JPH09500544A

JPH09500544A - 組換えｐｒｒｓｖタンパク、該組換えｐｒｒｓｖタンパクを含有する診断キットおよびワクチン

Info

Publication number: JPH09500544A
Application number: JP7529381A
Authority: JP
Inventors: プラナ・デュラン，フアン; カサル・アルバレス，ホセ・イグナシオ; クリメント・サンチェス，イサベル
Original assignee: サイアナミド・イベリカ，ソシエダ・アノニマ
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-10
Publication date: 1997-01-21
Also published as: ITTO950367A1; DK0717108T3; CA2167080A1; DE69533690D1; ATE280829T1; TW450977B; ITTO950367A0; DE69533690T2; NL1000365A1; PT717108E; GB9509392D0; CA2167080C; IT1277996B1; NL1000365C2; FR2719845A1; AU2409495A; GB2289279A; DK53595A; DE19517773A1; GB2289279B

Abstract

(57)【要約】本発明は、許容宿主細胞培養で増殖させた組換えバキュロウイルスの発現系において、スペインで単離されたＰＲＲＳＶ（ＰＲＲＳ-Ｏlot）のＯＲＦ２〜７に対応するブタ呼吸・生殖症候群（ＰＲＲＳ）を引き起こすウイルスの組換えタンパクの生産を開示する。該組換えタンパクはＰＲＲＳに対してブタを効果的に保護できるワクチンを処方するのに、ＰＲＲＳＶを認識する抗体の存在、ならびにブタ生体試料中のＰＲＲＳＶの存在を検出するのに適する診断キットを調製するのに適する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えＰＲＲＳＶタンパク、該組換えＰＲＲＳＶタンパクを含有する診断キットおよびワクチン発明の分野本発明は、許容宿主細胞培養で増殖させた組換えバキュロウイルス発現系で産生されるブタ生殖・呼吸症候群（porcine reproductive and respiratory syndr ome）（ＰＲＲＳ）の病原体であるウイルス組換えタンパクに関する。本発明は、該組換えタンパクの少なくとも１種を含有する診断キットおよびワクチンにも関する。発明の背景スペインでは、１９９１年１月中旬に、ドイツから輸入された３００匹の子ブタ群から、子ブタにおける呼吸器系変調の最初の例が検出された（プラナ(Plana )ら、メディカル・アンド・ベテリナリー(Med．Vet.)，第８巻，11号，1991年）。その後、まもなく、最初に問題が発生した子ブタ群の近傍に存在する２カ所の農場における２つ子ブタ群から、妊娠後期において異常に多数の流産が発生し、子ブタの死亡率が７０％に達するという特徴を有する疾患が検出された。これらの動物間流行病の発生原因は不明であったが、それらの症候学は、欧州ではドイツで最初に検出されたブタ疾患について報告されている臨床的徴候や、１９８７年にアメリカ合衆国およびカナダで検出され、不可解ブタ病（Mystery Swine Disease）と命名された疾患（ヒル(Hill)、不可解ブタ病委員会の例会、1 990年10月６日、デンバー、アメリカ合衆国）に類似していた。この疾患は、妊娠中の雌ブタに様々な影響を与えるが、特に、食欲不振、流産、死産などを招いたり、ミイラ胎児や数時間で死亡する虚弱な子ブタしか生まれなかったり、分娩後の呼吸障害をもたらす。この疾患は、かつては「ブルーイヤーブタ病(Blue-ea red Pig Disease)」、「不可解生殖症候群(Mysterious Reproductive Syndrome)」（ＭＲＳ）、「ブタ不妊・呼吸症候群(Swine Infertility and Respiratory Synd rome)」（ＳＩＡＲＳ）および「ブタ流行性流産・呼吸症候群(Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome)」（ＰＥＡＲＳ）などと呼ばれていたが、現在では「ブタ生殖・呼吸症候群」（ＰＲＲＳ）として公知である。現在のところ、この疾患の病原体がＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）と命名されたウイルスであることは公知である。このウイルスは、それをレリスタッド（ Lelystad）ウイルス（ＬＶ）と命名したオランダのＣＤＩ/レリスタッドの研究者グループによって、初めて単離された(ウェスブールト，ジー（Wesvoort，G）ら、ベテリナリー・クウォータリー(Vet．Quarterly)，第３巻，121-130頁，199 1年)。数カ月後、スペインでは、ラボラトリオス・ソブリノ/サイアナミド（Lab oratorios Sobrino/Cyanamid）によって、別の単離体が得られた(プラナ（Plana ）ら、ベテリナリー・マイクロバイオロジー(Vet．Microbiol.)，33巻：203.211 頁，1992年)。この単離体は、本明細書では、ＰＰＲＳ-Ｏlotとして同定される。それ以来、このウイルスの新しい単離体が報告されている(欧州出願第0 529 5 84 A2号、ＰＣＴ出願第WO 93/06211号および第WO 93/07898号)。ＰＲＲＳウイルスの構造的特徴は、以下の２つの最近の刊行物に記載されている。ａ）ミューレンベルグ，ヨット・ヨット・エム（Muelenberg，J.J.M.）ら、「ブタ流行性流産・呼吸症候群（ＰＥＡＲＳ）の病原体であるレリスタッドウイルスはＬＤＶおよびＥＤＶに関連している」，ヴァイロロジー(Virology)，192巻： 62-72頁（1993年）；およびｂ）コツェルマン，カー・カー（Cozelmann，K-K.）ら、「アルテリウイルス（ Arterivirus）グループの１種であるブタ生殖・呼吸症候群ウイルスの分子的特徴付け」，ヴァイロロジー(Virology)，193巻：329-339頁(1993年)。ＰＲＲＳウイルスは、サイズが５０〜６０ｎｍであり、ヌクレオカプシドに含まれる約３０〜３５ｎｍのエンベロープを有し、ゲノム物質として単−ＲＮＡ分子を有する。ＰＲＲＳＶは、最初は、これらの形態学的データに基づいて、トガウイルス（Togavirus）として分類されたが、そのゲノム構造および転写・翻訳機構に基づけば、コロナウイルス科（Coronaviridae）に近いものであった。最近、既存グループと比較した差異および/または類似性に基づいて、アルテリウイルス科（Arteriviridae）と命名された新しい科に含めて分類することが提案された(カヴァナフ・ディー（Cavanagh D.）ら、アーカイブズ・オブ・ヴァイロロジー(Arch．Virology)，1994年)。ＰＲＲＳＶと共に、このグループには、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が含まれる。最近、全レリスタッドウイルス（ＬＶ）ゲノム（ミューレンベルグら、前出）、チュービンゲン（ドイツ）ＰＲＲＳウイルス単離体（ＴＶ）のゲノムセグメント（コツェルマンら、前出）、およびＰＲＲＳ-Ｏlotウイルスのセグメント（スペイン特許出願第ES P9301973号）がクローン化され、配列決定された。得られたすべての結果に基づいて、ＰＲＲＳＶゲノムは、３'末端にポリ（Ａ）鎖を含む単鎖ＲＮＡ分子から構成されていると言える。ゲノムの長さは約１５，０００塩基対（ｂｐ）であり、その構造中に、それはウイルスタンパクをコードする７つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦはＯＲＦ１からＯＲＦ７と命名されており、それらの間に小さい重複セグメントを示す。これらウイルスタンパクの合成は、長さは様々であるが、類似の３'ポリアデニル化末端と、非コード５'末端配列から始まる５'リーダー配列とを有する、一群の亜ゲノム転写物（ｍＲＮＡ）から行われるという説が提出されている。この形式のウイルスタンパク発現は、重複（nested）ｍＲＮＡとして命名されており、以前、コラニウイルス（coranivirus）について報告されたことがある（スパーン，ダブリュ・ジェイ・エム(Spaan，W.J.M.)、カヴァナフ，ディー(Cavanagh，D.)、およびホルジネック，エム・シー(Horzineck，M.C.)、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴァイロロジー(J．Gen．Virol.)，69巻：2939-2952頁，1988頁)。レリスタッド（ＬＶ）およびチュービンゲン（ＴＶ）ＰＲＲＳＶウイルス単離体ヌクレオチド配列に基づいて、また、他のアルテリウイルスについて観察されているものとの相同性によって、ウイルスゲノムにおいて、ＯＲＦ１（ａおよびｂ）はウイルスポリメラーゼおよびレプリカーゼをコードしているという説が提出されている。ＯＲＦ２〜６はウイルスエンベロープタンパクをコードしており、ＯＲＦ７はヌクレオカプシドタンパクをコードしているようである。ウイルスレプリカーゼおよびポリメラーゼは、それぞれ、サイズの大きい（２６０および１６３ｋＤａ）タンパクであり、それらの両方は３個の可能なグリコシル化（糖鎖形成）部位を含んでいる。３'末端に位置するエンベロープタンパク（ＯＲＦ２〜６）は小さい（３０〜１９ｋＤａ）。それらのすべては、アミノ（Ｎ-）およびカルボキシ（Ｃ-）末端に、リーダー配列および膜アンカーとして機能しうる疎水性配列を含んでいる。一般的に、それらは、膜に関連した位置に従って、疎水性タンパクである。ＯＲＦ６は、Ｎ末端の９０アミノ酸残基以内に位置する３つの疎水性セグメントを有すること指摘すべきである。他方、ＯＲＦ７によってコードされるタンパクは、おそらくウイルスヌクレオカプシドに対応するものであるが、Ｎ末端にアルギニン、リジンおよびヒスチジン残基を有し、非常に塩基性である。ＬＶおよびＴＶウイルスのポリメラーゼ、構造タンパクおよびヌクレオカプシドのアミノ酸配列は、ＬＤＶウイルスと比較して２９％〜６７％の同一性およびＥＡＶウイルスと比較して２０％〜３６％の同一性を示す。このことは、ＰＲＲＳウイルスの進化がＥＡＶよりＬＤＶに近いことを示唆している。ＰＲＲＳＶによって引き起こされる疾患は、ブタ畜産業に大きな損失をもたらす原因となる。このため、ＰＲＲＳＶによって引き起こされる感染を予防することが可能なワクチンが開発されている。一般的に、公知のＰＲＲＳＶに対するワクチンは、ＰＣＴ特許出願第WO 92/21 375号、第WO 92/06211号、第WO 93/07898号およびスペイン特許出願第ES P93019 73号に記載されているが、マクロファージ上で増殖させた後、不活化したウイルスから得られるワクチンである。スペイン特許出願第ES P9301973号は、ブタ生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）を回避することが可能なワクチンを提供する。このワクチンは、死産児、ミイラ胎児または生存しているが虚弱な子ブタの分娩、発情期の反復、および、ＰＲＲＳの原因となるウイルスによって生じる類似の問題など、雌ブタの生殖器系変調を回避するのに有効であることが示されている。同様に、このワクチンがワクチン接種した動物において細胞免疫を誘発することが確認されている。該ワクチンは、適当量のＰＲＲＳウイルス抗原、すなわち不活化したスペイン株（ＰＲＲＳ-Ｏlot）を、アジュバントおよび保存剤と共に含有する。本発明は、ＰＲＲＳＶによって引き起こされる感染に対して有効に保護することが可能な新しいワクチンを得る目的で組換えＤＮＡ技術が採用された第２世代のワクチンを提供する。本発明のワクチンは、少なくとも１種の組換えＰＲＲＳＶタンパクを含有する。他方、本発明は、組換えＰＲＲＳＶタンパクを用いた酵素免疫学的検定法（ＥＬＩＳＡ）の利用を伴う新しいＰＲＲＳＶ診断システムまたはキットを提供する。これらの新規な組換えワクチンは、完全なウイルスを操作するのではなく、その一部のみを操作するだけでよいので、ウイルスを放出するような事故の危険性を排除することができ、既存の不活化ＰＲＲＳＶウイルスに比べて顕著な効果を表す。遺伝子技術の手段による組換えタンパクの生産は、実際のところ、上記のとおりである。組換えタンパクについては、数多くの発現系および生産システムが公知である。