JPH0937787A - Ｄｎａ塩基配列に含まれるベクター部の自動除去方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ベクターに組み込まれてクローニングされた
ＤＮＡからベクターの一部の塩基配列としてのベクター
部を高精度で除去し、正確な構造を持つ、クローニング
目的のＤＮＡ断片を得ることを目的とする。 【構成】 ベクター切断時と目的ＤＮＡ断片生成用とに
使用された制限酵素とベクターとに応じて、クローニン
グ結果のＤＮＡの塩基配列からベクター部を検索するた
めの検索キーを作成し、該作成された検索キーを用いて
ベクター部を特定し、特定されたベクター部の自動除去
を行うように構成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はクローン、すなわち増産
すべき遺伝子を含んだＤＮＡの断片を、ベクターと呼ば
れる環状ＤＮＡ分子に化学的に結合させ、そのベクター
を例えば大腸菌などの細胞内で増殖させることにより、
目的のＤＮＡの断片を増産するＤＮＡクローニングにお
いて、増産後のベクターから目的のＤＮＡ断片を取り出
す時、取り出される断片の内部に含まれるベクターの一
部を自動的に除去するベクター部自動除去方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】核酸の構成単位はヌクレオチドであり、
このヌクレオチドは塩基、糖、リン酸の３成分が結合し
たものである。ヌクレオチドはヌクレオシドにリン酸が
結合したものでもあり、リン酸はヌクレオシドをはしか
けして、ポリマーが作られ、ＤＮＡ（レオキシリボ核
酸）とＲＮＡ（リボ核酸）のいずれかが形成される。

【０００３】核酸を構成する塩基にはプリン塩基とピリ
ミジン塩基の２種類があり、プリン塩基にはアデニンＡ
とグアニンＧがあり、またピリミジン塩基にはシトシン
ＣとチミンＴがある。

【０００４】ポリヌクレオチド鎖構造と呼ばれる構造を
持つＤＮＡは、前述の４つの塩基アデニンＡ、グアニン
Ｇ、シトシンＣ、およびチミンＴが一列に並んだ細長い
糸のような構造を持っており、例えば１個のヒトの細胞
の染色体からＤＮＡを引き出し、それらを繋ぎ合わせる
と１ｍにもおよび、この上に３０億個の塩基が並んでい
ると言われる。

【０００５】このようにＤＮＡは塩基が一列、すなわち
鎖状に結合した塩基一次配列の構造を持ち、その鎖は一
般的に非常に長いが、遺伝子工学においては、多種類の
遺伝子を持つＤＮＡを切断して、切断結果としての多数
のＤＮＡ断片の中から特定の遺伝子情報を持つものを選
び出し、選び出されたＤＮＡ断片、すなわち目的ＤＮＡ
断片を多量に生成させる必要があることが多い。

【０００６】このような目的のために、目的ＤＮＡ断片
をベクターと呼ばれるＤＮＡ、一般に環状のＤＮＡに化
学結合によって連結させ、目的ＤＮＡ断片とベクターＤ
ＮＡの結合物である組替えＤＮＡを大腸菌などの適当な
細胞に取り込ませ、その細胞を増殖させることにより組
替えＤＮＡを多量に生成し、結果として目的ＤＮＡ断片
を大量に生成するクローニングと言う操作が行われる。

【０００７】すなわち、一般に配列のユニークな目的Ｄ
ＮＡ断片はその量が微量であることが多く、この目的Ｄ
ＮＡ断片（ＤＮＡフラグメント）をベクターに組み込ん
でクローニングが行われる。ベクターは一般的に環状の
二重らせん構造のＤＮＡであり、この二重らせん構造の
ある特定の箇所を制限酵素と呼ばれる酵素で切断し、そ
の切断箇所に目的ＤＮＡフラグメントが組み込まれる。
制限酵素によるＤＮＡの切断について説明するために、
まずＤＮＡの構造について更に説明する。

【０００８】ＤＮＡは、前述のように塩基が一列、すな
わち鎖状に結合した塩基一次配列の構造を持っている。
このＤＮＡ鎖には向きがあり、ＡＴＧＣＡＣＧＡ→とＡ
ＴＧＣＡＣＧＡ←（すなわちＡＧＣＡＣＧＴＡ→）とは
別のものである。

【０００９】このＤＮＡ鎖の両側、すなわち末端には名
称がついており、糖の３′の位置に水酸基がついた末端
は３′末端と呼ばれ、また他方の末端、すなわち糖の
５′の位置にリン酸基がついた末端は５′末端と呼ばれ
る。そしてＤＮＡ鎖を記述する際には、一般に５′末端
が左、３′末端が右となるように記述する。

【００１０】ＤＮＡは通常、向きが異なって相補的な２
本の塩基配列がくっついた二重鎖の状態で存在する。こ
の時２本の塩基配列において、お互いに向かい合う塩基
の間には一定の関係があり、アデニンＡはチミンＴと、
またグアニンＧはシトシンＣと向き合うようになってい
る。この例を次に示す（上下の塩基がペアとなってい
る）。

【００１１】

【数１】

【００１２】このようにＤＮＡは、相補鎖となる２本の
塩基配列が組となって１つの遺伝的意味を持つが、制限
酵素はこのような塩基配列のうちの４〜６個の塩基から
成る塩基配列であって、その制限酵素に特有の塩基配列
を識別し、その箇所でＤＮＡを切断する。図２１はこの
制限酵素によるＤＮＡ塩基配列の切断の説明図である。
同図において、例えばＨpaＩと呼ばれる制限酵素は、Ｄ
ＮＡの２本鎖の同一の位置でＤＮＡを切断するが、Ｅco
ＲＩなどの場合は２本の鎖の切断位置が異なっている。

【００１３】図２１に示されるように、多くの制限酵素
が識別するヌクレオチド配列は塩基対６個であり、この
識別領域、すなわち制限酵素サイトにおける２本の鎖の
ヌクレオチド配列は逆向きに同一である。多くの制限酵
素は、それが切断する２本の鎖の切断位置が異なり、互
い違いの末端、すなわちコヒーシブ末端を作り出すこと
になる。

