JPH09324000A - インターロイキン−２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体 - Google Patents
インターロイキン−２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 免疫原性や副作用がきわめて少なくかつ製造
時の収量等の点でも実用に耐えうるもので抗癌剤として
有用であるのみならず、免疫疾患の治療にも有用な医薬
を製造する。 【課題手段】インターロイキン−２受容体を特異的に認
識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体、ならびに上
記接合体を有効成分とする医薬組成物。
時の収量等の点でも実用に耐えうるもので抗癌剤として
有用であるのみならず、免疫疾患の治療にも有用な医薬
を製造する。 【課題手段】インターロイキン−２受容体を特異的に認
識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体、ならびに上
記接合体を有効成分とする医薬組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はインターロイキン−
２受容体（ＩＬ−２Ｒと略す。以下、同じ。）を特異的
に認識する因子とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅと略
す。以下、同じ。）との接合体（conjugate）およびこ
れを有効成分とする医薬組成物に関する。
２受容体（ＩＬ−２Ｒと略す。以下、同じ。）を特異的
に認識する因子とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅと略
す。以下、同じ。）との接合体（conjugate）およびこ
れを有効成分とする医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】固形癌に有効な抗癌剤が少ないことや多
剤耐性癌細胞の出現などから新しい作用機序を持つ抗癌
剤の開発が望まれている。さらに、副作用の軽減や効果
増強を目指した Drug Delivery System （ＤＤＳ）の研
究も盛んである。しかし、未だ満足するものは得られて
いない。
剤耐性癌細胞の出現などから新しい作用機序を持つ抗癌
剤の開発が望まれている。さらに、副作用の軽減や効果
増強を目指した Drug Delivery System （ＤＤＳ）の研
究も盛んである。しかし、未だ満足するものは得られて
いない。
【０００３】本願発明者は、これらの状況を打破すべ
く、トキシンや抗癌剤などとモノクローナル抗体との接
合体を作製し、従来にはない利点を有した治療薬となる
可能性を in vitro や in vivoでの実験系で明らかにし
てきた（Hirota, N. et al., Cancer Res. 49:7106-710
9, 1989）が、その構造に異種蛋白を含んでいることか
ら生じる問題点を解決しえなかった。すなわち、モノク
ローナル抗体にトキシンを化学結合させたタンパク（イ
ムノトキシン）は異種蛋白でありヒトに投与すると副作
用として capillary leak syndrome を生じたり、長期
にわたる反復投与ができないという欠点がある。
く、トキシンや抗癌剤などとモノクローナル抗体との接
合体を作製し、従来にはない利点を有した治療薬となる
可能性を in vitro や in vivoでの実験系で明らかにし
てきた（Hirota, N. et al., Cancer Res. 49:7106-710
9, 1989）が、その構造に異種蛋白を含んでいることか
ら生じる問題点を解決しえなかった。すなわち、モノク
ローナル抗体にトキシンを化学結合させたタンパク（イ
ムノトキシン）は異種蛋白でありヒトに投与すると副作
用として capillary leak syndrome を生じたり、長期
にわたる反復投与ができないという欠点がある。
【０００４】最近になって、ウシ膵臓由来のＲＮａｓｅ
が顕著な抗癌性および抗ＨＩＶ活性を有することが報告
されている（Vescia, S. et al., Cancer Res. 40:3740
-3744, 1980; Wu, Y.N. et al., J. Biol. Chem. 268:1
0686-10693, 1993; Nitta, K. et al., Cancer Res. 5
4:920-927, 1994; Youle, R. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91:6012-6016, 1994）。これらの報告はウ
シＲＮａｓｅがヒトに免疫原性を示さない限り、治療目
的に使用できる可能性を示唆する。しかしながら、ヒト
ＲＮａｓｅのこのような活性は報告されていなかった。
が顕著な抗癌性および抗ＨＩＶ活性を有することが報告
されている（Vescia, S. et al., Cancer Res. 40:3740
-3744, 1980; Wu, Y.N. et al., J. Biol. Chem. 268:1
0686-10693, 1993; Nitta, K. et al., Cancer Res. 5
4:920-927, 1994; Youle, R. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 91:6012-6016, 1994）。これらの報告はウ
シＲＮａｓｅがヒトに免疫原性を示さない限り、治療目
的に使用できる可能性を示唆する。しかしながら、ヒト
ＲＮａｓｅのこのような活性は報告されていなかった。
【０００５】本発明者は、各種組織や細胞に広く存在し
ているヒトＲＮａｓｅにも同様の活性があるかを研究
し、ヒトＲＮａｓｅによりヒト由来の細胞を死滅させう
ることを見いだした（Jinno, H. et al., Life Science
58(21):190-198, 1996）。ＲＮａｓｅは、ヒト生理活
性物質として元々ヒトに存在している物質であるため、
免疫原性はきわめて少なく、またその生物活性や動態が
既に判明しているので、投与に伴う副作用も多くの点で
予測可能であるなど、治療薬への応用に関して優れた利
点を有していることが期待された。そこで、このような
殺細胞活性をもつＲＮａｓｅと特定の組織や細胞を特異
的に認識する物質とを組み合わせることによる、特定組
織や細胞に特異的な新規な治療薬の開発を行ってきた。
ているヒトＲＮａｓｅにも同様の活性があるかを研究
し、ヒトＲＮａｓｅによりヒト由来の細胞を死滅させう