組換えタンパクの大規模生産用として最も有効なシステムのひとつは、培養した昆虫細胞中における、アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）から誘導される組換えバキュロウイルスの複製に基づいている。バチュロウイルス発現技術に関する説明は、以下の論文に記載されている。ａ）ルッコウ，ヴィ・エイ（LucKow，V.A.）およびサマーズ，エム・ディ(Sum mers，M.D.)、「バキュロウイルス発現ベクターの開発における傾向」、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology)，６巻：47-55頁（1988年）；およびｂ）ビショップ，ディ・エイチ・エル(Bishop，D.H.L.)、「バキュロウイルス発現ベクター」、セミナーズ・イン・ヴァイロロジー(Seminars in Virology)，３巻：253-264頁(1992年)。本発明は、許容宿主細胞培養で増殖させたバキュロウイルスの発現系で産生される、特にＰＲＲＳ-Ｏlot単離体の、組換えＰＲＲＳＶタンパクを提供する。該組換えタンパクを産生することが可能な組換えバキュロウイルスおよび用いたトランスファーベクターは、本発明の別の目的を構成する。該組換えバキュロウイルスおよびタンパクを得る処方もまた、本発明の目的である。本発明はまた、ＰＲＲＳＶによって引き起こされる感染に対してブタを保護することを目的としたブタの予防接種用の新規なワクチンであって、本発明によって提供される組換えタンパクのうち少なくとも１種の組換えタンパクと、適当な担体またはアジュバントとを含有するワクチンを提供する。本発明はまた、ブタ由来の生物学的試料（例えば、血液、血清、痰、唾液または乳）中にＰＲＲＳＶを特異的に認識する抗体が存在するか否かを検出するための診断キットを提供する。このキットは、本発明によって提供される組換えタンパクのうち少なくとも１種の組換えタンパクおよび適当な検出方法を含んでいる。本発明はまた、ブタ由来の生物学的試料（例えば、血液、血清、痰、唾液、乳または組織）中に抗原（ＰＲＲＳＶ）が存在するか否かを検出するための診断キットを提供する。このキットは、本発明によって提供される組換えタンパクのうち少なくとも１種の組換えタンパクを用いて動物を免疫化して得られるＰＲＲＳＶを特異的に認識する少なくとも１種の抗体および適当な検出手段を含んでいる。図面の簡単な説明図１は、ＰＲＲＳ-Ｏlot単離体からクローン化された３３８３ｂｐの連続配列を示す。図２は、ＯＲＦ２(図２Ａ)、ＯＲＦ３(図２Ｂ)、ＯＲＦ４(図２Ｃ)、ＯＲＦ５ (図２Ｄ)、ＯＲＦ６（図２Ｅ）およびＯＲＦ７（図２Ｆ）によってコードされたタンパクに対応するアミノ酸配列を示す。図３は、ＬＶと比較した、クローンｐＰＲＲＳ-８、ｐＰＲＲＳ-１０８、ｐＰＲＲＳ-１０８、ｐＰＲＲＳ-１２１、ｐＰＲＲＳ-１３２、ｐＰＲＲＳ-１４６、ｐＰＲＲＳ-１４７、ｐＰＲＲＳ-１４８、ｐＰＲＲＳ-１５３およびｐＰＲＲＳ- ３の様々な拡がり、およびそれらの各々に含まれるＯＲＦを示す。この図において、（a）はＰＲＲＳＶゲノム、（b）はＫｂ単位のサイズ、および（c）はクローンの数を表す。図４は、ＯＲＦ２によってコードされるタンパクの遺伝子を含有するｐＰＲＲＳ-３クローンを示す。図５は、ＯＲＦ３によってコードされるタンパクの遺伝子を含有するｐＰＲＲＳ-１２１クローンを示す。図６は、ＯＲＦ４によってコードされるタンパクの遺伝子を含有するｐＰＲＲＳ-１４６クローンを示す。図７は、ＯＲＦ５によってコードされるタンパクの遺伝子を含有するｐＰＲＲＳ-１３２クローンを示す。図８は、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７によってコードされるタンパクの遺伝子を含有するｐＰＲＲＳ-８クローンを示す。図９は、ＥＬＩＳＡによる抗原力価測定の結果（４０５ｎｍでモニターした吸光度）を示す。この図において、（a）は抗原力価測定、（b）は４０５ｎｍでモニターした吸光度、および（c）は抗原希釈度［１/ の単位］を表す。図１０は、感染動物で得られたＰＲＲＳフィールド血清のＥＬＩＳＡによる力価測定の結果を示す。この図において、（a）は血清の力価測定、（b）は４０５ｎｍで読んだ吸光度の値、および（c）は血清希釈度［１/ の単位］を表す。図１１は、数十個のフィールド血清を用いたサンプリング実験から得た結果を示す。この図において、（a）は血清の力価測定、（b）は４０５ｎｍで読んだ吸光度の値、および（c）は血清を表す。発明の説明最近、当研究所では、ＰＲＲＳ病原体の探求を行ってきた。その主な結果は、ＰＲＲＳ-ＣＹ-ＪＰＤ-Ｐ５-６-９１と命名されたウイルスの単離である。それはＥＣＡＣＣに寄託され（受託番号Ｖ９３０７０１０８）、不活化ウイルスを含有するＰＲＲＳＶ用のワクチンが開発された(スペイン特許出願第ES P9301973号 )。それ以来、探求の努力は、ＰＲＲＳＶによって引き起こされる感染に対して有効な新しい組換えワクチンの開発を可能にするために、ＰＲＲＳＶ（ＰＲＲＳ- ＣＹ-ＪＰＤ-Ｐ５-６-９１）ゲノムの単離およびクローン化に向けられた。なお、本明細書では、該ゲノムはＰＲＲＳ-Ｏlotと命名した。そのために、該ＰＲＲＳ -Ｏlotゲノムのゲノムセグメントがクローン化された。クローン化された断片は、３'ウイルスゲノムに対応しており、３３３８ｂｐの連続配列を表す。このセグメントは、ＬＶおよびＴＶについて説明したＯＲＦ２〜７に対応する６つのオープンリーディングフレームを含む。それらは、ウイスルの抗原性および免疫原性に関与すると考えられるウイルス構造タンパク（ヌクレオカプシドおよびエンベロープ）をコードする。ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７によってコードされたタンパクは、対応するＬＶおよびＴＶタンパクに類似している。それらの特徴を表１に要約する。この表には、各ＯＲＦに関して、ヌクレオチドの相対的な位置、塩基対（ｂｐ）の数、アミノ酸（Ａａｃ）の数、各タンパクの分子量（ＫＤａ単位）およびグリコシル化部位が示されている。本明細書に添付の図１は、ＰＲＲＳ-Ｏlotウイルスゲノムの３'末端に対応するクローン化断片の３３３８ｂｐの完全な連続配列を示す。このヌクレオチド配列は、ＬＶおよびＴＶ単離体の対応する配列と比較して、９５％の相同性を示す。これら２つの比較単離物は、それらの間では、９９％の相同性を示す。ＰＲＲＳ-Ｏlot単離物のヌクレオチド配列における変化は、全配列にわたって見い出されるが、特に５'末端に集中している。指摘すべきは、ＬＶと比較して、ＰＲＲＳ- Ｏlotの１８６０位における３つのヌクレオチドが欠失していることである。本明細書の図２（２Ａ〜２Ｆ）は、ＰＲＲＳ-ＯlotウイルスのＯＲＦ２〜７によってコードされているタンパクのアミノ酸配列を示す。タンパクレベルでは、ヌクレオカプシドウイルスタンパクに対して期待されるように、ＰＲＲＳ-Ｏlot とＬＶＯＲＦ７との間には、９９％の相同性が観察され、それゆえ、ますます保存される。残りのタンパクに対する相同性の割合は、ＯＲＦ３、４および５に対する９３％からＯＲＦ２および６に対する９６.５％の値にまで達する。それらのすべては、余分なグリコシル化部位を有するＰＲＲＳ-ＯlotウイルスのＯＲＦ４を除いて、ＬＶについて説明したものに類似したグリコシル化部位を表す。ＰＲＲＳ-Ｏlotタンパクアミノ酸における上記の変化に関しては、変化の５０％は化学的に類似したアミノ酸におけるものであり、残りの変化は異なるアミノ酸におけるものである。ＬＶについて説明したように、ＯＲＦ７を除いて、残りのタンパクは、おそらく、それらの膜との関連性によって、高度の疎水性を表す。ＰＲＲＳ-Ｏlot ＯＲＦ２〜７の発現に対応する組換えタンパクは、適当な発現系で、また、好都合には、許容宿主細胞培養物中で増殖させた組換えバキュロウイルスの発現系で、産生することができる。これらの組換えタンパクを得るための全体的な手順は、基本的には、以下の一般的な工程からなる。Ｉ．バキュロウイルスに挿入すべきｃＤＮＡ配列の調製、および II．組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスの取得これらの一般的な工程は、さらに他のサブ工程に分割できる。すなわち、挿入すべきｃＤＮＡの調製は、以下のサブ工程からなる。Ｉ.ａＰＲＲＳ-Ｏlotウイルスの単離および精製、Ｉ.ｂＰＲＲＳ-Ｏlotウイルスのウイルス性ＲＮＡの単離、およびＩ.ｃＰＲＲＳ-ＯlotゲノムＲＮＡからのｃＤＮＡの合成一方、ＰＲＲＳ-Ｏlot ＯＲＦ２〜７に相当する組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスの取得は、以下のサブ工程からなる。 II.ａ挿入すべきＰＲＲＳ-ＯlotＯＲＦ遺伝子の調製、 II.ｂ該遺伝子のバキュロウイルス転移ベクターへの挿入、 II.ｃ相当するＰＲＲＳ-Ｏlot ＯＲＦ遺伝子を挿入された該転移ベクターでの許容される宿主細胞のトランスフェクション、 II.ｄ挿入ＯＲＦに相当する組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスの選択次いで、組換えバキュロウイルスの特徴付けおよび組換えタンパクの分析および精製を行う。これらの全ての工程を以下に詳しく記載する。本発明により提供される組換えタンパクの取得に用いる操作は、実施例１に記載したプロトコールに従って、ＰＲＲＳＶ、特に、ＰＲＲＳ-Ｏlotの単離および精製から開始する。ＰＲＲＳ-Ｏlotが単離、精製されたら、ウイルス性ＲＮＡを単離した。この目的のために、３'末端にポリ（Ａ）配列を有するウイルス性ＲＮＡの選択、精製に基づく方法を用いる市販のキット（ファルマシア）を使用した(実施例２)。得られたＲＮＡを、臭化エチジウム染色による０.７％中性アガロースゲルで分析し、５０００〜２３０００ｂｐの間の分子量を有する唯一のハンドの物質を確認した。次いで、市販のキット（ベーリンガー）を用い、ポリ（Ａ）鎖の存在を利用し、オリゴｄ（Ｔ）を、逆転写酵素および合成ｃＤＮＡ分子で延長できる延長プライマーとして用いる手段で該３'末端ウイルス性ＲＮＡに相当するｃＤＮＡを合成した(実施例３)。３'上流ＲＮＡ領域をクローン化するため、３'末端から約２５００ｂｐのところに位置する特定のウイルス性ゲノム配列に対するオリゴヌクレオチド・アニーリングを使用した。オリゴｄ(Ｔ)₁₂の代わりに２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを用いて２回目の合成を行った(実施例３.１)。ｃＤＮＡ合成は、合成材料に組み込んだ放射能の計測およびアルカリ性および中性アガロースゲルにおける電気泳動で確認し、定量した。その後、ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定を行った(実施例３.２)。ここで、最初にすべきことは１０００〜５０００ｎｔ（ヌクレオチド）の間の分子量を有する合成ｃＤＮＡ断片のサイズ選択であった。精製ｃＤＮＡをｐＭＴＬ２５ベクターにおける平滑末端にクローン化した。ＰＲＲＳＶ陽性クローンの分析は、ＬＶ配列に基づく、プラスミドＤＮＡ調製および制限部位のマッピングにより行った。分析した３００プラスミドのうち９個だけが陽性であり、８００〜２６００ｂｐのインサートを含んでいた。これらのｃＤＮＡの真性なことのはっきりした確認は、二本鎖プラスミドに適用されるジデオキシ法を用いる直接的配列決定で行った。得られた陽性のＰＲＲＳクローンは共通のポリ（Ａ）末端および異なる５'末端を有していた。これらのクローンを、ｐＰＲＲＳ-８、ｐＰＲＲＳ-１０８、ｐＰＲＲＳ-１２１、ｐＰＲＲＳ-１３２、ｐＰＲＲＳ-１４６、ｐＰＲＲＳ-１４７、ｐＰＲＲＳ-１４８およびｐＰＲＲＳ−１５３と命名した。クローンｐＰＲＲＳ-３は２回目の合成から抽出した。ＰＲＲＳＶ-Ｏlot ＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパクの遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスを得るために、一般的に、また、個別に次の操作に従った。まず、予め調製の必要のないＯＲＦ３遺伝子を除き、挿入すべき各ＯＲＦからの遺伝子を調製した。これらの遺伝子の調製のため、また、個々の場合に応じて、バキュロ移入ベクターに転移させる前に、ｐＭＴＬ２５、ｐＭＴＬ２４およびｐＭＴＬ２２プラスミドを用いた。予め得られたクローンからＯＲＦ２〜７に相当する遺伝子を得た。一連の操作の後、それらから新規な組換えプラスミドを作成した。