JPH0948800A - ガラニンレセプター蛋白質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】ガラニンレセプター蛋白質またはその塩、
該ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチド、該ガラニ
ンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含
有するプラスミド、該プラスミドを保持する形質転換
体、該ガラニンレセプター蛋白質の製造法、該ガラニン
レセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画
分、ガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニング方法またはスクリーニング用キッ
ト、該スクリーニング方法またはスクリーニング用キッ
トで得られるガラニンレセプターアゴニストまたはアン
タゴニスト、該ガラニンレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストを含有する医薬組成物、該ガラニンレセプ
ター蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体。 【効果】このスクリーニング方法によれば、胃潰瘍、糖
尿病、アルツハイマー病、痴呆症などの予防・治療剤、
鎮痛剤などの医薬品を早期に開発することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規ガラニンレセ
プター蛋白質あるいはその部分ペプチドもしくはその
塩、該ガラニンレセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ガラニンレ
セプター蛋白質あるいはその部分ペプチドもしくはその
塩の製造方法、該ガラニンレセプター蛋白質（またはそ
の部分ペプチド）およびそのＤＮＡの用途、該ガラニン
レセプター蛋白質あるいはその発現細胞を用いるガラニ
ンの生理活性の測定方法、および該ガラニンレセプター
蛋白質あるいはその発現細胞を用いるガラニンレセプタ
ーアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
法、該スクリーニングのためのキット、該スクリーニン
グ方法で得られたアゴニストまたはアンタゴニスト、さ
らに該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬
に関する。

【０００２】一つの態様では本発明は、マウス膵臓β細
胞株ＭＩＮ６由来の新規マウス由来ガラニンレセプター
蛋白質またはその塩、その蛋白質の部分ペプチドまたは
その塩、該マウス由来ガラニンレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該マウス由来ガラニン
レセプター蛋白質の製造方法、該ガラニンレセプター蛋
白質およびそのＤＮＡの用途、マウス由来ＭＩＮ６細胞
あるいは該マウス由来ガラニンレセプター蛋白質を用い
るガラニンの生理活性の測定方法、およびマウス由来Ｍ
ＩＮ６細胞または該マウス由来ガラニンレセプター蛋白
質を用いるガラニンレセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング方法に関する。

【０００３】好ましい態様では本発明は、ヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質
の部分ペプチド、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質また
はその部分ペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含
有するベクター、該ベクターを保持する形質転換体、ヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質の製造法、ヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質あるいはヒト・ガラニンレセプター
蛋白質発現細胞を用いるガラニンレセプターアゴニスト
／アンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリーニ
ング用キット、該スクリーニング方法で得られるヒト・
ガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト、
および該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医
薬組成物に関する。

【０００４】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機
能を調節している。これらのレセプター蛋白質の多くは
共役している guanine nucleotide-binding protein
（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通
じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また７個の膜貫通
領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセ
プター蛋白質と総称される。Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、
それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば
ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的と
して非常に重要な役割を担っている。

【０００５】膵臓は消化液を分泌する他にグルカゴンや
インシュリンを分泌することにより糖代謝に重要な役割
を果たしている。インシュリンは膵臓のβ細胞から分泌
されるが、主としてグルコースにより促進される。この
膵臓のβ細胞にも様々なレセプターが存在し、グルコー
ス以外の多くの因子、ペプチドホルモン（ガラニン，ソ
マトスタチン，ガストリックインヒビトリーポリペプチ
ド，グルカゴン，アミリンなど）、糖（マンノースな
ど）、アミノ酸、神経伝達物質などにより、インシュリ
ンの分泌が制御されていることが知られている。しか
し、ガラニン、アミリンについてはレセプター蛋白質ｃ
ＤＮＡの構造に関する知見はこれまでに報告されていな
い。さらに未知のレセプター蛋白質やレセプター蛋白質
サブタイプが存在するかどうかについても分かっていな
かった。

【０００６】膵臓の複雑な機能を調節する物質と、その
特異的レセプターとの関係を明らかにすることは、医薬
品開発に非常に重要な手段である。そして膵臓の機能を
調節するためのレセプター蛋白質に対するアゴニスト、
アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を
開発するためには、レセプター蛋白質の遺伝子の機能を
解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要
であった。近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が、
その構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すことを利
用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Poly
merase Chain Reaction ：以下、ＰＣＲと略称する）法
によって新規レセプター蛋白質を探索する方法が行われ
るようになった。

【０００７】ガラニンは中枢、末梢に存在するペプチド
であり、中枢では神経伝達物質（アセチルコリン）の遊
離抑制（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコ
ロジー、１６４巻、３５５−３６０頁、１９８９年）、
外来性アセチルコリンとの拮抗作用（プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ＵＳＡ、８５巻、９８４１−９８４５頁、１９８８
年）、膵臓ではインスリン分泌抑制（ダイアベーツ、３
４巻、１９２−１９６頁、１９８５年）などの薬理作用
を現す。また、ガラニンには学習行動を抑制したり（ニ
ューロサイエンス・レターズ、８８巻、３３１−３３５
頁、１９８８年）、食餌後の満腹感を抑制する効果など
も確認されている。これらの知見はガラニンの作用を阻
害する薬物を開発すれば、これが向知能薬や肥満治療
薬、あるいは糖尿病治療薬として用いることができる可
能性を示唆している。

【０００８】ガラニンの薬理作用は、すべて標的組織に
存在している特異的なガラニンレセプターを介して行わ
れる。したがって、ガラニン作用を阻害する最も簡便な
方法は、ガラニンがレセプターに作用する反応を特異的
に阻害する薬物、すなわち、ガラニンレセプターアンタ
ゴニストを開発することである。一般に、レセプターア
ンタゴニストを開発するためにはレセプター結合実験を
行う必要がある。ガラニンの場合にも、すでに、脳海馬
（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー、１８１巻、２６９−２７６頁、１９８９年）や胃、
十二指腸（ペプタイズ、１１巻、３３３−３３８頁、１
９９０年）などの膜画分を用いたガラニンレセプター結
合実験が報告されている。

【０００９】また、ラット膵臓より得られたＲｉｎ- ｍ
- ５Ｆ細胞にも特異的なガラニンレセプターが存在する
ことが報告されている（エンドクリノロジー、１２４
巻、２６３５−２６４１頁、１９８９年）。これらの報
告に従えば、ガラニンレセプター結合実験を実施するこ
とが可能である。しかしながら、これらの膜画分中のガ
ラニンレセプター含量は５０ｆｍｏｌ/ ｍｇ前後と極め
て低く、一回の測定に多量の膜画分を使用する必要があ
った。

【００１０】ガラニンは、生体内で前述したような薬理
作用を発揮するが、これらの作用を試験管内で簡便に測
定できるようになれば、レセプターアンタゴニストを開
発する過程においても有意義である。ガラニンのインス
リン分泌抑制作用については、膵臓より単離したランゲ
ルハンス島を用いた試験管内測定法で代替できることが
すでに報告されている（ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・ファーマコロジー、２０３巻、１１１−１１４頁、
１９９１年）。しかしながら、ランゲルハンス島は実験
のたびに単離する必要があり、この方法も簡便な方法と
は言えない。

【００１１】さらに簡便な方法として膵臓のβ細胞株
（Rin-m-5F細胞）を用いる方法が幾つか報告されてい
る。例えば、ガラニンレセプターのセカンドメッセンジ
ャー系への効果、すなわちアデニレートサイクレースを
阻害する活性を測定する方法（ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー、１７７巻、１４７−１
５２頁、１９８８年）、およびカリウムチャンネルを開
口する活性を測定する方法（プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ＵＳＡ、
８５巻、１３１２−１３１６頁、１９８８年）などであ
る。また、本細胞株を用いたガラニンのインスリン分泌
阻害活性を測定する方法も報告されているが、これら
は、フォルスコリン（アデニレートサイクレース活性化
剤）依存性のインスリン分泌についてのみであり、グル
コース依存性のインスリン分泌についての測定は不可能
であった。また、インスリン分泌量が少なく感度は低い
ものであった。

【００１２】その後、トランスジェニックマウスの膵臓
を用いたβ細胞株の作製法が開発され（プロシーディン
グ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・
ＵＳＡ、８５巻、９０３７−９０４１頁、１９８８
年）、βＴＣ−１細胞（プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ＵＳＡ、８５
巻、９０３７−９０４１頁、１９８８年）、ＩｇＳＶ１
９５細胞（ダイアベーツ、３８巻、１０５６−１０６２
頁、１９８９年）、ＭＩＮ６細胞（エンドクリノロジ
ー、１２７巻、１２６−１３２頁、１９９０年）などの
細胞株の樹立が報告された。なかでも、ＭＩＮ６細胞は
グルコース濃度に応じてインスリンを分泌するというβ
細胞本来の分化機能を最もよく保持し、またインスリン
の分泌量も高い。しかしながら、このＭＩＮ６細胞にガ
ラニンレセプター蛋白質が発現していることは未だ知ら
れていなかった。また、ガラニンの生物活性の評価系
や、ＭＩＮ６細胞を用いてガラニンレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストをスクリーニングするための効
率の良い具体的な方法については提案されていなかっ
た。

【００１３】最近、ヒト由来のガラニンレセプター蛋白
質をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、その塩基
配列および該ｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列が明
らかにされた（プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミック・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA. ）９１、９７８０−９７８３頁、１０月
１１日、１９９４年）。しかしながら、該レセプターを
用いてガラニンレセプターアゴニスト／アンタゴニスト
をスクリーニングするための具体的手段については一切
記載されていない。そこで、ガラニンレセプターアゴニ
スト／アンタゴニストを効率良くスクリーニングする方
法の開発が望まれていた。

【００１４】ガラニンは、１９８３年にブタ小腸より単
離された２９アミノ酸残基から成るポリペプチドで〔Ta
temoto, K. et al., フェブス・レター(FEBS Lett.) 1
64,124-128(1983) 〕、その一次構造は他の脳腸管ホル
モンとはほとんど類似していない。ガラニン免疫活性
は、そのレセプターとともに広く中枢神経系および末梢
神経系に分布しており〔Scofitsch, G. and Jacobowit
z, D.M. ペプタイズ（Peptides），６，５０９−５４
６（１９８５）、Melander, T.et al., ジャーナル・オ
ブ・コンパラティブ・ニューロロジー（J. Comp. Neuro
l.）、２４８、４７５−５１７（１９８６）、Rokaeus,
A.,トレンズ・イン・ニューロサイエンス（Trends in
Neurosci. ）、１０、１５８−１６４（１９８７）〕、
その分布のパターンは５−ＨＴ、ノルアドレナリン、ア
セチルコリンなどの古典的神経伝達物質を含む領域と一
致することから、これらの神経伝達物質と共存している
ことが考えられ、ガラニンはこれらの神経伝達物質によ
る前神経、後神経作用の調節を行っているものと思われ
る。

【００１５】ガラニンの生理作用は多岐にわたってお
り、中枢神経系においては脊髄神経系における単シナプ
ス反射を強力に抑制し〔Yanagisawa, M.et al., ニュー
ロサイエンス・レター（Neurosci. Lett. ）、７０、２
７８−２８２（１９８６）〕、その作用はソマトスタチ
ンよりはるかに強力であることが示された。また、ラッ
ト室旁核への投与による摂食行動の刺激〔Kyrokouli,
S.E. et al., ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファ
ルマコロジー（Eur. J. Pharmacol.）、１２２、１５９
−１６０（１９８６）〕、記憶形成への関与〔Crawley,
J.N. and Wenk, G.L., トレンズ・イン・ニューロサイ
エンス（Trends Neurosci.）、１２、２７８−２８２
（１９８９）〕、正中隆起におけるドーパミン分泌の抑
制〔Nordstrom,O. et al., ニューロサイエンス・レタ
ー（Neurosci. Lett. ）、７３、２１−２６（１９８
７）〕、海馬複側でのアセチルコリン放出の抑制〔Fiso
ne, G. etal.,プロシージングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８４、７３３
９−７３４３（１９８７）〕、５−ＨＴの代謝回転の低
下〔Fuxe, K. et al.,Acta.Physiol. Acand. 、１３
３、５７９−５８１（１９８８）〕、そしてＡＴＰ感受
性Ｋ⁺ チャンネルを活性化しグルタミン酸の放出を低下
させる〔Ben-Ari, Y.,ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・ニューロサイエンス（Eur. J. Neurosci. ）、２、６
２−６８（１９９０）〕などガラニンの中枢における生
理的重要性が大きく示唆されている。

【００１６】特に、ガラニンは内側中隔核、対角束核お
よび基底核においてコリンアセチルトランスフェラーゼ
が共存している唯一の神経ペプチドであり〔Melender,
T. et al.,ブレイン・リサーチ（Brain Res.）、３６
０、１３０−１３８（１９８５）、Melender, T. et a
l.,ニューロサイエンス・レター（Neurosci. Lett.
）、１９、２２３−２４０（１９８６）、Chen-Palay,
V., ブレイン・リサーチ（Bran Res. Bull）、２１、
４６５−４７２（１９８８）〕、コリン作動性神経に抑
制的に働くことが示されている一方で、アルツハイマー
症においてこれらの部位でコリン作動性神経に変性が見
られることから、ガラニンのアンタゴニストがアルツハ
イマー症などによるコリン作動性神経の変性を防げるの
ではないかと期待されている（Whitehouse, P. J. et a
l., サイエンス（Science ）、２１５、１２３７−１２
３９（１９８２）、Chen-Palay, V., ジャーナル・オブ
・コンパラティブ・ニューロロジー（J. Comp. Neuro
l.）、２７３、５４３−５５７（１９８８））。下垂体
においては、成長ホルモン、プロラクチンの分泌刺激作
用が認められており〔Tanoh, T. et al., ニューロエン
ドクリノロジー（Neuroendocrinology）、５４、８３−
８８（１９９１）、Koshiyama, H. et al., ニューロサ
イエンス・レター（Neurosci. Lett. ）、７５、４９−
５４（１９８７）〕、特に、成長ホルモン分泌において
視床下部ソマトスタチン分泌調節を介するコリン作動性
ニューロンの関与が示されている。

【００１７】一方、末梢系では、膵臓において、インス
リンに対しガラニンがその基礎分泌をin vivo 、in vit
roともに抑制し〔McDnald, T. J. et al.,ダイアベイツ
（Diabates）、３４、１９２−１９６（１９８５）、Ta
keda, Y. et al., バイオメディカル・リサーチ（Biom
ed. Res.）、８（Suppl.）、１１７−１２５（１９８
７）、Lindskog, S. et al., Acta. Physiol. Scand.、
１２９、３０５−３０９（１９８７）〕、さらには, グ
ルコース刺激によるインスリン放出をも抑制する〔Dunn
ing, B.E. and Taborsky G.J., Jr., ダイアベイツ（Di
abates）、３７、１１５７−１１６２（１９８８）〕。
さらに、β細胞のランゲルハンス島周囲に密なガラニン
免疫活性を含む神経繊維網が認められるという免疫組織
学的な知見と考えあわせ、ガラニンが膵ホルモン、特に
インスリンの分泌の神経調節因子の１つであることを強
く示唆している。また、胃においてもガラニンは用量依
存的にソマトスタチンの基礎分泌を抑制し、あるいはＧ
ＲＰ刺激によるガストリン分泌およびソマトスタチン分
泌を抑制すること、ガラニン免疫活性を含む神経繊維網
が胃に認められることから、ガラニンは胃においても胃
内分泌調節の重要な神経調節因子の１つとして作用して
いることが示唆されている〔Yanaihara, N. etal., ガ
ラニン（In Galanin (eds. by Hokfelt, T. et al.), M
acmillan Press、１８５−１９６（１９９１）〕。

【００１８】これらのことから、ガラニンアゴニストは
成長ホルモン分泌刺激剤、インスリン分泌抑制剤などの
医薬品として有用であり、一方、ガラニンアンタゴニス
トは成長ホルモン分泌抑制剤、インスリン分泌促進剤な
どの医薬品として有用であることがわかる。一般に、あ
る生理活性物質アゴニストやアンタゴニストを開発する
場合、該物質が特異的に結合するレセプターと親和性の
高い化合物の探索が行われている。ガラニンレセプター
としては、現在、ウシの海馬膜画分が用いられている
が、動物種が異なるために、その膜画分に対して高親和
性であった化合物がヒトのガラニンレセプターに対して
も高親和性であるという保証は得られていない。ヒト・
ガラニンレセプターｃＤＮＡはクローニングされてお
り、ＣＯＳ細胞での発現も報告されているが〔Habert-O
rtoll, E. et al., プロシージングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA） 91, 9
780-9783 (1994) 〕、発現量が低く、また一過性の発現
であるために、スクリーニングには不適切であると考え
られる。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規ガラニ
ンレセプター蛋白質あるいはその部分ペプチドもしくは
その塩、該ガラニンレセプター蛋白質またはその部分ペ
プチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含有するベクター、該ベクターで形質転換された宿
主、該形質転換体から得られた細胞膜分画、該ガラニン
レセプター蛋白質あるいはその部分ペプチドもしくはそ
の塩の製造方法、該ガラニンレセプター蛋白質またはそ
の発現細胞（該形質転換体を含む）を用いるガラニンの
生理活性の測定方法、該ガラニンレセプター蛋白質また
はその発現細胞を用いるガラニンレセプターアゴニスト
またはアンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリ
ーニング用キット、該スクリーニングにより得られたア
ゴニストまたはアンタゴニスト、該ガラニンレセプター
蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを含有
する医薬、該ガラニンレセプター蛋白質に対する抗体、
該ガラニンレセプター蛋白質あるいはその抗体を用いた
免疫アッセイ技術、該ガラニンレセプター蛋白質および
そのＤＮＡの用途などを提供するものである。

【００２０】また本発明は、マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ
６由来の新規マウス由来ガラニンレセプター蛋白質ある
いはその部分ペプチドもしくはその塩、該マウス由来ガ
ラニンレセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該マウス由来ガラニン
レセプター蛋白質あるいはその部分ペプチドもしくはそ
の塩の製造方法、該マウス由来ガラニンレセプター蛋白
質またはマウス由来ＭＩＮ６細胞を用いるガラニンの生
理活性の測定方法、該マウス由来ガラニンレセプター蛋
白質またはマウス由来ＭＩＮ６細胞を用いるガラニンレ
セプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニ
ング方法、該ガラニンレセプター蛋白質に対する抗体、
該ガラニンレセプター蛋白質あるいはその抗体を用いた
免疫アッセイ技術、該ガラニンレセプター蛋白質および
そのＤＮＡの用途を提供するものである。

【００２１】従来の方法で製造されたヒト・ガラニンレ
セプタータンパク質および該ヒト・ガラニンレセプター
タンパク質を発現するＣＯＳ細胞は、ガラニンレセプタ
ーアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングに用い
るためのレセプター標品としては不十分であった。した
がって、より実用的なヒト・ガラニンレセプター蛋白質
の製造方法の確立が望まれていた。ヒト・ガラニンレセ
プター蛋白質を使用してガラニンレセプターのアゴニス
ト／アンタゴニストをスクリーニングすることができれ
ば、実験動物を用いることの欠点（例えば、種が異なる
ことにより、ヒトに対して効果を発揮できない化合物が
得られる可能性があることなど）を克服することがで
き、ヒトに対して有効な医薬の開発が効率よく行なえる
ようになると期待される。

【００２２】したがって、本発明は、新規なヒト由来ガ
ラニンレセプター蛋白質、該ヒト由来ガラニンレセプタ
ー蛋白質の部分ペプチド、あるいはその塩、該ヒト由来
ガラニンレセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する
ベクター、該ベクターで形質転換された宿主、該形質転
換体から得られた細胞膜分画、該ヒト由来ガラニンレセ
プター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の
製造方法、該ヒト由来ガラニンレセプター蛋白質、該ヒ
ト由来ガラニンレセプター蛋白質発現細胞又はそれから
得られた細胞膜分画などを用いるガラニンの生理活性の
測定方法、該ヒト由来ガラニンレセプター蛋白質、該ヒ
ト由来ガラニンレセプター蛋白質発現細胞などを用いる
ガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該ス
クリーニングにより得られたアゴニストまたはアンタゴ
ニスト、さらにはヒト由来ガラニンレセプター蛋白質に
対するアゴニストまたはアンタゴニストを含有する医
薬、該ヒト由来ガラニンレセプター蛋白質に対する抗
体、該ヒト由来ガラニンレセプター蛋白質あるいはその
抗体を用いた免疫アッセイ技術、該ヒト由来ガラニンレ
セプター蛋白質およびそのＤＮＡの用途などを提供する
ものである。

【００２３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをより効率
的に単離するためのＤＮＡプライマーを合成することに
成功し、該プライマーを用いて各種細胞よりｃＤＮＡを
増幅し、その解析を進めた。その結果、本発明者らは、
新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡ断片を単離し、その部分的な構造を決定することに
成功した。このＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、公
知のＧ蛋白質共役型レセプターと、ＤＮＡおよびアミノ
酸の相同性が認められ、新規のガラニンレセプター蛋白
質をコードしていると考えられた。さらに、本発明者ら
は、研究を重ねた結果、完全長の翻訳枠を持つｃＤＮＡ
をクローニングすることに成功し、該ガラニンレセプタ
ー蛋白質の全アミノ酸配列および全塩基配列を解析する
ことに成功した。

【００２４】本発明者らは、適当な手段で発現させた該
レセプター蛋白質を用いれば、レセプター蛋白質結合実
験あるいは細胞内セカンドメッセンジャーの測定等を指
標に、生体内あるいは天然・非天然の化合物より、該レ
セプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニス
トをスクリーニングすることができことを見いだした。
さらに、本発明者らは、該アゴニストおよびアンタゴニ
ストをガラニンに起因する疾病の予防・治療剤として開
発することができることを見いだした。さらに、本発明
者らは、該ガラニンレセプター蛋白質発現細胞における
グルコース依存性あるいはフォルスコリン依存性のイン
スリン分泌がガラニンにより抑制されるという初めての
知見を得た。そして、本発明者らは、この知見に基づ
き、ガラニンおよびガラニンアンタゴニスト活性の簡便
な測定法を見いだした。また、同時に、該ガラニンレセ
プター蛋白質発現細胞の細胞膜画分が多量のガラニンレ
セプターを含むことを知見し、該細胞の細胞膜画分を用
いたガラニンレセプターアゴニスト／アンタゴニストの
スクリーニング方法を確立することに成功した。

【００２５】例えば、本発明者らは、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡをより効率的に単離
するためのＤＮＡプライマーを用いてマウス膵臓β細胞
株ＭＩＮ６由来のｃＤＮＡを増幅し、その解析を進め
た。その結果、本発明者らは、新規Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするマウス由来のｃＤＮＡ断片を
単離し、その部分的な構造を決定することに成功した。
このマウス由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、
公知のＧ蛋白質共役型レセプターと、ＤＮＡおよびアミ
ノ酸の相同性が認められたことから、マウスの膵臓で発
現機能している新規のレセプター蛋白質をコードしてい
ると考えられた。さらに、本発明者らは、研究を重ねた
結果、完全長の翻訳枠を持つｃＤＮＡをクローニングす
ることに成功し、該レセプター蛋白質の全アミノ酸配列
および全塩基配列を解析することに成功した。そして、
このマウス由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が、
ヒト由来のガラニンレセプター蛋白質（プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad.Sci. USA. ）91,pp.9780-978
3, 10 月11日,1994 年）と、ＤＮＡおよびアミノ酸配列
と高い相同性があることから、このマウス由来のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質は、マウス由来のガラニンレ
セプター蛋白質であることが分かった。

【００２６】さらに、本発明者らは、ＭＩＮ６細胞にお
けるグルコース依存性あるいはフォルスコリン依存性の
インスリン分泌がガラニンにより抑制されるという初め
ての知見を得た。そして、本発明者らは、この知見に基
づき、ガラニンおよびガラニンアンタゴニスト活性の簡
便な測定法を見いだした。また、同時に、ＭＩＮ６細胞
の細胞膜画分が多量の（０. ５〜１. ０ｐｍｏｌ／ｍ
ｇ）ガラニンレセプターを含むことを知見し、ＭＩＮ６
細胞の細胞膜画分を用いたガラニンレセプターアゴニス
ト／アンタゴニストのスクリーニング方法を確立するこ
とに成功した。

