JPH0949831A - Method for determining pyrazolopyrido pyridazine derivative, peroxide, or peroxide active material - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光法による
ピラゾロピリドピリダジン誘導体、過酸化物または過酸
化活性物質の定量方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for quantifying a pyrazolopyridopyridazine derivative, a peroxide or a peroxidation active substance by a chemiluminescence method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】微量の過酸化水素等の過酸化物あるいは
ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の活性を正確に定
量あるいは測定することは分析化学および生化学におい
て重要である。臨床検査の分野では測定対象物質を最終
的に過酸化水素に変換して定量する手法が多用されてい
る。例えば、血清中のグルコースの定量では、グルコー
スオキシダーゼを用いて生成する過酸化水素を定量する
ことによりグルコースを定量する方法が知られている。
この他にも測定対象物をコレステロールオキシダーゼ、
ウリカーゼ、コリンオキシダーゼ等の多種多様な酸化酵
素を用いて生成する過酸化水素を定量することにより測
定対象物を定量する方法が知られており、臨床検査の分
野に応用されている。2. Description of the Related Art Accurately quantifying or measuring the activity of a trace amount of peroxide such as hydrogen peroxide or a peroxidative active substance such as peroxidase is important in analytical chemistry and biochemistry. In the field of clinical examination, a method of finally converting a substance to be measured into hydrogen peroxide and quantifying it is often used. For example, in the quantification of glucose in serum, a method of quantifying glucose by quantifying hydrogen peroxide generated using glucose oxidase is known.
In addition to this, the measurement target is cholesterol oxidase,
A method for quantifying an object to be measured by quantifying hydrogen peroxide produced using various oxidases such as uricase and choline oxidase is known, and is applied to the field of clinical examination.
【０００３】また、抗原や抗体あるいはＤＮＡをペルオ
キシダーゼ等の酸化酵素で標識し、その酵素活性や生成
する過酸化水素を定量することにより抗原、抗体または
ＤＮＡを定量する方法が知られている。これら測定に
は、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と発色化合
物を反応させ比色分析する方法が知られているが、満足
な感度が得られない場合がある。There is also known a method of quantifying an antigen, antibody or DNA by labeling the antigen, antibody or DNA with an oxidase such as peroxidase and quantifying the enzymatic activity and the amount of hydrogen peroxide produced. For these measurements, a method in which hydrogen peroxide and a color-forming compound are reacted in the presence of peroxidase and colorimetric analysis is known, but satisfactory sensitivity may not be obtained in some cases.
【０００４】また、生体中あるいは食品中の微量の過酸
化物、特に過酸化脂質の定量も最近注目を集めてきてい
るが、これらを定量しようとする際にも従来の比色試薬
では満足な感度が得られない場合が多々ある。従って、
より微量の過酸化水素やペルオキシダーゼ活性の定量方
法が強く求められてきている。Further, although the determination of a very small amount of peroxide, particularly lipid peroxide, in the living body or food has recently been attracting attention, the conventional colorimetric reagents are satisfactory in the determination of these amounts. There are many cases where sensitivity cannot be obtained. Therefore,
There is a strong demand for a method for quantifying a smaller amount of hydrogen peroxide or peroxidase activity.
【０００５】過酸化水素やペルオキシダーゼ活性の現在
知られている最も高感度な定量法としては、生物発光や
化学発光を利用するものがある。特に、化学発光を利用
するものとしては、ルミノール、イソルミノール、ルシ
ゲニン、アクリジニウムエステル等の発光化合物が古く
からよく知られており（生物発光と化学発光、今井一
洋、廣川書店）、これらの化合物を用いた臨床診断シス
テムも知られている〔協和メデックス（株）：ＡＣＳ−
１８０、三共（株）：ルミノマスター、アマーシャム
社：Ａｍｅｒｌｉｔｅキット、ヘキストジャパン：ベリ
ラックスシステム等〕。また、クマリン誘導体を用いた
過酸化水素および過酸化活性物質の化学発光法による定
量方法が知られている（特開平５−８１５２１９）。[0005] The most known methods for highly sensitive determination of hydrogen peroxide and peroxidase activity at present are bioluminescence and chemiluminescence. In particular, luminescent compounds such as luminol, isoluminol, lucigenin, and acridinium ester are well known (bioluminescence and chemiluminescence, Kazuhiro Imai, Hirokawa Shoten) for utilizing chemiluminescence. Clinical diagnostic system using the compound of [Kyowa Medex Co., Ltd .: ACS-
180, Sankyo Co., Ltd .: Lumino Master, Amersham Company: Amerlite Kit, Hoechst Japan: Berelax System, etc.]. Further, a method for quantifying hydrogen peroxide and a peroxidative active substance using a coumarin derivative by a chemiluminescence method is known (Japanese Patent Laid-Open No. 5-815219).
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】化学発光法による過酸
化物あるいは過酸化活性物質活性の定量方法において従
来からいくつかの化学発光化合物が使用されてはいる
が、さらに高い発光感度を有する化合物が望まれてい
る。Although some chemiluminescent compounds have been conventionally used in the method for quantifying the activity of a peroxide or a peroxidative active substance by a chemiluminescence method, a compound having higher luminescence sensitivity has been used. Is desired.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）一般式
（Ｉ）The present invention comprises (a) general formula (I)
【０００８】[0008]
【化３】 Embedded image
【０００９】（式中、Ｒ1 は水素、低級アルキル、シク
ロアルキル、低級アルケニル、ヒドロキシ、低級アルコ
キシ、低級アルカノイル、置換もしくは非置換のアリー
ル、置換もしくは非置換のヘテロアリール、アラルキ
ル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、スルホ、カルボキシ、
低級アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニ
ル、置換もしくは非置換のカルバモイル、置換もしくは
非置換のアミノ、置換スルフォニル、置換スルフィニル
または置換チオを表し、Ｒ2 は水素、低級アルキル、シ
クロアルキル、低級アルケニル、低級アルカノイル、置
換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘ
テロアリール、アラルキル、低級アルコキシカルボニ
ル、アリールオキシカルボニル、置換スルフォニル、置
換スルフィニルまたは置換チオを表す）で表される化合
物［以下、化合物（Ｉ）という］もしくはその塩で表さ
れるピラゾロピリドピリダジン誘導体を選択し、（ｂ）
試料中の過酸化物、過酸化活性物質及び該ピラゾロピリ
ドピリダジン誘導体から選ばれる一種の未知量の物質を
既知量の残りの２種の化合物と共存させ、それにより未
知量の１種の物質を既知量の２種の化合物と反応させ、
（ｃ）反応により生じる発光シグナルを測定し、（ｄ）
あらかじめ作成した検量線から試料中の物質を定量する
こと、からなる試料中の過酸化物質、過酸化活性物質ま
たは該ピラゾロピリドピリダジン誘導体の定量方法に関
する。(Wherein R 1 is hydrogen, lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, hydroxy, lower alkoxy, lower alkanoyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, aralkyl, halogen, cyano, Nitro, sulfo, carboxy,
Lower alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl, substituted or unsubstituted carbamoyl, substituted or unsubstituted amino, substituted sulfonyl, substituted sulfinyl or substituted thio, R 2 represents hydrogen, lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkanoyl, A compound represented by a substituted or unsubstituted aryl, a substituted or unsubstituted heteroaryl, an aralkyl, a lower alkoxycarbonyl, an aryloxycarbonyl, a substituted sulfonyl, a substituted sulfinyl or a substituted thio) [hereinafter referred to as a compound (I)] Alternatively, a pyrazolopyridpyridazine derivative represented by its salt is selected, and (b)
An unknown amount of a substance selected from a peroxide, a peroxide active substance and the pyrazolopyridopyridazine derivative in a sample is allowed to coexist with a known amount of the remaining two compounds, whereby an unknown amount of one Reacting a substance with known amounts of two compounds,
(C) The luminescence signal generated by the reaction is measured, and (d)
Quantifying a substance in a sample from a calibration curve prepared in advance, which comprises a method for quantifying a peroxidative substance, a peroxidative active substance or the pyrazolopyridpyridazine derivative in the sample.
【００１０】また、本発明により、一般式（Ｉａ）According to the present invention, the general formula (Ia)
【００１１】[0011]
【化４】 Embedded image
【００１２】（式中、Ｒ1aは低級アルキル、シクロアル
キル、低級アルケニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、
低級アルカノイル、置換もしくは非置換のアリール、置
換もしくは非置換のヘテロアリール、アラルキル、ハロ
ゲン、シアノ、ニトロ、スルホ、カルボキシ、低級アル
コキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、置換も
しくは非置換のカルバモイル、置換もしくは非置換のア
ミノ、置換スルフォニル、置換スルフィニルまたは置換
チオを表す）で表される化合物を提供することができ
る。(Wherein R 1a is lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, hydroxy, lower alkoxy,
Lower alkanoyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, aralkyl, halogen, cyano, nitro, sulfo, carboxy, lower alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl, substituted or unsubstituted carbamoyl, substituted or unsubstituted Amino, substituted sulfonyl, substituted sulfinyl or substituted thio) can be provided.
【００１３】[0013]
【発明の実施の形態】式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各基
の定義において、低級アルキルおよび低級アルコキシ、
低級アルカノイル、低級アルコキシカルボニルにおける
低級アルキル部分としては、直鎖または分枝状の炭素数
１〜６の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロ
ピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ
−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、イ
ソアミル、ヘキシル等が包含される。シクロアルキルと
しては、炭素数３〜８の、例えばシクロプロピル、シク
ロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘ
プチル、シクロオクチル等が包含される。低級アルケニ
ルとしては、直鎖または分枝状の炭素数２〜６の、例え
ばビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセ
ニル等が包含される。アリールおよびアリールオキシカ
ルボニルにおけるアリール部分は、例えばフェニル、ナ
フチル等を表す。ヘテロアリールとしては、ピロリル、
イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、チエニル、
フリル、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリ
ル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニ
ル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、
ベンゾチオフェニル、ベンゾフリル、キノリニル、イソ
キノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、キノキサリ
ニル、フタラジニル等が包含される。アラルキルとして
は、炭素数７〜１５の、例えばベンジル、フェネチル、
ナフチルメチル、ベンズヒドリル等が包含される。ハロ
ゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味す
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the definition of each group of formula (I) and formula (Ia), lower alkyl and lower alkoxy,
The lower alkanoyl and the lower alkyl moiety in the lower alkoxycarbonyl include linear or branched C1-C6, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert.
-Butyl, pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, isoamyl, hexyl and the like. Cycloalkyl includes, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl and the like having 3 to 8 carbon atoms. The lower alkenyl includes linear or branched C2-C6, for example, vinyl, propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl and the like. The aryl moiety in aryl and aryloxycarbonyl represents, for example, phenyl, naphthyl and the like. Heteroaryl includes pyrrolyl,
Imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, thienyl,
Furyl, thiazolyl, oxazolyl, oxadiazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, indolyl, benzimidazolyl, indazolyl,
Benzothiophenyl, benzofuryl, quinolinyl, isoquinolinyl, quinazolinyl, cinnolinyl, quinoxalinyl, phthalazinyl and the like are included. As aralkyl, those having 7 to 15 carbon atoms, for example, benzyl, phenethyl,
Naphthylmethyl, benzhydryl and the like are included. Halogen means each atom of fluorine, chlorine, bromine and iodine.
【００１４】置換アリールおよび置換ヘテロアリールに
おける置換基としては、同一または異なって置換数１〜
４の、例えば低級アルキル、シクロアルキル、低級アル
ケニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルカノイ
ル、アラルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、スルホ、
カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは
非置換のカルバモイル、置換もしくは非置換のアミノ等
があげられる。低級アルキル、シクロアルキル、低級ア
ルケニル、低級アルコキシ、低級アルカノイル、アラル
キル、ハロゲンおよび低級アルコキシカルボニルはそれ
ぞれ前記と同意義を表す。置換カルバモイルおよび置換
アミノにおける置換基としては、同一または異なって置
換数１〜２の、例えば低級アルキル等があげられ、低級
アルキルは前記と同意義を表す。Substituents in the substituted aryl and the substituted heteroaryl are the same or different and have 1 to 1 substituents.
4, for example, lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, hydroxy, lower alkoxy, lower alkanoyl, aralkyl, halogen, cyano, nitro, sulfo,
Examples thereof include carboxy, lower alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted carbamoyl, substituted or unsubstituted amino and the like. Lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkoxy, lower alkanoyl, aralkyl, halogen and lower alkoxycarbonyl are as defined above. Examples of the substituent in the substituted carbamoyl and the substituted amino include the same or different and the number of substitution is 1 to 2, for example, lower alkyl and the like, and the lower alkyl has the same meaning as described above.