挿入された各ＯＲＦに相当する遺伝子を含む組換えプラスミドをアルカリ溶菌法で精製し、挿入領域の制限エンドヌクレアーゼによるマッピングおよび配列決定で特徴付けた。得られた新規なベクターはｐＰＲＲＳ-ＯＲＦＮと命名され、ここに、Ｎは各ＯＲＦの番号を意味する(Ｎ＝２〜７)。次いで、各ＯＲＦ遺伝子を適当な転移ベクターにクローンした。用いた転移ベクターはｐＡｃＹＭ１（マツウラ（Matuura）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴァイロロジー(J．Gen Virol.)，68巻，1233-50頁）であった。一連の操作の後、各々、挿入されたＯＲＦ遺伝子を含む新規な組換えプラスミドを作成した。得られた組換えプラスミドをアルカリ溶菌法で精製し、制限エンドヌクレアーゼによるマッピングで特徴付けた。正しいインサート領域配列を確認するため、インサート両端の配列決定を行った。得られた新規な移入ベクターを分析し、挿入した遺伝子が、ＡｃＮＰＶウイルス・ポリヘドリン(polyhedrin)・プロモーターによる発現のための正しい方向を有していることを確認した。得られた移入ベクターは、以下のとおりであった。名称ＯＲＦｐＰＲＲＳ-Ｂac８２ｐＰＲＲＳ-Ｂac２３ｐＰＲＲＳ-Ｂac９４ｐＰＲＲＳ-Ｂac３５ｐＰＲＲＳ-Ｂac５６ｐＰＲＲＳ-Ｂac７７次いで、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、Ｓf９クローンを、ＡｃＲＰ２３-lacＺ親ウイルスの精製感染性ＤＮＡと相当する移入ベクターの混合物でトランスフェクトした。このトランスフェクションが完了したら、Ｘ-galによるウイルス性子孫（progeny）の染色後、プラーク色調表現型分析により組換えバキュロウイルスを同定した。得られた組換えバキュロウイルスは、（英国）ウイルトシャーＳＰ４ＯＪＧ、サリスバリー、ポートンダウンのヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）に寄託した。実施例４〜９に、各々、ＯＲＦ２〜７によってコードされる遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得を詳細に記載している。ＰＲＲＳ-Ｏlot ＯＲＦ２〜７組換えタンパクは、特異的ＰＲＲＳＶ抗体（実施例１２）の存在の検出と、少なくとも、ＰＲＲＳ-Ｏlot ＯＲＦ２〜７の１つに相当する１つの組換えタンパクで免疫した動物から得られるＰＲＲＳＶを特異的に同定する抗体による抗原（ＰＲＲＳＶ）の存在の検出のための診断目的に使用できる。また、これらのタンパクは、ＰＲＲＳＶに対して動物を免疫するためにも使用できる。したがって、該タンパクは、ＰＲＲＳＶの感染症に対してブタを効率よく保護できる組換えワクチンを処方するために使用できる。これらのワクチンは能動的でも受動的でもよい。能動ワクチンは、本発明で提供される組換えタンパクの少なくとも１種を、免疫学的に許容される希釈剤およびアジュバントに懸濁させることにより製造できる。受動ワクチンは、該タンパクで動物を免疫し、該タンパクに対するポリクローナル抗体を単離することにより得ることができる。抗体を単離、精製した後、それらはワクチン適用に使用できる。本発明の１つの具体例において、該ウイルス性抗原（抗原相）を免疫学的に許容される希釈剤およびアジュバントと合してなる、ＰＲＲＳＶによる感染症から有効に保護できる組換えワクチンが得られる。抗原相の調製のため、昆虫細胞、好ましくは、スポドプテラ・フルギペルダ（ Spodoptera frugiperda）の細胞をＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜７に相当する組換えタンパクを生産できる種々の組換えバキュロウイルスで感染し、該タンパク発現に適した条件下でインキュベートした。次いで、直ちに細胞を集め、洗浄し、適当な緩衝液に再懸濁し、前記した組換えワクチンの調製に使用した。もう１つの具体例において、抗原相は、好ましくは、ＯＲＦ３、ＯＲＦ５およびＯＲＦ７のような、単一の組換えＰＲＲＳＶタンパクを発現する組換えバキュロウイルスで感染した昆虫細胞のホモジネートからなる(実施例１３)。もう１つ別の具体例では、抗原相は、例えば、ＯＲＦ３、ＯＲＦ５およびＯＲＦ７に相当するタンパクを発現する組換えバキュロウイルスで感染した昆虫細胞の混合物のような、各々が、異なった組換えＰＲＲＳＶタンパクを発現する異なった組換えバキュロウイルスで感染した昆虫細胞の混合物のホモジネートからなる。一般に、ワクチンは、目的の組換えタンパクを発現するバキュロウイルスで感染された約５０×１０⁶の昆虫細胞を抗原相として含有するように処方した。ワクチンが種々の組換えタンパクを含有する場合、抗原相は、目的の組換えタンパク当たり、バキュロウイルスで感染された約５０×１０⁶の昆虫細胞からなる。例えば、ＯＲＦ３、５および７に相当するタンパクを含むワクチンの処方の場合、抗原相は、ＯＲＦ３組換えタンパクを発現するバキュロウイルスで感染された約５×１０⁶の昆虫細胞、ＯＲＦ５組換えタンパクを発現するバキュロウイルスで感染された約５×１０⁶の昆虫細胞および組換えＯＲＦ７タンパクを発現するバキュロウイルスで感染された約５×１０⁶の昆虫細胞からなる(実施例１３)。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはその他同様な食塩水を免疫学的に許容される希釈剤として使用できる。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、アルミナ・ゲル懸濁液、Ｑui１Ａなどのような水性アジュバント、鉱油、グリセリド類およびオレイック・エーテル−酸誘導体に基づく油性アジュバントなど、一般にワクチンの処方に通常使８８８の混合物からなる油性アジュバントが良好な結果をもたらすことが確認された。マーコール５２はエッソ・エスパニョーラＳ.Ａ．製造の低密度鉱油である。シマルソール５１００はＳＥＰＩＣにより販売されているポリオキシオレエートエーテルである。モンタナイド８８８はＳＥＰＩＣにより販売されている高純度アンヒドロマンニトールオクタデカノエートエーテルである。本発明のワクチンには、細胞応答強化剤（cell response potentiator：ＣＲＰ）物質、すなわち、ＩＬ-１（インターロイキン-１）、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、γ-ＩＦＮ（ガンマーインターフェロン）のようなヘルパーＴ細胞サブポピュレーション（Ｔｈ₁およびＴｈ₂）を強化する物質、細胞壊死因子およびワクチン接種動物において、理論的に、細胞免疫を惹起させる同様な物質も含有させることができる。これらのＣＲＰ物質は水性および油性アジュバントと共に、ワクチン処方に使用できる。同様に、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＩＳＣＯＭ（イムノ・スティムラント・コンプレックス）またはリポゾームのような、細胞応答を調節し、免疫刺激する他のタイプのアジュバントを使用することもできる。本発明のワクチンは、該抗原相を免疫学的に許容される希釈剤およびアジュバントと懸濁または混合することにより得ることができる。アジュバントが油性の場合、エマルジョンが形成される。具体的かつ好ましい場合、アジュバントがマーコール５２、シマルソール５１００およびモンタナイド８８８の混合物であれば、ワクチンはｗ/ｏ/ｗタイプの二重水/油/水エマルジョンとなる。ワクチンがＣＲＰ物質を含有する場合、これらの物質は、抗原相およびアジュバントの両方に添加できる。別法として、ワクチンがＣＲＰを含有しない場合、所望により、それらをワクチン接種部位と異なる別の部位に同時に注射できる。また、これらのワクチンには、１種以上の組換えＰＲＲＳＶタンパクの外に、以下に記載する１種以上の病原体を含むブタの異なる病原体の組み合わせを含有させて、多価ワクチンを調製することもできる。特に限定するものではないが、これらの病原体には、アクチノバチルス・プロイロニウモニアエ(Actinobacillu s pleuropneumoniae )、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ブタ・パラボウイルス(Porcine paravovirus)、レプトスピラ(Leptospira)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、エリシペロスリックス・ルシオパシアエ(E rysipelothrix rhusiopathiae )、パスツーレラ・マルトシダ(Pasteurella multo cida )、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、ブタ呼吸器コロナウイルス(Porcine respiratory coronavirus)、ロタウイルス（Rotavir us ）またはオウジエスキー病(Aujeszky's disease)、ブタ・インフルエンザおよび伝染性胃腸炎の原因となる病原体が包含される。本発明のウイルスの安全性および有効性試験は、該ワクチンが安全で、同時に有効であることを証明した。１回量が、１種以上の組換えＰＲＲＳＶタンパクを発現する５０×１０⁶感染昆虫細胞と同等以上のウイルス性抗原または抗原相の２ｍｌ深部筋肉内投与、次いで、２ｍｌ用量の再ワクチン接種により、ワクチン接種動物がＰＲＲＳＶによる感染症から有効に保護できることが確認された。同様に、ワクチン接種および該ワクチンで再接種したブタが、攻撃のときには血清学的結果が存在しなかったにもかかわらず、保護された事実に基づき(実施例１４、表４および１０)、試験用のワクチンのいくつか、すなわち、ｒＰＲＲＳＣおよびｒＰＲＲＳＤで識別されるワクチンにより、ワクチン接種動物に細胞免疫を導入できることが確認された。調製した組換えワクチンの妊娠したブタにおけるＰＲＲＳの予防における有効性を測定、評価する目的で、妊娠したブタに異なるワクチンを接種し、次いで、ビルレント・ウイルスを用いる放出テストに付すことからなる試験を設定した。得られた結果に基づき、このテストの対象としたワクチンの効能が評価できた。これらのワクチンの効能を評価するためには、再現性ある結果、すなわち、子ブタの種々の生長期における生存数および死亡数ならびにブタおよび子ブタにおける血清学的結果を考慮した(実施例１４)。発明の詳細な記載（実施例）実施例１.-ＰＲＲＳ-Ｏlotウイルスの取得および精製１.１-ブタ肺胞マクロファージの取得１.１.１-動物ベルギーランドレース（Belgium Landrace）とラージホワイト（Large White ）種の雑種である７〜８週齢のブタを使用した。本発明者らの所有の牧場からの該動物は以下の疾患に対して血清陰性であった：オーエスキ−ブタパルボウイルス、口蹄古典ブタ熱、ブタ・インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型およびＨ３Ｎ２型）および伝染性胃腸炎。１.１.２-マクロファージの単離体重１０ｋｇあたり０.１ｇのチオペンタールナトリウムを頸静脈に注射することにより、該動物を麻酔した。次いで、それらを犠牲にし、喉頭蓋下の気管を結紮し該結紮の上を切断した後、肺を摘出した。その摘出肺のＰＢＳで外部洗浄した。マクロファージを得るために、抗生物質で１：５００（ＰＥＧ溶液：１０００ＩＵ/ｍｌペニシリン、１ｍｇ/ｍｌストレプトマイシン、および０.５ｍｇ/ ｍｌゲンタマイシン）で補足された合計５００ｍｌのＰＢＳで連続的に内部洗浄を行った(４〜５)。これらの洗浄物を集め、３００ｇで１５分間遠心分離した。以下の工程は、連続的な遠心分離/沈降により細胞をＰＢＳで２回洗浄して、最終的に、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭおよび抗生物質（１：１０００(ＰＥＧ)）を含有するＤＭＥＭ培地（非必須アミノ酸で補足された（１００ｘ）ＤＭＥＭ、ギブコ(GIBCO)）中に再懸濁することであった。ニューバウアー（Newbauer）チャンバー中でトリパンブルーで染色することにより該細胞を計数した。０.１ｍｌの１０^-1マクロファージ懸濁液を０.４ｍｌのＤＭＥＭおよび０.５ｍｌのトリパンブルー溶液に加えた。大多数の場合、得られた細胞の数は１〜１.２×１０⁹ 個であった。細菌および真菌の検出に適した培養培地中に接種することにより、該マクロファージ細胞に対して無菌制御を行った。マイコプラズマが存在しないことは、該ＤＮＡに選択的に結合して高特異性ＤＮＡ-ＤＡＰＩ蛍光複合体を形成するＤＡＰＩ（４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール）による細胞化学的検出により確認された。