【００２７】より具体的には、本発明者らは、マウス膵
臓β細胞株ＭＩＮ６由来の新規なｃＤＮＡ断片として
〔図１〕に示すものをＰＣＲ法によって増幅、クローニ
ングし、その配列の解析から新規レセプター蛋白質をコ
ードしていることを明らかにした。この配列をアミノ酸
配列に翻訳したところ、第３、第４、第５および第６膜
貫通領域が疎水性プロット上で確認された〔図２〕。ま
た、増幅されたＤＮＡのサイズも、既知のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質と比較して同程度の約４００ｂｐで
あった。

【００２８】本発明者らは、このｃＤＮＡの塩基配列を
鋳型としてデーターベースを検索したところ、公知のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質であるヒト由来ソマトス
タチンレセプターサブタイプ４（ＪＮ０６０５）、ヒト
由来ソマトスタチンレセプターサブタイプ２（Ｂ４１７
９５）およびラット由来リガンド不明レセプター（Ａ３
９２９７）とそれぞれアミノ酸で３６％、３０％および
３０％のホモロジーが認められた〔図３〕。上記の
（ ）内の略語は、NBRF-PIR/swiss-PROT にデータとし
て登録される際の整理番号であり、通常Accession Numb
erまたはエントリーネームと呼ばれている。

【００２９】さらに、本発明者らは、ＭＩＮ６細胞から
抽出したPoly(A) ⁺ ＲＮＡ画分からｃＤＮＡを調製し、
このｃＤＮＡをラムダｇｔ２２ファージに挿入してｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。さらに、ＰＣＲによって
得られたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片
ｐ３Ｈ２−３４をプローブとしてｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることによって、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を完全にコードするｃＤＮＡを
クローニングすることに成功した。該ｃＤＮＡの塩基配
列およびそれにコードされるアミノ酸配列を〔図４〕に
示した。このアミノ酸配列に基づいて疎水性プロットを
行なったところ、第１、第２、第３、第４、第５、第６
および第７膜貫通領域が疎水性プロット上で確認された
〔図５〕。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
は、公知のヒト由来ガラニンレセプター蛋白質とアミノ
酸で９２％のホモロジーが認められた〔図６〕。

【００３０】また別の態様において、例えば、本発明者
らは、公知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質とは異な
るアミノ酸配列を有する新規なヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングすることに
成功した。公知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質のア
ミノ酸配列の第１５番目のアミノ酸がＣｙｓであるのに
対して、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質のア
ミノ酸配列（配列番号：５および図１１及び１２）の第
１５番目のアミノ酸はＴｒｐである。また、公知のヒト
・ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基
配列のうち、該ヒト・ガラニンレセプター蛋白質の第１
５番目のアミノ酸をコードする塩基配列がそれぞれ¹⁵Ｃ
ｙｓ（ＴＧＴ）であるのに対して、本発明のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列の
うち、該ヒト・ガラニンレセプター蛋白質の第１５番目
のアミノ酸をコードする塩基配列は¹⁵Ｔｒｐ（ＴＧＧ）
である。

【００３１】さらに、本発明者らは、公知のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質を発現しているＣＯＳ細胞〔Habe
rt-Ortoll, E. et al., プロシージングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc.Natl. Acad. Sci. USA） 9
1, 9780-9783 (1994) 〕に比べて、本発明のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質をはるかに大量に発現するＣＨＯ
細胞株を製造することに成功した。そして、該ＣＨＯ細
胞株または本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質も
しくはその部分ペプチドを用いることにより効率よく確
実にヒト・ガラニンレセプターアゴニスト／アンタゴニ
ストをスクリーニングできることを見いだした。本発明
者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。

【００３２】すなわち、本発明は、 （１）配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：５で
表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有することを特徴とするガラニンレセプター蛋白質
またはその塩、 （２）形質転換体ＣＨＯ細胞により産生された第（１）
項記載のガラニンレセプター蛋白質、 （３）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質をコ
ードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、 （４）第（３）項記載のＤＮＡを含有することを特徴と
するベクター、 （５）第（４）項記載のベクターを保持する形質転換
体、 （６）宿主細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする第
（５）項記載の形質転換体、 （７）第（５）記載の形質転換体を培養し、ガラニンレ
セプター蛋白質またはその塩を生成せしめることを特徴
とする第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質また
はその塩の製造方法、 （８）（ｉ）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白
質もしくはその塩またはその部分ペプチドもしくはその
塩に、ガラニンを接触させた場合と（ii）第（１）項記
載のガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩またはそ
の部分ペプチドもしくはその塩に、ガラニンおよび試験
試料を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす
るガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト
のスクリーニング方法、 （９）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質もし
くはその塩またはその部分ペプチドもしくはその塩を含
有することを特徴とするガラニンレセプターアゴニスト
またはアンタゴニストのスクリーニング用キット、 （１０）第（８）項記載のスクリーニング方法または第
（９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
るガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト
を提供する。

【００３３】より具体的には、本発明は、 （１１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするマ
ウス由来ガラニンレセプター蛋白質またはその塩、 （１２）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（１１）項記載
のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質またはその塩、 （１３）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質またはその塩、 （１４）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質の
部分ペプチドまたはその塩、 （１５）第（１１）項または第（１２）項記載のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチドまたはそ
の塩、 （１６）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、

【００３４】（１７）第（１１）項または第（１２）項
記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質をコードす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、 （１８）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、 （１９）配列番号：３で表わされる塩基配列を有する第
（１７）項記載のＤＮＡ、 （２０）配列番号：４で表わされる塩基配列を有する第
（１７）項記載のＤＮＡ、 （２１）配列番号：６で表わされる塩基配列を有する第
（１８）項記載のＤＮＡ、 （２２）第（１７）項記載のＤＮＡを含有することを特
徴とするベクター、 （２３）第（１８）項記載のＤＮＡを含有することを特
徴とするベクター、 （２４）第（２２）項記載のベクターを保持する形質転
換体、 （２５）第（２３）項記載のベクターを保持する形質転
換体、

【００３５】（２６）第（２４）項記載の形質転換体を
培養し、形質転換体の細胞膜にマウス由来ガラニンレセ
プター蛋白質を生成せしめることを特徴とする第（１
１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質また
はその塩の製造方法、 （２７）第（２５）項記載の形質転換体を、ヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの発現が可能
な条件下で培養することを特徴とする第（１３）項記載
のヒト・ガラニンレセプター蛋白質の製造法、 （２８）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質を
含有する細胞またはその細胞膜画分、 （２９）第（１１）項または第（１２）項記載のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞またはそ
の細胞膜画分、 （３０）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分、

【００３６】（３１）第（１）項記載のガラニンレセプ
ター蛋白質もしくはその塩、第（１４）項記載の部分ペ
プチドもしくはその塩、または第（２８）項記載の細胞
もしくはその細胞膜画分を用いることを特徴とするガラ
ニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、 （３２）第（１１）項または第（１２）項記載のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩、第（１
５）項記載の部分ペプチドもしくはその塩、または第
（２９）項記載の細胞もしくはその細胞膜画分を用いる
ことを特徴とするガラニンレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング方法、 （３３）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質もしくはその塩、第（１６）項記載の部分ペプチ
ドもしくはその塩、または第（３０）項記載の細胞もし
くはその細胞膜画分を用いることを特徴とするガラニン
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、

【００３７】（３４）（ｉ）第（１）項記載のガラニ
ンレセプター蛋白質もしくはその塩、第（１４）項記載
の部分ペプチドもしくはその塩または第（２８）項記載
の細胞もしくはその細胞膜画分およびガラニンを接触
させた場合と（ii）第（１）項記載のガラニンレセプ
ター蛋白質もしくはその塩、第（１４）項記載の部分ペ
プチドもしくはその塩、または第（２８）項記載の細胞
もしくはその細胞膜画分およびガラニンおよび試験化
合物などを含めた試料を接触させた場合との比較を行な
うことを特徴とするガラニンレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストのスクリーニング方法、 （３５）（ｉ）第（１１）項記載のマウス由来ガラニ
ンレセプター蛋白質もしくはその塩または第（１５）項
記載の部分ペプチドもしくはその塩およびガラニンを
接触させた場合と（ii）第（１１）項記載のマウス由
来ガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩または第
（１５）項記載の部分ペプチドもしくはその塩、ガラ
ニンおよび試験化合物などの試料を接触させた場合との
比較を行なうことを特徴とするガラニンレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （３６）（ｉ）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレ
セプター蛋白質もしくはその塩または第（１６）項記載
の部分ペプチドもしくはその塩、あるいは第（３０）項
記載のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞
もしくはその細胞膜画分、およびガラニンを接触させ
た場合と（ii）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレ
セプター蛋白質もしくはその塩または第（１６）項記載
の部分ペプチドもしくはその塩、あるいは第（３０）項
記載のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞
もしくはその細胞膜画分、およびガラニンおよび試験
化合物などの試験試料を接触させた場合との比較を行な
うことを特徴とするガラニンレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストのスクリーニング方法、

【００３８】（３７）第（１）項記載のガラニンレセプ
ター蛋白質もしくはその塩、第（１４）項記載の部分ペ
プチドもしくはその塩、または第（２８）項記載の細胞
もしくはその細胞膜画分を含有することを特徴とするガ
ラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのス
クリーニング用キット、 （３８）第（１１）項または第（１２）項記載のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩、第（１
５）項記載の部分ペプチドもしくはその塩、または第
（２９）項記載の細胞もしくはその細胞膜画分を含有す
ることを特徴とするガラニンレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストのスクリーニング用キット、 （３９）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質もしくはその塩、第（１６）項記載の部分ペプチ
ドもしくはその塩、または第（３０）項記載の細胞もし
くはその細胞膜画分を含有することを特徴とするガラニ
ンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング用キット、 （４０）第（３１）〜（３６）項のいずれか一記載のス
クリーニング方法または第（３７）〜（３９）項のいず
れか一記載のスクリーニング用キットを用いて得られる
ガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト、 （４１）第（３２）または（３５）項記載のスクリーニ
ング方法または第（３８）項記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られるガラニンレセプターアゴニストま
たはアンタゴニスト、 （４２）第（３３）または（３６）項記載のスクリーニ
ング方法または第（３９）項記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られるガラニンレセプターアゴニストま
たはアンタゴニスト、

【００３９】（４３）第（４０）項記載のガラニンレセ
プターアゴニストを含有することを特徴とする医薬組成
物、 （４４）第（４１）項記載のガラニンレセプターアゴニ
ストを含有することを特徴とする医薬組成物、 （４５）第（４２）項記載のガラニンレセプターアゴニ
ストを含有することを特徴とする医薬組成物、 （４６）第（４０）項記載のガラニンレセプターアンタ
ゴニストを含有することを特徴とする医薬組成物、 （４７）第（４１）項記載のガラニンレセプターアンタ
ゴニストを含有することを特徴とする医薬組成物、 （４８）第（４２）項記載のガラニンレセプターアンタ
ゴニストを含有することを特徴とする医薬組成物、 （４９）アセチルコリン遊離抑制剤、インスリン分泌抑
制剤、成長ホルモン分泌刺激剤、学習行動抑制剤または
満腹感抑制剤であることを特徴とする第（４３）項記載
の医薬組成物、 （５０）アセチルコリン遊離促進剤、成長ホルモン分泌
抑制剤、インスリン分泌促進剤、学習行動促進剤または
満腹感促進剤であることを特徴とする第（４６）項記載
の医薬組成物、 （５１）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質も
しくはその塩または第（１４）項記載の部分ペプチドも
しくはその塩に対する抗体、 （５２）第（１１）項または第（１２）項記載のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩または第
（１５）項記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する
抗体、及び （５３）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質もしくはその塩、または第（１６）項記載の部分
ペプチドもしくはその塩に対する抗体を提供する。

【００４０】より具体的には、 （５４）標識したガラニンを第（１）項記載のガラニン
レセプター蛋白質もしくはその塩（例えば、第（１１）
項記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質もしくは
その塩など）または第（１４）項記載のガラニンレセプ
ター蛋白質部分ペプチドもしくはその塩（例えば、第
（１５）項記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質
部分ペプチドもしくはその塩など）に接触させた場合
と、標識したガラニンおよび試験化合物を第（１）項記
載のガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩（例え
ば、第（１１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質もしくはその塩など）または第（１４）項記載の
ガラニンレセプター蛋白質部分ペプチドもしくはその塩
（例えば、第（１５）項記載のマウス由来ガラニンレセ
プター蛋白質部分ペプチドもしくはその塩など）に接触
させた場合における、標識したガラニンの第（１）項記
載のガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩（例え
ば、第（１１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質もしくはその塩など）または第（１４）項記載の
ガラニンレセプター蛋白質部分ペプチドもしくはその塩
（例えば、第（１５）項記載のマウス由来ガラニンレセ
プター蛋白質部分ペプチドもしくはその塩など）に対す
る結合量を測定し、比較することを特徴とするガラニン
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、

【００４１】（５５）標識したガラニンを第（１）項記
載のガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞（例え
ば、第（１１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質などを含有する細胞〔ただし、マウス由来ＭＩＮ
６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）を除く〕など）に
接触させた場合と、標識したガラニンおよび試験化合物
を第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質を含有す
る細胞（例えば、第（１１）項記載のマウス由来ガラニ
ンレセプター蛋白質などを含有する細胞〔ただし、マウ
ス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）を除
く〕など）に接触させた場合における、標識したガラニ
ンの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特
徴とするガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴ
ニストのスクリーニング方法、

【００４２】（５６）標識したガラニンを第（１）項記
載のガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞（例え
ば、第（１１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質などを含有する細胞〔ただし、マウス由来ＭＩＮ
６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）を除く〕など）の
細胞膜画分に接触させた場合と、標識したガラニンおよ
び試験化合物を第（１）項記載のガラニンレセプター蛋
白質を含有する細胞（例えば、第（１１）項記載のマウ
ス由来ガラニンレセプター蛋白質などを含有する細胞
〔ただし、マウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４９５４）を除く〕など）の細胞膜画分に接触させた場
合における、標識したガラニンの該細胞の膜画分に対す
る結合量を測定し、比較することを特徴とするガラニン
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、

【００４３】（５７）標識したガラニンを第（５）項記
載の形質転換体（例えば、第（２４）項記載の形質転換
体など）を培養することによって該形質転換体の細胞膜
に発現したガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス
由来ガラニンレセプター蛋白質など）に接触させた場合
と、標識したガラニンおよび試験化合物を第（５）項記
載の形質転換体（例えば、第（２４）項記載の形質転換
体など）を培養することによって該形質転換体の細胞膜
に発現したガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス
由来ガラニンレセプター蛋白質など）に接触させた場合
における、標識したガラニンの該マウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質に対する結合量を測定し、比較すること
を特徴とするガラニンレセプターアゴニストまたはアン
タゴニストのスクリーニング方法、

【００４４】（５８）ガラニンを第（１）項記載のガラ
ニンレセプター蛋白質を含有する細胞（例えば、第（１
１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質など
を含有する細胞〔ただし、マウス由来ＭＩＮ６細胞（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９５４）を除く〕など）に接触させた
場合と、ガラニンおよび試験化合物を第（１）項記載の
ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞（例えば、第
（１１）項記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質
などを含有する細胞〔ただし、マウス由来ＭＩＮ６細胞
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）を除く〕など）に接触さ
せた場合における、マウス由来ガラニンレセプター蛋白
質を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴
とするガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
ストのスクリーニング方法、

【００４５】（５９）ガラニンを第（５）項記載の形質
転換体（例えば、第（２４）項記載の形質転換体など）
を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現し
たガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由来ガラ
ニンレセプター蛋白質など）に接触させた場合と、ガラ
ニンおよび試験化合物を第（５）項記載の形質転換体
（例えば、第（２４）項記載の形質転換体など）を培養
することによって該形質転換体の細胞膜に発現したガラ
ニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質など）に接触させた場合における、ガラ
ニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質など）を介する細胞刺激活性を測定し、
比較することを特徴とするガラニンレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、

【００４６】（６０）細胞刺激活性が、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−
ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、インスリン分泌などを促
進する活性または抑制する活性（特に、細胞内ｃＡＭＰ
生成またはインスリン分泌を促進する活性または抑制す
る活性など）である第（５８）項または第（５９）項記
載のスクリーニング方法、 （６１）第（３１）項、第（３４）項（例えば、第（３
２）項、第（３５）項など）、および第（５４）項〜第
（６０）項のいずれか一記載のスクリーニング方法で得
られるガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
スト、

【００４７】（６２）第（６１）項記載のガラニンレセ
プターアゴニストを含有することを特徴とするアセチル
コリン遊離抑制剤、インスリン分泌抑制剤、学習行動抑
制剤または満腹感抑制剤、 （６３）第（６１）項記載のガラニンレセプターアンタ
ゴニストを含有することを特徴とするアセチルコリン遊
離促進剤、インスリン分泌促進剤、学習行動促進剤また
は満腹感促進剤、 （６４）第（４０）項（例えば、第（４１）項など）、
または第（６１）項記載のガラニンレセプターアンタゴ
ニストを含有することを特徴とする向知能剤、肥満治療
剤または糖尿病治療剤、 （６５）第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質を
含有する細胞（例えば、第（１１）項記載のマウス由来
ガラニンレセプター蛋白質などを含有する細胞）を含有
することを特徴とする第（３７）項（例えば、第（３
８）項など）記載のスクリーニング用キット、

【００４８】（６６）第（１）項記載のガラニンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞（例えば、第（１１）項記載
のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質などを含有する
細胞）の膜画分を含有することを特徴とする第（３７）
項（例えば、第（３８）項など）記載のスクリーニング
用キット、 （６７）第（３７）項（例えば、第（３８）項など）、
第（６５）項、または第（６６）項記載のスクリーニン
グ用キットを用いて得られるガラニンレセプターアゴニ
ストまたはアンタゴニスト、 （６８）第（６７）項記載のガラニンレセプターアゴニ
ストを含有することを特徴とするアセチルコリン遊離抑
制剤、インスリン分泌抑制剤、学習行動抑制剤または満
腹感抑制剤、

【００４９】（６９）第（６７）項記載のガラニンレセ
プターアンタゴニストを含有することを特徴とするアセ
チルコリン遊離促進剤、インスリン分泌促進剤、学習行
動促進剤または満腹感促進剤、 （７０）第（４０）項（例えば、第（４１）項など）、
または第（６９）項記載のガラニンレセプターアンタゴ
ニストを含有することを特徴とする向知能剤、肥満治療
剤または糖尿病治療剤、および （７１）第（５１）項記載の抗体（例えば、第（５２）
項記載の抗体など）と、第（１）項記載のガラニンレセ
プター蛋白質もしくはその塩（例えば、第（１１）項記
載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質もしくはその
塩など）または第（１４）項記載のガラニンレセプター
蛋白質部分ペプチドもしくはその塩（例えば、第（１
５）項記載のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質部分
ペプチドもしくはその塩など）とを接触させることを特
徴とする第（１）項記載のガラニンレセプター蛋白質も
しくはその塩（例えば、第（１１）項記載のマウス由来
ガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩など）または
第（１４）項記載のガラニンレセプター蛋白質部分ペプ
チドもしくはその塩（例えば、第（１５）項記載のマウ
ス由来ガラニンレセプター蛋白質部分ペプチドもしくは
その塩など）の定量方法を提供する。

【００５０】さらに、本発明は、 （７２）マウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
９５４）またはその細胞膜画分にガラニンを接触させた
場合における、マウス由来ＭＩＮ６細胞の生物活性を測
定することを特徴とするガラニンの生理活性の測定方
法、 （７３）（ｉ）マウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４９５４）またはその細胞膜画分に、ガラニンを接
触させた場合と（ii）マウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４９５４）またはその細胞膜画分に、ガラニ
ンおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とするガラニンレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング方法、 （７４）マウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
９５４）またはその細胞膜画分を含有することを特徴と
するガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニング用キット、 （７５）第（７３）項記載のスクリーニング方法または
第（７４）項記載のスクリーニング用キットを用いて得
られるガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
スト、

【００５１】（７６）第（７５）項記載のガラニンレセ
プターアゴニストを含有することを特徴とするアセチル
コリン遊離抑制剤、インスリン分泌抑制剤、学習行動抑
制剤または満腹感抑制剤、 （７７）第（７５）項記載のガラニンレセプターアンタ
ゴニストを含有することを特徴とするアセチルコリン遊
離促進剤、インスリン分泌促進剤、学習行動促進剤また
は満腹感促進剤、 （７８）標識したガラニンをマウス由来ＭＩＮ６細胞
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）に接触させた場合と、標
識したガラニンおよび試験化合物をマウス由来ＭＩＮ６
細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）に接触させた場合に
おける、標識したガラニンの該マウス由来ＭＩＮ６細胞
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするガ
ラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのス
クリーニング方法、 （７９）標識したガラニンをマウス由来ＭＩＮ６細胞
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）の細胞膜画分に接触させ
た場合と、標識したガラニンおよび試験化合物をマウス
由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）の細胞
膜画分に接触させた場合における、標識したガラニンの
該マウス由来ＭＩＮ６細胞の膜画分に対する結合量を測
定し、比較することを特徴とするガラニンレセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、 （８０）ガラニンをマウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４９５４）に接触させた場合と、ガラニンおよ
び試験化合物をマウス由来ＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４９５４）に接触させた場合における、マウス由来
ガラニンレセプター蛋白質を介した細胞刺激活性（特
に、ＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌活性またはＭＩ
Ｎ６細胞内ｃＡＭＰ生成を抑制する活性または促進する
活性など）を測定し、比較することを特徴とするガラニ
ンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング方法、

【００５２】（８１）細胞刺激活性が、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃ
ＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−
ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、インスリン分泌などを促
進する活性または抑制する活性（特に、細胞内ｃＡＭＰ
生成またはインスリン分泌を促進する活性または抑制す
る活性など）である第（８０）項記載のスクリーニング
方法、 （８２）第（７３）項および第（７８）項〜第（８１）
項のいずれか一記載のスクリーニング方法を用いて得ら
れるガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
ト、 （８３）第（７５）項または第（８２）項記載のガラニ
ンレセプターアゴニストを含有することを特徴とするア
セチルコリン遊離抑制剤、インスリン分泌抑制剤、学習
行動抑制剤または満腹感抑制剤、 （８４）第（７５）項または第（８２）項記載のガラニ
ンレセプターアンタゴニストを含有することを特徴とす
るアセチルコリン遊離促進剤、インスリン分泌促進剤、
学習行動促進剤または満腹感促進剤、 （８５）第（７５）項または第（８２）項記載のガラニ
ンレセプターアンタゴニストを含有することを特徴とす
る向知能剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤を提供す
る。

【００５３】より具体的には、本発明は、 （８６）部分ペプチドが、第（１３）項記載のヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質分子のうち細胞膜の外に露出し
ている部分ペプチドである第（１６）項記載の部分ペプ
チド、 （８７）ベクターがｐＴＳ８６３で標示されるヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質の発現ベクターである第（２
３）項記載のベクター、 （８８）形質転換体がＣＨＯ細胞である第（２５）項記
載の形質転換体、 （８９）ＣＨＯ細胞がＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−５または
ＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−７で標示されるＣＨＯ細胞であ
る第（８８）項記載のＣＨＯ細胞、 （９０）細胞がＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−５またはＣＨＯ
／ｐＴＳ８６３−７で標示されるＣＨＯ細胞である第
（３０）項記載の細胞またはその細胞膜画分、 （９１）（ｉ）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレセ
プター蛋白質もしくはその塩、または第（１６）項記載
の部分ペプチドもしくはその塩に、ガラニンを接触させ
た場合と、（ii）第（１３）項記載のヒト・ガラニンレ
セプター蛋白質もしくはその塩、または第（１６）項記
載の部分ペプチドもしくはその塩に、ガラニンおよび試
験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴
とする第（３３）項記載のガラニンレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、