【００１５】置換カルバモイルおよび置換アミノにおけ
る置換基としては、同一または異なって置換数１〜２
の、例えば置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロ
アルキル、低級アルケニル、低級アルカノイル、アリー
ル、アラルキル等があげられる。低級アルキル、シクロ
アルキル、低級アルケニル、低級アルカノイル、アリー
ルおよびアラルキルはそれぞれ前記と同意義を表す。置
換低級アルキルにおける置換基としては、例えばヒドロ
キシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルカノイ
ル、スルホ等があげられ、低級アルコキシおよび低級ア
ルカノイルはそれぞれ前記と同意義を表す。Substituents in the substituted carbamoyl and the substituted amino may be the same or different and the number of substitution is 1 to 2.
, For example, substituted or unsubstituted lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkanoyl, aryl, aralkyl and the like. Lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkanoyl, aryl and aralkyl are as defined above. Examples of the substituent in the substituted lower alkyl include hydroxy, lower alkoxy, carboxy, lower alkanoyl, sulfo and the like, and lower alkoxy and lower alkanoyl have the same meanings as described above.
【００１６】置換スルフォニル、置換スルフィニルおよ
び置換チオにおける置換基としては、例えば置換もしく
は非置換の低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケ
ニル、低級アルカノイル、アリール、アラルキル等があ
げられる。低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケ
ニル、低級アルカノイル、アリールおよびアラルキルは
それぞれ前記と同意義を表す。置換低級アルキルにおけ
る置換基としては、例えばヒドロキシ、低級アルコキ
シ、カルボキシ、低級アルカノイル、スルホ等があげら
れ、低級アルコキシおよび低級アルカノイルはそれぞれ
前記と同意義を表す。Substituents in substituted sulfonyl, substituted sulfinyl and substituted thio include, for example, substituted or unsubstituted lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkanoyl, aryl and aralkyl. Lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkanoyl, aryl and aralkyl are as defined above. Examples of the substituent in the substituted lower alkyl include hydroxy, lower alkoxy, carboxy, lower alkanoyl, sulfo and the like, and lower alkoxy and lower alkanoyl have the same meanings as described above.
【００１７】過酸化活性物質としては、過酸化活性を有
するものならいずれでもよく、例えば、ペルオキシダー
ゼ、鉄化合物（例えば、鉄塩化物、鉄酸化物等）、ヨウ
化物（例えば、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化アンモニウム
等）、モリブデン酸塩（例えば、リンモリブデン酸塩
等）、ウロヘミン、ヘモグロビン、ポルフィリン化合物
等があげられる。ペルオキシダーゼは、微生物あるいは
動植物から分離精製し得るが、市販品であってもよ
い。。The peroxidation active substance may be any substance having peroxidation activity, and examples thereof include peroxidase, iron compounds (eg, iron chloride, iron oxide, etc.), and iodides (eg, sodium iodide, iodine). Ammonium fluoride), molybdate (for example, phosphomolybdate), urohemin, hemoglobin, porphyrin compound and the like. Peroxidase can be separated and purified from microorganisms or animals and plants, but may be a commercially available product. .
【００１８】過酸化物としては、例えば、過酸化水素、
過酸化脂質等があげられる。化合物（Ｉ）は、ジャーナ
ル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー(J.Heter
ocycl. Chem.)、３０巻、２６７頁（１９９３年）に記
載の方法あるいは下記製造法により得ることができる。As the peroxide, for example, hydrogen peroxide,
Examples include lipid peroxides. Compound (I) is available from Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heter)
Chem.), Vol. 30, p. 267 (1993) or the following production method.
【００１９】[0019]
【化５】 Embedded image
【００２０】（式中、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異な
って、水素または低級アルキルを表し、Ｒ1 およびＲ2
は前記と同意義を表す） Ｒ3 およびＲ4 の定義における低級アルキルは前記と同
意義を表す。化合物（ＶＩ）は、化合物（ＩＶ）と化合
物（Ｖ）とを、炭酸カリウム等の塩基存在下、ジメチル
スルホキシド等の溶媒中、０℃から用いた溶媒の沸点の
間の温度で０．５〜１００時間反応させることにより得
ることができる。[0020] (wherein, R 3 and R 4 are the same or different, represent hydrogen or lower alkyl, R 1 and R 2
Represents the same meaning as described above) The lower alkyl in the definition of R 3 and R 4 has the same meaning as described above. The compound (VI) is obtained by mixing the compound (IV) and the compound (V) in the presence of a base such as potassium carbonate in a solvent such as dimethylsulfoxide at a temperature between 0 ° C. and the boiling point of the solvent used to form 0.5 to It can be obtained by reacting for 100 hours.
【００２１】原料化合物（ＩＶ）は、ジャーナル・オブ
・オーガニック・ケミストリー(J.Org. Chem.) 、２１
巻、１２４０頁（１９５６年）、ジャーナル・オブ・オ
ーガニック・ケミストリー(J. Org. Chem.) 、２９巻、
１９１５頁（１９６４年）、ケミーシュ・ベリヒテ(Che
m. Ber.)、９９巻、３４９２頁（１９６６年）等に記載
の方法あるいは下記に示す方法により得ることができ
る。The starting compound (IV) is a compound of Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 21.
Vol., 1240 (1956), Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), Vol. 29,
1915 (1964), Chemische Berichte (Che
m. Ber.), vol. 99, page 3492 (1966) and the like, or by the method shown below.
【００２２】[0022]
【化６】 [Chemical 6]
【００２３】（式中、Ｒ1 およびＲ2 は前記と同意義を
表す） 化合物（ＩＶ）は、化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）
とを、メタノール、エタノール等のアルコール等の溶媒
中、室温から用いた溶媒の沸点の間の温度で１分〜２４
時間反応させることにより得ることができる。原料化合
物（ＩＩ）は、市販品であるか、ケミーシュ・ベリヒテ
(Chem. Ber.)、９９巻、２９００頁（１９６６年）等に
記載の方法あるいはそれに準じて得ることができる。(Wherein R 1 and R 2 have the same meanings as described above) The compound (IV) is the compound (II) or the compound (III).
In a solvent such as alcohol such as methanol or ethanol at a temperature between room temperature and the boiling point of the solvent used for 1 minute to 24 minutes.
It can be obtained by reacting for a time. The raw material compound (II) is a commercially available product, or is Chemiche Berichte
(Chem. Ber.), 99, 2900 (1966) and the like, or can be obtained according to the method.
【００２４】化合物（ＩＶ）の中でＲ1 が置換スルフォ
ニルまたは置換スルフィニルである化合物（ＩＶａ）
は、化合物（ＩＶ）の中でＲ1 が置換チオである化合物
（ＩＶｂ）を、ジクロロメタン等の溶媒中、１分〜１２
時間、ｍ−クロロ過安息香酸等の酸化剤で処理すること
により得ることができる。化合物（Ｉ）は、化合物（Ｖ
Ｉ）とヒドラジンとを、メタノール、エタノール等のア
ルコール等の溶媒中、室温から用いた溶媒の沸点の間の
温度で１分〜１２時間反応させた後、得られた生成物を
２００〜３５０℃で１分〜１２時間加熱することにより
得ることができる。Compound (IVa) in which R 1 is substituted sulfonyl or substituted sulfinyl in the compound (IV)
Is a compound (IVb) in which R 1 is substituted thio in the compound (IV) in a solvent such as dichloromethane for 1 minute to 12 minutes.
It can be obtained by treating with an oxidizing agent such as m-chloroperbenzoic acid for a time. Compound (I) is a compound (V
I) and hydrazine are reacted in a solvent such as alcohol such as methanol or ethanol at a temperature between room temperature and the boiling point of the solvent used for 1 minute to 12 hours, and then the obtained product is heated at 200 to 350 ° C. It can be obtained by heating for 1 minute to 12 hours.
【００２５】上記製造法における中間体および目的化合
物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、
濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマト
グラフィー等に付して単離精製することができる。ま
た、中間体においては、特に精製することなく次の反応
に供することも可能である。また、化合物（Ｉ）の塩と
しては、酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等
の無機酸塩、およびマレイン酸塩、フマル酸塩、クエン
酸塩等の有機酸塩が、またアルカリ付加塩としては、ア
ンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、などがあげられ
る。また化合物（Ｉ）と水あるいは各種溶媒との付加物
も化合物（Ｉ）の塩として本発明に含有される。The intermediate and the target compound in the above-mentioned production method are separated and purified by a method commonly used in synthetic organic chemistry, for example,
It can be isolated and purified by filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, various types of chromatography and the like. In addition, the intermediate can be subjected to the next reaction without purification. Examples of the salt of compound (I) include acid addition salts, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate and phosphate, and organic acid salts such as maleate, fumarate and citrate. Examples of the alkali addition salt include ammonium salt, lithium salt, sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and the like. Further, an adduct of compound (I) with water or various solvents is also included in the present invention as a salt of compound (I).
【００２６】化合物（Ｉ）の具体例を第１表に示す。Specific examples of the compound (I) are shown in Table 1.
【００２７】[0027]
【表１】 [Table 1]
【００２８】なお、表中の化合物２、化合物３および化
合物８は、ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケ
ミストリー(J. Heterocycl. Chem.)、３０巻、２６７頁
（１９９３年）に記載の方法により得ることができる。
次に、本発明の定量方法について説明する。過酸化物の
定量においては、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ６〜１
０の緩衝液に既知量の化合物（Ｉ）もしくはその塩およ
び過酸化活性物質を溶解して試薬液とし、これに過酸化
物を含有する試料を加え、−１０〜９０℃、好ましくは
２０〜５０℃で反応させる。反応液中の発光シグナルを
測定し、あらかじめ既知量の過酸化物についての試験か
ら求めた検量線を利用して試料中の過酸化物を定量す
る。緩衝液としては、例えばリン酸塩、トリス−塩酸、
酢酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、ホウ酸塩、フタル酸
塩、グリシン、グッド等の緩衝剤の水溶液があげられ、
緩衝剤は０．００５〜２ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０
１〜０．５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．０２〜
０．２ｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。化合物（Ｉ）も
しくはその塩は０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ
／ｌ、好ましくは０．０５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度に
なるように調整する。過酸化活性物質は１０-8〜２００
ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度
になるように、例えばペルオキシダーゼを用いる場合は
１０-4〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０Ｕ／ｍ
ｌの濃度になるように調整する。Compound 2, compound 3 and compound 8 in the table are prepared by the method described in Journal of Heterocyclic Chemistry (J. Heterocycl. Chem.), Vol. 30, p. 267 (1993). Obtainable.
Next, the quantification method of the present invention will be described. In the determination of peroxide, pH 4 to 12, preferably pH 6 to 1
A known amount of compound (I) or a salt thereof and a peroxidative active substance is dissolved in a buffer solution of 0 to prepare a reagent solution, and a sample containing peroxide is added thereto, and the temperature is -10 to 90 ° C, preferably 20 to React at 50 ° C. The luminescence signal in the reaction solution is measured, and the peroxide in the sample is quantified using a calibration curve previously obtained from a test for a known amount of peroxide. Examples of the buffer solution include phosphate, Tris-hydrochloric acid,
Aqueous solutions of buffers such as acetate, succinate, oxalate, borate, phthalate, glycine, Good, etc.
The buffer is 0.005 to 2 mol / l, preferably 0.0
1-0.5 mol / l, more preferably 0.02-
Used at a concentration of 0.2 mol / l. Compound (I) or a salt thereof is 0.01 μmol / l to 100 mmol
/ L, preferably adjusted to a concentration of 0.05 to 20 mmol / l. Peroxide active substance is 10 -8 to 200
mg / ml, preferably 10 to 100 mg / ml, for example, when using peroxidase, 10 −4 to 100 U / ml, preferably 10 to 50 U / m.
Adjust to a concentration of 1.
