JPH09500104A - 中耳炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 今回、型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼの菌体表面付属構造物から得られる繊維状タンパク質であるフィンブリンからなるワクチンが、中耳炎の研究、その予防又は症状の軽減に有用であることが判明した。同時に、フィンブリンをコードするＤＮＡの遺伝子配列及びフィンブリンのアミノ酸配列についても決定した。フィンブリンをコードするＤＮＡを含んだベクターも開発し、かかるベクターを含んでいて上記ＤＮＡを発現しかつ純粋なフィンブリン源を与える形質転換体を調製した。

Description

【発明の詳細な説明】 中耳炎ワクチン 発明の背景 中耳炎は中耳の感染症であって主に小児に発症する。治療せずに放っておくと 、この病気は難聴を引き起こすことがあり、発育の遅れをきたす可能性もある。 １９８７−８７の期間に呼吸器系の疾患で診療所を訪れた１億３千万人の患者う ちの３千百万人が中耳炎が原因であったと推計されている。最近のデータの示す ところでは、不特定の化膿性中耳炎は、内科医のもとを訪れる２４歳以下の年齢 の患者に対して診断を下す必要のある最も一般的な３０の病名リストのトップに ランクされる。この病気の治療には年間１０億ドル以上も使われており、勤労世 帯の所得からその治療費として支出される金額は３億ドル乃至６億ドルにものぼ ると推計されている。全児童のおよそ８３％が３歳までに少なくとも１度は急性 中耳炎に罹患した経験をもつと推測される。ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈ ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の型別不能な菌株は、中耳炎の 全症例の２５〜３０％、及び再発性中耳炎の５３％の原因となる菌であり、滲出 を伴う慢性中耳炎の６２％の症例で単離されている主たる病原菌である。型別不 能なヘモフィルス・インフルエンゼ（ＮＴＨｉ）は中耳炎の主たる病原菌である にもかかわらず、この病気の発病メカニズムについても宿主の免疫反応について も完全には解明されていない。 型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼに対する免疫を賦与するか或いはヘ モフィルス・インフルエンゼによって引き起こされる中耳炎の症状を軽減するた めのワクチンがあれば非常に望ましいはずである。 発明の概要 今回、型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼの菌体表面付属構造物から得 られる繊維状タンパク質であるフィンブリンからなるワクチンが、中耳炎の研究 、その予防又は症状の軽減に有用であることが判明した。同時に、フィンブリン をコードするＤＮＡの遺伝子配列及びフィンブリンのアミノ酸配列についても決 定 した。今回、フィンブリンをコードするＤＮＡを含んだベクターも開発し、かか るベクターを含んでいて上記ＤＮＡを発現しかつ純粋なフィンブリン源を与える 形質転換体を調製した。 図面の簡単な説明 図１は、Ａ)クーマシーブリリアントブルーで染色した、(ａ)分子量標準マー カー；(ｂ)ＮＴＨｉの１１２８株から調製した全外膜タンパク；及び(ｃ)１１２ ８株から単離したフィンブリン；のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド ゲル電気泳動図（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）である。 図２は、同一のＮＴＨｉ菌株１１２８を投与して免疫処置したチンチラの鼓膜 の、ＨＥ染色（ヘマトキシリン-エオシン染色）した組織切片の光学顕微鏡写真 である。チンチラの免疫処置は、(Ａ)対照標品；(Ｂ)１１２８株の全外膜タンパ ク；(Ｃ)１１２８株から単離したフィンブリン；(Ｄ)１１２８株の単離主要外膜 タンパク；を用いて行った。顕微鏡写真(Ｅ)はチンチラの正常な鼓膜を示す。こ れらの顕微鏡写真の倍率はすべて２１０×である。組織を示すのに使用した略号 は次の通りである：Ｅｐ＝表皮層；ＣＴ＝繊維層の結合組織；ＭＥＭ＝中耳粘膜 ；ＭＥＣ＝中耳腔；ＲＢＣｓ＝赤血球。対照チンチラ(Ａ)の鼓膜（ＴＭ）では、 ＣＴ層が肥厚し浮腫を起こしているのが分かる。正常な鼓膜(Ｅ)と比較して、鼓 膜の肥厚の最も少ないものはＢとＣであることに注目されたい。１１２８株から 単離された主要外膜タンパクで免疫処置したチンチラ(Ｄ)では、鼓膜が著しく肥 厚しており、出血を伴っていることが繊維層（ＣＴ）に赤血球(ＲＢＣｓ)及び浮 腫が存在していることから分かる。 図３は、同一のＮＴＨｉ菌株１１２８を投与して免疫処置したチンチラの中耳 粘膜の、ＨＥ染色した組織切片の光学顕微鏡写真である。チンチラの免疫処置は 、(Ａ)対照標品；(Ｂ)１１２８株の全外膜タンパク（ＯＭＰ）；(Ｃ)ＮＴＨｉ １１２８株から単離したフィンブリン；(Ｄ)１１２８株の単離主要外膜タンパク ；を用いて行った。顕微鏡写真(Ｅ)はチンチラの正常な中耳粘膜を示す。これら の顕微鏡写真の倍率はすべて２１０×である。ＥＸ＝滲出液；ＭＥＣ＝中耳腔； ＭＥＭ＝中耳粘膜；ＮＢ＝新生骨（骨新生）；ＲＢＣｓ＝赤血球；ＣＴ＝結合組 織。 図４(Ａ)は、ＮＴＨｉ １１２８株のエポン包埋薄切片試料の透過型電子顕微 鏡写真であり、細い繊維状の周毛性線毛を示す。 図４(Ｂ)は、チンチラ抗フィンブリン抗血清と金粒子結合プロテインＡを用い て間接的に免疫標識し、シャドウイングした無固定・無染色ＮＴＨｉ １１２８ 株の透過型電子顕微鏡写真である。線毛は、黒色の金粒子で標識された白色の「 細いすじ」として見える。 図５は、ＮＴＨｉフィンブリンのヌクレオチド配列である。推定アミノ酸配列 をＤＮＡ配列の下に示した。大文字はオープンリーディングフレーム（読取り枠 ）に対応する。フィンブリンのアミノ酸配列決定によって求めたＮ末端及び内部 ＣＮＢｒ断片のアミノ酸配列を下線で示した。リボソーム結合部位を二重下線で 示した。