【００１４】制限酵素で切断された位置に前述の目的Ｄ
ＮＡ断片が組み込まれる。図２２はこの目的ＤＮＡ断片
のベクターへの組み込みの説明図である。同図におい
て、環状のプラスミドＤＮＡ分子が制限酵素によって切
断され、コヒーシブ末端を持つ直線状プラスミドＤＮＡ
分子となる。ここでプラスミドとは、例えばバクテリア
などの中に含まれ、染色体ＤＮＡとは異なって自律的に
増殖する環状ＤＮＡである。この直線状プラスミドＤＮ
Ａ分子と、目的ＤＮＡ断片、すなわち染色体ＤＮＡを同
じ制限酵素で切断して作った多種類のＤＮＡ断片の１つ
とが、塩基対形成、すなわちコヒーシブ末端のアニーリ
ングによって環状のＤＮＡとして結合しやすくなる。

【００１５】このように制限酵素によって作られるコヒ
ーシブ末端は組替えＤＮＡ技術にとって重要であり、同
じ制限酵素で切断することによりどんなＤＮＡ断片でも
繋ぎ合わせることができる。最後に２本鎖ＤＮＡの１本
鎖切断部を修復する酵素であるＤＮＡリガーゼを作用さ
せることにより、直線状プラスミドＤＮＡ分子と目的Ｄ
ＮＡ断片とが結合され、染色体ＤＮＡを組み込んだプラ
スミドＤＮＡ分子が作られる。

【００１６】このようにして生成されたプラスミドＤＮ
Ａ分子は細菌、または酵母の中で殖やすことができる。
これがＤＮＡクローニングである。このＤＮＡクローニ
ングに用いられるベクターと、そのベクター内で多種の
制限酵素によってそれぞれ切断される多くの制限酵素サ
イトが集中しているマルチクローニングサイトの例を図
２３に示す。同図では異なるマルチクローニングサイト
を持つ２種のベクターが示されている。

【００１７】このＤＮＡクローニングの結果として大量
に生成されたプラスミドＤＮＡ分子から目的ＤＮＡ断片
を切り出す場合には、クローニングされたＤＮＡ断片の
ヌクレオチド配列を正確に決定し、不必要な部分の塩基
を削除して、正確な構造を持つＤＮＡ断片を取り出す必
要がある。このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定す
るために、ＤＮＡ塩基配列を自動的に読み取る装置とし
てのＤＮＡシーケンサが用いられる。

【００１８】ＤＮＡにおけるＡ，Ｇ，Ｔ、およびＣの配
列順序を知ることは、すなわち遺伝情報を解明すること
につながり、この塩基配列を決めるシーケンス技術は他
の分野の技術と互いに関連しながら進歩しており、その
発展は制限酵素や核酸関連酵素の発見、ＤＮＡのクロー
ニング、核酸化学などの技術分野の発展と大いに関連し
ている。

【００１９】最近ではコンピュータ技術がシーケンス法
の１つとして活用され、人間の能力を越えた膨大なデー
タの入力や蓄積が可能となり、塩基配列の決定にとって
コンピュータは必須の道具として用いられるようになっ
ている。

【００２０】ＤＮＡの塩基配列を自動的に読み取る装置
であるＤＮＡシーケンサにおいては、ジデオキシ法、ま
たはサンガ法と呼ばれる方法が塩基配列決定のために用
いられる。一般にＤＮＡの二重鎖の一方の相補鎖の一部
分を、ＤＮＡ合成のきっかけとなるプライマーとしてＤ
ＮＡ合成を行う際に、ジデオキシヌクレオチドと言うヌ
クレオチドが取り込まれると、そこでＤＮＡ合成がスト
ップし、様々な長さのＤＮＡの断片（フラグメント）が
得られるが、プライマーを用いたＤＮＡ合成反応の際
に、Ｇ，Ａ，Ｔ、およびＣの各塩基に対応するジデオキ
シヌクレオチドを加えることにより、それぞれの塩基の
位置で鎖の伸びがストップした様々な長さのＤＮＡ断片
が得られる。

【００２１】図２４は特定のヌクレオチド、この場合ア
デニンＡの所で切断されてできるＤＮＡ断片の作り方の
説明図である。この場合にはＤＮＡ鎖から１個のヌクレ
オチド、すなわちアデニンＡを取り除く程度の穏やかな
化学処理が行われ、５′末端にリン酸基を持つ左側の断
片のみが放射性の断片となり、これらの断片をゲル電気
泳動させることにより、放射性の断片のみはその断片の
長さ、例えば分子量に対応する位置で検出される。

【００２２】ＤＮＡシーケンサでは、ジデオキシ法の反
応生成物としてのＤＮＡ断片が蛍光標識され、その結果
としての蛍光標識されたいろいろの長さの鎖を持つＤＮ
Ａ断片が、ゲル電気泳動によって分離される。ゲル内を
泳動されてくるＤＮＡ断片に対してゲル上のある位置に
おいてレーザ照射により蛍光色素を励起発光させ、この
蛍光を光検出器で検出する。電気泳動と同時に経時的に
蛍光を検出していくことにより、Ｇ，Ａ，Ｔ、およびＣ
の各塩基に対応するＤＮＡ断片の泳動パターンのデータ
を得ることができる。このようにして得られたデータが
コンピュータによって解析され、塩基配列データに変換
される。

【００２３】ＤＮＡシーケンサの出力データとしては、
ＤＮＡ塩基配列そのものと、配列の決定に使われた波形
データがある。この波形データはゲル電気泳動パターン
のデータに対応し、Ｇ，Ａ，Ｔ、およびＣの各波形にお
いて波形の蛍光強度のピークの位置がその塩基の存在す
る位置に対応する。