【００２９】過酸化活性物質の定量においては、ｐＨ４
〜１２、好ましくはｐＨ６〜１０の緩衝液に既知量の化
合物（Ｉ）もしくはその塩および過酸化物を溶解して試
薬液とし、これに過酸化活性物質を含有する試料を加
え、−１０〜９０℃、好ましくは２０〜５０℃で反応さ
せる。反応液中の発光シグナルを測定し、あらかじめ既
知量の過酸化活性物質についての試験から求めた検量線
を利用して試料中の過酸化活性物質を定量する。緩衝液
の種類および緩衝液の濃度は過酸化物を定量する際と同
様である。化合物（Ｉ）もしくはその塩は０．０１μｍ
ｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０５〜
２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるように調整する。過酸化
物は０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ま
しくは０．０５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるように
調整する。In the determination of the peroxidative active substance, pH4
To 12, preferably pH 6 to 10, a known amount of compound (I) or a salt thereof and a peroxide is dissolved to prepare a reagent solution, to which a sample containing a peroxidative active substance is added, The reaction is performed at 90 ° C, preferably 20 to 50 ° C. The luminescence signal in the reaction solution is measured, and the peroxidatively active substance in the sample is quantified using a calibration curve previously obtained from a test for a known amount of peroxidatively active substance. The type of buffer solution and the concentration of the buffer solution are the same as in the determination of peroxide. Compound (I) or its salt is 0.01 μm
ol / l to 100 mmol / l, preferably 0.05 to
Adjust to a concentration of 20 mmol / l. The peroxide is adjusted to have a concentration of 0.01 μmol / l to 100 mmol / l, preferably 0.05 to 20 mmol / l.
【００３０】化合物（Ｉ）もしくはその塩の定量におい
ては、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ６〜１０の緩衝液
に既知量の過酸化物および過酸化活性物質を溶解して試
薬液とし、これに化合物（Ｉ）を含有する試料を加え、
−１０〜９０℃、好ましくは２０〜５０℃で反応させ
る。反応液中の発光シグナルを測定し、あらかじめ既知
量の化合物（Ｉ）についての試験から求めた検量線を利
用して試料中の化合物（Ｉ）を定量する。緩衝液の種類
および緩衝液の濃度は過酸化物を定量する際と同様であ
る。過酸化物は０．０１μｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ
／ｌ、好ましくは０．０５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度に
なるように調整する。過酸化活性物質は１０-8〜２００
ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度
になるように、例えばペルオキシダーゼを用いる場合は
１０-4〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０Ｕ／ｍ
ｌの濃度になるように調整する。In the quantification of compound (I) or a salt thereof, known amounts of peroxide and peroxide-active substance are dissolved in a buffer solution having a pH of 4 to 12, preferably pH 6 to 10 to prepare a reagent solution. Adding a sample containing (I),
The reaction is carried out at -10 to 90 ° C, preferably 20 to 50 ° C. The luminescence signal in the reaction solution is measured, and the compound (I) in the sample is quantified using a calibration curve previously obtained from a test for a known amount of compound (I). The type of buffer solution and the concentration of the buffer solution are the same as in the determination of peroxide. Peroxide is 0.01 μmol / l-100 mmol
/ L, preferably adjusted to a concentration of 0.05 to 20 mmol / l. Peroxide active substance is 10 -8 to 200
mg / ml, preferably 10 to 100 mg / ml, for example 10 −4 to 100 U / ml, preferably 10 to 50 U / m when using peroxidase.
Adjust to a concentration of 1.
【００３１】化合物（Ｉ）もしくはその塩、過酸化物お
よび過酸化活性物質のいずれの定量においても、反応液
には、必要に応じて、トリトンＸ−１００等の界面活性
剤を添加することもできる。また、必要に応じて、蛋白
質、ポリアルキル四級アミン、蛍光剤、ジメチルスルホ
キシド等をエンハンサーとして用いることができる。さ
らに、必要に応じて、アルカリ水溶液を添加することに
より発光反応を強化することもできる。蛋白質として
は、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清ア
ルブミン（ＨＳＡ）、ヒト免疫グロブリン、卵白アルブ
ミン等を使用することができる。ポリアルキル四級アミ
ンとしては、例えばポリジアリールジメチルアンモニウ
ムクロライド、ポリアルキルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロライド等を使用することができる。蛍光剤とし
ては、例えばフルオレッセイン、４−フルオロ−７−ニ
トロベンゾフラザン、７−フルオロ−４−ニトロベンゾ
キサジアゾールとアミン、クマリン化合物、アミノ酸、
ペプチドもしくは蛋白質との結合物あるいはこれらの誘
導体等を使用することができる。アルカリ水溶液として
は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶
液を使用することができる。エンハンサーの使用量は、
反応液の０．０００１〜１０重量％である。If necessary, a surfactant such as Triton X-100 may be added to the reaction solution in the determination of any of the compound (I) or its salt, the peroxide and the peroxide active substance. it can. In addition, proteins, polyalkyl quaternary amines, fluorescent agents, dimethyl sulfoxide and the like can be used as enhancers, if necessary. Furthermore, the luminescence reaction can be enhanced by adding an alkaline aqueous solution, if necessary. As the protein, for example, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), human immunoglobulin, ovalbumin, etc. can be used. As the polyalkyl quaternary amine, for example, polydiaryldimethylammonium chloride, polyalkyldimethylbenzylammonium chloride and the like can be used. Examples of the fluorescent agent include fluorescein, 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan, 7-fluoro-4-nitrobenzoxadiazole and amine, coumarin compound, amino acid,
Binders with peptides or proteins, their derivatives and the like can be used. As the alkaline aqueous solution, for example, an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like can be used. The amount of enhancer used is
It is 0.0001 to 10% by weight of the reaction liquid.
【００３２】本発明は、最終的に過酸化水素等の過酸化
物を測定することに基づくものであればいずれの診断上
の検査方法にも好適に応用できる。例えば、生体試料中
の基質から酵素を利用して化学量論的に過酸化水素を生
成させ、これを定量することにより基質の定量が行われ
ている。また生体試料中の酵素活性を測定するために適
当な酵素や基質を加えて酵素反応を行わせ生成する過酸
化水素の生成速度を測定することにより試料中の酵素活
性の定量が行われている。これらの具体例として、例え
ば特異的オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、ガラ
クトースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
ウリカーゼ等）の作用に基づいた、これらの基質の定量
や、モノアミンオキシダーゼ、コリンエステラーゼ等の
生体内酵素の活性測定に用いることができる。The present invention can be suitably applied to any diagnostic inspection method as long as it is based on the final measurement of peroxide such as hydrogen peroxide. For example, the substrate is quantified by producing hydrogen peroxide stoichiometrically from the substrate in a biological sample using an enzyme and quantifying the hydrogen peroxide. Also, in order to measure the enzyme activity in a biological sample, the enzyme activity in the sample is quantified by measuring the production rate of hydrogen peroxide produced by adding an appropriate enzyme or substrate to carry out an enzymatic reaction. . Specific examples of these include specific oxidases (glucose oxidase, galactose oxidase, cholesterol oxidase,
It can be used for the quantification of these substrates based on the action of uricase and the like, and the activity measurement of in vivo enzymes such as monoamine oxidase and cholinesterase.
【００３３】また、本発明は、酵素免疫測定法にも好適
に応用することができる。この場合の測定対象物質とし
ては、血清、尿等に含まれる薬物、ホルモンあるいは各
種疾患に由来する微量成分等である。免疫測定のための
方法としては、酵素免疫測定法、医学書院（１９８７年
版）に記載の各方法、例えば固定化した抗体に抗原を反
応させ、その抗原に例えばペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ等の酵素標識した抗体を反応させ、該酵
素活性自身または該酵素の作用により生成する過酸化水
素を定量する方法等をあげることができる。The present invention can also be suitably applied to the enzyme immunoassay method. In this case, the substance to be measured is a drug contained in serum, urine or the like, a hormone or a trace component derived from various diseases. As the method for immunoassay, enzyme immunoassay, each method described in Iin Shoin (1987 edition), for example, immobilized antibody is reacted with an antigen, and the antigen is labeled with an enzyme such as peroxidase or glucose oxidase. Examples include a method of reacting an antibody and quantifying hydrogen peroxide produced by the enzyme activity itself or the action of the enzyme.
【００３４】また、化合物（Ｉ）を例えば抗体の標識物
質として用い、抗原抗体反応を行わせることにより抗原
または抗体を定量することができる。さらに、本発明
は、ポリヌクレオチド測定法に応用することができる。
ポリヌクレオチド測定法としては、被検査ポリヌクレオ
チドと相補的に結合するポリヌクレオチドにペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素または化合物
（Ｉ）を標識し、被検ポリヌクレオチドと相補的に結合
した該酵素標識化または該化合物（Ｉ）標識化ポリヌク
レオチドの酵素活性を測定または標識化合物（Ｉ）を定
量して被検ポリヌクレオチド量を定量する方法があげら
れる。その方法は、ＤＮＡプローブ、ジスク（株）（１
９８８年版）、ＤＮＡプローブＩＩ、ジスク（株）（１
９９０年版）等に記載されている。The antigen or antibody can be quantified by using the compound (I) as a labeling substance for an antibody and carrying out an antigen-antibody reaction. Furthermore, the present invention can be applied to a polynucleotide measuring method.
As a method for measuring a polynucleotide, a polynucleotide that complementarily binds to a test polynucleotide is labeled with an enzyme such as peroxidase or glucose oxidase, or compound (I), and the enzyme is labeled with the test polynucleotide that complementarily binds. Alternatively, there may be mentioned a method of measuring the enzyme activity of the compound (I) -labeled polynucleotide or quantifying the labeled compound (I) to quantify the amount of the test polynucleotide. The method is a DNA probe, DISK Corporation (1
1988 edition), DNA probe II, DISK Corporation (1)
990 version) and the like.
【００３５】発光シグナルの測定は、一定時間の積算発
光量（発光強度）もしくは反応の終了までの積算発光量
を測定することにより行う。発光シグナルを測定する方
法としては、感光性写真フィルムを感光させて発光の強
度を記録する方法、光電子倍増管（Photomultiphier:通
称フォトマル）を用いた測定器で発光の強度を測定する
方法（生物発光と化学発光、今井一洋、廣川書店）、フ
ォトンカウンターを用いる方法等の一般によく用いられ
ている方法を適用することができる。The luminescence signal is measured by measuring the accumulated luminescence amount (luminescence intensity) for a certain period of time or the accumulated luminescence amount until the end of the reaction. As a method of measuring the luminescence signal, a method of exposing the photosensitive photographic film to record the intensity of the luminescence, a method of measuring the intensity of the luminescence with a measuring instrument using a photomultiplier (commonly known as Photomul) (biological Commonly used methods such as luminescence and chemiluminescence, Kazuhiro Imai, Hirokawa Shoten) and a method using a photon counter can be applied.
【００３６】次に、実施例によって本発明の態様を説明
する。Next, embodiments of the present invention will be described with reference to examples.
【００３７】[0037]
実施例１ ４−アミノ−３−メチルスルフィニル−１−フェニル−
１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３
−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合
物１）の合成 ５−アミノ−３−メチルチオ−１−フェニルピラゾー
ル−４−カルボニトリルの合成 ビス（メチルチオ）メチレンプロパンジニトリル１７．
０ｇ（１００ｍｍｏｌ）、フェニルヒドラジン１０．８
ｇ（１００ｍｍｏｌ）およびエタノール８０ｍｌの混合
物を２時間加熱還流した。溶媒を留去した後、残渣にエ
タノール２０ｍｌを加えて結晶化させ、吸引濾取するこ
とにより、目的物を融点１３６〜１３７℃の無色針状晶
として２０．９ｇ（９．１ｍｍｏｌ）得た（収率９１
％）。Example 1 4-amino-3-methylsulfinyl-1-phenyl-
1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3
-D] Synthesis of pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (Compound 1) Synthesis of 5-amino-3-methylthio-1-phenylpyrazole-4-carbonitrile Bis (methylthio) methylenepropanedinitrile 17.
0 g (100 mmol), phenylhydrazine 10.8
A mixture of g (100 mmol) and 80 ml of ethanol was heated under reflux for 2 hours. After the solvent was distilled off, 20 ml of ethanol was added to the residue for crystallization, and suction filtration was performed to obtain 20.9 g (9.1 mmol) of the desired product as colorless needle crystals having a melting point of 136 to 137 ° C ( Yield 91
%).
