JPH09500096A - ヒト免疫不全ウイルスに対する予防接種および中和抗体誘発に用いられるペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＩＶ−１のｇｐ１２０蛋白質のエピトープに対応する新規ペプチドを開示する。これらの免疫原性ペプチドはＨＩＶに対する抗体依存性細胞性細胞障害を誘起し、従って、ＨＩＶ感染に対する予防接種およびＨＩＶに対する強化された免疫反応の誘発に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト免疫不全ウイルスに対する予防接種および中和抗体誘発に用いられるペプチ ド発明の背景 本発明はＡＩＤＳに対する予防接種に使用するのに適したペプチドに関する。 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）とし て知られるようになった疾患の原因である。この致死的疾患は、１９８１年に初 めて認められたが、治癒法はいまだ見い出されていない。ＨＩＶは、性的接触、 感染血または血液製剤および出産など種々の経路によって伝播する。ＨＩＶ感染 が複雑であり、これといった有効な治療法がないため、ＡＩＤＳの根絶は、すで に感染した人々の治療よりも新たな感染の防止によって達成されると思われる。 このため、多くの努力が、感染を検出する方法および感染を防御する方法の開発 に費やされている。感染者、感染した血およびその他生物学的製品を明らかにす るための診断的方法が開発されている。 たいていのウイルスと同様、ＨＩＶはしばしば中和抗体の産生を誘発する。し かし、多くの他のウイルスや他の感染因子では感染により防御免疫が導かれるの に対し、ＨＩＶ特異抗体は、疾病の進行を停止するには不充分である。したがっ て、ＨＩＶの場合には、自然感染の免疫を誘発するワクチンでは効果がないこと になる。実際、ＨＩＶ蛋白ｇｐ１６０から調製されたワクチンは、中和抗体を誘 発するものの、ＨＩＶ感染に対する免疫性はごくわずかにすぎないようである。 有効な抗ＨＩＶワクチンを製造できないことは、１９９０年代の終りまでは有効 なワクチンを得ることはできないであろうという予測を導いた。 ＨＩＶゲノムは十分に性質が調べられてきた。その約１０Ｋｂは、ＨＩＶ複製 のための調節セグメント、ならびに、コア蛋白質、逆転写酵素−蛋白質分解酵素 −エンドヌクレアーゼ、内部および外部エンベロープ糖蛋白質をそれぞれコード するｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子を含む配列をコードする。 ＨＩＶｅｎｖ遺伝子は、細胞内糖蛋白質ｇｐ１６０をコードし、これは通常蛋 白分解によりプロセスされてウイルス外部糖蛋白質ｇｐ１２０と、ウイルス膜貫 通糖蛋白質ｇｐ４１を形成する。ｇｐ１２０プロテインは、ｇｐ４１との非共有 結合性相互作用によりＨＩＶビリオンと連結したままである。これらの非共有結 合性相互作用は弱く、その結果、ｇｐ１２０の大半は細胞およびビリオンから可 溶性の状態で解放される。 ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の産物に対する抗体がＨＩＶに感染したＡＩＤＳお よびＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）患者の血清に発見されることから、ＨＩＶ− １ゲノムのｇａｇおよび特にｅｎｖ領域によりコードされる蛋白は免疫原性をも つことが、過去の研究によりわかっている。 ＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者、ならびに、当該ウイルスに感染した無症状者の血 清から得られるいくつかの抗体はｇｐ１２０およびｇｐ１６０に特異的であるこ とが、すでにわかっている。これらの抗体はしばしば中和活性をもつ。エンベロ ープ糖蛋白質は、ＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者の血清中の抗体によりもっとも適合 して認識されるＨＩＶ−１抗原である。Ａｌｌａｎ他「ＡＩＤＳ患者体内に抗体 を誘発する主要な糖蛋白質はＨＴＬＶ−IIIによりコード化される」Ｓｃｉｅｎ ｃｅ２２８：１０９１〜１０９４（１９８５）、Ｂａｒｉｎ他「ＨＴＬＶ−III のウイルス性エンベロープ蛋白はＡＩＤＳ患者体内の抗体の主要な標的抗原をあ らわす」Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１０９４〜１０９６（１９８５）。さらに、患 者血清中の抗体は、ｇａｇ遺伝子によりコード化されるウイルス性コア蛋白のエ ピトープをも認識する。 臨床検査用およびワクチン組成物候補としての免疫学的に重要なＨＩＶ−１抗 原は、バクテリア、酵母、種痘疹などのさまざまな発現システムにおいてＨＩＶ −１ゲノムの部分をクローン化することにより調製される。Ｃａｂｒａｄｉｌｌ ａ他「バクテリア合成されたｅｎｖポリペプチドを用いた、ヒトＡＩＤＳレトロ ウイルスに対する抗体の血清診断」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１２８〜１ ３３（１９８６）、Ｃｈａｎｇ他「組換え大腸菌を使用した免疫学的検定でのヒ トＴ細胞リンパ向性ウイルス−III（ＨＴＬＶ−III）に対する抗体の検出−誘導 されたウイルス抗原性ペプチド」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：９０５〜９０ ９（１９８５）。しかしながら、組換えＤＮＡ法により産生されたＨＩＶ−１抗 原 は、なお徹底的に精製しなければならない。これは、調製されるＨＩＶ−１抗原 を汚染する可能性のある、発現システムの抗原に対するなんらかの抗体反応によ り、予防接種時の副作用およびＥＬＩＳＡ検定における誤った陽性反応が起きる のを避けるためである。また、精製中のＨＩＶ−１抗原の変性は、重要な抗原活 性を破壊することがある。完全ウイルスからの蛋白の調製は、やはり、ウイルス による汚染をもたらす可能性がある。 いくつかの刊行物に、ＨＩＶ−１の抗原性蛋白の部分に対応する、選択された 合成ペプチドの免疫学的反応性を示すデータが呈示されている。１つの研究にお いて、ＨＩＶ−１のアミノ酸残基７３５〜７５２に対応するアミノ酸配列Ｔｙｒ −Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ −Ｇｌｙ−Ｃｙｓをもつペプチドが合成された。Ｋｅｎｎｅｄy他「合成ペプチ ドに対する抗血清はＨＴＬＶ−IIIエンベロープ糖蛋白質を認識する」Ｓｃｉｅ ｎｃｅ２３１：１５５６〜１５５９（１９８６）。このペプチドはｇｐ４１の部 分に由来し、ＨＩＶ−１に対する中和抗体反応を誘起する目的でラビットを免疫 化するために用いられた。さらに、抗ｇｐ４１抗体を含むことが知られているＡ ＩＤＳ患者からの数種の血清は、このペプチドとは反応性が弱い。これは、この ペプチドが、天然のｇｐ１６０／ｇｐ４１に対する抗体に、ある程度認識される 少なくとも１つのエピトープを含むことを示すものである。しかしながら、この ペプチドが、ラビット以外の哺乳類において中和抗体を誘起することは証明され ておらず、ヒトワクチンとしての使用についての示唆もない。 ＨＩＶ−１の免疫原性蛋白質には、抗体、細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞 によって認識され、そして、抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）において認 識される免疫原エピトープが存在する。伝統的には、中和抗体はウイルス感染の 防御に必須であると考えられる。中和抗体は感染ウイルス粒子に結合し、この過 程によりウイルス粒子の感染能が破壊される。 ウイルス感染細胞の排除の細胞的機序には細胞障害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞 およびＡＤＣＣが関係している。