【００２４】しかしながら、前述のように一般にＤＮＡ
の塩基配列における塩基の個数は非常に多いので、ＤＮ
Ａシーケンサによって一度に塩基配列の全てを決定する
ことはできず、一般に配列を決定したいＤＮＡを複数の
断片にフラグメント化して、各フラグメントの塩基配列
を決定し、それらの塩基配列を結合することによって全
体の塩基配列を決定する方法がとられている。

【００２５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、目的Ｄ
ＮＡ断片をベクターに組み込み、ＤＮＡクローニングを
行った後にＤＮＡシーケンサを用いて塩基配列を決定
し、不必要な塩基を削除して正確な目的ＤＮＡ断片を生
成することになるが、一般にシーケンサの出力としての
シーケンス結果には、目的ＤＮＡ断片に加えてクローニ
ングに用いたベクターの一部の塩基配列が含まれ、その
一部の塩基を削除することが困難であると言う問題点が
あった。

【００２６】このようなベクターの一部の塩基としての
ベクター部は、シーケンス結果の５′末端部、および
３′末端部に混入する可能性が高く、正確な目的ＤＮＡ
フラグメントを生成するためには、これらのベクター部
を確実に取り除く必要がある。従来は、目的ＤＮＡフラ
グメント塩基配列の前後にくる可能性があるベクター部
の塩基配列を用いて、全ての塩基が完全に一致しなくて
も検索結果を出力する検索法としての、ホモロジーサー
チを用いてベクター部を削除していた。しかしながら混
入したベクター部の塩基配列が短かったり、３′末端側
でのミスシーケンシング等の影響により混入したベクタ
ー部を的確に見つけ出すことができず、正しい構造の目
的ＤＮＡフラグメントを生成することができないという
問題点があった。

【００２７】本発明は、ＤＮＡシーケンス結果に混入し
たベクター部を高い確率で検索し、その検索結果からベ
クター部を自動的に削除することを目的とする。

【００２８】

【課題を解決するための手段及び作用】図１は本発明の
機能ブロック図である。同図はベクター、例えば環状プ
ラスミドＤＮＡ分子を切断し、その切断箇所に目的のＤ
ＮＡ断片を組み込んでクローニングを行う、ＤＮＡクロ
ーニング結果のＤＮＡ塩基配列からベクター内の塩基配
列の一部としてのベクター部を除去するベクター部自動
除去方法の機能ブロック図である。

【００２９】図１において、１でベクターの種類とベク
ターの切断時に使用された制限酵素、および目的ＤＮＡ
断片を得るために使用された制限酵素とに応じて、クロ
ーニング結果のＤＮＡ塩基配列からベクター部塩基配列
を検索するための検索キーとなる塩基配列が作成され、
２でその作成された検索キーを用いてベクター部塩基配
列が特定され、特定されたベクター部塩基配列の自動除
去が行われる。

【００３０】前述の検索キーとしては、例えば前部検索
キーと後部検索キーとが用いられる。これらの検索キー
は、クローニング結果としてのＤＮＡ塩基配列のうち
で、ベクター部と目的ＤＮＡ断片とのそれぞれが対応す
る制限酵素によって切断された末端部を含み、かつベク
ター部と目的ＤＮＡ断片のそれぞれの接合前の制限酵素
サイトに対応する塩基配列を含む領域であって、目的Ｄ
ＮＡ断片の前にあるものが前部検索キー、後にあるもの
が後部検索キーである。

【００３１】まずクローニング結果としてのＤＮＡ塩基
配列に対する前部検索キーおよび後部検索キーを用いた
検索において、あらかじめ設定された類似度以上となる
ことを条件としてホモロジー検索が行われ、その検索結
果がベクター・目的ＤＮＡ断片接合部候補として求めら
れる。このベクター・目的ＤＮＡ断片接合部候補のうち
前部検索キーに対応するものが５′側境界部位の１次候
補とされ、後部検索キーに対応するものが３′側境界部
位の１次候補とされる。

【００３２】これらの５′側、および３′側境界部位の
１次候補は一般にそれぞれ複数となる可能性があるた
め、本発明においては更に第２の前部検索キーおよび第
２の後部検索キーを用いた検索が行われる。第２の前部
検索キー、第２の後部検索キーは、ベクターのマルチク
ローニングサイト内で前述の前部検索キー、または後部
検索キーに対してそのキーの前または後で隣接すべき部
分が追加されたものであり、この第２の前部検索キーと
第２の後部検索キーとに対応して前述と同様にしてホモ
ロジー検索が行われ、その検索結果を含んで検索結果の
以前、または以後の全ての領域がベクター部の候補とし
て特定される。

【００３３】更にこれらのベクター部候補が目的ＤＮＡ
断片の前および後でそれぞれ１つのみであり、かつ前の
ベクター部候補と後のベクター部候補とがオーバーラッ
プしていない時、その特定されたベクター部候補がベク
ター部として自動除去される。

【００３４】以上のように本発明によれば、例えば制限
酵素サイトの塩基配列が前部検索キー、および後部検索
キーとして用いられて境界部位の１次候補が求められ、
更に前部検索キー、後部検索キーのそれぞれ前、後の塩
基配列の一部が追加された第２の前部検索キー、および
第２の後部検索キーに基づくホモロジー検索によってベ
クター部の候補が求められ、求められたベクター部候補
が適当である時にベクター部の自動除去が行われる。

【００３５】

【実施例】図２は本発明のベクター部自動除去方法の基
本処理フローチャートである。同図において、まずステ
ップＳ６で使用されたベクターの種類がベクターリスト
の中から選択されてベクターの入力が行われ、ステップ
Ｓ７で使用された制限酵素が制限酵素リストの中から選
択されて制限酵素の入力が行われ、ステップＳ８でベク
ターと制限酵素の情報から検索キーが作成されてベクタ
ー部が検索される。すなわち検索キーとマルチクローニ
ングサイトとのホモロジーがチェックされ、ベクター部
の絞り込みを行うベクター部特定プログラムが実行さ
れ、ステップＳ９でこのベクター部特定プログラムによ
って特定されたベクター部が除去されて処理を終了す
る。

