JPH09500652A - 固形腫瘍悪性疾患治療用の細胞ワクチンおよび使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 悪性の内部固形腫瘍を有する患者を治療するための放射線療法の効果を向上させるための方法および薬剤組成物を開示する。本方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍由来抗原を放出させるために腫瘍を照射すること、該抗原を単離したものを修飾した抗原提示細胞調製物と一緒に含む細胞ワクチンを調製すること、および該ワクチンを患者に投与することを含む。好ましい態様においては、抗原提示細胞は、フォトフェレシスに付されることにより光化学的に修飾された白血球である。

Description

【発明の詳細な説明】 固形腫瘍悪性疾患治療用の細胞ワクチンおよび使用法 関連出願 この出願は、本明細書中にそのまま援用される１９９２年１１月１８日出願の 米国特許出願第０７／９７７，６７２号明細書の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、癌治療の改良法に関する。更に詳しくは、本発明は、照射療法とフ ォトフェレシス（ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）とを組合わせることによる、内 部固形腫瘍悪性疾患を有する患者を治療するための放射線療法の有効性を改良す る方法および薬剤組成物に関する。 発明の背景 皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、異常Ｔ細胞の単クローンの大量増殖によ って引き起こされる免疫系の悪性疾患である。ＣＴＣＬに対する治療の選択は、 病状の程度、更には患者の全身的健康状態および年齢に依る。概して、皮膚に限 定される初期段階の病状は、局所ナイトロジェンマスタード、ソラレン光線療法 （「ＰＵＶＡ」、すなわち、ソラレン経口投与後に皮膚のＵＶＡ照射）および全 皮膚電子ビーム療法（ＴＳＥＢ）などの連続局所療法によって治療される。末期 段階病状、例えば、セザリー症候群は、体外光化学療法（「フォトフェレシス」 ）によって治療される。 皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療のためのフォトフェレシスは、１９８７年にエデル ソン（Ｅｄｅｌｓｏｎ）によって紹介された（エデルソン，Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３１６：２９７〜３０３（１９８７））。比較的新しいが、フ ォトフェレシスは、今のところＣＴＣＬの紅皮症変異に対する標準的療法と考え られている（エデルソン，Ｒ．、「光活性化薬剤（Ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔ ｅｄ Ｄｒｕｇｓ）」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２５６（８ ） ：６８〜７５（１９８８）；エデルソン，Ｒ．、「フォトフェレシス。臨床的 に適切な免疫生物学的応答修飾因子（Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ：Ａ Ｃｌｉ ｎｉｃａｌｌｙ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｐ ｏ ｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）」，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６３６ ：１５４〜１６４（１９９１））。療法は二 つの工程、すなわち、（１）光活性剤（例えば、８−メトキシソラレン、「８− ＭＯＰ」）の存在下で患者の白血球標品に照射して細胞を光化学的に変更するこ とおよび（２）光化学的に変更された細胞を再注入することを含む。 紅皮症のあるＣＴＣＬ患者が全てフォトフェレシス療法に反応するのではない 。反応するＣＴＣＬ患者の半数生存期間は６２か月より大、すなわち、他の様式 で治療された患者の約２倍長い（エデルソン，Ｒ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｄｅｒｍａｔ ｏｌ．