中和に関係するエピトープと種々の細胞免疫機 構に関係するエピトープは同じであるとは限らない。 ＡＤＣＣが、ウイルス感染時に働く免疫学的防御機構であることが先に見い出 されている。この反応では、抗原特異的抗体がターゲット細胞の表面構造に結合 し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）非制限ＣＤ１６＋、すなわち、Ｆｃ受 容体を有するエフェクター細胞が介在する細胞死を導く。たいていの血清陽性個 体の末梢血におけるＨＩＶ特異性細胞障害も、ｅｎｖ特異的ＩｇＧ抗体を有する ＭＨＣ非制限ＡＤＣＣエフェクター細胞が介在する（Ｔｙｌｅｒ他Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ．１４２：１１７７（１９８９）、Ｔａｎｎｅａｕ他Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１６２：８３７（１９９０）、Ｒｉｖｉｅｒｅ他Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３ ：２２７０（１９８９））。ＨＩＶ特異的ＡＤＣＣ活性はＨＩＶ−１感染個体由 来の血清の多くで見い出されている（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ他Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１３９：２２６３（１９８７）、Ｌｙｅｒｌｅｙ他ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ３：４０９（１９８７））。タイプおよび株に特異 的なＡＤＣＣが観察され、ある血清中の抗体は全ての株に対しＡＤＣＣを媒介し 、また、他の血清はＡＤＣＣ活性が全くない（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ他６３：３３ ７６（１９８９））。小児ＨＩＶ−１感染においては、ＡＤＣＣ媒介抗体の存在 が臨床状態の改善に有意に関連する（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ他１６１：１９８（１ ９９０））。ＡＤＣＣ反応はＨＩＶ感染の初期に現れ、ＨＩＶ−１_HTLVIIIB感染 ターゲット細胞に対する反応性の広範囲なＡＤＣＣは、血清型転換後２〜１２カ 月の間に現れる。 ＨＩＶ抗原を表面に提示する活性化細胞はＡＤＣＣのターゲット細胞となる可 能性がある。ＨＩＶ感染オートロガスＣＤ４＋Ｔ細胞の芽細胞が、ＡＤＣＣによ る細胞溶解のターゲットとなることが最近示された（Ｔａｎｎｅａｕ他Ｊ．Ｉｎ ｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１６２：８３７（１９９０））。多数の研究で、ＨＩＶのエ ンベロープ糖蛋白質はターゲットエピトープであると示唆されている。Ｅｖａｎ 他（ＡＩＤＳ３：２７３（１９８９））は、アフィニティーにより精製したヒト ＩｇまたはＨＩＶ−１のｅｎｖ蛋白質に対するポリクローナルウサギ血清を用い 、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対するＡＤＣＣを媒介する抗体を見い出した。Ｋ ｏｕｐ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：５８４（１９８９））は、リンパ芽球細胞系 において、エンベロープ糖蛋白質（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１）ま た はｇａｇ蛋白質（ｐ５５、ｐ４０、ｐ２４およびｐ１７）を発現するワクシニア ウイルスベクターを使用している。エンベロープ糖蛋白質複合体ｇｐ１２０／ｇ ｐ４１のみがＨＩＶ特異的ＡＤＣＣのターゲット抗原であることが見い出され、 これは、同様の系を用いた別の研究で確認された（Ｔａｎｎｅａｕ他Ｊ．Ｉｎｆ ｅｃｔ Ｄｉｓ．１６２：８３７（１９９０））。 さらに限定された領域が多数の研究において明らかにされている。ｇｐ１２０ のＶ３領域（アミノ酸３０９〜３１８）に対するネズミモノクローナル抗体は中 和（タイター、１：５００）およびＨＴＬＶＩＩＩＢに対するＡＤＣＣ（タイタ ー、１：８００）を媒介する（Ｂｒｏｌｉｄｅｎ他Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：９３ ６（１９９０））。また、Ｖ３領域（アミノ酸３０８〜３２２）に対するマウス −ヒトキメラ抗体はＡＤＣＣならびに中和および融合阻害を誘発する（Ｌｉｏｕ 他Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９６７（１９８９））。Ｌｙｅｒｌｙ他（Ａ ＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ３：４０９（１９８７）） は、ｇｐ１２０のＣ−末端部分（アミノ酸４６７〜５１１）におけるＡＤＣＣエ ピトープの場所を特定している。発明の概要 本発明により、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０蛋白質のエピトープに対応する新規なペ プチドが開示され記載される。各ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０ 蛋白質由来のエピトープアミノ酸配列を含むペプチドであり、前記エピトープは 、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１ ２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６ または配列番号４１の範囲内に位置し、前記エピトープ配列に対してサルで産生 した抗血清が、１：３０を超える希釈で０．５を超える特異的抗体依存性細胞性 細胞障害指標値を有する。 本発明の他の態様では、当該ペプチドが、配列番号１、配列番号５、配列番号 ６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配 列番号２０、配列番号２１、配列番号３６および配列番号４１からなるグループ から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列を有する。 本発明の別の態様では、新規ペプチドがワクチン組成物を調製するために使用 される。ワクチン組成物は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０蛋白質由来のエピ トープアミノ酸配列を、医薬的に許容可能な担体と共に、哺乳動物において免疫 反応を誘発するのに有効な量含み、前記エピトープは、配列番号１、配列番号５ 、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番 号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６または配列番号４１の範囲 内に位置し、前記エピトープ配列に対してサルで産生した抗血清が、１：３０を 超える希釈で０．５を超える特異的抗体依存性細胞性細胞障害指標値を有する。 好ましい態様では、ワクチン組成物は、さらに、フロイント完全アジュバント、 フロイント不完全アジュバント、ムラミルジペプチド、レバミソール、イソプリ ノシンまたはタフトシンのようなアジュバントを含む。 本発明のさらに別の態様では、少なくとも２種の新規ペプチドがワクチン組成 物で使用される。各ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０蛋白質由来の エピトープアミノ酸配列を含むペプチドであり、前記エピトープは、配列番号１ 、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号 １４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６または配列番 号４１の範囲内に位置し、前記エピトープ配列に対してサルで産生した抗血清が 、１：３０を超える希釈で０．