体と接触させた
後、ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素に結合した抗ヒトグル
タミン酸脱炭酸酵素抗体と非結合成分とを分離し、ヒト
グルタミン酸脱炭酸酵素に結合した抗ヒトグルタミン酸
脱炭酸酵素抗体を特異的に検出することを特徴とする、
抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体の測定方法である。
また本発明は、このような測定方法に用いるための、水
不溶性担体に結合させたヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を
含有することを特徴とする試薬キットである。以下、本
発明を詳細に説明する。

【０００９】１．組換えＧＡＤ発現ミエロ−マ細胞株 本発明の組換えヒトＧＡＤ発現ミエロ−マ細胞株は、遺
伝子工学を用いた通常の方法、即ちミエロ−マ細胞株に
以下のような発現ベクタ−を導入することにより作製す
ることができる。

【００１０】本発明で用いるＧＡＤをコ−ドするＤＮＡ
配列を発現する、即ちＧＡＤを生産しうる複製可能な発
現ベクタ−は、既に報告されているＧＡＤをコ−ドする
ＤＮＡ配列に加え、該ＤＮＡ配列を発現させるためのＤ
ＮＡ配列や宿主中でベクタ−ＤＮＡを複製するための複
製起点等を有し、選択した宿主を形質転換できるもので
あればよく、適宜選択して使用できる。該ＤＮＡ配列を
発現させるためのＤＮＡ配列としては、プロモ−タ−系
が重要であり、ＳＶ４０プロモ−タ−系やサイトメガロ
ウイルスプロモ−タ−系などが例示できるが、宿主との
関係において適宜選択すればよい。

【００１１】ＧＡＤにはＧＡＤ６５とＧＡＤ６７などの
分子種があり、いずれをも用いる事ができるが、ＩＤＤ
Ｍに関する抗ＧＡＤ抗体を検出するためには、本発明で
用いるＧＡＤをコ−ドするＤＮＡ配列としては、ヒトＧ
ＡＤ６５をコ−ドするＤＮＡ配列が望ましく、公知文献
（例えばＫａｒｌｓｅｎ， Ａ．Ｅ． ｅｔ．ａｌ．，
Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８，８３３７（１９９１））などを参照して調製すれば
よい。

【００１２】本発明で用いるミエロ−マ細胞株として、
実施例に示したマウスミエロ−マ細胞株ＳＰ２／０（免
疫グロブリン非分泌マウスミエロ−マ、ＣＲＬ１５８
１；ＡＴＣＣ）ばかりでなく、Ｐ３Ｕ１，ＮＳ１などを
好ましく例示できる。

【００１３】発現ベクタ−によるミエロ−マ細胞株の形
質転換は、例えばエレクトロポ−ション法等の通常の方
法に従えば良く、特に限定はない。

【００１４】ミエロ−マ細胞株の培養は、通常の方法に
より行うことができる。より具体的には、例えば通常の
培養器具を用いた静置培養、適当な細胞培養装置を用い
た大量培養を例示できる。細胞培養装置としては、ホロ
ファイバ−型やタンク型のものが例示できるが、細胞を
担体から剥がす操作を必要としない等の観点からタンク
型のものが好ましい。

【００１５】ミエロ−マ細胞に導入されたＧＡＤをコ−
ドするＤＮＡ配列は、プロモ−タ−系の働きにより発現
され、細胞内にＧＡＤが発現したミエロ−マ細胞が出現
する。ミエロ−マ細胞からＧＡＤを調製するには、例え
ば細胞に緩衝液を加え、ホモジナイザ−でホモジネ−ト
した後、遠心分離した後、上清を回収する。その後、上
清を抗ＧＡＤ抗体を用いたアフィニティ−クロマトグラ
フィ−にかけ、ＧＡＤを精製すればよい。このような目
的に用いる抗体としては、実施例で示すＧＡＤ１抗体が
例示できる。本願ではこのようにして組換えヒトＧＡＤ
を発現するミエローマＳＰＧ１２、ＳＰＧ１４、ＳＰＧ
１９、ＳＰＧ１１１、ＳＰＧ３５、ＳＰＧ３１１、ＳＰ
Ｇ４６、ＳＰＧ５９、ＳＰＧ６８、ＳＰＧ６１０、ＳＰ
Ｇ７２、ＳＰＧ７３、ＳＰＧ７１３、ＳＰＧ８６、ＳＰ
Ｇ８７及びＳＰＧ８８が得られ、特にＳＰＧ１４は発現
量が最大であった。