フィンブリン遺伝子の下流に位置するステムループ構造を太字と下線で 示した。 図６は、サザーンハイブリダイゼーションブロッティング分析の結果を示す図 である。親株のＮＴＨｉ １１２８株のゲノムＤＮＡをパネルＡのレーン１、２ 、３、４及びパネルＢのレーン１で泳動し、変異株のＤＮＡをパネルＡのレーン ５、６、７、８及びパネルＢのレーン２、３、４、５で泳動した。ＥｃｏＲＩで 完全に消化したＤＮＡをパネルＡのレーン１と５及びパネルＢのレーン１と２で 泳動し、ＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIII（パネルＡのレーン２と６及びパネルＢのレー ン３）、ＥｃｏＲＩ-ＰｓｔＩ（パネルＡのレーン３と７及びパネルＢのレーン ４）及びＴａｑＩ（パネルＡのレーン４と８及びパネルＢのレーン５）のＤＮＡ 消化物についても同様に泳動した。電気泳動は１％アガロースゲル上で行い、ニ トロセルロース膜に移して、³²Ｐ標識フィンブリン遺伝子（パネルＡ）及び³²Ｐ 標識クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（パネルＢ）をプ ローブとして検出した。 図７は、(ｂ)ＮＴＨｉ １１２８株の単離フィンブリンの上方バンド、(ｃ)Ｎ ＴＨｉ １１２８株の全外膜タンパク、(ｄ)変異株の全外膜タンパク、(ｅ)変異 株の単離下方バンドに対して、親株ＮＴＨｉ １１２８株の単離フィンブリンの 上方バンドに対するポリクローナル抗血清をプローブとして用いて検出したウエ スタンブロッティング分析の結果を示す図である。レーン(ａ)は予め染 色しておいた分子量標準マーカーを含んでいる。 図８は、次のヘモフィルス・インフルエンゼ臨床単離株（型別不能及びｂ型） ：(ａ)８６-０４２；(ｂ)８６-０４３；(ｃ)１６６７ ＭＥＥ；(ｄ)１１２８；( ｅ)１８８５ ＭＥＥ；(ｆ)１６９ ｐ＋；(ｇ)９０-１００Ｌ；(ｈ)９００-１０ ０ Ｒ；(ｉ)９０-１１１ Ｌ；(ｊ)９０-１１２ Ｒ；(ｋ)９０-１１４ＮＰ；(ｌ) ９０-１１４ Ｌ；(ｍ)Ｍｒ １３ ｐ−；(ｎ)Ｍｒ １３ ｐ＋；(ｏ)Ｅａｇａｎ ｐ＋；(ｐ)Ｅａｇａｎ ｐ−、から得た全外膜タンパク標品に対して、標準チン チラ血清プール（Ａ及びＢ）又は１１２８株から単離したフィンブリンで免疫処 置して得たチンチラ血清（Ｃ及びＤ）をプローブとして用いて検出したウエスタ ンブロッティング分析の結果を示す図である。 図９は、ｐＥＴ３ａ（レーン１）で形質転換或いは０.５ｍＭ ＩＰＴＧでの誘 導前にｐＮＨＦで形質転換（レーン２）又は０.５ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導後にｐ ＮＨＦで形質転換（レーン３）した大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)/ｐＬｙｓ Ｓ株から 調製した菌体溶解物のウエスタンブロッティング分析の結果を示す図である。ブ ロットは、ＮＴＨｉ １１２８株の単離フィンブリンに対するチンチラポリクロ ーナル抗血清（２５０分の１に稀釈）をプローブとして用いて検出した。 図１０は、組換え型（レーン１）及び野生型（レーン２）バキュロウイルス感 染細胞中でのフィンブリンの発現を示す図である。感染細胞の細胞抽出液をＳＤ Ｓ-ＰＡＧＥにかけ、ＮＴＨｉ １１２８株の単離フィンブリンに対するチンチラ ポリクローナル抗血清（２５０分の１に稀釈）を１次抗体として用いたウエスタ ンブロッティングにより分析した。 発明の詳細な説明 今回、表面付属構造物である線毛が、慢性中耳炎に罹患した小児の中耳及び鼻 咽頭から採取したすべて（１００％）の細菌で生産されることを発見した。線毛 は、透過型電子顕微鏡での研究から、細菌の表皮粘膜への最初のドッキング又は 付着に関与しているらしい。 線毛を構成するタンパク質であるフィンブリンをワクチンとして動物に投与す ると、フィンブリンに対する免疫反応が誘起され、ワクチン接種した動物が後で ＮＴＨｉにさらされても重症の中耳炎から防御されることが判明した。金標識抗体による線毛の位置の確認 単離フィンブリンに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（ＭＡ ｂ ４Ａ５ｕと命名）両者の組合せによるＮＴＨｉ線毛の標識の解像度をさらに 高めることを目的として、顕微鏡写真に高低差の感じを出すために、無固定・無 染色のまま金標識抗体で標識した細菌全体を低角度白金-パラジウムシャドウイ ング処理した。図４に示す通り、単離フィンブリンで免疫処置したチンチラの集 団から採取した抗血清プールで、ＮＴＨｉ １１２８株、すなわちＡｍｅｒｉｃ ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号 （受託番号は未だ付与されていない）を標識した。このような標識実験か ら、検査した中耳炎単離物すべて（１００％）において、単離フィンブリンで免 疫処置したチンチラにおける免疫反応が線毛に対するものであったことが判明し た。受動免疫 フィンブリンのサブユニットタンパク質に対する動物の免疫反応によって賦与 される生体防御を、実験的中耳炎のチンチラ模擬実験で求めた。ＮＴＨｉ １１ ２８株から単離したフィンブリンに対するチンチラ又はウサギの高度免疫血清５ ｍｌ／ｋｇでチンチラを受動免疫した。対照チンチラには、ウサギ又はチンチラ の標準血清を投与した。次に、チンチラに骨性外耳道経由で同種ＮＴＨｉ（すな わち、２.５〜３.５ｃｆｕ／耳のＮＴＨｉ １１２８株）を感染させた。チンチ ラを検査してその病状の重さを調べた。表１に示す通り、免疫処置したウサギ又 はチンチラの血清を投与した免疫チンチラでは、鼓膜の病状が軽減した（それぞ れ、ｐ≦０.０５及びｐ≦０.００１）。表２に示す通り、チンチラ抗フィンブリ ン血清を投与したチンチラ群では、対照群と比べると、中耳分泌液の存在数が少 なかった。 ＮＴＨｉに対する能動免疫用のワクチンを調製するため、次の幾つかのＮＴＨ ｉタンパクを単離した：ＮＴＨｉ １１２８株のフィンブリン；ＮＴＨｉ １８８ ５株、ＡＴＣＣ受託番号 （受託番号は未だ付与されていない）のフィン ブリン；及びＮＴＨｉ １１２８株の全外膜タンパク。