５を超える特異的抗体依存性細胞性細胞障害指標 値を有する。ペプチドは、哺乳動物で免疫反応を誘発するのに有効な量存在し、 医薬的に許容可能な担体と組み合わされる。 好ましい態様では、このワクチン組成物は、さらに、フロイント完全アジュバ ント、フロイント不完全アジュバント、ムラミルジペプチド、レバミソール、イ ソプリノシンまたはタフトシンのようなアジュバントを含む。 また、本発明によれば、哺乳動物に本明細書に記載の組成物の一つを投与する ステップを含む、ヒト免疫不全ウイルスの感染から哺乳動物を防御する方法が開 示される。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または腹膜腔内注射によ ることができる。 さらに、本発明によれば、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０蛋白質由来のエピ トープアミノ酸配列を、医薬的に許容可能な担体と共に含む組成物を、抗体を誘 発するのに有効な量投与するステップを含む、哺乳動物において中和抗ＨＩＶ抗 体を誘発する方法が開示される。このエピトープは、配列番号１、配列番号５、 配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号 １９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６または配列番号４１の範囲内 に位置し、前記エピトープ配列に対してサルで産生した抗血清が、１：３０を超 える希釈で０．５を超える特異的抗体依存性細胞性細胞障害指標値を有する。 本発明の別の態様では、ワクチン組成物は、少なくとも２種の新規ペプチドを 含む。各ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０蛋白質由来のエピトープ アミノ酸配列を含むペプチドであり、前記エピトープは、配列番号１、配列番号 ５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列 番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６または配列番号４１の範 囲内に位置し、前記エピトープ配列に対してサルで産生した抗血清が、１：３０ を超える希釈で０．５を超える特異的抗体依存性細胞性細胞障害指標値を有する 。ペプチドは、哺乳動物で免疫反応を誘発するのに有効な量存在し、医薬的に許 容可能な担体と組み合わされる。発明の詳細な説明 本発明は、霊長類検体によるＨＩＶ中和抗体の産生を誘起することが見出ださ れたペプチドに関する。これらのペプチドは、Ｋｅｎｎｅｄｙ他、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ２３１：１５５６〜１５５９（１９８６）に示されるアミノ酸座標をもつｇｐ １２０蛋白質の領域に対応する。本発明のペプチドは、ｇｐ１２０−１２（アミ ノ酸座標１５９〜１８３）、ｇｐ１２０−１５（アミノ酸座標２００〜２２５） 、ｇｐ１２０−１６（アミノ酸座標２１３〜２３７）、および、ｇｐ１２０−１ ９（アミノ酸座標２５５〜２７６）と称される。ペプチドｇｐ１２０−１９は、 Ｈｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１０２１〜１０２３（１９８８））に記載され たペプチドに類似しているが、ｇｐ１２０−１９は霊長類において中和抗体を誘 起することが見い出された。本発明のペプチドはワクチン組成物における免疫原 として使用でき、また、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体産生を誘起す るするのに使用できる。特に重要なのは、ＨＩＶ中和抗体である。 蛋白質は、多数の抗原決定基やエピトープを含み、これらは、特異的抗体の認 識および結合部位を含む蛋白質の領域である。一般に、蛋白質は５〜１０個のエ ピトープを含み、各エピトープは６〜８個のアミノ酸の配列を含む。エピトープ は、６〜８個のアミノ酸が直線配列上に存在する連続型でも、エピトープを形成 するアミノ酸が蛋白質の三次元的折り返しにより集まる非連続型でもよい。エピ トープが比較的少ない数のアミノ酸であるとしても、抗体との反応は、エピトー プを囲む蛋白質内アミノ酸により影響を受ける。 蛋白質の抗原部位やエピトープをマッピングすることを目的とした研究は、問 題の蛋白質のさまざまな領域に対応する合成ペプチドを用いることにより促進さ れている（Ｌｅｒｎｅｒ他「免疫学的疾病の生物学：病院実務読本」（Ｄｉｘｏ ｎおよびＦｉｓｈｅｒ編）３３１〜３３８頁（１９８３）、Ｌｅｒｎｅｒ、Ａｄ ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４））。エピトープのマッピング研究に おける有用性に加え、合成ペプチドは、蛋白質の主要な抗原決定基を包含させれ ば、ワクチンや診断用試薬としての可能性を有している（Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍ ｏｒｔｅｌ、Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｖｉｒｏｌ．１３７Ｅ：４９ ７〜５２８（１９８６）、Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ「抗原としての合成 ペプチド」、ＢｕｒｏｄｅｎおよびＶａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ編「生化学 および分子生物学における研究技法」第１９巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ０ −４４４−８０９７４−０（１９８８））。 合成ペプチドは、特異的抗体の産生および反応性に関していくつかの利点を有 する。合成ペプチドの正確な配列は、蛋白質のアミノ酸配列決定法により決定さ れる蛋白質のアミノ酸配列や蛋白質をコードするＤＮＡ配列から決定される予測 アミノ酸配列から選択できる。特異的合成ペプチドの使用により、予防接種およ び抗体の産生または検定において完全長蛋白質の必要はなくなる。さらに、Ｍｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄと共同研究者による固相ペプチド合成法により、本質的に無制 限の量の合成ペプチドを化学的に製造することが可能である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ「蛋白質」第３版第２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ、ニューヨーク、第３章（１９７６））。自動ペプチド合成器の実用化は 、このような技術をさらに前進させている。 蛋白質の抗原領域を予測するためにさまざまな基準が用いられるが、このよう な領域に対応するペプチドは、必ずしもワクチンとして有用ではない。例えば、 ペプチドが、蛋白質と反応する抗体により認識される適切な空間的配位になけれ ば、抗原性は失われる。また、Ｃ型レトロウイルスおよびＨＩＶから由来するペ プチドのいくつかは、ＨＩＶ自身と同様に強い免疫抑制因子として作用すること が判明している（Ｃｉａｎｃｉｏｌｏ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：２９０ ０〜２９０５（１９８０）、Ｃｉａｎｃｉｏｌｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２３０：４５３〜４５５（１９８５））。このようなペプ チドは、患者に対して有害な効果をもち、ワクチンとして用いるには適当ではな い。 