JPH0940580A

JPH0940580A - 抗ＨＩＶ剤ＩＦＮ−ω

Info

Publication number: JPH0940580A
Application number: JP7192837A
Authority: JP
Inventors: S Cunzi Myriam; エスキュンツィミリアム; M Pissa Row Paula; エムピサロウポーラ
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 1997-02-10

Abstract

(57)【要約】【課題】ＨＩＶ感染を治療する。【解決手段】ＩＦＮ−ωを有効量投与し、ＨＩＶの
複製を抑制する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】哺乳類において、Ｉ型インタ
ーフェロン遺伝子は、アルファ−インターフェロン（Ｉ
ＦＮ−α）、ベータ−インターフェロン（ＩＦＮ−β）
及びオメガ−インターフェロン（ＩＦＮ−ω）の３種の
遺伝子ファミリーを含む上科を形成している。ヒトにお
いて、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−ωをコードする単機能遺
伝子のみが存在するのに対し、ＩＦＮ−αファミリーは
１３種の機能遺伝子を含有する。上記に述べた全てのイ
ンターフェロンは抗ウィルス作用及び抗増殖作用を有す
るが、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−αのＨＩＶに対するin v
ivo における抗ウィルス作用は限られている。さらに、
興味あることに、水胞性口内炎ウィルス又は脳心筋ウィ
ルスの複製の抑制によりインターフェロンの活性を測定
した場合、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−ωの間には大きな質
的な差異は認められないことが報告されている。（Adol
f ら。J. Biol. Chem. 265, 9290-9295;1990参照) 。イ
ンターフェロン媒介によるＨＩＶ発現抑制は、インター
フェロン誘導細胞性遺伝子によりコードされたタンパク
質とウィルス決定因子との間の複合体の相互作用による
ものと考えられる。in vitroにおける急性の感染におい
て、ＩＦＮの主な抗ウィルス作用は、プロウィルスのＤ
ＮＡ合成の形成前段階で起こるのに対し、慢性的な感染
細胞においては、ＩＦＮがウィルスの凝集を抑制するこ
とのようである。in vivo において、ＩＦＮ−αの上昇
した血清レベルは、初期にはＨＩＶの複製の抑制に貢献
しているようであるが、感染の後期には、ＩＦＮ−α耐
性の獲得率がＡＩＤＳの進行に伴い非常に増大する。最
近得られた証拠は、ＨＩＶ特異的 Tat及びRev タンパク
が、ＩＦＮの抗ウィルス作用を回避する役目をしている
可能性を示唆している。（Shirazi ら。J. Interferon
Res. 14, 259-263;1994 参照）。この結果は、Tat タン
パクが、ＩＦＮの抗ウィルス作用において重要な役目を
行う酵素であるdsRNA 依存プロテインキナーゼ（ＰＫ
Ｒ）のTar-媒介誘導を抑制することが可能であるという
知見に関係していることも考えられる。（Hovanessian,
J. Interferon Res. 9, 644-647; 1989参照）。

【０００２】驚くべきことに、ＩＦＮ−ωはＨＩＶ複製
の活性な抑制剤であり、ＨＩＶ−１の実験室分離株及び
一次分離株どちらも、同投与量を使用した場合、他のＩ
型インターフェロンによるよりも、より効果的にＩＦＮ
−ωにより抑制される。恐らく、ＩＦＮ−ωは、様々な
ＩＦＮ刺激性遺伝子をより持続させて発現させるように
誘導することにより、ＩＦＮ−α２耐性分離株の複製の
抑制を可能にしていると考えられる。ＩＦＮ−ωをコー
ドする遺伝子は既に分離され、配列を決定され、大腸菌
（E.coli, EP-B-0,170,204 参照) 、酵母（EP-A-0,264,
790参照) 、昆虫細胞(Vossら。Eur. J. Biochem. 217,
913-919;1993参照) 及びチャイニーズハムスターの卵巣
細胞(Adolfら。Biochem. Biophys. Acta 1089, 167-17
4;1991 参照) において発現されている。これらは、グ
リコシル化された形態及びグリコシル化されていない形
態で記載されている。従って、本発明は、グリコシル化
及び未グリコシル化のＩＦＮ−ωを有効量投与すること
を含む、ＨＩＶ−１感染症を処置する新しい方法及びグ
リコシル化及び未グリコシル化のＩＦＮ−ωを有効量含
有する相当する医薬組成物の製造方法に関する。

