JPH09322780A - 脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするｄｎａフラグメント、前記フラグメントを含んで成る組換分子、並びに形質転換細胞及び植物を獲得するための方法 - Google Patents
脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするｄｎａフラグメント、前記フラグメントを含んで成る組換分子、並びに形質転換細胞及び植物を獲得するための方法Info
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- JPH09322780A JPH09322780A JP8342685A JP34268596A JPH09322780A JP H09322780 A JPH09322780 A JP H09322780A JP 8342685 A JP8342685 A JP 8342685A JP 34268596 A JP34268596 A JP 34268596A JP H09322780 A JPH09322780 A JP H09322780A
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- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】形質転換細胞を利用した脂肪アルデヒドデカル
ボニラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、及び改
変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物を獲得する方
法の提供。 【解決手段】アラビドプシス・サリアナ由来の脂肪アル
デヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコ
ードするＤＮＡフラグメントを得て、そのフラグメント
を含む組換ＤＮＡを得て、その組換ＤＮＡを利用して形
質転換細胞を獲得し、その形質転換細胞を利用して脂肪
アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するタンパク質を
製造する。また、ＤＮＡフラグメントの過剰発現を及ぼ
す又は発現阻害遺伝子の発現を及ぼすＤＮＡと作用可能
式に連結されている組換ＤＮＡ分子を植物細胞に移入
し、改変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物を獲得
する。その植物から細胞、果実、種子又は子孫を誘導す
る。
ボニラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法、及び改
変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物を獲得する方
法の提供。 【解決手段】アラビドプシス・サリアナ由来の脂肪アル
デヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコ
ードするＤＮＡフラグメントを得て、そのフラグメント
を含む組換ＤＮＡを得て、その組換ＤＮＡを利用して形
質転換細胞を獲得し、その形質転換細胞を利用して脂肪
アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するタンパク質を
製造する。また、ＤＮＡフラグメントの過剰発現を及ぼ
す又は発現阻害遺伝子の発現を及ぼすＤＮＡと作用可能
式に連結されている組換ＤＮＡ分子を植物細胞に移入
し、改変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物を獲得
する。その植物から細胞、果実、種子又は子孫を誘導す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は脂肪アルデヒドデカ
ルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするＤ
ＮＡフラグメントに関連し、ここでこのタンパク質はア
ルカン類の生合成に関与する。本発明はまた上記のフラ
グメントを含む組換ＤＮＡ及びこの組換ＤＮＡを利用し
て形質転換宿主細胞を獲得するための方法に関する。本
発明は更に形質転換細胞及びこの形質転換細胞を利用し
て脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するタンパ
ク質を製造するための方法に関する。更に、本発明は改
変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物を獲得するた
めの方法、及びこの植物から誘導された形質転換植物、
細胞、果実、種子又は子孫に関する。
ルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするＤ
ＮＡフラグメントに関連し、ここでこのタンパク質はア
ルカン類の生合成に関与する。本発明はまた上記のフラ
グメントを含む組換ＤＮＡ及びこの組換ＤＮＡを利用し
て形質転換宿主細胞を獲得するための方法に関する。本
発明は更に形質転換細胞及びこの形質転換細胞を利用し
て脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性を有するタンパ
ク質を製造するための方法に関する。更に、本発明は改
変エピクチクラ蝋組成を示す形質転換植物を獲得するた
めの方法、及びこの植物から誘導された形質転換植物、
細胞、果実、種子又は子孫に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物は脂肪酸類、アルコール類、エステ
ル類及びアルカン類より主として成る長鎖脂質（Ｃ２０
−Ｃ４０）より成るエピクチクラ蝋（ＥＷ）層により履
われている（Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９７６）。植
物種間で劇的に相違する多種多様な特異的な蝋成分があ
り、それ故個々の植物の種の表層の一般的な特徴付けを
担っている（Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９７５）。こ
の固有のＥＷ層は各植物種とその環境との特異的な相互
作用を媒介し、そしてそれは日照り／霜、病原体及び昆
虫の如き非生物性及び生物性ストレスに対する防御の最
前線となる。
ル類及びアルカン類より主として成る長鎖脂質（Ｃ２０
−Ｃ４０）より成るエピクチクラ蝋（ＥＷ）層により履
われている（Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９７６）。植
物種間で劇的に相違する多種多様な特異的な蝋成分があ
り、それ故個々の植物の種の表層の一般的な特徴付けを
担っている（Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９７５）。こ
の固有のＥＷ層は各植物種とその環境との特異的な相互
作用を媒介し、そしてそれは日照り／霜、病原体及び昆
虫の如き非生物性及び生物性ストレスに対する防御の最
前線となる。
【０００３】ＥＷ層の主要的な機能は表皮を介する水損
失の軽減であり（Ｈａｌｌ ａｎｄＪｏｎｅｓ，１９６
１）、それは日照り寛容を担う特徴である。更に、個々
の脂質成分又はＥＷ抽出物並びに植物表層の物理構造は
昆虫の挙動に影響を及ぼすことができ、これは特定の昆
虫に対する植物の耐性をもたらしうる（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，１９６３，Ｓｔａｅｄｌｅｒ，１９８６，Ｅｉｇｅ
ｎｂｒｏｄｅ ａｎｄ Ｅｓｐｅｌｉｅ，１９９５）。
更に、ＥＷ層は植物と植物病原性菌類との相互作用にお
ける主要機能を有する（Ｐｏｄｉｌａら、１９９３）。
ＥＷはヒトによっても利用される。ろうやしは商業的目
的のために利用される蝋、例えば研磨用のカルナバ蝋を
生成し、一方似たようなタイプがその他の様々な植物種
から集められる。
失の軽減であり（Ｈａｌｌ ａｎｄＪｏｎｅｓ，１９６
１）、それは日照り寛容を担う特徴である。更に、個々
の脂質成分又はＥＷ抽出物並びに植物表層の物理構造は
昆虫の挙動に影響を及ぼすことができ、これは特定の昆
虫に対する植物の耐性をもたらしうる（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎ，１９６３，Ｓｔａｅｄｌｅｒ，１９８６，Ｅｉｇｅ
ｎｂｒｏｄｅ ａｎｄ Ｅｓｐｅｌｉｅ，１９９５）。
更に、ＥＷ層は植物と植物病原性菌類との相互作用にお
ける主要機能を有する（Ｐｏｄｉｌａら、１９９３）。
ＥＷはヒトによっても利用される。ろうやしは商業的目
的のために利用される蝋、例えば研磨用のカルナバ蝋を
生成し、一方似たようなタイプがその他の様々な植物種
から集められる。
【０００４】ＥＷ生合成経路は伸長−還元脱カルボキシ
ル化メカニズムを基礎とするものと推定され、これは長
鎖脂肪酸、アルデヒド及びアルカンを生成する（Ｂｉａ
ｎｃｈｉら、１９８５；Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９４；
ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９７
６；ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，１
９９４）。即ち、蝋合成は様々な生化学工程により決定
され、数多くの遺伝子が関与することが示唆される。こ
のことは、トウモロコシ、オオムギ、ブラッシカ（Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ）種及びアラビドプシス・サリアナ（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の如きいくつ
かの種について観察される大量の突然変異遺伝子座に対
応する（Ｂａｋｅｒ，１９７４；ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔ
ｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９７９；Ｂｉａｎｃｈｉ
ら、１９８５；Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９８０；Ｋ
ｏｏｒｎｎｅｅｆら、１９８９；ＭｃＮｅｖｉｎら、１
９９３；Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９４）。ほとんどの突
然変異体は、蝋生成の減少に基づく野生型植物の灰緑色
の外観と比べ、鮮緑色の無蝋表現型を示す。突然変異体
は、トウモロコシ及びブラッシカ種に関してはｇｌｏｓ
ｓｙ（ｇｌ）と呼ばれ、そしてオオムギ及びアラビドプ
シスに関してはｅｃｅｒｉｆｅｒｕｍ（ｃｅｒ）と呼ば
れる。目視、それ故蝋構造ベースで選別された天然ｇｌ
及びｃｅｒ突然変異体は劇的な突然変異体であり、それ
は脂質組成及び結晶構造において変化を有する。ブラッ
シカ種において、ｇｌ突然変異体は特定の昆虫に対して
耐性であることが示された（Ｓｔｏｎｅｒ，１９９
２）。
ル化メカニズムを基礎とするものと推定され、これは長
鎖脂肪酸、アルデヒド及びアルカンを生成する（Ｂｉａ
ｎｃｈｉら、１９８５；Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９４；
ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９７
６；ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，１
９９４）。即ち、蝋合成は様々な生化学工程により決定
され、数多くの遺伝子が関与することが示唆される。こ
のことは、トウモロコシ、オオムギ、ブラッシカ（Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ）種及びアラビドプシス・サリアナ（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の如きいくつ
かの種について観察される大量の突然変異遺伝子座に対
応する（Ｂａｋｅｒ，１９７４；ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔ
ｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９７９；Ｂｉａｎｃｈｉ
ら、１９８５；Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９８０；Ｋ