２５（３） ：１〜６（１９９１））。しかしながら、ＣＴＣＬ患者の最大 ２５％までがフォトフェレシスに対してある一定の反応を有することから、補助 的なＴＳＥＢ療法、化学療法（例えば、経口メトトレキセート（ルーク（Ｒｏｏ ｋ），Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２７：１５３５〜１５４０（１ ９９１））または皮下インターフェロンα−２ｂ（ヒールド（Ｈｅａｌｄ），Ｐ ．Ｗ．ら、Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６２：６２９〜６３８（１９８９ ））が最近になって紹介された。 フォトフェレシスの作用機序は完全に解明されていない。８−ＭＯＰおよび紫 外線に対して悪性Ｔ細胞クローンを暴露した後にその照射され損傷された細胞を 患者に戻すことは、Ｔ細胞表面受容体によって応答が媒介される異常Ｔ細胞に対 する特異的応答を引き起こすと考えられる。この仮説と一致するのは、照射され た血液白血球の再注入後に、Ｔ細胞の１種類または複数の病原性クローンに対し て免疫が生じることである（エデルソン，Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３１６：２９７〜３０３（１９８７）；エデルソン，Ｒ．、Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｍｅｄ．６２ ：５６５〜５７７（１９８９）；ルーク，Ａ．ら、チバ財団 シンポジウム（Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）１４６ ，ニューヨーク，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），（１９８９）１７１〜１７７）。 Ｔ細胞受容体は、特定の抗原が抗原提示細胞上の表面マーカーと結合した場合 にのみ、その抗原を認識することによって細胞性免疫応答を媒介する。表面マー カーは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）として知られる一群の分子に属 する。抗原提示細胞上の抗原／ＭＨＣ分子に対するＴ細胞受容体の結合は、Ｔ細 胞の変化を引き起こす。これらの変化は、集合的に細胞性免疫応答を含む。 二つのシグナルが、抗原提示細胞と結合している抗原に対してＴ細胞に媒介さ れた応答を引き起こす主な原因となっている。第一シグナルは、抗原提示細胞上 の抗原に対するＴ細胞の結合後に生じる。第二の同時刺激性シグナルは、「補助 」膜分子または可溶性メッセンジャーによって抗原提示細胞から応答性Ｔ細胞へ 送られる。これらの可溶性細胞内メッセンジャーは、免疫応答の最大反応および 期間を調節し且つサイトカインと総称される。サイトカインとしては、リンホカ イン、モノカイン、インターロイキン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子の ような以前に文献中で論評された群がある（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ ，第７版，ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーション ズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ） ，オックスフォード，英国，１９９１年，１４０〜１５０頁）。抗原提示細胞が 第二グナルを送らない場合、Ｔ細胞はほとんど麻痺状態になる、すなわち、抗原 に対して免疫応答を開始することができない。ある種の抗原提示細胞、例えば、 休止Ｔ細胞は、第二シグナルを送ることができない。したがって、外因性サイト カインまたは他の第二シグナルの不存在下において、抗原提示細胞としても機能 するこのような休止Ｔ細胞は、提示された抗原に対する免疫応答をダウンレギュ レートし且つ膜受容体がふさがれたＴ細胞の抗原特異的免疫麻痺をもたらす。抗 原提示細胞の他の種類、例えば、単球は、サイトカインを放出することができる 。したがって、サイトカインを放出するように刺激された単球は、提示された抗 原に対する免疫応答をアップレギュレートする。 ＣＴＣＬおよび強皮症の他に、フォトフェレシスは、尋常性天疱瘡、全身性硬 化症（ルーク，Ａ．