【００１６】２．ＧＡＤを発現するミエロ−マ細胞株に
より製造されたＧＡＤを分析検体と接触させ、ＧＡＤと
結合した抗ＧＡＤ抗体を検出する、抗ＧＡＤ抗体の測定
法 この測定法では、組換えＧＡＤを発現するミエロ−マ細
胞株より製造されたＧＡＤを分析検体と接触させ、抗Ｇ
ＡＤ抗体を測定するが、特にヒト血清に含まれる抗ＧＡ
Ｄ自己抗体の生理的濃度を正確かつ迅速に測定すること
ができる。

【００１７】例えば、すでに市販されているリップＡｎ
ｔｉ−ＧＡＤヘキスト（ヘキスト社）で用いられている
方法、すなわち放射性物質で標識したＧＡＤと分析検体
を接触せしめた後、分析検体中の抗体を、抗ヒト免疫グ
ロブリン抗体含有ヤギ血清、及び抗体と特異的に結合す
ることが知られているプロテインＡが結合した樹脂と混
合・遠心操作を行うことにより沈殿させ、沈殿中の放射
能を測定することで分析検体中の抗ＧＡＤ自己抗体を測
定する方法において、標識されるＧＡＤに本願のミエロ
ーマ細胞株が発現した組換えＧＡＤを用いることができ
る。

【００１８】３．ＧＡＤを水不溶性担体に結合させ、分
析検体と接触させた後、ＧＡＤに結合した抗ＧＡＤ抗体
と非結合成分とを分離し、ＧＡＤに結合した抗ＧＡＤ抗
体を特異的に検出する、抗ＧＡＤ抗体の測定法 本発明では、水不溶性担体に結合したＧＡＤに、分析検
体中の抗ＧＡＤ抗体を結合させ、この結合した抗ＧＡＤ
抗体を測定することが例示でき、特にヒト血清に含まれ
る抗ＧＡＤ自己抗体の濃度を測定することができる。

【００１９】この方法では、水不溶性担体としては例え
ばマイクロタイタ−プレ−ト等の板状のものの他、例え
ばポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック製、
金属セラミックス等の無機物質等のビ−ズ状の支持体も
用いることができる。

【００２０】ＧＡＤの固相化、即ち前記水不溶性担体と
の結合には、ＧＡＤを直接結合させる方法や、他の物質
を介して結合させる方法の２通りが考えられる。直接結
合させる方法としては、蛋白質濃度で例えば１０μｇ／
ｍｌのＧＡＤをプレ−トのウエルに適当量（例えば１０
０μｌ程度）加え、一晩静置させる方法が例示できる。

【００２１】他の物質を介して結合させる方法として
は、例えば架橋剤や抗ＧＡＤ抗体を介して結合させる方
法があり、具体的にはＰＢＳ溶液に抗ＧＡＤ抗体を適当
濃度（例えば２μｇ／ｍｌ）となるように溶解し、プレ
−トのウエル等に適当量（例えば１００μｌ程度）加え
て一晩静置し、続いて蛋白質濃度で例えば１０μｇ／ｍ
ｌのＧＡＤをプレ−トのウエルに適当量（例えば１００
μｌ程度）加え、一晩静置させる方法が例示できる。

【００２２】このような水不溶性担体にＧＡＤを介して
結合した抗ＧＡＤ抗体は、サンドイッチ法又は競合法な
どの方法で測定することができる。例えばサンドイッチ
法の場合は、標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用い、固
体支持体にＧＡＤを介して結合した抗ＧＡＤ自己抗体に
当該標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を特異的に結合さ
せ、標識を検出すれば良い。

【００２３】一方、競合法の場合には、標識抗ＧＡＤ抗
体を用いればよい。この場合、標識抗ＧＡＤ抗体と、検
体中の抗ＧＡＤ抗体の間でＧＡＤへの競合が生じる。

【００２４】本発明で用いる標識としては、例えば通常
使用されている放射性物質、蛍光性物質、発光物質、ア
ルカリ性ホスファタ−ゼや西洋ワサビペルオキシタ−ゼ
等の酵素、更にはビオチン等が例示できるが、取扱いの
容易性等の観点から、アルカリ性ホスファタ−ゼや西洋
ワサビペルオキシタ−ゼ等の酵素が特に好ましい。