ることを見いだした（Jinno, H. et al., Life Science
58(21):190-198, 1996）。ＲＮａｓｅは、ヒト生理活
性物質として元々ヒトに存在している物質であるため、
免疫原性はきわめて少なく、またその生物活性や動態が
既に判明しているので、投与に伴う副作用も多くの点で
予測可能であるなど、治療薬への応用に関して優れた利
点を有していることが期待された。そこで、このような
殺細胞活性をもつＲＮａｓｅと特定の組織や細胞を特異
的に認識する物質とを組み合わせることによる、特定組
織や細胞に特異的な新規な治療薬の開発を行ってきた。
【０００６】一般に、増殖因子受容体を過剰発現してい
る癌細胞では悪性度が高く、従来の治療法では治癒させ
ることはできず、細胞膜上に発現する増殖因子受容体を
分子標的としたターゲット療法が必要である（Ozawa,
S., Cancer Res. 63:2169-2173, 19 ; Kitazawa, Y.,
Clin. Cancer Res. in press; Ikeda, Y., Annals ofTh
oracic Surgery, in press）。最近、本発明者は、副作
用の軽減や効果増強を目指した抗癌剤として、ヒト上皮
増殖因子受容体を過剰発現する癌細胞を認識するヒト上
皮増殖因子（ＥＧＦ）とＲＮａｓｅの接合体を作成した
ところ、ＥＧＦ受容体に依存した殺細胞効果が認められ
た（Jinno, H. et al., Cancer Chemotherapy and Phar
macology 38:303-308, 1996）。
る癌細胞では悪性度が高く、従来の治療法では治癒させ
ることはできず、細胞膜上に発現する増殖因子受容体を
分子標的としたターゲット療法が必要である（Ozawa,
S., Cancer Res. 63:2169-2173, 19 ; Kitazawa, Y.,
Clin. Cancer Res. in press; Ikeda, Y., Annals ofTh
oracic Surgery, in press）。最近、本発明者は、副作
用の軽減や効果増強を目指した抗癌剤として、ヒト上皮
増殖因子受容体を過剰発現する癌細胞を認識するヒト上
皮増殖因子（ＥＧＦ）とＲＮａｓｅの接合体を作成した
ところ、ＥＧＦ受容体に依存した殺細胞効果が認められ
た（Jinno, H. et al., Cancer Chemotherapy and Phar
macology 38:303-308, 1996）。
【０００７】しかしながら、ＥＧＦ−ＲＮａｓｅ接合体
は製造時の収量が悪く、実用には向かないという問題が
存在する。また、ＥＧＦは免疫系の細胞を特異的に認識
することはないので、ＥＧＦ−ＲＮａｓｅ接合体による
免疫疾患の治療は期待できず、免疫疾患にも有効な接合
体が求められていた。
は製造時の収量が悪く、実用には向かないという問題が
存在する。また、ＥＧＦは免疫系の細胞を特異的に認識
することはないので、ＥＧＦ−ＲＮａｓｅ接合体による
免疫疾患の治療は期待できず、免疫疾患にも有効な接合
体が求められていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】そこで、免疫原性や副
作用がきわめて少なくかつ製造時の収量等の点でも実用
に耐えうるもので抗癌剤として有用であるのみならず、
免疫疾患の治療にも有用な医薬を製造することが本発明
の目的である。
作用がきわめて少なくかつ製造時の収量等の点でも実用
に耐えうるもので抗癌剤として有用であるのみならず、
免疫疾患の治療にも有用な医薬を製造することが本発明
の目的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
鋭意検討したところ、本願発明者はインターロイキン−
２（ＩＬ−２と略す。以下、同じ。）とＲＮａｓｅとの
接合体による癌細胞等のＩＬ−２Ｒ過剰発現細胞に対す
る殺細胞効果を見いだし、本発明を完成させた。
鋭意検討したところ、本願発明者はインターロイキン−
２（ＩＬ−２と略す。以下、同じ。）とＲＮａｓｅとの
接合体による癌細胞等のＩＬ−２Ｒ過剰発現細胞に対す
る殺細胞効果を見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】すなわち、本発明は、インターロイキン−
２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼと
の接合体を提供する。
２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼと
の接合体を提供する。
【００１１】本発明はさらに、上記接合体を有効成分と
する医薬組成物を提供する。
する医薬組成物を提供する。
【００１２】本発明において、ＩＬ−２Ｒを特異的に認
識する因子とはＩＬ−２、その活性断片、ＩＬ−２Ｒ抗
体またはその活性断片などのＩＬ−２Ｒに親和性を有す
るあらゆる物質を意味する。すなわち、本発明における
ＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子とはＩＬ−２Ｒに対
する親和性を有するものであればよく、125 Ｉ−ＩＬ−
２を用いる competitive assay（新生化学実験講座１２
「分子免疫学Ｉ−免疫細胞・サイトカイン−」 p.170-1
76, 東京化学同人, 1989）などの方法で検出されるあら
ゆる物質を含む。ＩＬ−２Ｒはα鎖、β鎖、γ鎖からな
るが、それぞれの鎖あるいはその組み合わせに対して親
和性を持つあらゆる物質も含まれる。これらのＩＬ−２
Ｒを特異的に認識する因子は天然由来のものであって
も、遺伝子工学的手法で製造したものであってもよい。
識する因子とはＩＬ−２、その活性断片、ＩＬ−２Ｒ抗
体またはその活性断片などのＩＬ−２Ｒに親和性を有す
るあらゆる物質を意味する。すなわち、本発明における
ＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子とはＩＬ−２Ｒに対
する親和性を有するものであればよく、125 Ｉ−ＩＬ−
２を用いる competitive assay（新生化学実験講座１２
「分子免疫学Ｉ−免疫細胞・サイトカイン−」 p.170-1
76, 東京化学同人, 1989）などの方法で検出されるあら
ゆる物質を含む。ＩＬ−２Ｒはα鎖、β鎖、γ鎖からな
るが、それぞれの鎖あるいはその組み合わせに対して親
和性を持つあらゆる物質も含まれる。これらのＩＬ−２
Ｒを特異的に認識する因子は天然由来のものであって
も、遺伝子工学的手法で製造したものであってもよい。