【００３６】図３は本発明のベクター部自動除去処理の
全体フローチャートである。同図は、ＤＮＡシーケンサ
を用いて読み取られたＤＮＡ塩基配列、すなわちフラグ
メントからベクター部を自動的に削除する、ベクター部
自動除去処理の全体フローチャートである。

【００３７】図３において、まずステップＳ１１でベク
ター部自動除去の対象となるクローン（ＤＮＡフラグメ
ント）が選択され、ステップＳ１２で例えばディスプレ
イ上に表示されたメニューからユーザによってベクター
部自動除去が選択され、それによってベクター部自動除
去ダイアログ（対話形式メニュー）が表示され、ステッ
プＳ１３でそのダイアログを用いて、使用されたベクタ
ーがベクターリストから選択される。

【００３８】更にベクター部自動除去ダイアログを用い
て、ステップＳ１４〜Ｓ１７でベクターの前部、後部の
切断部、目的ＤＮＡの前部、後部の切断部の作成に使用
された制限酵素、一般的には４種類の制限酵素が選択さ
れ、ステップＳ１８でベクター部特定・除去プログラム
が実行され、処理を終了する。

【００３９】ステップＳ１８のベクター部特定・除去プ
ログラムの詳細を説明する前に、その他のステップにお
ける処理を具体的に説明する。まずステップＳ１１で
は、メインウィンドウに表示されたクローンのうちでベ
クターの自動除去を行うべきクローンが選択され、ステ
ップＳ１２でディスプレイ上に表示されたメニュー項目
の中からベクター部自動除去メニューがユーザによって
選択されると、ベクター・制限酵素選択用のダイアログ
が開く。このダイアログにはすでにベクターデータベー
スに登録されているベクター名がリストとして表示され
ており、ステップＳ１３において実際に使用されたベク
ターがこのベクターリストから選択される。

【００４０】図４はベクターデータベース内に登録され
ているベクター名リストの例である。同図において本実
施例ではＰＵＣ１８が選択されたものとする。ベクター
が選択されると、選択されたベクターのマルチクローニ
ングサイトにおける塩基配列のデータ、および制限酵素
サイトのデータが抽出され、マルチクローニングサイト
の中に存在する制限酵素サイトに対応する制限酵素の名
が表示される。

【００４１】図５はベクターデータベースに格納されて
いるＰＵＣ１８の塩基配列を示す。同図において、塩基
配列の第５行目の最後から２番目のＡから、第６行目の
後から２６番目のＣまでの部分（アンダーライン部）
が、マルチクローニングサイトである。

【００４２】ステップＳ１３で選択されたベクター、こ
こではＰＵＣ１８についてデータベースから、マルチク
ローニングサイトとその前後、それぞれ５つの塩基を含
む塩基配列が抽出される。これは検索キーの文字列を少
しでも多くしておくためである。またデータベースから
は、このマルチクローニングサイトに含まれる制限酵素
サイトのそれぞれに対応して、制限酵素情報、すなわち
制限酵素の名称、塩基配列、制限酵素サイトの位置、お
よび切断箇所のデータが抽出される。図５はこのように
して抽出されたマルチクローニングサイトと、制限酵素
情報の例である。

【００４３】図３のステップＳ１３で使用されたベクタ
ーが選択され、マルチクローニングサイトと制限酵素情
報が抽出された後に、ステップＳ１４〜Ｓ１７でベクタ
ーと目的ＤＮＡ断片のそれぞれについて、５′側と３′
側でＤＮＡ鎖の切断に使用された制限酵素４つが選択さ
れる。この選択は、図７に示されるような制限酵素リス
トの中から、使用された制限酵素を指定することによっ
て成される。図７はベクターとしてＰＵＣ１８が選択さ
れた場合の制限酵素のリストを示し、これはベクターの
マルチクローニングサイトに含まれる制限酵素サイトを
切断する制限酵素のリストである。

【００４４】ステップＳ１４〜Ｓ１７で制限酵素４つが
選択されると、ステップＳ１８のベクター部特定プログ
ラムにおいてベクター部削除のための検索に用いられる
検索キーが特定される。一般的にはベクター側とＤＮＡ
断片側とで異なる制限酵素を用いてＤＮＡ鎖の切断を行
うことができるが、ここでは簡単のためベクター側とＤ
ＮＡ断片側で同一の制限酵素を使用した場合を考える。
すなわち本実施例ではベクターとＤＮＡ断片のそれぞれ
５′側で同一の制限酵素としてＨＩＮＤ IIIを使用し、
またベクターとＤＮＡ断片の３′側で同一の制限酵素、
ＸＢＡ Iを使用したものとする。これにより、図２２で
示したように、ベクターとＤＮＡ断片との結合部におけ
る塩基配列は、制限酵素サイトの塩基配列と同じにな
る。

【００４５】図８は図３のステップＳ１８におけるベク
ター部特定プログラムの全体フローチャートである。同
図において処理が開始されると、まずステップＳ２１で
検索キーの塩基配列が決定される。すなわちベクターの
種類と制限酵素のデータから、５′側と３′側の２つの
検索キー、すなわち前部検索キーと後部検索キーが作成
され、ステップＳ２２で前部検索キーと後部検索キーを
用いたホモロジー検索が行われ、５′側と３′側でそれ
ぞれベクターとＤＮＡ断片の境界を示す境界部位の１次
候補のリストが作成される。一般にこの境界部位の１次
候補は、５′側と３′側とでそれぞれ複数となることが
多い。

【００４６】続いてステップＳ２３で境界部位の２次候
補のリストの作成が行われる。すなわち５′側の境界部
位１次候補を含み、その前の領域、および３′側境界部
位の１次候補を含み、その後の領域と、前部，後部検索
キーを含むマルチクローニングサイトとのホモロジーチ
ェックが行われ、境界部位の２次候補が求められる。ス
テップＳ２４でそれぞれの境界部位の２次候補がユニー
ク（１つのみ）であることと、５′側の２次候補と３′
側の２次候補との位置関係が調べられ、例えば位置関係
に矛盾がなければステップＳ２５で境界部位の２次候補
が切断部位として決定されて処理を終了する。