【００２５】４．試薬キット 本発明により提供される試薬キットは、本願の抗ＧＡＤ
抗体の測定に用いるために使用される。このキットには
先に説明した様なＧＡＤ発現ミエロ−マ細胞株を培養し
て製造した組換ＧＡＤを用いることが望ましいが、測定
方法によっては従来から知られている方法で調製したＧ
ＡＤを用いても構わない。また、サンドイッチ法か又は
競合法かによって必要となる他の試薬を含んでいても良
い。

【００２６】５．抗ＧＡＤ抗体の作製法 本発明の抗ＧＡＤ抗体の作製法は、これまで説明してき
た本発明のＧＡＤ発現ミエロ−マ細胞株から製造したＧ
ＡＤを免疫原として、ヒト以外の動物種に免疫すること
を特徴とする。

【００２７】モノクロ−ナル抗体を作製するときには免
疫原はマウスが、ポリクロ−ナル抗体を作製するときに
は免疫原はウサギが例示できるが、その限りではない。

【００２８】調製された抗ＧＡＤ抗体は、前記した抗Ｇ
ＡＤ自己抗体の免疫化学的測定法において使用すること
が可能である。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、糖尿病の診断に効果的
な組換えＧＡＤ、特に組換えヒトＧＡＤ６５をミリグラ
ム単位で大量に製造することが可能となる。しかも、本
発明のようにミエロ−マ細胞においてＧＡＤをコ−ドす
るＤＮＡ配列を発現させることによって、種々の効果が
達成させる。即ちミエロ−マ細胞を使用することで、大
量のＧＡＤを製造することが可能となる。また、ミエロ
−マ細胞は付着性の細胞ではないため、比較的容易に浮
遊培養が可能で、簡便な装置等を用いて培養操作を行う
ことができる。しかもこの培養操作においては特別な熟
練は必要とされず、付着細胞と比較してより大量の培養
が可能である。更にミエローマから得れるＧＡＤは、既
に天然型と同じ構造を有しているため、リフォールディ
ングが不要なばかりでなく、抗ＧＡＤ抗体と反応性を有
するＧＡＤを確実に得ることができる。

【００３０】また、本発明によれば、糖尿病の診断の対
象である血清中の抗ＧＡＤ自己抗体は、水不溶性の固体
担体に結合したＧＡＤを介して結合し、最終的には標識
抗ヒト免疫グロブリン抗体により検出されうるだけの、
ＧＡＤとの結合性を有していることが明らかになった。
このことは、抗ＧＡＤ自己抗体測定において、一般的に
ＢＦ分離と呼ばれている操作（ＧＡＤと抗ＧＡＤ抗体と
が結合した物と結合していない物とを分離する操作）が
可能となり、それを用いてサンドイッチ法を行うことが
できるという大きな利点がある。

【００３１】上記２つの発明は、組み合わせることによ
り、より効果的に活用することができる。

【００３２】更に、本発明で提供される大量の組換えＧ
ＡＤは、基礎研究にも広く応用することができる。この
ような基礎研究としては、ＧＡＤの立体構造の解明、Ｇ
ＡＤと抗ＧＡＤ自己抗体の結合様式の解明、抗ＧＡＤ自
己抗体産生Ｂリンパの樹立、ＧＡＤ反応性Ｔリンパ球の
樹立等があげられる。これらの研究成果は、新規糖尿病
治療薬の開発に有効に活用されることが期待できる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００３４】実施例１ ヒトＧＡＤ６５遺伝子の取得 ヒトすい臓のｃＤＮＡライブラリ−（ｃｌｏｎｅ ｔｅ
ｃｈ社）から配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレ
オチドを用いて市販のキット（ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，宝酒造（株））を用い、ヒトＧ
ＡＤ６５の遺伝子を増幅させた。得られたＰＣＲ反応物
から、市販のキット（ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ，
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ヒトＧＡＤ６５遺
伝子をクロ−ニングした。