【００３８】ジメチル ４−アミノ−３−メチルチオ
−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ
ン−５，６−ジカルボキシラートの合成 ５−アミノ−３−メチルチオ−１−フェニルピラゾール
−４−カルボニトリル１１．５ｇ（５０ｍｍｏｌ）、無
水炭酸カリウム２０．８ｇ（１４５ｍｍｏｌ）およびジ
メチルスルホキシド３００ｍｌの混合物中に、ジメチル
アセチレンジカルボキシラート９．０ｇ（６３ｍｍｏ
ｌ）のジメチルスルホキシド（２０ｍｌ）溶液を氷冷下
撹拌滴下し、さらに、室温で６０時間撹拌した。このと
き、反応液は褐色から緑色を帯びた褐色に変化した。反
応終了後、反応混合液を氷水５００ｍｌ中に注ぎ出し、
３０分間室温で撹拌した。析出した黒褐色の固形物を取
り出し、メタノール２０ｍｌを加えて少し加熱した。得
られた白色結晶を吸引濾取し、メタノールから再結晶す
ることにより、目的物を融点１２０〜１２２℃の無色針
状晶として４．８０ｇ（１２．９ｍｍｏｌ）得た。Synthesis of dimethyl 4-amino-3-methylthio-1-phenyl-1H-pyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 5-amino-3-methylthio-1-phenylpyrazole- In a mixture of 11.5 g (50 mmol) of 4-carbonitrile, 20.8 g (145 mmol) of anhydrous potassium carbonate and 300 ml of dimethyl sulfoxide, 9.0 g (63 mmo of dimethyl acetylenedicarboxylate) was added.
A solution of l) in dimethyl sulfoxide (20 ml) was added dropwise with stirring under ice cooling, and the mixture was further stirred at room temperature for 60 hours. At this time, the reaction liquid changed from brown to greenish brown. After the reaction was completed, the reaction mixture was poured into 500 ml of ice water,
Stir for 30 minutes at room temperature. The precipitated blackish brown solid was taken out, 20 ml of methanol was added, and the mixture was heated for a while. The obtained white crystals were collected by suction filtration and recrystallized from methanol to obtain 4.80 g (12.9 mmol) of the desired product as colorless needle crystals having a melting point of 120 to 122 ° C.
【００３９】ジメチル ４−アミノ−３−メチルスル
フィニル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［２，３−
ｂ］ピリジン−５，６−ジカルボキシラートの合成 ジメチル ４−アミノ−３−メチルチオ−１−フェニル
−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５，６−ジ
カルボキシラート３．７４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジクロ
ロメタン（５０ｍｌ）溶液に７０％ｍ−クロロ過安息香
酸２．４３ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０
ｍｌ）溶液を２０分間で添加し、混合物を３０分間激し
く撹拌した。溶媒を留去した後、残渣をメタノールで洗
浄することにより、目的物を無色固体として３．２６ｇ
（８．４０ｍｍｏｌ）得た（収率８４％）。さらに、メ
タノールから再結晶することにより、融点１４６〜ｌ４
８℃の無色針状晶を得た。Dimethyl 4-amino-3-methylsulfinyl-1-phenyl-1H-pyrazolo [2,3-
b] Synthesis of pyridine-5,6-dicarboxylate Dimethyl 4-amino-3-methylthio-1-phenyl-1H-pyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 3.74 g (10 mmol) ) In dichloromethane (50 ml) in 70% m-chloroperbenzoic acid 2.43 g (10 mmol) in dichloromethane (20
ml) solution was added in 20 minutes and the mixture was vigorously stirred for 30 minutes. After distilling off the solvent, the residue was washed with methanol to obtain 3.26 g of the desired product as a colorless solid.
(8.40 mmol) was obtained (84% yield). Furthermore, by recrystallizing from methanol, the melting point is 146 to 14
Colorless needle crystals were obtained at 8 ° C.
【００４０】４−アミノ−３−メチルスルフィニル−
１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］
ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７
Ｈ）ジオン（化合物１）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−メチルスルフィニル−１−
フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［２，３−ｂ］ピリジン−
５，６−ジカルボキシラート０．３８８ｇ（１．０ｍｍ
ｏｌ）およびヒドラジンヒドラート５ｍｌをメタノール
５０ｍｌに加え、２時間加熱還流した。反応終了後、メ
タノールおよび過剰のヒドラジンヒドラートを留去し
た。残渣にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾
取して固体を得た。得られた生成物をホットプレートを
使用して２５０〜３００℃で３０分間加熱し、メタノー
ルでよく洗浄することにより、目的物を粉状化合物とし
て０．３ｌ２ｇ（０．８８ｍｍｏｌ）得た（収率８８
％）。さらに、ジメチルスルホキシドおよびメタノール
の混合溶液から再結晶することにより、融点３６０℃以
上の無色結晶を得た。4-amino-3-methylsulfinyl-
1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6]
Pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7
H) Synthesis of dione (Compound 1) Dimethyl 4-amino-3-methylsulfinyl-1-
Phenyl-1H-pyrazolo [2,3-b] pyridine-
0.38 g (1.0 mm) of 5,6-dicarboxylate
ol) and 5 ml of hydrazine hydrate were added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and the solid was collected by suction filtration. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate and thoroughly washed with methanol to obtain 0.312 g (0.88 mmol) of the desired product as a powdery compound (yield 88
%). Further, recrystallization from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol gave colorless crystals having a melting point of 360 ° C or higher.
【００４１】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４２０，３３２
０，３１７０，３１００−２８００（ｂｒｏａｄ），１
６５０（ＣＯ），１５９０，１５６５，１５００． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２４６，２９９，
３４６；λｍｉｎ ｎｍ：２２０，２８０，３２０． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：３．０９（３Ｈ，ｓ，Ｓ
ＯＣＨ3 ），７．３ｌ−７．６８（３Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5
−Ｈ），８．２３−８．４０（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ 5 −
Ｈ），８．８１（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１
０．０７（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１０．６
５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１１．５８（１
Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：３５７（Ｍ+ ＋１，２２），
３５６（Ｍ+ ，１００），３４ｌ（７２），３４０（６
５），３０７（１９），２９３（１５）．IR (KBr) νcm-1: 3420, 332
0, 3170, 3100-2800 (broad), 1
650 (CO), 1590, 1565, 1500. UV (ethanol) λ max nm: 246, 299,
346; λ min nm: 220, 280, 320. NMR (DMSO-d6) Δ: 3.09 (3H, s, S
OCHThree), 7.3l-7.68 (3H, m, C6HFive
-H), 8.23-8.40 (2H, m, C6H Five−
H), 8.81 (1H, brs, NH or OH), 1
0.07 (1H, brs, NH or OH), 10.6
5 (1H, brs, NH or OH), 11.58 (1
H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 357 (M++1,22),
356 (M+, 100), 34l (72), 340 (6
5), 307 (19), 293 (15).
【００４２】実施例２ ４−アミノ−１−フェニル−３−（チオフェン−２−イ
ル）−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド
［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオ
ン（化合物４）の合成 ５−アミノ−１−フェニル−３−（チオフェン−２−
イル）ピラゾール−４−カルボニトリルの合成 メチルチオ（チオフェン−２−イル）メチレンプロパン
ジニトリル２．０６ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびフェニル
ヒドラジン１．１ｇ（１０ｍｍｏｌ）を用い、実施例１
と同様にして、融点１６５〜１６７℃の目的物を得
た。Example 2 4-Amino-1-phenyl-3- (thiophen-2-yl) -1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5, Synthesis of 8 (6H, 7H) dione (Compound 4) 5-Amino-1-phenyl-3- (thiophen-2-
Synthesis of (yl) pyrazole-4-carbonitrile Using 2.06 g (10 mmol) of methylthio (thiophen-2-yl) methylenepropanedinitrile and 1.1 g (10 mmol) of phenylhydrazine, Example 1
Similarly to the above, the target compound having a melting point of 165 to 167 ° C. was obtained.
【００４３】ジメチル ４−アミノ−ｌ−フェニル−
３−（チオフェン−２−イル）ピラゾロ［３，４−ｂ］
ピリジン−５，６−ジカルボキシラートの合成 ５−アミノ−１−フェニル−３−（チオフェン−２−イ
ル）ピラゾール−４−カルボニトリル２．６６ｇ（１０
ｍｍｏｌ）、無水炭酸カリウム２７．６ｇ（２００ｍｍ
ｏｌ）およびジメチルスルホキシド３００ｍｌの混合物
中に、ジメチルアセチレンジカルボキシラート１０．０
ｇ（７０ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（２０ｍ
ｌ）溶液を氷冷下３０分間で滴下し、さらに、室温で６
０時間撹拌した。このとき、反応液は褐色から緑色を帯
びた褐色に変化した。反応終了後、反応混合液を氷水５
００ｍｌ中に注ぎ出し、３０分間室温で撹拌した。析出
した黒褐色の固形物を濾取して風乾後、メタノール２０
ｍｌに添加した。白色結晶を濾取し、メタノールから再
結晶することにより、目的物を融点１７８〜１８０℃の
無色結晶として３．５０ｇ得た。Dimethyl 4-amino-1-phenyl-
3- (thiophen-2-yl) pyrazolo [3,4-b]
Synthesis of pyridine-5,6-dicarboxylate 5-amino-1-phenyl-3- (thiophen-2-yl) pyrazole-4-carbonitrile 2.66 g (10
mmol), 27.6 g of anhydrous potassium carbonate (200 mm
ol) and 300 ml of dimethylsulfoxide in a mixture of dimethylacetylene dicarboxylate 10.0
g (70 mmol) of dimethyl sulfoxide (20 m
l) The solution was added dropwise under ice-cooling for 30 minutes, and further, at room temperature,
Stir for 0 hours. At this time, the reaction liquid changed from brown to greenish brown. After the reaction was completed, the reaction mixture was mixed with ice water 5
Poured into 00 ml and stirred for 30 minutes at room temperature. The black-brown solid that precipitated was collected by filtration, air-dried, and then methanol 20
ml. White crystals were collected by filtration and recrystallized from methanol to obtain 3.50 g of the desired product as colorless crystals having a melting point of 178 to 180 ° C.
【００４４】４−アミノ−ｌ−フェニル−３−（チオ
フェン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：
５，６］ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６
Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物４）の合成 ジメチル ４−アミノ−１−フェニル−３−（チオフェ
ン−２−イル）ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５，
６−ジカルボキシラート０．３４ｇ（１．０ｍｍｏｌ）
およびヒドラジンヒドラート５ｍｌをメタノール５０ｍ
ｌに加え、２時間加熱還流した。反応終了後、メタノー
ルおよび過剰のヒドラジンヒドラートを留去した。残渣
にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾取して固
体を得た。得られた生成物をホットプレートを使用して
２５０〜３００℃で３０分間加熱し、メタノールでよく
洗浄することにより、目的物を粉状化合物として０．３
４２ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）得た（収率９１％）。さら
に、ジメチルスルホキシドおよびメタノールの混合溶液
から再結晶することにより、融点３５５〜３６６℃の無
色針状結晶を得た。4-Amino-1-phenyl-3- (thiophen-2-yl) -1H-pyrazolo [4 ', 3':
5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6
Synthesis of (H, 7H) dione (Compound 4) Dimethyl 4-amino-1-phenyl-3- (thiophen-2-yl) pyrazolo [3,4-b] pyridine-5,
0.34 g (1.0 mmol) of 6-dicarboxylate
And 5 ml of hydrazine hydrate with 50 m of methanol
It was heated to reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and the solid was collected by suction filtration. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate and thoroughly washed with methanol to give the target product as a powdery compound in an amount of 0.3.
42 g (0.91 mmol) was obtained (yield 91%). Further, recrystallization from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol gave colorless needle crystals having a melting point of 355 to 366 ° C.
【００４５】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４５０，３２５
０，３１７０（ＮＨまたはＯＨ），３０００（ｂｒｏａ
ｄ），１６５０（ＣＯ），ｌ５９５，１４９０，１３７
０． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２４０，３０９，
３４３，３５０；λｍｉｎ ｎｍ：２１５，３１０，３
３０． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：７．２５−７．６８（５
Ｈ，ｍ，Ｃ4 Ｈ3 Ｓ−ＨおよびＣ6 Ｈ5 −Ｈ），７．７
９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，５．０Ｈｚ，５’−
Ｈ），８．３０−８．４１（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −
Ｈ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：３７７（Ｍ+ ＋１，２５），
３７６（Ｍ+ ，１００），２９１（１４），７７
（６）．IR (KBr) νcm −1 : 3450,325
0,3170 (NH or OH), 3000 (broa
d), 1650 (CO), 1595, 1490, 137
0. UV (ethanol) λ max nm: 240, 309,
343, 350; λ min nm: 215, 310, 3
30. NMR (DMSO-d 6) δ : 7.25-7.68 (5
H, m, C 4 H 3 S-H and C 6 H 5 -H), 7.7
9 (1H, dd, J = 1.2, 5.0Hz, 5'-
H), 8.30-8.41 (2H, m , C 6 H 5 -
H). LR-MS m / z (%): 377 (M ++ 1,25),
376 (M + , 100), 291 (14), 77
(6).
