JPH09313188A - Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを分離、その
構造を解明すること、それにより、Ｇ型肝炎ウイルスの
検出が容易になり、肝障害との関連の解明が可能とな
る。 【解決手段】 本発明により、Ｇ型肝炎ウイルスゲノム
ＲＮＡの塩基配列が明らかにされ、このＲＮＡと相補的
なＤＮＡ又は相同的なＤＮＡの塩基配列に基づいて設定
したプライマーにより、Ｇ型肝炎ウイルスの検出を行
う。また、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質により抗原抗体反応
によりＧ型肝炎ウイルスの検出を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｇ型肝炎ウイルス
遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質及びそれらの用途に関
する。

【０００２】

【従来の技術】Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢＶウイルスと称
することがある）は最近発見されたフラビウイルス族の
１種のＲＮＡウイルスであり、現在ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ
−Ｂ、ＧＢＶ−Ｃの３種類の存在が報告されている。Ａ
〜Ｅ型の肝炎ウイルスだけでは説明のつかない肝炎があ
ることから、非Ａ〜Ｅ型肝炎の病因としてＧ型肝炎ウイ
ルスについて検討がなされている。

【０００３】ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ−Ｂは感染実験に使用
されたタマリンの血清から検出されたが、これまでにヒ
トからのゲノムの検出の報告はない。

【０００４】ＧＢＶ−Ｃのゲノムの検出は、アメリカに
おいてはSimons等 (Nature Medicine 1: 564-569, 199
5) により行われた。すなわち、ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ−
Ｂに対する抗体陽性者の血清から、ヘリカーゼに相当す
る部位を増幅する縮重プライマー (degenerate primer)
を用いたボリメラーゼチェインリアクション (ＰＣＲ）
によって、ヒトのＧＢＶ−Ｃゲノムが検出された。しか
し、彼らが検出した症例のうち、慢性肝炎が明らかな症
例は４例であり、このウイルスと肝障害の関係について
の詳細は未だ明らかにされていない。

【０００５】最近、日本においてはYoshiba 等により、
検索した６例の非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型劇症肝炎患者のうち
３例からＧＢＶ−Ｃゲノムを検出されたという報告がな
され(Lancet 346: 1131-1132, 1995)、この疾患とウイ
ルスとの関連が注目されている。しかしながら、この検
出は、Ｇ型肝炎ウイルスゲノム中、変異の生じやすいヘ
リカーゼ領域から誘導されたプライマーを用いるＰＣＲ
により、ヘリカーゼ領域の塩基配列を決定したのみであ
り、他の領域の配列は解明されていない。

【０００６】Ｇ型肝炎ウイルスを検出し、日本人におけ
る肝障害との関連をさらに検討するためには、日本に主
に存在するＧ型肝炎ウイルスゲノムの塩基配列を決定し
て構造を解明することが望まれる。また、ウイルスの検
出のためには、上述のヘリカーゼ領域のような変異の起
きやすい部位のみでなく、5'末端非翻訳領域のような変
異の少ない高度に保存された領域の解明も望まれる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、非Ａ〜
Ｅ型肝炎の原因ウイルスとしてのＧ型肝炎ウイルスの分
離、同定は重要な課題であり、特に日本に存在するウイ
ルスについての検討が望まれている。

【０００８】従って、本発明の目的は、Ｇ型肝炎ウイル
ス遺伝子を分離し、その塩基配列を決定し、この塩基配
列を利用して、肝炎患者血清からのＧ型肝炎ウイルスの
検出を行う方法を提供することである。また、Ｇ型肝炎
ウイルス蛋白質、及びそれを用いたＧ型肝炎ウイルスの
検出を行う方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、非Ａ、非
Ｂ、非Ｃ型肝疾患患者の血清中から、Ｇ型肝炎ウイルス
ゲノムを分離し、そのヘリカーゼ領域、5'末端非翻訳領
域、コア〜エンベロープ領域、ポリメラーゼ領域の一部
の塩基配列を決定して、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、配列番号１、５、
９、13または17の塩基配列を有するＧ型肝炎ウイルスゲ
ノムＲＮＡ、配列番号２、６、10、14または18の塩基配
列を有する前記Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに相補的
なＤＮＡ、および配列番号３、７、11、15または19の塩
基配列を有する、前記Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに
相同的なＤＮＡである。また、配列番号４、８、12また
は16で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有
するＤＮＡである。

【００１１】さらに、本発明により、配列番号４、８、
12または16で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなるＧ型肝炎ウイルス蛋白質も提供される。

【００１２】また、本発明は、前記Ｇ型肝炎ウイルスゲ
ノムＲＮＡに相補的なＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａ、および前記組換え体ＤＮＡにより形質転換された形
質転換体であり、さらに、前記形質転換体を培養し、得
られる培養物からＧ型肝炎ウイルス蛋白質を分離するこ
とを特徴とするＧ型肝炎ウイルス蛋白質の生産方法にも
関する。

【００１３】さらに、本発明は、前記Ｇ型肝炎ウイルス
ゲノムＲＮＡに相補的なＤＮＡ、あるいはＲＮＡに相同
的なＤＮＡの塩基配列に基づいて設定されたプライマー
を用いて、Ｇ型肝炎ウイルスを検出する方法を提供す
る。

【００１４】また本発明は、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質の
少なくとも一部を抗原として用いる抗原抗体反応によ
り、あるいは該抗原に対する抗体を用いる抗原抗体反応
によりＧ型肝炎ウイルスを検出することを特徴とするＧ
型肝炎ウイルスの検出方法である。

【００１５】さらに、本発明は、前記蛋白質の少なくと
も一部、あるいは前記蛋白質に対する抗体を有効成分と
して含むＧ型肝炎診断剤である。

【００１６】さらに、本発明は、前記蛋白質の少なくと
も一部を有効成分として含むＧ型肝炎ワクチンである。

【００１７】ここで、「Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ
に相同的なＤＮＡ」とは、ＤＮＡ塩基配列において、対
応するＲＮＡ塩基配列中のウラシル (Ｕ) をチミン
(Ｔ) に置換した以外は全て同一の配列であることを意
味する。