ｏｏｒｎｎｅｅｆら、１９８９；ＭｃＮｅｖｉｎら、１
９９３；Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９４）。ほとんどの突
然変異体は、蝋生成の減少に基づく野生型植物の灰緑色
の外観と比べ、鮮緑色の無蝋表現型を示す。突然変異体
は、トウモロコシ及びブラッシカ種に関してはｇｌｏｓ
ｓｙ（ｇｌ）と呼ばれ、そしてオオムギ及びアラビドプ
シスに関してはｅｃｅｒｉｆｅｒｕｍ（ｃｅｒ）と呼ば
れる。目視、それ故蝋構造ベースで選別された天然ｇｌ
及びｃｅｒ突然変異体は劇的な突然変異体であり、それ
は脂質組成及び結晶構造において変化を有する。ブラッ
シカ種において、ｇｌ突然変異体は特定の昆虫に対して
耐性であることが示された（Ｓｔｏｎｅｒ，１９９
２）。
【０００５】遺伝子操作手法による植物におけるＥＷの
生合成経路の改変はＥＷの改変を可能にし、その結果植
物とその環境との相互作用の改変を可能にする。従っ
て、ＥＷ成分の変化は植物を（非）生物ストレスに対し
て耐性へと操作する新規のシステムを供するであろう。
更に、生合成ルートの改変は、薬理、化粧品、洗剤、プ
ラスチック及び潤滑剤を含む工業用途を有する新規の蝋
をもつ植物又は細菌の提供の可能性を開く。
生合成経路の改変はＥＷの改変を可能にし、その結果植
物とその環境との相互作用の改変を可能にする。従っ
て、ＥＷ成分の変化は植物を（非）生物ストレスに対し
て耐性へと操作する新規のシステムを供するであろう。
更に、生合成ルートの改変は、薬理、化粧品、洗剤、プ
ラスチック及び潤滑剤を含む工業用途を有する新規の蝋
をもつ植物又は細菌の提供の可能性を開く。
【０００６】一般に、アラビドプシスにおける生化学工
程はＣ３０に至るまでの脂肪酸への一連の伸長反応より
成り、それらはアルコールへと還元されるか、又は還元
及び脱カルボニル化されてアルカンとなる。植物におけ
るＥＷの形成を司る酵素の更なる分析は、ＥＷ生合成に
関与する精製酵素の欠如によって妨げられる。従って、
ＥＷ生合成経路の更なる研究のためにこれらの酵素の同
定をできるようにする手段を企画することが所望され
る。ＣＥＲ遺伝子によってコードされるタンパク質生成
物はおそらく膜結合型であり、従って生化学的に単離す
ることが困難である。従って、かかる単離を成し遂げる
ため、そして蝋生合成ルートを改変することができるよ
うにするため、本発明の目的はＥＷ生合成に関与する酵
素をコードする遺伝子を単離することにある。
程はＣ３０に至るまでの脂肪酸への一連の伸長反応より
成り、それらはアルコールへと還元されるか、又は還元
及び脱カルボニル化されてアルカンとなる。植物におけ
るＥＷの形成を司る酵素の更なる分析は、ＥＷ生合成に
関与する精製酵素の欠如によって妨げられる。従って、
ＥＷ生合成経路の更なる研究のためにこれらの酵素の同
定をできるようにする手段を企画することが所望され
る。ＣＥＲ遺伝子によってコードされるタンパク質生成
物はおそらく膜結合型であり、従って生化学的に単離す
ることが困難である。従って、かかる単離を成し遂げる
ため、そして蝋生合成ルートを改変することができるよ
うにするため、本発明の目的はＥＷ生合成に関与する酵
素をコードする遺伝子を単離することにある。
【０００７】従って、我々はアラビドプシス・サリアナ
のｃｅｒ突然変異体を分子レベルで分析した。アラビド
プシス・サリアナはＥＷ生合成に関与する遺伝子の単離
に極めて適し、その理由は特にＥＷに影響する２２の遺
伝子座が既にわかっているからである（Ｋｏｏｒｎｎｅ
ｅｆら、１９８９；ＭｃＮｅｖｉｎら、１９９３）。こ
れらの突然変異体の生化学組成分析は多くの遺伝子座に
起因する機能を可能にした。トランスポゾン・タッギン
グ技術の適用により、我々は脂肪アルデヒドからアルカ
ンへの脱カルボニル化に関与するタンパク質の合成を司
る遺伝子を単離することができた。遺伝子座の事前の表
示との整合性のため、単離した遺伝子をＣＥＲ１と命名
し、そして対応のタンパク質をＣＥＲ１タンパク質と命
名した。（Ａｐａｒｔｓら、１９９３；Ａａｒｔｓら、
１９９５）
のｃｅｒ突然変異体を分子レベルで分析した。アラビド
プシス・サリアナはＥＷ生合成に関与する遺伝子の単離
に極めて適し、その理由は特にＥＷに影響する２２の遺
伝子座が既にわかっているからである（Ｋｏｏｒｎｎｅ
ｅｆら、１９８９；ＭｃＮｅｖｉｎら、１９９３）。こ
れらの突然変異体の生化学組成分析は多くの遺伝子座に
起因する機能を可能にした。トランスポゾン・タッギン
グ技術の適用により、我々は脂肪アルデヒドからアルカ
ンへの脱カルボニル化に関与するタンパク質の合成を司
る遺伝子を単離することができた。遺伝子座の事前の表
示との整合性のため、単離した遺伝子をＣＥＲ１と命名
し、そして対応のタンパク質をＣＥＲ１タンパク質と命
名した。（Ａｐａｒｔｓら、１９９３；Ａａｒｔｓら、
１９９５）
【０００８】関連文献 植物の蝋の生合成及び遺伝子に基づく論文はｖｏｎ Ｗ
ｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ（１９９５）のＷａ
ｘｅｓ，Ｔｈｅ Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｄｕｎｄｅ
ｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ；Ｅｄ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｍｉｌｔｏ
ｎにより公開されている。アラビドプシスのＥｃｅｒｉ
ｆｅｒｕｍ突然変異体の葉エピクチクラ蝋の分析につい
ての論文はＭ．Ａ．Ｊｅｎｋｓらの１９９５，Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１０８巻、３６９〜３７
７頁に公開されている。
ｅｔｔｓｔｅｉｎ−Ｋｎｏｗｌｅｓ（１９９５）のＷａ
ｘｅｓ，Ｔｈｅ Ｏｉｌｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｄｕｎｄｅ
ｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ；Ｅｄ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｍｉｌｔｏ
ｎにより公開されている。アラビドプシスのＥｃｅｒｉ
ｆｅｒｕｍ突然変異体の葉エピクチクラ蝋の分析につい
ての論文はＭ．Ａ．Ｊｅｎｋｓらの１９９５，Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１０８巻、３６９〜３７
７頁に公開されている。
【０００９】Ｅｉｇｅｎｂｒｏｄｅ ａｎｄ Ｅｓｐｅ
ｌｉｅはＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｎｔｏ
ｍｏｌｏｇｙ １９９５、第４０巻、１７１〜１９４頁
に昆虫草食動物に対する植物エピクチクラ脂質の作用に
ついての論文を公開している。
ｌｉｅはＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｎｔｏ
ｍｏｌｏｇｙ １９９５、第４０巻、１７１〜１９４頁
に昆虫草食動物に対する植物エピクチクラ脂質の作用に
ついての論文を公開している。
【００１０】定義 遺伝子又はセンス遺伝子：ＲＮＡ分子及び／又はポリペ
プチドとして発現されうるヌクレオチド配列。 プロモーター：（センス）遺伝子又はアンチセンス遺伝
子の発現を指令するヌクレオチド配列又はそれより誘導
されたヌクレオチド配列。
プチドとして発現されうるヌクレオチド配列。 プロモーター：（センス）遺伝子又はアンチセンス遺伝
子の発現を指令するヌクレオチド配列又はそれより誘導
されたヌクレオチド配列。
【００１１】アンチセンス遺伝子：本明細書において定
義している標的遺伝子と５０％以上、好ましくは８０％
以上の相同性を有し、且つ標的遺伝子に対して３’から
５’の方向においてプロモーターに連結され、そしてＲ
ＮＡ分子として発現できるヌクレオチド配列。
義している標的遺伝子と５０％以上、好ましくは８０％
以上の相同性を有し、且つ標的遺伝子に対して３’から
５’の方向においてプロモーターに連結され、そしてＲ
ＮＡ分子として発現できるヌクレオチド配列。
【００１２】阻害遺伝子：（センス）遺伝子又はアンチ
センス遺伝子であって、その発現が本明細書において定
義する標的遺伝子の発現の阻止又は阻害を及ぼすもの。 標的遺伝子：本明細書において定義する阻害遺伝子の適
切な発現により阻害される遺伝子。
センス遺伝子であって、その発現が本明細書において定
義する標的遺伝子の発現の阻止又は阻害を及ぼすもの。 標的遺伝子：本明細書において定義する阻害遺伝子の適
切な発現により阻害される遺伝子。
【００１３】発明の概要 本発明はアラビドプシス・サリアナのＥＷ生合成に関与
するＣＥＲ１遺伝子の単離を述べる。ｃｅｒ１突然変異
体のＥＷは予め分析されており、そしてアルデヒドに特
に富み、しかもアルカン欠くことがわかっている。この
ことは、提供するＣＥＲ１遺伝子によりコードされるＣ
ＥＲ１タンパク質がアルデヒドのアルカンへの転換に関
与することを示す。
するＣＥＲ１遺伝子の単離を述べる。ｃｅｒ１突然変異
体のＥＷは予め分析されており、そしてアルデヒドに特
に富み、しかもアルカン欠くことがわかっている。この
ことは、提供するＣＥＲ１遺伝子によりコードされるＣ
ＥＲ１タンパク質がアルデヒドのアルカンへの転換に関
与することを示す。
【００１４】本発明は、ファージラムダ中のゲノムアラ
ビドプシス・サリアナＤＮＡライブラリーからＥＷ生合
成に関与するＣＥＲ１として表示するタンパク質をコー
ドするＣＥＲ１遺伝子を単離した。この遺伝子は図１〜
２に示すヌクレオチド配列を有する。図１〜２はＣＥＲ
１遺伝子の部分ヌクレオチド配列を示し、その完全ヌク
レオチド配列は約６０００のヌクレオチドを含んで成る
であろうと仮定される。更に、図３〜５に示すヌクレオ
チド配列を有するＣＥＲ１ ｃＤＮＡを単離した。この
ｃＤＮＡから推定したＣＥＲ１タンパク質のアミノ酸配
列を図８〜１０に示す。
ビドプシス・サリアナＤＮＡライブラリーからＥＷ生合
成に関与するＣＥＲ１として表示するタンパク質をコー
ドするＣＥＲ１遺伝子を単離した。この遺伝子は図１〜
２に示すヌクレオチド配列を有する。図１〜２はＣＥＲ
１遺伝子の部分ヌクレオチド配列を示し、その完全ヌク
レオチド配列は約６０００のヌクレオチドを含んで成る
であろうと仮定される。更に、図３〜５に示すヌクレオ
チド配列を有するＣＥＲ１ ｃＤＮＡを単離した。この
ｃＤＮＡから推定したＣＥＲ１タンパク質のアミノ酸配
列を図８〜１０に示す。
【００１５】従って、本発明は図８〜１０に示すアミノ
酸配列を含んで成るタンパク質をコードするＤＮＡフラ
グメント又はそれと実質的に相同性であり、且つ脂肪ア
ルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質を
提供する。更に、本発明は図３〜５に示すヌクレオチド
配列又は相同性のヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ
フラグメントを提供する。このＤＮＡフラグメントは以
降しばしばＣＥＲ１遺伝子と呼び、それは事実上ＣＥＲ
１ ｃＤＮＡであることが理解されるはずである。「相
同性ヌクレオチド配列」とは、ＣＥＲ１タンパク質アミ
ノ酸配列から合成されうる任意の核酸配列を意図する
か、又はそうでなければ別の生物において同定され、そ
してＣＥＲ１タンパク質核酸配列もしくはＣＥＲ１タン
パク質に対して調製された抗体をプローブとして利用し
て単離された任意の核酸配列を意図する。これにより、
核酸又は抗原法によりＣＥＲ１配列を利用して他の生物
から単離された配列は同じ活性を有するその他のタンパ
ク質を単離するために似たようにして利用されうること
がわかる。かかるタンパク質も相同性であると考える。
酸配列を含んで成るタンパク質をコードするＤＮＡフラ
グメント又はそれと実質的に相同性であり、且つ脂肪ア
ルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質を
提供する。更に、本発明は図３〜５に示すヌクレオチド
配列又は相同性のヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ
フラグメントを提供する。このＤＮＡフラグメントは以
降しばしばＣＥＲ１遺伝子と呼び、それは事実上ＣＥＲ
１ ｃＤＮＡであることが理解されるはずである。「相
同性ヌクレオチド配列」とは、ＣＥＲ１タンパク質アミ
ノ酸配列から合成されうる任意の核酸配列を意図する
か、又はそうでなければ別の生物において同定され、そ
してＣＥＲ１タンパク質核酸配列もしくはＣＥＲ１タン