【０００３】

【発明の実施の形態】ＩＦＮ−ωのＨＩＶ−１複製を抑
制する活性を以下のように試験した。２×１０⁶の抹消
血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、ウィルスチャレンジの８
時間前に１mlあたり５から５００ユニットのＩＦＮ−ω
で処理した。重複させた培養物（duplicate culture)
を、Ｔ細胞栄養性ＨＩＶ−１分離株ＮＬ４−３及び／又
はそのマクロファージ変異体ＡＤ８１と共に、３×１０
³cpm の逆転写酵素（ＲＴ）活性において接種し、１２
日間ＩＦＮ−ωの連続存在下に維持した。ＨＩＶ−１の
複製は、培養物の上澄みを、感染後様々な時間において
ＲＴアッセイによりモニターした。ＩＦＮ−ωの存在下
及び非存在下における重複ＲＴの活性測定値の平均を時
間に対してプロットした。ＩＦＮ−ωは、Ｔ細胞栄養性
ＨＩＶ−１実験室分離株ＮＬ４−３及びそのマクロファ
ージ栄養性変異体ＡＤ８１の複製も、全ての濃度におい
て抑制することが見出された（図１Ａ及び図１Ｂ）。抑
制は、投与量に依存しているが、上澄みのＲＴ活性の減
少は、ＩＦＮの濃度と直線的な比例関係にはなかった。
細胞の生存率は感染を通して９０％より大きかった。Ｉ
ＦＮ−ω及びＩＦＮ−α２との比較を次のように行っ
た。３種のＩＦＮ−α２−感受性株（図２Ａ、図２Ｂ、
図２Ｃ）及び３種のＩＦＮ−α２−非感受性株（図３
Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ）のＨＩＶ−１一次分離株の、ＩＦ
Ｎ−α２及びＩＦＮ−ωに対する感受性の試験を同じ投
与量（１００U/ml）で行った。ＩＦＮ−ω又はＩＦＮ−
α２の存在下或いは非存在下において重複させた培養物
の平均のＲＴ活性を、時間に対してプロットし、かつ抑
制率（％Ｉ）を得られた曲線の下部の面積の差異から計
算した。ＩＦＮ−α２感受性一次分離株は、ＩＦＮ−ω
に対して感受性であるばかりでなく、１００U/mlにおけ
るウィルス複製の抑制は、ＩＦＮ−α２よりもＩＦＮ−
ωの方が大きいことが見出された。分離株ＮＬ４−３及
びＡＤ８１に対して、ＩＦＮ−ωのグリコシル化形態を
用いたとき同様の結果が得られた。さらに、ＩＦＮ−ω
は、同じ投与量においてＩＦＮ−α２に対して耐性であ
る３種の分離株の複製を抑制する（２０％未満の抑制）
ことが可能であった。これらの知見は、次の表１に要約
される。

【０００４】

【表１】表１抑制率表現型 HIV-1 分離株 IFN-α2 IFN-ω IFN-α2 IFN-ω ＮＬ４−３６７８６ＳＳＡＤ８１７８９３ＳＳＰＩ８６５９７０８５ＳＳＰＩ８３７７４８７２ＳＳＰＩ８６３７７５８９ＳＳＰＩ７６３３９４３ＲＳＰＩ７７００１７３９ＲＳＰＩ７６０２２０５１ＲＳＳ＝ＩＦＮ感受性（＞２０％抑制）Ｒ＝ＩＦＮ耐性（＜２０％抑制）