【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの塩基配列
の決定 まず、本発明者等は、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝炎、肝硬
変、肝癌と考えられた症例を対象とし、患者血清中より
Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡを分離し、その塩基配列
を決定した。症例は、ＨＢ_S 抗原についてはＲＩＡ法
で、ＨＶＣ抗体は第２世代の抗体で陰性を確認したもの
である。

【００２０】Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ分離、クロ
ーニングおよび塩基配列の決定は以下のようにして行っ
た。

【００２１】ウイルスゲノムＲＮＡはグアニジン法で抽
出したものを使用し、逆転写酵素およびランダムプライ
マーを用いて単鎖のｃＤＮＡ (Ｇ型肝炎ウイルスゲノム
ＲＮＡに相補的なＤＮＡ) を合成し、Yoshiba 等、Lanc
et 346: 1131-1132, 1995 に記載の縮重プライマーを使
用したＰＣＲにより、ｃＤＮＡを増幅した。このプライ
マーは、Simons等により報告されたＧＢＶ−Ｃのヘリカ
ーゼ領域に由来する塩基配列を有する。増幅したｃＤＮ
Ａ断片の検出は、アガロース電気泳動後、臭化エチジウ
ムを用いた染色により行った。期待された大きさ (expe
cted size)を有し、陽性と考えられたＤＮＡ断片をアガ
ロースゲルから回収し、プラスミドベクターpBluescrip
t でクローニングし、ジデオキシ法で塩基配列を決定し
た。クローニングは、後出の実施例に詳細に記載したよ
うに、増幅したｃＤＮＡ断片を適宜制限酵素で消化して
プラスミドに導入した後、大腸菌に組み込み、得られた
組み換え体を培養してｃＤＮＡ含有プラスミドを単離す
ることにより、Ｇ型肝炎ウイルスｃＤＮＡをクローニン
グした。

【００２２】上記のようにしてｃＤＮＡについて塩基配
列を決定した結果を、配列表の配列番号２として示す。
この配列番号２の塩基配列から、Ｇ型肝炎ウイルスゲノ
ムＲＮＡの配列を導き、配列番号１として示す。配列番
号３はＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに相同的なＤＮＡ
の塩基配列を示す。

【００２３】これらは、ＧＢＶ−Ｃのヘリカーゼ領域に
相当する塩基配列である。配列番号３の相同的ＤＮＡを
Simons等の報告によるアメリカ型のプロトタイプと比較
すると、ＧＢＶ−Ｃと77％の相同性を有している。

【００２４】さらに、配列番号２より導いた、Ｇ型肝炎
ウイルス蛋白質をコードする推定アミノ酸配列を配列番
号４に示す。アミノ酸配列の比較で97％の相同性を示
す。

【００２５】Ｇ型肝炎ウイルスゲノムのヘリカーゼ領域
以外の部分の塩基配列決定は、ＧＢ肝炎ウイルスゲノム
の一部に相同的あるいは相補的と考えられるプライマー
を用いてＰＣＲにより遺伝子ｃＤＮＡを増幅し、ヘリカ
ーゼ領域で行ったのと同様にクローニングすることによ
り行った。このようにして下記の部分の塩基配列を決定
した。カッコ内の％は、上記と同様にアメリカ型プロト
タイプのＧＢＶ−Ｃと比較した時の相同性である。

【００２６】コア〜エンベロープ領域 配列番号５：ＲＮＡ 配列番号６：ｃＤＮＡ 配列番号７：相同的ＤＮＡ（87％) 配列番号８：アミノ酸 (93％)ポリメラーゼ領域の一部 配列番号９：ＲＮＡ 配列番号10：ｃＤＮＡ 配列番号11：相同的ＤＮＡ（88％) 配列番号12：アミノ酸 (100 ％)ポリメラーゼ領域の一部 配列番号13：ＲＮＡ 配列番号14：ｃＤＮＡ 配列番号15：相同的ＤＮＡ（86％) 配列番号16：アミノ酸 (93％)5'末端非翻訳領域 配列番号17：ＲＮＡ 配列番号18：ｃＤＮＡ 配列番号19：相同的ＤＮＡ（89％) 配列番号17で示される5'末端非翻訳領域は、変異が少な
く、高度に保存された領域であるため、この配列に基づ
いて設定したプライマーを用いれば、Ｇ型肝炎ウイルス
の検出が有利に行える。

【００２７】被検サンプルからのＧ型肝炎ウイルスの検
出 上記のようにして、本発明者らにより明らかにされたＧ
型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの塩基配列を利用すれば、
被検サンプルからＧ型肝炎ウイルスの検出を容易に行う
ことができる。

【００２８】ウイルス検出のための、患者血清からのｃ
ＤＮＡサンプルは次のようにして調製する。即ち、少量
の血清に対し、約５倍量のグアニジン溶液を加え、混和
した後、フェノール抽出を行い、抽出されたＲＮＡをエ
タノールにより沈澱させる。このようにして得られたウ
イルスゲノムＲＮＡを鋳型として、例えば、逆転写酵素
及びランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。
逆転写酵素としては、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転
写酵素、ＴthＤＮＡポリメラーゼ等が使用できる。

【００２９】上記で得られたｃＤＮＡについて、本発明
のＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの塩基配列に基づいた
プライマーを用いて、ＰＣＲにより特定の領域を増幅す
る。具体的には、配列番号２、６、10、14または18に示
されるＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに相補的なＤＮＡ
の配列、あるいは配列番号３、７、11、15または19に示
されるＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡに相同的なＤＮＡ
の配列に基づいて設定されたプライマーにより、Ｇ型肝
炎ウイルスゲノムＲＮＡに特異的な一定部分を増幅させ
ることにより、あるいはさらに必要により適宜制限酵素
処理することにより、Ｇ型肝炎ウイルスの検出を行うこ
とができる。

【００３０】プライマーの設定に仕方により、ｃＤＮＡ
の一定部分の増幅が可能かどうかをみることにより、ウ
イルス検出或いは変異を調べることができる。また、適
宜プライマーでの増幅後、特異的制限酵素での切断のパ
ターンを調べることによりウイルスの検出、あるいは変
異の有無をみることができる。