【００４６】実施例３ ４−アミノ−３−メチルチオ−１−フェニル−１Ｈ−ピ
ラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３−ｄ］ピ
リダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物５）の
合成 実施例１で得られたジメチル ４−アミノ−３−メチ
ルチオ−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］
ピリジン−５，６−ジカルボキシラート０．３７ｇ
（１．０ｍｍｏｌ）およびヒドラジンヒドラート５ｍｌ
をメタノール５０ｍｌに加え、２時間加熱還流した。反
応終了後、メタノールおよび過剰のヒドラジンヒドラー
トを留去した。残渣にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄
し、吸引濾取して黄色針状晶を得た。得られた生成物を
ホットプレートを使用して２５０〜３００℃で３０分間
加熱した。このとき、化合物の色は黄色からほとんど無
色に変化した。この生成物をメタノールでよく洗浄する
ことにより、目的物を融点３５３〜３５８℃（分解）の
粉状化合物として０．３ｌ３ｇ（０．９２ｍｍｏｌ）得
た（収率９２％）。Example 3 4-Amino-3-methylthio-1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) Synthesis of dione (Compound 5) Dimethyl 4-amino-3-methylthio-1-phenyl-1H-pyrazolo [3,4-b] obtained in Example 1.
Pyridine-5,6-dicarboxylate 0.37 g
(1.0 mmol) and 5 ml of hydrazine hydrate
Was added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate. At this time, the color of the compound changed from yellow to almost colorless. The product was thoroughly washed with methanol to obtain 0.313 g (0.92 mmol) of the desired product as a powdery compound having a melting point of 353 to 358 ° C (decomposition) (yield 92%).
【００４７】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３５００，３４２
５，３２６０，３１６０，３０５０（ｂｒｏａｄ），２
９５０，１６５０（ＣＯ），１５９５，１５７５，１５
００，１３７０． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２３５，２５５，
２９７，３０４；λｍｉｎ ｎｍ：２０８，２２５，２
５０． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：２．７６（３Ｈ，ｓ，Ｓ
ＣＨ3 ），７．２２−７．６４（３Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −
Ｈ），８．２６−８．４０（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5−
Ｈ），９．８１（２Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１
１．５５（２Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：３４１（Ｍ+ ＋１，２１），
３４０（Ｍ+ ，１００），３２５（４），３０８
（６），３０７（３０），２９３（７），７７（１
８），４４（８）．IR (KBr) νcm −1 : 3500, 342
5,3260,3160,3050 (broad), 2
950, 1650 (CO), 1595, 1575, 15
00, 1370. UV (ethanol) λ max nm: 235, 255,
297, 304; λ min nm: 208, 225, 2
50. NMR (DMSO-d 6) δ : 2.76 (3H, s, S
CH 3), 7.22-7.64 (3H, m, C 6 H 5 -
H), 8.26-8.40 (2H, m , C 6 H 5 -
H), 9.81 (2H, brs, NH or OH), 1
1.55 (2H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 341 (M + +1,21),
340 (M + , 100), 325 (4), 308
(6), 307 (30), 293 (7), 77 (1
8), 44 (8).
【００４８】実施例４ ４−アミノ−３−メタンスルフォニル−１−フェニル−
１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３
−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合
物６）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−メタンスルフォニル−１
−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−
５，６−ジカルボキシラートの合成 実施例１で得られたジメチル ４−アミノ−３−メチ
ルチオ−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］
ピリジン−５，６−ジカルボキシラート３．７４ｇ（１
０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液に７０
％ｍ−クロロ過安息香酸５．８２ｇ（２４ｍｍｏｌ）の
ジクロロメタン（４０ｍｌ）溶液を２０分間で添加し、
混合物を１時間激しく撹拌した。溶媒を留去した後、残
渣をメタノールで洗浄することにより、目的物を無色固
体として３．１８ｇ（７．８７ｍｍｏｌ）得た（収率７
９％）。さらに、メタノールから再結晶することによ
り、融点１８７〜１８９℃の無色針状晶を得た。Example 4 4-amino-3-methanesulfonyl-1-phenyl-
1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3
Synthesis of -d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (Compound 6) Dimethyl 4-amino-3-methanesulfonyl-1
-Phenyl-1H-pyrazolo [3,4-b] pyridine-
Synthesis of 5,6-dicarboxylate Dimethyl 4-amino-3-methylthio-1-phenyl-1H-pyrazolo [3,4-b] obtained in Example 1
Pyridine-5,6-dicarboxylate 3.74 g (1
0 mmol) in dichloromethane (50 ml) in 70
% M-chloroperbenzoic acid 5.82 g (24 mmol) in dichloromethane (40 ml) was added over 20 minutes,
The mixture was vigorously stirred for 1 hour. After the solvent was distilled off, the residue was washed with methanol to obtain 3.18 g (7.87 mmol) of the desired product as a colorless solid (yield 7
9%). Further, by recrystallization from methanol, colorless needle crystals having a melting point of 187 to 189 ° C. were obtained.
【００４９】４−アミノ−３−メタンスルフォニル−
１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］
ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７
Ｈ）ジオン（化合物６）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−メタンスルフォニル−１−
フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−
５，６−ジカルボキシラート０．４０４ｇ（１．０ｍｍ
ｏｌ）およびヒドラジンヒドラート５ｍｌをメタノール
５０ｍｌに加え、２時間加熱還流した。反応終了後、メ
タノールおよび過剰のヒドラジンヒドラートを留去し
た。残渣にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾
取して黄色針状晶を得た。得られた生成物をホットプレ
ートを使用して２５０〜３００℃で３０分間加熱し、メ
タノールでよく洗浄することにより、目的物を粉状化合
物として０．３３５ｇ（０．９０ｍｍｏｌ）得た（収率
９０％）。さらに、ジメチルスルホキシドおよびメタノ
ールの混合溶液から再結晶することにより、融点３６０
℃以上の無色結晶を得た。4-amino-3-methanesulfonyl-
1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6]
Pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7
H) Synthesis of dione (Compound 6) Dimethyl 4-amino-3-methanesulfonyl-1-
Phenyl-1H-pyrazolo [3,4-b] pyridine-
0.46 g (1.0 mm) of 5,6-dicarboxylate
ol) and 5 ml of hydrazine hydrate were added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate and thoroughly washed with methanol to obtain 0.335 g (0.90 mmol) of the desired product as a powdery compound (yield 90%). Further, by recrystallizing from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol, the melting point of 360
Colorless crystals above ℃ were obtained.
【００５０】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３３８０，３２０
０，３０００，２９２０，１６５０（ＣＯ），１３６
６，１３１０，１１３０，５６０． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２４６，３００，
３４５；λｍｉｎ ｎｍ：２２０，２７５，２９０． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：３．６１（３Ｈ，ｓ，Ｓ
Ｏ2 ＣＨ3 ），７．４５−７．７２（３Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ
5 −Ｈ），８．１５（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯ
Ｈ），８．２３−８．３４（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −
Ｈ），１０．３１（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），
ｌｌ．１８（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：３７３（Ｍ+ ＋１，２０），
３７２（Ｍ+ 、ｌ００），ｌ９９（１３），７８（４
３），７７（２３），６９（１２），６３（４３）．IR (KBr) νcm −1 : 3380,320
0, 3000, 2920, 1650 (CO), 136
6, 1310, 1130, 560. UV (ethanol) λ max nm: 246, 300,
345; λ min nm: 220, 275, 290. NMR (DMSO-d 6) δ : 3.61 (3H, s, S
O 2 CH 3), 7.45-7.72 ( 3H, m, C 6 H
5- H), 8.15 (1H, brs, NH or O
H), 8.23-8.34 (2H, m , C 6 H 5 -
H), 10.31 (1H, brs, NH or OH),
ll. 18 (1H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 373 (M + +1,20),
372 (M + , 100), 199 (13), 78 (4
3), 77 (23), 69 (12), 63 (43).
【００５１】実施例５ ４−アミノ−３−（ベンゾチオフェン−２−イル）−１
−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピ
リド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）
ジオン（化合物７）の合成 ５−アミノ−３−（ベンゾチオフェン−２−イル）−
１−フェニルピラゾール−４−カルボニトリルの合成 （ベンゾチオフェン−２−イル）（メチルチオ）メチレ
ンプロパンジニトリル２．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）およ
びフェニルヒドラジン１．１ｇ（１０ｍｍｏｌ）を用
い、実施例１と同様にして、融点２６０〜２６２℃の
目的物を得た。Example 5 4-Amino-3- (benzothiophen-2-yl) -1
-Phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H)
Synthesis of dione (Compound 7) 5-Amino-3- (benzothiophen-2-yl)-
Synthesis of 1-phenylpyrazole-4-carbonitrile In the same manner as in Example 1 using 2.56 g (10 mmol) of (benzothiophen-2-yl) (methylthio) methylenepropanedinitrile and 1.1 g (10 mmol) of phenylhydrazine. Thus, the target product having a melting point of 260 to 262 ° C. was obtained.
【００５２】ジメチル ４−アミノ−３−（ベンゾチ
オフェン−２−イル）ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
−５，６−ジカルボキシラートの合成 ５−アミノ−３−（ベンゾチオフェン−２−イル）−１
−フェニルピラゾール−４−カルボニトリル３．１６ｇ
（１０ｍｍｏｌ）およびジメチルアセチレンジカルボキ
シラート１．４２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を用い、実施例２
と同様にして、融点２１８〜２２０℃の目的物を得
た。Synthesis of dimethyl 4-amino-3- (benzothiophen-2-yl) pyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 5-amino-3- (benzothiophen-2-yl) ) -1
-Phenylpyrazole-4-carbonitrile 3.16 g
Example 10 using (10 mmol) and 1.42 g (10 mmol) of dimethyl acetylenedicarboxylate.
In the same manner as described above, a target product having a melting point of 218 to 220 ° C was obtained.
【００５３】４−アミノ−３−（ベンゾチオフェン−
２−イル）−１−フェニル−ｌＨ−ピラゾロ［４' ，
３' ：５，６］ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，
８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物７）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−（ベンゾチオフェン−２−
イル）−１−フェニルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
−５，６−ジカルボキシラート０．４５８ｇ（１．０ｍ
ｍｏｌ）およびヒドラジンヒドラート５ｍｌをメタノー
ル５０ｍｌに加え、２時間加熱還流した。反応終了後、
メタノールおよび過剰のヒドラジンヒドラートを留去し
た。残渣にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾
取して黄色針状晶を得た。得られた生成物をホットプレ
ートを使用して２５０〜３００℃で３０分間加熱し、メ
タノールでよく洗浄することにより、目的物を粉状化合
物として０．４０５ｇ（０．９５ｍｍｏｌ）得た（収率
９５％）。さらに、ジメチルスルホキシドおよびメタノ
ールの混合溶液から再結晶することにより、融点３５０
〜３６１℃の無色粉状化合物を得た。4-amino-3- (benzothiophene-
2-yl) -1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ′,
3 ′: 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,
Synthesis of 8 (6H, 7H) dione (Compound 7) Dimethyl 4-amino-3- (benzothiophene-2-
Yl) -1-phenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 0.458 g (1.0 m
mol) and 5 ml of hydrazine hydrate were added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After the reaction,
Methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate and thoroughly washed with methanol to obtain 0.405 g (0.95 mmol) of the desired product as a powdery compound (yield 95%). Further, by recrystallization from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol, the melting point of 350
A colorless powdery compound of ˜361 ° C. was obtained.
【００５４】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４３０，３１７
０，３０００（ｂｒｏａｄ），１６５０（ＣＯ），１６
００，１４９０，１３６５，８０５． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２３１，３１７；
λｍｉｎ ｎｍ：２１５，３０５． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：７．２８−７．６８（５
Ｈ，ｍ，芳香環−Ｈ），７．９２−８．１１（２Ｈ，
ｍ，芳香環−Ｈ），７．９２（１Ｈ，ｓ，３’−Ｈ），
８．２３−８．４３（２Ｈ，ｍ，芳香環−Ｈ），９．９
７（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），ｌｌ．０２（２
Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：４２６（Ｍ+ ，８），２７８
（８），２５６（５），４５（１００）．IR (KBr) νcm -1 : 3430,317
0, 3000 (broad), 1650 (CO), 16
00, 1490, 1365, 805. UV (ethanol) λ max nm: 231,317;
λmin nm: 215, 305. NMR (DMSO-d 6) δ : 7.28-7.68 (5
H, m, aromatic ring-H), 7.92-8.11 (2H,
m, aromatic ring-H), 7.92 (1H, s, 3'-H),
8.23-8.43 (2H, m, aromatic ring-H), 9.9
7 (1H, brs, NH or OH), ll. 02 (2
H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 426 (M + , 8), 278.