ここではＮＴＨｉの１１ ２８株と１１８５株について述べるが、ＡＴＣＣ番号４３０４１として公衆の入 手可能な菌株を含め、他の型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼ株も使用し 得る。フィンブリン及び全外膜タンパクの単離 Ｃａｒｌｏｎｅ他の“Ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒｉｓ ｏｌａｔｉｎｇ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ-ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｏｕｔｅｒｍｅｍｂ ｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ ”と題する報文(１９８６)，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４，３３０ 、に記載の方法の修正法で外膜タンパクを単離した。ＮＴＨｉの１８８５株と１ １２８株の各々を次の通り培養した。ＮＴＨｉを、５％ＣＯ₂及び９５％空気の 湿性雰囲気中、３７℃に恒温維持した２ｍｇＮＡＤ/ｌ；２ｍｇヘミン/ｌ添加ブ レーンハートインフュージョン培地中で１８時間増殖させた。次にＮＴＨｉを４ ℃で２０分間４０００×ｇで遠心して上清をデカントして回収した。ＮＴＨｉの 菌体ペレットを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）に再懸濁し、目盛り６ ０％にセットしたＡｒｔｅｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ.製のＡｒｔｅｋ Ｓｏｎ ｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒモデル１５０を用いて氷上において２０秒間の パルスで３度超音波処理した。超音波処理試料を４℃で５分間９１００×ｇで遠 心した。ペレットを回収し、その上清については再度遠心して粗外膜画分を回収 した。これらのペレットを一緒にして１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液に再懸濁し、 同体積の２％(ｗ/ｖ)サルコシル含有１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液と混合した。こ の懸濁液を随時振盪しながら室温で６０分間インキュベーションした。しかる後 に、懸濁液を４℃で３０分間５９００×ｇで遠心して、ペレットを回収した。２ ００ｍｌの再蒸留水でペレットを懸濁しないようにペレット表面を穏やかに洗浄 した。ペレットを２０ｍｌ再蒸留水に懸濁して外膜タンパク懸濁液を得た。この 外膜タンパク懸濁液をアリコ ートに分割して凍結し、７０℃で保存した。ＮＴＨｉの１１２８株から上述の方 法で単離した全外膜タンパクを動物の能動免疫用の免疫原として使用した。 フィンブリンを単離するため、上記全外膜懸濁液を、当業者にはスラブゲルと して知られる大型の５〜２０％連続濃度勾配ポリアクリルアミドゲルにかけた。 このスラブゲルを３０ｍＡ/ゲルでおよそ４時間泳動して、水洗した。スラブゲ ルを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手 したＩＳＳ Ｐｒｏ-Ｇｒｅｅｎ染色系を用いて製造業者の指示通り１０分間又は 一晩ネガティブ染色した。フィンブリンのバンドを、隣のレーンで泳動した分子 量標準マーカーに対する相対的な移動度から同定した。２５.５ｋＤａのバンド をカミソリで切り出してフィンブリンを得たが、３７.５ｋＤａのバンドをその ２次構造に再構成することができれば３７.５ｋＤａバンドも使用することがで きる。この３７.５ｋＤａバンドはフィンブリンが完全に変性したものを含んで いる。フィンブリンを得るために、２５.５ｋＤａバンド全体を切り出して約１ ｃｍ長に細片した。バンドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙ ｓｔｅｍｓ社の指示通り脱染色した。次に、４〜５個のゲルの細片を電気溶出チ ューブに入れて９ｍＡ／チューブで４時間電気溶出した。Ｂｉｏ-Ｒａｄ Ｅｌｅ ｃｔｒｏ-Ｅｌｕｔｅｒ及びメンブランキャップｗ/１２０００ＭＷＣＯからの電 気溶出チューブの回収チップに電気溶出タンパク質を集めた。電気溶出したタン パク質を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｃｒｏ-ＰｒｏＤｉｃｏｎ社製（テキサス州ヒ ューストン）から入手した分子量カットオフ１００００の透析膜を用いて蒸留水 に対して２４時間透析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動標品の銀染色で他の外膜 タンパク質による汚染がみられなくなるまで、上記の手順を繰り返した。このよ うにしてＮＴＨｉの１１２８株及び１８８５株から単離したフィンブリンを、動 物の能動免疫の免疫原としても使用した。 さらに、ネガティブ染色試料の透過型電子顕微鏡によって外膜タンパク標品を 観察して、単離フィンブリンが透析によってフィラメントへと再構成されること を確認した。能動免疫 それぞれ１０匹のチンチラからなる集団５組について、塩類対照標品或いは次 の免疫原：１１２８株から得た全外膜タンパク標品；ＮＴＨｉ １１２８株から 得た単離フィンブリン；ＮＴＨｉ １８８５株から得た単離フィンブリン；又は １１２８株の主要外膜タンパク質を構成するがフィンブリンサブユニットとは無 関係の、４０.５ｋＤａの単離主要外膜タンパク、のいずれかで能動免疫した。 ４０.５ｋＤａの主要外膜は「Ｐ２」タンパク質としても知られている。これら すべての免疫原について、それらを免疫原として使用する前に、Ｗｈｉｔｔａｋ ｅｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社からＱＣＬ-１０００という商品名で市販されて いる発色性変形細胞溶解物アッセイでそれらのエンドトキシン（内毒素）含量を 調べた。