１.２-ブタ肺胞マクロファージ中のウイルスの複製ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した上記ＤＭＥＭ培地中の１００ｍｌのマクロファージ懸濁液（３×１０⁶細胞/ｍｌ）を含有する細胞培養バイアル（１５０ｃｍ²）を使用した。該細胞にＰＲＲＳ-Ｏlotウイルスを感染させ、ラボラトリオス・ソブリノ（Laboratorios Sobrino）で単離し、ＰＲＲＳ-ＪＰＤ-Ｐ５-６-９１（ＥＣＡＣＣ、受託番号Ｖ９３０７０１０８）と命名した。１０^-3の感染多重度にて感染させ、該感染細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。この時間の経過後、該培地を取り出し、２％ＦＣＳおよび抗生物質を含有する新鮮なＤＭＥＭで置換した。インキュベーションを３７℃で継続した。定期的に顕微鏡で該培養を観察して、マクロファージ上のウイルスにより生じた細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定した。一般に、３〜４日の感染によるＣＰＥは７０〜８０％であった。巨大変形細胞が出現した。通常、これらの調製物の力価は１０^6.55ＴＣＩＤ₅₀/ｍｌ（ミリリットルあたりの組織培養感染用量５０）であった。１０^-4の多重度で感染したマクロファージは、１オーダー倍未満のウイルス収量を与えた。実施例１（１.１.２）に記載の通り得られたブタマクロファージ細胞に対する単層検定における免疫ペルオキシダーゼにより、これらの細胞中のウイルスの存在を決定した。簡単にいうと、これは以下のとおり行った。９６ウェル力価プラーク中で、マクロファージ上で複製した５０μｌのＰＲＲＳ- Ｏlotウイルスを１００μｌのマクロファージに感染させた。該プラークを３７ ℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション完了後、該培地を取り出し、該プラークを食塩水（０.１ＭＮａＣｌ）で２回洗浄した。次いで、３７℃ および−３０℃での連続的なインキュベーション（および２０％ホルムアルデヒド）の後、それらを２０％ホルムアルデヒドで固定した。食塩水で２回洗浄した後、攻撃された動物からの抗ＰＲＲＳ血清の１：５０の希釈液５０μｌ。非感染動物からの陰性血清で同時インキュベーションを行った。インキュベーションは３７℃で１時間行った。上記溶液を取り出した後、食塩水で２回洗浄した。直ちに、５０μｌ中のプロテインＡ(ProteinＡ)（シグマ）０.１μｇを加え、３７℃ で１時間インキュベートした。検定は、酢酸緩衝液および酸素化水の存在下ジメチルホルムアミドに溶解したＡＥＣ（３-アミノ-９-エチル-カルバゾール）で現像した。暗所中室温で１５〜３０分後、該平板を顕微鏡で観察した。感染細胞は、無色である非感染細胞と比較すると、染色された暗赤色を示した。１.３-ＰＲＲＳウイルス精製ＰＲＲＳＶ感染細胞培養から該ウイルスを精製した。該培養を遠心分離（２０分、６５００ｇ）により清澄化した。該上清をミリポア・ミニタン（Millipore- Minitan）限外濾過系（４.５ｐＳｉ、３００ｋＤａ孔径フィルター）を用いて１０倍濃縮した。ついで、遠心分離（５時間、２００００ｇ）により該ウイルスを沈降させた。上清を捨て、４℃で一夜１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)（シグマ）を含有する沈殿物をＰＢＳで可溶化した。不連続ショ糖勾配（ＰＢＳ中２０〜５０％ｗ/ｖ）中、遠心分離（９５００ｇ、３時間）により該ウイルスを精製した。遠心分離が完了したら、該ウイルスを含有する帯を該勾配から抽出し、トリス/ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、最終的に２６０００ｇで一夜遠心分離してウイルスを沈降させた。ポリアクリルアミド-ＳＤＳゲル中（１２％）の電気泳動により該精製ウイルスを分析した(ラエムリ(Laemmli)、英国、ネイチャー(Nature)，227巻：680頁， 1970年)。クーマシーブルーで染色し免疫ブロット法に付すことにより全タンパクを検出した(タウビン，エイチ(Towbin，H.)、ステヘリン，ティー（Staehelin ，T.）およびゴードン，ジェイ(Gordon，J.)，1979年、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユー・エス・エイ(P roc．Natl．Acad．Sci．USA)，76巻：4350-4354頁)。該ブロットを、コバレセント（covalescent）抗ＰＲＲＳＶ血清を用いてペルオキシダーゼ-プロテインＡ（シグマ）コンジュゲートで現像した。マクロファージからのタンパク質の混入のため、クーマシー染色ゲル中のＰＲＲＳＶに関連したいずれかの特定の帯を観察することは不可能であった。しかしながら、１５.５〜３０ＫＤａの分子量のいくつかのウイルスタンパク質を免疫ブロット法により同定した。また、現像時間を延長すれば、６０ＫＤａを越える分子量の帯を観察することができた。しかし、これらは非感染マクロファージにおいても検出されたため、それらはＰＲＲＳウイルス関連タンパク質ではないと結論づけられた。実施例２.-ウイルスＲＮＡの単離市販のファルマシアＰ-Ｌバイオケミカルズキット（Pharmacia P-L Biochemic als kit）を使用した。この方法は、３'末端ポリ（Ａ）鎖を含有するウイルスＲＮＡの選択および精製に基づく。オリゴ-セルロース（dＴ）マトリックスによるＲＮＡ-ポリ（Ａ）の塩化グアニジニウム精製により該ウイルスカプシドを破砕した。簡単に言えば、ＰＲＲＳ-ＯlotウイルスＲＮＡを以下のとおり単離した。４００００ｇで一夜遠心分離することにより該精製ウイルスを沈降させた。次いで、該上清を捨て、０.４ｍｌのキット抽出緩衝液で沈殿物を可溶化した。セルロース-ｄ（Ｔ）マトリックスへ吸着させ、低および高塩濃度の緩衝液で連続的に洗浄した後、該ＲＮＡ-ポリ（Ａ）を高ＣｌＮａ濃度で溶出した。１：１０容量の２.５Ｍ酢酸カリウム、０.２５ｍｇ/ｍｌグリコンゲンおよび２容量のエタノールを加えることにより（２時間以上、−２０℃）、該ＲＮＡを沈殿させた。この時間の経過後、１６０００ｇで３０分間遠心分離することにより該ＲＮＡを回復させた。該沈殿物をエタノール（７５％）で洗浄することにより、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス-ＣｌＨ、ｐＨ＝８.０および１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁した。得られたＲＮＡを、エチジウムブロミドで染色することにより０.７％中性アガロースゲル中で分析した。５０００〜２３０００ｂｐ分子量の物質の単一の帯が観察された。低分子量物質の不存在、したがって細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの可能性を指摘しなければならない。しかしながら、得られた物質の量は少なく、該ウイルスで感染したマクロファージ培養２５０ｍｌあたりＲＮＡ１００ｎｇ以下であった。ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動および電子顕微鏡（データは示していない）で示されるとおり、この低い収量は精製ウイルスの低い収量と合致する。実施例３.-ＰＲＲＳ-ＯlotウイルスゲノムＲＮＡからのｃＤＮＡ合成３.１-ｃＤＮＡの調製ＰＲＲＳ-Ｏlotウイルス単離物の３'末端ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素で伸長され得、ＤＮＡ分子コピーを合成し得る伸長プライマーとしてオリゴｄ（Ｔ）を使用するため、この方法にはポリ（Ａ）鎖の存在を利用した。３'末端前のＲＮＡ領域をクローン化するために、３'末端の約２５００ｂｐに位置するウイルスゲノムの特異的配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。市販のキット（ベーリンガー(Boehringer)）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。この方法は、簡単に言うと、上記実施例で得られた０.１μｇのＰＲＲＳＲＮＡ−ポリ（Ａ）を、最終容量２０μｌ中、各々１ｍＭのｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ［³²Ｐ-α-ｄＣＴＰの５〜１０μＣｉ］、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ)、２５単位のリボヌクレアーゼ阻害剤、０.８μオリゴｄ(Ｔ)₁₂および４０単位の逆転写酵素の存在下でインキュベートした。該反応物を４２℃で１時間インキュベートし、次いで同じ試験管内で第２鎖の合成を開始した。この目的のために、緩衝液、リボヌクレアーゼおよび２５単位のイー・コリ（E．coli）ＤＮＡポリメラーゼを加えた。インキュベーションは２２℃で１時間、６５℃で１０分間行った。最終的に、平滑末端を得るために、４単位のＤＮＡＴ４ポリメラーゼを加えた。３７℃で１０分後、ＥＤＴＡおよびサルコシルを加えることにより反応を停止した。オリゴｄ（Ｔ）₁₂の代わりに５'-CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA-３'オリゴヌクレオチドを使用する以外は同じ条件下で、第２のｃＤＮＡ合成を行った。いずれの場合も、上記実施例と同様にして、フェノール：クロロホルムで該混合物を抽出し、該物質をエタノールで沈殿させた。合成された物質中に取り込まれた放射活性を計数し、アルカリ性および中性のアガロースゲル中で電気泳動に付すことにより、ｃＤＮＡ合成を確認し定量した。３.２-クローニングおよび配列決定まず、小さすぎる断片のクローン化を避けるために、合成されたｃＤＮＡを大きさで選択した。この目的のために、ｃＤＮＡ合成からの該物質を遠心分離（３０分、１６００ｇ）により回収した。沈殿物を真空乾燥し、トリス/ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）ｐＨ＝８.０に溶解し、１％アガロースゲルに重層した。ＤＥＡＥ −セルロースペーパーで該ゲルから、また、ＣｌＮａによる溶出、次いで沈殿により後者から、１０００〜５０００ｂｐのｃＤＮＡ断片を回収した。精製ｃＤＮＡを、ｐＵＣ１８由来のベクターであるｐＭＴＬ２５ベクターの平滑末端中にクローン化した。この目的のために、ＳmalＩで該ベクターを直線化し、アルカリホスファターゼで処理してベクターバックグラウンドを減少させた。ＤＮＡＴ４リガーゼで連結した後、組換えコロニーの色による初期選択を可能にする(挿入を有する白コロニーに対して、挿入を有さない青コロニー)、Ｘ-ガル（gal）（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルβ-Ｄ-ガラクロピラノシド）（ベーリンガー）およびＩＰＴＧ（イソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド）（ゴールド・バイオック(Gold Bioch)）の存在下、該連結混合物でイー・コリＸＬ-１ブルー能力細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡ調製物（ビルンボイム（Birnboim）およびドーリー(Doly)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)，７巻，1513-1523頁，1979年）を使用し、ＬＶ配列に基づく制限部位をマッピングすることにより、陽性ＰＲＲＳコロニーの分析を行った。分析した３００個のプラスミドのうち９個だけが陽性であり、８００〜２６００ｂｐの挿入を含有していた。これらのｃＤＮＡクローンの信頼性の最終的な確認は、２本鎖ＤＮＡに適用されるジデオキシ鎖-停止法（サンガー，エフ（Sanger,F.）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ．Mol．Biol.)，94巻：441-448頁，1975年）を用いるそれらの直接配列決定により行った。普遍オリゴヌクレオチド(５'-GTAAAACGACGGCCA GT-３')および逆（５'-AACAGCTATGACCATG-３'）オリゴヌクレオチドを用いて、すべてのクローンを配列決定した。