【００５４】（９２）（ｉ）標識したガラニンを第（１
３）項記載のヒト・ガラニンレセプター蛋白質もしくは
その塩、または第（１６）項記載の部分ペプチドもしく
はその塩に接触させた場合と、（ii）標識したガラニン
および試験化合物を第（１３）項記載のヒト・ガラニン
レセプター蛋白質もしくはその塩、または第（１６）項
記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合に
おける、標識したガラニンの該ヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する
結合量を測定し、比較することを特徴とする第（３３）
項記載のガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴ
ニストのスクリーニング方法、 （９３）（ｉ）標識したガラニンを、第（３０）項記載
の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（i
i）標識したガラニンおよび試験化合物を第（３０）項
記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合との
比較を行なうことを特徴とする第（３３）項記載のガラ
ニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、 （９４）（ｉ）標識したガラニンを、第（３０）項記載
の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、（i
i）標識したガラニンおよび試験化合物を第（３０）項
記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合にお
ける、標識したガラニンの該細胞またはその細胞膜画分
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする第
（３３）項記載のガラニンレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストのスクリーニング方法、

【００５５】（９５）（ｉ）ガラニンを、第（３０）項
記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、
（ii）ガラニンおよび試験化合物を第（３０）項記載の
細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、
組換え型ヒト・ガラニンレセプターを介した細胞刺激活
性（例えば、Ｋ⁺ チャンネルの開放、Ｎ型Ｃａ⁺ チャン
ネルの閉鎖、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成の抑制、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞
遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増
殖などを促進する活性または抑制する活性など）を測定
し、比較することを特徴とする第（３３）項記載のガラ
ニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング方法、 （９６）医薬組成物がアセチルコリン遊離抑制剤、イン
スリン分泌抑制剤、成長ホルモン分泌刺激剤、学習行動
抑制剤または満腹感抑制剤である第（４５）項記載の医
薬組成物、 （９７）医薬組成物が分裂病もしくは胃潰瘍の予防・治
療剤または鎮痛剤である第（４５）項記載の医薬組成
物、 （９８）医薬組成物がアセチルコリン遊離促進剤、成長
ホルモン分泌抑制剤、インスリン分泌促進剤、学習行動
促進剤または満腹感促進剤である第（４８）項記載の医
薬組成物、 （９９）医薬組成物が糖尿病、アルツハイマー病または
痴呆症の予防・治療剤である第（４８）項記載の医薬組
成物、 （１００）第（１８）項記載のＤＮＡを含有することを
特徴とするガラニンレセプター蛋白質欠損症の予防・治
療剤、および （１０１）ガラニンレセプター蛋白質欠損症が糖尿病、
アルツハイマー病または痴呆症である第（１００）項記
載の予防・治療剤を提供する。

【００５６】本明細書において、「実質的に同一」とは
蛋白質の活性、例えば、リガンドの結合活性、生理的な
特性などが、実質的に同じであることを意味する。アミ
ノ酸の置換、欠失あるいは挿入はしばしばポリペプチド
の生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめ
ないし、こうした場合その置換、欠失あるいは挿入を施
されたポリペプチドは、そうした置換、欠失あるいは挿
入のされていないものと実質的に同一であるとされるで
あろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な
置換物としては、そのアミノ酸が属するところのクラス
のうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。非極
性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、
トリプトファン、メチオニンなどが挙げられる。極性
（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオ
ニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミ
ンなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸
としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げ
られる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アス
パラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

【００５７】本発明のガラニンレセプター蛋白質として
は、温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、
ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒト、ウサギ、ネ
コ、イヌなど）のあらゆる組織（例えば、扁桃核、下垂
体、膵臓、脳（全脳、中脳黒質など）、腎臓、肝臓、生
殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、
消化管、胃、血管、心臓、胸腺、脾臓、白血球など）ま
たは細胞などに由来するガラニンレセプター蛋白質であ
って、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば如何なる
ものであってもよい。すなわち、本発明のガラニンレセ
プター蛋白質としては、配列番号：１で表わされるアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質の他に、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列と約９０〜９９. ９％の相同性を有
するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を
有する蛋白質などが挙げられる。実質的に同質の活性と
しては、例えばガラニン結合活性、シグナル情報伝達な
どが挙げられる。実質的に同質とは、ガラニン結合活性
などが性質的に同質であることを示す。したがって、ガ
ラニン結合活性の強さなどの強弱、レセプター蛋白質の
分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

【００５８】一つの具体的態様の中で、本発明のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質としては、マウスのあら
ゆる組織（例えば、扁桃核、下垂体、膵臓、脳、腎臓、
肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、肺、消化管、血
管、心臓、胸腺、脾臓、白血球など）または細胞などに
由来するガラニンレセプター蛋白質であって、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するものであれば如何なるものであって
もよい。すなわち、本発明のマウス由来ガラニンレセプ
ター蛋白質としては、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列を含有する蛋白質の他に、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列と約９０〜９９. ９％の相同性を有す
るアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有
する蛋白質などが挙げられる。

【００５９】実質的に同質の活性としては、例えばガラ
ニン結合活性、シグナル情報伝達などが挙げられる。実
質的に同質とは、ガラニン結合活性などが性質的に同質
であることを示す。したがって、ガラニン結合活性の強
さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的要
素は異なっていてもよい。より具体的には、本発明のマ
ウス由来ガラニンレセプター蛋白質としては、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス膵臓
β細胞株ＭＩＮ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４）由来の
ガラニンレセプター蛋白質などの他に、配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ
酸（好ましくは１個以上３０個以下、さらに好ましくは
１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸）が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ
酸（好ましくは１個以上３０個以下、さらに好ましくは
１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸）が付加したアミノ酸配列、あるいは配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以
上のアミノ酸（好ましくは１個以上３０個以下、さらに
好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以
上１０個以下のアミノ酸）が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列を含有するマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質などが挙げられる。

【００６０】より具体的には、配列番号：２で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列（例え
ば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約９０〜
９９.９％の相同性を有するアミノ酸配列など）を含有
するマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来のガラニンレセプ
ター蛋白質などが挙げられる。さらに、配列番号：２で
表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ
酸（好ましくは１個以上３０個以下、さらに好ましくは
１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸）が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ
酸（好ましくは１個以上３０個以下、さらに好ましくは
１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１０個以
下のアミノ酸）が付加したアミノ酸配列、あるいは配列
番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以
上のアミノ酸（好ましくは１個以上３０個以下、さらに
好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以
上１０個以下のアミノ酸）が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列を含有するマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質なども挙げられる。

【００６１】一つの具体的態様の中で、本発明のヒト・
ガラニンレセプター蛋白質としては、ヒトのあらゆる組
織（例えば、胃、下垂体、膵臓、脳（全脳、中脳黒質な
ど）、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または
細胞などに由来するヒト・ガラニンレセプター蛋白質で
あって、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば如何な
るものであってもよい。すなわち、本発明のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質としては、配列番号：５で表わさ
れるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番
号：５で表わされるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％
の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：５
で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に
同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に
同質の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナ
ル情報伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガ
ンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。し
たがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプ
ター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。

【００６２】より具体的には、本発明のヒト・ガラニン
レセプター蛋白質としては、配列番号：５で表わされる
アミノ酸配列を含有することを特徴とするヒト由来のヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質などが挙げられる。ま
た、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質として
は、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列中の１また
は２個以上（好ましくは、１個以上２０個以下）のアミ
ノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：５で表わされ
るアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１個
以上２０個以下）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列中の１または２
個以上（好ましくは、１個以上２０個以下）のアミノ酸
が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋
白質なども挙げられる。

【００６３】さらに、本発明のガラニンレセプター蛋白
質には、Ｎ末端のMet が保護基（例えば、ホルミル基、
アセチル基などのＣ_1-6 アシル基など）で保護されてい
るもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｕ
がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖
が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基など
のＣ_1-6 アシル基など）で保護されているもの、あるい
は糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質な
ども含まれる。ただし、配列番号：５で表わされるアミ
ノ酸配列の第１５番目のＴｒｐがＣｙｓに置換されたア
ミノ酸配列を有する公知のヒト・ガラニンレセプター蛋
白質は本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質の範囲
から除かれる。

【００６４】本発明のガラニンレセプター蛋白質の塩と
しては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま
しい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のガラニンレセプ
ター蛋白質またはその塩は、温血動物の組織または細胞
から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造すること
もできるし、後述するガラニンレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
っても製造することができる。また、後述のペプチド合
成法に準じて製造することもできる。

【００６５】本発明のガラニンレセプター蛋白質の部分
ペプチドとしては、例えば、本発明のガラニンレセプタ
ー蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位な
どが用いられる。具体的には、本発明のガラニンレセプ
ター蛋白質の疎水性プロット解析において細胞外領域
（親水性（Hydrophilic ）部位）であると分析された部
分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic
）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることがで
きる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得る
が、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良
い。例えば、本発明のマウス由来ガラニンレセプター蛋
白質の部分ペプチドとしては、本発明のマウス由来ガラ
ニンレセプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出し
ている部位など、具体的には、〔図２〕で示される本発
明のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質の疎水性プロ
ット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic ）
部位）であると分析された部分ペプチドである。

【００６６】本発明のガラニンレセプター蛋白質の部分
ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される
酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機
酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ
ンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

【００６７】本発明のガラニンレセプター蛋白質の部分
ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法
に従って、あるいは本発明のガラニンレセプター蛋白質
を適当なペプチダーゼで切断することによって製造する
ことができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相
合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわ
ち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくは
アミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有
する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチド
を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱
離としては、たとえば、以下の〜に記載された方法
が挙げられる。

【００６８】M. Bodanszky および M.A. Ondetti 、
ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Intersci
ence Publishers, New York (1966 年) Schroeder およびLuebke、ザ ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965 年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善( 株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タ
ンパク質の化学IV、 205、(1977 年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合
成 広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。

【００６９】本発明のガラニンレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：１、配列番
号：２または配列番号：５のアミノ酸配列と実質的に同
一のアミノ酸配列を含有する上述のガラニンレセプター
蛋白質（ただし、配列番号：５で表わされるアミノ酸配
列の第１５番目のＴｒｐがＣｙｓに置換されたアミノ酸
配列を有する公知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を
除く）をコードする塩基配列を含有するものであればい
かなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、組織
・細胞由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファー
ジ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれで
あってもよい。また、組織・細胞よりｍＲＮＡ画分を調
製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polyme
rase Chain Reaction （以下、ＲＴ- ＰＣＲ法と略称す
る。）によって増幅することもできる。

【００７０】一つの具体的態様の中で、本発明のマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡとし
ては、本発明の配列番号：１のアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するマウス由来ガラニンレセ
プター蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであ
ればいかなるものであってもよい。より具体的には、配
列番号：１のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓β細胞
株ＭＩＮ６由来のガラニンレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡとしては、配列番号：３で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いられる。ま
た、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓
β細胞株ＭＩＮ６由来のガラニンレセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどが用いられ
る。

【００７１】さらにまた、本発明のヒト・ガラニンレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、本発明の配
列番号：５のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する上述のヒト・ガラニンレセプター蛋白質
（ただし、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列の第
１５番目のＴｒｐがＣｙｓに置換されたアミノ酸配列を
有する公知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を除く）
をコードする塩基配列を含有するものであればいかなる
ものであってもよい。より具体的には、配列番号：５の
アミノ酸配列を含有するヒト・ガラニンレセプター蛋白
質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００７２】本発明のガラニンレセプター蛋白質を完全
にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ガ
ラニンレセプター蛋白質の部分塩基配列を有する合成Ｄ
ＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、
または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをガラニンレ
セプター蛋白質の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断
片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブ
リダイゼーションによって選別する。ハイブリダイゼー
ションの方法は、例えば Molecular Cloning２nd（ed.
；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss, 1989 ）に記載の方法などに従って行われる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行う。例えば、本発明のマウ
ス由来ガラニンレセプター蛋白質を完全にコードするＤ
ＮＡのクローニングの手段としては、マウス由来ガラニ
ンレセプター蛋白質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡ
プライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、また
は適当なベクターに組み込んだＤＮＡをヒトまたはマウ
ス由来ガラニンレセプター蛋白質の一部あるいは全領域
を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識し
たものとのハイブリダイゼーションによって選別する。

【００７３】クローン化されたガラニンレセプター蛋白
質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したり
して使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側
に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端
側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴ
ＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻
訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて
付加することもできる。

【００７４】本発明のガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡ
を含有するベクター（例えば、発現ベクター、特に、ヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡを含有する発現プ
ラスミド）は、例えば、（イ）本発明のガラニンレセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断
片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクタ
ー（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡの
場合発現プラスミド）中のプロモーターの下流に連結す
ることにより製造することができる。ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢ
Ｒ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１
５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどが用いられる。本発明で用いられるプ
ロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応
して適切なプロモーターであればいかなるものでもよ
い。

【００７５】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、
rec Ａプロモーター、λＰ_L プロモーター、lpp プロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、pen Ｐプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどが
それぞれ利用できる。なお、発現にエンハンサーの利用
も効果的である。

【００７６】また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、ガラニンレセプター蛋白質のＮ端末側に付加
する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリ
フォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配
列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミ
ラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列な
どが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクタ
ーα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリ
ン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配
列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。

【００７７】さらに、本発明のヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質ＤＮＡを含有するベクターのうち、発現プラス
ミドの好ましい構築方法を以下に示す。プラスミドとし
ては、ｐＡＫＫＯ−１１１（ｐＡ１- １１と表記する場
合もある）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶなどが用
いられ、なかでもｐＡＫＫＯ−１１１（ｐＡ１- １１）
などが好ましい。プロモーターとしては、宿主となる細
胞で効率よく機能するものであれば何でもよく、ＳＶ４
０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ- Ｔ
Ｋプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＲＳＶプロモー
ターなどが挙げられ、なかでもＣＭＶプロモーター、Ｓ
Ｒαプロモーターなどが好ましく、特にＳＲαプロモー
ターが好ましい。発現プラスミドには、以上の他にエン
ハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナ
ル、選択マーカー等を含有しているものを用いるのが好
ましい。選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素
（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子、ネオ
マイシンリン酸転移酵素（以下、ｎｅｏ遺伝子と略称す
る場合がある）などが挙げらる。ｄｈｆｒ遺伝子はメソ
トレキセート（ＭＴＸ）耐性を与え、ｎｅｏ遺伝子はＧ
−４１８耐性を与える。特に、ｄｈｆｒ遺伝子が欠損し
ているＣＨＯ細胞を用いて、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マー
カーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によ
っても選択できる。

【００７８】本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質
をコードするＤＮＡを保持する好ましい発現プラスミド
としては、具体的には、ヒト・ガラニンレセプター蛋白
質をコードするＤＮＡの上流に前記のプロモーター（特
に、ＳＲαプロモーターなど）を挿入し、好ましくはヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの下
流にＳＶ初期遺伝子ポリＡ付加シグナルを挿入し、さら
にそのポリＡ付加シグナルの下流にｄｈｆｒ遺伝子、ア
ンピシリン耐性遺伝子などを挿入したものなどが好まし
い。より具体的には、例えばヒト・ガラニンレセプター
蛋白質ＤＮＡの上流にＳＲαプロモーターを挿入し、ヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの下
流にＳＶ初期遺伝子ポリＡ付加シグナルを挿入し、その
下流にｄｈｆｒ遺伝子を挿入し、さらにその下流にアン
ピシリン耐性遺伝子を挿入したｐＴＳ８６３で標示され
る発現プラスミド〔図１３〕などが好適である。このよ
うにして作製したヒト・ガラニンレセプター蛋白質ＤＮ
Ａを含有する発現プラスミドを宿主細胞に導入すること
によって、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを高発現できる細胞を作製することができる。

【００７９】本発明のガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡ
を含有するベクターを導入する宿主細胞としては、例え
ば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞などが用いられる。このようにして構築さ
れたガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含
有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。エシ
ェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例としては、エシェ
リヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プ
ロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pro
c. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０( １
９６８) 〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(
１９８１) 〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）〕，１２０巻，５１７( １９７８) 〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９( １９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティッ
クス（Genetics），３９巻，４４０( １９５４) 〕など
が用いられる。

【００８０】バチルス属菌としては、たとえばバチルス
・スブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５( １９８３) 〕，２０７−２１〔ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bio
chemistry ），９５巻，８７( １９８４) 〕などが用い
られる。酵母としては、たとえばサッカロマイセス セ
レビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２
２Ｒ^- ，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１
２などが用いられる。

【００８１】昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが
用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５
巻，５９２( １９８５) 〕。動物細胞としては、たとえ
ばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハ
ムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズ
ハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ＣＨＯ細胞），ＣＨ
Ｏ Ｋ−１，ヒトＦＬ細胞，２９３細胞，Ｌ細胞，ミエ
ローマ細胞，Ｃ１２７細胞，Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞，
Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。

【００８２】上記エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０( １９７２) やジーン（Gene），１７巻，
１０７( １９８２) などに記載の方法に従って行なわれ
る。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mole
cular ＆ General Genetics ），１６８巻，１１１( １
９７９) などに記載の方法に従って行われる。酵母を形
質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），７５巻，１９２９( １９７８) に記載の方法に従
って行なわれる。

【００８３】昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバ
イオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(198
8) ）などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞
を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６( １９７３) に記載の方法に従っ
て行なわれる。このようにして、ガラニンレセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質
転換された形質転換体が得られる。

【００８４】以上の宿主細胞の中でも、本発明のヒト・
ガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡを含有する発現プラス
ミドの宿主細胞としては、特に、動物細胞などが好まし
く、例えば２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ
細胞、ミエローマ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｂａｌｂ／ｃ３
Ｔ３細胞、Ｓｐ- ２／Ｏ細胞などが挙げられ、なかでも
ＣＨＯ細胞または２９３細胞などが好ましく、特にＣＨ
Ｏ細胞〔ジャーナル・オブ・エクスペリメント・オブ・
メディソン（Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．）、１０８、９４５
（１９５８）〕などが好適である。さらに、ＣＨＯ細胞
のなかでも、ｄｈｆｒ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞
（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細胞と略称する場合があ
る）〔プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７７、４２１
６−４２２０（１９８０）〕、ＣＨＯ Ｋ−１細胞〔プ
ロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、６０、１２７５（１
９６８）〕などが好ましい。発現プラスミド中に選択マ
ーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子が挿入されている場合は、
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細胞などが好適である。

【００８５】発現プラスミドと宿主細胞の組み合わせと
しては、適宜好ましい組み合わせを選択することができ
るが、例えば、ｐＴＳ８６３で標示される発現プラスミ
ド〔図１３〕の宿主細胞としては、例えばＣＨＯ（ｄｈ
ｆｒ^- ）細胞などが好適である。この発現プラスミドの
動物細胞への導入方法としては、公知の方法、例えばリ
ン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A.
J. ヴィロロジー(Virology) 52, 456-467 (1973) 〕、
電気穿孔法〔Neumann, E. et al. エンボ・ジャーナル
(EMBO J.) 1, 841-845 (1982) 〕等が用いられる。以上
のようにして、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡ
を含有するベクターで形質転換された形質転換体が得ら
れる。また、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡを
含有する発現プラスミドで形質転換された形質転換体
は、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を製造することが
できる。

【００８６】ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を高発現
できる細胞は、前述の発現プラスミドが染色体に組込ま
れた細胞をクローン選択によって選択することによって
得ることができる。具体的には、まず、上記の選択マー
カーを指標として形質転換体を選択する。さらに、この
ようにして選択マーカーを用いて得られた形質転換体に
対して、繰り返しクローン選択を行うことにより、ヒト
・ガラニンレセプター蛋白質の高発現能を安定に有する
細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選
択マーカーとして用いた場合、メソトレキセート（ＭＴ
Ｘ）の濃度を漸次上げて培養して耐性細胞を選択するこ
とにより、導入遺伝子を細胞内で増幅することにより、
さらに高発現の細胞株を得ることもできる。なお、宿主
としてＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細胞を用いた場合であって
も、例えばｐＴＳ８６３で標示される発現プラスミドに
はｄｈｆｒ遺伝子が導入されているので〔図１３〕、ｐ
ＴＳ８６３で標示される発現プラスミドを含有するＣＨ
Ｏ（ｄｈｆｒ^- ）細胞は、結果として、ｄｈｆｒ遺伝子
を有していることになる。本願明細書においては、ｄｈ
ｆｒ遺伝子を含有する発現プラスミド（例えば、ｐＴＳ
８６３など）をＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細胞に含有せしめ
て得られるＣＨＯ細胞を「ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞」
と表記する場合がある。

【００８７】本発明において、ヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質ＤＮＡを高発現できる形質転換体としては、例
えば、後述する実施例１１で得られるｐＴＳ８６３で標
示される発現プラスミドをＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細胞に
含有せしめて得られるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞などが
挙げられる。具体的には、ＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−５で
標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞、ＣＨＯ／ｐＴＳ
８６３−７で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞など
が挙げられる。これらのＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞は、
公知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を発現するＣＯ
Ｓ細胞に比べて、大量のヒト・ガラニンレセプター蛋白
質を発現することができ、さらには、天然のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質を含有する組織（例えば、ヒトme
lanoma Bowes細胞など）に比べて、約１０〜１００倍、
好ましくは約１００倍のレセプター活性（例えば、リガ
ンド結合活性など）を有するものである。したがって、
これらのＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞は、後述するヒト・
ガラニンレセプターアゴニスト／アンタゴニストのスク
リーニング方法に有効なものである。

【００８８】本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質
および本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有
する細胞は、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質
ＤＮＡを含有するベクター（特に、発現プラスミド）を
含有する形質転換体を、ヒト・ガラニンレセプター蛋白
質をコードするＤＮＡの発現が可能な条件下で培養する
ことによっても製造することができる。宿主がエシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としては、たとえば塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな
どが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因
子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ま
しい。

【００８９】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や攪拌を加えることもできる。

【００９０】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkho
lder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５( １９８０) 〕
や０. ５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G.
A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，
５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約
５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜
３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や攪
拌を加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、Grace's Insect Medium （Grace,
T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動
化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなど
が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整す
るのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加える。

【００９１】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience ），１２２
巻，５０１( １９５２) 〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Virology），８巻，３９６( １９５９) 〕，ＲＰＭ
Ｉ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン
・メディカル・アソシエーション（The Jounal of the
American Medical Association），１９９巻，５１９(
１９６７) 〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ
・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディ
スン（Proceeding of the Society for the Biological
Medicine ），７３巻，１( １９５０)〕，α- ＭＥＭ
培地などが用いられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細
胞およびｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を用いる場合、チ
ミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭ
ＥＭ培地を用いるのが好ましい。ｐＨは約６〜８である
のが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜
７２時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌な
どを加える。

【００９２】このようにして、ガラニンレセプター蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するベクター（特に、発現
プラスミド）を保持する形質転換体からガラニンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞を製造することができる。例
えば、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有
する細胞としては、具体的には、ヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質を含有するＣＨＯ細胞などが好ましく、ＣＨ
Ｏ／ｐＴＳ８６３−５で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ⁺ ）細胞、ＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−７で標示されるＣ
ＨＯ（ｄｈｆｒ⁺ ）細胞などを培養して製造することが
できる。上記した本発明のガラニンレセプター蛋白質を
含有する細胞の培養物からガラニンレセプター蛋白質
（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質）またはそ
の部分ペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法
により行なうことができる。

【００９３】ガラニンレセプター蛋白質を培養菌体ある
いは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法
で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁
し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などに
よって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ
過によりガラニンレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方
法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニ
ジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登
録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界
面活性剤が含まれていてもよい。

【００９４】培養液中にガラニンレセプター蛋白質が分
泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で
菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。こ
のようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含
まれるガラニンレセプター蛋白質の精製は、自体公知の
分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができ
る。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒
沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。かくして得られるガラニンレセプター蛋白質が遊離
体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法により、遊離体または他の塩に変換することができ
る。