チンチラに、完全フロイントアジュバント中の免疫原１００μｇを皮下 注射した。次いで３０日後に、不完全フロイントアジュバント中の同一免疫原５ ０μｇを注射した。２度目の追加免疫後に、５匹の集団を２つのグループに分け 、１１２８株又は１８８５株のいずれかを骨性外耳道経由で感染させた。チンチ ラを４週間にわたって次の検査項目、耳鏡検査による鼓膜の病状；下位骨性外耳 道の上鼓室穿刺によって回収したＮＴＨｉの半定量的計数；固定した中耳表皮粘 膜及び鼓膜の組織病変についての光学顕微鏡検査、について調べた。 表３及び表４に示す通り、１１２８株の全外膜タンパク標品及び単離フィンブ リンは、同種有線毛ＮＴＨｉ株（すなわち、ＮＴＨｉ １１２８株）を感染させ たチンチラの鼓膜病状を軽減するのに、どちらも同じ様に有効であった（ｐ≦０ .００１）。１１２８株から得た全外膜タンパクでの免疫処置はＮＴＨｉ １８８ ５株による異種感染からの防御にも有効であり（ｐ≦０.００１）、フィンブリ ンでの免疫処置よりも中耳における滲出又は細菌増殖が少ない。１８８５株から 得たフィンブリンでの免疫処置は、同種感染（ｐ≦０.０１）及び異種感染（ｐ ≦０.０２）のいずれについても防御効果が幾分低かった。分子量約４０.５ｋＤ ａの主要外膜タンパクでの免疫処置は、１１２８株及び１８８５株のいずれの感 染に対しても防御効果を発揮しなかった。実際、分子量約４０.５ｋＤａの主要 外膜タンパクを投与したチンチラは、耳鏡検査で鼓膜の病状が著しく悪化してい ることが判明した（ｐ≦０.００５）。 対照の塩類対照標品で免疫処理したチンチラでは、鼓膜及び中耳粘膜共に中程 度の組織病変を示した。図２に示す通り、鼓膜が肥厚して繊維層に浮腫がみられ たが、中耳粘膜検体では粘膜の肥厚、骨新生並びに表皮下に存在する赤血球と炎 症細胞の存在が最も少なかった。中耳腔に多形核白血球滲出液が密集して存在し ていた。 ＮＴＨｉの１１２８株から得た全外膜タンパク又はフィンブリンで免疫処置し たチンチラでは、鼓膜の組織病変が対照チンチラに比べると軽かった。フィンブ リンよりも全外膜タンパクを投与したときのほうが、滲出液のみられない耳又は 無菌滲出液が観察されることが多かった。図３に示す通り、全外膜タンパクを投 与した場合、多形核白血球からなる滲出液は中耳腔には存在しなくなる。図３か ら、正常チンチラ(Ｅ)に比べて最も粘膜層の肥厚が小さかったのは対照チンチラ (Ａ)であることが分かる。中耳腔に多形核白血球が密集して存在していたが、こ れはＮＴＨｉによる中耳炎の感染後に典型的にみられる。全外膜タンパクで免疫 処置したチンチラ(Ｂ)では、粘膜のＣＴ層がかなり肥厚しており、表皮下で出血 していることが赤血球の存在及び若干の骨新生から分かる。フィンブリンで免疫 処置したチンチラ(Ｃ)では、全外膜タンパクで免疫処置したチンチラ(Ｂ)の場合 と類似してはいたが、さらに、主に多形核白血球からなる滲出液が中耳腔に観察 された。１１２８株の単離主要外膜タンパクで免疫処置したチンチラ(Ｄ)では、 中耳粘膜に炎症がみられる点で（ＮＴＨｉ感染させたすべてのチンチラで観察さ れた通り）類似していたが、極度の骨新生、滲出液に占める単核白血球の割合が 多くなり、中耳膜の表皮層の病巣剥離の形跡が観察され、その病状の重さは他の 集団では観察されなかったものである。 このように、フィンブリン又は外膜タンパクでのワクチン接種によって誘導さ れるフィンブリンに対する抗体は、ＮＴＨｉによって引き起こされる中耳炎から の防御に寄与する。 フィンブリンは、ＮＴＨｉから単離されたものであっても或いは全外膜タンパ ク標品の一成分であっても、能動又は受動免疫によって中耳炎に対する防御反応 を賦与するので、免疫賦活剤として使用するのに適している。最大範囲の防御を 与えるために、痘苗原（ｖａｃｃｉｎｏｇｅｎ）は、防御作用が高くかつ広域交 差反応性をもつ免疫反応を引き起こすべきである。中耳炎から単離された ＮＴＨｉにはかなりの不均質性がみられるので、ヘモフィルス・インフルエンゼ の無作為に選んだ１５株のｂ型及び型別不能な臨床単離菌の菌体外膜から全外膜 タンパク質を単離した。ワクチンの防御作用と交差反応性の程度を調べるために 、上記の各菌体外膜を界面活性剤で可溶化し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを行って、ＮＴ Ｈｉ １１２８株から単離したフィンブリンに対するチンチラのポリクローナル 抗血清をプローブとして用いたウエスタンブロッティング分析に付した。図８に 示す通り、ウエスタンブロッティングの結果から、１５株すべての菌体外膜単離 物においてほぼ同一の泳動バンドでチンチラポリクローナル抗血清との反応が観 察され、これら１５株の各々に存在するフィンブリンが血清学的に関連している ことを示していた。したがって、異なる１５株のフィンブリンは共通のエピトー プを有している。このように、ＮＴＨｉ １１２８株から単離したフィンブリン は、中耳炎の原因となる様々な型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼの感染 を防御するための特に好適な免疫原である。 フィンブリン遺伝子のクローニング及び配列決定 ＮＴＨｉ １１２８株から単離した染色体ＤＮＡを超音波処理で剪断し、２〜 ５ｋｂのＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲルを用いて単離した。これらの ＤＮＡフラグメントにＳｔｒａｔａｇｅｎ社製のＮｏｔ-ＥｃｏＲＩリンカー-ア ダプターを付加して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社製のλｇｔ１１と連結した。Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎ社製のＧｉｇａｐａｃｋ Ｐｌｕｓを製造業者の指示通り使用して 、上記連結ＤＮＡをλ粒子中にインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でパッケージ ングして、ゲノムライブラリーを得た。