(8), 256 (5), 45 (100).
【００５５】実施例６ ４−アミノ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾ
ロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３−ｄ］ピリダ
ジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物９）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−メチル−２−フェニルピ
ラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５，６−ジカルボキシ
ラートの合成 ５−アミノ−３−メチルピラゾール−４−カルボニトリ
ル [J. Org. Chem., 21, 1240(1956)]３．９６ｇ（２０
ｍｍｏｌ）およびジメチルアセチレンジカルボキシラー
ト２．８４ｇ（２０ｍｍｏｌ）を用い、実施例２と同
様にして、融点１９０〜１９１℃の目的物を得た。Example 6 4-Amino-3-methyl-1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) Synthesis of dione (Compound 9) Synthesis of dimethyl 4-amino-3-methyl-2-phenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 5-Amino-3-methylpyrazole-4- Carbonitrile [J. Org. Chem., 21, 1240 (1956)] 3.96 g (20
mmol) and 2.84 g (20 mmol) of dimethyl acetylenedicarboxylate were obtained in the same manner as in Example 2 to obtain the desired product having a melting point of 190 to 191 ° C.
【００５６】４−アミノ−３−メチル−１−フェニル
−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，
３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化
合物９）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−メチル−１−フェニルピラ
ゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５，６−ジカルボキシラ
ート０．３４ｇ（１．０ｍｍｏｌ）およびヒドラジンヒ
ドラート５ｍｌをメタノール５０ｍｌに加え、２時間加
熱還流した。反応終了後、メタノールおよび過剰のヒド
ラジンヒドラートを留去した。残渣にメタノール２０ｍ
ｌを加えて洗浄し、吸引濾取して黄色針状晶を得た。得
られた生成物をホットプレートを使用して２５０〜３０
０℃で３０分間加熱し、メタノールでよく洗浄すること
により、目的物を粉状化合物として０．２６２ｇ（０．
８５ｍｍｏｌ）得た（収率８５％）。さらに、ジメチル
スルホキシドおよびメタノールの混合溶液から再結晶す
ることにより、融点３４０〜３４２℃の淡黄色針状結晶
を得た。4-Amino-3-methyl-1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,2]
Synthesis of 3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (Compound 9) Dimethyl 4-amino-3-methyl-1-phenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxy 0.34 g (1.0 mmol) of phthalate and 5 ml of hydrazine hydrate were added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20m methanol to the residue
1 was added for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. 250-30 the obtained product using a hot plate
By heating at 0 ° C. for 30 minutes and washing well with methanol, 0.262 g (0.
85 mmol) was obtained (yield 85%). Further, by recrystallization from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol, pale yellow needle crystals having a melting point of 340 to 342 ° C were obtained.
【００５７】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４８０，３４０
０，３２８０，３０００（ｂｒｏａｄ），１６４０（Ｃ
Ｏ），ｌ５９５，１５００． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２５４，３４５；
λｍｉｎ ｎｍ：２２０，３００． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：２．７４（３Ｈ，ｓ，Ｃ
Ｈ3 ），７．１８−７．７２（３Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −
Ｈ），８．２６−８．４０（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −
Ｈ），９．９０（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１
０．８２（２Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：３０９（Ｍ+ ＋１，１７），
３０８（Ｍ+ ，８６），２５６（５），２３（８），４
５（１００）．IR (KBr) νcm -1 : 3480,340
0,3280,3000 (broad), 1640 (C
O), 1595, 1500. UV (ethanol) λ max nm: 254, 345;
λmin nm: 220, 300. NMR (DMSO-d 6) δ : 2.74 (3H, s, C
H 3), 7.18-7.72 (3H, m, C 6 H 5 -
H), 8.26-8.40 (2H, m , C 6 H 5 -
H), 9.90 (1H, brs, NH or OH), 1
0.82 (2H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 309 (M + +1,17),
308 (M + , 86), 256 (5), 23 (8), 4
5 (100).
【００５８】実施例７ ４−アミノ−１，３−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾロ
［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３−ｄ］ピリダジ
ン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物１０）の合成 ジメチル ４−アミノ−１，３−ジフェニルピラゾロ
［３，４−ｂ］ピリジン−５，６−ジカルボキシラート
の合成 ５−アミノ−１，３−ジフェニルピラゾール−４−カル
ボニトリル [J. Org.Chem., 29, 1915(1964)]２．６０
ｇ（１０ｍｍｏｌ）およびジメチルアセチレンジカルボ
キシラート１．４２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を用い、実施例
２と同様にして、融点２７７〜２７９℃の目的物を得
た。Example 7 4-Amino-1,3-diphenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione ( Synthesis of compound 10) Synthesis of dimethyl 4-amino-1,3-diphenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 5-amino-1,3-diphenylpyrazole-4-carbonitrile [J. Org. Chem., 29, 1915 (1964)] 2.60
g (10 mmol) and 1.42 g (10 mmol) of dimethylacetylene dicarboxylate were used in the same manner as in Example 2 to obtain the desired product having a melting point of 277 to 279 ° C.
【００５９】４−アミノ−１，３−ジフェニル−１Ｈ
−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３−
ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物
１０）の合成 ジメチル ４−アミノ−１，３−ジフェニルピラゾロ
［３，４−ｂ］ピリジン−５，６−ジカルボキシラート
０．４０２ｇ（１．０ｍｍｏｌ）およびヒドラジンヒド
ラート５ｍｌをメタノール５０ｍｌに加え、２時間加熱
還流した。反応終了後、メタノールおよび過剰のヒドラ
ジンヒドラートを留去した。残渣にメタノール２０ｍｌ
を加えて洗浄し、吸引濾取して黄色針状晶を得た。得ら
れた生成物をホットプレートを使用して２５０〜３００
℃で３０分間加熱し、メタノールでよく洗浄することに
より、目的物を粉状化合物として０．３１５ｇ（０．８
５ｍｍｏｌ）得た（収率８５％）。さらに、ジメチルス
ルホキシドおよびメタノールの混合溶液から再結晶する
ことにより、融点３５８〜３６８℃の無色粉状化合物を
得た。4-amino-1,3-diphenyl-1H
-Pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-
d] Synthesis of pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (Compound 10) Dimethyl 4-amino-1,3-diphenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 0.402g (1.0 mmol) and 5 ml of hydrazine hydrate were added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml methanol to the residue
Was added and washed, and suction filtration was performed to obtain yellow needle crystals. 250-300 the obtained product using a hot plate
By heating for 30 minutes at ℃ and washing well with methanol, 0.315 g (0.8
5 mmol) was obtained (yield 85%). Further, by recrystallization from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol, a colorless powdery compound having a melting point of 358 to 368 ° C. was obtained.
【００６０】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４７０，３４０
５，３１８０，３０００（ｂｒｏａｄ），１６５０（Ｃ
Ｏ），ｌ４９５，１４９０． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２３５，２５５，
３４６；λｍｉｎ ｎｍ：２１５，２４０，３００． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：６．５０（ｌＨ，ｂｒ
ｓ，ＮＨ），７．２５−７．８５（８Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5
−Ｈ），８．３２−８．４５（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5−
Ｈ），１０．６４（ｌＨ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），
１１．２４（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：３７ｌ（Ｍ+ ＋１，２２），
３７０（Ｍ+ ，１００），２８５（１０），８３（１
１），４５（４９），４４（２５）．IR (KBr) νcm −1 : 3470,340
5,3180,3000 (broad), 1650 (C
O), 1495, 1490. UV (ethanol) λ max nm: 235, 255,
346; λ min nm: 215, 240, 300. NMR (DMSO-d 6) δ : 6.50 (lH, br
s, NH), 7.25-7.85 (8H , m, C 6 H 5
-H), 8.32-8.45 (2H, m , C 6 H 5 -
H), 10.64 (lH, brs, NH or OH),
11.24 (1H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 37l (M ++ 1,22),
370 (M + , 100), 285 (10), 83 (1
1), 45 (49), 44 (25).
【００６１】実施例８ ４−アミノ−３−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１
−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピ
リド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）
ジオン（化合物１１）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−（ｐ−ジメチルアミノフ
ェニル）−１−フェニルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ
ン−５，６−ジカルボキシラートの合成 ５−アミノ−３−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１
−フェニルピラゾール−４−カルボニトリル [Chem. Be
r., 99, 3492(1966)] １．５７ｇ（５ｍｍｏｌ）および
ジメチルアセチレンジカルボキシラート０．８５ｇ（６
ｍｍｏｌ）を用い、実施例２と同様にして、融点２０
７〜２０８℃の目的物を得た。Example 8 4-Amino-3- (p-dimethylaminophenyl) -1
-Phenyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H)
Synthesis of dione (compound 11) Synthesis of dimethyl 4-amino-3- (p-dimethylaminophenyl) -1-phenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 5-amino-3 -(P-dimethylaminophenyl) -1
-Phenylpyrazole-4-carbonitrile [Chem. Be
r., 99 , 3492 (1966)] 1.57 g (5 mmol) and dimethyl acetylenedicarboxylate 0.85 g (6
mmol) in the same manner as in Example 2 with a melting point of 20
The desired product of 7 to 208 ° C was obtained.
【００６２】４−アミノ−３−（ｐ−ジメチルアミノ
フェニル）−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，
３' ：５，６］ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，
８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物１１）の合成 ジメチル ４−アミノ−３−（ｐ−ジメチルアミノフェ
ニル）−１−フェニルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
−５，６−ジカルボキシラート０．４４５ｇ（１．０ｍ
ｍｏｌ）およびヒドラジンヒドラート５ｍｌをメタノー
ル５０ｍｌに加え、２時間加熱還流した。反応終了後、
メタノールおよび過剰のヒドラジンヒドラートを留去し
た。残渣にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾
取して黄色針状晶を得た。得られた生成物をホットプレ
ートを使用して２５０〜３００℃で３０分間加熱し、メ
タノールでよく洗浄するすることにより、目的物を粉状
化合物として０．３８２ｇ（０．９２ｍｍｏｌ）得た
（収率９２％）。さらに、ジメチルスルホキシドおよび
メタノールの混合溶液から再結晶することにより、融点
３１５〜３２１℃の無色粉状化合物を得た。4-amino-3- (p-dimethylaminophenyl) -1-phenyl-1H-pyrazolo [4 ',
3 ′: 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,
Synthesis of 8 (6H, 7H) dione (Compound 11) Dimethyl 4-amino-3- (p-dimethylaminophenyl) -1-phenylpyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 0 .445 g (1.0 m
mol) and 5 ml of hydrazine hydrate were added to 50 ml of methanol, and the mixture was heated under reflux for 2 hours. After the reaction,
Methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate and thoroughly washed with methanol to obtain 0.382 g (0.92 mmol) of the desired product as a powdery compound. 92%). Further, by recrystallization from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol, a colorless powdery compound having a melting point of 315 to 321 ° C. was obtained.
【００６３】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４５５，３１７
０，３０００（ｂｒｏａｄ），１６５０（ＣＯ），ｌ６
１０，１５９５，１４９０，１３５０． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２４９，２６８，
３２６；λｍｉｎ ｎｍ：２２０，２５０，３ｌ０． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：３．３０〔６Ｈ，ｓ，Ｎ
（ＣＨ3 ）2 〕，６．５１（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたは
ＯＨ），６．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｃ6 Ｈ
5 −Ｈ），７．３３（１Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −Ｈ），７．
５３−７．６２（５Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −Ｈ，ＮＨまたは
ＯＨ），８．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｃ6 Ｈ
5 −Ｈ），９．９０（１Ｈ，ｓ，ＮＨまたはＯＨ），１
１．６１（１Ｈ，ｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：４１４（Ｍ+ ＋１，２８），
４１３（Ｍ+ ，１００），３９８（３），３２８
（３），２０７（６），１６４（４），４４（２）．IR (KBr) νcm −1 : 3455,317
0,3000 (broad), 1650 (CO), 16
10, 1595, 1490, 1350. UV (ethanol) λ max nm: 249, 268,
326; λ min nm: 220, 250, 310. NMR (DMSO-d 6) δ : 3.30 [6H, s, N
(CH 3 ) 2 ], 6.51 (1H, brs, NH or OH), 6.93 (2H, d, J = 8.7Hz, C 6 H
5 -H), 7.33 (1H, m, C 6 H 5 -H), 7.