得られたＰＲＲＳクローンの大多数は、１つの共通のポリ（Ａ）鎖および異なる５'末端を含有していた。該クローンをｐＰＲＲＳ-８、ｐＰＲＲＳ-１０８、ｐＰＲＲＳ-１２１、ｐＰＲＲＳ-１３２、ｐＰＲＲＳ-１４６、ｐＰＲＲＳ-１４７、ｐＰＲＲＳ-１４８およびｐＰＲＲＳ-１５３と命名した。第２のｃＤＮＡ合成から、クローンＰＲＲＳ-３を得た。図３は、ＬＶと比較したこれらのクローンの異なる伸長およびそれそれに含有されるＯＲＦを示す。一方、図１は、ＰＲＲＳ-Olot単離体からクローン化された３３８３ｂｐの連続配列を示す。図２（２Ａ〜２Ｆ）は、各ＯＲＦにコードされるタンパクに対応するアミノ酸配列を示す。実施例４.-ＯＲＦ２によりコードされるタンパク遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得４.１-ＯＲＦ２遺伝子の調製本明細書中に記載する異なるＯＲＦの調製のために、ｐＵＣ１８ベクター由来のｐＭＴＬ２５、ｐＭＴＬ２４およびｐＭＴＬ２２遺伝子を、それらがバキュロウイルス移入ベクター中にクローン化される前に使用した。使用するベクターは、それそれの個別の場合について示される。ＯＲＦ２遺伝子は７４７ｂｐの大きさであり、ｃＤＮＡｐＰＲＲＳ-３クローンから得た(図４)。該ＤＮＡをＭaeＩで消化し、約９００ｂｐの挿入をアガロースゲル中で精製した。イー・コリＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理することにより、付着挿入末端を平滑末端に変えた。ＳmaＩ、アルカリホスファターゼで処理され、１％低融点アガロースゲル中で精製されたｐＭＴＬ２５中でクローン化を行った。ＤＮＡＴ４リガーゼ（ベーリンガー）で連結後、イー・コリＸＬ-１ブルー細胞を該連結混合物で形質転換し、陽性クローンをまず色により選択した。アルカリ溶菌法（ビルンボイム（Birnboim）およびドーリー(Doly)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(N ucleic Acids Res.)，７巻，1513-1523頁，1979年）により、挿入ＯＲＦ２遺伝子を含有する該組換えプラスミドを精製し、制限エンドヌクレアーゼでマッピングし、該挿入領域を配列決定することにより特徴付けした。新しく得られたベクターをｐＰＲＲＳ-ＯＲＳ２と命名した。この中には、挿入の開始およびＢamＨＩ部位から約５０ｂｐにＯＲＦ２開始コドン（ＡＴＧ）が位置している。４.２-ＯＲＦ２遺伝子のバキュロウイルス移入ベクターへの挿入請求の範囲に記載の、すべての実験に使用したバキュロウイルス移入ベクターは、単一のＢamＨＩ挿入部位を有するｐＡｃＹＭ１ベクター（マツウラ（Matsuu ra）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴァイロロジー(J．Gen Virol.)，68 巻，1233-50頁）であった。該ベクターは、ディー・エイチ・エル・ビショップ（D.H.L．Bishop）教授（I .V.E.M.、英国オックスフォード）により命名された。該挿入のために、該ベクターをＢamＨＩエンドヌクレアーゼで完全に消化し、ついでアルカリホスファターゼ酵素で処理してベクターの再連結を防いだ。ＯＲＦ２は２８.４ＫＤａのタンパクをコードする。簡単に言えば、対応する遺伝子をｐＡｃＹＭ１ベクターへ挿入するために、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ２プラスミドを出発物質として使用した。このプラスミドにおいては、ＯＲＦ２遺伝子がＢamＨＩ部位に隣接している。したがって、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ２をＢamＨＩで消化し、１％低融点アガロースゲルに重層して９３５ｂｐの断片を得る。挿入をベクターに連結するためにＤＮＡＴ４リガーゼ（ベーリンガー）を用い、ストルール（Struhl）法（バイオテクニークズ(Biotechniques)，６巻，452-453頁，1985年）に従い、この断片をｐＡｃＹＭ１のＢamＨＩ部位に挿入した。該連結混合物を使用してイー・コリＤＨ５細胞を形質転換した。アルカリ溶菌法（ビルンボイム（Birnboim）およびドーリー (Doly)、前出）に従い、挿入されたＯＲＦ２遺伝子を含有する、得られた組換えプラスミドを精製し、制限エンドヌクレアーゼでマッピングし、挿入端を配列決定して挿入領域の正しい配列を確認した。新しく得られた移入ベクターをｐＰＲＲＳ-Ｂac８と命名した。ＡｃＮＰＶバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターによる発現のための正しい配向でＰＲＲＳ遺伝子を有することが示された。４.３-バキュロウイルスのトランスフェクションおよび選択スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、Ｓf９クローンを、親ウイルスＡｃＲＰ２３-lacＺ（５００ｎｇ）(ポシー（Posee）博士（I.V. E.M.、英国オックスフォード）により命名された)の精製感染性ＤＮＡと移入ベクターｐＰＲＲＳ-Ｂac８ＤＮＡ（２μｇ）との混合物で同時トランスフェクトした。組換えの効率を上げるために、Ｂsu３６１酵素でlacＺ遺伝子（キッツ（K itts）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuc．Acids Res.），18巻，566 7-72頁，1990年）内で親ウイルスＤＮＡを直線化した。同時トランスフェクションのために、リポフェクション（lipofection）（ギブコ（Gibco）-ＢＲＬ）法を用いた(フェルグナー（Felgner）ら、プロシーティングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユー・エス・エイ(Proc．Natl．Aca d．Sci．U.S.A.)，84巻，7413-7417頁(1987年))。同時トランスフェクションの後、細胞変性効果が観察されるまで、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質で補足した完全ＴＮＭＦＨ培地中で該細胞を５日間インキュベートした。次いで、トランスフェクション上清を回収し、組換えウイルスをプラーク検定により同定した。β-ガラクトシダーゼ遺伝子が発現されているため、ＡｃＲＰ２３-lacＺ親ウイルスは、Ｘ-ガル（gal）基質の存在下、青色の溶菌プラークを示した。ウイルスの子孫をＸ-ガルで染色した後、まず、明らかなプラークにより組換えウイルスを同定した。各ウイルスのいくつかのプラークを拾い、３回の精製に付し、ついで高力価のウイルスストックを調製した。最終的に得られた組換えバキュロウイルスをＡｃＮＰＶ、ＰＲＲＳ２と命名した。これは、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（European collect ion of Animal Cell Cultures(ECACC)）に受託番号Ｖ９４０２１００７で寄託されている。実施例５-ＯＲＦ３によりコードされるタンパク遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得５.１-バキュロウイルス移入ベクターへのＯＲＦ３遺伝子の挿入ＯＲＦ３は、３０.８ＫＤａの概算分子量のタンパクをコードしている。ｐＰＲＲＳ-１２１プラスミドＤＮＡを、ｐＡｃＹＭ１移入ベクターへの対応する遺伝子の挿入の出発物質として用いた（図５）。このベクターにおいて、ＯＲＦ３開始コドンはＢamＨＩ部位から１０ｂｐに位置する。この遺伝子は、ＢamＨＩおよびＳau３Ａ酵素で二重消化することによって切断して、ＢamＨＩと親和性である粘着末端を生成させることができる。消化した後に、その混合物を１％低溶融アガロースゲルに負荷し、１００９ｂｐの断片を精製した。それを単離し、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて、ＢamＨＩおよびアルカリホスファターゼで処理したｐＡｃＹＭ１ベクターに連結した。続いて、イー・コリ（E．coli ）ＤＨ５細胞を形質転換し、前記の方法により組換えプラスミドを精製し、特徴付けした。ポリヘドリン・プロモーターに向けての正確な配列および挿入の向きが確認されたら、その新たな移入ベクターは、ｐＰＲＲＳ-Ｂac２と命名した。５.２-組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜に用いた方法は、ＯＲＦ２に関して前記したもの（実施例４.３）と同様であった。得られた組換えバキュロウイルスは、ＡｃＮＰＶ，ＰＲＲＳ３と命名した。それは、受託番号Ｖ９４０１１３２５でＥＣＡＣＣに寄託されている。実施例６.-ＯＲＦ４によりコードされるタンパク遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得６.１-ＯＲＦ４遺伝子の調製ＯＲＦ４遺伝子のサイズは、５４９ｂｐである。それは、ＢamＨＩ、ＡflIII およびＰstＩ酵素で消化したｐＰＲＲＳ-１４６クローン（図６）から得た。最初の２酵素はインサートの両側を切断し、ＰstＩを用いて、遺伝子単離を困難としたであろうＯＲＦ４遺伝子と同様のサイズのベクターＤＮＡ断片を切断した。低溶融アガロースゲル中で１１１２ｂｐの断片を精製し、ＢamＨＩおよびＮcoＩ（ＡflIIIと親和性）で消化したｐＭＴＬ２２ベクターにクローン化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、イー・コリＤＨ５細胞を形質転換した後に、組換えプラスミドをアルカリ分解法（ビルンボイム（Birmboin）およびドーリー(Doly)、前出）により精製し、制限エンドヌクレアーゼ・マッピングにより特徴付けした。新たに得られたベクターは、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ４と呼称した。それには、Ｂa mＨＩサイトから５ｂｐに位置するＯＲＦ４のＡＴＧ開始コドンが含まれる。６.２-バキュロウイルス移入ベクターへのＯＲＦ４遺伝子の挿入ＯＲＦ４は２０.０ＫＤａのタンパクをコードしている。対応する遺伝子は、ＢamＨＩ＋ＢglIIで消化することによりｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ４プラスミドから得た。１１１２ｂｐの断片を１％低溶融アガロースゲル中で精製し、ｐＡｃＹＭＩ -ＢamＨＩに直接クローン化した。組換えクローンの同定および特徴付けの方法は、前記したもの（実施例４.２）と同一であった。正確な向きおよび挿入配列が確認されたら、その新たなプラスミドは、ｐＰＲＲＳ-Ｂac９と命名した。このプラスミドを次のトランスフェクション実験および組換えバキュロウイルスの調製に用いた。６.３-組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜に随伴する方法は、ＯＲＦ２に関して前記した方法（実施例４.３）と同様であった。組換えバキュロウイルスは、ＡｃＮＰＶ,ＰＲＲＳ４と命名した。それは、受託番号Ｖ９４０２１００８でＥＣＡＣＣに寄託されている。実施例７.-ＯＲＦ５によりコードされるタンパク遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得７.１-ＯＲＦ５遺伝子の調製ＯＲＦ５のサイズは６００ｂｐである。それは、クローンｐＰＲＲＳ-１３２から得た(図７)。そのＤＮＡをＢstＸＩおよびＢfrＩ酵素で消化し、ＯＲＦ５を含有する７００ｂｐの断片を１％低溶融アガロースゲル中で精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理する方法によって、断片の末端を粘着末端から平滑末端に変換した後、その断片をｐＭＴＬ２５/ＳmaＩベクターにクローン化した。用いた方法は、実施例４.１に記載した方法と同様であった。新たに得たベクターは、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ５と命名した。それには、該遺伝子の開始点から１５ｂｐに位置するＯＲＦ５ＡＴＧ開始コドンが含まれる。７.２-バキュロウイルス移入ベクターへのＯＲＦ５遺伝子の挿入ＯＲＦ５は２２.４ＫＤａのタンパクをコードしている。