さらに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２において特に明らかなように、これら２ つのウイルス群の各々には、ウイルスの数多くの血清型すなわち分離体を導くか なりの遺伝学的変異性がある。このため、免疫原の形成に用いるペプチドにする 蛋白質の領域を選択する際には、かなりの制約がある。しかし、ＨＩＶ−１およ びＨＩＶ−２蛋白質の免疫主要部分には、比較的不変なものがあることがわかっ た。合成ペプチドは、天然の分子内の通常は免疫原性をもたない型共通配列［ｔ ｙｐｅ ｃｏｍｍｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ］に対して免疫反応を誘発するとい う点において、ウイルス性ワクチンに対する重要な鍵でもある。これらの、さも なければ沈黙しているエピトープは、広範な防御特異性をもつ。Ｓｔｅｗａｒｄ 他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ８：５１〜５８（１９８７）。いくつかの試験 的ワクチンが、ウイルスに接触した恐れのある人々における感染を防御する目的 で作成された。Ｂｅｒｍａｎ他「組換え糖蛋白質ｇｐ１６０ではなくｇｐ１２０ を用いた予防接種後のＨＩＶ−１による感染からのチンパンジーの防御」Ｎａｔ ｕｒｅ３４５：６２２〜６２５（１９９０）。ＨＩＶの免疫学的に重要な蛋白質 の領域に対応する合成ペプチドについて、ＨＩＶの検出のための診断法における 用途、ＨＩＶに対する可能性のあるワクチンとしての用途、および、ポリクロー ナル抗体およびモノクローナル抗体の産生のための用途が見い出されている。 ｇｐ１２０上の多数の中和エピトープが、何人かの研究者により見い出され、 そして、特定されている。その総覧については、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、ＡＩＤＳ （１９８９）３（ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１１１〜Ｓ１１８を参照されたい。この 総覧において、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉはアミノ酸座標２５４〜２７４、３０３〜３ ３７、４５８〜４８４、４９１〜５２３を有する４つの異なるウイルス中和エピ トープに言及している。アミノ酸領域２５４〜２７４を有するペプチドは、ラビ ットを免疫化するために用いられ、生じた抗血清は上述したようにＨＩＶ−１を 中和することが見出だされた（Ｈｏ他）。 本発明に包含されるペプチドは、免疫化した宿主においてＨＩＶ特異的な抗体 の産生を誘起する少なくとも１つの連続型（直線型）エピトープを含むアミノ酸 配列を含む。 すなわち、本発明は、Ｍｕｅｓｉｎｇ他「ヒトＡＩＤＳ／リンパ節病レトロウ イルスの核酸構造および発現」Ｎａｔｕｒｅ３１３：４５０〜４５８（１９８５ ）に記載されたＨＩＶ−１ ＨＴＬＶIII−Ｂのエンベロープ遺伝子によりコー ドされるＨＩＶｇｐ１２０蛋白質の領域に対応する免疫原ペプチドを包含する。 ヌクレオチド配列は、ＨＩＶＰＶ２２の名称でＧｅｎｂａｎｋリリース６３にお いて提供される。本発明はさらに、ペプチドの免疫原特性に重大な影響を及ぼさ ない、ペプチドの機能的等価な変異体を包含する。例えば、アミノ酸残基の保存 的置換、すなわち、１個または数個のアミノ酸残基のアミノ酸類似体による置換 は本発明の範囲内にある。 相同体は、アミノ酸残基を保存的に置換したペプチドである。互いに保存的に 置換できるアミノ酸には以下のものがあるがこれらに限定されるものではない。 グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタ ミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／スレオニン、リジン／アルギニ ン、フェニルアラニン／チロシン。相同ペプチドは、下記に示す配列を有するｇ ｐ１２０−１２、ｇｐ１２０−１５、ｇｐ１２０−１６およびｇｐ１２０−１９ で示されるペプチドを認識する抗体により認識されるならば、本発明の範囲内に あるものとみなされる。さらに、本発明のペプチドに対応する相同ペプチドで、 異なるＨＩＶ分離体から由来するすべてのものも、本発明の範囲内に含まれる。 類似体は、本発明のペプチドと機能的に等価であり、ある程度の天然に存在し ないまたは修飾されたアミノ酸を含んでいるペプチドと定義される。さらに、１ 種以上のペプチドおよびペプチド類似体ないし相同体のポリマーも本発明の範囲 内である。また、ｇｐ１２０−１２、ｇｐ１２０−１５、ｇｐ１２０−１６およ びｇｐ１２０−１９の夫々よりもアミノ酸残基が少ないが、各ペプチドに存在す る１個以上の免疫原性エピトープを含み、従って、元のペプチドの免疫原性を有 するペプチドも本発明の範囲内である。対象のペプチドを、より長い配列の免疫 原性エピトープを維持したまま、いずれかの末端で短縮できる程度を決定するた めの分析方法は後記する。 本明細書に具体的に開示したペプチドのいずれかの末端にアミノ酸を付加する ことも、付加がペプチドの免疫学的性質にかなりの悪影響を与えない限り、本発 明の範囲内と考えられる。通常の試験方法により、このように延長または短縮さ れたペプチドが所望の免疫学的性質を有しているか否かを決定できる。アミノ酸 が付加される場合、得られるペプチドはなお比較的短いことが好ましく、例えば 、５０アミノ酸以下の長さであり、好ましくは、約４０または４５アミノ酸以下 の長さであり、最も好ましくは、約２５、３０または３５アミノ酸以下の長さで ある。 本発明のペプチドは公知の固相ペプチド合成技術を用いて合成された（Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄおよびＢａｒａｎｙ「ペプチド：分析、合成、生物学」第１巻、 Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｎｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニ ューヨーク、第１章（１９８０））。合成により、さらに、元来の蛋白質配列に 対応しない１つ以上のアミノ酸を、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末 端に付加することが可能となる。このような付加アミノ酸は、ペプチドを別のペ プチドや、大きな担体蛋白質や、固相支持体に結合させるために有用である。こ れらの目的に有用なアミノ酸には、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラ ギン酸、システイン、および、これらの誘導体があるが、これらに限定されるも のではない。例えば、ＮＨ₂アセチル化やＣＯＯＨ末端アミド化など、さらなる 蛋白質改変技術を用いて、ペプチドを別の蛋白質やペプチド分子や支持体に結合 させるためのさらなる手段を提供することができる。ペプチドを互いに、あるい は担体蛋白質や固相支持体に結合させるための処理法は、公知である。したがっ て、カルボキシまたはアミノ末端において、担体または固相支持体に結合または 非結合の上述の付加アミノ酸残基を含むペプチドは、本発明の範囲内にある。本 発明のペプチドに対する言及は、ここに論じられるすべての態様を包含する。 ワクチン製造の別の方法は、分子生物学技術を用いて、本発明の１つ以上のペ プチドと高度に免疫原性の蛋白質を含む融合蛋白質を生成することである。例え ば、問題の抗原とコレラ毒素のＢサブユニットを含む融合蛋白質が、問題の抗原 に対する免疫反応を誘発することが証明されている（Ｓａｎｃｈｅｚ他「ワクチ ン開発の基礎としての、コレラ菌（ビブリオ・コレラ）におけるコレラ毒素Ｂサ ブユニットの過剰発現のための組換えシステム」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４８１〜４８５（１９８９））。