53-7.62 (5H, m, C 6 H 5 -H, NH or OH), 8.41 (2H, d , J = 8.7Hz, C 6 H
5- H), 9.90 (1H, s, NH or OH), 1
1.61 (1H, s, NH or OH). LR-MS m / z (%): 414 (M + +1,28),
413 (M + , 100), 398 (3), 328
(3), 207 (6), 164 (4), 44 (2).
【００６４】実施例９ ４−アミノ−１−フェニル−３−フェニルチオ−１Ｈ−
ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド［２，３−ｄ］
ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化合物１
２）の合成 ５−アミノ−１−フェニル−３−フェニルチオピラゾ
ール−４−カルボニトリルの合成 ビス（フェニルチオ）メチレンプロパンジニトリル [Ch
em. Ber., 99, 2900(1966)] １４．７ｇ（５０ｍｍｏ
ｌ）、フェニルヒドラジン６．５ｇ（６０ｍｍｏｌ）お
よびエタノール８０ｍｌの混合物を７時間加熱還流し
た。溶媒を留去した後、残渣にエタノール１００ｍｌを
加えて結晶化させ、吸引濾取することにより、目的物を
融点１７２〜１７３℃の無色針状晶として１３．７ｇ
（４７ｍｍｏｌ）得た（収率９４％）。Example 9 4-Amino-1-phenyl-3-phenylthio-1H-
Pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d]
Pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (Compound 1
Synthesis of 2) Synthesis of 5-amino-1-phenyl-3-phenylthiopyrazole-4-carbonitrile Bis (phenylthio) methylenepropanedinitrile [Ch
em. Ber., 99 , 2900 (1966)] 14.7 g (50 mmo
A mixture of 1), 6.5 g (60 mmol) of phenylhydrazine and 80 ml of ethanol was heated under reflux for 7 hours. After distilling off the solvent, 100 ml of ethanol was added to the residue for crystallization, and suction filtration was carried out to give 13.7 g of the desired product as colorless needle crystals having a melting point of 172 to 173 ° C.
(47 mmol) was obtained (94% yield).
【００６５】ジメチル ４−アミノ−１−フェニル−
３−フェニルチオピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−
５，６−ジカルボキシラートの合成 ５−アミノ−１−フェニル−３−フェニルチオピラゾー
ル−４−カルボニトリル３．１ｇ（１１ｍｍｏｌ）、ジ
メチルアセチレンジカルボキシラート２．０ｇ（１４ｍ
ｍｏｌ）および無水炭酸カリウム６．０ｇ（４３ｍｍｏ
ｌ）を用い、実施例２と同様にして、融点１６０〜１
６１℃の目的物を得た。Dimethyl 4-amino-1-phenyl-
3-Phenylthiopyrazolo [3,4-b] pyridine-
Synthesis of 5,6-dicarboxylate 5-amino-1-phenyl-3-phenylthiopyrazole-4-carbonitrile 3.1 g (11 mmol), dimethyl acetylenedicarboxylate 2.0 g (14 m
mol) and 6.0 g of anhydrous potassium carbonate (43 mmo
1) and melting point 160-1 in the same manner as in Example 2.
The target product at 61 ° C. was obtained.
【００６６】４−アミノ−１−フェニル−３−フェニ
ルチオ−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，６］ピリド
［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオ
ン（化合物１２）の合成 ジメチル ４−アミノ−１−フェニル−３−フェニルチ
オピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５，６−ジカルボ
キシラート０．８８ｇ（２．０ｍｍｏｌ）およびヒドラ
ジンヒドラート５ｍｌをメタノール５０ｍｌに加え、２
時間加熱還流した。反応終了後、メタノールおよび過剰
のヒドラジンヒドラートを留去した。残渣にメタノール
２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾取して黄色針状晶を得
た。得られた生成物をホットプレートを使用して２５０
〜３００℃で３０分間加熱し、メタノールでよく洗浄す
ることにより、目的物を融点３２０〜３２４℃の無色針
状結晶として０．７０ｇ（１．７２ｍｍｏｌ）得た（収
率８６％）。4-Amino-1-phenyl-3-phenylthio-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (compound Synthesis of 12) Dimethyl 4-amino-1-phenyl-3-phenylthiopyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate 0.88 g (2.0 mmol) and hydrazine hydrate 5 ml in methanol. In addition to 50 ml, 2
Heated to reflux for an hour. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off. 20 ml of methanol was added to the residue for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. 250 the obtained product using a hot plate
By heating at ~ 300 ° C for 30 minutes and washing well with methanol, 0.70 g (1.72 mmol) of the desired product was obtained as colorless needle crystals with a melting point of 320-324 ° C (yield 86%).
【００６７】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：３４３０，３２６
０（ＮＨまたはＯＨ），３１８０（ＮＨまたはＯＨ），
３０５０−２６００（ｂｒｏａｄ，ＮＨまたはＯＨ），
１６５０（ＣＯ），１５９３，１５７２，１４８９，１
３５８． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２０１，２４６，
２９９，３４８，３６０；λｍｉｎ ｎｍ：２２０，２
８８，３２８． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ：７．２３−７．４２（６Ｈ，
ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −Ｈ），７．５０−７．５６（２Ｈ，ｍ，
Ｃ6 Ｈ5 −Ｈ），７．９０−８．ｌ２（２Ｈ，ｍ，Ｎ
Ｈ），８．３４−８．３８（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −
Ｈ），９．９１（ｌＨ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１
１．５８（１Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：４０３（Ｍ+ ＋１，２７），
４０２（Ｍ+ ，１００），４０１（１２），２９３（１
３），５８（１４），５６（１３），４５（２２），４
４（１７）．IR (KBr) νcm −1 : 3430,326
0 (NH or OH), 3180 (NH or OH),
3050-2600 (broad, NH or OH),
1650 (CO), 1593, 1572, 1489, 1
358. UV (ethanol) λ max nm: 201,246,
299, 348, 360; λ min nm: 220, 2
88,328. NMR (CDCl 3) δ: 7.23-7.42 (6H,
m, C 6 H 5 -H) , 7.50-7.56 (2H, m,
C 6 H 5 -H), 7.90-8 . 12 (2H, m, N
H), 8.34-8.38 (2H, m , C 6 H 5 -
H), 9.91 (lH, brs, NH or OH), 1
1.58 (1H, brs, NH or OH). LR-MS m / z (%): 403 (M + +1,27),
402 (M + , 100), 401 (12), 293 (1
3), 58 (14), 56 (13), 45 (22), 4
4 (17).
【００６８】実施例１０ ４−アミノ−１−フェニル−３−フェニルスルフィニル
−１Ｈ−ピラゾロ［４'，３' ：５，６］ピリド［２，
３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，７Ｈ）ジオン（化
合物１３）の合成 ジメチル ４−アミノ−１−フェニル−３−フェニル
スルフィニル−１Ｈ−ピラゾロ［２，３−ｂ］ピリジン
−５，６−ジカルボキシラートの合成 実施例９で得られたジメチル ４−アミノ−１−フェ
ニル−３−フェニルチオピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ
ン−５，６−ジカルボキシラート０．８７ｇ（２ｍｍｏ
ｌ）およびｍ−クロロ過安息香酸０．４９ｇ（２ｍｍｏ
ｌ）を用い、実施例４と同様にして、融点２１４〜２
１５℃の目的物を得た。Example 10 4-Amino-1-phenyl-3-phenylsulfinyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,6] pyrido [2,2]
Synthesis of 3-d] pyridazine-5,8 (6H, 7H) dione (Compound 13) Dimethyl 4-amino-1-phenyl-3-phenylsulfinyl-1H-pyrazolo [2,3-b] pyridine-5,6 -Synthesis of dicarboxylate Dimethyl 4-amino-1-phenyl-3-phenylthiopyrazolo [3,4-b] pyridine-5,6-dicarboxylate obtained in Example 9 0.87 g (2 mmo
l) and 0.49 g of m-chloroperbenzoic acid (2 mmo
1) and melting point 214-2 in the same manner as in Example 4.
The desired product at 15 ° C was obtained.
【００６９】４−アミノ−１−フェニル−３−フェニ
ルスルフィニル−１Ｈ−ピラゾロ［４' ，３' ：５，
６］ピリド［２，３−ｄ］ピリダジン−５，８（６Ｈ，
７Ｈ）ジオン（化合物１３）の合成 ジメチル ４−アミノ−１−フェニル−３−フェニルス
ルフィニル−１Ｈ−ピラゾロ［２，３−ｂ］ピリジン−
５，６−ジカルボキシラート０．４５ｇ（１．０ｍｍｏ
ｌ）およびヒドラジンヒドラート５ｍｌをメタノール５
０ｍｌに加え、２時間加熱還流した。反応終了後、メタ
ノールおよび過剰のヒドラジンヒドラートを留去した。
残渣にメタノール２０ｍｌを加えて洗浄し、吸引濾取し
て黄色針状晶を得た。得られた生成物をホットプレート
を使用して２５０〜３００℃で３０分間加熱し、メタノ
ールでよく洗浄することにより、目的物を粉状化合物と
して０．３２ｇ（０．７６６ｍｍｏｌ）得た（収率７６
％）。さらに、ジメチルスルホキシドおよびメタノール
の混合溶液から再結晶することにより、融点３１４〜３
１６℃の無色結晶を得た。4-amino-1-phenyl-3-phenylsulfinyl-1H-pyrazolo [4 ', 3': 5,
6] pyrido [2,3-d] pyridazine-5,8 (6H,
Synthesis of 7H) dione (Compound 13) Dimethyl 4-amino-1-phenyl-3-phenylsulfinyl-1H-pyrazolo [2,3-b] pyridine-
5,6-dicarboxylate 0.45 g (1.0 mmo
l) and 5 ml of hydrazine hydrate with 5 ml of methanol
It was added to 0 ml and heated under reflux for 2 hours. After completion of the reaction, methanol and excess hydrazine hydrate were distilled off.
20 ml of methanol was added to the residue for washing, and suction filtration was carried out to obtain yellow needle crystals. The obtained product was heated at 250 to 300 ° C. for 30 minutes using a hot plate and thoroughly washed with methanol to obtain 0.32 g (0.766 mmol) of the desired product as a powdery compound (yield 76
%). Furthermore, by recrystallizing from a mixed solution of dimethyl sulfoxide and methanol, the melting point 314-3
16 ° C. colorless crystals were obtained.
【００７０】ＩＲ（ＫＢｒ）νcm-1：ｌ６４８（Ｃ
Ｏ），１４９０，１３７５． ＵＶ（エタノール）λｍａｘ ｎｍ：２０３，２４２，
３００，３４７；λｍｉｎ ｎｍ：２２０，２８２，３
１８． ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：７．５８−７．６２（６
Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −Ｈ），７．７９（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ
5 −Ｈ），８．３１（２Ｈ，ｍ，Ｃ6 Ｈ5 −Ｈ），８．
７７（１／２Ｈ，ｂｒｓ，ＮＨまたはＯＨ），１０．１
０（１／２Ｈ，ｓ，ＮＨまたはＯＨ），ｌ１．７０（ｌ
／２Ｈ，ｓ，ＮＨまたはＯＨ）． ＬＲ−ＭＳｍ／ｚ（％）：４１９（Ｍ+ ＋１，２６），
４１８（Ｍ+ ，１００），４０２（ｌ２），３７０（２
４），３０９（ｌ８），２９３（ｌ６），７７（１
２）．IR (KBr) νcm -1 : l648 (C
O), 1490, 1375. UV (ethanol) λ max nm: 203, 242,
300, 347; λ min nm: 220, 282, 3
18. NMR (DMSO-d 6) δ : 7.58-7.62 (6
H, m, C 6 H 5 -H), 7.79 (2H, m, C 6 H
5 -H), 8.31 (2H, m, C 6 H 5 -H), 8.
77 (1 / 2H, brs, NH or OH), 10.1
0 (1 / 2H, s, NH or OH), 1.70 (l
/ 2H, s, NH or OH). LR-MS m / z (%): 419 (M ++ 1,26),
418 (M + , 100), 402 (12), 370 (2
4), 309 (18), 293 (16), 77 (1
2).