【００１３】リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）とはＲＮ
Ａを分解する作用を有するあらゆる物質のことであり、
ＲＮエース、ＲＮアーゼと略記することもある。ＲＮＡ
（リボ核酸）分解酵素ともいう。ヒトではＲＮａｓｅ１
を初めとする数種のＲＮａｓｅの存在することが知られ
ている。これらの各種ＲＮａｓｅのみならず、その修飾
物や変異体もＲＮＡを分解する作用を有する限り本発明
のリボヌクレアーゼに含まれる。ＲＮａｓｅの修飾物と
は例えばＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒが結合する部
分（例えば、ヒトＲＮａｓｅ １のＮ末端にある数アミ
ノ酸）を欠落するなどの修飾がなされているが、いまだ
ＲＮＡ分解活性を有するものが挙げられる。ＲＮａｓｅ
は天然由来のものであっても、遺伝子工学的手法で製造
したものであってもよい。
Ａを分解する作用を有するあらゆる物質のことであり、
ＲＮエース、ＲＮアーゼと略記することもある。ＲＮＡ
（リボ核酸）分解酵素ともいう。ヒトではＲＮａｓｅ１
を初めとする数種のＲＮａｓｅの存在することが知られ
ている。これらの各種ＲＮａｓｅのみならず、その修飾
物や変異体もＲＮＡを分解する作用を有する限り本発明
のリボヌクレアーゼに含まれる。ＲＮａｓｅの修飾物と
は例えばＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒが結合する部
分（例えば、ヒトＲＮａｓｅ １のＮ末端にある数アミ
ノ酸）を欠落するなどの修飾がなされているが、いまだ
ＲＮＡ分解活性を有するものが挙げられる。ＲＮａｓｅ
は天然由来のものであっても、遺伝子工学的手法で製造
したものであってもよい。
【００１４】ＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子とＲＮ
ａｓｅの接合とは、両者の作用が発揮される状態で両者
が化学的に結合している状態をいい、接合体は当業者に
おいて通常用いられている各種手段で製造することがで
きる。
ａｓｅの接合とは、両者の作用が発揮される状態で両者
が化学的に結合している状態をいい、接合体は当業者に
おいて通常用いられている各種手段で製造することがで
きる。
【００１５】接合体は化学合成法で製造することが可能
である。例えば、ＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子、
例えばＩＬ−２を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸−Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）等で修飾して
チオール基を導入し、一方で２−イミノチオラン（ 2-i
minothiolane）等によりＲＮａｓｅにチオール基を導入
し、両者をＳ−Ｓ結合を介して接合させることにより、
製造できる。
である。例えば、ＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子、
例えばＩＬ−２を３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸−Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）等で修飾して
チオール基を導入し、一方で２−イミノチオラン（ 2-i
minothiolane）等によりＲＮａｓｅにチオール基を導入
し、両者をＳ−Ｓ結合を介して接合させることにより、
製造できる。
【００１６】本発明の、ＩＬ−２Ｒを特異的に認識する
因子とＲＮａｓｅとの接合体は、遺伝子工学的に製造す
ることも可能である。例えば、ヒトＩＬ−２をコードす
るＤＮＡとヒトＲＮａｓｅをコードするＤＮＡとからな
る遺伝子をプラスミドに組み込み、この融合蛋白を効率
的に発現する宿主細胞中で発現させることにより、例え
ば、ＲＮａｓｅのＣ末端にＩＬ−２のＮ末端を遺伝子レ
ベルで結合させたタンパクを製造することができる。
因子とＲＮａｓｅとの接合体は、遺伝子工学的に製造す
ることも可能である。例えば、ヒトＩＬ−２をコードす
るＤＮＡとヒトＲＮａｓｅをコードするＤＮＡとからな
る遺伝子をプラスミドに組み込み、この融合蛋白を効率
的に発現する宿主細胞中で発現させることにより、例え
ば、ＲＮａｓｅのＣ末端にＩＬ−２のＮ末端を遺伝子レ
ベルで結合させたタンパクを製造することができる。
【００１７】ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡは例え
ばＡＴＣＣから入手することができる。また、ヒトＲＮ
ａｓｅをコードするｃＤＮＡは例えば文献記載の方法で
得られたｃＤＮＡ（Seno, M., et al., Biochim. Bioph
ys. Acta 1218:466-468, 1994; Futami, J. et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. 216:406-413, 1995）を
用いることができる。
ばＡＴＣＣから入手することができる。また、ヒトＲＮ
ａｓｅをコードするｃＤＮＡは例えば文献記載の方法で
得られたｃＤＮＡ（Seno, M., et al., Biochim. Bioph
ys. Acta 1218:466-468, 1994; Futami, J. et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. 216:406-413, 1995）を
用いることができる。
【００１８】遺伝子工学的製造技術は、上記の、ＩＬ−
２Ｒを特異的に認識する因子とＲＮａｓｅとの接合体と
同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換
したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列また
はその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１〜
複数個のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチドを用いて既知の手法に従って行
えばよく、特に限定されないが、シグナル配列の付加や
改良、宿主−ベクター系の好適な選択、遺伝子の発現制
御部位の改良等により発現効率の調節などを図ることが
できる。また、宿主の選択により糖鎖が結合されたもの
として得てもよい。