【０００５】抑制メカニズムを以下のように調べた。Ｈ
ＩＶ−１複製の抑制メカニズムをさらに詳細に調べるた
め、単伝染環のウィルスのタンパク質合成におけるＩＦ
Ｎ−ωの効果を調べ、ＩＦＮ−α２において観察される
それと比較した。ＰＢＭＣｓを、ＩＦＮで前処理を行
い、ＩＦＮ−ω又はＩＦＮ−α２の１００U/ml存在下又
は非存在下において、1.５×１０³cpm/mlのＨＩＶ−
１、ＮＬ４−３でチャレンジした。ＨＩＶ−１タンパク
質のレベルを感染９６時間後に測定した。ウェスタンブ
ロット分析により、ＩＦＮの非存在下において、高レベ
ルのｐ５５及びｐ２４を検出し、また微量のｐ１６０も
検出した。ＩＦＮ−α２の存在下において、これらのウ
ィルスタンパク質のレベルは著しく低いが、ＩＦＮ−ω
の同投与量存在下ではかろうじて検出可能であった（図
４）。

【０００６】次にＩＦＮ誘導遺伝子の発現について述べ
る。ＩＦＮの抗ウィルス活性は、受容体へのＩＦＮの結
合により誘発された多数の細胞性遺伝子により媒介され
る。そのため、ＩＦＮ−ω及びＩＦＮ−α２によるＨＩ
Ｖ−１複製の抑制率の差異が、ＩＦＮ誘導細胞性遺伝子
の発現の差異に相当しているかどうかを検討した。ＰＢ
ＭＣｓを１００U/mlのＩＦＮ−ω又はＩＦＮ−α２で処
理し、全細胞性のＲＮＡを処理後２、４及び８時間後に
分離し、ＩＦＮ刺激性遺伝子の誘導反応速度をノザンブ
ロット法により分析を行った（図５）。２',５' −オリ
ゴアデニレート合成酵素（２',５' −ＯＡＳ）ｍＲＮＡ
はＩＦＮ−ω及びＩＦＮ−α２で処理した細胞内で２時
間まで検出可能であった。しかし、２',５' −ＯＡＳの
転写レベルはＩＦＮ−α２で処理後４時間で最大とな
り、８時間までに減少した。これに対し、ＩＦＮ−ωで
処理した細胞内では、ピークとなった後一定になった。
同様にＩＲＦ−１及び９−２７遺伝子からの転写レベル
は、ＩＦＮ−ωで処理した細胞内で誘導される間一定で
あったのに対し、ＩＦＮ−α２処理細胞は８時間までに
減少した。しかし、最も明らかな質的な差異は、ＩＳＧ
−１５をコードする遺伝子の誘導と共に見出された。こ
の遺伝子の発現は、ＩＦＮ−α２処理細胞内において
２',５' −ＯＡＳをコードする遺伝子と同じパターンの
後に続くが、ＩＦＮ−ωは高レベルのＩＳＧ−１５ｍＲ
ＮＡを誘導し、これらのレベルは誘導の間一定であっ
た。このように、ＩＦＮに接触させて８時間後のウィル
スチャレンジの際、２',５' −オリゴアデニレート合成
酵素、ＩＲＦ−１、９−２７及びＩＳＧ−１５ｍＲＮＡ
は、ＩＦＮ−α２で処理した細胞におけるよりも、ＩＦ
Ｎ−ωで処理した細胞内の方が高レベルであった。

【０００７】次のインターフェロン、細胞、ウィルスス
トック及び一般的方法が用いられた。ＩＦＮ−ω及びＩ
ＦＮ−α２の抗ウィルス活性を、ＭＴＴ（Cheungら。J.
Immunol. 146, 121-127; 1991参照）を使用して細胞変
性アッセイで試験した（Hansenら。J. Immunol. Method
s 119, 203-210; 1989参照）。水胞性口内炎ウィルスを
チャレンジングウィルスとして、ＥＢＴｒ（ＮＢＬ−
４）ウシ気管細胞を指標細胞として用いた。このアッセ
イにおいて、活性は、ＩＦＮ−α２を指標として用いて
標準化した。抹消血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をヘマフェ
レーズド（hemapheresed）標準供与血から、メーカーの
指示に従い、フィコル（Ficoll）(Organon Teknica Cap
pel,Durham, NC)で遠心分離を行い、５ mg/mlのフィト
ヘムアグルチニン(DIFCO Laboratories, Detroit, MI)
で４８時間刺激を行い、１５％熱不活性化胎児ウシ血清
（ＦＢＳ）、２ mM Ｌ−グルタミン、５０ mg/mlのゲン
タマイシン及び１０ユニット/ml のインターロイキン２
（GIBCO BRL)を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地（GIBCO
BRL, Grand Island, NY)中に維持した。ＣＥＭｘ１７４
細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地、２mMＬ−グルタミン及
び５０ mg/mlゲンタマイシン中に維持した。