【００３１】プライマーとしては、適宜長さ、例えば17
〜35塩基の長さの合成ＤＮＡで、Ｇ型肝炎ウイルスゲノ
ムＲＮＡに相同な配列のものと、相補的な配列のものと
の組合わせであればよい。例えば、配列番号20〜29で示
される塩基配列を有するＤＮＡからなるプライマー等が
例示できる。実施例４で使用した配列番号20〜23のもの
が特に好ましい。これらのプライマーは、例えばアプラ
イドバイオシステムズ(ＡＢＩ) 社製ＤＮＡ自動合成機
等を用いて合成すればよい。

【００３２】ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は常法に従い、
ＤＮＡを熱変性し、これにプライマーをアニールさせ、
次いで耐熱性ポリメラーゼ、dNTP (dATP、 dGTP 、dCT
P、dTTP) を添加し、ＤＮＡ鎖を伸長させる。この熱変
性、プライマーのアニーリング、ＤＮＡ鎖の伸長の工程
を繰り返すことにより目的の領域を増幅できる。

【００３３】増幅したｃＤＮＡ、あるいは増幅し、適宜
制限酵素で処理したｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル電
気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動等の電気泳動後、
臭化エチジウム染色等の手段で分別、検出できる。使用
するプライマーの種類により、現われるバンドの位置が
異なる。

【００３４】別の方法として、ウイルスＲＮＡに相補的
なＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドなどを
プローブとして用い、これをマイクロタイタープレート
に固相化してウイルスＲＮＡを捕捉することができる。
即ち、上記のプレートに、デタージェント、プロテアー
ゼなどで処理してウイルスＲＮＡを露出させた被検血清
を反応させ、緩衝液で洗浄し、ウイルスＲＮＡと相補的
な別のＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズさせ、例えば分岐鎖ＤＮＡによるシグナ
ル増幅のような手段を用いて検出することができる。

【００３５】また、これらのウイルスと相補的なＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドは、血液、
肝臓から抽出したウイルスＲＮＡやそのｃＤＮＡを用い
たＰＣＲによる増幅産物をドットブロット、サザンブロ
ット、ノーザンブロット、その他のメンブレンなどに結
合させた核酸を検出するためのプローブとして使用する
ことができる。

【００３６】上記のような操作で得られるＧ型肝炎ウイ
ルスＲＮＡのｃＤＮＡについて、さらにクローニングし
て塩基配列を決定する場合には、前に記載した塩基配列
の決定方法を用いればよい。即ち、ＰＣＲ増幅し、分別
したＤＮＡを適当な制限酵素(例えば、ＥcoＲＩ、Ｂam
ＨＩ、ＨindIII等) によって切り出すか、或いは平滑末
端化し、次いで同一の制限酵素で切断した、或いは平滑
末端化したクローニングベクターに挿入し、これを形質
転換可能な宿主に導入することにより形質転換させ、テ
トラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性によって目的
とする組換え体ＤＮＡをクローニングすることができ
る。

【００３７】ベクターＤＮＡとしては、Ｍ13ファージベ
クター等のファージベクター、ｐＵＣ18、ｐＵＣ19等プ
ラスミドベクター等を、宿主としては大腸菌、酵母等を
用いることができる。

【００３８】このようにしてクローニングされた組換え
体ＤＮＡから塩基配列を決定すればよい。すなわち、既
に得たテトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性のト
ランスフォーマントの中から、求めるクローンをコロニ
ーハイブリダイゼーションによって二次スクリーニング
する。このコロニーハイブリダイゼーションによって陽
性を示したクローンのヌクレオチド配列を、通常の塩基
配列決定法、例えば、サンガー法、マキサム−ギルバー
ト法等によって決定することができる。

【００３９】Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質 次に、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質の発現について説明す
る。塩基配列の決定の項で述べた方法により、得られた
クローンからＧ型肝炎ウイルス蛋白質をコードする遺伝
子の全部又は一部を切り出し、これを適当なプロモータ
ー、エンハンサー等の下流につないだ後、適当な宿主に
導入して形質転換を行う。プロモーターとしてはLacZ、
Ptac、LacI等が挙げられ、宿主としては、XLI-Blue、TB
1 、JM107等が挙げられる。

【００４０】本発明のＧ型肝炎ウイルス蛋白質を得るに
は、前記形質転換体を一般に使用されている培地で培養
し、通常行われている方法によって精製すればよい。培
地としては、例えばアンピシリンを含むＬＢ培地、ＴＢ
培地、２ＸＹＴ培地等が挙げられる。遺伝子の発現を効
率良くするためには、必要に応じて上記培地にイソプロ
ピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド (ＩＰＴＧ）、
グルコース等を添加することもできる。

【００４１】培養は、通常37℃で６〜７時間行い、必要
により通気や攪拌を行うこともできる。培養後、菌体を
集め、例えば緩衝液に懸濁させた後、凍結、融解処理、
煮沸処理等を行った後、遠心分離により上清液を得る。

【００４２】得られた上清液からのＧ型肝炎ウイルス蛋
白質の分離、精製は、通常知られている蛋白質の精製方
法に従えばよい。例えば、塩析法、遠心分離法、各種ク
ロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて精
製が行われる。

【００４３】各種クロマトグラフィーとしては、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げら
れる。また、精製品の純度及びおよその分子量の確認は
ＳＤＳ (ラウリル硫酸ナトリウム) ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット法等を用いて行わ
れる。精製された蛋白質のアミノ酸配列の解析は、気相
プロテインシークエンサーを用いた自動エドマン分析法
等によって行うこともできる。

【００４４】上記の方法によって製造された本発明のＧ
型肝炎ウイルス蛋白質は、Ｇ型肝炎の診断薬、或いはＧ
型肝炎ウイルスワクチン等として用いることができる。
本発明のＧ型肝炎ウイルス蛋白質を用いて、次に述べる
ようにしてＧ型肝炎ウイルス抗体を検出することができ
る。

【００４５】まず、マイクロタイタープレートにＧ型肝
炎ウイルス蛋白質を固相化し、これに被検血清を加えて
反応させ、緩衝液により洗浄し、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白
質に結合した抗体に、アルカリフォスファイターゼ又は
ペンオキシダーゼなどで標識した抗ヒトイムノグロブリ
ン (ＩｇＧ) 抗体を反応させ、緩衝液により洗浄後、発
色基質を加え、デンシトメーターにより吸光度の変化を
検出することにより、抗体を検出することができる。