２Ｒを特異的に認識する因子とＲＮａｓｅとの接合体と
同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換
したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列また
はその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１〜
複数個のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチドを用いて既知の手法に従って行
えばよく、特に限定されないが、シグナル配列の付加や
改良、宿主−ベクター系の好適な選択、遺伝子の発現制
御部位の改良等により発現効率の調節などを図ることが
できる。また、宿主の選択により糖鎖が結合されたもの
として得てもよい。
【００１９】得られた融合タンパク質は当分野で公知の
方法により分離、精製を行うことができる。これの方法
には遠心分離、硫酸アンモニウム塩析、各種カラムクロ
マトグラフィーなどを含むがこれに限定されない。
方法により分離、精製を行うことができる。これの方法
には遠心分離、硫酸アンモニウム塩析、各種カラムクロ
マトグラフィーなどを含むがこれに限定されない。
【００２０】本発明の接合体は、薬理的に許容しうる担
体、賦形剤、希釈剤などと混合して医薬組成物とするこ
とができる。本発明の医薬組成物は、ペプチド医薬に一
般に使用されている投与方法、すなわち非経口投与方
法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによ
って投与するのが好ましい。経口投与した場合、本発明
の医薬組成物は消化管内で分解を受けるため、この投与
方法は一般的には効果的でないが、消化管内で分解を受
けにくい製剤、例えば活性成分である本発明の接合体を
リポソーム中に抱容したマイクロカプセル剤として経口
投与することも可能である。また、直腸、鼻内、舌下な
どの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能
である。この場合は座剤、点鼻スプレー、舌下錠といっ
た形態で投与することができる。
体、賦形剤、希釈剤などと混合して医薬組成物とするこ
とができる。本発明の医薬組成物は、ペプチド医薬に一
般に使用されている投与方法、すなわち非経口投与方
法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによ
って投与するのが好ましい。経口投与した場合、本発明
の医薬組成物は消化管内で分解を受けるため、この投与
方法は一般的には効果的でないが、消化管内で分解を受
けにくい製剤、例えば活性成分である本発明の接合体を
リポソーム中に抱容したマイクロカプセル剤として経口
投与することも可能である。また、直腸、鼻内、舌下な
どの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能
である。この場合は座剤、点鼻スプレー、舌下錠といっ
た形態で投与することができる。
【００２１】本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の種
類、患者の年齢、体重、症状の程度および投与経路など
によっても異なるが、一般的に０．１μｇ／ｋｇ体重〜
１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができる。
０．５μｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与
するのが好ましく、１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体
重がさらに好ましい。
類、患者の年齢、体重、症状の程度および投与経路など
によっても異なるが、一般的に０．１μｇ／ｋｇ体重〜
１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができる。
０．５μｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与
するのが好ましく、１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体
重がさらに好ましい。
【００２２】本発明の接合体を、ＩＬ−２Ｒを発現する
ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）細胞、および対照としてＩ
Ｌ−２Ｒを発現しない細胞に添加して培養し、その殺細
胞活性を試験したところ、本発明の接合体は用量依存的
にＩＬ−２Ｒを発現するＡＴＬ細胞を殺す作用を示し
た。一方、対照であるＩＬ−２Ｒを発現しない細胞では
このような殺細胞活性は全く観察されなかった。したが
って、本発明の接合体はＩＬ−２Ｒを発現する細胞に対
して特異的に殺細胞活性を示すことが明らかとなった。
ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）細胞、および対照としてＩ
Ｌ−２Ｒを発現しない細胞に添加して培養し、その殺細
胞活性を試験したところ、本発明の接合体は用量依存的
にＩＬ−２Ｒを発現するＡＴＬ細胞を殺す作用を示し
た。一方、対照であるＩＬ−２Ｒを発現しない細胞では
このような殺細胞活性は全く観察されなかった。したが
って、本発明の接合体はＩＬ−２Ｒを発現する細胞に対
して特異的に殺細胞活性を示すことが明らかとなった。
【００２３】ヒトＲＮａｓｅは、通常でも血中に存在し
ており免疫原性は極めて弱く、優れた薬効成分であると
いえる。成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等の疾病において
はＩＬ−２Ｒが過剰発現されており、病態との関連が示
唆されているが、ヒトＩＬ−２Ｒを過剰発現している細
胞を本願発明の接合体により選択的に死滅させることに
より、白血病、血管肉腫、腎臓癌、リンパ腫などの癌や
ＡＩＤＳ、成人性I型糖尿病、関節リューマチ、斑点型
乾癬等に対する治療薬および臓器移植時の拒絶反応等に
対する免疫抑制剤の開発への応用可能である。特に本発
明のように全てヒト生理活性物質のみからなる上記疾患
の治療薬を製造することは初めての例である。
ており免疫原性は極めて弱く、優れた薬効成分であると
いえる。成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等の疾病において
はＩＬ−２Ｒが過剰発現されており、病態との関連が示
唆されているが、ヒトＩＬ−２Ｒを過剰発現している細