【００９５】なお、組換え体が産生するガラニンレセプ
ター蛋白質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵
素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポ
リペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾
酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、
アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、
グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成するガ
ラニンレセプター蛋白質の活性は標識したガラニンなど
との結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノ
アッセイなどにより測定することができる。

【００９６】なお、上記の手法において、本発明のヒト
・ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡに代え
て、公知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質をコードす
るＤＮＡを用いることによって、組換え型ヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質を高発現する細胞や組換え型ヒト・
ガラニンレセプター蛋白質を単離することもできる。公
知のヒト・ガラニンレセプター蛋白質はＣＯＳ細胞で発
現されているが、一般にＣＯＳ細胞での発現量は少な
い。しかし、本発明の発現プラスミドの構築方法に従え
ば、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を高発現
する細胞（特に、ＣＨＯ細胞）だけでなく、公知のヒト
・ガラニンレセプター蛋白質を高発現する細胞（特に、
ＣＨＯ細胞）を製造することができる。

【００９７】本発明のガラニンレセプター蛋白質を含有
する細胞の細胞膜画分（例えば、ヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞の細胞膜画分あるいはマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞の細胞膜
画分）は、ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞
（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する
細胞あるいはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質を含
有する細胞）を破砕した後、それ自体公知の方法で得ら
れる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破
砕方法としては、例えば、Potter−Elvehjem型ホモジナ
イザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーや
ポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波によ
る破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細い
ノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられ
る。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心
分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したガラニンレセプタ
ー蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質あ
るいはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質）と細胞由
来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
本発明のガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞やそ
の細胞膜画分中のガラニンレセプター蛋白質の量（例え
ば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞や
その細胞膜画分中のヒト・ガラニンレセプター蛋白質の
量あるいはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質を含有
する細胞やその細胞膜画分中のマウス由来ガラニンレセ
プター蛋白質の量）は、１細胞当たり１０³ 〜１０⁸ 分
子であるのが好ましく、１０⁵ 〜１０⁷ 分子であるのが
好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリ
ガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリ
ーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロッ
トで大量の試料を測定できるようになる。

【００９８】本発明のガラニンレセプター蛋白質、ガラ
ニンレセプター蛋白質の部分ペプチドおよびガラニンレ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体および抗
血清の入手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構
築、同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開
発と医薬品候補化合物のスクリーニング、構造的に類
似したリガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラ
ッグデザインの実施、遺伝子診断におけるプローブ、
ＰＣＲプライマーの作製、遺伝子治療、トランスジ
ェニック動物（例えば、トランスジェニックマウスな
ど）の作製、遺伝子欠損による病態モデル動物の作製
等に用いることができる。特に、本発明の組み替え型ガ
ラニンレセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結
合アッセイ系によって、ヒトなどの温血動物に特異的な
ガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを
スクリーニングすることができ、該アゴニストまたはア
ンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用
することができる。例えば、本発明のマウス由来ガラニ
ンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡおよびマウス由
来ガラニンレセプター蛋白質は、抗体および抗血清の
入手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、
同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医
薬品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似した
ガラニンレセプターとの比較にもとづいたドラッグデザ
インの実施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプ
ライマーの作成、トランスジェニックマウスの作製、
遺伝子欠損による病態モデル動物の作製等に用いるこ
とができる。

【００９９】また、本発明のヒト・ガラニンレセプター
蛋白質、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチ
ドおよびヒト・ガラニンレセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡは、抗体および抗血清の入手、組換え型レセ
プター蛋白質の発現系の構築、同発現系を用いたレセ
プター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスク
リーニング、構造的に類似したリガンド・レセプター
との比較にもとづいたドラッグデザインの実施、遺伝
子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマーの作製、
遺伝子治療などに用いることができる。特に、本発明の
ヒト・ガラニンレセプター蛋白質の発現系を用いたレセ
プター結合アッセイ系によって、温血動物（特に、ヒ
ト）に特異的なガラニンレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストをスクリーニングすることができ、該アゴ
ニストまたはアンタゴニストをガラニンに起因する各種
疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。

【０１００】本発明のガラニンレセプター蛋白質、ガラ
ニンレセプター蛋白質部分ペプチド、ガラニンレセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡおよび抗体の用途につい
て、以下により具体的に説明する。 （１）ガラニンの定量法 本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、ヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質あるいはマウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質）もしくはその塩、または本発明の部分
ペプチドまたはその塩は、リガンドであるガラニンに対
して特異的な結合性を有しているので、被検体中のガラ
ニンの濃度あるいは生体内におけるガラニン濃度を感度
良く定量することができる。

【０１０１】すなわち、被検体を本発明のガラニンレセ
プター蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白
質あるいはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質）もし
くはその塩、またはガラニンレセプター蛋白質（例え
ば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質あるいはマウス由
来ガラニンレセプター蛋白質）の部分ペプチドもしくは
その塩と接触させることによって、被検体中のガラニン
濃度を定量することができる。本発明のガラニンの定量
方法は、例えば競合法と組み合わせることによって用い
ることができる。具体的には、例えば、以下のまたは
などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って
用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行） さらに、本発明のガラニンの定量法は、ガラニン濃度の
増減に起因する疾病（例えば、胃潰瘍、糖尿病、アルツ
ハイマー病など）の診断方法としても使用できる。

【０１０２】（２）ガラニンレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストのスクリーニング方法 本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由
来ガラニンレセプター蛋白質）もしくはその塩、または
本発明の部分ペプチドもしくはその塩を用いるか、また
は組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築し、該発現
系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによ
って、ガラニンとガラニンレセプター蛋白質（例えば、
マウス由来ガラニンレセプター蛋白質）との結合を阻害
する化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽
出液、動物組織抽出液など）またはその塩をスクリーニ
ングすることができる。

【０１０３】このような化合物には、ガラニンレセプタ
ー（例えば、マウス由来ガラニンレセプター）を介して
細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコ
リン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの低下、インスリン分泌などを促進する活性ま
たは抑制する活性など、特に細胞内ｃＡＭＰ生成または
インスリン分泌を促進する活性または抑制する活性な
ど）を有する化合物（いわゆる、ガラニンレセプターア
ゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆ
る、ガラニンレセプターアンタゴニスト）などが含まれ
る。

【０１０４】すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のガラ
ニンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部
分ペプチドもしくはその塩に、ガラニンを接触させた場
合と（ii）本発明のガラニンレセプター蛋白質もしくは
その塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩に、
ガラニンおよび試験化合物を接触させた場合との比較を
行なうことを特徴とするガラニンレセプターアゴニスト
またはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供す
る。

【０１０５】本発明のスクリーニング方法においては、
（ｉ）本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、マ
ウス由来ガラニンレセプター蛋白質など）もしくはその
塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩に、ガラ
ニンを接触させた場合と（ii）本発明のガラニンレセプ
ター蛋白質（例えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋
白質など）もしくはその塩または本発明の部分ペプチド
もしくはその塩に、ガラニンおよび試験化合物を接触さ
せた場合における、例えば該ガラニンレセプター蛋白質
（例えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白質）もし
くはその塩または該部分ペプチドもしくはその塩に対す
るガラニンの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比
較することを特徴とする。

【０１０６】ガラニンレセプターアゴニストまたはアン
タゴニストのスクリーニング方法においては、ヒト・ガ
ラニンレセプタータンパク質としてヒト海馬を用いるこ
とも考えられる。しかし、ヒト由来の組織は入手が極め
て困難であるため、スクリーニングに用いるものとして
は適当ではなく、実際には、細胞（特に、ＣＨＯ細胞な
どの動物細胞）に大量発現させた組換え型ヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質が適している。さらには、ヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質を持続的に安定発現している細
胞株を用いるのが最も好ましい。したがって、本発明の
ヒト・ガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩、本発
明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチドも
しくはその塩、または本発明のヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分は、ガラ
ニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスク
リーニング用試薬として有用である。すなわち、本発明
は、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質もしくは
その塩、本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩、または本発明のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜
画分を用いることを特徴とするガラニンレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提
供する。

【０１０７】より具体的には、本発明は、 （Ｉ）（ｉ）本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ガラニンを
接触させた場合と（ii）本発明のヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ガ
ラニンおよび試験化合物などの試料を接触させた場合と
の比較を行なうことを特徴とするガラニンレセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
および （II）（ｉ）本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質
を含有する細胞またはその細胞膜画分に、ガラニンを接
触させた場合と（ii）本発明のヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に、ガラ
ニンおよび試験化合物などの試料を接触させた場合との
比較を行なうことを特徴とするガラニンレセプターアゴ
ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提
供する。具体的には、本発明のスクリーニング方法
（Ｉ）および（II）においては、（ｉ）と（ii）の場合
における、例えば該ヒト・ガラニンレセプター蛋白質、
その部分ペプチドもしくはそれらの塩、またはヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細
胞膜画分に対するガラニンの結合量、細胞刺激活性など
を測定して、比較することを特徴とするものである。

【０１０８】より具体的には、本発明は、 （ｉ）標識したガラニンを、本発明のガラニンレセ
プター蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白
質）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に接触
させた場合と、（ii）標識したガラニン（例えば、ヒト
・ガラニン）および試験化合物を、本発明のガラニンレ
セプター蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋
白質）もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に接
触させた場合における、標識したガラニンの該レセプタ
ー蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する
結合量を測定し、比較することを特徴とするガラニンレ
セプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニ
ング方法、 （ａ）（ｉ）標識したガラニンを、本発明のガラニ
ンレセプター蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質あるいはマウス由来ガラニンレセプター蛋白
質）を含有する細胞（例えば、マウスＭＩＮ６細胞（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４９５４）など）または該細胞の膜画分
に接触させた場合と、（ii）標識したガラニンおよび試
験化合物を、本発明のガラニンレセプター蛋白質（例え
ば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質あるいはマウス由
来ガラニンレセプター蛋白質）を含有する細胞またはそ
の細胞膜画分に接触させた場合における、標識したガラ
ニンの該細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測
定し、比較することを特徴とするガラニンレセプターア
ゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
および （ｂ）（ｉ）ガラニンを、本発明のガラニンレセプター
蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ある
いはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質）を含有する
細胞（例えば、マウスＭＩＮ６細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４９５４）など）またはその細胞膜画分に接触させた場
合と、（ii）ガラニンおよび試験化合物を、本発明のガ
ラニンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞
膜画分に接触させた場合における、ガラニンレセプター
（例えば、ヒト・ガラニンレセプターあるいはマウス由
来ガラニンレセプター）を介した細胞刺激活性（例え
ば、Ｋ⁺ チャンネルの開放、Ｎ型Ｃａ⁺ チャンネルの閉
鎖、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成（の抑制）、細胞
内ｃＧＭＰ生成、インスリン分泌、イノシトールリン酸
産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−
ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、ホルモ
ンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する
活性または抑制する活性など、特に細胞内ｃＡＭＰ生成
またはインスリン分泌を促進する活性または抑制する活
性など）を測定し、比較することを特徴とするガラニン
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニング方法、 標識ガラニンを、本発明のガラニンレセプター蛋白
質（例えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白質）を
コードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養すること
によって細胞膜上に発現したガラニンレセプター蛋白質
（例えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白質）に接
触させた場合と、標識したガラニンおよび試験化合物を
本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由
来ガラニンレセプター蛋白質）をコードするＤＮＡを含
有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発
現したガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由来
ガラニンレセプター蛋白質）に接触させた場合におけ
る、標識ガラニンの該ガラニンレセプター蛋白質（例え
ば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白質）に対する結
合量を測定し、比較することを特徴とするガラニンレセ
プターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニン
グ方法、

【０１０９】 ガラニンを、本発明のガラニンレセプ
ター蛋白質（例えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋
白質）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養
することによって細胞膜上に発現したガラニンレセプタ
ー蛋白質（例えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白
質）に接触させた場合と、ガラニンおよび試験化合物を
本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由
来ガラニンレセプター蛋白質）をコードするＤＮＡを含
有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発
現したガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由来
ガラニンレセプター蛋白質）に接触させた場合におけ
る、ガラニンレセプター（例えば、マウス由来ガラニン
レセプター）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキド
ン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細
胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、インスリン分泌
などを促進する活性または抑制する活性など、特に細胞
内ｃＡＭＰ生成またはインスリン分泌を促進する活性ま
たは抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴
とするガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
ストのスクリーニング方法を提供する。

【０１１０】上記のまたは（ａ）のスクリーニング
方法において、ガラニンレセプター蛋白質（例えば、ヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質）に結合して、ガラニン
とガラニンレセプター蛋白質（例えば、ヒト・ガラニン
レセプター蛋白質）との結合を阻害する化合物がガラニ
ンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストとして選
択できる。さらに、上記（ｂ）のスクリーニング方法
において、ガラニンレセプター（例えば、ヒト・ガラニ
ンレセプター）に結合し、該レセプターを介して細胞刺
激活性（例えば、Ｋ⁺ チャンネルの開放、Ｎ型Ｃａ⁺ チ
ャンネルの閉鎖、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成の抑
制、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、
細胞の遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、
細胞増殖などを促進する活性または抑制する活性など）
を有する化合物をガラニンレセプターアゴニストとして
選択することができる。一方、上記のまたは（ａ）
のスクリーニング方法において、ガラニンとガラニンレ
セプター蛋白質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋
白質）との結合を阻害する活性が認められた試験化合物
の中で、該細胞刺激活性を有しない化合物をガラニンレ
セプターアンタゴニストとして選択することができる。

【０１１１】本発明のガラニンレセプター蛋白質（例え
ば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質）を含有する細胞
が得られる以前は、ガラニンレセプター蛋白質（例え
ば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質）を高発現できる
細胞がなかったため、ガラニンレセプターアゴニストま
たはアンタゴニストを効率良くスクリーニングすること
ができなかった。本発明のスクリーニング方法の具体的
な説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方
法に用いるガラニンレセプター蛋白質、例えば、マウス
由来ガラニンレセプター蛋白質としては、本発明のガラ
ニンレセプター蛋白質またはガラニンレセプター蛋白質
の部分ペプチド、例えば、マウス由来ガラニンレセプタ
ー蛋白質またはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質の
部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであっ
てもよいが、マウスなどの臓器、組織、細胞などの膜画
分が好適である。また、組換え体を用いて大量発現させ
たガラニンレセプター蛋白質（例えば、組換えマウス由
来ガラニンレセプター蛋白質など）なども適している。

【０１１２】ガラニンレセプター蛋白質、例えば、マウ
ス由来ガラニンレセプター蛋白質を製造するには、前述
の方法が用いられるが、該ガラニンレセプター蛋白質を
コードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現する
ことにより行うことができる。目的部分をコードするＤ
ＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれ
に制約されるものではない。例えば遺伝子断片や合成Ｄ
ＮＡを用いてもよい。ガラニンレセプター蛋白質、例え
ば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく
発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とする
バキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclea
r polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモ
ーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒト
ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプ
ロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込む
のが好ましい。

【０１１３】発現したレセプターの量と質の検査はそれ
自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Na
mbi ，P ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜1955
9 頁,1992 年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。したがって、本発明のスクリーニング方法におい
て、ガラニンレセプター蛋白質またはガラニンレセプタ
ー蛋白質の部分ペプチド、例えば、マウス由来ガラニン
レセプター蛋白質またはマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質の部分ペプチドを含有するものとしては、それ自
体公知の方法に従って精製したガラニンレセプター蛋白
質またはガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチド、例
えば、マウス由来ガラニンレセプター蛋白質または該マ
ウス由来ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチドであ
ってもよいし、該ガラニンレセプター蛋白質を含有する
細胞またはその細胞膜画分を用いてもよい。

【０１１４】本発明のスクリーニング方法において、ガ
ラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由来ガラニン
レセプター蛋白質）を含有する細胞を用いる場合、該細
胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化して
もよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行う
ことができる。例えば、マウス由来ガラニンレセプター
蛋白質を含有する細胞としては、マウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質を発現した宿主細胞や、マウス由来ガラ
ニンレセプター蛋白質を含有する天然細胞などをいう。
マウス由来ガラニンレセプター蛋白質を発現する宿主細
胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞などが挙げられる。マウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質を発現した宿主細胞は、前述した組換え
体を用いるマウス由来ガラニンレセプター蛋白質の製造
法に準じて製造することができる。

【０１１５】ガラニンレセプターアゴニストまたはアン
タゴニストをスクリーニングする前記の、（ａ）及
びの方法を実施するためには、適当なガラニンレセプ
ター画分（例えば、マウス由来ガラニンレセプター画
分）と、標識したガラニンが必要である。例えば、マウ
ス由来ガラニンレセプター画分としては、天然型のマウ
ス由来ガラニンレセプター画分、天然型のマウス由来ガ
ラニンレセプターと同等の活性を有する組換え型マウス
由来ガラニンレセプター画分、組換え型マウス由来ガラ
ニンレセプターを発現した細胞、マウス由来ガラニンレ
セプターを含有する天然細胞などが望ましい。ここで、
同等の活性とは、同等のガラニン結合活性などを示す。
リガンドとして使用するガラニンとしては、市販のもの
などを用いることができる。また、ガラニンの代わり
に、公知のガラニンレセプターアゴニストやアンタゴニ
ストなどを使用することもできる。標識したガラニンと
しては、標識したガラニン、標識したガラニンアナログ
化合物などが用いられる。標識したガラニンとしては、
例えば、〔³ Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕な
どで標識したガラニンなどを用いることができ、さらに
は、〔³ Ｈ〕、〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕などで標識した公
知のガラニンアゴニストやアンタゴニストなどを用いる
こともできる。例えば、〔¹²⁵ Ｉ〕で標識されたガラニ
ン（Ｄｕｐｏｎ／ＮＥＮ）などが好適である。

【０１１６】具体的には、ガラニンレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを行なうに
は、例えば、まず本発明のガラニンレセプター蛋白質
（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質又はマウス
由来ガラニンレセプター蛋白質など）を含有する細胞ま
たは細胞の膜画分を、あるいはガラニンレセプター蛋白
質（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質又はマウ
ス由来ガラニンレセプター蛋白質など）またはその部分
ペプチドを、スクリーニングに適したバッファーに懸濁
することによりレセプター標品を調製する。バッファー
には、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸
バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのガラニンと
レセプターとの結合を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的
で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテア
ーゼによるレセプターやガラニンの分解を抑える目的
で、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチ
ニン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンな
どのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。例え
ば、試験化合物を同バッファーに懸濁した１０^-4Ｍ〜１
０^-10 Ｍの試験化合物溶液を反応チューブに入れ、そし
て、０. ０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液を添加
する。

【０１１７】さらに、０. ０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセ
プター溶液に、一定量（例えば、２０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌの場合、約１００００ｃｐｍ〜１００００００ｃｐ
ｍ、また別の場合５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐ
ｍ）の標識したガラニンを添加する。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のガラニンを加
えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、
望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ま
しくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙
等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス
繊維濾紙に残存する放射活性（例えば、〔¹²⁵Ｉ〕の
量）を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウ
ンターで計測する。濾過には、マニホールドやセルハー
ベスターを用いることができるが、セルハーベスターを
用いることが効率を上げるために望ましい。拮抗する物
質がない場合のカウント( Ｂ₀ ）から非特異的結合量
（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀ −ＮＳＢ）を１００
％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えばカ
ウント（Ｂ₀ −ＮＳＢ）の５０％以下になる試験化合物
を拮抗阻害能力のある候補物質、アゴニストまたはアン
タゴニスト候補化合物として選択することができる。

【０１１８】例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質
を用いた場合、具体的には次のような手順で操作を行な
う。 （ｉ）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ- ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０. １％ ＢＳＡ、０. ０５％ ＣＨＡＰＳ、０.
５ｍＭ ＰＭＳＦ、４０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２
０μｇ／ｍｌ Ｅ−６４、１０μｇ／ｍｌ ペプスタチ
ン、ｐＨ７．４の反応バッファーを作製する。 （ii）反応バッファーに試験化合物を懸濁した試験化合
物溶液２μｌを氷上で反応チューブに入れる。試験化合
物の最終濃度を１００μＭに調製する。 （iii ）−８０℃で凍結乾燥してあるヒト・ガラニンレ
セプター蛋白質を含有する細胞膜画分を室温に戻し、軽
くボルテックスした後、適当な濃度に希釈し、細胞膜画
分溶液を調製する（例えば、０. ５ｍｇタンパク／ｍｌ
（ウシ海馬膜画分、ＣＨＯ細胞膜画分）など）。この細
胞膜画分溶液をcell strainer に通した後、反応チュー
ブに分注器で２００μｌ分中する。 （iv）反応バッファーに希釈した〔¹²⁵ Ｉ〕ガラニンを
２μｌずつ氷上で反応チューブに入れる。 （ｖ）２５℃で６０分間もしくは７５分間反応を行な
う。 （vi）マニホールドを使用し、Ｂ／Ｆ分離を行なう。こ
の時に使用するフィルター（ＧＦ／Ｆ、ワットマン社）
はあらかじめＰＥＩ液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ- ＨＣｌ、
０．３％ ポリエチレンイミド）、ｐＨ７．４）に１時
間以上浸しておく。（vii ）フィルターをγ−カウンタ
ーでカウントする。特異的結合を４０〜５０％以上阻害
した化合物を±、５０％以上阻害した化合物を＋と評価
する。

【０１１９】ガラニンレセプターアゴニストまたはアン
タゴニストをスクリーニングする前記の（ｂ）及び
の方法を実施するためには、ガラニンレセプター蛋白質
を介する細胞刺激活性（例えば、マウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質を介する細胞刺激活性）（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、インスリン分泌
などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の
方法または市販の測定用キットを用いて測定することが
できる。また、上記（ｂ）のスクリーニング方法をヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質に関連して実施するため
には、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を介する細胞刺
激活性（例えば、Ｋ⁺ チャンネルの開放、Ｎ型Ｃａ⁺ チ
ャンネルの閉鎖、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ²⁺濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成の抑
制、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内
蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細
胞の遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細
胞増殖などを促進する活性または抑制する活性など）を
公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定する
ことができる。

【０１２０】具体的には、まず、ガラニンレセプター蛋
白質を含有する細胞（例えば、ヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞あるいはマウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質を含有する細胞）をマルチウェルプレー
ト等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては
前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当
なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定
時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液
を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定
量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラ
キドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によ
って検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添
加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生
抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞
の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑
制作用として検出することができる。

【０１２１】細胞刺激活性を測定してスクリーニングを
行なうには、適当なガラニンレセプター蛋白質を発現し
た細胞（例えば、適当なマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質を発現した細胞）が必要である。本発明のガラニ
ンレセプター蛋白質を発現した細胞、例えばマウス由来
ガラニンレセプター蛋白質を発現した細胞としては、天
然型のマウス由来ガラニンレセプター蛋白質を有する細
胞株（例えば、マウスＭＩＮ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９
５４）など）、前述の組換え型マウス由来ガラニンレセ
プター蛋白質発現細胞株などが望ましい。こうした細胞
のなかでも、天然型のマウス由来ガラニンレセプター蛋
白質を有する細胞株であるマウス膵臓由来ＭＩＮ６細胞
は、ガラニンが該細胞膜上のガラニンレセプターに結合
した場合、細胞内からインスリンを分泌することができ
る。したがって、マウス膵臓由来ＭＩＮ６細胞は、イン
スリン分泌を細胞刺激活性の指標とする場合、最も好ま
しい細胞である。

【０１２２】試験化合物としては、例えばペプチド、タ
ンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。ガラニンレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キ
ットは、例えば、本発明のガラニンレセプター蛋白質ま
たはその塩（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質
もしくはその塩あるいはマウス由来ガラニンレセプター
蛋白質またはその塩）、本発明のガラニンレセプター蛋
白質の部分ペプチドまたはその塩（例えば、ヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩ある
いはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチ
ドまたはその塩）、本発明のガラニンレセプター蛋白質
を含有する細胞（例えば、ヒト・ガラニンレセプター蛋
白質を含有する細胞あるいはマウス由来ガラニンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞）、あるいは本発明のガラニ
ンレセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分（例えば、
ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞の膜画
分あるいはマウス由来ガラニンレセプター蛋白質を含有
する細胞の膜画分）などを含有するものである。