【００４６】また、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質に対する抗
体を用いて、Ｇ型肝炎ウイルス抗原を検出するには、以
下のようにする。

【００４７】まず、上記Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質を用い
てラット等の動物を免疫することによりモノクローナル
抗体を２種類以上作製する。これらの抗体の一つをマイ
クロタイタープレートに固相化し、これに被検血清を加
えて反応させ、緩衝液で洗浄し、結合したウイルス抗原
に別のモノクローナル抗体を反応させ、再度緩衝液によ
り洗浄する。これに抗ラットマウスイムノグロブリン
(ＩｇＧ) 抗体を反応させ、緩衝液により洗浄後、発色
基質を加え、デンシトメーターにより吸光度の変化を検
出することにより、抗体を検出することができる。

【００４８】本発明のＧ型肝炎ウイルス蛋白質をＧ型肝
炎ワクチンとして投与する場合、通常は注射 (皮下又は
筋肉) によって投与される。その投与量は、動物か人間
かによって、また年齢、投与経路、投与回数により異な
り、広範囲に変えることができるが、一般には0.01〜１
μg/kg体重／日である。本発明のＧ型肝炎ワクチンは、
有効成分であるＧ型肝炎ウイルス蛋白質を適切な希釈剤
及び薬理学的に使用し得る担体との組成物として投与で
きる。投与は１日１回で１〜６カ月間に数回投与すれば
よい。

【００４９】また、本発明のＧ型肝炎ワクチンには、安
定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有し、
通常単位投与量アンプルもしくは多投与量容器又はチュ
ーブの状態で提供される。上記の組成物は使用する際に
適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解
させる粉体であってもよい。

【００５０】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。

【００５１】

【実施例１】Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの分離 非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝硬変合併肝細胞癌の患者の血清10
0 μL に対し、4.2Mチオシアン酸グアニジン、0.1M Tri
s-HCl(pH7.5)、0.5 ％Ｎ−ラウリルサルコシル溶液を42
5 μL 、２−メルカプトエタノールを４μL 添加後、30
分間転倒混和した。

【００５２】その後、４：１に混和したフェノール−ク
ロロホルム液で３回、クロロホルムで１回抽出し、除蛋
白を行った後、エタノール沈殿を行った。該沈殿を70
％、100 ％のエタノールでそれぞれ洗い、得られたペレ
ットを精製済みのＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡとして
用いた。

【００５３】

【実施例２】Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子のクローニングおよび塩基配列
の決定 (1) Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子のクローニング 実施例１で得られたゲノムＲＮＡに、50mM Tris-HCl(pH
8.3)、75mM KCl、10mMDTT、３mM MgCl₂、１mM dNTPsミ
ックス (dATP, dCTP, dGTP, dTTPからなる４種デオキシ
ヌクレオシド三リン酸; TOYOBO社製) 、60μg/mlランダ
ムプライマー (TAKARA社製) 、10U/ml M-MLV逆転写酵素
(GIBCO BRL 社製) の各溶液を加えて総量20μL にし
た。次いで、得られた溶液について42℃で30分間逆転写
反応を行い、ｃＤＮＡを得た。

【００５４】次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、Yoshiba
等、Lancet 346: 1131-1132, 1995に記載の、Ｇ型肝炎
ウイルスゲノムのヘリカーゼ領域に特異的なプライマー
(配列番号30、31) を用いてＰＣＲ反応による増幅を行
った。反応は、上記ｃＤＮＡ溶液１〜５μL に対して10
mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、1.5 mM MgCl₂、0.1%Tr
iton X-100 、0.2 mM dNTP 、センス側およびアンチセ
ンス側プライマーを各４μg/ml、並びに、30U/ml Taq D
NAポリメラーゼ (パーキンエルマーシータス社製) を加
え、総量25μL で行った。このサンプルを、94℃で４分
を１サイクル、94℃で30秒、53℃で１分及び72℃で１分
を１サイクルとしてこれを40サイクル、72℃で７分を１
サイクル行った。

【００５５】ＰＣＲ産物を１〜３％アガロースゲルにて
泳動し、エチジウムブロマイド染色により紫外線下に可
視化したバンドを切り出し、QIAEX,ゲル抽出キット(QIA
GEN)を用いて期待された泳動度のＤＮＡ断片を回収し
た。

【００５６】次に、ＤＮＡの末端をそろえ (制限酵素Ec
oRI 及びBamHI で処理) または平滑化したＭ13ファージ
ベクターに挿入し、組換え体プラスミドを得た。この組
換え体を用いて大腸菌JM109 を形質転換させ、12〜16時
間培養してプラークを形成させることによりＧ型肝炎ウ
イルスｃＤＮＡ断片を組み込んだファージを得た。

【００５７】(2) 塩基配列の決定 上記の方法で得たファージを大腸菌JM105 に感染させ、
十分に増殖させた後、菌体を分離し、ポリエチレングリ
コールを用いてファージを回収した。その後、フェノー
ルとクロロホルムとを４：１に混合した溶液で２回、ク
ロロホルムで１回抽出することでファージの１本鎖ＤＮ
Ａを回収した。これを用いて、Sangarらのジデオキシ法
によりＤＮＡの塩基配列を決定した。

【００５８】その結果を配列番号２に示す。配列番号２
の配列より、本発明のＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡヘ
リカーゼ領域の配列を決定することができ、その結果を
配列番号１に示す。また、配列番号１より、Ｇ型肝炎ウ
イルスゲノムＲＮＡに相同的なＤＮＡの塩基配列を決定
することができ、その結果を配列番号３に示す。更に、
配列番号２より、Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質をコードする
推定アミノ酸配列を決定することができる。この場合、
Ｇ型肝炎ウイルス蛋白質をコードしていると考えられる
部分は、配列番号２の塩基配列のうち、２〜100 番目の
99個の塩基配列であると考えられ、該塩基配列から推定
されるアミノ酸配列を、配列番号４に示す。

【００５９】さらに、ｃＤＮＡを増幅させるためのプラ
イマーを下記のプライマーに変えて上記と同じ操作を行
い、Ｇ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの他の領域について
も塩基配列を決定した。