胞を本願発明の接合体により選択的に死滅させることに
より、白血病、血管肉腫、腎臓癌、リンパ腫などの癌や
ＡＩＤＳ、成人性I型糖尿病、関節リューマチ、斑点型
乾癬等に対する治療薬および臓器移植時の拒絶反応等に
対する免疫抑制剤の開発への応用可能である。特に本発
明のように全てヒト生理活性物質のみからなる上記疾患
の治療薬を製造することは初めての例である。
【００２４】
【発明の効果】本発明の接合体はヒト生理活性物質のみ
から構成されているため、副作用が弱いと考えられ、長
期投与が可能となる。また、ＩＬ−２Ｒを特異的に認識
する因子によってＩＬ−２Ｒを特異的に発現する組織又
は細胞に選択的に作用する。
から構成されているため、副作用が弱いと考えられ、長
期投与が可能となる。また、ＩＬ−２Ｒを特異的に認識
する因子によってＩＬ−２Ｒを特異的に発現する組織又
は細胞に選択的に作用する。
【００２５】インターロイキン受容体（ＩＬ−Ｒ）を過
剰に発現する細胞は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）などの
癌細胞および免疫異常を起こしたＴ細胞等に限定されて
いるので、本発明のＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子
とＲＮａｓｅとの接合体を有効成分とする医薬は選択的
な抗癌剤、臓器移植時の拒絶反応等に対する免疫抑制剤
およびＡＩＤＳ、成人性I型糖尿病、関節リューマチ、
斑点型乾癬などの治療薬として有用である。
剰に発現する細胞は成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）などの
癌細胞および免疫異常を起こしたＴ細胞等に限定されて
いるので、本発明のＩＬ−２Ｒを特異的に認識する因子
とＲＮａｓｅとの接合体を有効成分とする医薬は選択的
な抗癌剤、臓器移植時の拒絶反応等に対する免疫抑制剤
およびＡＩＤＳ、成人性I型糖尿病、関節リューマチ、
斑点型乾癬などの治療薬として有用である。
【００２６】
【実施例】以下、参考例および実施例により本発明を詳
細に説明するが、本発明は、これらの参考例および実施
例に限定されるものではない。
細に説明するが、本発明は、これらの参考例および実施
例に限定されるものではない。
【００２７】参考例１：ヒトＲＮａｓｅの肝臓組織から
の抽出、精製 ヒト肝組織をｐＨ４．０の酸性下で均質化し、得られた
溶液を４℃で一晩放置する。その溶液をｐＨ６．８に調
整し高速遠心を行い、その上清を０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）で平衡化させたセルロースホスフェイ
Ｐ１１（ワットマン社製）を充填したカラムに吸着さ
せ、塩化ナトリウム濃度を連続的に増加させることによ
り溶出させた。この溶出液を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−１５
０（ファルマシア社製）を充填したカラムでゲル濾過を
行い、同じ緩衝液で平衡化したポリグアニル酸・アガロ
ース（シグマ社製）を充填したアフィニティーカラムに
吸着させ、１Ｍ塩化ナトリウムを含んだ緩衝液で溶出す
ることによってヒトＲＮａｓｅを精製した。
の抽出、精製 ヒト肝組織をｐＨ４．０の酸性下で均質化し、得られた
溶液を４℃で一晩放置する。その溶液をｐＨ６．８に調
整し高速遠心を行い、その上清を０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．８）で平衡化させたセルロースホスフェイ
Ｐ１１（ワットマン社製）を充填したカラムに吸着さ
せ、塩化ナトリウム濃度を連続的に増加させることによ
り溶出させた。この溶出液を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−１５
０（ファルマシア社製）を充填したカラムでゲル濾過を
行い、同じ緩衝液で平衡化したポリグアニル酸・アガロ
ース（シグマ社製）を充填したアフィニティーカラムに
吸着させ、１Ｍ塩化ナトリウムを含んだ緩衝液で溶出す
ることによってヒトＲＮａｓｅを精製した。
【００２８】参考例２：ヒトＲＮａｓｅ １の遺伝子工
学的製造法 ヒト膵臓ＲＮａｓｅ １は文献記載の方法（J.Futami e
t al. BBRC, 216:406-413, 1995）により遺伝子工学的
に調製することができる。簡単に述べると、ヒトＲＮａ
ｓｅ １ ｃＤＮＡインサート（Seno, M. et al., Bio
chem. Biophys.Acta 1218:466-468, 1994）をプラスミ
ドｐＥＴ３ａに組み込む。得られるプラスミドｐＢＯ２
６で大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（１３）
を形質転換し、形質転換体をグルコース（０．４％）、
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニ
コール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、６００ｎ
ｍの吸光度が０．４になるまで培養する。その後、イソ
プロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）を加えて誘導し、さらに３７℃で３時間培養す
る。細胞を遠心により回収し、生理食塩水で洗浄し、使
用時まで−８０℃で保存する。
学的製造法 ヒト膵臓ＲＮａｓｅ １は文献記載の方法（J.Futami e
t al. BBRC, 216:406-413, 1995）により遺伝子工学的
に調製することができる。簡単に述べると、ヒトＲＮａ
ｓｅ １ ｃＤＮＡインサート（Seno, M. et al., Bio
chem. Biophys.Acta 1218:466-468, 1994）をプラスミ
ドｐＥＴ３ａに組み込む。得られるプラスミドｐＢＯ２
６で大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（１３）
を形質転換し、形質転換体をグルコース（０．４％）、
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニ
コール（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、６００ｎ
ｍの吸光度が０．４になるまで培養する。その後、イソ
プロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）を加えて誘導し、さらに３７℃で３時間培養す