パク質に対して調製された抗体をプローブとして利用し
て単離された任意の核酸配列を意図する。これにより、
核酸又は抗原法によりＣＥＲ１配列を利用して他の生物
から単離された配列は同じ活性を有するその他のタンパ
ク質を単離するために似たようにして利用されうること
がわかる。かかるタンパク質も相同性であると考える。
【００１６】更に、本発明はアラビドプシス・サリアナ
の染色体ＤＮＡから単離したＣＥＲ１遺伝子の５’調節
領域又はプロモーターを提供する。このプロモーターは
図６〜７に示すヌクレオチド配列を有するか、又は相同
性遺伝子のプロモーターである。
の染色体ＤＮＡから単離したＣＥＲ１遺伝子の５’調節
領域又はプロモーターを提供する。このプロモーターは
図６〜７に示すヌクレオチド配列を有するか、又は相同
性遺伝子のプロモーターである。
【００１７】更に、本発明は上記のＤＮＡフラグメント
を含んで成る組換ＤＮＡ分子（組換核酸配列）を提供す
る。特に、本発明は組換核酸配列であって、改変脂肪ア
ルデヒドデカルボニラーゼ活性を示す宿主細胞を獲得す
るために適切に利用でき、前記宿主細胞の中でＣＥＲ１
遺伝子を発現せしめることのできる遺伝子を含んで成
り、前記ＣＥＲ１タンパク質をコードするような組換核
酸配列を提供する。ここでこの遺伝子は図３〜５に示す
配列を有する遺伝子であるか、又は相同性の遺伝子であ
る。特に、ＣＥＲ１タンパク質の好適な基質を含む特定
の宿主細胞、例えばブラッシカ植物の細胞が考慮され
る。別の好適な本発明に係る態様において、前記遺伝子
の発現を駆動するプロモーターはＣＥＲ１遺伝子のプロ
モーターを含んで成る。このプロモーターは図６〜７に
示す配列を有する。
を含んで成る組換ＤＮＡ分子（組換核酸配列）を提供す
る。特に、本発明は組換核酸配列であって、改変脂肪ア
ルデヒドデカルボニラーゼ活性を示す宿主細胞を獲得す
るために適切に利用でき、前記宿主細胞の中でＣＥＲ１
遺伝子を発現せしめることのできる遺伝子を含んで成
り、前記ＣＥＲ１タンパク質をコードするような組換核
酸配列を提供する。ここでこの遺伝子は図３〜５に示す
配列を有する遺伝子であるか、又は相同性の遺伝子であ
る。特に、ＣＥＲ１タンパク質の好適な基質を含む特定
の宿主細胞、例えばブラッシカ植物の細胞が考慮され
る。別の好適な本発明に係る態様において、前記遺伝子
の発現を駆動するプロモーターはＣＥＲ１遺伝子のプロ
モーターを含んで成る。このプロモーターは図６〜７に
示す配列を有する。
【００１８】本発明はまた、組換核酸配列であって、改
変された脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性を示す宿
主細胞を獲得するために適切に利用でき、前記宿主細胞
の中で標的遺伝子の発現を阻害できる阻害遺伝子を本質
的に含んで成る配列も提供する。本発明の好適な態様に
おいて、この標的遺伝子はＣＥＲ１遺伝子であり、この
遺伝子は図１〜２に示す配列を有するものであるか、又
は相同性の標的遺伝子である。
変された脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性を示す宿
主細胞を獲得するために適切に利用でき、前記宿主細胞
の中で標的遺伝子の発現を阻害できる阻害遺伝子を本質
的に含んで成る配列も提供する。本発明の好適な態様に
おいて、この標的遺伝子はＣＥＲ１遺伝子であり、この
遺伝子は図１〜２に示す配列を有するものであるか、又
は相同性の標的遺伝子である。
【００１９】更に、本発明は組換核酸配列であって、改
変アルカン生合成を示す宿主細胞を獲得するために適切
に利用でき、前記宿主細胞の中でのアルカン生合成に関
与するＣＥＲ１タンパク質をコードする標的遺伝子の発
現を阻害することのできる阻害遺伝子を本質的に含んで
成る配列を提供する。ここでこの標的遺伝子は図１〜２
に示す配列を有するか、又は相同性の標的遺伝子であ
る。
変アルカン生合成を示す宿主細胞を獲得するために適切
に利用でき、前記宿主細胞の中でのアルカン生合成に関
与するＣＥＲ１タンパク質をコードする標的遺伝子の発
現を阻害することのできる阻害遺伝子を本質的に含んで
成る配列を提供する。ここでこの標的遺伝子は図１〜２
に示す配列を有するか、又は相同性の標的遺伝子であ
る。
【００２０】本発明の好適な態様において、当該標的遺
伝子は図１〜２に示す配列を有するＣＥＲ１遺伝子であ
る。
伝子は図１〜２に示す配列を有するＣＥＲ１遺伝子であ
る。
【００２１】本発明の更なる好適な態様において、当該
阻害遺伝子は前記標的遺伝子に対して特異的な（セン
ス）遺伝子又はアンチセンス遺伝子である。本発明の更
なる好適な態様において、当該阻害遺伝子の発現を駆動
するプロモーターはＣＥＲ１遺伝子のプロモーターを含
んで成り、このプロモーターは図６〜７において示す配
列を有する。
阻害遺伝子は前記標的遺伝子に対して特異的な（セン
ス）遺伝子又はアンチセンス遺伝子である。本発明の更
なる好適な態様において、当該阻害遺伝子の発現を駆動
するプロモーターはＣＥＲ１遺伝子のプロモーターを含
んで成り、このプロモーターは図６〜７において示す配
列を有する。
【００２２】本発明は更に改変ＥＷ組成を有する植物を
獲得するための方法も提供し、この方法は： ａ．本発明に係る任意の組換核酸配列を植物細胞に移入
する、 ｂ．前記核酸配列の組込まれた細胞から完全新植物を発
生させる、そして ｃ．改変ＥＷ組成を有する植物を選定する、工程を含ん
で成る。
獲得するための方法も提供し、この方法は： ａ．本発明に係る任意の組換核酸配列を植物細胞に移入
する、 ｂ．前記核酸配列の組込まれた細胞から完全新植物を発
生させる、そして ｃ．改変ＥＷ組成を有する植物を選定する、工程を含ん
で成る。
【００２３】本発明の更なる別の態様は、本発明に係る
組換核酸配列がその中に組込まれて含んで成る組換ゲノ
ムである。特に、植物ゲノム又は細菌ゲノムが考慮され
る。一般に、本発明は上記の組換ＤＮＡ分子を宿主細胞
に移入することにより形質転換宿主細胞を獲得するため
の方法を提供する。前記組換ＤＮＡ分子は好ましくは宿
主細胞の中でＤＮＡフラグメントの（過剰）発現を及ぼ
すことのできるＤＮＡ配列に作用可能式に連結されたＣ
ＥＲ１タンパク質又は相同性タンパク質をコードするＤ
ＮＡフラグメントを含んで成る。特に細菌宿主細胞が考
慮される。このようにして形質転換させた細菌細胞はＣ
ＥＲ１タンパク質又は相同性タンパク質の生産に利用で
きる。従って、本発明はＣＥＲ１タンパク質又は相同性
タンパク質を生産するための方法を提供し、この方法は
この形質転換細菌細胞を適当な培養培地の中で培養し、
そしてこのタンパク質を単離することを含んで成る。本
発明は更に形質転換植物及び細胞、果実、種子、又は交
配もしくは自家受粉を通じて前記植物から誘導された子
孫も包括する。
組換核酸配列がその中に組込まれて含んで成る組換ゲノ
ムである。特に、植物ゲノム又は細菌ゲノムが考慮され
る。一般に、本発明は上記の組換ＤＮＡ分子を宿主細胞
に移入することにより形質転換宿主細胞を獲得するため
の方法を提供する。前記組換ＤＮＡ分子は好ましくは宿
主細胞の中でＤＮＡフラグメントの（過剰）発現を及ぼ
すことのできるＤＮＡ配列に作用可能式に連結されたＣ
ＥＲ１タンパク質又は相同性タンパク質をコードするＤ
ＮＡフラグメントを含んで成る。特に細菌宿主細胞が考
慮される。このようにして形質転換させた細菌細胞はＣ
ＥＲ１タンパク質又は相同性タンパク質の生産に利用で
きる。従って、本発明はＣＥＲ１タンパク質又は相同性
タンパク質を生産するための方法を提供し、この方法は
この形質転換細菌細胞を適当な培養培地の中で培養し、
そしてこのタンパク質を単離することを含んで成る。本
発明は更に形質転換植物及び細胞、果実、種子、又は交
配もしくは自家受粉を通じて前記植物から誘導された子
孫も包括する。
【００２４】発明の詳細な説明アラビドプシス・サリアナのＣＥＲ１遺伝子の単離 トランスポゾン誘導型ｃｅｒ突然変異体の表現型及び遺
伝分析 エピクチクラ蝋生合成に関与する遺伝子を単離するた
め、我々はＩ／ｄＳｐｍトランスポゾン・タッギング手
法を利用してＥｎ／Ｓｐｍ−Ｉ／ｄＳｐｍトランスポゾ
ン・タッギングシステムを含むアラビドプシス系を作成
及びスクリーニングした（実験の章：Ａａｒｔｓら、１
９９５を参照のこと）。スクリーニングした系別のう
ち、我々は多重Ｉ／ｄＳｐｍ因子及びＴＥｎ２トランス
ポサーゼＴ−ＤＮＡ（Ａａｒｔｓら、１９９５）をもつ
一の系を選定した。これは正常野生型植物より若干鮮緑
色の半不稔性突然変異体を示した。表現上は、これらの
突然変異体は光沢を帯びた幹を有し、繁殖力の低下した
公知のクラスのｃｅｒ突然変異体に非常に似ていた（Ｋ
ｏｏｒｎｎｅｅｆら、１９８９）。このクラスにおける
ｃｅｒ１，ｃｅｒ３，ｃｅｒ６及びｃｅｒ１０突然変異
体による補完試験は、トランスポゾン誘導型突然変異体
がｃｅｒ１−１に対して対立形態であることを示した。
我々のｃｅｒ１突然変異体（我々はこれをｃｅｒ１−ｍ
と呼ぶ）とｃｅｒ１−１突然変異体との間には表現型の
はっきりとした相違はなかった。双方は光沢の強い幹及
び果実の表現型を示し、蝋生成の目に見える徴候はなか
った。
伝分析 エピクチクラ蝋生合成に関与する遺伝子を単離するた
め、我々はＩ／ｄＳｐｍトランスポゾン・タッギング手
法を利用してＥｎ／Ｓｐｍ−Ｉ／ｄＳｐｍトランスポゾ
ン・タッギングシステムを含むアラビドプシス系を作成
及びスクリーニングした（実験の章：Ａａｒｔｓら、１
９９５を参照のこと）。スクリーニングした系別のう
ち、我々は多重Ｉ／ｄＳｐｍ因子及びＴＥｎ２トランス
ポサーゼＴ−ＤＮＡ（Ａａｒｔｓら、１９９５）をもつ
一の系を選定した。これは正常野生型植物より若干鮮緑
色の半不稔性突然変異体を示した。表現上は、これらの
突然変異体は光沢を帯びた幹を有し、繁殖力の低下した
公知のクラスのｃｅｒ突然変異体に非常に似ていた（Ｋ
ｏｏｒｎｎｅｅｆら、１９８９）。このクラスにおける
ｃｅｒ１，ｃｅｒ３，ｃｅｒ６及びｃｅｒ１０突然変異
体による補完試験は、トランスポゾン誘導型突然変異体
がｃｅｒ１−１に対して対立形態であることを示した。
我々のｃｅｒ１突然変異体（我々はこれをｃｅｒ１−ｍ
と呼ぶ）とｃｅｒ１−１突然変異体との間には表現型の
はっきりとした相違はなかった。双方は光沢の強い幹及
び果実の表現型を示し、蝋生成の目に見える徴候はなか
った。
【００２５】ｃｅｒ１−ｍ突然変異体のＩ／ｄＳｐｍ因
子によるタッギング ｃｅｒ１−ｍ突然変異体はトランスポーズ性Ｉ／ｄＳｐ
ｍ因子をもつ系において見い出され、そしてそれはおそ
らくはＩ／ｄＳｐｍ因子の挿入により生じたものであ
る。ｃｅｒ１がタッギングされたかを決定するため、突
然変異体由来の数多くの子孫を、野生表現型に戻った子
孫についてスクリーニングした。これはトランスポゾン
誘導型突然変異性の典型的な表現型である。胚種先祖返
りは４つの個々の子孫において５０分の１〜３００分の
１の頻度で認められ、不安定な突然変異体はＣＥＲ１遺
伝子におけるトランスポゾン挿入に事実上よることが示
唆される。
子によるタッギング ｃｅｒ１−ｍ突然変異体はトランスポーズ性Ｉ／ｄＳｐ
ｍ因子をもつ系において見い出され、そしてそれはおそ
らくはＩ／ｄＳｐｍ因子の挿入により生じたものであ
る。ｃｅｒ１がタッギングされたかを決定するため、突
然変異体由来の数多くの子孫を、野生表現型に戻った子
孫についてスクリーニングした。これはトランスポゾン
誘導型突然変異性の典型的な表現型である。胚種先祖返
りは４つの個々の子孫において５０分の１〜３００分の
１の頻度で認められ、不安定な突然変異体はＣＥＲ１遺
伝子におけるトランスポゾン挿入に事実上よることが示
唆される。
【００２６】分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ）子孫のＤ
ＮＡブロット分析（実験の章を参照のこと）は、ｃｅｒ
１−ｍ突然変異表現型と共に分離するＩ／ｄＳｐｍイン
サート（Ｉ／ｄＳｐｍ８９）を示した。このＩ／ｄＳｐ
ｍ８９インサートの隣接ＤＮＡを逆ポリメラーゼ連鎖反
応（ＩＰＣＲ）により増幅し、そしてクローニングし
た。ＤＮＡ配列に基づき、野生型及び先祖返りＩ／ｄＳ
ｐｍ８９除去対立形態のＰＣＲ増幅のためのプライマー
をデザインした。３つの個別に誘導された胚種先祖返り
植物は全て除去対立形態を含み、ｃｅｒ１−ｍ突然変異
体がＩ／ｄＳｐｍ８９挿入により事実上タッギングさ
れ、ｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９対立形態ができている
ことを示している。Ｉ／ｄＳｐｍ因子の除去は通常短い
塩基対欠失及び付加をもたらすが（Ａａｒｔｓら、１９
９３）、この３つのケースにおいては、先祖返り対立形
態のＤＮＡ配列は野生型ＤＮＡ配列と同一であり、遺伝
子の必須不可決な位置でのＩ／ｄＳｐｍ８９の挿入が示
唆される。