移入ベクターへ対応する遺伝子を挿入するために、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ５ベクターを酵素ＢamＨＩで消化した。７０６ｂｐの断片を１％低溶融アガロースゲル中で精製し、ｐＡｃＹｍｌ-ＢamＨＩ移入ベクターに直接連結した。組換えプラスミドは、前記のように特徴付けた。新たな移入ベクターは、ｐＰＲＲＳ-Ｂac３と命名した。それを続くトランスフェクション実験に用いた。７.３-組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜に随伴する方法は、ＯＲＦ２に関して前記した方法（実施例４.３）に類似していた。得られた組換えバキュロウイルスは、ＡｃＮＰＶ，ＰＲＲＳ５と命名し、受託番号Ｖ９４０１１３２６でＥＣＡＣＣに寄託されている。実施例８.-ＯＲＦ６によりコードされるタンパク遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得８.１-ＯＲＦ６遺伝子の調製ＯＲＦ６遺伝子のサイズは５１９ｂｐである。それは、ｐＰＲＲＳ-８遺伝子クローンから調製した(図８)。最初に、そのＤＮＡをＡflIII酵素で消化し、ＯＲＦ６遺伝子のサイズに近いバンドを消失させた。９９０ｂｐのＡflIII-ＡflII I断片は、１％低溶融アガロースゲル中で精製し、ＴaqＩで消化した。新たな７９０ｂｐの断片を低溶融アガロースゲル中で精製し、ＡccＩおよびアルカリホスファターゼで処理したｐＭＴＬ２４ベクターにクローン化した。続いて、実施例４.１に記載した工程を行った。新たなベクターは、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ６と命名した。それには、該遺伝子の開始点から４６ｂｐに位置するＯＲＦ６開始コドンが含まれる。８.２-バキュロウイルス移入ベクターへのＯＲＦ６遺伝子の挿入ＯＲＦ６は１９.０ＫＤａのタンパクをコードしている。これは、エンベロープタンパクであると提唱されており、その疎水的な性質を考慮すると、膜−貫通タンパクであると考えられる。移入ベクターへの対応する遺伝子の挿入については、ｐＭＴＬ２４のＡccＩ部位にクローン化したＯＲＦ６を含有するｐＰＲＲＳ -ＯＲＦ６ベクターを、ＢamＨＩ酵素で消化した。７９０ｂｐの断片を１％アガロースゲルから精製し、ベクターｐＰＲＲＳ-ＢamＨＩに直接連結した。新しい移行ベクターは、ｐＰＲＲＳ-Ｂac５と命名した。それは、続くトランスフェクション実験で用いた。８.３-組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜組換えウイルスのトランスフェクションおよび選抜に用いた方法は、ＯＲＦ２に関して前記した方法（実施例４.３）に類似していた。得られた組換えバキュロウイルスは、ＡｃＮＰＶ，ＰＲＲＳ６と命名した。それは、受託番号Ｖ９４０１１３２７でＥＣＡＣＣに寄託されている。実施例９-ＯＲＦ７によってコードされるタンパク遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスの取得９.１-ＯＲＦ７遺伝子の調製ＯＲＦ７遺伝子のサイズは３８４ｂｐである。それは、ｐＰＲＲＳ-８遺伝子クローンから調製した(図８)。実施例８.１に記載した断片ＡflIII-ＡflIIIをＨ paＩ酵素で消化した。ＯＲＦ７遺伝子を含有する４３０ｂｐのＡflIII−ＨpaＩ断片を、低溶融アガロースゲル中で精製し、続いてＮcoＩ-ＳmaＩで消化したｐＰＭＴＬ２５ベクターにクローン化した。組換えコロニーの分析および特徴付けは実施例４.１に記載のごとく行った。新たなベクターは、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦＴと命名した。それには、該遺伝子の開始点から１６ｂｐに位置するＯＲＦ７開始コドンが含まれる。９.２-バキュロウイルス移入ベクターへのＯＲＦ７遺伝子の挿入ＯＲＦ７は１３.８ＫＤａのタンパクをコードしている。これは、ウイルス核タンパクであると提唱されている。移入ベクターへの対応する遺伝子の挿入については、ｐＰＲＲＳ-ＯＲＦ７プラスミドをＢglIIおよびＢamＨＩ酵素で消化した。得られた４３０ｂｐの断片を低溶融アガロースゲルから単離し、ｐＡｃＹＭ１-ＢamＨＩベクター内に直接連結した。適当に特徴付けした後に、新たなｐＰＲＲＳ-Ｂac７移入ベクターを得た。それは、続くトランスフェクション実験に用いた。９.３-組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜組換えバキュロウイルスのトランスフェクションおよび選抜に用いた方法は、ＯＲＦ２に関して前記した方法（実施例４.３）と同様であった。得られた組換えバキュロウイルスは、ＡｃＮＰＶ，ＰＲＲＳ７と命名した。それは、受託番号Ｖ９４０１１３２８でＥＣＡＣＣに寄託されている。実施例１０．組換えタンパクの分析および免疫検出ＩＰＦＵ/細胞の感染の多重度でＳｆ９細胞を異なった組換えバキュロウイルスで感染させ、その培養物を採取するまで２７℃にてインキュベートした。異なった細胞培養は、単層および懸濁液中で行った。全てのケースにおいて、結果は同様であった。培養物は、異なった感染後時間に採取した。各組換えウイルスについての最適な採取時間を測定した。これは、４８および９６ｐ.ｉ.ｈ.（感染後時間）の間の範囲であった。細胞は、１５００ｒｐｍにて１０分間遠心することによって採取し、ＰＢＳｐＨ：７.４で２回洗浄し、続いて２５ｍＭ重炭酸塩溶液に再懸濁し溶解した。それらを１００００ｒｐｍにて１０分間遠心し、可溶性細胞質画分を残りの不溶性細胞夾雑物から分離した。総細胞抽出物ならびに異なった画分は、１１％ポリアクリルアミド・ゲル中の電気泳動によって分析し、クーマシーブルーで染色するか、または免疫学的検出用のニトロセルロース膜に移行させた。２８.４、３０.８、２０.０，２２.４、１９.０および１３.８ＫＤａの分子量マーカーと共にクーマシーブルーで染色することによってバンドを観察した。これらのサイズは、各々、ＯＲＦ２、３、４、５、６および７によりコードされる遺伝子について予想されたサイズに相当する。異なった遺伝子の発現レベルには、大きな変動がある：かなりなレベルのＯＲＦ３、５および７、相当なレベルのＯＲＦ２および４、ならびに低いレベルのＯＲＦ６。ＯＲＦ２および６に対応する低い発現レベルの遺伝子は、各々４２および３９ヌクレオチドと、該タンパクＡＴＧ開始コドンとポリヘドリン・バキュロウイルスプロモーターとの間が大きく離れていることによるのであろう。幾つかの場合において、良好な発現を得るためには、この距離を実質的に最小限に維持しなければならないことが示された。低い発現の原因となるもう１つの要因は、これらのタンパクの高い疎水性であろう。感染細胞の可溶性画分および不溶性画分を別々に分析すると、ＯＲＦ７を除き、大部分の発現されたＰＲＲＳタンパクが不溶性であり、膜夾雑物に結合したままであることが観察された。これは、これらのタンパクの疎水性および糖鎖付加された性質によるものであろう。これらの糖タンパクの大部分には、それらを膜につなぎ留める膜貫通領域が含まれている。かかる特徴が、細胞抽出物からこれらのタンパクを精製することを困難なものとしている。免疫検出については、標準的な方法（バーネット(Burnette)、アナリティカル・バイオケミストリー(Anal．Biochem.)，第112巻，195-203頁，1981年；トウビン（Towbin）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユー・エス・エイ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)，第76巻，4350-4354頁，1979年）により、タンパクをニトロセルロース膜に移行させた。タンパク移行は、２２Ｖにて３０分間、セミ-ドライ装置（バイオ-ラド（Bio- Rad）社製）で行った。次いで、ニトロセルロース片を、２０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ７.５、５００ｍＭＮａＣｌ(ＴＢＳ)中の３％粉末スキムミルクで、室温にて１時間ブロッキングした。続いて、その片を、最初に、ＴＢＳ-０.０５％ツイーン２０中に１/１００希釈した抗-ＰＲＲＳブタ抗血清（Ｃ-４５）で室温にて２時間インキュベートし、ＴＢＳ-０.０５％ツイーン２０で室温にて３０分間洗浄し、次いでアルカリフォスファターゼ結合抗-ブタＩｇＧ(希釈率１/１０００)(シグマ（Sigma）社製)で１時間インキュベートした。その片をさらに１回洗浄し、最後に、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ、１００ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ９.５中のＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）(シグマ（Sigm a）社製)およびＢＣＩＰ（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-ホスフェート） (シグマ（Sigma）社製)溶液で、目視できるバンドが現れるまで染色した。反応は蒸留水で停止させた。イムノブロットにより特異的な反応が認められた全てのケースにおいて、概算ＯＲＦサイズに相当する分子量のタンパクが得られた。幾つかのケースにおいて、特にＯＲＦ３および５においては、４５ＫＤａまでの他の大きなサイズのバンドの存在が認められた。これらのバンドは、予期された潜在的な部位と一致する、異なったタンパクの糖鎖付加を表すであろう。１０.１-組換えタンパクの抗原的特徴付けバキュロウイルスで発現された組換えタンパクの正確な抗原性は、イムノブロッティング・アッセイにおいて、異なった動物血清に対するそれらの反応によってチェックした。組換えタンパクは、前記の方法により発現させ、ニトロセルロースに移行させて、抗-ＰＲＲＳＶ抗体を含有する、以前に特徴付けしたブタ血清収集物と反応させた。該血清は、実験的（＃１-４）または天然（＃５-８）に感染した動物で得られた。ＯＲＦ３、５および７に相当するタンパクが、チェックすべき最初のものであった。結果を表２に示す。このアッセイにより、組換えタンパク３、５および７が、各々、天然のウイルスタンパク３、５および７と抗原的に同様であることが証明された。アッセイを組換えタンパク２、４および６で行うと、フィールドの血清による認識に関する点において結果は大きく変動した。この変動の理由は、それらの低い発現レベルおよび/またはそれらの高い疎水性であろう。これらのアッセイは、バキュロウイルス系で発現されたＰＲＲＳＶ組換えタンパクが天然のウイルスタンパクと抗原的に区別できないことを証明している。実施例１１．組換えタンパクの精製組換えタンパク精製を設計するストラテジーには、該タンパクの構造特性が考慮されるべきである。これらの特徴のうちの２つは指摘すべきである：（１）それらを不溶性としている疎水性、および（２）それらを膜に対して高親和性としている多数の膜貫通領域の存在。例えば：異なった著者（ホール，エス・エル（ Hall，S.L.）ら、ワクチン(Vaccine)，第９巻，659-667頁,（1991年）８月：トード，エヌ（Tordo，N.）ら、ヴァイロロジー(Virology)，第194巻，5269頁(199 3年)）により記載されているごとく、完全に感染させた細胞を用いることができる場合に、それらをワクチンとして使用する際、ほとんどの場合において、これらの特徴はタンパクの抽出および精製を簡便としない。それにもかかわらず、モデルとしてＯＲＦ３タンパクを用いてこれらのタンパクを精製する幾つかの試行がなされてきた。１１.１-ＯＲＦ３由来のタンパクの精製前記の実施例に記載された方法により、Ｓf９細胞を組換えＡｃＮＰＶ，ＰＲＲＳ３ウイルスで感染させた。その感染細胞は、４００ｇにて１０分間遠心することによって採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２０×１０⁶細胞/ｍｌで再懸濁した。凍結/解凍によってその細胞を破裂させ、遠心によって可溶性画分を不溶性画分から分離した。全てのケースにおいて、その不溶性画分を続く処理に用いた。以下に用いた幾つかの方法を記載する。カオトロピック剤での処理最初に、不溶性画分を１ＭＮaＣｌで、次いで、２Ｍまたは４Ｍ塩化グアニジニウムで洗浄した。その細胞ペレットを別個の緩衝液に再懸濁し、室温にて１時間維持した。次いで、その調製物を１５０００ｒｐｍにて５分間遠心した。別個の画分における組換えタンパクの存在は、１５％ポリアクリルアミド-ＳＤＳゲル（ドデシル硫酸ナトリウム）中の電気泳動によって分析した。