【００６０】配列番号32、33に示す塩基配列を有するプ
ライマーを用い、配列番号６に示すｃＤＮＡ配列を決定
した。これより配列番号５のＲＮＡ配列および配列番号
７の相同的なＤＮＡ配列が決定された。推定アミノ酸配
列は配列番号８に示す通りである。この配列はコア〜エ
ンベロープ領域と考えられる。

【００６１】配列番号34、35に示す塩基配列を有するプ
ライマーを用い、配列番号10に示すｃＤＮＡ配列を決定
した。これより配列番号９のＲＮＡ配列および配列番号
11の相同的なＤＮＡ配列が決定された。推定アミノ酸配
列は配列番号12に示す通りである。この配列はポリメラ
ーゼ領域の一部と考えられる。

【００６２】配列番号36、37に示す塩基配列を有するプ
ライマーを用い、配列番号14に示すｃＤＮＡ配列を決定
した。これより配列番号13のＲＮＡ配列および配列番号
15の相同的なＤＮＡ配列が決定された。推定アミノ酸配
列は配列番号16に示す通りである。この配列もポリメラ
ーゼ領域の一部と考えられる。

【００６３】配列番号38、39に示す塩基配列を有するプ
ライマーを用い、配列番号18に示すｃＤＮＡ配列を決定
した。これより配列番号17のＲＮＡ配列および配列番号
19の相同的なＤＮＡ配列が決定された。この配列は5'末
端非翻訳領域と考えられる。

【００６４】

【実施例３】蛋白質の発現の確認 (1) 蛋白質の発現および精製 上記の塩基配列の決定に用いた方法と同様にして、Ｇ型
肝炎遺伝子断片を宿主菌XL1-Blue中のpMAL-C2 にクロー
ニングした。ＩＰＴＧを用いて、宿主菌XL1-Blue中のpM
AL-C2 にクローニングされたＧ型肝炎ウイルスヘリカー
ゼ遺伝子断片の発現を誘導し、37℃にて３〜４時間培養
した後、遠心チューブに移し、12000rpm、30秒間 (４
℃) 遠心することにより大腸菌の培養液から集菌し、50
mM Tris-HCl(pH7.4)を用いて洗浄後、１×Column buffe
r (10 mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、１mM
アジ化ナトリウム、10mMβ−メルカプトエタノール及び
１mMEGTA を含む) に溶解し、凍結 (−20℃) 、融解を
２回繰り返した後、100 ℃で５分間加熱し、発現蛋白質
を得た。

【００６５】2.5 ×10cmのカラムにアミロース樹脂をつ
め、８倍量の１×Column buffer にて洗浄したものに、
１ml／分の速度で発現タンパク質の粗抽出物を注入す
る。さらに８倍量の１×Column buffer で洗浄した後、
Column buffer に10mMマルトースを加えた溶液を流し、
タンパクを抽出した。

【００６６】(2) 蛋白質の発現の確認 次に、(1) で得られた蛋白についてＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、分子量の大きさによって
分けた後、ウエスタンブロットによりナイロン膜に蛋白
を転写した。同じ患者の抗血清を１次抗体、アルアカリ
ホスファターゼをラベルした抗ヒト１gG抗体を２次抗体
として、発現した蛋白の検出を行った。ヘリカーゼ蛋白
とマルトース結合蛋白との融合蛋白と考えられる46.5キ
ロダルトンのバンドが検出された。

【００６７】

【実施例４】患者血清100 μL から得られたｃＤＮＡ20
μL のうち５μL を用いて以下のＰＣＲ反応を行った。
プライマーとして、配列番号20〜23に示す塩基配列を有
するＤＮＡを合成して使用した。

【００６８】反応はnestedＰＣＲ法にて行った。１stＰ
ＣＲ反応液は、滅菌蒸留水15μL に10×ＰＣＲバッファ
ー [500mM KCl,100mM Tris-HCl(pH8.8), 15mM MgCl₂、1
% Triton X-100] 2.5μL 、10mM dNTP[N=A,C,T,G] 0.5
μL 、Taq ＤＮＡpolymerase [5000 units/ml;和光社
製] 0.15μL 、およびプライマーとして配列番号20およ
び22 [各0.1 μg/μL]を各1.0 μL 加えたものとした。

【００６９】反応チューブ(0.5μL)に、上記反応液とｃ
ＤＮＡとを入れ、流動パラフィン２滴を加え、94℃に加
温したサーマルサイクラーにセットした。１stＰＣＲ反
応のサイクルは、94℃４分間の後、94℃１分間、53℃２
分間、７２℃ １．５分間を30サイクル行い、最後に72
℃で７分間インキュベートし、４℃にて保存した。

【００７０】２ndＰＣＲ反応液は、滅菌蒸留水を18μL
に、プライマーを配列番号21および23に変更したものを
使用した。反応チューブに２nd反応液と１stＰＣＲ産物
２μL とを入れ、１stＰＣＲと同様に流動パラフィンを
滴下した。２ndＰＣＲ反応のサイクルは、１stＰＣＲの
30サイクルを35サイクルに変更して実施した。

【００７１】Ｇ型肝炎ウイルスは、２ndＰＣＲ産物５μ
L を３％アガロースゲルにより電気泳動後、エチジウム
ブロマイド染色を行ったときの121 bpバンドの有無によ
り、その存否を判定することができる。

【００７２】非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎患者血清、非Ａ非Ｂ非
Ｃ型肝硬変患者血清、および健常人血清を用いて上記試
験を行った結果を図１に示す。

【００７３】

【発明の効果】本発明により、Ｇ型肝炎ウイルスゲノム
ＲＮＡの5'末端非翻訳領域、ヘリカーゼ領域、コア〜エ
ンベロープ領域、およびポリメラーゼ領域の塩基配列が
解明され、特に、変異の少ない5'末端非翻訳領域につい
ても塩基配列が決定されたので、この塩基配列を利用し
てＧ型肝炎ウイルスの検出が容易に行える。Ｇ型肝炎ウ
イルスは非Ａ、非Ｂ、非Ｃ型肝癌の原因ウイルスとし
て、重要視されており、本発明によりＧ型肝炎ウイルス
の検出が容易に行えることは非常に有用である。また、
本発明のＧ型肝炎ウイルス蛋白質は、Ｇ型肝炎の診断
剤、Ｇ型肝炎ワクチン等として有用である。