【００７１】実施例１１ ２０ｍｍｏｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌ
にペルオキシダーゼ１００ｕ、トリトンＸ−１００，５
０ｍｇおよび試験化合物あるいは対照化合物としてルミ
ノールをそれぞれ１０ｍｇ溶解し、試薬液とした。試験
管に試薬液を４００μｌ分取し、３７℃で１０分間放置
した後、３７℃の恒温状態に保たれた発光光度計〔ルミ
カウンター１０００：日音医理科器械製作所（株）製〕
にセットし、９０μｍｏｌ／ｌの過酸化水素１０μｌお
よび１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０μｌを添加して、
１分間の積算発光量（発光強度、ｃｐｍ）を測定した。Example 11 100 ml of 20 mmol phosphate buffer (pH 8.0)
Peroxidase 100u, Triton X-100,5
0 mg and 10 mg each of luminol as a test compound or a control compound were dissolved to obtain a reagent solution. A 400 μl portion of the reagent solution was placed in a test tube, allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes, and then kept at a constant temperature of 37 ° C. for luminescence photometer [Lumicounter 1000: manufactured by Nichine Medical & Scientific Instruments Co., Ltd.].
, 10 μl of 90 μmol / l hydrogen peroxide and 10 μl of 1N sodium hydroxide aqueous solution were added,
The integrated luminescence amount (luminescence intensity, cpm) for 1 minute was measured.
【００７２】測定結果を第２表に示す。The measurement results are shown in Table 2.
【００７３】[0073]
【表２】 [Table 2]
【００７４】第２表から明らかなように、過酸化水素を
試料とした場合、本発明の化合物を用いることによりル
ミノールを用いた場合を上回る発光感度が得られた。As is apparent from Table 2, when hydrogen peroxide was used as a sample, the luminescence sensitivity obtained by using the compound of the present invention was higher than that when luminol was used.
【００７５】実施例１２ ２０ｍｍｏｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌ
にペルオキシダーゼ１００ｕ、トリトンＸ−１００，５
０ｍｇおよび化合物１、化合物２、化合物３、化合物
４、化合物５、化合物６あるいは対照化合物としてルミ
ノールをそれぞれ１０ｍｇ溶解し、試薬液とした。Example 12 100 ml of 20 mmol phosphate buffer (pH 8.0)
Peroxidase 100u, Triton X-100,5
0 mg and 10 mg of each of compound 1, compound 2, compound 3, compound 4, compound 5, compound 6 or luminol as a control compound were dissolved to obtain a reagent solution.
【００７６】試験管に試薬液を４００μｌ分取し、３７
℃で１０分間放置した後、３７℃の恒温状態に保たれた
発光光度計〔ルミカウンター１０００：日音医理科器械
製作所（株）製〕にセットし、各種濃度の過酸化水素１
０μｌおよび１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１０μｌを添
加して、１分間の積算発光量（発光強度）を定量した。400 μl of the reagent solution was put into a test tube and
After leaving it at 10 ℃ for 10 minutes, set it in a luminometer [Lumicounter 1000: manufactured by Nichine Medical & Scientific Instruments Co., Ltd.] kept at a constant temperature of 37 ℃, and hydrogen peroxide of various concentrations 1
0 μl and 10 μl of 1N sodium hydroxide aqueous solution were added, and the integrated luminescence amount (luminescence intensity) for 1 minute was quantified.
【００７７】測定結果を図１に示す。図１から明らかな
ように、過酸化水素を試料とした場合、本発明の化合物
を用いることによりルミノールを用いた場合を上回る発
光感度が得られた。The measurement results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 1, when hydrogen peroxide was used as a sample, the luminescence sensitivity obtained by using the compound of the present invention was higher than that when luminol was used.
【００７８】実施例１３ ２０ｍｍｏｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌ
にトリトンＸ−１００，５０ｍｇ、化合物１、化合物
５、化合物８、化合物１０、化合物１３あるいは対照化
合物としてルミノールをそれぞれ１０ｍｇ溶解し、試薬
液とした。試験管に試薬液を４００μｌ分取し、３７℃
で１０分間放置した後、３７℃の恒温状態に保たれた発
光光度計〔ルミカウンター１０００：日音医理科器械製
作所（株）製〕にセットし、３００ｍｍｏｌ／ｌの過酸
化水素１０μｌおよび各種濃度のペルオキシダーゼ溶液
１０μｌを添加して、１分間の積算発光量（発光強度）
を定量した。Example 13 100 ml of 20 mmol phosphate buffer (pH 8.0)
Triton X-100 (50 mg), compound 1, compound 5, compound 8, compound 10, compound 13 or luminol (10 mg) as a reference compound was dissolved in each to prepare a reagent solution. Collect 400 μl of the reagent solution in a test tube and incubate at 37 ℃
After leaving it for 10 minutes at room temperature, set it in a luminescence photometer [Lumicounter 1000: manufactured by Nichine Medical Science Instrumentation Co., Ltd.] kept at a constant temperature of 37 ° C., and 10 μl of hydrogen peroxide of 300 mmol / l and various concentrations. 10 μl of the peroxidase solution of the above is added, and the accumulated luminescence amount (luminescence intensity) for 1 minute
Was quantified.
【００７９】測定結果を図２に示す。図２から明らかな
ように、ペルオキシダーゼを試料とした場合、本発明の
化合物を用いることによりルミノールを用いた場合を上
回る発光感度が得られた。The measurement results are shown in FIG. As is clear from FIG. 2, when the sample of peroxidase was used, the use of the compound of the present invention resulted in higher luminescence sensitivity than that of the case of using luminol.
【００８０】[0080]
【発明の効果】本発明により、過酸化物および過酸化活
性物質活性を高感度で定量することができる。Industrial Applicability According to the present invention, the activity of peroxides and peroxide active substances can be quantified with high sensitivity.
【図１】本発明の化合物およびルミノールを用いて過酸
化水素を定量した際の化合物濃度と積算発光量の関係を
表した図である。FIG. 1 is a diagram showing the relationship between compound concentration and cumulative luminescence amount when hydrogen peroxide was quantified using the compound of the present invention and luminol.
──●── 化合物１を用いて定量したときの結果であ
る。 ──●── 化合物２を用いて定量したときの結果であ
る。 ──○── 化合物３を用いて定量したときの結果であ
る。 ──■── 化合物４を用いて定量したときの結果であ
る。 ──□── 化合物５を用いて定量したときの結果であ
る。 ──▲── 化合物６を用いて定量したときの結果であ
る。 ──△── ルミノールを用いて定量したときの結果で
ある。── ● ── These are the results when quantified using Compound 1. ── ● ── These are the results when quantification was performed using Compound 2. ── ○ ── These are the results when quantified using Compound 3. ── ■ ── These are the results when quantified using Compound 4. ── □ ── These are the results when quantified using Compound 5. ── ▲ ── These are the results when quantified using Compound 6. ── △ ── These are the results when quantified using Luminol.
【図２】本発明の化合物およびルミノールを用いてペル
オキシダーゼ活性を測定した際の化合物濃度と積算発光
量の関係を表した図である。FIG. 2 is a diagram showing the relationship between compound concentration and cumulative luminescence amount when peroxidase activity was measured using the compound of the present invention and luminol.
──▲── 化合物１を用いて定量したときの結果であ
る。 ──○── 化合物５を用いて定量したときの結果であ
る。 ──●── 化合物８を用いて定量したときの結果であ
る。 ──□── 化合物１０を用いて定量したときの結果で
ある。 ──■── 化合物１３を用いて定量したときの結果で
ある。 ──△── ルミノールを用いて定量したときの結果で
ある。── ▲ ── These are the results when quantified using Compound 1. ── ○ ── These are the results when quantified using Compound 5. ── ● ── These are the results when quantified using Compound 8. ————— Results of quantification using Compound 10. ── ■ ── These are the results when quantified using Compound 13. ── △ ── These are the results when quantified using Luminol.
Claims (5)
低級アルケニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級ア
ルカノイル、置換もしくは非置換のアリール、置換もし
くは非置換のヘテロアリール、アラルキル、ハロゲン、
シアノ、ニトロ、スルホ、カルボキシ、低級アルコキシ
カルボニル、アリールオキシカルボニル、置換もしくは
非置換のカルバモイル、置換もしくは非置換のアミノ、
置換スルフォニル、置換スルフィニルまたは置換チオを
表し、Ｒ2 は水素、低級アルキル、シクロアルキル、低
級アルケニル、低級アルカノイル、置換もしくは非置換
のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、ア
ラルキル、低級アルコキシカルボニル、アリールオキシ
カルボニル、置換スルフォニル、置換スルフィニルまた
は置換チオを表す）もしくはその塩で表されるピラゾロ
ピリドピリダジン誘導体を選択し、（ｂ）試料中の過酸
化物、過酸化活性物質及び該ピラゾロピリドピリダジン
誘導体から選ばれる一種の未知量の物質を既知量の残り
の２種の化合物と共存させ、それにより未知量の１種の
物質を既知量の２種の化合物と反応させ、（ｃ）反応に
より生じる発光シグナルを測定し、（ｄ）あらかじめ作
成した検量線から試料中の物質を定量すること、からな
る試料中の過酸化物質、過酸化活性物質または該ピラゾ
ロピリドピリダジン誘導体の定量方法。1. (a) General formula (I): (In the formula, R 1 is hydrogen, lower alkyl, cycloalkyl,
Lower alkenyl, hydroxy, lower alkoxy, lower alkanoyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, aralkyl, halogen,
Cyano, nitro, sulfo, carboxy, lower alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl, substituted or unsubstituted carbamoyl, substituted or unsubstituted amino,
Represents substituted sulfonyl, substituted sulfinyl or substituted thio, R 2 is hydrogen, lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkanoyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, aralkyl, lower alkoxycarbonyl, aryl Oxycarbonyl, substituted sulfonyl, substituted sulfinyl or substituted thio) or a salt thereof is selected, and (b) the peroxide, the peroxide active substance and the pyrazolopyri in the sample are selected. An unknown amount of a substance selected from dopyridazine derivatives is allowed to coexist with a known amount of the remaining two compounds, whereby an unknown amount of one substance is reacted with a known amount of two compounds, (c) The luminescence signal generated by the reaction is measured, and (d) from the calibration curve prepared in advance. Quantifying the substance in the postal peroxide substance in the sample of the method of quantifying peroxidative substance or the pyrazolopyrimidine pyridopyridazine derivatives.
載の定量方法。2. The method for quantification according to claim 1, wherein the peroxide is hydrogen peroxide.
る請求項１記載の定量方法。3. The quantification method according to claim 1, wherein the peroxidatively active substance is peroxidase.
ィルム、フォトマルまたはフォトンカウンターを用いる
方法である請求項１記載の定量方法。4. The quantification method according to claim 1, wherein the method for measuring the luminescence signal is a method using a photosensitive photographic film, Photomal or a photon counter.
ルケニル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルカノ
イル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非
置換のヘテロアリール、アラルキル、ハロゲン、シア
ノ、ニトロ、スルホ、カルボキシ、低級アルコキシカル
ボニル、アリールオキシカルボニル、置換もしくは非置
換のカルバモイル、置換もしくは非置換のアミノ、置換
スルフォニル、置換スルフィニルまたは置換チオを表
す）で表されるピリダジン誘導体。5. A compound represented by the general formula (Ia): (In the formula, R 1a is lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, hydroxy, lower alkoxy, lower alkanoyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, aralkyl, halogen, cyano, nitro, sulfo, carboxy. , Lower alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl, substituted or unsubstituted carbamoyl, substituted or unsubstituted amino, substituted sulfonyl, substituted sulfinyl or substituted thio).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12716996A JPH0949831A (en) | 1995-05-31 | 1996-05-22 | Method for determining pyrazolopyrido pyridazine derivative, peroxide, or peroxide active material |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13337995 | 1995-05-31 | ||
| JP7-133379 | 1995-05-31 | ||
| JP12716996A JPH0949831A (en) | 1995-05-31 | 1996-05-22 | Method for determining pyrazolopyrido pyridazine derivative, peroxide, or peroxide active material |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0949831A true JPH0949831A (en) | 1997-02-18 |
Family
ID=26463182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12716996A Withdrawn JPH0949831A (en) | 1995-05-31 | 1996-05-22 | Method for determining pyrazolopyrido pyridazine derivative, peroxide, or peroxide active material |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0949831A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008096190A (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Chisso Corp | Calcium quantification method and calcium quantification kit |
-
1996
- 1996-05-22 JP JP12716996A patent/JPH0949831A/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008096190A (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Chisso Corp | Calcium quantification method and calcium quantification kit |
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