【０１２３】本発明のスクリーニング用キットの例とし
ては、次のものが挙げられる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution （ギブコ社製）に、
０. ０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加え
たもの。孔径０. ４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、
４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 マウス由来ガラニンレセプター標品 マウス由来ガラニンレセプター蛋白質を発現させたＣＨ
Ｏ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵ 個／穴で継代
し、３７℃、５％ＣＯ₂ 、９５％ａｉｒで２日間培養し
たもの。

【０１２４】標識ガラニン 〔³ Ｈ〕、〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識
したガラニン 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて５μＭに希釈する。 ガラニン標準液 ガラニンを０. １％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１００μＭとなるように溶解し、−２０
℃で保存する。

【０１２５】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したマウス由来ガ
ラニンレセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測
定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定
用緩衝液を各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10 Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識ガラニンを１０μｌ加え、室温にて１時間反応
させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のか
わりに１０^-4Ｍのガラニンを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識ガラニンを０. ２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 オートガンマーカウンターまたは液体シンチレーショ
ンカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測
定し、Percent of Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式
〔数１〕で求める。

【０１２６】

【数１】ＰＭＢ＝〔（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀ −ＮＳ
Ｂ）〕×１００ ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【０１２７】本発明のスクリーニング用キットの別の例
としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 ０. ０１％のウシ血清アルブミン、０. ０５％のＣＨＡ
ＰＳを加えたハンクス緩衝液。孔径０. ２２μｍのフィ
ルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時
調製しても良い。 ヒト・ガラニンレセプター蛋白質標品 ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞を、１
２穴プレートに５×１０⁵ 個／穴で継代し、３７℃、５
％ＣＯ₂ 、９５％ａｉｒでコンフルエントになるまで培
養したもの。 標識ガラニン 市販の〔³ Ｈ〕、〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕などで標識した
ガラニン 溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 ガラニン標準液 ガラニンを滅菌水で１０^-4Ｍとなるように溶解し、−２
０℃で保存する。

【０１２８】〔測定法〕 １２穴組織培養用プレートにて培養したヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質を含有する細胞を、測定用緩衝液１
ｍｌで２回程度洗浄する。 測定用緩衝液を吸い出した後、４℃に冷やした１０^-3
〜１０^-10 Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、１０
０ｐＭ標識ガラニンを含む測定用緩衝液を０. ５ｍｌ加
え、３７℃、５％ＣＯ₂ 、９５％air で１時間反応させ
る。非特異的結合量を知るためには試験化合物と共に１
μＭのガラニンを加えておく。 反応液を除去し、３７℃の１ｍｌの洗浄用緩衝液で３
回洗浄する。細胞に結合した標識ガラニンを０. ５ｍｌ
の０. ２Ｎ ＮａＯＨではがした後、γ- カウンターで
放射活性を測定し、Percent of Maximum Binding（ＰＭ
Ｂ）を上記の式〔数１〕で求める。

【０１２９】なお、上記のスクリーニング方法およびス
クリーニング用キットにおいては、本発明のヒト・ガラ
ニンレセプター蛋白質、その部分ペプチドおよび本発明
のヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する細胞もし
くはその細胞膜画分の代わりに、公知のヒト・ガラニン
レセプター蛋白質ＤＮＡなどのＤＮＡから製造した組換
え型ヒト・ガラニンレセプター蛋白質、その部分ペプチ
ドまたは組換え型ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含
有する細胞もしくはその細胞膜画分を用いることもでき
る。

【０１３０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、ガラニンとガラニンレセプターとの結合を阻害する
化合物であり、具体的にはガラニンレセプターを介して
細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる、
ガラニンレセプターアゴニスト）、あるいは該刺激活性
を有しない化合物（いわゆる、ガラニンレセプターアン
タゴニスト）である。該アゴニストおよびアンタゴニス
トとしては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド
性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、こ
れらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の
化合物であってもよい。また、本発明のガラニンレセプ
ターアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のスク
リーニング方法またはスクリーニング用キットを用い
て、試験化合物（例えば、ペプチド、タンパク、非ペプ
チド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、
植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの
試験化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化
合物であってもよい。）の中から選択される化合物また
はその塩であり、特に好ましくはガラニンと本発明の組
換え型ヒト・ガラニンレセプタータンパク質との結合を
阻害する化合物である。該化合物の中でも、ガラニンレ
セプターアゴニストはヒト・ガラニンレセプターを介し
て細胞刺激活性を有する化合物であり、ガラニンレセプ
ターアンタゴニストは該細胞刺激活性を有しない化合物
である。

【０１３１】さらに、本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られた該ガラニン
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストの構造式を
化学修飾あるいは置換したもの、また、該化合物の構造
式を基にデザイン化した化合物なども、本発明のスクリ
ーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得
られたガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
ストに含まれる。該ガラニンレセプターアゴニストまた
はアンタゴニストの塩としては、とりわけ生理学的に許
容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例
えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられ
る。

【０１３２】該ガラニンレセプターアゴニストは、ガラ
ニンが有する生理活性と同様の作用、例えば、全部また
は一部を有しているので、該生理活性に応じて安全で低
毒性な医薬組成物として有用である。一方、ガラニンレ
セプターアンタゴニストは、ガラニンが有する生理活性
を抑制することができる、例えば、ガラニンが有する生
理活性の全部または一部を抑制することができるので、
該ガラニン活性を抑制する安全で低毒性な医薬組成物と
して有用である。具体的には、ガラニンレセプターアゴ
ニストはアセチルコリン遊離抑制剤、インスリン分泌抑
制剤、成長ホルモン分泌刺激剤、学習行動抑制剤または
満腹感抑制剤などとして有用であり、さらには、分裂病
もしくは胃潰瘍の予防・治療剤または鎮痛剤などとして
有用である。一方、ガラニンレセプターアンタゴニスト
はアセチルコリン遊離促進剤、インスリン分泌促進剤、
成長ホルモン分泌抑制剤、学習行動促進剤または満腹感
促進剤などとして有用であり、さらには、肥満治療剤、
糖尿病、向知能剤、アルツハイマー病または痴呆症の予
防・治療剤などとして有用である。

【０１３３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはア
ンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って実施することができる。例えば、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に
認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、
安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施
に要求される単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は指
示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので
ある。

【０１３４】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方することができる。

【０１３５】注射用の水性液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、
Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム
など）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばア
ルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（た
とえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート
８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補
助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど
と併用してもよい。

【０１３６】また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベン
ザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例え
ば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールな
ど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノー
ルなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整され
た注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒト）に
対して投与することができる。

【０１３７】該アゴニストまたはアンタゴニストの投与
量は、投与対象動物の種類、対象臓器の種類、症状、化
合物の種類、製剤の剤形、投与方法などにより差異はあ
るが、経口投与の場合、通常一般的に成人（６０ｋｇと
して）においては、一日につき約０. １〜１００ｍｇ、
好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．
０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その
１回投与量は投与対象動物、対象臓器の種類、症状、化
合物の種類、製剤の剤形、投与方法などによっても異な
るが、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。

【０１３８】（３）ガラニンレセプター蛋白質欠乏症の
予防・治療剤 本発明のガラニンレセプター蛋白質、例えば、ヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、ガラニ
ンレセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤として使用す
ることができる。例えば、生体内において本発明のガラ
ニンレセプター蛋白質、例えば、ヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質が減少しているためにガラニンの生理作用が
期待できない患者がいる場合に、（イ）本発明のガラニ
ンレセプター蛋白質、例えば、ヒト・ガラニンレセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に投与し、生体内
で該ガラニンレセプター蛋白質、例えば、ヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質発現させることによって、あるいは
（ロ）細胞に本発明のガラニンレセプター蛋白質、例え
ば、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを挿入し、該ガラニンレセプター蛋白質、例えば、ヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質を発現させた後に、該細
胞を該患者に移植することなどによって、該患者のガラ
ニンレセプター蛋白質、例えば、ヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質の量を増加させ、ガラニンの作用を充分に発
揮させることができる。したがって、本発明のガラニン
レセプター蛋白質、例えば、ヒト・ガラニンレセプター
蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明の
ガラニンレセプター蛋白質欠乏症（例えば、糖尿病、ア
ルツハイマー病または痴呆症など）の予防・治療剤など
として用いることができる。本発明のＤＮＡを上記の予
防・治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独ある
いはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ
ー、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター
などの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って
実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施
した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセ
ル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外
の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液
剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
本発明のＤＮＡを生理学的に認められる担体、香味剤、
賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などととも
に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態
で混和することによって製造することができる。これら
製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量
が得られるようにするものである。

【０１３９】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方することができる。注射用の水性液としては生
理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例
えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナト
リウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たと
えばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコー
ル（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベ
ート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。

【０１４０】また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベン
ザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例え
ば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールな
ど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノー
ルなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整され
た注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒト）に
対して投与することができる。該ＤＮＡの投与量は、症
状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に
成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.
１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば
注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。また、本発明のＤＮＡを細胞に
挿入し、該ガラニンレセプター蛋白質、例えば、ヒト・
ガラニンレセプター蛋白質を発現させ、該細胞を患者に
移植する方法は、それ自体公知の方法あるいはそれに準
じる方法を用いることができる。

【０１４１】（４）本発明のガラニンレセプター蛋白質
もしくはその塩または本発明のガラニンレセプター蛋白
質の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体または抗
血清の製造 本発明のガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩また
は本発明のガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチドも
しくはその塩に対する抗体（例えば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本発明のガ
ラニンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の
ガラニンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその
塩を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製
造法に従って製造することができる。例えば、モノクロ
ーナル抗体は、後述の方法に従って製造することができ
る。

【０１４２】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、ヒト・ガ
ラニンレセプター蛋白質あるいはマウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質）もしくはその塩または本発明のガラニ
ンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩（以
下、ガラニンレセプターと略称する場合がある）は、温
血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ
自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に
際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュ
バントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程
度行われる。用いられる温血動物としては、たとえばサ
ル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツ
ジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスターがあげられる
が、マウス、ラットおよびハムスターが好ましく用いら
れる。

【０１４３】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ガ
ラニンレセプター（例えば、標識化ヒト・ガラニンレセ
プターあるいは標識化マウス由来ガラニンレセプター）
と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の
活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の
方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチ
ャー（Nature) 、256 、495 (1975)〕に従い実施でき
る。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましく
はＰＥＧが用いられる。

【０１４４】骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ
３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ
３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞
（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：
１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１
０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で
添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１
〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞
融合を実施できる。

【０１４５】ガラニンレセプター抗体産生ハイブリドー
マ（例えば、抗ヒト・ガラニンレセプター抗体産生ハイ
ブリドーマあるいは抗マウス由来ガラニンレセプター抗
体産生ハイブリドーマ）のスクリーニングには種々の方
法が使用できるが、たとえばガラニンレセプター抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合した抗ガラニンレセプターモノクロ
ーナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体また
はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養
上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したガラニ
ンレセプターを加え、固相に結合した抗ガラニンレセプ
ターモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられ
る。

【０１４６】抗ガラニンレセプターモノクローナル抗体
の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って
行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で
行なわれる。選別および育種用培地としては、ハイビリ
ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いて
も良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％
の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０
％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業
（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上
記の抗血清中の抗マウス由来ガラニンレセプター抗体価
の測定と同様にして測定できる。

【０１４７】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗ガラニンレセプターモノクローナル抗体の分離精製は
通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロ
ブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、
等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡ
Ｅ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合
固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの
活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて
抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以上の
（１）および（２）の方法に従って製造させる本発明の
ガラニンレセプター抗体は、ガラニンレセプターを特異
的に認識することができるので、被検液中のガラニンレ
セプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定
量などに使用することができる。

【０１４８】すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発
明のガラニンレセプターに反応する抗体と、被検液およ
び標識化ガラニンレセプターとを競合的に反応させ、該
抗体に結合した標識化ガラニンレセプターの割合を測定
することを特徴とする被検液中のガラニンレセプターの
定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した抗体および
標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させた
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
徴とする被検液中のガラニンレセプターの定量法におい
て、一方の抗体がガラニンレセプターのＮ端部を認識す
る抗体で、他方の抗体がガラニンレセプターのＣ端部に
反応する抗体であることを特徴とする被検液中のガラニ
ンレセプターの定量法を提供する。

【０１４９】本発明のガラニンレセプターを認識するモ
ノクローナル抗体（以下、抗ガラニンレセプター抗体と
称する場合がある）を用いてガラニンレセプターの測定
を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうことも
できる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いて
もよく、また、抗体分子のＦ( ａｂ')₂ 、Ｆａｂ' 、あ
るいはＦａｂ画分を用いてもよい。

【０１５０】本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限
されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば
ヒト・ガラニンレセプター量あるいはマウス由来ガラニ
ンレセプター量などのガラニンレセプター量）に対応し
た抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的ま
たは物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含
む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法
であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネ
フロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサン
ドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点
で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし
い。

【０１５１】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹³¹ Ｉ〕、〔³ Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが、
上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレス
カミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発
光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さら
に、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−ア
ビジン系を用いることもできる。

【０１５２】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。

【０１５３】サンドイッチ法においては不溶化した抗ガ
ラニンレセプター抗体に被検液を反応させ（１次反
応）、さらに標識化抗ガラニンレセプター抗体を反応さ
せ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定することにより被検液中のガラニンレセプター量を
定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序
に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずら
して行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前
記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ
法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識
用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要は
なく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗
体の混合物を用いてもよい。

【０１５４】本発明のサンドイッチ法によるガラニンレ
セプターの測定法においては、１次反応と２次反応に用
いられる抗ガラニンレセプター抗体はガラニンレセプタ
ーの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられ
る。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体
は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ガラニンレ
セプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられ
る抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識
する抗体が用いられる。

【０１５５】本発明のガラニンレセプター抗体をサンド
イッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノ
メトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いること
ができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを
抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗
原と( Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。

【０１５６】イムノメトリック法では、被検液中の抗原
と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応
させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中
の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化
抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたの
ち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識
量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロ
メトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の
結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の
抗原量僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合に
もレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーな
どが好適に用いられる。

【０１５７】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてガラ
ニンレセプターの測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。

【０１５８】例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techni
ques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techn
iques(Part B)) 、同書 Vol. 74(Immunochemical Techn
iques(Part C)) 、同書 Vol. 84(Immunochemical Techn
iques(Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 9
2(Immunochemical Techniques(Part E: Monoclonal Ant
ibodiesand General Immunoassay Methods))、同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I: Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))( 以上、ア
カデミックプレス社発行) などを参照することができ
る。以上のように、本発明のガラニンレセプター抗体を
用いることによって、ガラニンレセプターを感度良く定
量することができる。

【０１５９】（５）本発明のガラニンレセプター蛋白質
をコードするＤＮＡを有する動物の作製 本発明のガラニンレセプター蛋白質（例えば、マウス由
来ガラニンレセプター蛋白質）をコードするＤＮＡを用
いて、本発明のガラニンレセプター蛋白質を発現するト
ランジェニック動物を作製することができる。動物とし
ては、温血哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）が挙
げられるが、特に、マウスなどが好適である。

【０１６０】本発明のガラニンレセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該
ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に
結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に
有利である。たとえば本発明のガラニンレセプター蛋白
質ＤＮＡを転移させる場合、本発明のガラニンレセプタ
ー蛋白質ＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモー
ターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、対象動
物の受精卵、たとえばウサギ受精卵へマイクロインジェ
クションすることによって本発明のガラニンレセプター
蛋白質を高産生するＤＮＡ転移動物を作出できる。この
プロモーターとしては、たとえばウイルス由来プロモー
ター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモー
ターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現する
ＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモー
ターなどが用いられる。

【０１６１】受精卵細胞段階におけるガラニンレセプタ
ー蛋白質ＤＮＡの転移は、対象動物の胚芽細胞および体
細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後
の作出動物の胚芽細胞においてガラニンレセプター蛋白
質が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細
胞及び体細胞の全てにガラニンレセプター蛋白質を有す
ることを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の
子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにガラニンレセ
プター蛋白質を有する。

【０１６２】本発明のガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡ
転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを
確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼
育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有
する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相
同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、こ
の雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該Ｄ
ＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明
のガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡ（例えば、マウス由
来ガラニンレセプター蛋白質ＤＮＡなど）が転移された
動物は、ガラニンレセプター蛋白質が高発現させられて
いるので、ガラニンレセプター蛋白質に対するアゴニス
トまたはアンタゴニストをスクリーニングするための動
物などとして有用である。

【０１６３】本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のた
めの細胞源として使用することもできる。たとえば、本
発明のＤＮＡ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮ
Ａを直接分析するかあるいは遺伝子により発現されたタ
ンパク質組織を分析することにより、ガラニンレセプタ
ー蛋白質について分析することができる。ガラニンレセ
プター蛋白質を有する組織の細胞を標準組織培養技術に
より培養し、これらを使用して、たとえば脳や末梢組織
由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を
研究することができる。また、その細胞を用いることに
より、たとえば各種組織の機能を高めるような医薬の選
択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこか
ら、本発明のガラニンレセプター蛋白質を単離精製する
ことも可能である。

【０１６４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。

【０１６５】 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸

【０１６６】 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン

【０１６７】 Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン

【０１６８】 ＮＶａｌ ：ノルバリン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｂｌｃ ：γ−ブチルロラクトン−γ−カルボニル基 Ｋｐｃ ：２−ケトピペリジン−６−カルボニル基 Ｏｔｃ ：３−オキソペルヒドロ−１，４−チアジン −５−カルボニル基 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基

【０１６９】後述の実施例３で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐ３
Ｈ２−３４は、平成６年１０月１２日から通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８２８として寄託されており、ま
た平成６年１０月１２日から財団法人発酵研究所にＩＦ
Ｏ １５７４９として寄託されている。後述の実施例４
で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichi
a coli) ＪＭ１０９／ｐＭＧＲ２０は、平成６年１２月
１５日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９３７と
して寄託されており、また平成６年１２月１４日から財
団法人発酵研究所にＩＦＯ １５７７３として寄託され
ている。マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６は、平成６年１２
月２７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５４
として寄託されており、また平成７年４月１１日から財
団法人発酵研究所にＩＦＯ ５０４５４として寄託され
ている。後述の実施例１２で得られたプラスミドｐＴＳ
８６３を保持する形質転換体エシェリヒア コリ（Esch
erichia coli) ＳＵＲＥ／ｐＴＳ８６３は、平成７年５
月２５日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１１０
として寄託されており、また平成７年６月１日から財団
法人発酵研究所にＩＦＯ １５８２６として寄託されて
いる。また、後述の実施例１３で得られたプラスミドｐ
ＴＳ８６３を保持する形質転換体ＣＨＯ／ｐＴＳ８６３
−５およびＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−７は、それぞれ平成
７年５月２５日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５
１１１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５１１２として寄託され
ており、またそれぞれ平成７年６月１日から財団法人発
酵研究所にＩＦＯ ５０４５６およびＩＦＯ ５０４５
７として寄託されている。

【０１７０】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ｐ３Ｈ２−３４に含まれるマウス膵臓
β細胞株ＭＩＮ６由来ガラニンレセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａにコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕ｐＭＧＲ２０に含まれるマウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６由来ガラニンレセプター蛋白質ｃＤＮＡ
にコードされる蛋白質の全アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３〕ｐ３Ｈ２−３４に含まれるマウス膵臓
β細胞株ＭＩＮ６由来ガラニンレセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａの部分塩基酸配列を示す。 〔配列番号：４〕ｐＭＧＲ２０に含まれるマウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６由来ガラニンレセプター蛋白質ｃＤＮＡ
中の全翻訳領域をもつ塩基酸配列を示す。 〔配列番号：５〕実施例１１で得られた本発明のヒト・
ガラニンレセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６〕実施例１１で得られた本発明のヒト・
ガラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。

【０１７１】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、成書
（Maniatisら、モレキュラー・クローニング〔Molecula
r Cloning 〕、Cold SpringHarbor Laboratory 、1989
年）に記載されている方法に従った。

【０１７２】

【参考例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造 公知のヒト由来ＴＲＨレセプター蛋白質（ＨＴＲＨ
Ｒ）、ヒト由来ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質（Ｌ１０
９１８、ＨＵＭＲＡＮＴＥＳ）、ヒトバーキットリンパ
腫由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６８１４９、
ＨＳＢＬＲ１Ａ）、ヒト由来ソマトスタチンレセプター
蛋白質（Ｌ１４８５６、ＨＵＭＳＯＭＡＴ）、ラット由
来μ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ０２０８３、Ｒ
ＮＵ０２０８３）、ラット由来κ−オピオイドレセプタ
ー蛋白質（Ｕ００４４２、Ｕ００４４２）、ヒト由来ニ
ューロメジンＢレセプター蛋白質（Ｍ７３４８２、ＨＵ
ＭＮＭＢＲ）、ヒト由来ムスカリン作動性アセチルコリ
ンレセプター蛋白質（Ｘ１５２６６、ＨＳＨＭ４）、ラ
ット由来アドレナリンα₁ Ｂレセプター蛋白質（Ｌ０８
６０９、ＲＡＴＡＡＤＲＥ０１）、ヒト由来ソマトスタ
チン３レセプター蛋白質（Ｍ９６７３８、ＨＵＭＳＳＴ
Ｒ３Ｘ）、ヒト由来Ｃ₅ ａレセプター蛋白質（ＨＵＭＣ
５ＡＡＲ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質
（ＨＵＭＲＤＣ１Ａ）、ヒト由来リガンド不明レセプタ
ー蛋白質（Ｍ８４６０５、ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）およ
びラット由来アドレナリンα₂ Ｂ（Ｍ９１４６６、ＲＡ
ＴＡ２ＢＡＲ）の第１膜貫通領域付近のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い
部分を見いだした。

【０１７３】また、公知のマウス由来リガンド不明レセ
プター蛋白質（Ｍ８０４８１、ＭＵＳＧＩＲ）、ヒト由
来ボンベジンレセプター蛋白質（Ｌ０８８９３、ＨＵＭ
ＢＯＭＢ３Ｓ）、ヒト由来アデノシンＡ２レセプター蛋
白質（Ｓ４６９５０、Ｓ４６９５０）、マウス由来リガ
ンド不明レセプター蛋白質（Ｄ２１０６１、ＭＵＳＧＰ
ＣＲ）、マウス由来ＴＲＨレセプター蛋白質（Ｓ４３３
８７、Ｓ４３３８７）、ラット由来ニューロメジンＫレ
セプター蛋白質（Ｊ０５１８９、ＲＡＴＮＥＵＲＡ）、
ラット由来アデノシンＡ１レセプター蛋白質（Ｍ６９０
４５、ＲＡＴＡ１ＡＲＡ）、ヒト由来ニューロキニンＡ
レセプター蛋白質（Ｍ５７４１４、ＨＵＭＮＥＫＡ
Ｒ）、ラット由来アデノシンＡ３レセプター蛋白質（Ｍ
９４１５２、ＲＡＴＡＤＥＮＲＥＣ）、ヒト由来ソマト
スタチン１レセプター蛋白質（Ｍ８１８２９、ＨＵＭＳ
ＲＩ１Ａ）、ヒト由来ニューロキニン３レセプター蛋白
質（Ｓ８６３９０、Ｓ８６３７１Ｓ４）、ラット由来リ
ガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６１４９６、ＲＮＣＧ
ＰＣＲ）、ヒト由来ソマトスタチン４レセプター蛋白質
（Ｌ０７０６１、ＨＵＭＳＳＴＲ４Ｚ）およびラット由
来ＧｎＲＨレセプター蛋白質（Ｍ３１６７０、ＲＡＴＧ
ＮＲＨＡ）の第６膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分
を見いだした。