プラークハイブリダイゼーションでゲノ ムライブラリーをスクリーニングするため、６２４ｂｐのＰＣＲ（ポリメラーゼ 連鎖反応）生成物プローブを下記に述べる通り作製した。 最初に、上述の通り１１２８株から単離したフィンブリン１００μｇをＣＮＢ ｒ５００μｇ及びトリプファン５μｇと共に７０％ギ酸１００μｌに懸濁するこ とによって、フィンブリンをＣＮＢｒで切断した。切断したタンパクを回収し、 蒸留水で数回洗浄した。 この切断されたタンパク断片をポリアクリルアミドゲルにかけ、前記と同一の 条件下で泳動し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＩｍｏｂｉｌｏｎ膜に移した。約２ ｐｇ以上のバンドをすべて切り出し、タンパク断片の配列を南カリフォルニア大 学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，リ バーサイド）に委託してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７５パルス式 液体タンパクシークエンサー及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｍ ｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒで決定した。タンパク断片を含んだ２つの 最も主要なバンドはＮ末端ペプチドと内部ペプチドであることが判明し、それぞ れ２０残基及び１５残基のＡＰＱＥＮＴＦＹＡＧＶＫＡＧＱＧＳＦＨＤとＶＳＫ ＴＦＳＬＮＳＤＶＴＦＡＦという配列であることが分かった。これらのアミノ酸 配列に基づいて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ合成装置 で２種類のヌクレオチド配列を合成し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製のオリゴヌクレオチドカートリッジで精製した。これら２種類のヌクレオチ ド配列は、Ｇｌｎ３からＡｌａ９のアミノ酸配列に対応する１２８通りの縮重を もつ５′-ＣＡ(ＡＧ)ＧＡ(ＡＧ)ＡＡ(ＣＴ)ＡＣ(ＡＧＴＣ) ＴＴ(ＣＴ)ＴＡ(ＣＴ)ＧＣ−３′の２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドと、Ｐｈｅ１ ５からＡｓｐ１０のアミノ酸配列に対応する５１２通りの縮重をもつ５′-ＡＡ Ａ(ＡＧＴＣ)ＧＣ(ＡＧ)ＡＡ(ＡＧＴＣ)ＧＴ(ＡＧＴＣ)ＡＣ(ＧＡ)ＴＣ-３′の １８ｍｅｒオリゴヌクレオチドであった。１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをセン スプライマーとして使用し、２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドはフィンブリンのＮ 末端領域をコードするゲノムＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンス プライマーとして使用した。ＰＣＲ生成物を次の通り得た。１００ｎｇゲノムＤ ＮＡ、５０ｐｍｏｌの２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマー、５０ｐｍｏｌ の１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドプライマー、１０ｎｍｏｌの各デオキシヌクレ オシド三リン酸及びＧｉｂｃｏ社製のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ５ユニットを含 む混合物を最終体積１００μｌで調製した。上記混合物中のゲノムＤＮＡを９４ ℃で１分間変性させ、次に５０℃で約２分間アニーリングし、７２℃で約２分間 伸張させた。最後のアニーリングステップは７２℃で約１０分間行い、ＰＣＲ増 幅生成物を含んだ混合物を得た。このＰＣＲ増幅生成物をアガロースゲルで泳動 し、アガロースゲルから精製し、Ｂａｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製のラン ダムラベリングキットを用いて³²Ｐ標識して、放射性標識した６２４ｂｐのＰＣ Ｒ生成物プローブを得た。 この６２４ｂｐのＰＣＲ生成物プローブをハイブリダイゼーションプローブと して用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ著、Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２ 版（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）発行）に記載された方法に したがって、上記ゲノムライブラリーをスクリーニングした。上記６２４ｂｐの ＰＣＲ生成物は、ゲノムライブラリーの中の３つのファージプラークとハイブリ ダイズした。上記ハイブリダイゼーションは、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のＭｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版 （１９８９）に記載された５０％のホルムアルデヒド含有標準溶液を用いて４２ ℃で一晩行った。フィルターを６５℃の０.１％ＸＳＳＣ及び１１％ＳＤＳ中で ３０分間洗浄し、Ｘ線フィルム に暴露した。陽性プラークはラジオグラフから同定し、寒天プラグから回収した 。ファージプラークから得た３種類のＤＮＡフラグメントを「λＦＤ１」、「λ ＦＤ２」及び「λＦＤ」と名付けた。ファージＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消 化し、スピン溶出法で単離した。これらのＤＮＡフラグメントを、Ｓｉｇｍａ社 から入手可能なプラスミドｐＵＣ１８にサブクローニングした。これらのファー ジに挿入されたヘモフィルス・インフルエンゼＤＮＡフラグメントから、「ＦＤ １」、「ＦＤ２」及び「ＦＤ３」と名付けたプラスミドが得られた。