ＮＡブロット分析（実験の章を参照のこと）は、ｃｅｒ
１−ｍ突然変異表現型と共に分離するＩ／ｄＳｐｍイン
サート（Ｉ／ｄＳｐｍ８９）を示した。このＩ／ｄＳｐ
ｍ８９インサートの隣接ＤＮＡを逆ポリメラーゼ連鎖反
応（ＩＰＣＲ）により増幅し、そしてクローニングし
た。ＤＮＡ配列に基づき、野生型及び先祖返りＩ／ｄＳ
ｐｍ８９除去対立形態のＰＣＲ増幅のためのプライマー
をデザインした。３つの個別に誘導された胚種先祖返り
植物は全て除去対立形態を含み、ｃｅｒ１−ｍ突然変異
体がＩ／ｄＳｐｍ８９挿入により事実上タッギングさ
れ、ｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９対立形態ができている
ことを示している。Ｉ／ｄＳｐｍ因子の除去は通常短い
塩基対欠失及び付加をもたらすが（Ａａｒｔｓら、１９
９３）、この３つのケースにおいては、先祖返り対立形
態のＤＮＡ配列は野生型ＤＮＡ配列と同一であり、遺伝
子の必須不可決な位置でのＩ／ｄＳｐｍ８９の挿入が示
唆される。
【００２７】ＣＥＲ１遺伝子のクローニング プローブとしてのＩ／ｄＳｐｍ８９隣接ゲノムＤＮＡに
より、相同性ｃＤＮＡクローン及び長さ１７bpのゲノム
クローンが対応のＤＮＡライブラリーから単離された。
このｃＤＮＡクローンがＣＥＲ１遺伝子座を起源とする
ことを確認するため、挿入ＤＮＡの一部をプローブとし
て用い、そしてｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９突然変異体
及び先祖返り植物のブロットにハイブリダイズさせた。
突然変異体は全てＩ／ｄＳｐｍ８９インサートを含むフ
ラグメントに対するホモ接合体であったが、除去も観察
され、そして全ての先祖返り体はＩ／ｄＳｐｍ８９イン
サーに対するヘミ接合体であるか又はインサーを欠いて
いた。
より、相同性ｃＤＮＡクローン及び長さ１７bpのゲノム
クローンが対応のＤＮＡライブラリーから単離された。
このｃＤＮＡクローンがＣＥＲ１遺伝子座を起源とする
ことを確認するため、挿入ＤＮＡの一部をプローブとし
て用い、そしてｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９突然変異体
及び先祖返り植物のブロットにハイブリダイズさせた。
突然変異体は全てＩ／ｄＳｐｍ８９インサートを含むフ
ラグメントに対するホモ接合体であったが、除去も観察
され、そして全ての先祖返り体はＩ／ｄＳｐｍ８９イン
サーに対するヘミ接合体であるか又はインサーを欠いて
いた。
【００２８】単離された遺伝子が実際にエピクチクラ蝋
生成に関与するＣＥＲ１遺伝子であるとの決定的な証拠
は野生表現型は有するが小型の突然変異ｃｅｒセクター
のない植物の分析から得られた。ｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐ
ｍ８９分析の際、かかる３種の植物は様々な子孫におい
て見い出された。これらの植物のうちの１つにおける突
然変異セクターであってＩ／ｄＳｐｍ８９に対してヘミ
接合体であるものは小さな葉で終わり、それからＤＮＡ
わＰＣＲ分析のために単離した。Ｉ／ｄＳｐｍ特異性末
端プライマーと別のＣＥＲ１特異性プライマー（実験の
章参照のこと）との組合せを、ｃｅｒセクター由来のＤ
ＮＡ及び同一の植物の野生型のロゼット葉由来のＤＮＡ
についてのＰＣＲのために用いた。２つのｃｅｒセクタ
ー特異性ＤＮＡフラグメントを２通りのプライマー組合
せのために増幅させた。新しいｃｅｒセクター特異性Ｉ
／ｄＳｐｍ挿入を、クローニングした遺伝子のコード領
域内のＩ／ｄＳｐｍ８９インサーの１．０kb上流に配置
せしめた。クローニングした遺伝子へのＩ／ｄＳｐｍ因
子の新たな挿入は再び突然変異ｃｅｒ表現型をもたらし
たため、我々はクローニングした遺伝子が実際にエピク
チクラ蝋生合成に関与するＣＥＲ１であるものと考え
た。
生成に関与するＣＥＲ１遺伝子であるとの決定的な証拠
は野生表現型は有するが小型の突然変異ｃｅｒセクター
のない植物の分析から得られた。ｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐ
ｍ８９分析の際、かかる３種の植物は様々な子孫におい
て見い出された。これらの植物のうちの１つにおける突
然変異セクターであってＩ／ｄＳｐｍ８９に対してヘミ
接合体であるものは小さな葉で終わり、それからＤＮＡ
わＰＣＲ分析のために単離した。Ｉ／ｄＳｐｍ特異性末
端プライマーと別のＣＥＲ１特異性プライマー（実験の
章参照のこと）との組合せを、ｃｅｒセクター由来のＤ
ＮＡ及び同一の植物の野生型のロゼット葉由来のＤＮＡ
についてのＰＣＲのために用いた。２つのｃｅｒセクタ
ー特異性ＤＮＡフラグメントを２通りのプライマー組合
せのために増幅させた。新しいｃｅｒセクター特異性Ｉ
／ｄＳｐｍ挿入を、クローニングした遺伝子のコード領
域内のＩ／ｄＳｐｍ８９インサーの１．０kb上流に配置
せしめた。クローニングした遺伝子へのＩ／ｄＳｐｍ因
子の新たな挿入は再び突然変異ｃｅｒ表現型をもたらし
たため、我々はクローニングした遺伝子が実際にエピク
チクラ蝋生合成に関与するＣＥＲ１であるものと考え
た。
【００２９】ＣＥＲ１ ｃＤＮＡの分析 エピクチクラ蝋は主としてアラビドプシスの幹及び果実
の表皮上に見い出され、従って単離ＣＥＲ１遺伝子はこ
れらの器官の中で発現されるであろう。従ってＣＥＲ１
転写をＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションによ
り試験し、そして予測通り、ＣＥＲ１転写体は野生型の
幹及び果実組織において見い出された。更に強い発現が
アラビドプシスの花において検出され、それにおいては
ＣＥＲ１遺伝子の発現は突然変異体の雄の不稔性表現型
に基づいて予測されうる。アラビドプシスは葉の上にご
くわずかな蝋形成を有し、葉転写体のレベルの低さを示
唆する。ＣＥＲ１遺伝子の転写はｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐ
ｍ８９突然変異花の中ではブロッキングされ、一方ｃｅ
ｒ１−１花における転写は影響されなかった。化学誘導
されたｃｅｒ１−１突然変異体の突然変異表現型はおそ
らくはささいな転位、例えば点突然変異に基づく。ｃｅ
ｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍとｃｅｒ１−１との間でのＦ1 ハイ
ブリドの花において、遺伝子の転写レベルは２種の親の
中間体であった。
の表皮上に見い出され、従って単離ＣＥＲ１遺伝子はこ
れらの器官の中で発現されるであろう。従ってＣＥＲ１
転写をＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションによ
り試験し、そして予測通り、ＣＥＲ１転写体は野生型の
幹及び果実組織において見い出された。更に強い発現が
アラビドプシスの花において検出され、それにおいては
ＣＥＲ１遺伝子の発現は突然変異体の雄の不稔性表現型
に基づいて予測されうる。アラビドプシスは葉の上にご
くわずかな蝋形成を有し、葉転写体のレベルの低さを示
唆する。ＣＥＲ１遺伝子の転写はｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐ
ｍ８９突然変異花の中ではブロッキングされ、一方ｃｅ
ｒ１−１花における転写は影響されなかった。化学誘導
されたｃｅｒ１−１突然変異体の突然変異表現型はおそ
らくはささいな転位、例えば点突然変異に基づく。ｃｅ
ｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍとｃｅｒ１−１との間でのＦ1 ハイ
ブリドの花において、遺伝子の転写レベルは２種の親の
中間体であった。
【００３０】長さ２１０９bpのＣＥＲ１ ｃＤＮＡは６
２５個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを含
んでいた（図３〜５）。対応のゲノムＤＮＡ配列の一部
を決定し、そしてイン・フレーム・停止コドンがＡＴＧ
開始コドンの３３bp上流に見つかり、ｃＤＮＡクローン
が完全なオープンリーディングフレームを含んで成るこ
とが示唆された。推定ＴＡＴＡ転写開始配列がゲノムＤ
ＮＡ配列の中のＡＴＧ開始コドンの７２bp上流に存在し
ていた（図１〜２）。この推定タンパク質は７２．３kD
の見かけ分子量及び８．２３のｐＩを有していた。ＰＣ
／Ｇｅｎｅコンピューターによるアミノ酸配列の分析は
このタンパク質を膜内在タンパク質に分類せしめた。ア
ミノ酸位置１７８〜２１３及び３２５〜３５０に広がる
２つの推定トランスメンブランヘリックスが推定され、
そして更なる膜結合型ヘリックスはアミノ酸の位置７〜
２７，４５〜６５，９９〜１１９及び１２６〜１４６を
占めている。２つの考えられるＡｓｎグリコシル化部位
が２５８及び４５６位に見い出された。Ｉ／ｄＳｐｍ８
９の挿入はＴｈｒ（アミノ酸位置２７２）以降のリーデ
ィングフレームを破綻させる（図８〜１０）。
２５個のアミノ酸のオープンリーディングフレームを含
んでいた（図３〜５）。対応のゲノムＤＮＡ配列の一部
を決定し、そしてイン・フレーム・停止コドンがＡＴＧ
開始コドンの３３bp上流に見つかり、ｃＤＮＡクローン
が完全なオープンリーディングフレームを含んで成るこ
とが示唆された。推定ＴＡＴＡ転写開始配列がゲノムＤ
ＮＡ配列の中のＡＴＧ開始コドンの７２bp上流に存在し
ていた（図１〜２）。この推定タンパク質は７２．３kD
の見かけ分子量及び８．２３のｐＩを有していた。ＰＣ
／Ｇｅｎｅコンピューターによるアミノ酸配列の分析は
このタンパク質を膜内在タンパク質に分類せしめた。ア
ミノ酸位置１７８〜２１３及び３２５〜３５０に広がる
２つの推定トランスメンブランヘリックスが推定され、
そして更なる膜結合型ヘリックスはアミノ酸の位置７〜
２７，４５〜６５，９９〜１１９及び１２６〜１４６を
占めている。２つの考えられるＡｓｎグリコシル化部位
が２５８及び４５６位に見い出された。Ｉ／ｄＳｐｍ８
９の挿入はＴｈｒ（アミノ酸位置２７２）以降のリーデ
ィングフレームを破綻させる（図８〜１０）。
【００３１】図６〜７はＣＥＲ１遺伝子のプロモーター
のヌクレオチド配列を示す。この配列はＣＥＲ１遺伝子
のＡ．サリアナエコタイプＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅ
ｃｔａゲノムクローンから得た。
のヌクレオチド配列を示す。この配列はＣＥＲ１遺伝子
のＡ．サリアナエコタイプＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅ
ｃｔａゲノムクローンから得た。
【００３２】ＣＥＲ１相同体はその他の種に存在する 蝋生産は多くの植物種に一般的であり、そして蝋生合成
に関与する遺伝子は種間でよく保存されていることがあ
る。これはＣＥＲ１ ｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列で
実施するデーターベースサーチとして確認され、ｃＤＮ
Ａと、双子葉類種及び単子葉類種の双方に由来の配列の
発現配列ｔａｇ（ＥＳＴ）との有意な相同性を示した
（方法を参照のこと）。アラビドプシスのつぼみから単
離したＥＳＴ ＡＴＴＳ１００１ ｃＤＮＡの推定アミ
ノ酸配列は推定ＣＥＲ１アミノ酸配列（図８〜１０）の
Ｃ末端領域（２１０個のアミノ酸）に対して５３．８％
の同一性を示した。更に、Ｂ．キャンペストリス（Ｂ．
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のつぼみのＥＳＴは４９．１％
の推定アミノ酸配列同一性（１１７個のアミノ酸）を示
し、ポテトの表皮のＥＳＴは６７．４％のアミノ酸同一
性（４６個のアミノ酸）を示し、そしてセネシオ・オド
ルス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｏｄｏｒｕｓ）表皮ｃＤＮＡは
３１．３％のアミノ酸同一性（５１３個のアミノ酸）を
示した（図８〜１０）。この近縁配列の族は単子葉類種
オオムギ及びコメにも及びうる。トウモロコシの栄養分
裂組織のＥＳＴは１１０個のアミノ酸にわたって５２．
７％のアミノ酸同一性を示した。５’末端から配列決定
した２種類のコメのカルスｃＤＮＡの相同性は推定ＣＥ
Ｒ１アミノ酸配列のＮ末端からちょうど始まり、約８０
個のアミノ酸を占める配列決定されたｃＤＮＡ全長に及
ぶ（全体で３７．５％の同一性；図８〜１０）。興味深
くは、推定ＣＥＲ１アミノ酸配列に対して短いアミノ酸
鎖類似性を有する別のコメのｃＤＮＡの推定アミノ酸配
列が、ＥＲＧ３遺伝子によりコードされる酵母のＣ−５
ステロールデサチュラーゼタンパク質に至るこの領域に
おける相同性を示した（Ａｒｔｈｉｎｇｔｏｎら、１９
９１）。これらの２本の短い相同鎖はＣＥＲ１，ＳＯＬ