【０１７４】上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Prot
ein シークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフ
トウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Da
ta Bank を検索した際に示される整理番号であり、それ
ぞれ通常Accession Numberおよびエントリーネームと呼
ばれるものである。ただし、ＨＴＲＨＲは特願平５−２
８６９８６号（ＥＰＡ ６３８６４５）に記載されてい
る配列である。特に多くの受容体ｃＤＮＡで一致する塩
基部分を基準とし、その他の部分においてもなるだけ多
くの受容体ｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために混合
塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通する塩
基配列に相補的である配列番号：７または配列番号：８
で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本を作成し
た。

【０１７５】 〔合成ＤＮＡ〕 ５' −ＣＧＴＧＧ（ＧまたはＣ）Ｃ（ＡまたはＣ）Ｔ（ＧまたはＣ）（Ｇまたは Ｃ）ＴＧＧＧＣＡＡＣ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＣＣＴＧ−３' （配列番号：７） ５' −ＧＴ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）（ＡまたはＧ）（Ａまたは Ｇ）ＧＧＣＡ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）ＣＣＡＧＣＡＧＡ（ＧまたはＴ）ＧＧＣＡ ＡＡ−３' （配列番号：８） （ ）内は合成時に複数の塩基に混合して合成する。

【０１７６】

【実施例１】マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６からのpoly(
Ａ) ⁺ ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成 マウス膵β細胞株ＭＩＮ６（Junichi Miyazaki et al.
Endocrinology, Vol.127, No.1, p126-132）よりグアニ
ジンチオシアネート法により Total ＲＮＡを調製後
（Kaplan B.B. et al., Biochem. J. 183, 181-184 (19
79) ）、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を用い
て、poly( Ａ) ⁺ ＲＮＡ画分を調製した。次に、poly(
Ａ) ⁺ ＲＮＡ画分５μｇにプライマーとしてランダムＤ
ＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニイマウス白
血病ウイルスの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バ
ッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物
はフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタ
ノール沈殿を行った後、３０μｌのＴＥ（Tris-EDTA so
lution; 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA (pH 8.0))
に溶解した。

【０１７７】

【実施例２】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定 実施例１でマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃ
ＤＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成し
たＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行っ
た。反応液の組成は、該合成ＤＮＡプライマー各１００
ｐＭ、０. ２５mMｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ polymer
ase １μｌおよび酵素に付属の１０×バッファー１０μ
ｌで、総反応溶液量は１００μｌとした。増幅のための
サイクルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー
社）を用い、９６℃・３０秒、４５℃・１分、６０℃・
３分のサイクルを３０回繰り返した。Ｔａｑ ＤＮＡ p
olymerase を添加する前に、残りの反応液を混合し、９
５℃・５分、６５℃・５分の加熱を行った。増幅産物の
確認は１. ２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウ
ムブロミド染色によって行った。

【０１７８】

【実施例３】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター候補クローンの選択 実施例２で行なったＰＣＲ後の反応産物は０. ８％の低
融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカ
ミソリで切り出した後、熱融解、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。ＴＡクローニン
グキット（インビトロゲン社）の処方に従い、回収した
ＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ^TMII（インビトロゲ
ン社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０
９ competent cell （宝酒造株式会社）に導入して形質
転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアン
ピシリン、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド
（ＩＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬ
Ｂ寒天培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを滅
菌した爪楊枝を用いて分離し、形質転換体エシェリヒア
コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐ３Ｈ２−３４
を得た。

【０１７９】個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ
培地で一晩培養し、自動プラスミド抽出装置（クラボ
ウ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤ
ＮＡの一部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入
されているｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤ
ＮＡの一部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロ
ロフォルム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。
塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator C
ycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光
式自動シーケンサーを用いて解読した。得られた塩基配
列の情報は、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリ
ング社）を用いて行った。

【０１８０】決定した塩基配列〔図１〕をもとにホモロ
ジー検索を行なった結果、形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐ３Ｈ２- ３４の
保有するプラスミドに挿入されたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分か
った。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日
立システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をア
ミノ酸配列に変換した後〔図１〕、疎水性プロット〔図
２〕およびアミノ酸配列に基づくホモロジー検索を行な
い、ヒトソマトスタチンレセプターサブタイプ４（ＪＮ
０６０５）、ヒトソマトスタチンレセプターサブタイプ
２（Ｂ４１７９５）、ラット由来リガンド不明レセプタ
ー（Ａ３９２９７）との相同性を見いだした〔図３〕。
上記の（）内の略語は、NBRF-PIR/Swiss-PROT にデータ
として登録される際の整理番号であり、通常Accession
Numberまたはエントリーネームと呼ばれるものである。

【０１８１】

【実施例４】マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡ
ライブラリーからのレセプター蛋白質の全コード領域を
含むｃＤＮＡのクローニング ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡライブラリーの構築には、ＢＲＬ
社の Superscript^TMLambda System （BRL ，Cat ．825
6）および Stratagene 社の Gigapack II Gold （Strat
agene，Cat ．200215）を用いた。上記のキットを用い
てＭＩＮ６ poly( Ａ) ⁺ ＲＮＡ １０μｇより、２.
２×１０⁶ ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・ユニッ
ト）のＭＩＮ６ ｃＤＮＡライブラリーを構築した。こ
のｃＤＮＡライブラリーを、硫酸マグネシウムで処理し
た大腸菌Y1090r^- と混ぜ、３７℃、１５分間インキュベ
ートした後、０. ５％アガロース（ファルマシア社）Ｌ
Ｂを加え、１. ５％寒天（和光純薬社）ＬＢプレート(
５０μg/ml Ampicillin 含有）に播いた。プラークので
きたプレートにニトロセルロースフィルターを置き、フ
ィルター上にプラークを転写した。このフィルターをア
ルカリ処理することによって変性させた後、８０℃、３
時間の加熱によってＤＮＡの固定を行なった。

【０１８２】このフィルターを、５０％ formamide，４
×ＳＳＰＥ（ＳＳＰＥ：150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄・
H₂O, 1.25 mM EDTA, pH7.4) ，５× Denhardt's 溶液，
０.１％ ＳＤＳ( ドデシル硫酸ナトリウム) ，１００
μｇ／ｍｌ salmon sperm ＤＮＡを含むバッファー中
で、以下に述べるプローブと４２℃で一晩インキュベー
トし、ハイブリダイズさせた。プローブとしては、実施
例２で得られたプラスミドｐ３Ｈ２- ３４に挿入された
ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断、回収後、ランダムプラ
イムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて
〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（デュポン社）を取り込ませることに
よって標識して用いた。洗浄は、２×ＳＳＣ，０. １％
ＳＤＳで５５℃、１時間行ない、その後、−８０℃で
オートラジオグラフィを行ってハイブリダイズするプラ
ークを検出した。

【０１８３】このスクリーニングにより、２個の独立し
たプラークにハイブリダイゼーションのシグナルが認め
られた。この２個のクローンからそれぞれＤＮＡを調製
し、ＳａｌＩとＮｏｔＩで消化したものをアガロース電
気泳動後、解析したところ、各々約２. ０ｋｂ，３. ０
ｋｂのところに挿入断片が確認でき、このうち約３.０
ｋｂのバンドを生じるもの（λＮｏ. ２０）を選択し
た。λＮｏ. ２０の約３. ０ｋｂのＮｏｔＩ ＳａｌＩ
断片をプラスミドｐBluescript ^TM IIＳＫ（＋）のＮｏ
ｔＩ ＳａｌＩサイトにサブクローニングした後、この
プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換
体エシェリヒア コリ ＪＭ１０９／ｐＭＧＲ２０を得
た。このプラスミドｐＭＧＲ２０を、実施例２で示され
た塩基配列から予想される制限酵素地図をもとにして制
限酵素地図を作製したところ、実施例２で示されるレセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡから予想されるレセプ
ター蛋白質の全長をコードするＤＮＡを保持しているこ
とが分かった。

【０１８４】

【実施例５】ＭＩＮ６由来レセプター蛋白質全長ｃＤＮ
Ａの塩基配列の決定 実施例４で得られたプラスミドｐＭＧＲ２０に挿入した
ＮｏｔＩ ＳａｌＩ断片のうち、レセプター蛋白質をコ
ードしていると考えられる領域およびその周辺計１６０
７ｂｐの塩基配列を決定した。具体的には、ＮｏｔＩ
ＳａｌＩ断片中に存在する制限酵素サイトを利用して、
不必要な部分を除き、または必要な断片をサブクローニ
ングし、配列解析のための鋳型プラスミドを調製した。
また、一部の領域の塩基配列については、既に決定した
塩基配列をもとにして塩基配列決定用のプライマーを合
成して、さらに確認を行なった。塩基配列決定のための
反応は Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式ＤＮＡシーケンサー
（ＡＢＩ社）を用いて解読し、データー解析にはＤＮＡ
ＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を使用
した。

【０１８５】ｐＭＧＲ２０に挿入されているｃＤＮＡの
コードするマウスガラニンレセプター蛋白質の翻訳領域
周辺の塩基配列を〔図４〕に示した。そして、マウスガ
ラニンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列
は〔図４〕の塩基配列の第４８１番目〜１５２５番目の
塩基配列に対応する。そして、これにコードされるレセ
プター蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号：２で表され
るアミノ酸配列であった〔図４〕。このアミノ酸配列
は、ヒト由来ガラニンレセプター蛋白質とアミノ酸配列
において９２％の相同性を有することから、ｐＭＧＲ２
０に挿入されているｃＤＮＡは、マウス由来のガラニン
レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡであることが分
かった。

【０１８６】

【実施例６】ＭＩＮ６細胞膜画分を用いたガラニンレセ
プター結合実験 （１）ＭＩＮ６細胞からの膜画分の調製法 ＭＩＮ６細胞は公知の方法（エンドクリノロジー、１２
７巻、１２６−１３２頁、１９９０年）により培養し
た。すなわち、１５％ウシ胎児血清、４. ５ｇ／ｌ グ
ルコース、５μｌ／ｌメルカプトエタノール、７５ｍｇ
／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン
を添加したダルベッコ改変イーグル培地中、５％炭酸ガ
ス存在下で培養した。培養した本細胞をＥＤＴＡを含む
ＰＢＳにて洗浄し、培養器から剥離させた。剥離した本
細胞を遠心して回収し、以下の膜画分調製に供した。

【０１８７】回収した細胞（約２. ５ｍｌ容量）をホモ
ジェナイズ用緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃ 、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０. ５ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ
ペプスタチン、２０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、４μｇ
／ｍｌ Ｅ−６４、ｐＨ ７. ２）２０ｍｌに懸濁し、
これをポリトロン・ホモジェナイザー（キネマティカ
社）を用いて、２３, ０００ｒｐｍ、１分間ホモジェナ
イズした。得られたホモジェネートを日立高速遠心機
（型式：ＣＲ２６Ｈ）を用いて、日立ＲＰ２４Ａロータ
ー中で５, ０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。遠心後の
上清を回収し、日立超遠心機（型式：ＳＣＰ７０Ｈ）を
用いて日立ＲＰ４２ローター中で３０, ０００ｒｐｍ、
１時間超遠心し、ペレットを得た。得られたペレットを
再びモジェナイズ用緩衝液に懸濁し、用時まで−７０℃
に保存した。

【０１８８】（２）ＭＩＮ６細胞膜画分を用いたレセプ
ター結合実験 上記（１）の方法により調製されたＭＩＮ６細胞膜画分
をレセプター結合実験用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０. ０３％ ＮａＮ₃ 、０. １％Ｂ
ＳＡ、０. ０５％ ＣＨＡＰＳ、０. ５ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、１０μｇ／ｍｌ ペプスタチン、２０μｇ／ｍｌ
ロイペプチン、４μｇ／ｍｌ Ｅ−６４、ｐＨ７. ４）
を用いて、膜蛋白質濃度が５０μｇ／ｍｌになるように
希釈した。希釈された膜画分を各１００μｌずつポリプ
ロピレン製試験管（ファルコン社製、2038）に分注し、
以下のレセプター結合実験に供した。また、市販の〔
¹²⁵ Ｉ〕ラジオアイソトープ標識されたブタ型ガラニン
（ニューイングランドニュクレアー社製）をレセプター
結合実験用緩衝液を用いて、濃度が５ｎＭになるように
希釈し、以下の実験に用いた。

【０１８９】可変濃度の標準ブタ型ガラニン溶液あるい
はガラニン関連ペプチド溶液 ３μｌ、および５ｎＭ
標識ガラニン溶液２ μｌを上記膜画分１００μｌと混
合する。これを２５℃の水浴中、７５分間静置しレセプ
ター結合反応を促した。この後、氷冷した結合実験用緩
衝液１. ５ｍｌを反応液に加え結合反応を停止し、即座
にガラス繊維濾紙（ワットマン社製、GF/F）にて濾過
し、膜画分を濾紙に捕集する。さらに、１. ５ｍｌの同
緩衝液で濾紙を洗浄後、濾紙中のラジオアイソトープ量
をガンマー線検出機にて計測した。標識ガラニンの結合
量は、以下の〔数２〕により求めたPercent of Maximum
Binding（ＰＭＢ）で表した。

【０１９０】

【数２】ＰＭＢ＝〔（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀ −ＮＳ
Ｂ）〕×１００

【０１９１】ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：非特異的結合量（１μＭ 標準ガラニン存在下
での標識ガラニンの結合量） Ｂ₀ ：最大結合量（標準ブタ型ガラニン非存在下での
標識ガラニンの結合量）

【０１９２】上記の方法により測定した標識ガラニンの
結合量（ＰＭＢ）を標準ブタ型ガラニン、ラット型ガラ
ニン、ガラニン（１−１６）部分ペプチドあるいはガラ
ニンアンタゴニスト（ガランタイド）の濃度に対してプ
ロットした結果を〔図７〕に示した。また、この結果よ
りＰＭＢ＝５０％を与える濃度（ＩＣ₅₀）を各々求め
て、〔表１〕に示した。

【０１９３】

【表１】 ────────────────────────────── ペプチド ＩＣ₅₀値 ────────────────────────────── ブタ型ガラニン ０．１２ ｎＭ ラット型ガラニン ０．１３ ｎＭ ガラニン（１−１６） ３．３ ｎＭ ガランタイド ０．６９ ｎＭ ───────────────────────────────

【０１９４】〔表１〕より、ＭＩＮ６細胞の細胞膜画分
を用いれば、ガラニンレセプター結合実験を通じて、ガ
ラニンレセプターに対するリガンドのレセプター結合親
和性を測定できることが分かった。

【０１９５】

【実施例７】ガラニンレセプター結合実験によるガラニ
ンレセプターアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニ
ング 実施例６に記載した方法により、ガラニンレセプターア
ゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングを実施する
ことができる。すなわち、試験化合物溶液１μｌ、５ｎ
Ｍ 標識ガラニン溶液２μｌを、実施例６と同様にＭＩ
Ｎ６細胞膜画分１００μｌと混合する。以下、実施例６
と同様にして結合量を求め、ＰＭＢを一定量以下に減少
させる化合物をガラニンレセプターアゴニスト／アンタ
ゴニストとしてスクリーニングする。

【０１９６】

【実施例８】ＭＩＮ６細胞を用いたガラニン生物活性の
検出法 ガラニンは、グルコース刺激による膵ランゲルハンス島
のインスリン分泌を阻害する生物活性を有することが知
られている。この活性はＭＩＮ６細胞を用いた下記の方
法により、容易に検出することができる。この検出法の
うち、グルコース刺激によるインスリン分泌の測定は基
本的に公知の方法（ダイアベトロジア、３６巻、１１３
９−１１４５頁、１９９３年）に従った。すなわち、Ｍ
ＩＮ６細胞 ３×１０⁵ 個を２４ウエル・プレートにま
き、１５％ウシ胎児血清、４. ５ｇ／ｌ グルコース、
５μｌ／ｌメルカプトエタノール、７５ｍｇ／ｍｌ ペ
ニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加し
たダルベッコ改変イーグル培地中、５％炭酸ガス存在下
で３日間培養した。

【０１９７】細胞をクレブス・リンガー・ヘペス緩衝液
（１１９ｍＭ ＮａＣｌ、４. ７４ｍＭ ＫＣｌ、２.
５４ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１. １９ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 、
１. １９ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ
₃ 、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０.５％ ＢＳＡ）で３回
洗浄し、５ｍＭ グルコースを添加したクレブス・リン
ガー・ヘペス緩衝液中で３７℃、３０分間培養した。さ
らに、細胞をクレブス- リンガー- ヘペス緩衝液で２回
洗浄した。細胞を可変濃度のラット型ガラニンおよび２
５ｍＭ グルコースを添加したクレブス・リンガー・ヘ
ペス緩衝液中で３７℃、９０分間培養した。培養後の培
養上清を回収し、培養上清中に分泌されたインスリン量
を市販のラジオイムノアッセイ（アマシャム社製）を用
いて定量した。

【０１９８】〔図８〕にガラニン量に対するインスリン
分泌量をプロットした結果を示した。〔図８〕から、約
１００ｐＭのガラニンを添加することにより、グルコー
ス刺激により増大したインスリン分泌量は約半分まで減
少することが分かった。これにより、この方法を用いて
ガラニン活性を容易に検出できることが明らかになっ
た。

【０１９９】

【実施例９】ＭＩＮ６細胞を用いたガラニン生物活性の
検出法 ＭＩＮ６細胞をフォルスコリン処理すると、細胞内のｃ
ＡＭＰ濃度が上昇し、インスリン分泌量が増大する。こ
の現象はガラニンの添加により阻害することができ、ガ
ラニンの生物活性測定法として用いることができる。実
施例８と同様に培養および前処理（洗浄、５ｍＭ グル
コース処理、洗浄の操作）を行なった細胞を可変濃度の
ラット型ガラニン、１００μＭ フォルスコリン、２０
０μＭ イソブチルメチルキサンチンおよび６. ２５ｍ
Ｍ グルコースを添加したクレブス・リンガー・ヘペス
緩衝液中で３７℃、９０分間培養した。

【０２００】培養後の培養上清を回収し、培養上清中に
分泌されたインスリン量を市販のラジオイムノアッセイ
（アマシャム社製）を用いて定量した。また、細胞を過
塩素酸処理して細胞内のｃＡＭＰを抽出し、抽出液中の
ｃＡＭＰを市販のラジオイムノアッセイ（アマシャム社
製）を用いて定量した。〔図９〕にガラニン量に対する
インスリン分泌量をプロットした結果を示した。また、
〔図１０〕に細胞内ｃＡＭＰ量をプロットした結果を示
した。〔図９〕および〔図１０〕から、ＭＩＮ６細胞か
らのインスリン分泌またはＭＩＮ６細胞内のｃＡＭＰ濃
度を測定することによって、ガラニン活性を容易に検出
できることが分かった。

【０２０１】

【実施例１０】ＭＩＮ６細胞を用いたガラニンアゴニス
ト／アンタゴニストの生物活性の検出法 実施例８に記載した方法により、ガラニンアゴニスト／
アンタゴニストの活性を測定することができる。すなわ
ち、実施例８と同様に培養および前処理（洗浄、５ｍＭ
グルコース処理、洗浄の操作）を行なった細胞を適当
濃度の試験化合物、１００ｐＭのラット型ガラニン、２
５ｍＭ グルコースを添加したクレブス・リンガー・ヘ
ペス緩衝液中で３７℃、９０分間培養した。

【０２０２】培養後の培養上清を回収し、培養上清中に
分泌されたインスリン量を市販のラジオイムノアッセイ
を用いて定量した。コントロールとして、２５ｍＭ グ
ルコースのみを含むクレブス・リンガー・ヘペス緩衝液
中、および１００ｐＭ ラット型ガラニン、２５ｍＭ
グルコースを含むクレブス・リンガー・ヘペス緩衝液中
で培養した後の培養上清についても同様にインスリンを
定量した。これによりＭＩＮ６細胞を用いてガラニンレ
セプターアゴニスト／アンタゴニストの活性を容易に測
定できることが分かった。

【０２０３】

【実施例１１】ヒト・ガラニンレセプター蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡのクローニング ヒト melanoma Bowes 細胞を１０％ウシ胎児血清を含む
高グルコースＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、９５％ a
ir／５％ ＣＯ₂ 下で培養し、ほぼコンフルエントにな
ったところで、グアニジン−チオシアネート法によって
全ＲＮＡを調製した。ここで得られた全ＲＮＡからオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースカラムによってポリＡ⁺ ＲＮＡ画
分を調製した。このポリＡ⁺ ＲＮＡ １０μｇをランダ
ムヘキサマーと逆転写酵素を用いて１本鎖ＤＮＡを合成
した後、Escherichia coliＤＮＡ polymerase Ｉ、ＲＮ
ａｓｅ Ｈを用いて２本鎖ＤＮＡを合成し、ポリＡ⁺ Ｒ
ＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを得た。この２本鎖ｃＤＮＡを
Ｔ４ ＤＮＡ polymerase で処理し末端を平滑化した
後、ＥｃｏＲＩアダプターを付加した。この両末端にＥ
ｃｏＲＩアダプターが付加された２本鎖ｃＤＮＡをゲル
濾過によって約１０００ｂｐ以下のｃＤＮＡを除去した
後、Ｔ４ polynucleotide kinase を用いてＥｃｏＲＩ
アダプターにリン酸基を導入した。

【０２０４】次に、このｃＤＮＡをλｇｔ１１ Ｅｃｏ
ＲＩアームに組み込んだ後、in vitro パッケージング
を行ない、全体で約１. ５×１０⁶pfuの melanoma Bowe
s 細胞のｃＤＮＡライブラリー（平均鎖長約１. ６ｋｂ
ｐ、挿入率９８％）を作製した。このｃＤＮＡライブラ
リーのλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ^- 株に感染させ
た後、軟寒天プレート上に約１. ８×１０⁴ プラークず
つまき、４２℃で一晩インキュベートしてプラークを形
成させた。プラークをニトロセルロースフィルター上に
移した後、変性溶液〔０. ５Ｎ 水酸化ナトリウム，
１. ５Ｍ 塩化ナトリウム〕、中和溶液〔０. ５Ｍ ト
リス−塩酸（ｐＨ７. ０），１. ５Ｍ 塩化ナトリウ
ム〕、３×ＳＳＣ〔２０×ＳＳＣ＝３Ｍ 塩化ナトリウ
ム，０. ３Ｍクエン酸ナトリウム〕で順次処理し、風乾
後８０℃で３時間焼き付けを行ないファージＤＮＡをニ
トロセルロースフィルター上に固定した。

【０２０５】一方、プローブとして用いるためのｃＤＮ
Ａ断片を得るために、公知のヒト・ガラニンレセプター
ｃＤＮＡ〔Habert-Ortoll, E. et al., プロシージング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA） 91, 9780-9783 (1994) 〕の塩基配列に
基づき、合成オリゴヌクレオチドおよびを合成し
た。

【０２０６】は ５’ＴＣＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧ ３’ （配列番号：９） であり＋３８８〜＋４１４（翻訳開始部位を＋１とす
る。）センス配列を含む合成オリゴヌクレオチドであ
る。は ５’ＧＡＣＴＴＡＴＣＡＣＡＣＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧ ＡＴＧＧ ３’ （配列番号：１０） であり＋１０２４〜＋１０５３のアンチセンス配列を含
む合成オリゴヌクレオチドである。

【０２０７】この２本の合成ヌクレオチドをプライマー
として用い、ヒト melanoma Bowes細胞のポリＡ⁺ ＲＮ
Ａ５μｇを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行ない、６６９ｂ
ｐのヒト・ガラニンレセプター蛋白質のＣ末端側を含む
ｃＤＮＡ断片を得た。このｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９
のＨｉｎｃII部位に組み込み、プラスミドｐＨＧＲ５４
−７を得た。ｐＨＧＲ５４−７をＢａｍＨＩ，Ｈｉｎｃ
IIで二重消化して得られるヒト・ガラニンレセプター蛋
白質のＣ末端側を含むｃＤＮＡ断片をヒト melanoma Bo
wes 細胞のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのプ
ローブとして用いた。