これらのプ ラスミドの配列決定により、これらがフィンブリン遺伝子配列の異なる重複部分 をコードしているが、これらのいずれもが遺伝子全体を含んでいないことが判明 した。２３７ｂｐが重複しているプラスミドＦＤ１とＦＤ３を使用して、フィン ブリンのコーディング配列全体とその５′及び３′フランキング領域を含んだプ ラスミドを構築した。５′上流領域とフィンブリン遺伝子の最初の４５０ｂｐを 含んでいるプラスミドＦＤ１のＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIIIフラグメントを単離して 、これを、ＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIIIで消化し脱リン酸化しておいたプラスミドＦ Ｄ３に挿入して、「ＦＤ」と名付けたプラスミドを構築した。 プラスミドλＦＤ中のインサートフラグメントからフィンブリン遺伝子のヌク レオチド配列を決定した。このインサートの両方の鎖の配列を、Ｕ.Ｓ.Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ社製のシークエンサーＳｅｑｕｅｎｃｅ ２.０を用いて、上記Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ他のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版（１９８９）に記載のサンガーのジデオキシチェイン ターミネター法で決定した。ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を図５に示す。全 フィンブリン遺伝子は、４０６位のＡＴＧコドンから始まり、１４８５位のＴＡ Ａ終止コドンで終わる１０７７ｂｐのオープンリーディングフレーム（読取り枠 ；ＯＲＦ）を含んでいる。このオープンリーディングフレームの前には、大腸菌 のコンセンサス配列に類似していて開始コドンの１１ｂｐ上流から始まる推定リ ボソーム結合部位ＡＧＧＡが存在する。オープンリーディングフレームの下流に はロー（ρ）因子依存性の転写ターミネーターと一致するステムループ構造が存 在している。成熟型フィンブリンをコードする配列の前に、２１個のアミノ酸残 基からなる典型的なシグナル配列の特徴をもったリーダーペ プチドがコードされている。フィンブリン遺伝子は当初は３５９個のアミノ酸か らなる前駆体として翻訳され、その後でシグナル配列がプロセッシングを受けて ３３８残基のアミノ酸からなる成熟型フィンブリンとなる。計算上の分子量は３ ６.４ｋＤａであり、図１Ａのレーン３に示すＳＤＳ-ＰＡＧＥにおける上方バン ドの分子量とほぼ一致する。このバンドが真のフィンブリンであると考えられる 。図５に示す通り、フィンブリン遺伝子から推定されるアミノ酸配列は、精製フ ィンブリンのＣＮＢｒ切断で得られたＮ末端及び内部ペプチドのアミノ酸配列と 一致する。 ここで説明したフィンブリンをコードするオープンリーディングフレームは、 大腸菌その他の発現系において組換えタンパク質を発現させるのに使用すること ができる。その２つの具体例を以下に述べる。例１ ＮＴＨｉ １１２８株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いてフィンブリン遺伝子 のコーディング配列を増幅するためのＰＣＲのプライマーとして、フィンブリン 遺伝子のコーディング配列の最初の６つのコドンと最後の６つのコドンを基にし た２つのオリゴヌクレオチドを使用した。合成ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＮ ｄｅＩを用いて３７℃で１時間消化し、Ａｌａｎ Ｈ．ＲｏｓｅｎｂｅｒｇのＧ ｅｎｅ（１９８７），５６：１２５に記載された方法にしたがってＥｎｇｌａｎ ｄ Ｂｉｏｌａｓ社製の発現ベクターｐＥＴ３ａの対応クローニング部位にサブ クローニングし、Ｔ４リガーゼを用いて１４℃で一晩連結して、プラスミドｐＮ ＨＦを得た。連結ＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、所望通りの構築物で あることをＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩによる制限分析によって確認した。ベクター ｐＥＴ３ａ及びプラスミドｐＮＨＦで大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)/ｐＬｙｓＳを形 質転換した。φ１０プロモーターの調節下でのフィンブリン遺伝子産物の発現を 、０.５ｍｍｏｌのＩＰＴＧの添加によるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ合成の誘導 によって達成した。ＢＬ２１(ＤＥ３)/ｐＬｙｓＳ(ｐＮＨＦ)の全タンパク質プ ロフィールを分析して、ＢＬ２１(ＤＥ３)/ｐＬｙｓＳ(ｐＥＴ３ａ)のプロフィ ールと比較した。図９に示すウエスタンブロッティング分析は、大腸菌が組換え タンパク質を発現し たことを示している。例２ Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ.Ａ.著のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｒｏｋｏｐ，Ａ.，Ｂａｊｐａｉ， Ｒ.Ｋ.及びＨｏ，Ｃ.Ｓ.編，ＭｃＧｒａｗ社発行）に記載された方法にしたがっ てバキュロウイルスベクターを使用しても、フィンブリンを発現させることがで きる。ＰＣＲ増幅したフィンブリン遺伝子のコーディング配列をＣｌｏｎｅｔｅ ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国カリフォルニア州パロアルト）製のｐ ＢａｃＰＡＫ１ベクターのＢａｍＨＩ遺伝子にクローニングすることによって、 組換えｐＢａｃＰＡＫトランスファーベクターを構築した。ＨｉｎｄIII消化で 正しい配向のインサートをスクリーニングした後、野生型ウイルスＤＮＡとトラ ンスファーベクターＤＮＡの混合物で昆虫細胞スポロドプテラ・フルギペルダ（ Ｓｐｏｒｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に同時感染させることによ って、上記組換え遺伝子をウイルスゲノムに導入した。