ＩＰＴＲＢ、コメのＥＳＴ及びＥＲＧ３間で保存され、
そしてその一部はトウモロコシのＥＳＴにおいても見つ
かった。各相同鎖は短いモチーフを示し、以下の共通配
列を有する：Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ｈ
ｉｓ−Ｈｉｓ（ここでＸは任意のアミノ酸を表わす）。
に関与する遺伝子は種間でよく保存されていることがあ
る。これはＣＥＲ１ ｃＤＮＡ及び推定アミノ酸配列で
実施するデーターベースサーチとして確認され、ｃＤＮ
Ａと、双子葉類種及び単子葉類種の双方に由来の配列の
発現配列ｔａｇ（ＥＳＴ）との有意な相同性を示した
（方法を参照のこと）。アラビドプシスのつぼみから単
離したＥＳＴ ＡＴＴＳ１００１ ｃＤＮＡの推定アミ
ノ酸配列は推定ＣＥＲ１アミノ酸配列（図８〜１０）の
Ｃ末端領域（２１０個のアミノ酸）に対して５３．８％
の同一性を示した。更に、Ｂ．キャンペストリス（Ｂ．
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のつぼみのＥＳＴは４９．１％
の推定アミノ酸配列同一性（１１７個のアミノ酸）を示
し、ポテトの表皮のＥＳＴは６７．４％のアミノ酸同一
性（４６個のアミノ酸）を示し、そしてセネシオ・オド
ルス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｏｄｏｒｕｓ）表皮ｃＤＮＡは
３１．３％のアミノ酸同一性（５１３個のアミノ酸）を
示した（図８〜１０）。この近縁配列の族は単子葉類種
オオムギ及びコメにも及びうる。トウモロコシの栄養分
裂組織のＥＳＴは１１０個のアミノ酸にわたって５２．
７％のアミノ酸同一性を示した。５’末端から配列決定
した２種類のコメのカルスｃＤＮＡの相同性は推定ＣＥ
Ｒ１アミノ酸配列のＮ末端からちょうど始まり、約８０
個のアミノ酸を占める配列決定されたｃＤＮＡ全長に及
ぶ（全体で３７．５％の同一性；図８〜１０）。興味深
くは、推定ＣＥＲ１アミノ酸配列に対して短いアミノ酸
鎖類似性を有する別のコメのｃＤＮＡの推定アミノ酸配
列が、ＥＲＧ３遺伝子によりコードされる酵母のＣ−５
ステロールデサチュラーゼタンパク質に至るこの領域に
おける相同性を示した（Ａｒｔｈｉｎｇｔｏｎら、１９
９１）。これらの２本の短い相同鎖はＣＥＲ１，ＳＯＬ
ＩＰＴＲＢ、コメのＥＳＴ及びＥＲＧ３間で保存され、
そしてその一部はトウモロコシのＥＳＴにおいても見つ
かった。各相同鎖は短いモチーフを示し、以下の共通配
列を有する：Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ｈ
ｉｓ−Ｈｉｓ（ここでＸは任意のアミノ酸を表わす）。
【００３３】ＣＥＲ１タンパク質は蝋アルカン生合成に
おける機能を有する ｃｅｒ１突然変異体は劇的に変化したエピクチクラ蝋表
現型をもつ４種のｃｅｒ突然変異体の一つであり、対応
の野生型遺伝子に対するその生化学機能が注目される。
生化学研究は、ＣＥＲ２及びＣＥＲ６がきっと脂肪酸伸
長の成分をコードするという結論をもたらし、一方ＣＥ
Ｒ４は脂肪アルデヒド還元に関与することを示唆する
（Ｈａｎｎｏｕｆａら、１９９３；Ｌｅｍｉｅｕｘら、
１９９４；Ｊｅｎｋｓら、１９９５）。生化学研究（Ｈ
ａｎｎｏｕｆａら、１９９３；ＭｃＮｅｖｉｎら、１９
９３；Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９４）はｃｅｒ１突然変
異体が、幹の蝋のＣ30アルデヒド（トリアコンタナー
ル）からＣ29アルカン（ノナコサン）への転換をブロッ
キングし、そしてそれらが第二級アルコール（１４及び
１５−ノナコサノール）及びそのケトン（１５−ノナコ
サノン）誘導体を欠くことも示した。アルカン、第二級
アルコール及びケトンは野生型Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅ
ｒｅｃｔａ中の全蝋量の約６５％を占める（Ｌｅｍｉｅ
ｕｘら、１９９４）。アルデヒドからアルカンへの転換
はアルデヒドデカルボニラーゼにより媒介される（Ｃｈ
ｅｅｓｂｒｏｕｇｈ ａｎｄ Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄ
ｙ，１９８４）。我々は、ＣＥＲ１タンパク質がこの生
化学工程に関与して長鎖アルカンを生成するものと考え
た。
おける機能を有する ｃｅｒ１突然変異体は劇的に変化したエピクチクラ蝋表
現型をもつ４種のｃｅｒ突然変異体の一つであり、対応
の野生型遺伝子に対するその生化学機能が注目される。
生化学研究は、ＣＥＲ２及びＣＥＲ６がきっと脂肪酸伸
長の成分をコードするという結論をもたらし、一方ＣＥ
Ｒ４は脂肪アルデヒド還元に関与することを示唆する
（Ｈａｎｎｏｕｆａら、１９９３；Ｌｅｍｉｅｕｘら、
１９９４；Ｊｅｎｋｓら、１９９５）。生化学研究（Ｈ
ａｎｎｏｕｆａら、１９９３；ＭｃＮｅｖｉｎら、１９
９３；Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９４）はｃｅｒ１突然変
異体が、幹の蝋のＣ30アルデヒド（トリアコンタナー
ル）からＣ29アルカン（ノナコサン）への転換をブロッ
キングし、そしてそれらが第二級アルコール（１４及び
１５−ノナコサノール）及びそのケトン（１５−ノナコ
サノン）誘導体を欠くことも示した。アルカン、第二級
アルコール及びケトンは野生型Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅ
ｒｅｃｔａ中の全蝋量の約６５％を占める（Ｌｅｍｉｅ
ｕｘら、１９９４）。アルデヒドからアルカンへの転換
はアルデヒドデカルボニラーゼにより媒介される（Ｃｈ
ｅｅｓｂｒｏｕｇｈ ａｎｄ Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄ
ｙ，１９８４）。我々は、ＣＥＲ１タンパク質がこの生
化学工程に関与して長鎖アルカンを生成するものと考え
た。
【００３４】応用段階 本発明のＣＥＲ１タンパク質の核酸配列はゲノムＤＮ
Ａ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡに由来する、又は完全もしくは
部分的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。これ
らの遺伝子配列は例えばゲノムＤＮＡを適当な起源から
単離し、そして注目の配列をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を利用して増幅及びクローニングすることにより
クローニングできうる。他方、これらの遺伝子配列は、
宿主特異的配列を供することが所望される場合、完全又
は部分的に合成されたものであってよい。即ち、所望の
構造遺伝子全体又は一部（ＣＥＲ１タンパク質をコード
する遺伝子部分）を選定の宿主により優先されるコドン
を利用して合成してよい。宿主特異的コドンは例えば所
望の宿主の種において発現されるタンパク質において最
も頻繁に利用されるコドンから決定されうる。
Ａ，ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡに由来する、又は完全もしくは
部分的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。これ
らの遺伝子配列は例えばゲノムＤＮＡを適当な起源から
単離し、そして注目の配列をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を利用して増幅及びクローニングすることにより
クローニングできうる。他方、これらの遺伝子配列は、
宿主特異的配列を供することが所望される場合、完全又
は部分的に合成されたものであってよい。即ち、所望の
構造遺伝子全体又は一部（ＣＥＲ１タンパク質をコード
する遺伝子部分）を選定の宿主により優先されるコドン
を利用して合成してよい。宿主特異的コドンは例えば所
望の宿主の種において発現されるタンパク質において最
も頻繁に利用されるコドンから決定されうる。
【００３５】ＣＥＲ１タンパク質に係る核酸配列は数多
くの用途があるであろう。例えば、プローブとして利用
できる、又は宿主細胞中でのＣＥＲ１タンパク質の発現
を担う組換構築体が調製できる。意図する用途に応じ、
この構築体はＣＥＲ１タンパク質全体又はその一部をコ
ードする配列を含みうる。例えば、ＣＥＲ１タンパク質
の重要領域、例えば活性部位が同定されうる。このよう
にして、ＣＥＲタンパク質のうちの所望のＣＥＲ１活性
に必須なアミノ酸をコードする部分のみを含む更なる構
築体が調製できうる。
くの用途があるであろう。例えば、プローブとして利用
できる、又は宿主細胞中でのＣＥＲ１タンパク質の発現
を担う組換構築体が調製できる。意図する用途に応じ、
この構築体はＣＥＲ１タンパク質全体又はその一部をコ
ードする配列を含みうる。例えば、ＣＥＲ１タンパク質
の重要領域、例えば活性部位が同定されうる。このよう
にして、ＣＥＲタンパク質のうちの所望のＣＥＲ１活性
に必須なアミノ酸をコードする部分のみを含む更なる構
築体が調製できうる。
【００３６】ＣＥＲ１タンパク質の発現にとって有用な
系には原核系細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
酵母細胞及び植物細胞が含まれ、維管束及び非維管束植
物細胞が所望の宿主である。このようにして、ＣＥＲ１
タンパク質は生産されうる。更に、ＣＥＲ１タンパク質
コード配列の部位特異的突然変異誘発がＣＥＲ１タンパ
ク質の反応特性に対する特異的な突然変異の効果を研究
するために利用されうる。
系には原核系細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
酵母細胞及び植物細胞が含まれ、維管束及び非維管束植
物細胞が所望の宿主である。このようにして、ＣＥＲ１
タンパク質は生産されうる。更に、ＣＥＲ１タンパク質
コード配列の部位特異的突然変異誘発がＣＥＲ１タンパ
ク質の反応特性に対する特異的な突然変異の効果を研究
するために利用されうる。
【００３７】更に、ＣＥＲ１タンパク質コード配列又は
その一部の粗補性配列の転写を供するアンチセンス構築
体が調製されうる。このようにして、標的宿主生物の中
で生産されるＣＥＲ１タンパク質の量は削減できる。ま
た、ＣＥＲ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列はその
他の配列、例えばクロロプラストへの輸送のためのトラ
ンジットペプチドをコードする配列に連結されていてよ
い。
その一部の粗補性配列の転写を供するアンチセンス構築
体が調製されうる。このようにして、標的宿主生物の中
で生産されるＣＥＲ１タンパク質の量は削減できる。ま
た、ＣＥＲ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列はその
他の配列、例えばクロロプラストへの輸送のためのトラ
ンジットペプチドをコードする配列に連結されていてよ
い。
【００３８】本発明は改変蝋を有する植物を得るための
以下の工程を含む：アラビドプシス・サリアナのセンス
ＣＥＲ１もしくはアンチセンスＣＥＲ１遺伝子又はその
他の種の相同性対応物をＣＥＲ１プロモーターのコント
ロール下に置く。ここでこのプロモーターのＤＮＡ配列
は図６〜７に示し、そしてこれらの構築体は稔性穀類植
物の形質転換のために利用できる。この構築体を発現す
る形質転換植物の選別後、改変蝋生産を示すトランスジ
ェニック植物が選定できうる。
以下の工程を含む：アラビドプシス・サリアナのセンス
ＣＥＲ１もしくはアンチセンスＣＥＲ１遺伝子又はその
他の種の相同性対応物をＣＥＲ１プロモーターのコント
ロール下に置く。ここでこのプロモーターのＤＮＡ配列
は図６〜７に示し、そしてこれらの構築体は稔性穀類植
物の形質転換のために利用できる。この構築体を発現す
る形質転換植物の選別後、改変蝋生産を示すトランスジ
ェニック植物が選定できうる。
【００３９】一般に、改変蝋合成を示す植物はこのよう
にして得られうる。選定した品種の植物は前記植物の細
胞の中に１又は複数種の組換ポリヌクレオチドであっ
て、１もしくは複数の阻害遺伝子を本質的に含んで成る
ものを導入することによって遺伝子的に形質転換され
る。ここでこの阻害遺伝子は植物における適正な発現に
より、ＣＥＲ１遺伝子の発現を阻害することができる。
にして得られうる。選定した品種の植物は前記植物の細
胞の中に１又は複数種の組換ポリヌクレオチドであっ
て、１もしくは複数の阻害遺伝子を本質的に含んで成る
ものを導入することによって遺伝子的に形質転換され
る。ここでこの阻害遺伝子は植物における適正な発現に
より、ＣＥＲ１遺伝子の発現を阻害することができる。