【０２０８】プローブの標識は前述のｃＤＮＡ断片を
〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用いてランダムプライム法によ
って標識した。標識プローブを含むハイブリダイゼーシ
ョン用緩衝液〔５×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's液，１０
０μg/l 熱変性サケ精子ＤＮＡ，０. １％ ＳＤＳ〕中
６５℃でハイブリダイゼーションを行なった。フィルタ
ーは最終的に０. １×ＳＳＣ，０. １％ ＳＤＳ液中５
０℃で洗浄後、オートラジオグラムをとってプローブと
ハイブリダイゼーションするプラークを検索した。この
方法により得られたファージクローンλＨＧＲ２よりフ
ァージＤＮＡを抽出した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
してｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＵＣ１１８プラスミド
のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＨＧＲ２−３を得た。挿
入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列を〔α−³²Ｐ〕ｄ
ＣＴＰを用いて通常の方法で決定したところ、このｃＤ
ＮＡ断片は１８８２ｂｐ（図１１および図１２、配列番
号：６）から成ることがわかった。報告されているヒト
・ガラニンレセプターｃＤＮＡの塩基配列〔Habert-Ort
oll, E. et al., プロシージングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・
ユーエスエー（Proc.Natl. Acad. Sci. USA） 91, 9780
-9783 (1994) 〕と比較すると１カ所の塩基置換がみら
れた。この塩基置換は翻訳領域の中にあり、アミノ酸置
換を伴うもの¹⁵Ｃｙｓ（ＴＧＴ）→¹⁵Ｔｒｐ（ＴＧＧ）
であった（図１１および図１２、配列番号：６）。以上
のようにして、ヒト・ガラニンレセプターｃＤＮＡ断片
を含むプラスミドｐＨＧＲ２−３を得た。

【０２０９】

【実施例１２】ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａの発現プラスミドの構築 発現ベクターとしてはｐＡＫＫＯ−１１１（図１３では
ｐＡ１- １１と表記されている）を用いた。ｐＡＫＫＯ
−１１１は次のようにして構築した。特開平５−０７６
３８５公報に記載のｐＴＢ１４１７からＨｉｎｄIII お
よびＣｌａＩ処理によってＳＲαプロモーターおよびｐ
ｏｌｙＡ付加シグナルを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を
得た。また、ｐＴＢ３４８（Naruo, K. et al. バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）
128, 256-264(1985)）からＣｌａＩおよびＳａｌＩ処理
によりジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む
４．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片を
Ｔ４ポリメラーゼ処理により末端を平滑末端にした後、
Ｔ４ライゲースにより連結し、ｐＡＫＫＯ−１１１プラ
スミドを構築した。

【０２１０】実施例１１で得たヒトガラニンレセプター
ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＨＧＲ２−３およびｐ
ＨＧＲ５４−７から〔図１３〕のようにしてヒトガラニ
ンレセプターｃＤＮＡ発現プラスミドを作製した。ま
ず、ｐＨＧＲ２−３を制限酵素ＢａｍＨＩ，ＭｕｎＩで
二重消化し、得られた約１１９０ｂｐのＤＮＡ断片をｐ
ＨＧＲ５４−７のＢａｍＨＩ，ＭｕｎＩ部位に挿入し
た。このプラスミドＸｍａＩ，ＳａｃII部位にｐＨＧＲ
２−３をＮｃｏＩ消化して得られた４９５ｂｐ断片をＤ
ＮＡ polymerase Ｉ Klenow fragment 処理を行って末
端を平滑末端化を行ない、ＳａｌＩリンカーを付加した
後に、ＡｇｅＩ，ＳａｃIIで二重消化して得られる２０
０ｂｐ ＤＮＡ断片を導入し、ヒトガラニンレセプター
ｃＤＮＡの翻訳領域のみを含むプラスミドｐＴＳ８６２
を得た。最後に、プラスミドｐＴＳ８６２をＳａｌＩ消
化して得られた約１. ０ｋｂｐのヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質ｃＤＮＡの翻訳領域を含むＳａｌＩ ＤＮＡ
断片をｐＡＫＫＯ−１１１のＳａｌＩ部位に順方向に導
入し、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ｃＤＮＡ発現プ
ラスミドｐＴＳ８６３を得た。この発現プラスミドｐＴ
Ｓ８６３を大腸菌に形質転換し、形質転換体 エシェリ
ヒア コリ（Escherichia coli）ＳＵＲＥ／ｐＴＳ８６
３を得た。

【０２１１】

【実施例１３】 ヒト・ガラニンレセプター蛋白質ｃＤ
ＮＡのＣＨＯ（ｄｈｆｒ ^- ）細胞での発現 ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^- ）細胞３×１０⁴ 〜１×１０⁶ 細胞
を段階的に細胞数を変えて直径１０cmのシャーレに４枚
まき、１０％ウシ胎児血清を含むハムＦ１２培地で２４
時間培養した。この細胞に、実施例１２で得たヒトガラ
ニンレセプターｃＤＮＡ発現プラスミドｐＴＳ８６３
１. ５μｇをリン酸カルシウム法を用いてトランスフェ
クションを行った。トランスフェクション後２４時間後
に１０％透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に培地を
交換してプラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択
した。選択された細胞のコロニーをクローニングし、ヒ
トガラニンレセプターを安定に高発現する細胞株ＣＨＯ
／ｐＴＳ８６３−５およびＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−７の
２クローンを得た。

【０２１２】

【実施例１４】ヒト・ガラニンレセプター発現ＣＨＯ細
胞のヒト・ガラニンレセプター活性の測定 ヒト・ガラニンレセプター発現ＣＨＯ細胞を１２穴プレ
ートにまき、１０％透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培
地を用いて３７℃，９５％ air／５％ ＣＯ₂下コンフ
ルエントになるまで培養し、結合実験を行う前日に培地
交換を行ない、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列
を有するヒト・ガラニンレセプターを発現させた。

【０２１３】次に、〔¹²⁵ Ｉ〕ガラニン（ブタ型）に対
する結合実験を以下のようにして行なった。まず、細胞
を３７℃に暖めた結合測定用緩衝液（０. １％ ＢＳ
Ａ，０. ０５％ＣＨＡＰＳを含むＨＡＮＫＳ液）１mlで
２回洗浄し、この結合測定用緩衝液を吸い出した後、１
００ｐＭ〔¹²⁵ Ｉ〕ガラニン（ブタ型）を含む結合測定
用緩衝液０. ５mlを加え、３７℃，９５％ air／５％
ＣＯ₂ 条件下で１時間結合反応を行った。反応終了後、
結合測定用緩衝液を除き、３７℃に温めた１mlの結合測
定用緩衝液で３回洗浄した。細胞に結合した〔¹²⁵ Ｉ〕
ガラニン（ブタ型）の量は、０. ２Ｎ 水酸化ナトリウ
ムで細胞をはがした後、γ−カウンターで測定し、これ
を総結合量とした。また、結合反応時に１μＭの非標識
ガラニンを加えて同様の操作を行い、細胞に結合した〔
¹²⁵ Ｉ〕ガラニン（ブタ型）の量を非特異的結合量とし
た。結果を、〔表２〕に示す。

【０２１４】

【表２】 ────────────────────────────── 総結合量 非特異的結合量 細胞株番号 （ｃｐｍ） （ｃｐｍ） ────────────────────────────── ＣＨＯ／pTS863-5 50466.8±502.9 1458 ±100.1 ＣＨＯ／pTS863-7 59158.6±2095.1 1962.4 ± 56.3 ──────────────────────────────

【０２１５】〔表２〕から、本発明のヒト・ガラニンレ
セプター蛋白質を安定に高発現する細胞株ＣＨＯ／ｐＴ
Ｓ８６３−５およびＣＨＯ／ｐＴＳ８６３−７が、リガ
ンドであるガラニンと特異的に結合できることが確認さ
れた。

【０２１６】

【実施例１５】 ＧＡＬ５細胞膜画分での ¹²⁵Ｉ−ガラ
ニン（ヒト型）を用いた飽和結合実験およびスキャッチ
ャードプロット解析 ヒト・ガラニンレセプターを発現したＣＨＯ細胞（ＧＡ
Ｌ５細胞；実施例１３で得られるＣＨＯ／ｐＴＳ８６３
−５）を、１０％透析血清，２ｍＭグルタミン，ペニシ
リンおよび、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地
で、５％ＣＯ₂ インキュベーター、３７℃にて培養し
た。ＧＡＬ５細胞を、１ｇ／ｌ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ
で回収し、ホモジナイズバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ，５ｍＭＥＤＴＡ，０．０３％ＮａＮ₃ ，１０μｇ
／ｍｌペプスタチン，０．５ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（ＰＭＳＦ），２０μｇ／ｍｌ Ｅ−
６４，４０μｇ／ｍｌロイペプチン，ｐＨ７．３）で懸
濁し、ポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし
た。ホモジナイズ試料を、高速遠心機にて、２，５００
ｒｐｍ，１０分間，４℃で遠心した。上清を、３０，０
００ ｒｐｍ，６０分間，４℃で超遠心してペレットを
回収し、これをホモジナイズバッファーに懸濁し、ＧＡ
Ｌ５細胞膜画分とした。

【０２１７】ＧＡＬ５細胞膜画分を、アッセイバッファ
ー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，０．０８％
ＮａＮ₃ ，１０μｇ／ｍｌペプスタチン，０．５ｍＭ
ＰＭＳＦ，２０μｇ／ｍｌ Ｅ−６４，４０μｇ／ｍｌ
ロイペプチン，０．１％ＢＳＡ，０．０５％ＣＨＡＰ
Ｓ，ｐＨ７．４）で、膜蛋白濃度２μｇ／ｍｌに希釈
し、１００μｌ／チューブに分注した。このＧＡＬ５膜
画分を、１５ｐＭから５００ｐＭまで濃度を変えた ¹²⁵
Ｉ−ガラニン（ヒト型）と、２５℃，７５分間インキュ
ベーション後、濾過バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０３％ ＮａＮ₃ ，０．１％Ｂ
ＳＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳ，ｐＨ７．４，４℃）１．
５ｍｌで希釈し、ポリエチレンイミン処理したＧＦ／Ｆ
ガラス繊維濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社）にて濾過した。濾
紙を濾過バッファー１．５ｍｌで洗浄後、その放射活性
をγ−カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ）で測定し、結合量を求めた。非特異的結合量
は、ガラニン（ヒト型）２７０ｎＭ存在下において実施
した。結合データをスキャッチャードプロット解析した
結果、解離定数（Ｋｄ）は２０ｐＭ、発現量（Ｂｍａ
ｘ）は９．６ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと算出さ
れた。

【０２１８】

【実施例１６】 マウス由来ガラニンレセプター蛋白質
ｃＤＮＡを用いたノーザンブロット分析 マウス脳、胸腺、脾臓、肺、心臓、肝、腎臓、膵臓、睾
丸、小腸の平滑筋、ＭＩＮ６、及びＮｅｕｒｏ−２ａ細
胞から得られたｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡの５μｇをグリ
オキサールとジメチルスルホキシドで変性した後１．２
％アガロースゲル上の電気泳動にかけた（Thomas, P.
S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77,5201-5205, 1
980) 。電気泳動後、ＲＮＡをニトロセルロースフィル
ター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，独
国）上に転写し、そのフィルターを８０℃で２時間ベー
キング処理した。プローブとしては、ｐ３Ｈ２−３４の
ｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩで消化して切り出した
ものをＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅＤＮＡラベリングキット
（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰＬ
Ｃ，英国）でもって［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２２２ＴＢｑ
／ｍｍｏｌ，Ｄｕｐｏｕｔ／ＮＥＮ）を使用して標識し
た。ハイブリダイゼーションは、４２℃で５０％ホルム
アルデヒド，５×ＳＳＣ，５０ｍＭ ＮａＨＰＯ₄ ，ｐ
Ｈ６．５，１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液及び１００
μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中で行っ
た。フィルターは次に２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５
０℃で洗い、次に−８０℃で１２日間Ｘ−Ｏｍａｔフィ
ルムＡＲ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，米
国）上でオートラジオグラフィーした。マウス組織から
得られたｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを用いたノーザンブロ
ット分析において脳及び小腸においてのみマウスガラニ
ンレセプターの弱いハイブリダイゼーション・シグナル
を検出した〔図１４〕。このノーザン・ブロッティング
の結果は、ガラニンレセプターｍＲＮＡの発現レベルが
実質的にマウスの正常組織では低いものであることを示
している。

【０２１９】

【実施例１７】 （１） ＣＨＯ細胞でのマウス由来ガラニンレセプター
ｃＤＮＡの発現 完全な翻訳領域を持ったｃＤＮＡクローンｐＭＧＲ２０
をＮｏｔＩで消化処理し、平滑端とし、ＸｂａＩリンカ
ー（宝酒造（株））とライゲーションした。得られたｃ
ＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化して切り出
し、哺乳動物細胞用発現ベクター，ｐＡＫＫＯ−１１１
ＨのＳａｌＩ−ＳｐｅＩサイトの間に挿入した。ｐＡＫ
ＫＯ−１１１Ｈは実施例１２のｐＡＫＫＯ−１１１のク
ローニングサイトであるＳａｌＩサイトに合成ＤＮＡを
用いて、ＳａｌＩ−ＣｌａＩ−ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩのマ
ルチクローニングサイトを導入して作成した。得られた
ＳＲαプロモーターの下流に該マウス由来ガラニンレセ
プターｃＤＮＡを持つと共に選択マーカーとしてｄｈｆ
ｒ遺伝子を持つ発現プラスミドを、ｐＡＫＫＯＭＧＲ２
０と命名した。このプラスミドＤＮＡをＣｅｌｌ Ｐｈ
ｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）に添付のＣＨＯ ｄｈｆｒ^- 細胞にトラ
ンスフェクションした。デオキシリボヌクレオシド及び
リボヌクレオシドを欠いたα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ）に透析処理されたウシ胎児血清（ＦＢＳ Ｇ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ）を添加したものの中で形質転換体を
選択した。

【０２２０】（２） ［ ¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニンとの結
合アッセイ ｐＡＫＫＯＭＧＲ２０で形質転換されたＣＨＯ細胞及び
ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈで形質転換されたＣＨＯ細胞を
２．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとして１２穴ティ
シュ・カルチャー・プレート中で生育せしめ、１日間培
養する。０．１％ＢＳＡを含有するＨａｎｋｓ’ｂａｌ
ａｎｃｅｄ ｓａｌｔ溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄後室
温で１時間標識してないブタガラニン（１μＨの最終濃
度）の存在下あるいは非存在下に１００ｐＭの［
¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニン（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮ）と共
にインキュベーション処理をした。次に細胞を３回ＢＳ
Ａを含有するＨＢＳＳで洗い、０．１Ｎ ＮａＯＨ，１
％ＳＤＳで溶解処理し、残っている放射性物質でラベル
されたリガンドをγ−カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，米国）で定量した。

【０２２１】競合結合実験及びＳｃａｔｃｈａｒｄプロ
ット分析のため、形質転換体ＣＨＯ細胞から細胞膜画分
を調製した。３日間２２５ｃｍ² の組織培養用フラスコ
中で生育せしめた細胞を５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリ
ン酸塩で緩衝化された食塩溶液（ＰＢＳ）中に分散せし
め、次に遠心により収穫した。その細胞を同じ緩衝液で
洗い、次に１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭフェニルメチ
ルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ），２．０μｇ／
ｍｌのロイペプチン，４μｇ／ｍｌのＥ−６４及び０．
５μｇ／ｍｌのペプスタチンを含有する１０ｍＭの炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁した。Ｐｏｌ
ｙｔｒｏｎホモジナイザーでもってその細胞をホモジェ
ナイズした後、そのホモジュネートをＨｉｔａｃｈｉ
ＲＲ２Ａ２ローター（日立製作所）中で１０分間３，０
００ｒｐｍで遠心処理した。得られた上清液をＢｅｃｋ
ｍａｎＴｙｐｅ３０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳ
Ａ）中で３０分間３０，０００ｒｐｍの超遠心処理にか
けた。得られたペレット状物を次に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ，２０μｇ／ｍｌのロイペプチン，４μｇ
／ｍｌのＥ−６４及び０．５μｇ／ｍｌのペプスタチン
を含有する緩衝液中に懸濁し、細胞膜分画として用い
た。

【０２２２】競合結合アッセイ及び飽和結合アッセイを
Ohtaki et al.（J, Biol. Chem.,268, 26650-26657, 1
993）に従って行った。すなわち、該細胞膜分画を２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０５％Ｃ
ＨＡＰＳ，０．１％ＢＳＡ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５
ｍＭのＰＭＳＦ，２０μｇ／ｍｌのロイペプチン，４μ
ｇ／ｍｌのＥ−６４及び０．５μｇ／ｍｌのペプスタチ
ンを含有する緩衝液中で［ ¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニンと共
に２５℃で７５分間インキュベーション処理した。結合
しているリガンド及び遊離のリガンドを、０．３％のポ
リエチレンイミンで処理されたガラス・ファイバー・フ
ィルター（ＧＦ／Ｆ，Ｗｈａｔｍａｎ，英国）を通して
濾過により分離した。１μＭの標識してないブタ型ガラ
ニンの存在下に非特異的結合の量を決定した。競合型結
合アッセイでは、ガラニン及びガラニン・アナローグを
その緩衝液中に［ ¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニンと同時に加え
た。マウスガラニンレセプターｃＤＮＡを含有する発現
プラスミドで形質転換されたＣＨＯ細胞はコントロール
細胞と比較して顕著に［ ¹²⁵Ｉ］ガラニンと結合した
（図１５）。

【０２２３】Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析では、細胞膜分画
（１μｇの蛋白質）を［ ¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニンと７５
分間２５℃でインキュベーション処理した。３つをセッ
トとしたアッセイにおける代表例を１つだけ結果として
示してある。それぞれの記号は平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を
示す。Ｋｄ及びＢｍａｘ値はそれぞれ４５ｐＭ及び５ｐ
ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。Ｂは、［ ¹²⁵Ｉ］ガラニ
ン結合したもの（ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質）を、Ｂ／Ｆは
遊離のものに対する結合したものの比（ｐｍｏｌ／ｍ蛋
白質・ｎＭ）を示す。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析
では４５ｐＭの解離定数を持ち、さらに５ｐｍｏｌ／ｍ
ｇ蛋白質の最大結合サイト数（Ｂｍａｘ）を持つ高い親
和性を持つ結合サイトの単一の群の存在が認められた
（図１７）。

【０２２４】マウスガラニンレセプターに対する［ ¹²⁵
Ｉ］ブタ型ガラニンの競合結合アッセイ実験を行った。
［ ¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニン（最終濃度１００ｐＭ）の結
合に対する競合反応を標識してないブタ型ガラニン
（△）、ラットガラニン（●）、ヒトガラニン（■）、
ガラニン−（１−１６）（○）及びＭ１５ (▲）に関し
て調べた。細胞膜分画（１μｇの蛋白質）は、７５分間
２５℃で該リガンドとインキュベーション処理した。結
合した［ ¹²⁵Ｉ］ガラニンの量をコントロールに対する
百分率として表わした。各記号は、３つをセットとした
アッセイの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表わす。ブタ型ガラ
ニンでのＩＣ₅₀は０．２５±０．０３Ｍ，ラットガラニ
ンのＩＣ₅₀は０．２５±０．０１ｎＭ，ヒトガラニンの
ＩＣ₅₀は０．４３±０．０３ｎＭ，Ｍ１５のＩＣ₅₀は
０．８３±０．０１ｎＭで、ガラニン−（１−１６）の
ＩＣ₅₀は３．６±０．０４ｎＭであった。［ ¹²⁵Ｉ］ガ
ラニンの結合はガラニン及びガラニン由来ペプチド類に
よって競合的に阻害された。ブタ型ガラニン及びラット
ガラニンは［ ¹²⁵Ｉ］ガラニンの結合阻害においてほと
んど同じ高い効果を示したが、ヒトガラニンは幾分か低
いものであった。ブタ型ガラニンのＫｉ値は０．０７２
±０．００８ｎＭで、ラットガラニンのＫｉ値は０．０
６９±０．００２ｎＭで、ヒトガラニンのＫｉ値は０．
１２±０．００８ｎＭであった。ガラニンレセプターア
ンタゴニストＭ１５及びガラニン（１−１６）もまた［
¹²⁵Ｉ］ガラニンの結果を効果的に阻害した。それらの
Ｋｉ値はＭ１５では０．２３±０．００３ｎＭで、ガラ
ニン（１−１６）では１．０±０．０１１ｎＭであった
（図１８）。これらの得られた値はＭＩＮ６細胞の細胞
膜で得られたものにほとんど匹敵するものであった。

【０２２５】（３） ｃＡＭＰアッセイ 形質転換体ＣＨＯ細胞を２４穴ティシュ・カルチャー・
プレート中に２．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを播
種し、２日間培養した。得られた細胞を０．１％ＢＳＡ
及び１ｍＭ ＩＢＭＸを含有するＨＢＳＳで２回洗い、
次に試験用試薬を加えた同じ緩衝液をそのウェル中に加
えた。３７℃で３０分間インキュベーション処理した
後、培地をすてて、細胞内ｃＡＭＰを氷冷エタノールで
抽出した。抽出物の一部をエバポレーション処理し、ｃ
ＡＭＰの量をｃＡＭＰ ＥＩＡシステム（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）を用い、その試薬のプロトコールに従って定量し
た。フォスコリン刺激されたｃＡＭＰ産生のガラニンレ
セプターで仲介された阻止反応を観察した。ＭＧＲ２０
で形質転換されたＣＨＯ細胞及び模擬的に形質転換され
たＣＨＯ細胞をフォスコリン（１０μＭ）及びブタ型ガ
ラニン（０．１μＭ）と共に３７℃で３０分間インキュ
ベーション処理した。反応は該細胞を氷冷エタノールで
抽出することにより停止せしめた。細胞内ｃＡＭＰの量
をＥＩＡで定量した。３つをセットとしたアッセイの平
均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示してある。

【０２２６】ガラニンで誘導されるシグナルの転移誘導
を評価してＣＨＯ細胞中で発現されたマウスガラニンレ
セプターが機能していることを確めた。膵臓由来ガラニ
ンレセプターは、アデニレート・シクラーゼとネガティ
ブに共役しているＧ蛋白質の関与した経路を介してイン
スリンの放出（Cormont, M., et al., Diabtes, 40,117
0-1176, 1991; Gillison, S., et al., Diabtes, 43, 2
4-32, 1994)を阻害していることが示された。ガラニン
レセプターｃＤＮＡの導入されたＣＨＯ細胞におけるフ
ォスコリン刺激されたｃＡＭＰの蓄積がブタ型ガラニン
処理で効果的に抑制された。ｃＤＮＡインサートを持た
ないプラスミドベクターを有するＣＨＯ細胞形質転換体
もフォスコリン刺激されたｃＡＭＰの蓄積を示したが、
ブタ型ガラニン処理で阻害されることはなかった。ガラ
ニン処理単独ではＣＨＯ細胞形質転換体のｃＡＭＰレベ
ルを変化させることはなかった（図１９）。

【０２２７】

【発明の効果】本発明のガラニンレセプター蛋白質およ
び該蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体および抗血清
の入手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、
同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と
医薬品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似し
たリガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグ
デザインの実施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣ
Ｒプライマーの作成、トランスジェニック動物の作
製、レセプター蛋白質ＤＮＡ欠失による病態モデル動
物の作製等に用いることができる。特に、マウス由来ガ
ラニンのレセプターの構造・性質の解明はこれらの系に
作用するユニークな医薬品の開発につながる。さらに、
本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白質は、公知のヒ
ト・ガラニンレセプター蛋白質のアミノ酸配列とは異な
るアミノ酸配列を有する新規な蛋白質である。本発明の
ヒト・ガラニンレセプター蛋白質を含有する発現ベクタ
ーを保持する細胞（特に、ＣＨＯ細胞）は、公知のヒト
・ガラニンレセプター蛋白質を含有するＣＯＳ細胞に比
べて、はるかに大量のヒト・ガラニンレセプター蛋白質
を発現することができる。