個々のプラークを得て、 組換えウイルスがフィンブリンを発現するか検査した。図１０に示すウエスタン ブロッティング分析は、上記昆虫細胞がヘモフィルス・インフルエンゼのフィン ブリンを発現したことを示している。 発現したフィンブリンは、動物における中耳炎を予防及び／又はその症状の軽 減用、研究用並びに治療用ワクチンとして使用することができる。フィンブリン遺伝子の挿入変異導入 図６に示す通り、各種制限酵素で消化したＮＴＨｉ １１２８株のＤＮＡのゲ ノムサザーンハイブリダイゼーション分析の結果は、１１２８株にはフィンプリ ン遺伝子が１コピーしか存在していないことを示していた。ｐＢＲ３２５のクロ ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含んだ９５ ２ｂｐ ＳｆｕＩフラグメントを、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ社（米国ウィスコンシン州マディソン）製の８Ｋ ｇｍホスファターゼで平滑 末端とし、これを、ＢｓｔＥII消化し脱リン酸化し４種類のデオキシヌクレオシ ド三リン酸の存在下においてクレノウ酵素で一本鎖部分を埋めておいたプラスミ ドｐＦＤに、Ｔ４リガーゼを用いて連結した。この プラスミドでコンピテント大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００λ１ｇ/ｍｌア ンピシリン及び２５λ１ｇ/ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で 形質転換株を選択した。１つの形質転換株を「ＮＦＭ」と名付けた。このＮＦＭ 株の制限酵素マッピングで、クロラムフェニコールカセットの位置を確認すると ともに、遺伝子が１コピー挿入されていることを確認した。プラスミドｐＮＦＭ を精製し、ＢａｍＨＩで線状化し、これを用いて、Ｈｅｒｒｉｏｔ他，Ｊ．Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７９），１０１，５１７-５２４に記載のＭ-ＩＶ法 でコンピテントにしておいたＮＴＨｉ １１２８株を形質転換した。２λ１ｇ/ｍ ｌクロラムフェニコール添加ブレーンハートインフュージョン寒天培地上で変異 株を選択した。これらの変異株の中の１株及び親株の１１２８株のゲノムＤＮＡ を、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ、及びＴａ ｑＩで消化して、サザーンハイブリダイゼーション法で分析した。ＥｃｏＲＩ及 びＴａｑ１はクロラムフェニコール遺伝子内部の１カ所で切断し、ＨｉｎｄIII はクロラムフェニコールカセットの挿入部位の下流のフィンブリン遺伝子内の１ カ所を切断する。ｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ遺伝子のコードされた９５２ｂｐ ＳｆｕＩフラグメント及びフィンブリン 遺伝子のコードされた１０７７ｂｐのＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩフラグメントを³² Ｐ標識ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。そのオートラジオグラ フを図６に示す。全菌体抽出液からの免疫反応性タンパク質を検出するため、上 記上方バンドに対するチンチラ抗フィンブリンポリクローナル抗血清を用いたウ エスタンブロッティング分析で変異株を親株の１１２８株と比較した。図７に示 す通り、変異株には交差反応性のバンドは存在していなかった。クーマシー染色 では、図１の２つのバンドに対応する約３７.５ｋＤａと約２５.５ｋＤａの２つ のバンドがみられた。 フィンブリン遺伝子破壊変異株から得た下方バンドは、３７.５ｋＤａフィン ブリンに対する抗体とは交差反応しなかった。親株では２５.５ｋＤａバンドと の程度を異にする交差反応性が観察された。これらの結果は、下方バンド中のタ ンパク質が３７.５ｋＤａフィンブリンと会合し得ることを示唆している。変異 株で見付かった下方バンドが線毛形成に関与しているか否かを明らかにするため 、 ３６ｋＤａタンパク質を添加したときと添加しなかった場合の親株と変異株の下 方バンドを電子顕微鏡で調べた。親株だけで線毛が観察され、したがって、変異 株で観察された下方バンドが線毛とは無関係であることが判明した。フィンブリン遺伝子の破壊の線毛に与える影響 ネガティブ染色及び金標識抗体での標識から親株に線毛が存在することが実証 されたが、変異株には菌体表面付属構造物はみられなかった。変異株は親株に比 べると標的真核細胞に対する付着性が３２〜２６％劣っていた。 親株と変異株の病原性を比較した。１０匹のチンチラにＮＴＨｉを接種した。 そのうちの５匹には親株を接種し、残る５匹には変異株を接種した。接種量は、 親株については３.３×１０³細胞、変異株については４.０×１０³細胞であった 。ＮＴＨｉはチンチラの左耳の上部骨性外耳道に接種し、対照として滅菌塩類溶 液を右耳の上部骨性外耳道に接種した。その結果を表５に示す。これら２つの金 属株で、鼓膜の病状の時間経過にはさほど目立った差はないが、生存率には顕著 な差がみられた。内耳に対する影響として、平衡感覚失調症として顕在化する迷 路合併症が親株を接種したすべてのチンチラで観察された。これに対して、変異 株を接種したチンチラのうちの３匹で軽度乃至中程度の迷路合併症がみられた。 鼻内感染試験で、１２匹のチンチラに受動吸入法で約１０⁸ｃｆｕの親株又は 変異株のいずれかを接種した。表７に示す鼓膜の病状の検査結果は、変異株を接 種したチンチラで病状が著しく軽くなっていることを示している。変異株を接種 したチンチラでは迷路合併症が格段に減った。１３日後までに、親株集団で生存 したチンチラがたった３匹であったのに対して、変異株集団では６匹が生存した 。 このように、変異株の中耳裂に入り込み、生存し、繁殖する能力が格段に阻害 された。 