【００７４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列 G GAG CGG AUG CGG ACC GGU AGG CAC CUC GUG UUU UGU CAC UCA AAG GCG 49 Glu Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Val Phe Cys His Ser Lys Ala 5 10 15 GAG UGC GAG CGC CUG GCC GGU CAG UUU UCC UCU AGG GGG GUG AAC GCC 97 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gln Phe Ser Ser Arg Gly Val Asn Ala 20 25 30 AUU 100 Ile 33 配列番号：２ 配列の長さ：１００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 AATGGCGTTC ACCCCCCTAG AGGAAAACTG ACCGGCCAGG CGCTCGCACT CCGCCTTTGA 60 GTGACAAAAC ACGAGGTGCC TACCGGTCCG CATCCGCTCC 100 配列番号：３ 配列の長さ：１００ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (Genomic RNA と相同な ＤＮ
Ａ） 配列 ＧＧＡＧＣＧＧＡＴＧ ＣＧＧＡＣＣＧＧＴＡ ＧＧＣＡＣＣＴＣＧＴ ＧＴＴ
ＴＴＧＴＣＡＣ ＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧ ＡＧＴＧＣＧＡＧＣＧ ６０ ＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴ ＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴ ＣＴＡＧＧＧＧＧＧＴ ＧＡＡ
ＣＧＣＣＡＴＴ １００ 配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Glu Arg Met Arg Thr Gly Arg His Leu Val Phe Cys His Ser Lys Ala 5 10 15 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Gln Phe Ser Ser Arg Gly Val Asn Ala 20 25 30 Ile 33 配列番号：５ 配列の長さ：４１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： Genomic RNA 配列 A AGC CUU CGG GUG AGG GCG GGU GGC AUA UUC UUU UCC UUA CCG AUC AUG 49 Ser Leu Arg Val Arg Ala Gly Gly Ile Phe Phe Ser Leu Pro Ile Met 5 10 15 GCA GUC CUU CUG CUU CUC UUC GUU GUG CAG GCC GGG GCC AUU CUG GCC 97 Ala Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Val Gln Ala Gly Ala Ile Leu Ala 20 25 30 CCG GCC ACA CAU GCU UGU GGA GCG AAU GGG CAA UAU UUC CUC ACG AAU 145 Pro Ala Thr His Ala Cys Gly Ala Asn Gly Gln Tyr Phe Leu Thr Asn 35 40 45 UGC UGU GCC UUA GAG GAC AUA GGG UUC UGC CUG GAG GGU GGA UGC CUU 193 Cys Cys Ala Leu Glu Asp Ile Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu 50 55 60 GUG GCC UUG GGC UGC ACA AUU UGU ACU GAC CGU UGC UGG CCA CUG UAU 241 Val Ala Leu Gly Cys Thr Ile Cys Thr Asp Arg Cys Trp Pro Leu Tyr 65 70 75 80 CAG GCG GGU UUG GCC GUG CGG CCU GGC AAG UCC GCC GCC CAG UUG GUC 289 Gln Ala Gly Leu Ala Val Arg Pro Gly Lys Ser Ala Ala Gln Leu Val 85 90 95 GGG GAA CUC GGA AGC CUU UAC GGG CCC UUA UCG GUG UCC GCC UAC GUG 337 Gly Glu Leu Gly Ser Leu Tyr Gly Pro Leu Ser Val Ser Ala Tyr Val 100 105 110 GCG GGC AUC UUA GGG CUU GGG GAG GUC UAU UCG GGG GUC CUU ACC AUC 385 Ala Gly Ile Leu Gly Leu Gly Glu Val Tyr Ser Gly Val Leu Thr Ile 115 120 125 GGG GUG GCG UUG ACG CGC CGG GUC UAC 412 Gly Val Ala Leu Thr Arg Arg Val Tyr 130 135 配列番号：６ 配列の長さ：４１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 GTAGACCCGG CGCGTCAACG CCACCCCGAT GGTAAGGACC CCCGAATAGA CCTCCCCAAG 60 CCCTAAGATG CCCGCCACGT AGGCGGACAC CGATAAGGGC CCGTAAAGGC TTCCGAGTTC 120 CCCGACCAAC TGGGCGGCGG ACTTGCCAGG CCGCACGGCC AAACCCGCCT GATACAGTGG 180 CCAGCAACGG TCAGTACAAA TTGTGCAGCC CAAGGCCACA AGGCATCCAC CCTCCAGGCA 240 GAACCCTATG TCCTCTAAGG CACAGCAATT CGTGAGGAAA TATTGCCCAT TCGCTCCACA 300 AGCATGTGTG GCCGGGGCCA GAATGGCCCC GGCCTGCACA ACGAAGAGAA GCAGAAGGAC 360 TGCCATGATC GGTAAGGAAA AGAATATGCC ACCCGCCCTC ACCCGAAGGC TT 412 配列番号：７ 配列の長さ：４１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (Genomic RNA と相同な DNA) 配列 AAGCCTTCGG GTGAGGGCGG GTGGCATATT CTTTTCCTTA CCGATCATGG CAGTCCTTCT 60 GCTTCTCTTC GTTGTGCAGG CCGGGGCCAT TCTGGCCCCG GCCACACATG CTTGTGGAGC 120 GAATGGGCAA TATTTCCTCA CGAATTGCTG TGCCTTAGAG GACATAGGGT TCTGCCTGGA 180 GGGTGGATGC CTTGTGGCCT TGGGCTGCAC AATTTGTACT GACCGTTGCT GGCCACTGTA 240 TCAGGCGGGT TTGGCCGTGC GGCCTGGCAA GTCCGCCGCC CAGTTGGTCG GGGAACTCGG 300 AAGCCTTTAC GGGCCCTTAT CGGTGTCCGC CTACGTGGCG GGCATCTTAG GGCTTGGGGA 360 GGTCTATTCG GGGGTCCTTA CCATCGGGGT GGCGTTGACG CGCCGGGTCT AC 412 配列番号：８ 配列の長さ：１３７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ser Leu Arg Val Arg Ala Gly Gly Ile Phe Phe Ser Leu Pro Ile Met 5 10 15 Ala Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Val Gln Ala Gly Ala Ile Leu Ala 20 25 30 Pro Ala Thr His Ala Cys Gly Ala Asn Gly Gln Tyr Phe Leu Thr Asn 35 40 45 Cys Cys Ala Leu Glu Asp Ile Gly Phe Cys Leu Glu Gly Gly Cys Leu 50 55 60 Val Ala Leu Gly Cys Thr Ile Cys Thr Asp Arg Cys Trp Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Gln Ala Gly Leu Ala Val Arg Pro Gly Lys Ser Ala Ala Gln Leu Val 85 90 95 Gly Glu Leu Gly Ser Leu Tyr Gly Pro Leu Ser Val Ser Ala Tyr Val 100 105 110 Ala Gly Ile Leu Gly Leu Gly Glu Val Tyr Ser Gly Val Leu Thr Ile 115 120 125 Gly Val Ala Leu Thr Arg Arg Val Tyr 130 135 137 配列番号：９ 配列の長さ：２４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： Genomic RNA 配列 G AUU CGA CGG ACC UCA UGC UAC AAG UUG CUA CGC CAG CAA AUA CUC UCU 49 Ile Arg Arg Thr Ser Cys Tyr Lys Leu Leu Arg Gln Gln Ile Leu Ser 5 10 15 GCA GCU GUA GCU GAG CCC UAC UAC GUG GAU GGC AUA CCC GUC UCA UGG 97 Ala Ala Val Ala Glu Pro Tyr Tyr Val Asp Gly Ile Pro Val Ser Trp 20 25 30 GAA GCU GAC GCG CGA GCG CCG GCG AUG GUC UAC GGU CCU GGC CAA AGU 145 Glu Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Val Tyr Gly Pro Gly Gln Ser 35 40 45 GUC ACC AUU GAC GGA GAG CGC UAC ACC CUU CCG CAC CAG CUG CGG AUG 193 Val Thr Ile Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gln Leu Arg Met 50 55 60 CGG AAU GUG GCC CCU UCU GAG GUU UCA UCC GAG GUC AGC AUC GAG AUU 241 Arg Asn Val Ala Pro Ser Glu Val Ser Ser Glu Val Ser Ile Glu Ile 65 70 75 80 GGG 244 Gly 81 配列番号：１０ 