【０００８】ＨＩＶ−１ＮＬ４−３（Adachiら。J. Vio
rl. 59, 284-291(1986) 参照) のストック及びマクロフ
ァージ栄養性変異体ＡＤ８１（Freed ら。Nature 369,
107-108; 1994 参照) をジャーカット細胞内で、それぞ
れの感染クローン分子（ｐＮＬ４−３及びｐＡＤ８１）
の電気穿孔法により作製した。ＨＩＶ一次分離株はＨＩ
Ｖ血清反応陽性の供与体から誘導された。次にウィルス
ストックを、ＰＨＡで刺激した未感染の標準供与体ＰＢ
ＭＣｓと感染させたＰＢＭＣｓの短期共培養物から上澄
みを、濃縮せずに収穫した（Kunzi ら。J. Inf. Diseas
es 171, 822-828; 1995 参照) 。全てのストックの定量
は、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイにより決定し、cpm/ml
で表されている。ＩＦＮへの感受性を決定するため、細
胞をウィルスチャレンジの８時間前に処理し、１００ユ
ニット/ml の組み換えＩＦＮ−α２又は組み換えＩＦＮ
−ω内で維持した。ＩＦＮの存在又は非存在下に、２×
１０⁶の細胞を、ＲＴ活性が1.５×１０³cpm/mlのウィ
ルス接種数でチャレンジした。感染は重複して行われ、
培養液の上澄み液のＲＴ活性を、接種後、４日、８日及
び１２日後にアッセイした。

【０００９】逆転写酵素（ＲＴ）アッセイを以下のよう
に行った。ヴィリオンを伴った逆転写酵素活性を、前述
したように本質的に測定した（Shirazi et al. J. Vior
l. 66, 1321-1328; 1992参照）。簡単に述べると、１０
μl の培養上澄み液を、５０ mM ＴＲＩＳ（ｐＨ７.
8）、７.5 mM ＫＣｌ、５ mMＭｇＣｌ₂、２ mM ジチオ
スレイトール( ＤＴＴ）、0.０５％ノニデット(Nonide
t) P-40(Sigma, St. Louis, MO)及び０.5μCi [α³²P]
ＴＴＰ（３０００Ci/mmol)(ICN, Irvine, CA) 中に、po
ly(A) 及びoligo(dT)(1.57μg/ml)(Pharmacia, Piscata
wy, NJ) の鋳型プライマーを含有する５０μｌのＲＴ反
応緩衝液と混合した。反応液を３７℃で２時間培養し
た。反応生成物を、ＤＥ８１紙上にドット−ブロット装
置（Whatman International Ltd., Maidstone, Englan
d) でブロットした。試験紙を２０×ＳＳＣ（０.3 M Na
Cl, 0.63 M クエン酸ナトリウム) で２回洗浄し、９５
％エタノールで１回洗浄した。乾燥後、放射能をシンチ
レーションカウンターで測定した。アッセイの精度及び
再現性の確認には、力価が既知であるウィルスストック
（ＮＬ４−３）をポジティブコントロールとして用い
た。ＩＦＮの存在下又は非存在下のＲＴ活性の平均値
を、時間に対してプロットしており、抑制率（％Ｉ）
は、得られた曲線の下側の面積の差として表現されてい
る。（kunzi et al. J. Inf. Diseases 171, 822-828;
1995参照) 。