、「自己免疫疾患の治療におけるフォトフェレシス。尋常性 天疱瘡および全身性硬化症についての試験（Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ Ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎ ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６３６ ：２０９〜２１６（１９ ９ １））および慢性関節リウマチ（マラウィスタ（Ｍａｌａｗｉｓｔａ），Ｓ．ら 、「慢性関節リウマチに対するフォトフェレシス（Ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）」，Ａｎｎａｌｓ ｏ ｆ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６３６ ：２１７〜２２６ （１９９１））を含むいくつかの他の自己免疫疾患の治療に用いられてきた。 フォトフェレシス療法に対して有望な結果を示す現在進行中の他の予備試験とし ては、自己免疫型またはＩ型インスリン依存性糖尿病、心臓移植拒絶反応、エイ ズ（ＡＩＤＳ）関連コンプレックスおよび急性対宿主性移植片病がある。 要約すると、フォトフェレシスは、Ｔ細胞調節における障害を特徴とする種々 の自己免疫疾患に対して普遍化された臨床的利点を示すことが実証された。フォ トフェレシス療法に服しやすいと先行技術で報告された病状のリストにないもの は、循環性の異常なＴ細胞のクローン増殖が関与していない疾患であり、例えば 、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、咽 頭口部の扁平上皮癌、線維肉腫、腎臓癌、膀胱癌、脳癌、脊髄癌、悪性黒色腫お よび皮膚の転移性扁平上皮癌などの治療することが難しい癌に関係した固形腫瘍 悪性疾患がある。これまでのところ、このような固形腫瘍悪性疾患の治療は手術 、照射及び／または化学療法に限られている（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ′ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ，１２版， Ｊ．Ｄ．ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら監修，マクグロー・ヒル・インコーポレ ーテツド（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．），Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９９ １）を参照されたい）。 内部固形腫瘍の治療のために化学療法と併用されたＸ線照射の使用は、少なく とも若干の腫瘍細胞の増殖を破壊するかまたは阻害することによって普遍化され た治療的利点を有することができるが、このような従来の治療法は理想からほど 遠い。特に、これらの補助療法は、化学療法薬に特異性がないことに由来する潜 在的に毒性の副作用によって制限される。 発明の概要 本発明は、患者の細胞免疫系による破壊のために腫瘍に特異的に集中させる方 法を放射線療法と組合わせることにより、固形腫瘍悪性疾患の治療のための従来 のアプローチの問題を克服する。本質的には、本発明の方法は、それぞれが異な る病状を治療するのに有効であることが知られているＸ線照射およびフォトフェ レシスの二つの方法の相乗的組合わせである。本発明は、これら二つの方法が組 み合わされた場合に、固形腫瘍悪性疾患を有する患者の治療において相乗的な治 療的利点を与えるという知見である。細胞免疫応答の調節は本発明の実施に重要 であるので、（以下に記載の）細胞免疫応答を媒介する細胞ワクチンの受容患者 は、例えば、正常絶対値付近のＣＤ８陽性Ｔ細胞によって実証されるような受容 能力のある免疫系を有することが好ましい。 本発明の一つの態様により、内部固形腫瘍を有する患者を治療するための放射 線療法の有効性を改良する方法を提供する。該方法は、内部固形腫瘍に照射して 腫瘍由来抗原を放出させ、多数のこれらの抗原を単離し、そして予めフォトフェ レシスを施された、すなわち、光失活白血球標品を生成するように光活性剤存在 下で照射された白血球標品と該腫瘍由来抗原とを接触させることを包含する。