【００４７】図９は制限酵素サイトとその切断後の制限
酵素サイト内の領域の説明図である。制限酵素による制
限酵素サイトの切断形式としては、一般的に二重鎖の同
一の位置で切断されるとは限らず、(a) に示すように１
本鎖領域が３′側についている場合と、(c) に示すよう
に１本鎖領域が５′側についている場合と、(b) に示す
ように二重鎖が同じ位置で切断される場合とに分類され
る。なおここで１本鎖領域が３′側についているという
ことは、前述の二重鎖のうちＡ鎖で考えて、(a) におい
て領域Ｂ３は切断後に３′側に残るということを意味す
る。５′側についているという表現も含めて、以下同様
の意味である。

【００４８】図９において、一般的に制限酵素サイト内
で５′側に二重鎖の状態で残る部分を領域Ａ（Ｂ鎖につ
いても同様）、３′側に二重鎖の状態で残る部分を領域
Ｃ、１本鎖として５′側についている部分を領域Ｂ５、
１本鎖として３′側についている部分を領域Ｂ３と呼ぶ
ことにする。一般的に、ベクターと目的ＤＮＡ側で異な
る制限酵素を用いて切断が行われても、領域Ｂの塩基配
列が等しければベクターと目的ＤＮＡとを結合すること
ができる。なお図９は切断前の制限酵素サイトを説明す
るものである。

【００４９】制限酵素サイトとその切断について、具体
例を用いて更に説明する。前述のように一般的にはＤＮ
Ａ二重鎖はＡ鎖１本で表され、例えば次のようになる。 ＡＣＴＡ＾ＧＴ（＾は切断個所を示す） この表現ではＡ鎖とＢ鎖が次のように切断されることが
表されている。

【００５０】 これは図９(c) の場合に相当し、ＡＣが領域Ａ、ＴＡが
領域Ｂ５、ＧＴが領域Ｃに該当し、領域Ｂ３に該当する
ものは存在しない。

【００５１】同様にＡ＾ＣＴＡＧＴは以下のような切断
形式を示す。 これは図９(a) に相当し、Ａが領域Ａ、ＣＴＡＧが領域
Ｂ３、Ｔが領域Ｃに相当し、領域Ｂ５に相当するものは
存在しない。

【００５２】目的ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みに
際しては、目的ＤＮＡ断片の作成時の切断箇所、前後２
箇所、およびベクターの切断箇所、前後２箇所、合計４
箇所の制限酵素サイトが使用される。一般的には４箇所
の切断箇所に対する制限酵素はそれぞれ独立に選択され
ることになり、切断された後の１本鎖領域がついている
側と、それに対応して結合されるべき１本鎖領域の塩基
配列が等しければ、２つの断片の末端部を結合すること
ができる。

【００５３】例えば ＡＣＴＡ＾ＧＴ と ＴＧＴＡ＾ＣＡ ならば、１本鎖領域はそれぞれ５′側についており、１
本鎖領域の塩基配列は“ＴＡ”と同じであるために、結
合ができる。

【００５４】これに対して ＡＣＴＡ＾ＧＴ と ＴＧ＾ＴＡＣＡ の場合には、１本鎖領域の配列は上の例と同様である
が、１本鎖領域のついている側が異なっているため、断
片末端部を結合することはできない。

【００５５】図１０はベクターと目的ＤＮＡ断片とが接
合された状態における制限酵素サイト同士の接合部の説
明図である。同図ではベクター５側をＶ１、ベクター
３′側をＶ２、目的ＤＮＡ断片５′側をＦ１、目的ＤＮ
Ａ断片３′側をＦ２と呼び、例えばベクターの５′側の
切断部の制限酵素サイトのＡ領域であればＶ１Ａという
記号で表している。

【００５６】このようにして表現すると、接合部分の塩
基配列のうちで５′側の結合部配列は、１本鎖領域がベ
クター側にある場合［Ｖ１Ａ］＋［Ｖ１Ｂ５］＋［Ｆ１
Ｃ］、１本鎖領域が存在しない場合［Ｖ１Ａ］＋［Ｆ１
Ｃ］、１本鎖領域が目的ＤＮＡ断片側にある場合［Ｖ１
Ａ］＋［Ｆ１Ｂ３］＋［Ｆ１Ｃ］となる。また３′側の
結合部配列は、１本鎖領域が目的ＤＮＡ側にある場合
［Ｆ２Ａ］＋［Ｆ２Ｂ５］＋［Ｖ２Ｃ］、１本鎖領域が
存在しない場合［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２Ｃ］、１本鎖領域が
ベクター側にある場合［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２Ｂ３］＋［Ｖ
２Ｃ］となる。

【００５７】本実施例においては、これらの５′側結合
部塩基配列と３′側結合部塩基配列が、それぞれ５′側
（前部）検索キー、３′側（後部）検索キーとして使用
される。

【００５８】図１１は５′側検索キー決定処理のフロー
チャートである。同図において処理が開始されると、ま
ずステップＳ３０でベクター５′側の制限酵素サイトの
１本鎖領域が存在するか否か、存在する場合にはその１
本鎖領域が５′側と３′側のいずれについているかが判
定される。５′側についている場合には、ステップＳ３
１で目的ＤＮＡ断片５′側の制限酵素サイトの１本鎖領
域が５′側に存在するか否かが判定され、存在する場合
にはステップＳ３２でそれぞれの１本鎖領域の塩基配列
［Ｖ１Ｂ５］と［Ｆ１Ｂ５］とが（５′側から読んで）
等しいか否かが判定され、等しい場合は切断箇所の接合
が可能となり、ステップＳ３３で５′側検索キーが［Ｖ
１Ａ］＋［Ｖ１Ｂ５］＋［Ｆ１Ｃ］と決定されて、処理
を終了する。