【００３５】実施例２ ヒトＧＡＤ６５発現プラスミド
の構築 実施例１で得られたＧＡＤ６５遺伝子を出発材料とし
て、組換えＧＡＤ６５発現ベクタ−の構築を行った。

【００３６】実施例１で得られたベクタ−をＳａｌＩ、
ＮｏｔＩで切り出し，得られた断片（約１．８ｋ塩基
対）をまず市販のベクタ−（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，
東洋紡（株）製）に導入した後、ｘｈｏＩ，ＮｏｔＩで
切り出した断片を動物細胞発現プラスミドＢＣＭＧＳｎ
ｅｏ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻、９７−
１０４頁、１９８８年及びＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６
９巻、１３−２５頁、１９８９年参照）に挿入し、ヒト
ＧＡＤ６５発現プラスミドＢＣＭＧＳ−ＧＡＤを得た。
当該ベクタ−の構成を図１に示す。

【００３７】図中、ＣＭＶ−Ｐはサイトメガロウイルス
プロモ−タ−を示し、ＧＡＤはヒトグルタミン酸脱炭酸
酵素６５を、ＢＰＶはウシパピロ−マウイルスを、Ａｍ
ｐはβ−ラクタマ−ゼをコ−ドするＤＮＡ配列をそれぞ
れ示し、ｐｏｌｙＡはポリアデニレ−トアタッチメント
シグナルを示す。図中、Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝
子を示す。

【００３８】実施例３ ヒトＧＡＤ６５発現ミエロ−マ
細胞株の樹立 実施例２で得られたＢＣＭＧＳ−ＧＡＤ（１０μｇ）を
２×１０⁷個のＳＰ２／０細胞（免疫グロブリン非分泌
マウスミエロ−マ、ＣＲＬ１５８１；ＡＴＣＣ）にエレ
クトロポ−ション法で導入した（Ｇｅｎｅ Ｐｌｕｓｅ
ｒ，ＢＩＯＲＡＤ社製、９００Ｖ，２５μＦ）。氷上で
１０分間放置後細胞を集め、Ｅ−ＲＤＦ培地（１０％Ｆ
ＣＳを含む）で２４時間培養した。その後、選択培地
（Ｅ−ＲＤＦ培地、１０％ＦＣＳ、６００μｇ／ｍｌの
Ｇ４１８を含む）中で１日培養後、限界希釈法によりモ
ノクロ−ナル化し、１６クローンを得た。

【００３９】それぞれのクロ−ンのＧＡＤ６５発現の程
度は、ウエスタンブロット法により解析した。すなわ
ち、それぞれのクロ−ンの細胞破砕液を１０％アクリル
アミドゲル電気泳動により分離した後、ニトロセルロ−
ス膜に転写した。その後転写膜を、抗ＧＡＤモノクロ−
ナル抗体と反応させた後に、膜に結合した抗体を酵素標
識された抗マウス抗体（ＧＡＤ６；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａ
ｎｋ）と反応させた。その後、市販のキット（ＥＣＬ−
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用
いて、発色させた。結果を図２に示す。

【００４０】図中、ＳＰ２／０はホスト細胞、ＧＡＤ−
ＣＨＯはすでに報告されているＧＡＤ発現ＣＨＯ細胞
（１９９５年日本糖尿病学会参照）を、ＳＰＧ１２、Ｓ
ＰＧ１４、ＳＰＧ１９、ＳＰＧ１１１、ＳＰＧ３５、Ｓ
ＰＧ３１１、ＳＰＧ４６、ＳＰＧ５９、ＳＰＧ６８、Ｓ
ＰＧ６１０、ＳＰＧ７２、ＳＰＧ７３、ＳＰＧ７１３、
ＳＰＧ８６、ＳＰＧ８７及びＳＰＧ８８はクロ−ンの番
号を示す。また、各クロ−ンに対し、右側の列は左側の
列の４分の１相当の細胞破砕液を用いている。図中矢印
がＧＡＤ６５である。その結果、発現量が最大であるク
ロ−ンをＧＡＤ６５発現ミエロ−マ細胞株（ＳＰＧ１
４）として樹立した。