【００４０】ＣＥＲ１遺伝子の発現の阻害は改変蝋組成
物示す植物をもたらす。これは標的遺伝子に対して特異
的な阻害遺伝子の適切な発現により成し遂げられうる。
阻害遺伝子は一連の代替物、例えば同族又は異種（即
ち、別の起源から得られた）センス及びアンチセンス
（合成）遺伝子、又は適当な長さ及び適当な阻害に関し
て相同性を有するその一部から適切に選ばれうる。それ
らは国際特許出願ＷＯ９２／１８６２５及び国際特許出
願ＷＯ９０／１１６８２に例示されている。
物示す植物をもたらす。これは標的遺伝子に対して特異
的な阻害遺伝子の適切な発現により成し遂げられうる。
阻害遺伝子は一連の代替物、例えば同族又は異種（即
ち、別の起源から得られた）センス及びアンチセンス
（合成）遺伝子、又は適当な長さ及び適当な阻害に関し
て相同性を有するその一部から適切に選ばれうる。それ
らは国際特許出願ＷＯ９２／１８６２５及び国際特許出
願ＷＯ９０／１１６８２に例示されている。
【００４１】好ましくは、阻害遺伝子は本発明に従い表
皮において発現される。これは阻害遺伝子をアラビドプ
シス・サリアナ由来のＣＥＲ１遺伝子由来のプロモータ
ー又はその異種対応物（即ち、別の起源から得られたも
の）のコントロール下に融合させることにより成し遂げ
られうる。
皮において発現される。これは阻害遺伝子をアラビドプ
シス・サリアナ由来のＣＥＲ１遺伝子由来のプロモータ
ー又はその異種対応物（即ち、別の起源から得られたも
の）のコントロール下に融合させることにより成し遂げ
られうる。
【００４２】本発明の別の好適な態様において、ＣＥＲ
１タンパク質コード核酸を植物において活性な転写開始
調節領域に連結する。これらの領域はとりわけアグロバ
クテリウム遺伝子に一体化した調節領域（Ｎｏｓ，Ｏｃ
ｓ，Ｍａｓプロモーター）並びにウイルス遺伝子に一体
化した調節領域（ＣａＭＶ ３５Ｓ，ＣａＭＶ １９Ｓ
プロモーター）、又は一定の組織の中で活性な調節領
域、例えばナピン、種子もしくは葉ＡＣＰに由来のも
の、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット、Ｃａｂ等であ
る。調節転写終止配列も本発明の組換構築体に施してよ
い。これはＣＥＲ１タンパク質コード遺伝子の転写終止
領域であるか、又は別の遺伝子起源に由来のものであっ
てよい。
１タンパク質コード核酸を植物において活性な転写開始
調節領域に連結する。これらの領域はとりわけアグロバ
クテリウム遺伝子に一体化した調節領域（Ｎｏｓ，Ｏｃ
ｓ，Ｍａｓプロモーター）並びにウイルス遺伝子に一体
化した調節領域（ＣａＭＶ ３５Ｓ，ＣａＭＶ １９Ｓ
プロモーター）、又は一定の組織の中で活性な調節領
域、例えばナピン、種子もしくは葉ＡＣＰに由来のも
の、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット、Ｃａｂ等であ
る。調節転写終止配列も本発明の組換構築体に施してよ
い。これはＣＥＲ１タンパク質コード遺伝子の転写終止
領域であるか、又は別の遺伝子起源に由来のものであっ
てよい。
【００４３】ＣＥＲ１タンパク質をコードする遺伝子に
適合する植物形質転換構築体は多種多様な植物、特に非
常に長い脂肪アルデヒドを産生する植物、例えば限定す
ることなく、ブラッシカ、トウモロコシ及びコメに利用
されうる。本発明は単子葉植物及び双子葉植物に適用可
能である。
適合する植物形質転換構築体は多種多様な植物、特に非
常に長い脂肪アルデヒドを産生する植物、例えば限定す
ることなく、ブラッシカ、トウモロコシ及びコメに利用
されうる。本発明は単子葉植物及び双子葉植物に適用可
能である。
【００４４】植物又はその器官への組換核酸の転移は様
々な技術により達成されうる。その一部をここに例示
し、そしてそれはカルシウム／ポリエチレングリコール
法を利用するプロトプラストの形質転換（Ｋｒｅｎｓ
ら、１９８２；Ｎｅｇｒｕｔｉｕら、１９８７）、エレ
クトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら、１９８
５）、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ
ら、１９８６）、（ＤＮＡ又はＲＮＡコート化）粒子ボ
ンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）、ウイルス
等による感染、アグロバクテリウム種による好ましくは
いわゆるバイナリーベクター系の利用を介する自然ＤＮ
Ａ移入（Ｂｅｖａｎら、１９８４）を含んで成る。
々な技術により達成されうる。その一部をここに例示
し、そしてそれはカルシウム／ポリエチレングリコール
法を利用するプロトプラストの形質転換（Ｋｒｅｎｓ
ら、１９８２；Ｎｅｇｒｕｔｉｕら、１９８７）、エレ
クトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら、１９８
５）、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ
ら、１９８６）、（ＤＮＡ又はＲＮＡコート化）粒子ボ
ンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）、ウイルス
等による感染、アグロバクテリウム種による好ましくは
いわゆるバイナリーベクター系の利用を介する自然ＤＮ
Ａ移入（Ｂｅｖａｎら、１９８４）を含んで成る。
【００４５】形質転換植物材料の同定後、完全植物を論
文に記載されているよく知られたプロトコールを利用し
て再生する（例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５を参照
のこと）。使用する植物の器官についての任意の制限は
ない。
文に記載されているよく知られたプロトコールを利用し
て再生する（例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５を参照
のこと）。使用する植物の器官についての任意の制限は
ない。
【００４６】形質転換植物が得られたら、それらを所望
の特徴の存在及び／又は所望の特徴が発現される程度に
ついて評価できる。第一の評価には阻害遺伝子の発現レ
ベル及びトランスジェニック植物が改変蝋生合成を示す
程度が含まれうる。次いで、安定及び／又は推定可能な
特徴の遺伝子等を示すトランスジェニック植物を選別す
ることができる。
の特徴の存在及び／又は所望の特徴が発現される程度に
ついて評価できる。第一の評価には阻害遺伝子の発現レ
ベル及びトランスジェニック植物が改変蝋生合成を示す
程度が含まれうる。次いで、安定及び／又は推定可能な
特徴の遺伝子等を示すトランスジェニック植物を選別す
ることができる。
【００４７】本発明は、蝋生合成が可能であり、それに
ついての改変蝋の生産の商業的関心のもたれる任意の植
物に適用できうる。
ついての改変蝋の生産の商業的関心のもたれる任意の植
物に適用できうる。
【００４８】本発明はまた微生物におけるＣＥＲ１タン
パク質の発現も含む。真核又は原核系微生物、特に単細
胞宿主における発現のため、多種多様な構成又は調節性
プロモーターが採用されうる。微生物における発現はＣ
ＥＲ１タンパク質の簡便な起源を担う。記載の転写開始
領域はとりわけ細菌及び酵母宿主、例えばＥ．コリ、
Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマ
イセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の領域、例えばベーターガラ
クトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥ等
である。
パク質の発現も含む。真核又は原核系微生物、特に単細
胞宿主における発現のため、多種多様な構成又は調節性
プロモーターが採用されうる。微生物における発現はＣ
ＥＲ１タンパク質の簡便な起源を担う。記載の転写開始
領域はとりわけ細菌及び酵母宿主、例えばＥ．コリ、
Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマ
イセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の領域、例えばベーターガラ
クトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥ等
である。
【００４９】実験 方法 エンハンサー／サプレッサー−ミュテーター・インヒビ
ター／欠損サプレッサー−ミュテータートランスポゾン
植物及びｅｃｅｒｉｆｅｒｕｍ突然変異体 実験は全てアラビドプシス・サリアナのＬａｎｄｓｂｅ
ｒｇ ｅｒｅｃｔａエコタイプで実施し、それは表現型
補完のために試験した化学的又は物理的誘導型ｅｃｅｒ
ｉｆｅｒｕｍ（ｃｅｒ）突然変異体の遺伝子基礎でもあ
る（突然変異体は全てＭ．Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ，Ｗａｇ
ｅｎｉｎｇｅｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙより提供）。スクリーニングのため、２５
種類のエンハンサー／サプレッサー−ミュテーター・イ
ンヒビター／欠損サプレッサー−ミュテーター（Ｅｎ／
Ｓｐｍ−Ｉ／ｄＳｐｍ）トランスポゾンタッギング系を
それぞれに植物体づつ温室の中で個々に成育させ、そし
てｃｅｒ突然変異について調べた。これらの細胞系は全
て２回自家受粉世代交代を経て得られ、複数のトランス
ポゾン性Ｉ／ｄＳｐｍ因子を伴うＴＥｎ２ Ｅｎ／Ｓｐ
ｍトランスポサーゼＴ−ＤＮＡ遺伝子座を含む一の植物
体から始めた（Ａａｒｔｓら、１９９５）。オリジナル
のｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９トランスポゾンタッギン
グ突然変異体は、約１５種のＩ／ｄＳｐｍ因子を含み、
且つＴＥｎ２ Ｔ−ＤＮＡに対してホモ接合体である系
Ｈ１２．１．６．２において見い出された。ＴＥｎ５は
別のより活性なＴ−ＤＮＡ遺伝子座を含み、そしてその
他のＩ／ｄＳｐｍ因子を含まない別のＥｎ／Ｓｐｍトラ
ンスポサーゼ系である。この系をｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐ
ｍ８９植物体と交配させ、そしてｃｅｒ１Ｆ2 植物体を
除去セクターに関してスクリーニングした。子孫のため
に成育させた植物は全て交差受粉を避けるためにＡｒａ
ｃｏｎコンテナー（Ｂｅｔａ Ｔｅｃｈ，Ｇｅｎｔ，Ｂ
ｅｌｇｉｕｍ）の中に保った。ｃｅｒ突然変異体の稔性
は相対湿度を高めるためにその植物をプラスチックバッ
グの中で密閉に保つことにより条件を整えた（Ｋｏｏｒ
ｎｎｅｅｆら、１９８９）。
ター／欠損サプレッサー−ミュテータートランスポゾン
植物及びｅｃｅｒｉｆｅｒｕｍ突然変異体 実験は全てアラビドプシス・サリアナのＬａｎｄｓｂｅ
ｒｇ ｅｒｅｃｔａエコタイプで実施し、それは表現型
補完のために試験した化学的又は物理的誘導型ｅｃｅｒ
ｉｆｅｒｕｍ（ｃｅｒ）突然変異体の遺伝子基礎でもあ
る（突然変異体は全てＭ．Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ，Ｗａｇ
ｅｎｉｎｇｅｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙより提供）。スクリーニングのため、２５
種類のエンハンサー／サプレッサー−ミュテーター・イ
ンヒビター／欠損サプレッサー−ミュテーター（Ｅｎ／
Ｓｐｍ−Ｉ／ｄＳｐｍ）トランスポゾンタッギング系を
それぞれに植物体づつ温室の中で個々に成育させ、そし
てｃｅｒ突然変異について調べた。これらの細胞系は全
て２回自家受粉世代交代を経て得られ、複数のトランス
ポゾン性Ｉ／ｄＳｐｍ因子を伴うＴＥｎ２ Ｅｎ／Ｓｐ
ｍトランスポサーゼＴ−ＤＮＡ遺伝子座を含む一の植物
体から始めた（Ａａｒｔｓら、１９９５）。オリジナル
のｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９トランスポゾンタッギン
グ突然変異体は、約１５種のＩ／ｄＳｐｍ因子を含み、
且つＴＥｎ２ Ｔ−ＤＮＡに対してホモ接合体である系
Ｈ１２．１．６．２において見い出された。ＴＥｎ５は
別のより活性なＴ−ＤＮＡ遺伝子座を含み、そしてその
他のＩ／ｄＳｐｍ因子を含まない別のＥｎ／Ｓｐｍトラ
ンスポサーゼ系である。この系をｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐ
ｍ８９植物体と交配させ、そしてｃｅｒ１Ｆ2 植物体を
除去セクターに関してスクリーニングした。子孫のため
に成育させた植物は全て交差受粉を避けるためにＡｒａ
ｃｏｎコンテナー（Ｂｅｔａ Ｔｅｃｈ，Ｇｅｎｔ，Ｂ