フィンブリンを含んだワクチンをフロイントのアジュバントのようなキャリア に入れてチンチラに投与してきたが、医薬品として許容されるキャリアを含め、 その他のキャリアも適している。 フィンブリン遺伝子を含んでいてフィンブリンを発現するような形質転換微生 物を宿主動物に投与することによっても、フィンブリンが宿主動物に提供される 。このような微生物には、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）やマイコバクテ リウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）やアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕ ｓ）のような粘膜病原体で、好ましくは弱毒化したものが含まれる。形質転換株 の産生するフィンブリンは、宿主内で防御免疫反応を引き起こす。形質転換株は 適当なキャリアに入れて投与する。 有線毛ＮＴＨｉ臨床単離株の人間の口腔咽頭細胞に対する付着は、ＮＴＨｉ １１２８株から単離されたフィンブリンの接種量に応じて阻害されたが、 ４０.５ｋＤａのＮＴＨｉ外膜タンパク質では阻害されなかった。したがって、 フィンブリンは、それが１１２８株や１１８５株のようなＮＴＨｉから単離され たものであろうと、組換えＤＮＡ技術で生産されたものであろうと、宿主細胞へ のＮＴＨｉの付着を阻害又は低減させるために投与することができ、それによっ て中耳炎の症状の重さを軽減することができる。フィンブリンは、ＮＴＨｉの感 染前又は感染後に、フィンブリンとキャリアを含んでなる鼻内スプレーなどによ って、投与することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 シラコーバ、タチアナ 米国、オハイオ州 43220、コロンバス、 チャンバース・ロード 1220、アパートメ ント 414ビー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物に対する投与を目的とした、型別不能なヘモフィルス・インフルエン ゼに対するワクチンにして、フィンブリンを含んでなるワクチン。 ２．請求項１記載のワクチンにおいて、上記フィンブリンが型別不能なヘモフ ィルス・インフルエンゼから単離されたものであることを特徴とするワクチン。 ３．請求項１記載のワクチンにおいて、上記フィンブリンが型別不能なヘモフ ィルス・インフルエンゼ１８８５株から単離されたものであることを特徴とする ワクチン。 ４．請求項１記載のワクチンにおいて、上記フィンブリンが型別不能なヘモフ ィルス・インフルエンゼ１１２８株から単離されたものであることを特徴とする ワクチン。 ５．請求項１記載のワクチンにおいて、上記フィンブリンが組換えＤＮＡから 生産されたものであることを特徴とするワクチン。 ６．請求項１記載のワクチンにおいて、当該ワクチンが、上記フィンブリンを コーディングするＤＮＡ配列を含んだ形質転換微生物宿主をさらに含んでなり、 上記フィンブリンが上記動物において発現されることを特徴とするワクチン。 ７．中耳炎に対して動物をワクチン予防する方法にして、キャリア及びフィン ブリンを含んでなるワクチンを投与する段階を含んでなる方法。 ８．ヘモフィルス・インフルエンゼに感染した動物の中耳炎を治療する方法に して、当該動物の粘膜を介してフィンブリンを投与する段階を含んでなる方法。 ９．図５に示すアミノ酸配列を有するフィンブリン。 １０．型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼから単離されるフィンブリンに して、当該フィンブリンが、ポリアクリルアミドゲルで分子量約２５.５ｋＤａ 又は３７.５ｋＤａに相当する位置に泳動されることを特徴とするフィンブリン 。 １１．フィンブリンをコードするＤＮＡ配列。 １２．図５に示す、フィンブリンをコードするＤＮＡ配列。 １３．請求項１１記載のフィンブリンをコードするＤＮＡ配列を含んでなるベク ター。 １４．請求項１２記載のフィンブリンをコードするＤＮＡ配列を含んでなるベク ター。 １５．請求項１３記載のベクターにおいて、当該ベクターがプラスミドであるこ とを特徴とするベクター。 １６．請求項１３記載のベクターにおいて、当該ベクターがプラスミドｐＥＴ３ ａであることを特徴とするベクター。 １７．請求項１３記載のベクターにおいて、当該ベクターがバキュロウイルスで あることを特徴とするベクター。 １８．フィンブリンをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１３記載のベクターで 形質転換した微生物宿主。 １９．請求項１８記載の微生物宿主において、当該宿主が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）であることを特徴とする微生物宿主。 ２０．請求項１９記載の微生物宿主において、当該宿主がスポロドプテラ・フル ギペルダであることを特徴とする微生物宿主。 ２１．請求項２０記載の微生物宿主において、当該宿主が粘膜病原体であること を特徴とする微生物宿主。 ２２．フィンブリンを生産する方法にして、請求項１８記載の形質転換微生物宿 主をフィンブリンの発現に適した条件下で培養し、フィンブリンを回収すること からなる方法。 ２３．フィンブリンを生産する方法にして、請求項１９記載の形質転換微生物宿 主をフィンブリンの発現に適した条件下で培養し、フィンブリンを回収すること からなる方法。 ２４．フィンブリンを生産する方法にして、請求項２０記載の形質転換微生物宿 主をフィンブリンの発現に適した条件下で培養し、フィンブリンを回収すること からなる方法。 ２５．請求項２２記載の方法で生産されたフィンブリン。 ２６．請求項２３記載の方法で生産されたフィンブリン。 ２７．請求項２４記載の方法で生産されたフィンブリン。 ２８．型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼ１１２８株の生物学的に純粋な 培養物。 ２９．型別不能なヘモフィルス・インフルエンゼ１８８５株の生物学的に純粋な 培養物。