【００４１】実施例４ ヒトＧＡＤ６５発現ミエロ−マ
細胞株の大量培養 タンク型大量培養装置（Ａｘｅｌｌｏｎ，キリンビ−ル
（株）社製）を用いて、ＳＰＧ１４の大量培養を試み
た。３×１０⁷個のＳＰＧ１４をＥ−ＲＤＦ培地（１０
％ＦＣＳ、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む）３Ｌに
接種した（１×１０⁵個／ｍｌ）。３日間培養し、細胞
数が１×１０⁶個／ｍｌに到達したところで培地のかん
流を開始した。更に３日間かん流培養を続けることで、
細胞数は１．６×１０⁷個／ｍｌに到達した。なお培養
の間、温度は３７℃、ｐＨは７．０、溶存酸素は５ｐｐ
ｍになるようにコントロ−ルした。

【００４２】培養終了後、細胞を遠心分離して培地から
分離した。最終的に、３Ｌの培養タンクから４．８×１
０¹⁰個の細胞が回収できた。ＰＢＳで１度細胞をリンス
した後、−８０℃で凍結保存した。

【００４３】実施例５ 組換えヒトＧＡＤ６５の精製 ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（１ｍｌ；
ファルマシア社製）と抗ヒトＧＡＤ抗体ＧＡＤ１（ＨＢ
１８４；ＡＴＣＣ）１０ｍｇを使用して、添付されたプ
ロトコ−ルに従い、ＧＡＤ１結合抗体カラムを作製し
た。

【００４４】実施例４に記載した方法で培養して得た細
胞の５０分の１に当たる細胞（８．４×１０⁸）に、破
砕緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）、０．２ｍＭ ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ（ＰＬＰ），１ｍＭ ２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ
ｉｓｏｔｈｉｏｕｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＡＥ
Ｔ），１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃ
ｈｌｏｒｉｄｅ）５ｍｌを加えて、テフロンホモジナイ
ザ−でホモジナイズした。得られたホモジネ−トを遠心
分離し上清を得、ＳＰＧ１４細胞破砕液とした。

【００４５】平衡化緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭＰＬＰ，１ｍＭ ＡＥ
Ｔ）で平衡化した抗体カラムに、上記ＳＰＧ１４細胞破
砕液をロ−ドした。その後、同緩衝液（５ｍｌ）でカラ
ムを洗浄後、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ ＰＬＰ，１ｍＭＡＥ
Ｔ，２０ｍＭグルタミン酸、１０ｍＭジエタノ−ルアミ
ン）で溶出させた。その後、溶出フラクションは０．１
Ｎ ＨＣｌで中和した。以上の操作を数回行い、溶出フ
ラクションを集め、分画分子量１万の限外濾過膜で濃縮
した。

【００４６】濃縮後のサンプルの電気泳動のパタ−ンを
図３に示す。レ−ン１は濃縮後のサンプルを泳動したも
のであり、レ−ン８から２はそれぞれ１、２^-1、２^-2、
２^-3、２^-4、２^-5、２^-6ｍｇ／ｍｌの標準たんぱく質
（ＢＳＡ）を泳動したものである。この結果から明らか
なように、レ−ン１の組換えヒトＧＡＤ６５は十分に精
製されていることがわかる。また泳動の結果から、レ−
ン１の組換えヒトＧＡＤ６５はレ−ン６のＢＳＡと同タ
ンパク質量であると判断し、精製ＧＡＤ６５の濃度を決
定した。

【００４７】次に、細胞破砕液中に含まれるＧＡＤの濃
度を、表面プラズマ共鳴測定装置であるＢＩＡｃｏｒｅ
（ファルマシア社製）を用いて求めた。結果を図４に示
す。図４は、種々の濃度のＧＡＤを含む溶液をＢＩＡｃ
ｏｒｅで測定したときに得られたレゾナンスユニット
を、ＧＡＤの濃度でプロットした結果を示す。

【００４８】実施例４に記載した方法で培養して得た細
胞の５０分の１に当たる細胞（８．４×１０⁸）に、上
記破砕緩衝液５ｍｌを加えてホモジナイズした。得られ
たホモジネ−トを遠心分離し、得た上清を上清１とし
た。沈殿には破砕緩衝液５ｍｌを加えてホモジナイズ後
遠心分離し、得た上清を上清２とした。さらに沈殿に破
砕緩衝液５ｍｌを加えてホモジナイズ後遠心分離し、得
た上清を上清３とした。その結果、上清１、上清２、上
清３にはそれぞれ、１４５．５μｇ、３９μｇ、１３．
５μｇ、のＧＡＤ６５が含まれていると算出された。こ
の結果は、１回の培養で得た細胞の５０分の１に当たる
細胞（８．４×１０⁸個）中に２００μｇのＧＡＤ６５
（１４５．５μｇ＋３９μｇ＋１３．５μｇ）が含まれ
ていることを示す。すなわち、１回の培養で得られた細
胞中に合計１０ｍｇ（２００μｇ×５０）のＧＡＤ６５
が発現されていることを示し、本製造法の生産性が非常
に高いことを意味する。