得られた結果は、これらの塩で一連の処理に付することにより、３０％〜５０％純度のタンパクが得られることを示している。この精製タンパクは、イムノブロッティングまたは間接ＥＬＩＳＡのいずれかによって測定したところ、感染動物からの血清によってそれが認識されるので、天然のタンパクに抗原的に類似することが示された。活性剤での処理以下の濃度の活性剤を用いた。 −ＮＰ４００．５％ −オクチルグルコシド２％ −ＳＤＳ０.５％、１％および２％ −デオキシコール酸ナトリウム０.５％、１％および２％全てのケースにおいて、細胞調製は、前記同様に行った。組換えタンパクを含有する細胞夾雑物を、前記の活性剤濃度および記載した条件下で処理した。一般に、これらの条件下では、別個の活性剤で処理しても、多量の組換えタンパクを可溶化することはできないということができる。０.５％ＳＤＳだけからは、非常に低収率ではあるが、５０％概算純度のタンパクが得られた。抗原的に、このタンパクは、カオトロピック剤で精製したタンパクで得られたものよりも効率は低いが、直接ＥＬＩＳＡによると感染動物血清と反応する。要約すると、これらの部分精製タンパクは抗-ＰＲＲＳＶワクチンに用いることができる。実施例１２．診断用途本発明により提供される組換えタンパクの主な適用の１つは、ＰＲＲＳＶフィールド感染を診断するためのキットの調製物におけるそれらの使用である。１２.１-診断での適用のためにＳf９で発現させた抗原の調製単層であるいは浮遊液中で増殖させたＳf９細胞を、各組換えバキュロウイルスで、０.５〜１の感染多重度で感染させた。いずれの組換えウイルスを用いるかに応じて、培養を感染後４８および７２時間の間に収穫した。それらを１５℃ 、４００ｇにて１０分間遠心し、ＰＢＳで洗浄した。最後に、組換えタンパクを含有する細胞ペレットを、２％オクチルグルコシド（シグマ）を含むＰＢＳに再懸濁し、１時間氷上に放置した。次いで、それらを１０００ｇにて１０分間遠心して、細胞夾雑物を除去した。上清をＰＢＳに対して徹底的に透析して洗剤を除去し、１００００ｇで３０分間遠心して沈殿を除去し、後で使用するために−７０℃で貯蔵した。１２.２-診断のためのＥＬＩＳＡ法ポリスチレン９６-ウェルのＥＬＩＳＡ法プレート（ポリソープ(Polisorp)，N UNC）を、４℃で一晩インキュベートすることによって５０ｍＭ炭酸塩緩衝液ｐＨ：９.６中で作成した異なる希釈の組換え抽出物混合物（ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７）（１００μｌ/ウェル）で被覆した。図９で示すごとく、プレートのコーティングに選択した最適希釈は１/１００であった。該プレートを、室温にて３０分間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％脱脂乳）で飽和させた。続いて、ブロッキング溶液中で作成した異なる希釈の抗 -ＰＲＲＳＶ抗血清を添加した。インキュベーションを３７℃で１時間継続した。０.０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシターゼ-標識プロテインＡ（１/５０００希釈）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。前記したごとき洗浄を行い、ＡＢＴＳ［２,２'-アジノ-ビス(３-エチルベンズチアゾリン-６-スルホン酸)］を基質として用い、反応物を室温で１０分間展開した。１％ＳＤＳで反応を停止し、４０５ｎｍで吸光度をモニターした。感染動物フィールド血清から得られた通常のＥＬＩＳＡ法滴定を図１０に示す。フィールド血清滴定は、通常、１/１００〜１/８００希釈の範囲である。数ダースフィールド血清でのサンプリング実験で得られた結果を図１１に示す。明らかに陽性の血清で得られた力価は０.４〜１.７の範囲であることが分かる。未知血清からの力価は０.２〜０.３の範囲である。陰性血清は０.１未満の力価を与える。かくして、バキュロウイルスで発現されたこれらの組換えタンパクの使用は安全で、信頼ができ、かつ再現性のある方法であり、結局未感染動物から感染動物を区別するのを可能とすると結論される。実施例１３．組換えワクチンの処方後記する方法により、エマルジョン形態の、異なる組換えＰＲＲＳＶタンパク、特にＰＲＲＳ-Ｏlot［ＥＣＡＣＣＶ９３０７０１０８］を含有する異なったワクチンを調製した。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞・クローンＳf９ −以下Ｓf-９という−を、０.１プラーク形成単位（ＰＦＵ）/細胞の感染多重度にて、各々前記ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３、ＯＲＦ５およびＯＲＦ７（図２、４および６）に対応する組換えタンパクを産生できる、組換えバキュロウイルス： −ＡｃＮＰＶ、ＰＲＲＳ３、［ＥＣＡＣＣＶ９４０１１３２５］； −ＡｃＮＰＶ、ＰＲＲＳ５、［ＥＣＡＣＣＶ９４０１１３２６］；および −ＡｃＮＰＣ、ＰＲＲＳ７、［ＥＣＡＣＣＶ９４０１１３２８］で、１×１０⁶細胞/ｍｌの率にて感染させた。それらを、２リットルのブラウン (Braun)-ＭＤファーメンター中、１００ｒｐｍおよび３０％のＰＯ₂にて撹拌しつつ２７℃で７２時間インキュベートした。次いで、感染昆虫細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７.４で洗浄し、同ＰＢＳ緩衝液に５×１０⁷細胞/ｍｌで懸濁した。組換えタンパクＯＲＦ３、ＯＲＦ５およびＯＲＦ７のうちいずれか１つを発現する５０×１０⁶ Ｓf９細胞を含有する感染Ｓf９細胞ホモジネートを、マルコール（Marcol^R）５２７９０.０ｍｇサイマルソール（Simulsol^R）５１００７０.０ｍｇモンタナイド（Montanide^R）８８８８０.０ｍｇの混合物よりなる油状アジュバントまたは油相と混合することによってワクチンを処方した。これらの条件下、５３％抗原相および４７％の前記油性相よりなる (ここに、油性相/抗原相の関係が重量/容量関係（Ｗ/Ｖ）である)、２ｍｌの用量の４の組換えワクチンを調製した。調製したワクチンの処方を以下に示す。１．ｒＰＲＲＳＣと命名するワクチン：ＯＲＦ３を発現する５０×１０⁶ Ｓf９細胞よりなる５３容量％の抗原相；および４７重量％の前記した油性相、２．ｒＰＲＲＳＤと命名するワクチン：ＯＲＦ５を発現する５０×１０⁶ Ｓf９細胞よりなる５３容量％の抗原相；および４７重量％の前記した油性相、３．ｒＰＲＲＳＥと命名するワクチン：ＯＲＦ７を発現する５０×１０⁶ Ｓf９細胞よりなる５３容量％の抗原相；および４７重量％の前記した油性相、４．ｒＰＲＲＳＦと命名するワクチン：ＯＲＦ３を発現する５０×１０⁶Ｓf９細胞、ＯＲＦ５を発現する５０×１０⁶ Ｓf９細胞およびＯＲＳ７を発現する５０×１０⁶ Ｓf９細胞よりなる（合計１５０×１０⁶ Ｓf９細胞）５３容量％の抗原相；および４７重量％の前記した油性相。実施例１４．妊娠雌ブタにおける効果この試行は、実施例１３に記載したごとくに調製した組換えワクチンの効果を評価するために行った。その目的で、合計１２匹の雌ブタ-ランドレース（Land race）×ラージホワイト（Large White）の交雑種を用いた。該動物をリサーチセンターの安全牛舎に移した。２匹の雌ブタをランダムに選択し(雌ブタNo．４００３９８および４００２９８)、ｒＰＲＲＳＣと命名したワクチンを接種した。２匹の雌ブタ（雌ブタNo. ４００１１８および４００３０７）にｒＰＲＲＳＤと命名したワクチンを接種した。ｒＰＲＲＳＥと命名したワクチンに関しては、３匹の雌ブタをワクチン接種し(雌ブタNo.３１４０１０、３１３４２６および４０００５９)、ｒＰＲＲＳＦと命名したワクチンに関しては、３匹の雌ブタをワクチン接種した(雌ブタ No.３１３５２４、４０１２３６および４０１４２６)。２匹の残りの雌ブタ（雌ブタNo.１および２０）はワクチン接種せず、対照動物として使用した。耳に近い頸部の深筋肉内経路（ＩＭ）を介し、２ｍｌのワクチンの用量を雌ブタにワクチン接種し、２１日後に同用量を再ワクチン接種した。直腸温度、飼料摂取ならびにワクチン摂取および攻撃双方の後の臨床的徴候のごとき局所的および一般的反応を観察した。加えて、雌ブタにおける生殖攻撃後の結果、ならびに雌ブタおよび子ブタにおける血清学的結果をモニターした。結果の解析をワクチンの効果の評価で用いた（表１）。攻撃はリサーチセンターの安全牛舎で行った。すべての動物は、鼻孔内経路（ＩＮ）を介し、１０^6.1ＴＣＩＤ₅₀/ｍｌ（組織培養感染性用量５０％）の力価にて、単離しリサーチセンターに寄託して維持した株、ＰＲＲＳＶ-２１８-Ｐ５ -Ｍφ-Ｆ２２０５５-２９/１０/９４５ｍｌの率で感染させた。分娩の日における雌ブタの生殖結果の評価については、以下にデータを記載する（表３）： −生きて誕生し健康な子ブタのNo. −生きて誕生したが虚弱な子ブタのNo. −死産した子ブタのNo. −部分的自己溶解（浮腫状）を持つ子ブタのNo. −ミイラ化した子ブタのNo. −誕生第１週後に生きている子ブタ、および −離乳の時期（２５〜３０日齢）に生きている子ブタ次いで、以下のプログラム：Ｄ０（第０日）：出血およびワクチン接種Ｄ＋１４：出血［ワクチン接種後１４日］Ｄ＋２１：出血および再ワクチン接種［ワクチン接種後２１日］Ｄ＋２８：出血［ワクチン接種後２８日］Ｄ＋３５：出血［ワクチン接種後３５日］ＤＩ：出血および攻撃ＤＩ＋７：出血［感染後７日］に従って、ペルオキシダーゼ単層アッセイ（ＩＰＭＡ）［イムノ・ペルオキシダーゼ・モノレイヤー・アッセイ(Immuno Peroxidase Monolayer Assay)，ベンスヴォールト（Wensvoort）ら，ベテリナリー・クォータリー(Vet．Quarterly)，第13巻，３号(1991年７月)］によって、雌ブタ（表４）および子ブタ（表５、６、７、８および９）において血清学的応答を分析した。子ブタにおける（抗-ＰＲＲＳＶ抗体）における血清学的結果を表４に示す。該試行のワクチン対象を評価する目的で、血清学的結果および生殖結果を評価した。表１０はいくらかの血清学的データを示し、一方、表１１は生まれた子ブタの合計数、第１週後に生きていた子ブタの数、離乳子ブタの数および４０日齢を超えた子ブタの数を含めた、試行で用いた雌ブタの生殖データをまとめる。結果を総合すると、ワクチンｒＰＰＲＳＣの場合において、１匹の雌ブタが血清変換され（４００２９８）、１匹は血清変換されず（４００３９８）；ワクチンＤの場合において、いずれの雌ブタも血清変換されず；ワクチンＥおよびＦについては、主として、ＯＲＦ７でコードされたタンパクのために強力な血清変換があることが明らかである。ワクチン接種した動物をワクチン接種していない動物と比較すると、攻撃前に好都合な挙動があり、試行した組換えワクチン対象物はＰＲＲＳの防止についての有効な手段を構成するという可能性を主張することが可能となる。ＩＰＭＡ技術で滴定した抗体を欠くワクチン接種した雌ブタは保護されることが示され、これは該ワクチン（ｒＰＰＲＳＣおよびｒＰＰＲＳＤ）は細胞性免疫を誘導できることを示す。該ワクチンの有効性は、ａ）誕生した子ブタの合計数に対する第１週後に生きていた子ブタの百分率、ｂ）誕生した子ブタの合計数に対する離乳子ブタの百分率、およびｃ）誕生した子ブタの合計数に対する４０日齢を超えた子ブタの百分率；を比較することによって評価した。表１２は、誕生した子ブタの合計数に対する、第１週後に生きていた子ブタの百分率、離乳子ブタの百分率、および４０日齢を超えた子ブタの百分率のデータを示す。ＩＰＭＡ技術で評価した、抗体を欠く動物は保護されることが示された。図面の説明図３：ａ）ＰＲＲＳゲノムｂ）サイズ（Ｋｂ）ｃ）クローン番号図９：ａ）ＥＬＩＳＡ法による抗原の滴定ｂ）４０５ｎｍにおける吸光度ｃ）抗原希釈（１/ ）ｄ）１/２００における血清 −−・--・−− フィールド −−＋−−＋−− 実験 −−＊−−＊−− 陰性図１０：ａ）ＥＬＩＳＡ法による血清滴定ｂ）４０５ｎｍにおける吸光度ｃ）血清希釈（１/ ）ｄ）陽性−−・−−・−− 陰性−−＋−−＋−−図１１：ａ）フィールドｂ）４０５ｎｍにおける吸光度ｃ）雌ブタ血清

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/10 8931−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/02 8310−2Ｊ 33/569 ＬＧ０１Ｎ 33/53 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/569 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クリメント・サンチェス，イサベルスペイン、エ―17813バル・デ・ビアーニャ、カレテラ・カンプロドン（番地の表示なし）、”ラ・リバ"