腫 瘍由来抗原を、細胞ワクチンを生成する条件下で光失活白血球標品と接触させた 後、そのワクチンを患者に投与して、放射線療法の有効性を改良する。別の方法 を用いて、固形腫瘍から抗原をインビボで放出させることができる。これらとし ては、腫瘍の物理的処置（例えば、外科手術の時点で）、例えば、腫瘍の圧搾、 高濃度の食塩水または１種類若しくは複数の化学療法薬を用いる灌流または注入 がある。腫瘍から抗原をインビボ放出させる更に別の方法としては、動脈化学灌 流（すなわち、１種類または複数の高濃度の１種類または複数の化学療法薬を、 腫瘍のある器官に通じる動脈中に注入することによって灌流すること）；フォト フリン（ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）（すなわち、全身性または灌流経路によってポル フィリンなどの光活性剤を腫瘍に投与した後、該薬剤を現場で活性化させること ）；並びに腫瘍からインビボで抗原を放出させるのに十分な波長および強さのレ ーザー光線によって腫瘍を損傷させることがある。 好ましい態様において、腫瘍由来抗原は、腫瘍のＸ線照射の後に、ｉｎ ｖｉ ｖｏで腫瘍から放出させる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて循環系に腫瘍由来の抗原を 放出させるために十分な、部位特異的な腫瘍壊死の別の方法も本発明の範囲内で ある。 本発明の他の観点においては、照射療法の効果を向上させる細胞ワクチンが提 供される。この細胞ワクチンは、固形腫瘍由来の複数の抗原を、空のクラスＩお よび／または空のクラスIIの腫瘍組織適合性複合体分子の発現を誘発するように 処理された複数の抗原提示細胞と混合されて含む混合物の有効量を含んでいる。 典型的には、そのような誘発は、フォトフェレシス（ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉ ｓ）により行われ、そして誘発された細胞は「光不活性化」抗原提示細胞と呼ば れる。この混合物は薬学的に許容される担体中に含ませる。 本明細書中において、「有効量」の混合物とは、患者を治療するための照射療 法の効果を向上させるのに十分な量を意味する。ある量が「有効量」であるか否 かは、当業者に知られる基準で決定される。好ましい態様においては、細胞ワク チンの製造に用いられる抗原提示細胞は自己細胞、すなわち該ワクチンを投与さ れる患者から単離された細胞であって、白血球調製物をフォトフェレシスに付す ることにより光不活性化されたものである。しかしながら、抗原提示細胞の別の 供給源および光不活性化白血球の機能的均等物の別の製造方法もまた提供される 。固体腫瘍由来抗原は、全血液、リンパ液から、およびおそらくは尿からも単離 されるので、本細胞ワクチンは、該抗原を単離した元の体液を場合により検出可 能量含有する。 本発明の他の観点によると、上記記載の細胞ワクチンを製造する方法も提供さ れる。この方法は、複数の腫瘍由来抗原を単離し、白血球調製物を光活性化可能 な剤の存在下で照射に暴露して光不活性化白血球調製物を生ぜしめ、そして該複 数の腫瘍由来抗原を光不活性化白血球調製物と、細胞ワクチンを生じる条件下で 接触させることを含んでいる。混合物がまだ薬学的に許容される担体中に含まれ ていない場合は、患者への投与に先立ってそのような担体中に含ませる。 内部固形腫瘍を有する被験者を処置するための放射線治療の有効性を改善する ためのもう一つ別の方法もまた提供される。本方法には、固形腫瘍を照射して腫 瘍由来抗原をｉｎ ｖｉｖｏで放出させること、複数の腫瘍由来抗原を単離する こと、細胞調製物（被験者への投与に適した抗原提示細胞を含む）を処理して主 要組織適合性複合体分子の細胞による表面発現を増強すること、腫瘍由来抗原を 処理された細胞調製物と複数の抗原関連抗原提示細胞を形成する条件下で接触さ せること、並びに、抗原関連抗原提示細胞を被験者に投与すること、が含まれる 。腫瘍組織適合性分子の発現を増強するための細胞調製物の処理方法には、例え ば、以下の生体外方法または条件の１以上に細胞調製物を付することが含まれる ： （１）フォトフェレシス（photopheresis）、（２）生理的温度より低い温度お よび（３）細胞調製物を主要組織適合性分子の発現を誘導することが知られてい る１以上のサイトカイン類と接触させること。好ましい態様では、抗原提示細胞 は自己由来の細胞であり、即ち、当該細胞は治療を受ける被験者から単離される 。