ｅｌｇｉｕｍ）の中に保った。ｃｅｒ突然変異体の稔性
は相対湿度を高めるためにその植物をプラスチックバッ
グの中で密閉に保つことにより条件を整えた（Ｋｏｏｒ
ｎｎｅｅｆら、１９８９）。
【００５０】ｃｅｒ１−ｍ共分離性Ｉ／ｄＳｐｍ因子の
同定及び隣接ゲノムＤＮＡの単離 オリジナルのｃｅｒ１−ｍ突然変異体を２回の世代交代
でＬａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａ野生型にもどし交配
させた。２世代目のもどし交配子孫植物からゲノムＤＮ
Ａを単離し、そしてＩ／ｄＳｐｍ因子の存在について試
験した。植物を全て自家受粉させ、そしてその子孫をｃ
ｅｒ１表現型の分離について試験して、２世代目のもど
し交配子孫におけるＩ／ｄＳｐｍ因子とｃｅｒ１表現型
との連結を確認した。ｃｅｒ１−連結Ｉ／ｄＳｐｍ８９
因子及びいくつかのその他の未連結Ｉ／ｄＳｐｍ因子を
含む植物由来のゲノムＤＮＡを、Ｉ／ｄＳｐｍ特異的逆
ＰＣＲ（ＩＰＣＲ：Ｍａｓｓｏｎら、１９９１）を経
て、Ｉ／ｄＳｐｍ８９の両側の隣接ＤＮＡを得るために
用いた。Ｉ／ｄＳｐｍの双方の末端逆リピーツに適合す
る配列番号１のプライマーを利用する更なるＰＣＲ増幅
は最小限のトランスポゾンＤＮＡを伴うフラグメントの
単離を可能にした。Ｉ／ｄＳｐｍ８９隣接配列に基づ
き、配列番号２のプライマー２及び配列番号３のプライ
マー３をデザインした。それはＩ／ｄＳｐｍ８９挿入部
位を占める１８９bpの野生型ＤＮＡフラグメントを増幅
させる。
同定及び隣接ゲノムＤＮＡの単離 オリジナルのｃｅｒ１−ｍ突然変異体を２回の世代交代
でＬａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａ野生型にもどし交配
させた。２世代目のもどし交配子孫植物からゲノムＤＮ
Ａを単離し、そしてＩ／ｄＳｐｍ因子の存在について試
験した。植物を全て自家受粉させ、そしてその子孫をｃ
ｅｒ１表現型の分離について試験して、２世代目のもど
し交配子孫におけるＩ／ｄＳｐｍ因子とｃｅｒ１表現型
との連結を確認した。ｃｅｒ１−連結Ｉ／ｄＳｐｍ８９
因子及びいくつかのその他の未連結Ｉ／ｄＳｐｍ因子を
含む植物由来のゲノムＤＮＡを、Ｉ／ｄＳｐｍ特異的逆
ＰＣＲ（ＩＰＣＲ：Ｍａｓｓｏｎら、１９９１）を経
て、Ｉ／ｄＳｐｍ８９の両側の隣接ＤＮＡを得るために
用いた。Ｉ／ｄＳｐｍの双方の末端逆リピーツに適合す
る配列番号１のプライマーを利用する更なるＰＣＲ増幅
は最小限のトランスポゾンＤＮＡを伴うフラグメントの
単離を可能にした。Ｉ／ｄＳｐｍ８９隣接配列に基づ
き、配列番号２のプライマー２及び配列番号３のプライ
マー３をデザインした。それはＩ／ｄＳｐｍ８９挿入部
位を占める１８９bpの野生型ＤＮＡフラグメントを増幅
させる。
【００５１】ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリースクリー
ニング 種々のアラビドプシス組織を代表する増幅ｃＤＮＡラム
ダライブラリー（Ｎｅｗｍａｎら、１９９４）並びにＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏ
ｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）及びＥｕ
ｒｏｐｅａｎ ＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒ
ｅ（Ｍａｘ−Ｄｅｌｂｒｕｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて得られたＬａ
ｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａゲノムライブリーをＩ／
ｄＳｐｍ８９ ＩＰＣＲフラグメントプローブによりス
クリーニングした。ゲノムクローンのＤＮＡインサート
をＥｃｏＲＩフラグメントとしてサブクローニングし
た。
ニング 種々のアラビドプシス組織を代表する増幅ｃＤＮＡラム
ダライブラリー（Ｎｅｗｍａｎら、１９９４）並びにＡ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏ
ｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）及びＥｕ
ｒｏｐｅａｎ ＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒ
ｅ（Ｍａｘ−Ｄｅｌｂｒｕｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて得られたＬａ
ｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａゲノムライブリーをＩ／
ｄＳｐｍ８９ ＩＰＣＲフラグメントプローブによりス
クリーニングした。ゲノムクローンのＤＮＡインサート
をＥｃｏＲＩフラグメントとしてサブクローニングし
た。
【００５２】ＤＮＡ及びＲＮＡ分析 ＤＮＡ及びＲＮＡゲルブロットを６５℃にて一夜標準式
にハイブリダイズさせ、そして６５℃で２×のＳＳＣ
（１×のＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ，０．０１５Ｍ
のクエン酸ナトリウム）、１％のＳＤＳ又は（よりスト
リンジェンシーとするのに）０．１×のＳＳＣ，１％の
ＳＤＳで２回洗った。ＤＮＡ配列はＡＢＩＳｅｑｕｅｎ
ｃｅｒを利用して決定した。ＣＥＲ１ ｃＤＮＡ Ｓａ
ｌＩ及びＳａｌＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+ の中にサブクローニングし、そし
て配列決定した。二本鎖ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ特異性プ
ライマー１（配列番号４）、プライマー４（配列番号
５）、プライマー５（配列番号６）及びプライマー６
（配列番号７）を利用して完成させた（ＩｓｏｇｅｎＢ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。同じプラ
イマー並びにＩ／ｄＳｐｍ８９に隣接するプライマー２
及び３を、Ｉ／ｄＳｐｍ末端逆リピーツプライマー
（Ｔ：図８〜１０）との組合せで、突然変異ｃｅｒ１セ
クターをもたらすＣＥＲ１における新たな挿入を試験す
るために用いた。プライマー１〜６及びＴについてのＰ
ＣＲ条件は９４℃で５分、次いで９４℃（３０秒）、５
５℃（３０秒）及び７２℃（３分）の３０サイクルとす
る。ｃＤＮＡ配列に加えて、ＣＥＲ１開始コドンの１６
５６bp上流に至るまでの一本鎖ゲノムＤＮＡの配列を決
定した。ｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列をＰＣ／Ｇ
ｅｎｅコンピューターパッケージ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）を用いて分析した。
にハイブリダイズさせ、そして６５℃で２×のＳＳＣ
（１×のＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ，０．０１５Ｍ
のクエン酸ナトリウム）、１％のＳＤＳ又は（よりスト
リンジェンシーとするのに）０．１×のＳＳＣ，１％の
ＳＤＳで２回洗った。ＤＮＡ配列はＡＢＩＳｅｑｕｅｎ
ｃｅｒを利用して決定した。ＣＥＲ１ ｃＤＮＡ Ｓａ
ｌＩ及びＳａｌＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+ の中にサブクローニングし、そし
て配列決定した。二本鎖ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ特異性プ
ライマー１（配列番号４）、プライマー４（配列番号
５）、プライマー５（配列番号６）及びプライマー６
（配列番号７）を利用して完成させた（ＩｓｏｇｅｎＢ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。同じプラ
イマー並びにＩ／ｄＳｐｍ８９に隣接するプライマー２
及び３を、Ｉ／ｄＳｐｍ末端逆リピーツプライマー
（Ｔ：図８〜１０）との組合せで、突然変異ｃｅｒ１セ
クターをもたらすＣＥＲ１における新たな挿入を試験す
るために用いた。プライマー１〜６及びＴについてのＰ
ＣＲ条件は９４℃で５分、次いで９４℃（３０秒）、５
５℃（３０秒）及び７２℃（３分）の３０サイクルとす
る。ｃＤＮＡ配列に加えて、ＣＥＲ１開始コドンの１６
５６bp上流に至るまでの一本鎖ゲノムＤＮＡの配列を決
定した。ｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列をＰＣ／Ｇ
ｅｎｅコンピューターパッケージ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）を用いて分析した。
【００５３】データーベースサーチ ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｎｌら、１９９
０）を用いＣＥＲ１相同体についてＧｅｎＢａｎｋ及び
ＥＳＴデーターベースをサーチした。報告の相同性配列
のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、セネシオ・オドルス（Ｓ
ｅｎｅｃｉｏ ｏｄｏｒｕｓ）ＳＯＬＩＰＴＲＢ部分ｃ
ＤＮＡについてはＬ３３７９２；ＣＥＲ１ｃＤＮＡとほ
ぼ１００％の同一性を有する２種のアラビドプシスＥＳ
ＴについてはＴ２２４２０及びＺ１８４１８；アラビド
プシスＡＴＴＳ１００１ＥＳＴについてはＺ２５４８
７；ブラッシカ カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔ
ｒｉｓ）ＥＳＴについてはＬ３５８３５；ポテトＥＳＴ
についてはＲ２７５４３；トウモロコシＥＳＴについて
はＴ７０６５７；ＣＥＲ１に対してＮ末端相同性を有す
る２種のコメＥＳＴについてはＤ１５３２４及びＤ２２
３０８；内部相同性を有する２種のコメＥＳＴについて
はＤ４０６５８及びＤ２３９９６である。４種のコメＥ
ＳＴに対応するｃＤＮＡクローンはＲｉｃｅ Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＴＡＴＦ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、日本国茨城県）のナガムラ ヨ
シアキ氏より贈呈された。Ｄ１５３２４及びＤ２２３０
８の双方の５’末端をフレームシフト及びオリジナルデ
ーターベース配列において見い出せるその他の遇発的な
誤解読の補正のために再配列決定した。
０）を用いＣＥＲ１相同体についてＧｅｎＢａｎｋ及び
ＥＳＴデーターベースをサーチした。報告の相同性配列
のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、セネシオ・オドルス（Ｓ
ｅｎｅｃｉｏ ｏｄｏｒｕｓ）ＳＯＬＩＰＴＲＢ部分ｃ
ＤＮＡについてはＬ３３７９２；ＣＥＲ１ｃＤＮＡとほ
ぼ１００％の同一性を有する２種のアラビドプシスＥＳ
ＴについてはＴ２２４２０及びＺ１８４１８；アラビド
プシスＡＴＴＳ１００１ＥＳＴについてはＺ２５４８
７；ブラッシカ カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔ
ｒｉｓ）ＥＳＴについてはＬ３５８３５；ポテトＥＳＴ
についてはＲ２７５４３；トウモロコシＥＳＴについて
はＴ７０６５７；ＣＥＲ１に対してＮ末端相同性を有す
る２種のコメＥＳＴについてはＤ１５３２４及びＤ２２
３０８；内部相同性を有する２種のコメＥＳＴについて
はＤ４０６５８及びＤ２３９９６である。４種のコメＥ
ＳＴに対応するｃＤＮＡクローンはＲｉｃｅ Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＴＡＴＦ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、日本国茨城県）のナガムラ ヨ
シアキ氏より贈呈された。Ｄ１５３２４及びＤ２２３０
８の双方の５’末端をフレームシフト及びオリジナルデ
ーターベース配列において見い出せるその他の遇発的な
誤解読の補正のために再配列決定した。
【００５４】参考文献 Aarts, M. G. M., Dirkse, W. G., Stiekema, W. J., a
nd Pereira, A. (1993)。Transposon tagging of a mal
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17 。Aarts, M. G. M., Corzaan, P., Stiekema, W.