【００５９】これに対してステップＳ３１で目的ＤＮＡ
断片５′側の１本鎖領域が５′側に存在しない場合、お
よび５′側に存在してもステップＳ３２で１本鎖領域の
塩基配列が等しくないと判定された場合には、ステップ
Ｓ３４で制限酵素の選択ミスと判定され、制限酵素選択
処理に戻り、処理が繰り返される。

【００６０】ステップＳ３０でベクター５′側の１本鎖
領域が存在しないと判定されると、ステップＳ３５で目
的ＤＮＡ断片５′側の制限酵素サイトの１本鎖領域も存
在しないか否かが判定され、存在しない場合にはステッ
プＳ３６で５′側検索キーが［Ｖ１Ａ］＋［Ｆ１Ｃ］と
決定されて処理を終了する。またステップＳ３５で目的
ＤＮＡ断片の１本鎖領域が存在すると判定されると、ス
テップＳ３４で制限酵素の選択ミスと判定され、制限酵
素選択処理に戻り、処理が繰り返される。

【００６１】またベクター５′側の１本鎖領域が３′側
についているとＳ３０で判定されると、ステップＳ３７
で目的ＤＮＡ断片５′側の制限酵素サイトの１本鎖領域
が３′側に存在するか否かが判定され、存在する場合に
はステップＳ３８で１本鎖領域の塩基配列［Ｖ１Ｂ３］
と［Ｆ１Ｂ３］が等しいか否かが判定され、等しい場合
にはステップＳ３９で５′側検索キーが［Ｖ１Ａ］＋
［Ｖ１Ｂ３］＋［Ｆ１Ｃ］として決定され、処理を終了
する。これに対してステップＳ３７で１本鎖領域が３′
側に存在しない場合、または存在してもステップＳ３８
で１本鎖領域の２つの配列が等しくないと判定された時
には、ステップＳ３４で制限酵素の選択ミスと判定さ
れ、制限酵素選択処理へ戻り、処理が繰り返される。

【００６２】図１２は３′側検索キー決定処理のフロー
チャートである。このフローチャートは５′側に対する
図１１とほぼ同様であるので詳細な説明を省略するが、
ベクター３′側と目的ＤＮＡ断片３′側の制限酵素サイ
トの１本鎖領域が共に５′側についている場合には［Ｆ
２Ａ］＋［Ｆ２Ｂ５］＋［Ｖ２Ｃ］が、また３′側の１
本鎖領域が共に存在しない場合には［Ｆ２Ａ］＋［Ｖ２
Ｃ］が、また共に３′側についている場合には［Ｆ２
Ａ］＋［Ｖ２Ｂ３］＋［Ｖ２Ｃ］が３′側検索キーとし
て決定される。

【００６３】本実施例におけるベクター部特定プログラ
ムの詳細について、具体例を用いて更に説明する。図１
３は本実施例における前部検索キー、および後部検索キ
ーの説明図である。ここでは図６で説明したベクターＰ
ＵＣ１８のマルチクローニングサイト内に目的ＤＮＡ断
片が組み込まれた場合を具体例として説明する。

【００６４】すなわちベクターと目的ＤＮＡ断片の両方
の５′側で同一の制限酵素としてＨＩＮＤ IIIが使用さ
れ、またベクターと目的ＤＮＡの両方の３′側で同一の
制限酵素としてＸＢＡ Iが使用されたものとする。この
場合、図１３に示されるようにベクターと目的ＤＮＡと
の結合部における制限酵素サイトに依存する塩基配列は
制限酵素サイトの塩基配列と全く同じになる。従って前
部検索キー、すなわち５′側検索キーは制限酵素サイト
ＨＩＮＤ IIIの塩基配列と等しくなり、後部検索キー、
すなわち３′側検索キーは制限酵素サイトＸＢＡ Iの塩
基配列と等しくなる。また図６に示したマルチクローニ
ングサイトのうちで、目的ＤＮＡ断片によって置き替え
られた以外の部分を本実施例では残留マルチクローニン
グサイトと呼ぶことにする。

【００６５】図１４は、図１３の５′側検索キーを用い
た５′側境界部位１次候補の検索処理のフローチャート
である。同図において処理が開示されると、ステップＳ
５１で５′側検索キーを用いた対象クローンの塩基配列
中のホモロジー検索が行われ、そしてステップＳ５２で
検索キーと一定値以上のホモロジー（例えば６個の塩基
のうちで何個が一致するか）を示す領域として検索され
た結果が、境界部位の１次候補のリストとして獲得さ
れ、処理を終了する。

【００６６】図１５は３′側境界部位１次候補の検索処
理のフローチャートである。同図を図１４と比較する
と、検索キーとして後部検索キー、すなわち３′側検索
キーを用いた検索が行われ、３′側の境界部位１次候補
のリストが獲得される点のみが異なっている。

【００６７】図１６は、図１４によって得られた境界部
位１次候補、一般には複数の１次候補の中から２次候補
を絞り込む、２次候補検索処理のフローチャートであ
る。同図において処理が開始されると、まずステップＳ
６１でベクターのマルチクローニングサイトの中で５′
側の切断に使用された制限酵素サイトを含み、この制限
酵素サイトから５′側の領域が５′側残留マルチクロー
ニングサイト５ＭＣＳとして定義される。図１３ではこ
の５ＭＣＳは５′側検索キーと同一となる。

【００６８】続いてステップＳ６２で、ベクターデータ
ベース内にマルチクローニングサイト以外の塩基配列も
含まれる場合、すなわち図１３のように５′側検索キ
ー、ここでは５′側残留マルチクローニングサイトより
も５′側に更に５個の塩基の配列が含まれているが、こ
のような場合には５ＭＣＳの５′側の５つの塩基を５Ｍ
ＣＳに追加したものが５′側残留ベクター領域５ＶＡと
して定義される。図１３ではこの５ＶＡは塩基配列ＧＴ
ＧＣＣＡＡＧＣＴＴである。ベクターデータベース内に
マルチクローニングサイトの塩基配列のみしか含まれな
い場合には５ＶＡは５ＭＣＳと同一とされるが、一般的
にはデータベース内にマルチクローニングサイトの前後
の塩基配列は必ずといってよい程含まれるので、次に述
べるホモロジーチェックが有効となる。