より好ましくは、当該細胞は単球またはＢ細胞である。 本発明のもう一つ別の側面によれば、腫瘍特異的抗原に対する免疫系応答を増 強するための方法が開示される。本方法には、複数の腫瘍由来抗原をｉｎ ｖｉ ｖｏ で放出すること、腫瘍由来抗原を単離すること、並びに、単離された抗原を 抗原提示細胞を含む細胞調製物と接触することが含まれるが、この調製物はから の（empty）腫瘍組織適合性複合体分子の細胞による発現を増強するように処理 されている。好ましくは、抗原提示細胞は白血球であり、より好ましくは単球ま たはＢ細胞である。好ましい態様では、細胞調製物は、上記の生体外方法の任意 のもの、例えば、細胞調製物をフォトフェレシスおよび／または生理的温度より 低い温度に付することによって、からの腫瘍組織適合性複合体分子の発現を増強 するように処理される。腫瘍特異的抗原に対して免疫系を増強するための細胞ワ クチンは、抗原と抗原提示細胞の表面上に存在するからの腫瘍組織適合性分子と の結合を増強することが知られている条件下で、上記の細胞調製物を複数の腫瘍 由来抗原と接触させることによって形成される。その後、ワクチンを当業者に知 られる方法に従って被験者に投与する。 本発明のこれらの及び他の側面、並びに、多様な利点および有用性は、好まし い態様中の詳細な説明を参酌することにより、および添付する図面中に、さらに 明らかであろう。 図面の簡単な説明 図１は、トリパンブルー排除により決定した、ＲＭＡ細胞の生存に対する８− ＭＯＰおよびＵＶＡの影響を示す。 図２は、実験の複合セットとして１００ｎｇ／ｍｌの８−ＭＯＰおよび１Ｊ／ ｃｍ²のＵＶＡで処理したＲＭＡ細胞上のＤ^bクラスＩＭＨＣ分子の増強の時間経 過を示す。 発明の詳細な説明 内部固形腫瘍癌を有する被験者を処置するための放射線治療の有効性を改善す るための方法が提供される。本方法は、２つの治療方法、即ち：内部固形腫瘍癌 の処置のためのＸ線照射と、免疫系を腫瘍特異的抗原を特異的に認識するように 刺激するための方法とを共働的に組み合わせたものである。腫瘍特異的抗原は照 射後に固形腫瘍から放出される。特異的免疫応答は、腫瘍由来抗原を含む細胞ワ クチン（以下に記載する）の投与により仲介される。最も簡単な形態では、細胞 ワクチンは、複数の光不活性化白血球と混合した複数の腫瘍由来抗原を含む有効 量の混合物を含む。当該混合物は、薬学的に許容できる担体中に含有される。 内部固形腫瘍を有する被験者を処置するための放射線の有効性を改善するため の好ましい方法には、腫瘍由来抗原をｉｎ ｖｉｖｏで放出するように内部固形 腫瘍を照射すること、複数の腫瘍由来抗原を単離すること、および単離された抗 原を光不活性化された白血球調製物と接触させて細胞ワクチンを形成することが 含まれる。最も好ましい態様では、光不活性化された白血球調製物は、白血球調 製物を光活性化剤の存在下で紫外線Ａ放射（ＵＶＡ）または可視光で照射するこ とによって、即ち、白血球調製物をフォトフェレシスに付することによって形成 される。可視光の存在下でソラレン類を活性化するための条件は、１９９３年２ 月４日に出願された米国特許出願第０８，０１３，８３１号に開示されており、 その特許出願の全内容が参考文献として本明細書中に取り込まれる。細胞ワクチ ンは、固形腫瘍由来抗原と光不活性化した白血球調製物とを、腫瘍由来抗原を抗 原提示細胞のからのクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子中に積 み込むための条件下で混合することによって形成される。一般に、そのような条 件には、約２２℃から約３０℃の間の温度で細胞を混合してからのクラスＩまた はクラスＩＩ分子の安定性を高めることが含まれる。抗原をからのクラスＩ主要 組織適合性複合体分子中に積み込むための例示的条件は実施例３中に開示されて いる。 上記の米国特許出願第０８／０１３，８３１号に記載されているように、ソラ レンの存在下でのＵＶＡ光による光不活性化以外の方法は、からのクラスＩおよ び／またはからのクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の増強された発現を有す る細胞の調製物を調製するのに有用である。