このようなキメラペプ チドは、経口投与することができる。 新規なペプチドアミノ酸配列を、以下に示す。アミノ酸残基配列は、Ｍｕｅｓ ｉｎｇ他（「ヒトＡＩＤＳ／リンパ節症レトロウィルスの核酸構造および発現」 Ｎａｔｕｒｅ，３１３：４５０〜４５８（１９８５））によりすでに開示された ヌクレオチド配列から導かれる。ペプチドはそのカルボキシ末端に、カルボキシ ル基よりもアミド基を有する方が好ましい。カルボキシ末端は、カルボキシル基 および下記の分子部分であってもよい。 ｇｐ１２０−１２ Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ ｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ ｌ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ ｇｐ１２０−１５ Ｘ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌ ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈ ｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｙ− Ｚ ｇｐ１２０−１６ Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒ ｏ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈ ｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｙ−Ｚ ｇｐ１２０−１９ Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅ ｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅ ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｙ−Ｚ 上記中、Ｘは、ペプチドのアミノ末端ＮＨ₂基の水素原子またはペプチドの担 体への結合を促進するために選択される付加アミノ酸であり、Ｙは無いかまたは Ｃｙｓであり、Ｚは、カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基またはアミド基 である。用いられているアミノ酸略称を表２に示す。 ＨＩＶによる将来の感染を防御するため、あるいは、すでにＨＩＶに感染した 検体におけるＨＩＶに対する免疫反応を高めるためのワクチンとして有用である 。いかなる霊長類好ましくはヒトの検体にもペプチドを用いて予防接種できるが 、もっとも適切な検体はＨＩＶ感染の危険がある人々である。このような対象者 には、同性愛者、娼婦、薬物静脈注射常用者、および、患者や生物学的標本に接 触する医療従事者が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明は、 さらに、これらのペプチドを特異的に認識するモノクローナルおよびポリクロー ナル抗体を提供する。本発明は、さらに、ＨＩＶを中和する抗体を提供する。 本発明の好ましい態様において、ペプチドは免疫原として用いられる組成物に 調製される。これらの免疫原は霊長類およびヒトを含む哺乳類におけるワクチン として、あるいは、動物におけるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産 生を誘起するために用いることができる。このような組成物を調製するため、免 疫原として有効な量の少なくとも１種のペプチドを、ヒトを含む哺乳類への投与 に適した生理的に許容可能な担体に混合する。ペプチドは、互いに、または、他 のペプチドや蛋白質担体やその他の担体に共有結合で結合され、リポソームその 他のベシクルに組み込まれ、および／またはワクチン分野において知られるよう にアジュバントや吸着剤と混合される。例えば、１つあるいは複数のペプチドは 、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他「精製したＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質およびＩＳＣ ＯＭＳを用いた免疫化によるＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の誘導」Ｎａｔｕｒｅ３ ４４：８７３〜８７５（１９９０）に開示されるとおり、免疫刺激性複合体に混 合することができる。あるいは、ペプチドは、結合されずに、単に、ヒトを含む 哺乳類に投与するのに適した、通常の食塩水や緩衝化合物などの生理的に許容可 能な担体と混合される。 本発明のペプチドに対する免疫反応は種々の補助剤によって高められる。人手 可能なアジュバントは多く、また、急速に増している。好ましい態様では、フロ イントアジュバントが、ワクチンとしてペプチドを投与された哺乳類の免疫反応 を増大するために使用される。 抗体を誘起するすべての免疫原組成物と同様に、本発明のペプチドの免疫原と して有効な量は、経験的に決定されなければならない。考慮されるべき因子には 、天然ペプチドの免疫原性、ペプチドがアジュバントや担体蛋白質やその他の担 体に複合すなわち共有結合で結合されるかどうか、静脈内注射、筋肉内注射、皮 下注射などの組成物の投与経路、免疫化投与回数が含まれる。このような因子は ワクチン分野において公知であり、過度の実験を行なうことなくこのような決定 をなすことは免疫学者の技術範疇である。 本発明をさらに下記の実施例により説明するが、これらの実施例により本発明 の範囲が制限されるものではない。 実施例１ ペプチド合成 本発明のペプチドの合成にＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製４３０Ａ ペプチド合成機を使用した。各合成には、ｐ−メチルベンジル−ヒドリルアミン 固相支持体樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ルイビル、 ＫＹ）を使用した。ペプチドは、４３０Ａペプチド合成機のユーザーマニュアル （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９８６））に従って合成した。 合成に用いた全てのアミノ酸は、α−ＮＨ₂基を保護するｔ−ブチルカルボニ ル基（ｔ−Ｂｏｃ）を含み、スイスのＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧから入手し た。反応性側鎖基を有するアミノ酸は、所望しない側鎖の連鎖反応を防ぐための 追加保護基を含んでいた。これらのペプチドすべてを合成するのに用いた、保護 されたアミノ酸の各々を表１に記載する。 合成の完了後、合成されたペプチドから保護基を取り除き、Ｂｅｒｇｏｔ他「 固相ペプチド合成における分割試薬としてのトリフルオロメタンスルホン酸の用 途」Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、Ｐ ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、第１６号、１９８６年９月２日発行に 記載された方法にしたがって、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）を 用いる処理により、固相支持体樹脂からペプチドを切断した。以下に、用いられ たプロトコルの詳細を記す。 １．ペプチド−樹脂１グラムに対して、チオアニソールと１，２−エタン−ジ チオール（２：１）の３ｍｌをスカベンジ剤として添加し、混合物を室温で１０ 分間、連続的に攪拌しながらインキュベートした。 ２．トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１０ｍｌを添加し、室温で１０分間、連続的 に攪拌した。 ３．強く攪拌しながら、ＴＦＭＳＡ１ｍｌを滴下して添加し、室温で２５分間 反応させた。 ４．切断の後、ペプチドを無水エーテルを用いて沈殿させ洗浄した。 ５．沈殿洗浄されたペプチドを少量（約５ｍｌ）のＴＦＡに溶解した。 ６．溶解したペプチドを再び工程４のように沈殿洗浄し、沈殿物をＮ₂流下で 乾燥させた。 特異性の検定に用いる前に、所望に応じ、逆相高性能液体クロマトグラフィ（ ＨＰＬＣ）により、ペプチドをさらに精製してもよい。このような精製に特に適 したカラムとしては、水（ＴＦＡ）−アセトニトリル（ＴＦＡ）勾配を用いてペ プチドを溶出する逆相Ｖｙｄａｋ（登録商標）Ｃ−１８カラムがある。表２に示 すアミノ酸配列を有する、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の全配列を含む４０個のペプチ ドを合成した。アミノ酸座標２１３〜２２４の短縮ｇｐ１２０−１６／Ｂも合成 した。 実施例２ 細胞およびウイルスストック すべての中和試験は、Ｈ−９細胞およびＨＴＬＶ−IIIＢウイルス（Ｒ．Ｃ． Ｇａｌｌｏからのもので、ニューヨーク州マンハセットのノースショア病院のＷ ｉｌｌｉａｍ Ｈａｌｌ博士により供給された）を用いて実施された。Ｈ−９細 胞（Ｈ９ ＮＹとして示される）を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）２０％と、ペニシ リン／ストレプトマイシン（ＰＥＮ／ＳＴＲＥＰ各５０μｇ／ｍｌで殺真菌剤は 含まず）を補なったＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）内に保持した。細胞は、４日毎 に１：３希釈で、継代培養された。 細胞をプレートからかき取り、３２５×ｇの遠心分離によりペレット化した。 ペレット化された細胞を、前もって１／１０に希釈したストックウイルス１ｍｌ 中に再懸濁し、頻繁に攪拌しながら３７℃で６０分間にわたり吸着を行なった。 ウイルスの吸着ののち、細胞を再遠心分離し、ＦＣＳ２０％およびポリブレン（ ２μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１０ｍｌ中に再懸濁し（５×１０⁵細胞／ｍｌの 最終濃度に）、５％ＣＯ₂中において３７℃でインキュベートした。 感染された細胞は、シンシチウム形成、免疫蛍光検査における陽性細胞、ｐ− ２４産生（Ａｂｂｏｔｔ ｐ−２４抗原試験により検定される）を検査すること により、感染後（ｐ．ｉ．）４〜５日目に検出可能であることが判明した。ＨＩ Ｖ産生のピークは、ｐ．ｉ．１０〜１５日目にみられ、このとき、ウイルスを採 取した。破砕物を除くための低速遠心分離の後、感染細胞から採取したウイルス を含む上澄み液を、−９０℃でストックとして凍結した。５０％組織培養感染量 （ＴＣＩＤ₅₀）として終点タイター４０，０００の値をもつ１つのウイルススト ックが研究を通じて用いられた（ＮＴ３〜ＮＴ１９と呼ぶ）。 実施例３ 免疫化のためのペプチドの調製 Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン国ウプサラ）を二機能性リンカーとして 用い、下記に要約する製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指示にしたがって、本発 明 によるペプチドを、オボアルブミングレードＶ（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国ミ ズーリ州セントルイス）に、ほぼ１０：１（ペプチド：オボアルブミン）のモル 比で、共有結合で連結した。 オボアルブミンを結合緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．５）に溶解 した。つぎに、溶解されたオボアルブミンを、同じ緩衝液を用いてＳｅｐｈａｄ ｅｘＧ−２５Ｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を通過させた。蛋 白質濃度を２８０ｎｍで測定し、回収を判定した。ＳＰＤＰを、最終濃度４０ｍ Ｍになるよう、９９．５％エタノールに溶解した。つぎに、攪拌しながら、オボ アルブミン溶液にＳＰＤＰを滴下して添加した。つぎに、ＳＰＤＰ−オボアルブ ミン混合物を室温で約３０分間放置した。水を溶出剤として用い、混合物をＳｅ ｐｈａｄｅｘＧ−２５Ｍカラムを通過させることにより、オボアルブミン−ＳＰ ＤＰ複合体を非複合ＳＰＤＰから分離した。オボアルブミン−ＳＰＤＰ複合体の 置換度は、ペプチド溶液に添加すべき量を決定するために、複合体５０μｌを水 ２ｍｌで希釈した後に、希釈された複合体を２８０ｎｍで、および、希釈された 接合体にジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加して３ ４３ｎｍで測定することにより、決定された。 最後に、オボアルブミン−ＳＰＤＰ複合体に結合させる合成ペプチドを１０％ 酢酸に溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとした。適当な量（上記の置換度により決 定される）のオボアルブミン−ＳＰＤP接合体を添加し、室温で一晩静置した。 実施例４ 免疫化プロトコル Ｍ．ファクシキュラリス（Ｍａｃｃａｃａ ｆａｃｓｉｃｕｌａｒｉｓ）が抗 体の産生に用いられた。最初のペプチド注射の前に、血液試料をサルから採取し た。この最初の血液試料を「免疫前」（表３〜６）と呼び、内部対照として用い 、各免疫血清と同時に分析する。 リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．５ｍｌに懸濁したペプチド−ＳＰＤＰ− オボアルブミン１００μｇをサルに注射した。３週間おきに３回の筋肉内注射に よりサルを免疫化した。アジュバントとしては、免疫化全部についてフロイント 完全アジュバント０．５ｍｌを用いた。最終の免疫化から２週間後、サルから採 血し、免疫前および超免疫［ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ］血清について実施例５に 述べる中和検定を実施した。 実施例５ ＨＩＶ−１中和検定 ＨＴＬＶ１１−Ｂ感染能を中和する抗体を含む血清は、ペプチド特異性抗血清 を欠く対照の感染と比較して、ＨＩＶ−１シンシチウム形成を防ぐ能力、ｐ−２ ４抗原形成、免疫蛍光マーカーにより判定される感染細胞数の減少により検出さ れた。実施例２に記載したストックウイルスを、ＴＣＩＤ₅₀の値が１００になる まで希釈し、実施例４に記載したように免疫化されたサルから得られた、連続４ 倍希釈（１／５、１／２０、１／８０）の補体不活性免疫血清と混合した。陽性 （Ｐｏｓ）対照として、既知のＨＩＶ中和タイター１／４０〜１／１６０を有す るモルモット超免疫血清（ＭＳＶと呼ぶ）をすべての実験に含めた（Ｂ．Ｍｏｒ ｅｉｎ教授の提供による、ＢＭＣ獣医学ウイルス部門、スウェーデン国ウプサラ ）。３７℃で６０分間または４℃で１６時間にわたるインキュベーションの後、 血清−ウイルス混合体を、１×１０⁶個のＨ−９細胞に添加し、さらに３７℃で ６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を一度洗浄し、２ ４穴多皿プレート内に、各ウェルに成長培地（ＲＰＭＩ、ＰＣＳ１０％、ポリブ レン２μｇ／ｍｌ）２ｍｌを入れた中に置いた。 ｐ．ｉ．５〜１２日について、顕微鏡（倍率×２００）下で、シンシチウムの 存在について細胞を検査した。製造者の指示（Ａｂｂｏｔｔ ａｇ ｔｅｓｔ ＨＩＶＡＧ−１（登録商標）、ヒト血清または血漿におけるヒト免疫不全ウイル ス１型（ＨＩＶ−１）抗原の検出のための酵素免疫検定）にしたがって、感染細 胞からの上澄み液を、ｐ−２４抗原の存在について、ｐ．ｉ．１０日に、１０倍 連続希釈（１／１０〜１／１０００）で検定した。