【００６９】この５′側残留ベクター領域５ＶＡが求め
られた後に、図１４によって求められた境界部位の１次
候補のリストの要素全てについてステップＳ６３〜Ｓ６
６の処理が行われ、ホモロジーチェックが実行される。
まずステップＳ６３で境界部位１次候補（ＬＩＳＴ５）
の各候補を含み、各候補より５′側のＤＮＡ塩基配列の
配列領域がその候補に対するホモロジーチェック領域５
ＨＣＡとして定義され、ステップＳ６４で５ＶＡの塩基
数と、５ＨＣＡの塩基数、および２０が比較され、一番
少ない塩基数がホモロジーチェックのための塩基数ＨＣ
Ｂとして求められる。ステップＳ６５で５ＶＡの３′側
からＨＣＢの数だけの塩基が取り出され、５ＨＣＡの
３′側からＨＣＢの数だけの塩基とのホモロジーのチェ
ックが行われ、一定値以上のホモロジーが得られた場合
に、ステップＳ６６でＤＮＡ塩基配列側のＨＣＢの数だ
けの塩基が５′側境界部位２次候補とされて、処理を終
了する。なお、このＨＣＢを求めるときに比較される２
０は多くも少なくもない一定数を意味し、その値自体に
は特別の意味はない。

【００７０】図１７はこの５′側の境界部位２次候補検
索処理としてのホモロジーチェックの説明図である。同
図において、クローンの塩基配列のうちで５′側境界部
位１次候補を含み、それより５′側の領域がホモロジー
チェックの対象となる領域５ＨＣＡとして定義され、そ
の中で例えば５ＶＡの塩基数と一致するＨＣＢの個数の
塩基が取り出され、ホモロジーチェックが行われて境界
部位２次候補が決定される。

【００７１】図１８は３′側における境界部位２次候補
の決定処理のフローチャートであり、図１９は３′側に
おける２次候補検索処理の説明図である。これらは図１
６、および図１７とほぼ同様であるので、その詳細な説
明を省略する。

【００７２】図２０はベクター部を除去するための最終
的な切断部位の決定処理のフローチャートである。同図
において処理が開始されると、まずステップＳ８１で
５′側と３′側の境界部位の２次候補がそれぞれ１つで
あるかどうかが判定され、それぞれ１つである場合には
ステップＳ８２で５′側の２次候補と３′側の２次候補
がクローン塩基配列上でその相互の位置関係に矛盾がな
いか、すなわち３′側の２次候補が５′側の前にくると
いうような矛盾がないか、また２つの２次候補がお互い
にオーバーラップするというような矛盾がないか否かが
判定され、矛盾がない場合にはステップＳ８３で５′側
の２次候補と３′側の２次候補とがそれぞれ切断部位と
して決定されて、処理を終了する。

【００７３】一方、ステップＳ８１で５′側と３′側の
２次候補がそれぞれ１つでない場合、またはステップＳ
８２で２つの２次候補の位置関係に矛盾がある場合に
は、ステップＳ８４でベクター部の特定は不可能である
として処理を終了する。

【００７４】このようにして切断部位が決定されると、
図３のステップＳ１８におけるベクター部除去プログラ
ムが実行される。このベクター部除去プログラムにおい
ては、図２０で決定された切断部位を含んでベクター部
が除去される。すなわち切断部位として決定された５′
側境界部位２次候補を含む５′側の塩基配列と、３′側
境界部位２次候補を含む３′側塩基配列とが共にベクタ
ー部として除去される。

【００７５】これに対して切断部位、すなわち制限酵素
サイトの塩基配列を全て含む部位を削除するのでなく、
制限酵素サイトについては制限酵素による切断位置から
ベクター部を除去することも可能であり、具体的な発明
の実施方法が以上の記述に限定されないことは当然であ
る。

【００７６】また以上の説明では記述しなかったが、例
えば境界部位１次候補の検索結果や、境界部位２次候補
の検索結果など、各種の検索結果をディスプレイ上で識
別可能とし、削除すべきベクター部の同定を容易にする
ことも可能である。

【００７７】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
ればベクター部と目的ＤＮＡ断片との境界部のごく短い
塩基配列を検索キーとしてホモロジー検索を行うことに
より、一般に複数の境界部位１次候補を求め、その１次
候補について更にその前後でのホモロジーチェックを行
うことによりベクター部の確実な特定が可能となる。特
に一般的にシーケンサの出力において３′末端部側にシ
ーケンシングミスが起こることがあるが、本発明によっ
て３′末端部側に混入したベクター部を正確に削除する
ことが可能となる。また検索結果をそれぞれ区別できる
形式でディスプレイ上に表示することにより、自動削除
できなかった部分に対してもユーザによるマニュアル削
除の可能性を残すことができ、比較的短時間の検索によ
りベクター部の検索を高精度で行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の機能ブロック図である。