配列の長さ：２４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 CCCAATCTCG ATGCTGACCT CGGATGAAAC CTCAGAAGGG GCCACATTCC GCATCCGCAG 60 CTGGTGCGGA AGGGTGTAGC GCTCTCCGTC AATGGTGACA CTTTGGCCAG GACCGTAGAC 120 CATCGCCGGC GCTCGCGCGT CAGCTTCCCA TGAGACGGGT ATGCCATCCA CGTAGTAGGG 180 CTCAGCTACA GCTGCAGAGA GTATTTGCTG GCGTAGCAAC TTGTAGCATG AGGTCCGTCG 240 AATC 244 配列番号：１１ 配列の長さ：２４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (Genomic RNA と相同な DNA) 配列 GATTCGACGG ACCTCATGCT ACAAGTTGCT ACGCCAGCAA ATACTCTCTG CAGCTGTAGC 60 TGAGCCCTAC TACGTGGATG GCATACCCGT CTCATGGGAA GCTGACGCGC GAGCGCCGGC 120 GATGGTCTAC GGTCCTGGCC AAAGTGTCAC CATTGACGGA GAGCGCTACA CCCTTCCGCA 180 CCAGCTGCGG ATGCGGAATG TGGCCCCTTC TGAGGTTTCA TCCGAGGTCA GCATCGAGAT 240 TGGG 244 配列番号：１２ 配列の長さ：８１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ile Arg Arg Thr Ser Cys Tyr Lys Leu Leu Arg Gln Gln Ile Leu Ser 5 10 15 Ala Ala Val Ala Glu Pro Tyr Tyr Val Asp Gly Ile Pro Val Ser Trp 20 25 30 Glu Ala Asp Ala Arg Ala Pro Ala Met Val Tyr Gly Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Val Thr Ile Asp Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Pro His Gln Leu Arg Met 50 55 60 Arg Asn Val Ala Pro Ser Glu Val Ser Ser Glu Val Ser Ile Glu Ile 65 70 75 80 Gly 81 配列番号：１３ 配列の長さ：１２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列 C AUC UUG GGC GAU CCG GGG CGG GUU GCC AAG GCG GUG CUG GGG GGG GCU 49 Ile Leu Gly Asp Pro Gly Arg Val Ala Lys Ala Val Leu Gly Gly Ala 5 10 15 UAC GCC UUC CAG UAC ACC CCA AAC CAG CGG GUU AGG GAG AUG CUG AAA 97 Tyr Ala Phe Gln Tyr Thr Pro Asn Gln Arg Val Arg Glu Met Leu Lys 20 25 30 CUG UGG GAG UCA AAG AAA ACU CCG 121 Leu Trp Glu Ser Lys Lys Thr Pro 35 40 配列番号：１４ 配列の長さ：１２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 CGGAGTTTTC TTTGACTCCC ACAGTTTCAG CATCTCCCTA ACCCGCTGGT TTGGGGTGTA 60 CTGGAAGGCG TAAGCCCCCC CCAGCACCGC CTTGGCAACC CGCCCCGGAT CGCCCAAGAT 120 G 121 配列番号：１５ 配列の長さ：１２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (Genomic RNA と相同な ＤＮ
Ａ） 配列 ＣＡＴＣＴＴＧＧＧＣ ＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣ ＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡ ＧＧＣ
ＧＧＴＧＣＴＧ ＧＧＧＧＧＧＧＣＴＴ ＡＣＧＣＣＴＴＣＣＡ ６０ ＧＴＡＣＡＣＣＣＣＡ ＡＡＣＣＡＧＣＧＧＧ ＴＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＧＣＴ
ＧＡＡＡＣＴＧ ＴＧＧＧＡＧＴＣＡＡ ＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣ １２０ Ｇ
１２１ 配列番号：１６ 配列の長さ：４０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ile Leu Gly Asp Pro Gly Arg Val Ala Lys Ala Val Leu Gly Gly Ala 5 10 15 Tyr Ala Phe Gln Tyr Thr Pro Asn Gln Arg Val Arg Glu Met Leu Lys 20 25 30 Leu Trp Glu Ser Lys Lys Thr Pro 35 40 配列番号：１７ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic RNA 配列 AUAGGUGGGU CUUAAGGGUU GGUUAAGGUC CCUCUGGCGC UUGUGGCGAG AAAGCGCACG 60 GUCCACAGGU GUUGGUCCUA CCGGUGUAAU AAGGACCCGA CGUCAGGCUC GUCGUUAAAC 120 CGAGCCCGUU ACCCACCUGG GCAAACAACG CCCACGUACG GCCCACGUCG CCCUUCAAUG 180 UCUCUCUUGA CCAAUAGGCU UAGC 204 配列番号：１８ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to Genomic RNA 配列 GCTAAGCCTA TTGGTCAAGA GAGACATTGA AGGGCGACGT GGGCCGTACG TGGGCGTTGT 60 TTGCCCAGGT GGGTAACGGG CTCGGTTTAA CGACGAGCCT GACGTCGGGT CCTTATTACA 120 CCGGTAGGAC CAACACCTGT GGACCGTGCG CTTTCTCGCC ACAAGCGCCA GAGGGACCTT 180 AACCAACCCT TAAGACCCAC CTAT 204 配列番号：１９ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (Genomic RNA と相同な DNA) 配列 ATAGGTGGGT CTTAAGGGTT GGTTAAGGTC CCTCTGGCGC TTGTGGCGAG AAAGCGCACG 60 GTCCACAGGT GTTGGTCCTA CCGGTGTAAT AAGGACCCGA CGTCAGGCTC GTCGTTAAAC 120 CGAGCCCGTT ACCCACCTGG GCAAACAACG CCCACGTACG GCCCACGTCG CCCTTCAATG 180 TCTCTCTTGA CCAATAGGCT TAGC 204 配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 CACTATAGGT GGGTCTTAAG ２０ 配列番号：２１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 （合成ＤＮＡ） 配列 GCGCACGGTC CACAGGTGTT 20 配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GCCTATTGGT CAAGAGAGAC 20 配列番号：２３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GGGCGACGTG GACCGTACGT 20 配列番号：２４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 TCGGGTGAGG GCGGGTGGCA 20 配列番号：２５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 ACCGATCATG GCAGTCCTTC 20 配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GTACGTGGGC GTTGTTTGCC 20 配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 CCCGCCTGAT ACAGTGGCCA 20 配列番号：２８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 ACCCGGCGCG TCAACGCCAC 20 配列番号：２９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GCTTGTGGAG CGAATGGGCA 20 配列番号：３０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 TCYTTGATGA TDGAACTGTC 20 (Y=T or C, D=A, G, or T) 配列番号：３１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 TATGGGCATG GHATHCCYCT 20 (H=A, C, or T, Y=C or T) 配列番号：３２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 TACAGCCGGG GTAGCCCAAG 20 配列番号：３３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 CACGTCAGGT TCGGGACCGG 20 配列番号：３４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GTGACCCCTA CCCACGTGGT 20 配列番号：３５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 AGTTCTGAGT CTTCAGTCTC CGT 23 配列番号：３６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GGACTTCCGG ATAGCTGAGA AGCT 24 配列番号：３７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 GCGTCCACAC AGATGGCGCA 20 配列番号：３８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 CGGTCATCCT GGTAGCCACT 20 配列番号：３９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成ＤＮＡ） 配列 TGGTCCTTGT CAACTCGCCG 20