る。細胞を遠心により回収し、生理食塩水で洗浄し、使
用時まで−８０℃で保存する。
【００２９】２０％スクロース存在下に浸透圧ショック
により細胞を破砕し、凍結融解する。発現タンパク質の
封入体画分を含む不溶性分画を可溶化し、タンパク質の
再生（refolding）を行い、さらにカラムクロマトグラ
フィーにより精製してヒトＲＮａｓｅ １を得る。
により細胞を破砕し、凍結融解する。発現タンパク質の
封入体画分を含む不溶性分画を可溶化し、タンパク質の
再生（refolding）を行い、さらにカラムクロマトグラ
フィーにより精製してヒトＲＮａｓｅ １を得る。
【００３０】実施例１：ヒトＩＬ−２とヒトＲＮａｓｅ
１との接合体の製造（化学合成法） ニュートンらの方法（Newton, D.L. et al., J. Biol.
Chem. 267:19572, 1992）に準じて製造した。すなわ
ち、ヒトＩＬ−２（ヒトリコンビナントＩＬ−２、米国
シグマ社製）にジチオール基を導入するため、ＩＬ−２
の５倍量モル濃度の３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸−Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）を室温で３
０分間反応させることによってＩＬ−２を修飾する。こ
の際、未反応のＳＰＤＰは１００ｍＭ塩化ナトリウムを
含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）を充
填したカラムに通すことによって除去される。
１との接合体の製造（化学合成法） ニュートンらの方法（Newton, D.L. et al., J. Biol.
Chem. 267:19572, 1992）に準じて製造した。すなわ
ち、ヒトＩＬ−２（ヒトリコンビナントＩＬ−２、米国
シグマ社製）にジチオール基を導入するため、ＩＬ−２
の５倍量モル濃度の３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸−Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）を室温で３
０分間反応させることによってＩＬ−２を修飾する。こ
の際、未反応のＳＰＤＰは１００ｍＭ塩化ナトリウムを
含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）を充
填したカラムに通すことによって除去される。
【００３１】参考例２で得たヒト膵臓由来のＲＮａｓｅ
１へのチオール基の導入は２−イミノチオラン（ 2-i
minothiolane, ２−ＩＴ）により行った。すなわち、Ｒ
Ｎａｓｅ １の５倍量モル濃度の２−ＩＴと室温で９０
分間反応させることによってＲＮａｓｅ １を修飾し、
未反応の２−ＩＴは上記と同様にセファデックスＧ−２
５により除去した。
１へのチオール基の導入は２−イミノチオラン（ 2-i
minothiolane, ２−ＩＴ）により行った。すなわち、Ｒ
Ｎａｓｅ １の５倍量モル濃度の２−ＩＴと室温で９０
分間反応させることによってＲＮａｓｅ １を修飾し、
未反応の２−ＩＴは上記と同様にセファデックスＧ−２
５により除去した。
【００３２】修飾されたヒトＩＬ−２とヒトＲＮａｓｅ
１を等モル濃度で混合し、４℃で１２時間反応を行っ
た。
１を等モル濃度で混合し、４℃で１２時間反応を行っ
た。
【００３３】反応生成物の精製は、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−５
０（ファルマシア社製）を充填したカラムに通すことに
より行ない、本発明のＩＬ−２−ＲＮａｓｅ接合体を得
た。
衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−５
０（ファルマシア社製）を充填したカラムに通すことに
より行ない、本発明のＩＬ−２−ＲＮａｓｅ接合体を得
た。
【００３４】実施例２：ヒトＩＬ−２とヒトＲＮａｓｅ
１との接合体の製造（遺伝子工学的製造法） ヒト末梢血細胞からクローニングしたヒトＩＬ−２遺伝
子を含む、大腸菌ＭＣ１０６１株中のプラスミドｐＴＣ
ＧＦ−１１はＡＴＣＣから入手した（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 81:2543-2547, 1984）。プラスミドｐＥＴ
−３０ａ（＋）および大腸菌宿主細胞はＮｏｖａｇｅｎ
社より購入した。
１との接合体の製造（遺伝子工学的製造法） ヒト末梢血細胞からクローニングしたヒトＩＬ−２遺伝
子を含む、大腸菌ＭＣ１０６１株中のプラスミドｐＴＣ
ＧＦ−１１はＡＴＣＣから入手した（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 81:2543-2547, 1984）。プラスミドｐＥＴ
−３０ａ（＋）および大腸菌宿主細胞はＮｏｖａｇｅｎ
社より購入した。
【００３５】ヒト膵臓からクローニングしたヒト膵臓Ｒ
Ｎａｓｅ １遺伝子を含むｐＢＯ４９ ＤＮＡは岡山大
学工学部、妹尾晶治博士から恵与されたものを使用し
た。
Ｎａｓｅ １遺伝子を含むｐＢＯ４９ ＤＮＡは岡山大
学工学部、妹尾晶治博士から恵与されたものを使用し
た。
【００３６】ＩＬ−２とＲＮａｓｅ １との接合体を以
下の手順により製造した。
下の手順により製造した。
【００３７】形質転換 １）プラスミドｐＴＣＧＦ−１１から制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩでＩＬ−２をコードするＤＮＡイン
サートを切り出す。ｐＢＯ４９から同様に制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＸｂａＩを用いてヒト膵臓ＲＮａｓｅ １
をコードするＤＮＡインサートを切り出す。
ＩおよびＢａｍＨＩでＩＬ−２をコードするＤＮＡイン
サートを切り出す。ｐＢＯ４９から同様に制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＸｂａＩを用いてヒト膵臓ＲＮａｓｅ １
をコードするＤＮＡインサートを切り出す。
【００３８】２）プラスミドｐＥＴ−３０ａ（＋）中
に、上記ＤＮＡインサートをライゲーション（ヒト膵臓
ＲＮａｓｅ １をコードするＤＮＡのカルボキシ末端に
ＩＬ−２をコードするＤＮＡを融合させる）し、バクテ
リオファージＴ７プロモーターの制御下にクローン化す
る。
に、上記ＤＮＡインサートをライゲーション（ヒト膵臓
ＲＮａｓｅ １をコードするＤＮＡのカルボキシ末端に
ＩＬ−２をコードするＤＮＡを融合させる）し、バクテ