【０２２８】本発明のヒト・ガラニンレセプター蛋白
質、その部分ペプチドまたはヒト・ガラニンレセプター
蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分は、ヒト
・ガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト
を効率良くスクリーニングすることができる。本発明の
スクリーニング方法を用いることによって、アゴニスト
またはアンタゴニストを有利に選択することができるの
で、医薬品を早期に開発することができる。アゴニスト
は、例えば、アセチルコリン遊離抑制剤、インスリン分
泌抑制剤、成長ホルモン分泌刺激剤、学習行動抑制剤ま
たは満腹感抑制剤などとして、さらには、分裂病もしく
は胃潰瘍の予防・治療剤または鎮痛剤などとして有用で
ある。一方、アンタゴニストは、例えば、アセチルコリ
ン遊離促進剤、インスリン分泌促進剤、成長ホルモン分
泌抑制剤、学習行動促進剤または満腹感促進剤などとし
て、さらには、糖尿病、アルツハイマー病または痴呆症
の予防・治療剤などとして有用である。

【０２２９】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：１２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Met Ser Val Asp Arg Tyr Val Ala Ile Val His Ser Arg Arg 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Arg Val Ser Arg Asn Ala Leu Leu Gly Val Gly Phe 20 25 30 Ile Trp Ala Leu Ser Ile Ala Met Ala Ser Pro Val Ala Tyr His Gln 35 40 45 Arg Leu Phe His Arg Asp Ser Asn Gln Thr Phe Cys Trp Glu Gln Trp 50 55 60 Pro Asn Lys Leu His Lys Lys Ala Tyr Val Val Cys Thr Phe Val Phe 65 70 75 80 Gly Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ile Cys Phe Cys Tyr Ala Lys Val 85 90 95 Leu Asn His Leu His Lys Lys Leu Lys Asn Met Ser Lys Lys Ser Glu 100 105 110 Ala Ser Lys Lys Lys Thr Ala Gln Thr Val Leu Val Val Val Val Val 115 120 125

【０２３０】

【配列番号：２】 配列の長さ：３４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Leu Ala Met Val Asn Leu Ser Glu Gly Asn Gly Ser Asp Pro 1 5 10 15 Glu Pro Pro Ala Pro Glu Ser Arg Pro Leu Phe Gly Ile Gly Val Glu 20 25 30 Asn Phe Ile Thr Leu Val Val Phe Gly Leu Ile Phe Ala Met Gly Val 35 40 45 Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Thr Val Leu Ala Arg Ser Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Pro Arg Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ser Ile Ala 65 70 75 80 Asp Leu Ala Tyr Leu leu Phe Cys Ile Pro Phe Gln Ala Thr Val Tyr 85 90 95 Ala Leu Pro Thr Trp Val Leu Gly Ala Phe Ile Cys Lys Phe Ile His 100 105 110 Tyr Phe Phe Thr Val Ser Met Leu Val Ser Ile Phe Thr Leu Ala Ala 115 120 125 Met Ser Val Asp Arg Tyr Val Ala Ile Val His Ser Arg Arg Ser Ser 130 135 140 Ser Leu Arg Val Ser Arg Asn Ala Leu Leu Gly Val Gly Phe Ile Trp 145 150 155 160 Ala Leu Ser Ile Ala Met Ala Ser Pro Val Ala Tyr His Gln Arg Leu 165 170 175 Phe His Arg Asp Ser Asn Gln Thr Phe Cys Trp Glu Gln Trp Pro Asn 180 185 190 Lys Leu His Lys Lys Ala Tyr Val Val Cys Thr Phe Val Phe Gly Tyr 195 200 205 Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ile Cys Phe Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asn 210 215 220 His Leu His Lys Lys Leu Lys Asn Met Ser Lys Lys Ser Glu Ala Ser 225 230 235 240 Lys Lys Lys Thr Ala Gln Thr Val Leu Val Val Val Val Val Phe Gly 245 250 255 Ile Ser Trp Leu Pro His His Val Val His Leu Trp Ala Glu Phe Gly 260 265 270 Ala Phe Pro Leu Thr Pro Ala Ser Phe Phe Phe Arg Ile Thr Ala His 275 280 285 Cys Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe 290 295 300 Leu Ser Glu Asn Phe Arg Lys Ala Tyr Lys Gln Val Phe Lys Cys His 305 310 315 320 Val Cys Asp Glu Ser Pro Arg Ser Glu Thr Lys Glu Asn Lys Ser Arg 325 330 335 Met Asp Thr Pro Pro Ser Thr Asn Cys Thr His Val 340 345

【０２３１】

【配列番号：３】 配列の長さ：３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GCCGCGATGT CTGTGGATCG CTACGTGGCC ATTGTGCACT CGCGGCGCTC CTCCTCCCTC 60 AGGGTGTCCC GCAACGCACT GCTGGGCGTG GGCTTCATCT GGGCGCTGTC CATCGCCATG 120 GCCTCGCCGG TGGCCTACCA CCAGCGTCTT TTCCATCGGG ACAGCAACCA GACCTTCTGC 180 TGGGAGCAGT GGCCCAACAA GCTCCACAAG AAGGCTTACG TGGTGTGCAC TTTCGTCTTT 240 GGGTACCTTC TGCCCTTACT GCTCATCTGC TTTTGCTATG CCAAGGTCCT TAATCATCTG 300 CATAAAAAGC TGAAAAACAT GTCAAAAAAG TCTGAAGCAT CCAAGAAAAA GACTGCACAG 360 ACCGTCCTGG TGGTCGTTGT AGTA 384

【０２３２】

【配列番号：４】 配列の長さ：１０４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGAACTGG CTATGGTGAA CCTCAGTGAA GGGAATGGGA GCGACCCAGA GCCGCCAGCC 60 CCGGAGTCCA GGCCGCTCTT CGGCATTGGC GTGGAGAACT TCATTACGCT GGTAGTGTTT 120 GGCCTGATTT TCGCGATGGG CGTGCTGGGC AACAGCCTGG TGATCACCGT GCTGGCGCGC 180 AGCAAACCAG GCAACCCCCG CAGCACCACC AACCTGTTTA TCCTCAATCT GAGCATCGCA 240 GACCTGGCCT ACCTGCTCTT CTGCATCCCT TTTCAGGCCA CCGTGTATGC ACTGCCCACC 300 TGGGTGCTGG GCGCCTTCAT CTGCAAGTTT ATACACTACT TCTTCACCGT GTCCATGCTG 360 GTGAGCATCT TCACCCTGGC CGCGATGTCT GTGGATCGCT ACGTGGCCAT TGTGCACTCG 420 CGGCGCTCCT CCTCCCTCAG GGTGTCCCGC AACGCACTGC TGGGCGTGGG CTTCATCTGG 480 GCGCTGTCCA TCGCCATGGC CTCGCCGGTG GCCTACCACC AGCGTCTTTT CCATCGGGAC 540 AGCAACCAGA CCTTCTGCTG GGAGCAGTGG CCCAACAAGC TCCACAAGAA GGCTTACGTG 600 GTGTGCACTT TCGTCTTTGG GTACCTTCTG CCCTTACTGC TCATCTGCTT TTGCTATGCC 660 AAGGTCCTTA ATCATCTGCA TAAAAAGCTG AAAAACATGT CAAAAAAGTC TGAAGCATCC 720 AAGAAAAAGA CTGCACAGAC CGTCCTGGTG GTCGTTGTAG TATTTGGCAT ATCCTGGCTG 780 CCCCATCATG TCGTCCACCT CTGGGCTGAG TTTGGAGCCT TCCCACTGAC GCCAGCTTCC 840 TTCTTCTTCA GAATCACCGC CCATTGCCTG GCATACAGCA ACTCCTCAGT GAACCCCATC 900 ATATATGCCT TTCTCTCAGA AAACTTCCGG AAGGCGTACA AGCAAGTGTT CAAGTGTCAT 960 GTTTGCGATG AATCTCCACG CAGTGAAACT AAGGAAAACA AGAGCCGGAT GGACACCCCG 1020 CCATCCACCA ACTGCACCCA CGTG 1044

【０２３３】

【配列番号：５】 配列の長さ：３４９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Leu Ala Val Gly Asn Leu Ser Glu Gly Asn Ala Ser Trp Pro 1 5 10 15 Glu Pro Pro Ala Pro Glu Pro Gly Pro Leu Phe Gly Ile Gly Val Glu 20 25 30 Asn Phe Val Thr Leu Val Val Phe Gly Leu Ile Phe Ala Leu Gly Val 35 40 45 Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Thr Val Leu Ala Arg Ser Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Pro Arg Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ser Ile Ala 65 70 75 80 Asp Leu Ala Tyr Leu Leu Phe Cys Ile Pro Phe Gln Ala Thr Val Tyr 85 90 95 Ala Leu Pro Thr Trp Val Leu Gly Ala Phe Ile Cys Lys Phe Ile His 100 105 110 Tyr Phe Phe Thr Val Ser Met Leu Val Ser Ile Phe Thr Leu Ala Ala 115 120 125 Met Ser Val Asp Arg Tyr Val Ala Ile Val His Ser Arg Arg Ser Ser 130 135 140 Ser Leu Arg Val Ser Arg Asn Ala Leu Leu Gly Val Gly Cys Ile Trp 145 150 155 160 Ala Leu Ser Ile Ala Met Ala Ser Pro Val Ala Tyr His Gln Gly Leu 165 170 175 Phe His Pro Arg Ala Ser Asn Gln Thr Phe Cys Trp Glu Gln Trp Pro 180 185 190 Asp Pro Arg His Lys Lys Ala Tyr Val Val Cys Thr Phe Val Phe Gly 195 200 205 Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ile Cys Phe Cys Tyr Ala Lys Val Leu 210 215 220 Asn His Leu His Lys Lys Leu Lys Asn Met Ser Lys Lys Ser Glu Ala 225 230 235 240 Ser Lys Lys Lys Thr Ala Gln Thr Val Leu Val Val Val Val Val Phe 245 250 255 Gly Ile Ser Trp Leu Pro His His Ile Ile His Leu Trp Ala Glu Phe 260 265 270 Gly Val Phe Pro Leu Thr Pro Ala Ser Phe Leu Phe Arg Ile Thr Ala 275 280 285 His Cys Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Ser Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala 290 295 300 Phe Leu Ser Glu Asn Phe Arg Lys Ala Tyr Lys Gln Val Phe Lys Cys 305 310 315 320 His Ile Arg Lys Asp Ser His Leu Ser Asp Thr Lys Glu Asn Lys Ser 325 330 335 Arg Ile Asp Thr Pro Pro Ser Thr Asn Cys Thr His Val 340 345

【０２３４】

【配列番号：６】 配列の長さ：１０４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGAGCTGG CGGTCGGGAA CCTCAGCGAG GGCAACGCGA GCTGGCCGGA GCCCCCCGCC 60 CCGGAGCCCG GGCCGCTGTT CGGCATCGGC GTGGAGAACT TCGTCACGCT GGTGGTGTTC 120 GGCCTGATCT TCGCGCTGGG CGTGCTGGGC AACAGCCTAG TGATCACCGT GCTGGCGCGC 180 AGCAAGCCGG GCAAGCCGCG GAGCACCACC AACCTGTTCA TCCTCAACCT GAGCATCGCC 240 GACCTGGCCT ACCTGCTCTT CTGCATCCCC TTCCAGGCCA CCGTGTACGC GCTGCCCACC 300 TGGGTGCTGG GCGCCTTCAT CTGCAAGTTC ATCCACTACT TCTTCACCGT GTCCATGCTG 360 GTGAGCATCT TCACCCTGGC CGCGATGTCC GTGGACCGCT ACGTGGCCAT CGTGCACTCG 420 CGGCGCTCCT CCTCCCTCAG GGTGTCCCGC AACGCGCTGC TGGGCGTGGG CTGCATCTGG 480 GCGCTGTCCA TTGCCATGGC CTCGCCCGTG GCCTACCACC AGGGCCTCTT CCACCCGCGC 540 GCCAGCAACC AGACCTTCTG CTGGGAGCAG TGGCCCGACC CTCGCCACAA GAAGGCCTAC 600 GTGGTGTGCA CCTTCGTCTT CGGCTACCTG CTGCCGCTCC TGCTCATCTG CTTCTGCTAT 660 GCCAAGGTCC TTAATCACTT GCATAAAAAG TTGAAGAACA TGTCAAAGAA GTCTGAAGCA 720 TCCAAGAAAA AGACTGCACA GACAGTTCTG GTGGTGGTTG TGGTGTTTGG AATCTCCTGG 780 CTGCCGCACC ACATCATCCA TCTCTGGGCT GAGTTTGGAG TTTTCCCGCT GACGCCGGCT 840 TCCTTCCTCT TCAGAATCAC CGCCCACTGC CTGGCGTACA GCAATTCCTC CGTGAATCCT 900 ATCATTTATG CATTTCTCTC TGAAAATTTC AGGAAGGCCT ATAAACAAGT GTTCAAGTGT 960 CACATTCGCA AAGATTCACA CCTGAGTGAT ACTAAAGAAA ATAAAAGTCG AATAGACACC 1020 CCACCATCAA CCAATTGTAC TCATGTG 1047

【０２３５】

【配列番号：７】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを示す。 配列 CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG 25

【０２３６】

【配列番号：８】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを示す。 配列 GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27

【０２３７】

【配列番号：９】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCGTGGACC GCTACGTGGC CATCGTG 27

【０２３８】

【配列番号：１０】 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GACTTATCAC ACATGAGTAC AATTGGTTGA TGG 33

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６よりＰＣＲ増幅に
よって得た新規レセプター蛋白質ｃＤＮＡクローンｐ３
Ｈ２−３４の部分塩基配列とそれにコードされるアミノ
酸配列を示す。下線部分はＰＣＲ増幅に用いた合成プラ
イマーに相当する。

【図２】図１に示したアミノ酸配列をもとに作成した疎
水性プロットを示す。縦軸は疎水性のインデックスを示
し、横軸はアミノ酸数を示す。図中の番号３〜６は、疎
水性ドメインの存在を示す。

【図３】ｐ３Ｈ２−３４にコードされる新規レセプター
蛋白質の部分アミノ酸配列と、ヒトソマトスタチンレセ
プターサブタイプ４蛋白質（ＪＮ０６０５）、ヒトソマ
トスタチンレセプターサブタイプ２蛋白質（Ｂ４１７９
５）およびラット由来リガンド不明レセプター蛋白質
（Ａ３９２９７）の部分アミノ酸配列とを比較した図で
ある。黒塗りの部分は一致しているアミノ酸残基を表わ
す。

【図４】ｐ３Ｈ２−３４に挿入されているｃＤＮＡをプ
ローブとしてクローニングされたマウス由来ガラニンレ
セプター蛋白質ｃＤＮＡクローンｐＭＧＲ２０の塩基配
列とそれにコードされるアミノ酸配列を示す。

【図５】図４に示したアミノ酸配列をもとに作成した疎
水性プロットを示す。縦軸は疎水性のインデックスを示
し、横軸はアミノ酸数を示す。図中の番号１〜７は、疎
水性ドメインの存在を示す。

【図６】ｐＭＧＲ２０にコードされるマウス由来ガラニ
ンレセプター蛋白質のアミノ酸配列（ＭＯＵＳＥＧＡＬ
ＲＥＣＥ）と、ヒト由来ガラニンレセプター蛋白質のア
ミノ酸配列（ＨＵＭＡＧＡＬＡＭＩ）とを比較した図で
ある。黒塗りの部分は一致しているアミノ酸残基を表わ
す。

【図７】ＭＩＮ６細胞に対する標識ガラニンの結合量
（ＰＭＢ）を標準ブタ型ガラニン、ラット型ガラニン、
ガラニン（１−１６）部分ペプチドまたはガラニンレセ
プターアンタゴニスト（ガランタイド）の濃度に対して
プロットした結果を示す。

【図８】ガラニン量に対するＭＩＮ６細胞からのインス
リン分泌量をプロットした結果を示す。

【図９】ガラニン量に対するＭＩＮ６細胞からのインス
リン分泌量をプロットした結果を示す。

【図１０】ガラニン量に対するＭＩＮ６細胞内ｃＡＭＰ
量をプロットした結果を示した。

【図１１】実施例１１で得られた本発明のヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列およ
びそれから推定されるアミノ酸配列（第１番目〜第１３
５番目）を示す。

【図１２】実施例１１で得られた本発明のヒト・ガラニ
ンレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列およ
びそれから推定されるアミノ酸配列（第１３６番目〜第
３４９番目）を示す。

【図１３】実施例１２で得られたヒト・ガラニンレセプ
ター蛋白質ｃＤＮＡを保持する発現プラスミドｐＴＳ８
６３の構築図を示す。発現プラスミドｐＴＳ８６３の斜
線部分は、ヒト・ガラニンレセプター蛋白質をコードす
るｃＤＮＡを示し、ＤＨＦＲはｄｈｆｒ遺伝子を示し、
Ａｍｐ^r はアンピシリン耐性遺伝子を示し、ＳＲαprom
oter はＳＲαプロモーターを示す。

【図１４】マウス組織、Ｎｅｕｒｏ−２ａ及びＭＩＮ６
細胞から得られた各ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡとｐ３Ｈ２
−３４との間のノーザンブロッティング解析の結果を示
すもので、電気泳動の写真である。ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ Ｒ
ＮＡ（５μｇ／レーン）はグリオキザールで処理して変
性後１．２％アガロースゲル上で電気泳動処理した。Ｒ
ＮＡをニトロセルロースフィルター上にトランスファー
して、³²Ｐで標識されたｃＤＮＡインサート、ｐ３Ｈ２
−３４をプローブとしてハイブリダイゼーション処理し
た。レーン１：Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞；レーン２：ＭＩ
Ｎ６細胞；レーン３：小腸平滑筋；レーン４：睾丸；レ
ーン５：膵臓；レーン６：腎臓；レーン７：肝臓；レー
ン８：心臓；レーン９：肺；レーン１０：脾臓；レーン
１１：胸腺；レーン１２：脳矢印は分子量マーカーの位
置を示す。

【図１５】マウスガラニンレセプターｃＤＮＡで形質転
換されたＣＨＯ細胞とマウスガラニンレセプターｃＤＮ
Ａを持たないもので形質転換されたＣＨＯ細胞に対する
［¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニンの結合活性を比較した結果を
示すものである。全長の翻訳枠で形質転換されたＣＨＯ
−ＭＧＲ２０細胞及び模擬的に形質転換されたＣＨＯ細
胞（ＭＯＣＫ）は［ ¹²⁵Ｉ］ガラニン（最終濃度１００
ｐＭ）で３７℃で１時間、標識されていないブタ型ガラ
ニン（１μＭの最終濃度）の存在下（黒塗りの柱）ある
いはその非存在下（白塗りの柱）にインキュベーション
処理した。結合した［ ¹²⁵Ｉ］ガラニンの量は洗った後
細胞上に残っている放射活性の百分率として示した。３
つをセットとしてアッセイの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．とし
て値は示されている。

【図１６】マウスガラニンレセプターとヒトガラニンレ
セプターとの一次構造を比較して示したものである。一
致した残基は垂直の点線で示されている。予測される膜
貫通領域Ｉ−ＶＩＩは四角で囲んで示されている。

【図１７】マウスガラニンレセプターｃＤＮＡで形質転
換されたＣＨＯ細胞から得られた細胞膜分画に結合する
［ ¹²⁵Ｉ］ガラニンのＳｃａｔｃｈａｒｄ解析の結果を
示す。細胞膜分画（１μｇの蛋白質）を［ ¹²⁵Ｉ］ブタ
型ガラニンと７５分間２５℃でインキュベーション処理
した。３つをセットとしたアッセイにおける代表例を１
つだけ結果として示してある。それぞれの記号は平均値
±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。Ｋｄ及びＢｍａｘ値はそれぞれ
４５ｐＭ及び５ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。Ｂは、
［ ¹²⁵Ｉ］ガラニン結合したもの（ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白
質）を示し、Ｂ／Ｆは遊離のものに対する結合したもの
の比（ｐｍｏｌ／ｍ蛋白質・ｎＭ）を示す。

【図１８】マウスガラニンレセプターに対する［
¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニンの競合結合アッセイの結果を示
すものである。［ ¹²⁵Ｉ］ブタ型ガラニン（最終濃度１
００ｐＭ）の結合に対する競合反応を標識してないブタ
型ガラニン（△）、ラットガラニン（●）、ヒトガラニ
ン（■）、ガラニン−（１−１６）（○）及びＭ１５
(▲）に関して調べた。細胞膜分画（１μｇの蛋白質）
は、７５分間２５℃で該リガンドとインキュベーション
処理した。結合した［ ²⁵Ｉ］ガラニンの量をコントロ
ールに対する百分率として表わした。各記号は、３つを
セットとしたアッセイの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表わ
す。ブタ型ガラニンでのＩＣ₅₀は０．２５±０．０３
Ｍ，ラットガラニンのＩＣ₅₀は０．２５±０．０１ｎ
Ｍ，ヒトガラニンのＩＣ₅₀は０．４３±０．０３ｎＭ，
Ｍ１５のＩＣ₅₀は０．８３±０．０１ｎＭで、ガラニン
−（１−１６）のＩＣ₅₀は３．６±０．０４ｎＭであっ
た。

【図１９】フォスコリン刺激されたｃＡＭＰ産生のガラ
ニンレセプターで仲介された阻止反応の結果を示すもの
である。ＭＧＲ２０で形質転換されたＣＨＯ細胞（ＣＨ
Ｏ−ＭＧＲ２０）及び模擬的に形質転換されたＣＨＯ細
胞（ＭＯＣＫ）をフォスコリン（１０μＭ）及びブタ型
ガラニン（０．１μＭ）と共に３７℃で３０分間インキ
ュベーション処理した。反応は該細胞を氷冷エタノール
で抽出することにより停止せしめた。細胞内ｃＡＭＰの
量をＥＩＡで定量した。３つをセットとしたアッセイの
平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示してある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＭ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＭ ＡＣＬ ＡＣＬ ＡＤＰ ＡＤＰ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大瀧 徹也 茨城県つくば市春日１丁目７番地の９ 武 田春日ハイツ802号 (72)発明者 細谷 昌樹 茨城県土浦市板谷１丁目711番地の83 (72)発明者 大儀 和宏 茨城県つくば市梅園２丁目16番地１号 ル ン・ビーニ梅園206号 (72)発明者 音田 治夫 茨城県土浦市下高津４丁目５番26号

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：２又は配列番
   号：５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
   ノ酸配列を含有することを特徴とするガラニンレセプタ
   ー蛋白質またはその塩。
2. 【請求項２】 形質転換体ＣＨＯ細胞により産生された
   請求項１記載のガラニンレセプター蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１記載のガラニンレセプター蛋白
   質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】 請求項３記載のＤＮＡを含有することを
   特徴とするベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載のベクターを保持する形質
   転換体。
6. 【請求項６】 宿主細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴
   とする請求項５記載の形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項５記載の形質転換体を培養し、ガ
   ラニンレセプター蛋白質またはその塩を生成せしめるこ
   とを特徴とする請求項１記載のガラニンレセプター蛋白
   質またはその塩の製造方法。
8. 【請求項８】 （ｉ）請求項１記載のガラニンレセプタ
   ー蛋白質もしくはその塩またはその部分ペプチドもしく
   はその塩に、ガラニンを接触させた場合と（ii）請求項
   １記載のガラニンレセプター蛋白質もしくはその塩また
   はその部分ペプチドもしくはその塩に、ガラニンおよび
   試験試料を接触させた場合との比較を行なうことを特徴
   とするガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
   ストのスクリーニング方法。
9. 【請求項９】 請求項１記載のガラニンレセプター蛋白
   質もしくはその塩またはその部分ペプチドもしくはその
   塩を含有することを特徴とするガラニンレセプターアゴ
   ニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キッ
   ト。
10. 【請求項１０】 請求項８記載のスクリーニング方法ま
    たは請求項９記載のスクリーニング用キットを用いて得
    られるガラニンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
    スト。