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号20、22および21、23を用いてnestedＰ
ＣＲによりＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡの検出を行っ
た結果を示すアガロールゲル電気泳動図である。

【符号の説明】

１：サイズマーカー (φ×174 DNA/Hae III) ２：陽性者血清 ３：陰性者血清 ４：陰性者血清 ５：陰性コントロール（蒸留水） ６：陽性者血清 ７：陰性者血清 ８：陽性者血清 ９：陽性者血清 10：陽性者血清

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年６月３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/70 7823−4Ｂ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｌ 33/576 33/576 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１、５、９、13または17で表さ
   れる塩基配列を有するＧ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号２、６、10、14または18で表さ
   れる塩基配列を有する、請求項１記載のＧ型肝炎ウイル
   スゲノムＲＮＡに相補的なＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号３、７、11、15または19で表さ
   れる塩基配列を有する、請求項１記載のＧ型肝炎ウイル
   スゲノムＲＮＡに相同的なＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号４、８、12または16で表される
   アミノ酸配列を含むポリペプチドからなるＧ型肝炎ウイ
   ルス蛋白質。
5. 【請求項５】 配列番号４、８、12または16で表される
   アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項２または５記載のＤＮＡを組み込
   んだ組換え体ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換え体ＤＮＡにより形
   質転換された形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培養し、得
   られる培養物から請求項４記載の蛋白質を分離すること
   を特徴とする請求項４記載の蛋白質の生産方法。
9. 【請求項９】 請求項２または３記載のＤＮＡの塩基配
   列に基づいて設定されたプライマーを用いて、Ｇ型肝炎
   ウイルスを検出する方法。
10. 【請求項１０】 請求項４記載の蛋白質の少なくとも一
    部を抗原として用いる抗原抗体反応によりＧ型肝炎ウイ
    ルスを検出することを特徴とする、Ｇ型肝炎ウイルスの
    検出方法。
11. 【請求項１１】 請求項４記載の蛋白質に対する抗体を
    用いる抗原抗体反応によりＧ型肝炎ウイルスを検出する
    ことを特徴とする、Ｇ型肝炎ウイルスの検出方法。
12. 【請求項１２】 請求項４記載の蛋白質の少なくとも一
    部を有効成分として含むＧ型肝炎診断剤。
13. 【請求項１３】 請求項４記載の蛋白質に対する抗体を
    有効成分として含むＧ型肝炎診断剤。
14. 【請求項１４】 請求項４記載の蛋白質の少なくとも一
    部を有効成分として含むＧ型肝炎ワクチン。