リオファージＴ７プロモーターの制御下にクローン化す
る。
【００３９】３）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（λ
ＤＥ３ ｌｙｓｏｇｅｎｓ）の染色体コピーを含む発現
宿主を上記発現ベクターで形質転換する。発現宿主とし
て使用できる細胞株には、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどを含
む。これらの株は発現レベル、標的遺伝子の安定化ポテ
ンシャルおよびプロテアーゼ含量がそれぞれ異なるの
で、目的に応じて選択することが可能である。本実施例
では大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。
ＤＥ３ ｌｙｓｏｇｅｎｓ）の染色体コピーを含む発現
宿主を上記発現ベクターで形質転換する。発現宿主とし
て使用できる細胞株には、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどを含
む。これらの株は発現レベル、標的遺伝子の安定化ポテ
ンシャルおよびプロテアーゼ含量がそれぞれ異なるの
で、目的に応じて選択することが可能である。本実施例
では大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。
【００４０】４）形質転換体をカナマイシンを含むＬＢ
培地中、３７℃で、６００ｎｍにおける吸光度が０．４
〜０．６に達するまで培養する（約３時間）。
培地中、３７℃で、６００ｎｍにおける吸光度が０．４
〜０．６に達するまで培養する（約３時間）。
【００４１】５）最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて発
現を誘導し、さらに３時間培養を続ける。
現を誘導し、さらに３時間培養を続ける。
【００４２】細胞の溶菌と封入体の単離 １）遠心分離により細胞を回収し、溶菌用冷緩衝液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐＨ８．０、２５％スクロース、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）４０ｍｌ中に再懸濁する。
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐＨ８．０、２５％スクロース、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）４０ｍｌ中に再懸濁する。
【００４３】２）プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ０．５
Ｍ）、ライソザイム０．１ｍｇ／ｍｌを加えて、氷上で
３０分間インキュベートし、−２０℃で少なくとも１時
間凍結する。
Ｍ）、ライソザイム０．１ｍｇ／ｍｌを加えて、氷上で
３０分間インキュベートし、−２０℃で少なくとも１時
間凍結する。
【００４４】３）水浴中、室温まで迅速に溶解する。
【００４５】４）音波処理およびＤＮａｓｅ１による消
化によりＤＮＡを剪断する。
化によりＤＮＡを剪断する。
【００４６】５）界面活性剤混合物（０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％デオキシコール酸、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−
４０TM）で可溶性画分を洗浄し去り、遠心して不溶性画
分を回収する。
ｌ、１％デオキシコール酸、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−
４０TM）で可溶性画分を洗浄し去り、遠心して不溶性画
分を回収する。
【００４７】６）Ｔｒｉｔｏｎ／ＥＤＴＡ溶液（１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し
て大腸菌の細胞膜断片を放出させ、封入体画分（inclus
ion bodies）を遠心分離により回収する。この操作を２
〜３回繰り返す。
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し
て大腸菌の細胞膜断片を放出させ、封入体画分（inclus
ion bodies）を遠心分離により回収する。この操作を２
〜３回繰り返す。
【００４８】封入体の可溶化およびタンパク質の再生 １）封入体画分を４０ｍｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４中に懸濁し、ホ
モジェナイズする。
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４中に懸濁し、ホ
モジェナイズする。
【００４９】２）可溶性物質を遠心により除去する。
【００５０】３）上清に窒素ガスをパージして空気を除
去する。
去する。
【００５１】４）０．１Ｍ還元グルタチオンを加え、Ｎ
ａＯＨによってｐＨをアルカリ性に保つ。
ａＯＨによってｐＨをアルカリ性に保つ。
【００５２】５）窒素ガスをパージし、チューブを閉じ
て３７℃で少なくとも９０分間インキュベートする。
て３７℃で少なくとも９０分間インキュベートする。
【００５３】６）１ｍｇ／ｍｌのＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎ
ｔTM３−１４を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ
８．４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５Ｍ酸化グルタチ
オン中に２０倍で希釈し、少なくとも一晩室温で再生さ
せる。
ｔTM３−１４を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ
８．４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５Ｍ酸化グルタチ
オン中に２０倍で希釈し、少なくとも一晩室温で再生さ
せる。
【００５４】７）遠心によりタンパク質凝集体を除去す
る。
る。
【００５５】再生タンパク質の回収および最終精製工程 １）硫酸アンモニウムによる塩析 ４４−４８％飽和までの硫酸アンモニウム塩を加え、高
分子量の沈殿したタンパク質を濾過する。次いで６０％
飽和までの硫酸アンモニウム塩を加え、目的とするタン
パク質（本発明の接合体タンパク）を濾過により回収
し、ＰＢＳに再懸濁する。