J., and Pereira, A. (1995) 。A two-element Enhance
r-Inhibitor transposon system in Arabidopsis thali
ana. Mol. Gen. Genet. 247, 555-564 。Altschul, S.
F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipma
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tol. 73, 955-966 。Bevan, M. A. (1984) Binary Agro
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Acids Res. 12, 8711-8712 。
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【００６３】
配列番号：１ 5'-GACACTCCTTAGATCTTTTCTTGTAGTG-3'
【００６４】配列番号：２ 5'-GGAGCATGAGAATTGCAGATACC-3'
【００６５】配列番号：３ 5'-GGCGTCGTCAGGTGAGTTAAGTGC-3'
【００６６】配列番号：４ 5'-GGCCTCCGGCAATAGGTTGATG-3'
【００６７】配列番号：５ 5'-GGTGCTTAGTCTGGGTCTCATG-3'
【００６８】配列番号：６ 5'-CACAGGAGTGGACATTCACCAGAG-3' 配列番号：７ 5'-CGCATGAGTGTGGCACATCCC-3'
【図１】アラビドプシス・サリアナＣＥＲ１遺伝子の部
分ヌクレオチド配列。
分ヌクレオチド配列。
【図２】図１の続き。
【図３】アラビドプシス・サリアナＣＥＲ１ ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列。
のヌクレオチド配列。
【図４】図３の続き。
【図５】図４の続き。
【図６】アラビドプシス・サリアナＣＥＲ１遺伝子のプ
ロモーターのヌクレオチド配列。
ロモーターのヌクレオチド配列。
【図７】図６の続き。
【図８】ＣＥＲ１推定アミノ酸配列及び相同性アミノ酸
配列との対比。 （Ａ）セネシオ・オドルス由来のＳＯＬＩＰＴＲＢ（Ｓ
ＯＬＩＰＴ）の部分ｃＤＮＡ配列由来の及びアラビドプ
シス由来のＡＴＴＳ１００１（ＡＴ１００１）由来の相
同性アミノ酸配列と対比させたＣＥＲ１ ｃＤＮＡ（Ｃ
ＥＲ１）から推定したアミノ酸配列。ＣＥＲ１アミノ酸
配列中の２種の膜スパニング配列に上線を付した。ヒス
チジンリッチモチーフに下線を付した。ＣＥＲ１アミノ
酸配列中の推定グリコシル化アスパラギン残基に表示（
* ）をし、そしてｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９突然変異
体におけるリーディングフレームを破綻せしめるＩ／ｄ
Ｓｐｍ８９の挿入により生ずる標的部位二量化の箇所に
（↓）をつけた。点はＳＯＬＩＰＴＲＢ及びＡＴＴＳ１
００１ ｃＤＮＡが部分的であることを示し、且つ完全
アミノ酸配列のＮ末端が欠失していることを示す。 （Ｂ）約８０個のアミノ酸のＮ末端鎖。ＣＥＲ１タンパ
ク質と、２種のコメｃＤＮＡクローン（Ｄ１５３２４及
びＤ２２３０８）から推定した２種のアミノ酸配列との
間に全体で３７．５％の同一性がある。網かけ枠は類似
のアミノ酸残基を示し、同一のアミノ酸残基は太字で示
す。類似の残基は以下のようにグループ分けする：
（Ｖ，Ｌ，ＩＭ），（Ｓ，Ｔ），（Ｑ，Ｎ，Ｅ，Ｄ），
（Ｋ，Ｒ），（Ｇ，Ａ）及び（Ｆ，Ｗ，Ｙ）。
配列との対比。 （Ａ）セネシオ・オドルス由来のＳＯＬＩＰＴＲＢ（Ｓ
ＯＬＩＰＴ）の部分ｃＤＮＡ配列由来の及びアラビドプ
シス由来のＡＴＴＳ１００１（ＡＴ１００１）由来の相
同性アミノ酸配列と対比させたＣＥＲ１ ｃＤＮＡ（Ｃ
ＥＲ１）から推定したアミノ酸配列。ＣＥＲ１アミノ酸
配列中の２種の膜スパニング配列に上線を付した。ヒス
チジンリッチモチーフに下線を付した。ＣＥＲ１アミノ
酸配列中の推定グリコシル化アスパラギン残基に表示（
* ）をし、そしてｃｅｒ１::Ｉ／ｄＳｐｍ８９突然変異
体におけるリーディングフレームを破綻せしめるＩ／ｄ
Ｓｐｍ８９の挿入により生ずる標的部位二量化の箇所に
（↓）をつけた。点はＳＯＬＩＰＴＲＢ及びＡＴＴＳ１
００１ ｃＤＮＡが部分的であることを示し、且つ完全
アミノ酸配列のＮ末端が欠失していることを示す。 （Ｂ）約８０個のアミノ酸のＮ末端鎖。ＣＥＲ１タンパ
ク質と、２種のコメｃＤＮＡクローン（Ｄ１５３２４及
びＤ２２３０８）から推定した２種のアミノ酸配列との
間に全体で３７．５％の同一性がある。網かけ枠は類似
のアミノ酸残基を示し、同一のアミノ酸残基は太字で示
す。類似の残基は以下のようにグループ分けする：
（Ｖ，Ｌ，ＩＭ），（Ｓ，Ｔ），（Ｑ，Ｎ，Ｅ，Ｄ），
（Ｋ，Ｒ），（Ｇ，Ａ）及び（Ｆ，Ｗ，Ｙ）。
【図９】ＣＥＲ１ ＤＮＡから推定したアミノ酸配列。
【図１０】図９の続き。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アンディ ペレイラ オランダ国，6716 ヘーヘー エーディー エー，インディラ ハンディシンヘル 14 (72)発明者 ウィルヘルムス ヨハネス スティーケマ オランダ国，6708 ベーヘー ワーゲニン ゲン，フルットウェイド 197
Claims (15)
- 【請求項１】 図９〜１０に示すアミノ酸配列を含んで
成るタンパク質又はそれと実質的に相同性であり且つ脂
肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク
質をコードするＤＮＡフラグメント。 - 【請求項２】 図３〜５に示すヌクレオチド配列又は相
同性のヌクレオチド配列を含んで成る請求項１記載のＤ
ＮＡフラグメント。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡフラグメン
トのプロモーター、ここでこのプロモーターは図６〜７
に示すヌクレオチド配列を有する、又は相同性ＤＮＡフ
ラグメントのプロモーターを含んで成るＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のＤＮＡフラグメン
トを含んで成る組換ＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 前記ＤＮＡフラグメントが宿主細胞の中
で前記ＤＮＡフラグメントの過剰発現を及ぼすことので
きるＤＮＡ配列と作用可能式に連結されている、請求項
４記載の組換ＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 前記ＤＮＡフラグメントの発現を駆動せ
しめるＤＮＡ配列が請求項３において規定するプロモー
ターである、請求項５記載の組換ＤＮＡ分子。 - 【請求項７】 宿主細胞の中での請求項１又は２におい
て規定するＤＮＡフラグメントの発現を阻害することの
できる阻害遺伝子を含んで成る組換ＤＮＡ分子であっ
て、この阻害遺伝子がそれを発現させることのできるＤ
ＮＡ配列と作用可能式に連結されている、組換ＤＮＡ分
子。 - 【請求項８】 前記阻害遺伝子の発現を駆動するＤＮＡ
配列が請求項３において規定するプロモーターである請
求項７記載の組換ＤＮＡ分子。 - 【請求項９】 請求項４〜８のいづれか１項記載の組換
ＤＮＡ分子を宿主細胞に移入することによって形質転換
宿主細胞を獲得する方法。 - 【請求項１０】 請求項５又は６において規定する組換
ＤＮＡ分子を細菌宿主細胞に移入する、請求項９記載の
方法。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の方法により得られる
形質転換細菌細胞。 - 【請求項１２】 図８〜１０に示すアミノ酸配列を含ん
で成るタンパク質又はそれと実質的に相同性であり且つ
脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパ
ク質を製造するための方法であって、請求項１１記載の
形質転換細菌細胞を適当な培養培地の中で培養し、そし
て前記タンパク質を単離することを含んで成る方法。 - 【請求項１３】 改変エピクチクラ蝋（ＥＷ）組成を示
す形質転換植物を獲得するための方法であって： ａ）請求項５〜８のいづれか１項記載の組換ＤＮＡ分子
を植物細胞に移入する； ｂ）前記組換ＤＮＡ分子の組込まれた細胞から完全植物
を発生させる；そして ｃ）改変ＥＷ組成を示す植物を選定する；工程を含んで
成る方法。 - 【請求項１４】 請求項１３記載の方法により得られる
形質転換植物。 - 【請求項１５】 請求項１４記載の植物から誘導できる
細胞、果実、種子又は子孫。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95203329A EP0776973A1 (en) | 1995-12-08 | 1995-12-08 | Fatty aldehyde decarbonylase for transforming bacterial cells and plants |
| NL95203329:8 | 1995-12-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09322780A true JPH09322780A (ja) | 1997-12-16 |
Family
ID=8220904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8342685A Pending JPH09322780A (ja) | 1995-12-08 | 1996-12-06 | 脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードするｄｎａフラグメント、前記フラグメントを含んで成る組換分子、並びに形質転換細胞及び植物を獲得するための方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6437218B1 (ja) |
| EP (1) | EP0776973A1 (ja) |
| JP (1) | JPH09322780A (ja) |
| CA (1) | CA2192260C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013129393A1 (ja) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | トヨタ自動車株式会社 | 炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用 |
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|---|---|---|---|---|
| AU1919901A (en) * | 1999-11-17 | 2001-05-30 | Luc Adam | Pathogen tolerance genes |
| EP2285948B1 (en) * | 2008-03-03 | 2014-01-08 | Joule Unlimited Technologies, Inc. | Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest |
| PH12013500158A1 (en) | 2010-07-26 | 2013-03-11 | Genomatica Inc | Microorganisms and methods for the biosynthesis of aromatics, 2,4-pentadienoate and 1,3-butadiene |
| CN108823220B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-07-20 | 山东农业大学 | 一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1的克隆及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE921206A1 (en) * | 1991-04-16 | 1992-10-21 | Mogen Int | Male-sterile plants, method for obtaining male-sterile¹plants and recombinant dna for use therein |
| US6060644A (en) * | 1994-03-24 | 2000-05-09 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Isolation and use of cuticular lipid genes |
-
1995
- 1995-12-08 EP EP95203329A patent/EP0776973A1/en not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-12-05 US US08/759,436 patent/US6437218B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-06 CA CA002192260A patent/CA2192260C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-06 JP JP8342685A patent/JPH09322780A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013129393A1 (ja) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | トヨタ自動車株式会社 | 炭化水素合成酵素遺伝子及びその利用 |
| US9663799B2 (en) | 2012-02-27 | 2017-05-30 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Hydrocarbon synthase gene and use thereof |
| US9957497B2 (en) | 2012-02-27 | 2018-05-01 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Hydrocarbon synthase gene and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6437218B1 (en) | 2002-08-20 |
| CA2192260C (en) | 2009-02-17 |
| CA2192260A1 (en) | 1997-06-09 |
| EP0776973A1 (en) | 1997-06-04 |
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