結果は、４５４ｎｍでの吸光 度として示され、より高い吸収度はより高いｐ−２４抗原濃度ひいてはＨＩＶ感 染を示す。上澄み液の連続希釈は、もっとも正確な範囲（＜２．０吸光度単位） においてｐ−２４濃度を検出することができるように行なわれた。 感染細胞の数は、実験の最後（通常、ｐ．ｉ．１５日）に、免疫蛍光検査（Ｉ Ｆ）のために採用されたスライド上の細胞のアセトン固定により測定した。Ｊｅ ａｎｓｓｏｎ他「超免疫血清を利用した細胞培養からのマイコプラズマの除去」 Ｅｘ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１６１：１８１〜１８８（１９８５）に記載された標 準的方法にしたがって、ＨＩＶ感染者からの１／４００希釈超免疫血清、および 、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識した１／１００に希釈さ れた抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｆｒａｎｃｅ）を用いる、間 接的ＩＦ試験が使用された。表３〜６に、ペプチド１〜４０で免疫化されたサル からの超免疫血清のスクリーニングから得られた結果を示す。 表３（Ａ−Ｄ）〜表６において、上澄み液のｐ２４抗原含有量は、上述したよ うに、ＥＬＩＳＡにより分析された。抗原陽性細胞の相対量は、ＡＧ ＰＯＳ細 胞として示され、ここで、パーセンテージは、 −＝０％、＋＝＞０〜２％、＋＋＝３〜１０％、＋＋＋＝１１〜２０％ として示され、パーセンテージの間隔は抗原陽性細胞の数を示している。 表３Ａ（ＨＩＶＮＴ３Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−１〜ｇｐ１２ ０−１０で免疫化されたサル由来の血清を用いて得られた結果を示している。用 いられた細胞は、Ｈ９ ＮＹであり、用いられたウイルスは、実施例２で述べた ＨＴＬＶ−IIIＢ、Ｂａｔｃｈ １８であった。インキュベーションプロトコル は、３７℃で１時間の（ウイルスプラス血清）インキュベーションであった。 表３Ｂ（ＨＩＶＨＮＴ４Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−１１〜ｇｐ １２０−２０で免疫化されたサル由来の血清を用いて得られた結果を示している 。用いられた細胞は、Ｈ９ ＮＹであり、用いられたウイルスは、実施例２で述 べたＨＴＬＶ−IIIＢ、Ｂａｔｃｈ １８であった。インキュベーションプロト コルは３７℃で１時間の（ウイルスプラス血清）インキュベーションであった。 表３Ｃ（ＨＩＶＨＮＴ５Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−２１〜ｇｐ １２０−３０で免疫化されたサル由来の血清を用いて得られた結果を示している 。用いられた細胞は、Ｈ９ ＮＹであり、用いられたウイルスは、実施例２で述 べたＨＴＬＶ−IIIＢ、Ｂａｔｃｈ １８であった。用いられたインキュベーシ ョンプロトコルは３７℃で１時間のウイルスプラス血清インキュベーションであ った。 表３Ｄ（ＨＩＶＨＮＴ６Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−３１〜ｇｐ １２０−４０で免疫化されたサル由来の血清を用いて得られた結果を示している 。用いられた細胞は、Ｈ９ ＮＹであり、用いられたウイルスは、実施例２で述 べたＨＴＬＶ−IIIＢ、Ｂａｔｃｈ １８であった。インキュベーションプロト コルは３７℃で１時間の（ウイルスプラス血清）インキュベーションであった。 表４（ＨＩＶＴＡＢ４．ＸＬＳ）は、第１の試験（表３Ａ〜Ｄ）により決定さ れる推定中和抗体の第１の再試験の結果を示す。各試験において、用いられたウ イルスはＨＴＬＶ−IIIＢ、Ｂａｔｃｈ１８であり用いられた細胞はＨ９ ＮＹ であった。１〜１９列の第１の再試験結果は、中和試験番号５の結果である。イ ンキュベーションプロトコルは３７℃で１時間のインキュベーションであった。 ２０〜３２列の第１の再試験結果は中和試験番号７の結果である。インキュベー ションプロトコルは３７℃で１時間のインキュベーションであった。 表５（ＨＩＶＴＡＢ５．ＸＬＳ）は、陽性ペプチドの第２、第３、第４の再試 験の結果を示す。各試験において、用いられたウイルスはＨＴＬＶ−IIIＢ Ｂ ａｔｃｈ１８であり用いられた細胞はＨ９ ＮＹであった。１〜４列の第２の再 試験結果は、中和試験番号７の結果である。インキュベーションプロトコルは３ ７℃で１時間のインキュベーションであった。５〜１３列の第２の再試験結果は 中和試験番号１２の結果である。１４〜１６列の第３の再試験結果は中和試験番 号１２の結果である。インキュベーションプロトコルは３７℃で１時間のインキ ュベーションであった。１７〜３９列の第４の再試験結果は中和試験番号１６の 結果である。インキュベーションプロトコルは４℃で１６時間であった。４０〜 ５３列の第２の再試験結果は中和試験番号１９の結果である。インキュベーショ ンプロトコルは４℃で１６時間の細胞プラスウイルスであった。 表６（ＨＩＶＫＯＭＢＰ．ＸＬＳ）は、組合せ超免疫血清を用いた中和検定結 果である。ここで、ウイルスおよび細胞のインキュベーションは４℃で１６時間 であった。 表３（Ａ−Ｄ）〜６に示した結果は、本発明のペプチドが、霊長類検体におけ るＨＩＶ中和抗体の産生を誘起することを示している。したがって、ヒト検体の 予防接種にペプチドを使用することによって、ＨＩＶによる感染を防御し、また は、すでにＨＩＶに感染した検体における強化された免疫反応を誘発できる。 実施例６ ＡＤＣＣ検定 ＨＩＶ特異的ＡＤＣＣの測定法はＬｊｕｎｇｇｒｅｎ他が記載している（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９８７，１０４：７；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ ３９：２２６３（１９８７））。簡単に説明すれば、ＨＩＶ−１_HTLVIIIBを用い て連続的に感染させた細胞系Ｕ９３７クローン２をターゲット細胞として用いた 。ＨＩＶ抗体陰性血ドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞 として用いた。ＰＢＭＣは、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＮＮｙｋ ｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ、オスロ、ノルウェー）を用いた密度遠心法によ り集められ、付着細胞はスクラブドナイロンウール法（Ｍｅｒｒｉｌら、Ｅｕｒ ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：５３６（１９８１））によって取り除いた。⁵¹ Ｃｒでラベルしたターゲット細胞（１×１０⁴）およびエフェクター細胞のリン パ球（２×１０⁵）を血清希釈液と混合した。希釈液は、１：３０から始まる６ 段階の３倍連続希釈であった。上澄みを３時間後に取り、放出された放射能を測 定した。自発放出は１０％以下であった。 ＨＩＶ特異的ＡＤＣＣは、ＨＩＶ陽性血清による特異的⁵¹Ｃｒ放出からＨＩＶ 陰性血清による特異的⁵¹Ｃｒ放出を差し引くことによって求められる。特異的Ａ ＤＣＣ指標値（ＳＡＩ）が１：３０で０．５を超える血清がＨＩＶ特異的ＡＤＣ Ｃに関し陽性とみなされた（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９ ８７，１３９：２２６３）。この値は、ＨＩＶ抗体陰性血清により得られた特異 的⁵¹Ｃｒ放出よりも、標準偏差の３倍を超えて、大きな値である。既知のＡＤＣ Ｃタイターを有するＨＩＶ抗体陽性血清も各試験に含めた。ＳＡＩ値が０．５を 超える段階の最終希釈の逆数をＡＤＣＣタイターとした。非感染ターゲット細胞 に対する血清、および、ＨＩＶ抗体陰性対照血清ではＡＤＣＣ活性は認められな かった。 