【００１０】ウェスタンブロット分析を以下の様に行っ
た。細胞を、リン酸緩衝塩液で洗浄し、かつ５０ mM Ｔ
ｒｉｓ、１５０ mM ＮａＣｌ、０.1％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、１％ノニデット(Nonidet) P-40、0.
５％デオキシコール酸ナトリウム及び２ mM フェニルメ
チルスルフォニルフルオライド(Sigma, St. Louis, MO)
に溶解した。１００ mg の細胞性タンパク質をＳＤＳ−
ポリアクリルアミド（Bio-Rad Laboratories, Richmon
d, CA) 電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィ
ルター(Millipore, Bedford, MA)上に電気ブロットによ
り転写した。フィルターを次に、ＨＩＶ血清反応陽性の
供与体からの血清と共に培養し、ＨＩＶ特有の抗原抗体
錯体を¹²⁵Ｉでラベルしたタンパク質Ａ（New England
Nuclear, Boston, MA)と共に検出した。新しい抗ＨＩＶ
−１作用において、ＩＦＮ−ωは、ＨＩＶ−１による感
染の処置にそれ自身のみで有効であるか、又は抗レトロ
ウィルス活性を有する他の化合物との組み合わせにより
有効である。抗レトロウィルス活性を有する他の化合物
とは、核酸誘導体（例えば、ジドブジン（zidovudine,
1000-1200mg/日) 、ＤＤＩ（200-750mg/日) 、ＤＤ
Ｃ）、非核酸逆転写酵素抑制剤（例えば、ネビラピン
（nevirapine(100-1000mg/日) 、又はプロテアーゼ抑制
剤（例えばＲｏ３４−８９５９（200-2000 mg/日) が挙
げられる。

【００１１】従って、本発明の他の目的は、ＩＦＮ−ω
の有効量とさらにＨＩＶに対して活性な成分の有効量と
を組み合わせることにあるが、これらは別々に投与され
てもよい。ＩＦＮ−ωは、処置を要する被験体に非経口
投与してもよい。投与量及び投与率は、毎日又は１週間
に３回、約１×１０⁶−１０×１０⁶ユニットであり、
このとき、さらに有効量のＨＩＶに対する活性成分を経
口投与してもよい。ＩＦＮ−ωの典型的な医薬製剤は、
凍結乾燥してバイアルに入れたものである。剤形には、
安定剤としてヒト血清アルブミンを含有する。再構成し
た溶液の組成を例に示す。ＩＦＮ−ω 16.5 mcg (≡6.6 ×10⁶IU) ヒトアルブミン 5.00 mg/ml 塩化カリウム 0.20 mg/ml リン酸二水素カリウム 0.20 mg/ml 塩化ナトリウム 8.00 mg/ml リン酸水素二ナトリウム・12水和物 2.89 mg/ml 注射用の水 1.00 ml

【００１２】本発明のＩＦＮ−ωは、有用な医薬組成物
を作製する既知の方法に従って、製剤化でき、このとき
ポリペプチドは製薬上許容されるキャリアビヒクルとの
混合物と組み合わせられる。適するビヒクル及び形態に
ついては、E. W. MartinによりRemington's Pharmaceut
ical Scienceに述べられており、参考例が明確に記載さ
れている。ＩＦＮ−ωは、受容者（患者）への有効な投
与に適する製薬上許容される組成物を調製するために、
適する量のビヒクルと混合される。好ましい投与方法は
非経口投与である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＩＶ−１複製の、ＩＦＮ−ω媒介による抑
制。ＰＨＡ刺激によるＰＢＭＣｓは未処理であるか、又
は５、５０又は５００ U/mL のＩＦＮ−ωで８時間処理
した。１×１０⁶細胞/mL の重複させた培養物を、ＲＴ
活性が１.5×１０³cpm/mLのＨＩＶ−１ＮＬ４−３でチ
ャレンジした。培養物の上澄みのＲＴ活性を４日間毎に
アッセイし、各回毎に細胞を１：２に分割し、新鮮な培
地でＩＦＮ−ωの存在下又は非存在下に培養を行った。
平均ＲＴ活性は、cpm/mLで表されており、時間に対して
プロットされている。Ａ：Ｔ細胞栄養性ＨＩＶ−１ＮＬ４−３実験室分離株。Ｂ：ＮＬ４−３、ＡＤ８１のマクロファージ栄養性突然
変異体。