【図２】本発明のベクター部自動除去方法の基本処理フ
ローチャートである。

【図３】本発明のベクター部自動除去処理の全体フロー
チャートである。

【図４】ベクターデータベース内に格納されているベク
ターリストの例を示す図である。

【図５】ベクターＰＵＣ１８の塩基配列を示す図であ
る。

【図６】ベクターＰＵＣ１８のマルチクローニングサイ
トと制限酵素情報を説明する図である。

【図７】ベクターＰＵＣ１８に対する制限酵素リストを
示す図である。

【図８】ベクター部特定プログラムの全体処理フローチ
ャートである。

【図９】制限酵素サイトの説明図である。

【図１０】ベクターに組み込まれた目的ＤＮＡ断片の説
明図である。

【図１１】５′側検索キー決定処理のフローチャートで
ある。

【図１２】３′側検索キー決定処理のフローチャートで
ある。

【図１３】ベクター部特定プログラムで用いられる、ホ
モロジー検索用検索キーを説明する図である。

【図１４】５′側境界部位１次候補の検索処理フローチ
ャートである。

【図１５】３′側境界部位１次候補の検索処理フローチ
ャートである。

【図１６】５′側境界部位２次候補の検索処理フローチ
ャートである。

【図１７】５′側境界部位１次候補のホモロジーチェッ
クの説明図である。

【図１８】３′側境界部位２次候補の検索処理フローチ
ャートである。

【図１９】３′側境界部位１次候補のホモロジーチェッ
クの説明図である。

【図２０】ベクター部除去のための切断部位決定処理の
フローチャートである。

【図２１】制限酵素によるＤＮＡ塩基配列の切断例を説
明する図である。

【図２２】目的ＤＮＡ断片を環状プラスミドＤＮＡ分子
に結合させる操作を説明する図である。

【図２３】ベクターとマルチクローニングサイトの例を
示す図である。

【図２４】ＤＮＡ断片の作り方を説明する図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ベクターに目的ＤＮＡ断片を組み込んで
   クローニングを行う、ＤＮＡクローニングの結果として
   のＤＮＡ塩基配列から、ベクター内の塩基配列の一部と
   してのベクター部塩基配列を除去するベクター部の自動
   除去方法において、 前記ベクターと、該ベクターの切断時に使用した制限酵
   素と、目的ＤＮＡ断片を得るために使用した制限酵素と
   に応じて、前記ベクター部を前記クローニング結果のＤ
   ＮＡ塩基配列から検索するための検索キーとなる塩基配
   列を作成し、 該作成された検索キーを用いて前記ベクター部塩基配列
   を特定し、該特定されたベクター部塩基配列の自動除去
   を行うことを特徴するＤＮＡ塩基配列に含まれるベクタ
   ー部の自動除去方法。
2. 【請求項２】 前記ＤＮＡクローニング結果としてのＤ
   ＮＡ塩基配列がＤＮＡの塩基配列決定用シーケンサの出
   力であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ塩基配
   列に含まれるベクター部の自動除去方法。
3. 【請求項３】 前記検索キーが、前記クローニング結果
   としての正確なＤＮＡ塩基配列のうちで、前記目的ＤＮ
   Ａ断片の前および後にあり、前記ベクター部と目的ＤＮ
   Ａ断片とのそれぞれが対応する制限酵素によって切断さ
   れた末端部を含み、かつ該ベクター部と目的ＤＮＡ断片
   のそれぞれの接合前の制限酵素サイトに相当する塩基配
   列を含む領域としての、前部検索キーおよび後部検索キ
   ーであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ塩基配
   列に含まれるベクター部の自動除去方法。
4. 【請求項４】 ベクターデータベースに登録されている
   ベクターの塩基配列データ、該ベクター内のマルチクロ
   ーニングサイトのデータ、および該マルチクローニング
   サイトにおける制限酵素サイトのデータを用いて、前記
   前部検索キーおよび後部検索キーの塩基配列を作成する
   ことを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ塩基配列に含ま
   れるベクター部の自動除去方法。
5. 【請求項５】 前記クローニング結果としてのＤＮＡ塩
   基配列に対する前記検索キーを用いた検索において、対
   応する塩基の一致の割合を示す類似度があらかじめ設定
   された一定値以上となることを条件としてホモロジー検
   索を行い、該検索結果をベクター・目的ＤＮＡ断片接合
   候補として求めることを特徴とする請求項１記載のＤＮ
   Ａ塩基配列に含まれるベクター部の自動除去方法。
6. 【請求項６】 前記前部検索キーまたは後部検索キーに
   対して、前記ベクターのマルチクローニングサイト内で
   前または後に隣接すべき部分を追加して第２の前部検索
   キーまたは第２の後部検索キーを作成し、前記クローニ
   ング結果としてのＤＮＡ塩基配列において前記ベクター
   ・目的ＤＮＡ断片接合部を含み、該第２の前部検索キー
   または第２の後部検索キーに対応する部分を対象とし
   て、対応する塩基の一致の割合を示す類似度があらかじ
   め設定された一定値以上となることを条件としてホモロ
   ジー検索を行い、該検索結果を含み、該検索結果の以前
   または以後の全ての領域をベクター部候補として特定す
   ることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ塩基配列に含
   まれるベクター部の自動除去方法。
7. 【請求項７】 前記ベクター内で、前記マルチクローニ
   ングサイトの更に前または後で該マルチクローニングサ
   イトに隣接すべき部分を更に追加して、前記第２の前部
   検索キーまたは第２の後部検索キーを作成することを特
   徴とする請求項６記載のＤＮＡ塩基配列に含まれるベク
   ター部の自動除去方法。
8. 【請求項８】 前記特定されたベクター部候補が、前記
   目的ＤＮＡ断片の前および後でそれぞれ１つのみであ
   り、かつ該目的ＤＮＡ断片の前のベクター部候補と後の
   ベクター部候補がオーバーラップしていない時、該特定
   されたベクター部候補を除去することを特徴とする請求
   項６、または７記載のＤＮＡ塩基配列に含まれるベクタ
   ー部の自動除去方法。
9. 【請求項９】 ベクターに目的ＤＮＡ断片を組み込んで
   クローニングを行う、ＤＮＡクローニングの結果として
   のＤＮＡ塩基配列から、ベクター内の塩基配列の一部と
   してのベクター部塩基配列を除去するベクター部の自動
   除去装置において、 前記ベクターと、該ベクターの切断時に使用した制限酵
   素と、目的ＤＮＡ断片を得るために使用した制限酵素と
   に応じて、前記ベクター部を前記クローニング結果のＤ
   ＮＡ塩基配列から検索するための検索キーとなる塩基配
   列を作成する手段と、 該作成された検索キーを用いて前記ベクター部塩基配列
   を特定し、該特定されたベクター部塩基配列の自動除去
   を行う手段とを備えることを特徴するＤＮＡ塩基配列に
   含まれるベクター部の自動除去装置。