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルスＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパクのいずれかから選択されることを特徴とするブタ生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）の原因ウイルスの組換えタンパク。２．図２に示すアミノ酸配列よりなることを特徴とする請求項１記載のタンパク。３．許容宿主細胞培養で増殖させた組換えバキュロウイルス発現系において遺伝子工学によって得られる請求項１記載のタンパク。４．前記組換えバキュロウイルスが、少なくとも、ウイルスＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパクの遺伝子を含有し、それを発現する請求項３記載のタンパク。５．前記許容宿主細胞培養が許容昆虫細胞の培養である請求項３記載のタンパク。６．名称ＥＣＡＣＣ受託番号 AcNPV，PRRS2 Ｖ９４０２１００７ AcNPV，PRRS3 Ｖ９４０１１３２５ AcNPV，PRRS4 Ｖ９４０２１００８ AcNPV，PRRS5 Ｖ９４０１１３２６ AcNPV，PRRS6 Ｖ９４０１１３２７ AcNPV，PRRS7 Ｖ９４０１１３２８から選択される組換えバキュロウイルスの発現によって得られる請求項３記載のタンパク。７．ａ）バキュロウイルスに挿入すべき、ＰＲＲＳ-ＯlotゲノムＲＮＡから合成した、ｃＤＮＡ配列を調製し；次いで、ｂ）挿入されたＯＲＦに対応する組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスを得る工程よりなることを特徴とする、当該ウイルスのＯＲＦ２〜７のいずれかに含有される遺伝子によってコードされる、組換えＰＲＲＳ-Ｏlotタンパクを得る方法。８．挿入すべきｃＤＮＡ配列の調製が、ａ.１ウイルスＰＲＲＳ-Ｏlotを単離し、精製し、ａ.２ＰＲＲＳ-ＯlotウイルスＲＮＡを単離し、ａ.３ＰＲＲＳ-ＯlotゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを合成する、工程よりなる請求項７記載の方法。９．ウイルスＰＲＲＳ-Ｏlotの単離を、許容細胞培養での該ウイルスの複製によって行う請求項８記載の方法。１０．ＰＲＲＳ-ＯlotウイルスＲＮＡの単離を、オリゴｄ(Ｔ)₁₂-セルロースへの吸着によって行う請求項８記載の方法。１１．ＰＲＲＳ-ＯlotゲノムＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を、該ＲＮＡを、対応するｄＮＴＰ、逆転写酵素およびｄ(Ｔ)₁₂もしくは式５'-CGGGCTCGAGCCTTTGGC GA-３'のオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって行う請求項８記載の方法。１２．ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７に対応する組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスの取得を、ｂ.１バキュロウイルス移入ベクターに対応するＯＲＦ遺伝子を挿入し、ｂ.２対応するＯＲＦ遺伝子を挿入した該移入ベクターで許容宿主細胞をトランスフェクトし、次いでｂ.３対応する挿入されたＯＲＦ組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスを選択する工程よりなる請求項８記載の方法。１３．前記バキュロウイルス移入ベクターがベクターｐＡｃＹＭ１である請求項１２記載の方法。１４．組換えバキュロウイルスの複製用の前記許容宿主細胞のトランスフェクションを、対応するＯＲＦ遺伝子が挿入された移入ベクターのＤＮＡと野生型バキュロウイルスのＤＮＡとの混合物によって行う請求項１２記載の方法。１５．前記許容宿主細胞が昆虫細胞培養物である請求項１２記載の方法。１６．得られた組換えバキュロウイルスが、前記ウイルスのＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパクのいずれかから選択される、ＰＲＲＳ-Ｏlotの単一の組換えタンパクを発現する請求項１２記載の方法。１７．得られた組換えバキュロウイルスが、名称ＥＣＡＣＣ受託番号 AcNPV，PRRS2 Ｖ９４０２１００７ AcNPV，PRRS3 Ｖ９４０１１３２５ AcNPV，PRRS4 Ｖ９４０２１００８ AcNPV，PRRS5 Ｖ９４０１１３２６ AcNPV，PRRS6 Ｖ９４０１１３２７ AcNPV，PRRS7 Ｖ９４０１１３２８から選択される請求項１２記載の方法。１８．ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７の１つに対応する少なくとも１種の組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルス。１９．前記ウイルスのＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパクのいずれかから選択される、ＰＲＲＳ-Ｏlotの単一の組換えタンパクを発現する請求項１８記載の組換えバキュロウイルス。２０．名称ＥＣＡＣＣ受託番号 AcNPV，PRRS2 Ｖ９４０２１００７ AcNPV，PRRS3 Ｖ９４０１１３２５ AcNPV，PRRS4 Ｖ９４０２１００８ AcNPV，PRRS5 Ｖ９４０１１３２６ AcNPV，PRRS6 Ｖ９４０１１３２７ AcNPV，PRRS7 Ｖ９４０１１３２８から選択される請求項１８記載の組換えバキュロウイルス。２１．ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパクのいずれかに対応する少なくとも１種の組換えタンパクおよび適当な担体またはアジュバントよりなる、ブタの生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）に対してブタをワクチン接種し保護するのに適したワクチン。２２．前記組換えタンパクが、許容宿主細胞培養で増殖させた組換えバキュロウイルスの発現系において遺伝子工学によって得られる請求項２１記載のワクチン。２３．前記組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスが、名称ＥＣＡＣＣ受託番号 AcNPV，PRRS2 Ｖ９４０２１００７ AcNPV，PRRS3 Ｖ９４０１１３２５ AcNPV，PRRS4 Ｖ９４０２１００８ AcNPV，PRRS5 Ｖ９４０１１３２６ AcNPV，PRRS6 Ｖ９４０１１３２７ AcNPV，PRRS7 Ｖ９４０１１３２８から選択される請求項２１記載のワクチン。２４．前記組換えタンパクが部分的に精製されて用いられる請求項２１記載のワクチン。２５．前記抗原相が、ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ３、５および７によってコードされる組換えタンパクよりなる群から選択される、単一の組換えＰＲＲＳＶタンパクを含有する請求項２１記載のワクチン。２６．前記抗原相が、ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７によってコードされる組換えタンパクのうちの１種のみを発現する同一組換えバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞よりなる請求項２１記載のワクチン。２７．前記抗原相が、ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７によってコードされる異なる組換えタンパクのうちの１種のみを発現する異なる組換えバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞よりなる請求項２１記載のワクチン。２８．油状アジュバントを含有する請求項２１記載のワクチン。２９．前記油状アジュバントがマルコール（Marcol）５２、サマルソール（Si mulsol）５１００およびモンタナイド（Montanide）８８８の混合物よりなる請求項２８記載のワクチン。３０．水性アジュバントを含有する請求項２１記載のワクチン。３１．さらに、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ｇ-ＩＦＮ、細胞壊死因子および同様の物質のごとき細胞応答増強剤（ＣＲＰ）物質を含有する請求項２１記載のワクチン。３２．前記アジュバントが、ＭＤＰ、ＩＳＣＯＭまたはリポソームのごとき細胞応答を変調し免疫刺激できるアジュバントである請求項２１記載のワクチン。３３．ワクチン接種した動物において細胞性免疫を誘導できる請求項２１記載のワクチン。３４．１種以上のブタ病原体および適当な担体もしくはアジュバントと共に、ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７のいずれかに含有される遺伝子のいずれかによってコードされるタンパクのうちの１種に対応する少なくとも１種の組換えタンパクよりなる、ブタ生殖・呼吸症候群または他のブタ伝染病を予防できる二価または多価ワクチン。３５．アクチノバチラス・プロイロニウモニアエ(Actinobacillus pleuropneu moniae )、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ブタ・パラボウイルス(Porcine parvovirus)、レプトスピラ(Leptospira)、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli)、エリシペロトリックス・ルシオパシア(Erysipelothrix rh usiopathiae )、パスツーレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、ブタ呼吸器コロナウイルス(Porcine respiratory coronavirus)、ロタウイルス(Rotavirus)よりなる群から選択される少なくとも１種のブタ病原体よりなるか、または、オウジェスキー病(Aujeszky's disease)、ブタ・インフルエンザもしくは伝染性胃腸炎の病原体に対する請求項３４記載のワクチン。３６．ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７のいずれかに含有される遺伝子のいずれかによってコードされるタンパクの１種に対応する少なくとも１種の組換えタンパクおよび適当な担体またはアジュバントで動物を免疫化することによって得られる抗体を含有することを特徴とする、ブタ生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）に対してブタをワクチン接種し保護するのに適した受動ワクチン。３７．ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７のうちの１つに対応する少なくとも１種の組換えタンパクおよび適当な検出手段よりなる、ブタからの血液、血清、痰、唾液または乳のごとき生体試料中のＰＲＲＳＶを特異的に同定する抗体の存在を検出するための診断キット。３８．前記組換えタンパクが、許容宿主細胞培養で増殖させた組換えバキュロウイルスの発現系において遺伝子工学によって得られる請求項３７記載の診断キット。３９．前記組換えタンパクを発現する組換えバキュロウイルスが、名称ＥＣＡＣＣ受託番号 AcNPV，PRRS2 Ｖ９４０２１００７ AcNPV，PRRS3 Ｖ９４０１１３２５ AcNPV，PRRS4 Ｖ９４０２１００８ AcNPV，PRRS5 Ｖ９４０１１３２６ AcNPV，PRRS6 Ｖ９４０１１３２７ AcNPV，PRRS7 Ｖ９４０１１３２８から選択される請求項３８記載の診断キット。４０．ＰＲＲＳ-ＯlotのＯＲＦ２〜７の１つに対応する少なくとも１種の組換えタンパクおよび適当な検出手段で動物を免疫化することによって得られるＰＲＲＳＶを特異的に同定する抗体よりなる、ブタからの血液、血清、痰、唾液または乳のごとき生体試料中のＰＲＲＳＶの存在を検出するための診断キット。