【００４９】実施例６ 組換えヒトＧＡＤ６５の、患者
血清中の抗ＧＡＤ自己抗体との結合性 リップＡｎｔｉ−ＧＡＤヘキスト（ヘキスト社）で１２
５Ｕ／ｍｌの抗ＧＡＤ自己抗体が測定された血清に、コ
ントロ−ル細胞（ＳＰ２／０）または各種濃度のＳＰＧ
１４の細胞破砕液を共存させ、リップＡｎｔｉ−ＧＡＤ
ヘキストを用いて¹²⁵Ｉ−ＧＡＤと混合し、免疫グロブ
リンを沈殿させたときの沈殿中の放射能を測定した。細
胞破砕液の調製方法は実施例５で示した方法で行った。
結果を図５に示す。図５は、得られた放射能を、共存さ
せる細胞破砕液の希釈率でプロットした。図中、黒丸は
ＳＰＧ１４の細胞破砕液の結果を、白丸はＳＰ２／０の
細胞破砕液の結果を示す。それによれば、ＳＰＧ１４の
細胞破砕液が、患者血清中の抗ＧＡＤ自己抗体と上記キ
ット中のブタ由来ＧＡＤの結合を阻害することが示され
た。すなわち、組換えヒトＧＡＤ６５は、患者血清中の
抗ＧＡＤ自己抗体と結合することを示す。

【００５０】実施例７ 抗ＧＡＤ自己抗体のサンドイッ
チ酵素免疫測定法 今回精製したＧＡＤを用いて、抗ＧＡＤ自己抗体のサン
ドイッチ酵素免疫測定法による測定を行い検量線を引い
た。

【００５１】実施例５で精製したＧＡＤを１０μｇ／ｍ
ｌの濃度に調整しマイクロタイタ−プレ−トに１００μ
ｌを固定化した。その後、１０倍に希釈したリップＡｎ
ｔｉ−ＧＡＤヘキストに添付された４，８，３２，１２
５，２５６Ｕ／ｍｌの標準血清を１００μｌ加え、標準
血清中に存在する抗ＧＡＤ自己抗体をプレ−トに固定化
したＧＡＤと反応させた。次にＧＡＤと結合した抗ＧＡ
Ｄ自己抗体を、酵素標識された抗ヒトＩｇＧと反応させ
た後に、発色試薬で発色させた。

【００５２】結果を図６に示す。それによれば、ＧＡＤ
を固定化したウエルに標準血清を加えた場合の発色（白
丸）は、ＧＡＤを固定化していないウエルに標準血清を
加えた場合の発色（黒丸）と比較して明らかに高く、さ
らに抗体価の増加にともない発色も増加することが示さ
れた。

【００５３】実施例８ サンドイッチ酵素免疫測定法 実施例７で構築した抗ＧＡＤ自己抗体のサンドイッチ酵
素免疫測定法を用いて、ＩＤＤＭ患者血清（６３例）と
健常人血清（４５例）中の抗ＧＡＤ自己抗体を測定し
た。結果を図７に示す。図中、ＩＤＤＭはインスリン依
存型糖尿病を、ＮＣは健常人を示す。図中破線は健常人
血清で得られた値の平均＋２ＳＤを示す。それによれ
ば、健常人血清よりも明らかに高い値がＩＤＤＭ患者血
清で観測された。すなわち、患者血清中の抗ＧＡＤ自己
抗体をサンドイッチ酵素免疫測定法で測定できることが
示された。

【００５４】実施例９ 実施例７で構築した抗ＧＡＤ自己抗体のサンドイッチ酵
素免疫測定法を用いて、ＩＤＤＭ患者血清（３５検体）
と健常人（４５例）中の抗ＧＡＤ自己抗体を測定した。
結果を図８に示す。図中、ＩＤＤＭはインスリン依存型
糖尿病を、ＮＣは健常人を示す。図中、破線は健常人血
清で得られた値の平均＋２ＳＤを示す。それによれば、
ＩＤＤＭ患者血清３５検体中、６０％に相当する２１検
体が、健常人血清で得られた値の平均＋２ＳＤより高値
を示すことが観測された。即ち、患者血清中の抗ＧＡＤ
自己抗体をサンドイッチ酵素免疫測定法で測定できるこ
とが示された。