【図２】ＨＩＶ−１一次分離株に対する、ＩＦＮ−ω及
びＩＦＮ−α２媒介による抑制の比較。ＰＨＡ刺激によ
るＰＢＭＣｓは未処理であるか、又は１００ U/mL のＩ
ＦＮ−ωで８時間処理した。ＨＩＶ−１一次分離株によ
る感染を行い、上澄みのＲＴ活性を図１と同様にアッセ
イ及びプロットを行った。Ａ：ＩＦＮ−α２感受性一次分離株８６５９。Ｂ：ＩＦＮ−α２感受性一次分離株８３７７。Ｃ：ＩＦＮ−α２感受性一次分離株８６３７。

【図３】ＩＦＮ−α２耐性ＨＩＶ−１一次分離株の複製
はＩＦＮ−ωにより抑制される。ＰＢＭＣｓを図１に述
べたように刺激し、ＩＦＮ−α２耐性ＨＩＶ−１一次分
離株によりチャレンジした。ウィルスの複製を図１と同
様にアッセイし、記録した。Ａ：ＩＦＮ−α２耐性一次分離株７５３３。Ｂ：ＩＦＮ−α２耐性一次分離株７７００。Ｃ：ＩＦＮ−α２耐性一次分離株７６０２。

【図４】ウィルスタンパク質のレベルに対するＩＦＮ−
ωの効果。５×１０⁶ＰＨＡ刺激を行ったＰＢＭＣｓは
未処理（レーンａ）であるか、或いはＲＴ活性（＋）が
１.5×１０³cpm/mLのＨＩＶ−１ＮＬ４−３でチャレン
ジする前に、１００ U/mL のＩＦＮ−α２（Ａ）（レー
ンｂ）又はＩＦＮ−ω（Ｗ）（レーンｃ）で８時間処理
した。タンパク質を感染９６時間後に単離し、ＨＩＶ特
有タンパク質の発現を、ＨＩＶ血清反応陽性の供与体か
ら血清と共にウェスタンブロット分析により検出した。

【図５】ＩＦＮ−α２又はＩＦＮ−ωで処理された細胞
内のＩＦＮ刺激遺伝子の誘導反応速度のノザンブロット
分析。ＲＴ活性（＋）が１.5×１０³cpm/mLのＨＩＶ−
１ＮＬ４−３でチャレンジする前に、１×１０⁷の未感
染ＰＨＡ刺激を行ったＰＢＭＣｓを１００ U/mL のＩＦ
Ｎ−α２（Ａ４２）又はＩＦＮ−ω（Ｗ）で処理した。
全細胞性ＲＮＡをＩＦＮ処理後所定の時間毎に分離し、
５μｇのＲＮＡを２',５' −ＯＡＳ、ＩＲＦ−１、９−
２７、ＩＳＧ−１５及びアクチン特有プローブを用いて
ノザンハイブリダイゼーション(Nothern hybridizatio
n) により分析を行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ポーラエムピサロウアメリカ合衆国メリーランド州 21210 バルティモアハントリースクエア 5503

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効量のＩＦＮ−ωを含有するＨＩＶ
感染を治療するための医薬組成物。
【請求項２】有効量のＩＦＮ−ωを投与することに
よりＨＩＶの複製を抑制する請求項１記載の医薬組成
物。
【請求項３】ＩＦＮ誘導遺伝子の持続した発現によ
りＨＩＶの複製を抑制する請求項１及び２記載の医薬組
成物。
【請求項４】有効量のＨＩＶに対してより活性な成
分をさらに投与することを含む請求項１〜３いずれかに
記載の医薬組成物。
【請求項５】有効量のＩＦＮ−ωを投与することを
含むＨＩＶ感染の治療方法。
【請求項６】有効量のＩＦＮ−ωを投与し、ＨＩＶ
の複製を抑制することを含む請求項５記載のＨＩＶ感染
の治療方法。
【請求項７】ＩＦＮ誘導遺伝子の持続した発現によ
りＨＩＶの複製を抑制する請求項５及び６記載の方法。
【請求項８】請求項１〜４のいずれかに記載の医薬
組成物を製造するための、有効量のＩＦＮ−ωの使用。
【請求項９】有効量のＩＦＮ−ωが適するキャリア
に包含されている請求項１〜４いずれかに記載の医薬組
成物の製造方法。