上記実施例５に従って判定された超免疫血清を上記のＡＤＣＣ検定で試験した 。ＡＤＣＣ陽性血清に関する結果のみ下記表７に示す。このグループの他の全て の血清はＡＤＣＣ陰性であった。サル１〜４０の免疫前血清は全て、１：３０の タイターを有していた血清番号３６を除いて、感染したターゲット細胞に対し陰 性 であった。免疫前および超免疫血清の全てが、非感染ターゲット細胞に対してＡ ＤＣＣ陰性であった。 表７に示した結果は、本発明のペプチドが、ＨＩＶ−１_HTLVIIIBｇＰ１２０に 特異的な直線型ＡＤＣＣエピトープを含むことを示している。従って、本発明の ペプチドは、抗体依存性細胞性細胞障害を誘発し、ＨＩＶによる感染の防御を促 進し、ＨＩＶにすでに感染した患者において強化された免疫反応を誘発するのに 使用できる。 本発明の新規ペプチドの各々について活性エピトープに必要な正確なアミノ酸 を決定するために、欠失分析を下記実施例の通り行った。 実施例７ ペプチドの欠失分析 本発明のペプチドは本明細書に記載した通りの形でも、延長または短縮された 活性形でも使用できる。配列からのアミノ酸の除去または配列へのアミノ酸の付 加が、上記のようなペプチドの利点の特性に影響するかどうかを決定するために 、活性エピトープを含む配列部分を特定する通常の実験を行うことができる。例 えば、ｇｐ１２０−１について、１、２、３またはそれ以上のアミノ酸が、カル ボキシル末端、アミノ末端またはその両方から欠失しているペプチドを合成し、 これらペプチドを実施例４〜６に従って、系統的に試験することによって欠失分 析が行われる。得られる短縮ペプチドが、防御的または中和抗体の産生に関し、 非短縮形のものと免疫学的に等価である場合、問題の特性に関与するエピトープ は短縮配列内に存在すると結論できる。同様に、１、２、３またはそれ以上の（ 任意のアミノ酸から選択された）アミノ酸をペプチドのいずれかの末端に付加し た後、配列を試験できる。得られるペプチドが、非改変ペプチドに関し実施例４ 〜６で特定された特性を実質的に有する場合、改変されたペプチドは本発明の目 的に関し免疫学的に等価であると認められる。 試験すべきペプチドをデノボ(de novo)合成する他、アミノ酸を、本明細書に 開示の何れかの配列番号のペプチドから化学的に除去することもできる。例えば 、その開示を引用によりここに含めるＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ「有機化 学」第３版、１１４５〜１１４６頁（１９７６）に開示の方法により除去するこ とができる。要約すれば、フェニルイソチオシアネートを、ペプチドのＮ−末端 残基 に置換チオウレアを形成するために使用する。塩酸による穏和な加水分解で選択 的にＮ−末端残基をフェニルチオヒダントインとして除去する。残るペプチド鎖 は無傷のままであり、上記の実施例４〜６に開示の方法によって免疫学的活性を 検定する。残るペプチド鎖からＮ−末端残基を順次除去し、得られるペプチドを ＨＩＶ−特異的ＡＤＣＣを誘発する活性に関し試験するという、この手順を活性 が失われるまで繰り返す。この様にして、活性エピトープのアミノ酸配列が決定 される。 あるいは、Ｃ−末端アミノ酸を、遊離型のα−カルボキシル基の隣のペプチド 結合のみを切断する酵素であるカルボキシペプチダーゼを用いて選択的に除去す る。また、トリプシン、キモトリプシン、ペプシンのような酵素を使用して、本 発明のペプチドを小断片にしてもよい。次いで、これらの小断片は、実施例４〜 ６に記載した方法により分析される。 本発明の特定の態様について詳しく説明したが、これらの態様は例であって限 定的でないことは当業者に明らかであり、本発明の正しい範囲は添付の請求の範 囲に定義された通りである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リーモ，ラーシュ スウェーデン，フーヴォース，エス―430 80，ヘッレクーラヴェーゲン 17 (72)発明者 イェンソン，スティーグ スウェーデン，イェーテボリ，エス―411 27，フェレーニングスガータン 33 (72)発明者 ホーラル，ペーテル スウェーデン，イェーテボリ，エス―412 66，オランジェリーガータン 21 ビー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０蛋白質由来のエピトープアミノ酸配列を含 むペプチドであって、前記エピトープは、配列番号１、配列番号５、配列番号６ 、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列 番号２０、配列番号２１、配列番号３６または配列番号４１の範囲内に位置し、 前記エピトープ配列に対してサルで産生した抗血清が、１：３０を超える希釈で ０.５を超える特異的抗体依存性細胞性細胞障害指標値を有する、前記ペプチド 。 ２．エピトープ配列が、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配 列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番 号２１、配列番号３６および配列番号４１からなるグループから選択される配列 から本質的になるアミノ酸配列である請求の範囲第１項に記載のペプチド。 ３．医薬的に許容可能な担体と共に、請求の範囲第１項に記載のペプチドを、哺 乳動物において免疫反応を誘発するのに有効な量含むワクチン組成物。 ４．アジュバントをさらに含む請求の範囲第３項に記載のワクチン組成物。 ５．前記アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジ ュバント、ムラミルジペプチド、レバミソール、イソプリノシンおよびタフトシ ンからなるグループから選択される請求の範囲第４項に記載のワクチン組成物。 ６．医薬的に許容可能な担体と共に、哺乳動物において免疫反応を誘発するのに 有効な量の２種以上のペプチドを含み、前記ペプチドの各々が請求の範囲第１項 に記載のペプチドを包含する、ワクチン組成物。 ７．アジュバントをさらに含む請求の範囲第６項に記載のワクチン組成物。 ８．前記アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジ ュバント、ムラミルジペプチド、レバミソール、イソプリノシンおよびタフトシ ンからなるグループから選択される請求の範囲第７項に記載のワクチン組成物。 ９．哺乳動物に請求の範囲第３項に記載の組成物を投与するステップを含む、ヒ ト免疫不全ウイルスの感染から哺乳動物を防御する方法。 １０．前記組成物が請求の範囲第６項に記載の組成物である請求の範囲第９項に 記載の方法。 １１．前記投与ステップが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射または腹膜腔内 注射を含む請求の範囲第９項に記載の方法。 １２．請求の範囲第３項に記載の組成物を、抗体を誘発するのに有効な量投与す るステップを含む、哺乳動物において中和抗ＨＩＶ抗体を誘発する方法。 １３．前記組成物が請求の範囲第６項に記載の組成物である請求の範囲第１２項 に記載の方法。 １４．ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０蛋白質由来のエピトープアミノ酸配列を 含むペプチドであって、前記エピトープは、配列番号１、配列番号５、配列番号 ６、配列番号７、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１９、配 列番号２０、配列番号２１、配列番号３６または配列番号４１の範囲内に位置し 、前記エピトープ配列に対してサルで産生した抗血清が、１：３０を超える希釈 で０．５を超える特異的抗体依存性細胞性細胞障害指標値を有する前記ペプチド の、ヒト免疫不全ウイルスに対して哺乳動物を免疫するための医薬組成物の製造 のための使用。 １５．前記組成物が請求の範囲第６項に記載の組成物である請求の範囲第１４項 に記載の使用。