【００５５】更に、このＩＤＤＭ患者血清３５検体をリ
ップＡｎｔｉ−ＧＡＤヘキスト（ヘキスト社）で測定
し、前述のサンドイッチ酵素免疫測定法による測定値と
の相関を調べた。結果を図９に示す。図中、縦軸はリッ
プＡｎｔｉ−ＧＡＤヘキストによる測定値（抗ＧＡＤ自
己抗体量；Ｕ／ｍｌ）を、横軸はサンドイッチ酵素免疫
測定法による測定値（４０５ｎｍでの吸光度）を示す。
それによれば、実施例７で構築した抗ＧＡＤ自己抗体の
サンドイッチ酵素免疫測定法とリップＡｎｔｉ−ＧＡＤ
ヘキストとの間に高い相関が確認された。即ち、本サン
ドイッチ酵素免疫測定法が、ＩＤＤＭの識別に十分な感
度をもっていることが示された。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGTCGACAT GGCATCTCCG GGCTCTGGC 29。

【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGGCGGCCGC TCTAGAAATC TTGTCCTAGG CGTTC 35。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧＡＤ発現ベクタ−ＢＣＭＧＳ−ＧＡＤの構造
を示す図である。

【図２】実施例３で行ったウエスタンブロッディングの
結果を示す図である。

【図３】精製したＧＡＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結
果を示す図である。

【図４】精製したＧＡＤ６５を使用して作成した検量線
を示す図である。

【図５】実施例６で行った、沈殿中の放射能とＳＰＧ１
４細胞破砕液の濃度の関係を示す図である。

【図６】実施例７で行った標準血清濃度と吸光度の関係
を示す図である。

【図７】実施例８で行ったＩＤＤＭ患者血清及び健常人
血清と、吸光度との関係を示す図である。

【図８】実施例９で行ったＩＤＤＭ患者血清及び健常人
血清と、吸光度との関係を示す図である。

【図９】実施例９で行ったＩＤＤＭ患者血清の、サンド
イッチ酵素免疫測定法での測定値とリップＡｎｔｉ−Ｇ
ＡＤヘキストでの測定値との相関を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】組換えヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を発現
   することを特徴とするミエロ−マ細胞株。
2. 【請求項２】ＳＰＧ１４細胞株である請求項１に記載の
   細胞株。
3. 【請求項３】請求項１に記載の細胞株を培養し組換えヒ
   トグルタミン酸脱炭酸酵素を回収することを特徴とす
   る、組換えヒトグルタミン酸脱炭酸酵素の製造方法。
4. 【請求項４】ミエロ−マ細胞株がＳＰＧ１４細胞株であ
   る請求項３に記載の製造方法。
5. 【請求項５】請求項３又は４に記載の方法により製造さ
   れたヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を分析検体と接触さ
   せ、ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素と結合した抗ヒトグル
   タミン酸脱炭酸酵素抗体を検出することを特徴とする、
   抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体の測定方法。
6. 【請求項６】ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を水不溶性担
   体に結合させ、分析検体と接触させた後、ヒトグルタミ
   ン酸脱炭酸酵素に結合した抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵
   素抗体と非結合成分とを分離し、ヒトグルタミン酸脱炭
   酸酵素に結合した抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体を
   特異的に検出することを特徴とする、抗ヒトグルタミン
   酸脱炭酸酵素抗体の測定方法。
7. 【請求項７】請求項３又は４に記載の方法により製造さ
   れたヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を含有することを特徴
   とする、請求項５に記載の測定方法に用いる試薬キッ
   ト。
8. 【請求項８】水不溶性担体に結合させたヒトグルタミン
   酸脱炭酸酵素を含有することを特徴とする、請求項６に
   記載の測定方法に用いる試薬キット。
9. 【請求項９】請求項３または４に記載の方法で製造され
   たヒトグルタミン酸脱炭酸酵素を動物種に免疫すること
   を特徴とする、抗ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素抗体の製
   造法。