分子量の沈殿したタンパク質を濾過する。次いで６０％
飽和までの硫酸アンモニウム塩を加え、目的とするタン
パク質（本発明の接合体タンパク）を濾過により回収
し、ＰＢＳに再懸濁する。
【００５６】２）アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィー ＰＢＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化した抗−ＩＬ−
２−ヘパリン−セファロースのアフィニティーカラムに
上記１）で得られた接合体タンパク質を適用する。カラ
ムを十分洗浄した後、２．０Ｍ ＮａＣｌで溶出する。
得られる溶出物をＰＢＳで透析するか、あるいは脱塩す
る。
ィー ＰＢＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化した抗−ＩＬ−
２−ヘパリン−セファロースのアフィニティーカラムに
上記１）で得られた接合体タンパク質を適用する。カラ
ムを十分洗浄した後、２．０Ｍ ＮａＣｌで溶出する。
得られる溶出物をＰＢＳで透析するか、あるいは脱塩す
る。
【００５７】実施例３：ＩＬ−２とＲＮａｓｅとの接合
体の白血病細胞に対する殺細胞効果 ＩＬ−２Ｒを多く発現している成人Ｔ細胞白血病細胞株
であるＯＫＴ３と陰性対照細胞株ＭＯＬＴ４（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＣＲＬ１５８２）に対して in vitroで実施例
１で得たヒトＩＬ−２とヒトＲＮａｓｅとの接合体を１
０-9から１０-6Ｍ濃度で投与し、２日後の殺細胞効果を
検討した。得られた結果を図２に示す。ＯＫＴ３細胞で
は用量依存的に顕著な殺細胞効果が観察されたが、陰性
対照細胞株ＭＯＬＴ４では全く観察されなかった。
体の白血病細胞に対する殺細胞効果 ＩＬ−２Ｒを多く発現している成人Ｔ細胞白血病細胞株
であるＯＫＴ３と陰性対照細胞株ＭＯＬＴ４（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＣＲＬ１５８２）に対して in vitroで実施例
１で得たヒトＩＬ−２とヒトＲＮａｓｅとの接合体を１
０-9から１０-6Ｍ濃度で投与し、２日後の殺細胞効果を
検討した。得られた結果を図２に示す。ＯＫＴ３細胞で
は用量依存的に顕著な殺細胞効果が観察されたが、陰性
対照細胞株ＭＯＬＴ４では全く観察されなかった。
【図１】本発明の接合体の殺細胞効果を示すグラフであ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/22 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＶ // Ｃ１２Ｎ 15/09 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (4)
- 【請求項１】 インターロイキン−２受容体を特異的に
認識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体。 - 【請求項２】 インターロイキン−２受容体を特異的に
認識する因子がインターロイキン−２である請求項１記
載の接合体。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２記載の接合体を
有効成分とする医薬組成物。 - 【請求項４】 白血病治療薬である請求項３記載の医薬
組成物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8142485A JPH09324000A (ja) | 1996-06-05 | 1996-06-05 | インターロイキン−２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体 |
| DE69724328T DE69724328T2 (de) | 1996-06-05 | 1997-06-04 | Konjugate von einem Interleukin-2 Rezeptor spezifisch erkennenden Faktor mit Ribonuklease |
| AT97109034T ATE247983T1 (de) | 1996-06-05 | 1997-06-04 | Konjugate von einem interleukin-2 rezeptor spezifisch erkennenden faktor mit ribonuklease |
| EP97109034A EP0811385B1 (en) | 1996-06-05 | 1997-06-04 | Conjugate of a factor specifically recognizing interleukin-2 receptor with ribonuclease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8142485A JPH09324000A (ja) | 1996-06-05 | 1996-06-05 | インターロイキン−２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09324000A true JPH09324000A (ja) | 1997-12-16 |
Family
ID=15316427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8142485A Pending JPH09324000A (ja) | 1996-06-05 | 1996-06-05 | インターロイキン−２受容体を特異的に認識する因子とリボヌクレアーゼとの接合体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0811385B1 (ja) |
| JP (1) | JPH09324000A (ja) |
| AT (1) | ATE247983T1 (ja) |
| DE (1) | DE69724328T2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3129493B1 (en) | 2014-04-09 | 2021-07-07 | The Scripps Research Institute | Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters |
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