例示的な代替方法には、紫外線Ｂ（ ＵＶＢ）照射、細胞を化学療法剤（単数または複数）および／またはサイトカイ ン（単数または複数）、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と接触させること、細胞 を約２２℃から約３０℃の範囲内の温度に露出すること、細胞を低張または高張 生理食塩溶液または組織培養培地に露出すること、および細胞を静水圧に露出す ることが含まれる。 からのクラスＩ分子は、生理的温度で熱力学的に不安定である。従って、生理 的温度より低い温度への細胞調製物の露出は、「からの」分子を安定化すること によってからの主要組織適合性複合体クラスＩ分子の「増強された発現」をもた らすと考えられる。本明細書中で使用する場合、「増強された発現」という用語 は、からの主要組織適合性複合体分子を、対応する天然由来の抗原提示細胞の表 面上に存在すると考えられるものより実質的に多く、その細胞表面上に有してい る細胞のことを言う。 細胞ワクチンは、当技術分野で知られる任意の適切な投与様式に従って、例え ば、患者の血液流または免疫系中への注入により、被験者に投与される。皮内注 射は好ましい投与方法である。しかしながら、皮下注射、筋肉内注射および／ま たは、腫瘍由来抗原が被験者の細胞免疫系に露出するような、即ち、細胞免疫系 を含む細胞が腫瘍由来抗原の存在を認識し、それに反応できるように、細胞ワク チンを貯蔵器中に蓄積するための任意の他の様式を使用することができる。従っ て、細胞ワクチンはさらに、選択された投与様式のために適した薬学的に許容で きる担体を含む。薬学的に許容できる担体は、当技術分野で知られており、例え ば、血液系への注射による投与のために意図されるワクチンに関しては、通常の 生理食塩水が挙げられる。 好ましい態様では、被験者は、Ｘ線照射治療を受け入れ可能な内部固形腫瘍を 有する人間である。本明細書で使用する場合、固形腫瘍に関する「Ｘ線照射治療 を受け入れ可能な」という語句は、腫瘍由来抗原をｉｎ ｖｉｖｏで放出するの に十分な損傷である細胞損傷を照射に応答して受けやすい腫瘍細胞を少なくとも 多少は含む腫瘍を意味する。 「照射」という用語は本明細書で使用する場合、その通常の意味を有し、Ｘ線 照射が体内を貫通して、腫瘍特異的抗原のｉｎ ｖｉｖｏでの放出を誘導するこ とができるのに十分なエネルギーを有しているという程度に限定されるに過ぎな い。特定の型の腫瘍を損傷するための最適照射強度は当業者に知られている。一 般に、内部固形腫瘍を処置するために当技術分野で許容され得る放射線の任意の 形態または強度が、本発明の目的のためにｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍由来抗原を放出 するのに有用である。 放射線はＲＡＤＳで測定され、Ｘ線照射の典型的投与量は腫瘍照射治療のため には約１０００から約４０００ＲＡＤＳの間である。本発明のための放射線投与 量の範囲は、約１００から約６０００ＲＡＤＳの範囲内である。腫瘍（通常の放 射線治療の対象物）を破壊するのに必要とされるよりも、腫瘍を損傷して腫瘍由 来抗原のｉｎ ｖｉｖｏでの放出を誘導するのに必要な放射線の方が少ないため に、本発明はより低い投与量での放射線の使用を可能にし、それにより、高投与 量のＸ線照射に付随する有毒な副作用を回避することができる。典型的には、放 射線は数週間に渡って分画した投与量で投与され、処置あたり３００ＲＡＤＳ以 下が投与される。 本発明の組み合わせ治療は、被験者の免疫系の協力を得て、内部の腫瘍を特異 的に標的にし、それを破壊するので、組み合わせ治療を受け入れる被験者が反応 力のある（competent）免疫系を有していることが好ましい。一般に、特定の被 験者の免疫反応性（immunocompetence）は、被験者から採取した血液試料中のＣ Ｄ８陽性Ｔ細胞の量を測定することにより決定される。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の通常 の絶対値付近を有する被験者は、本発明の目的のためには免疫反応性であると考 えられる。一般に、少なくとも約１００ＣＤ８細胞／１００ｍｌ血液であるＣＤ ８値を有する被験者は免疫反応性であると考えられる。 ”内部固形腫瘍”相は外皮、すなわち、非皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、新生物と称 する。特定の治療または組み合わせ療法が上記新生物の進行を留保するのに有効 であるか否かは当業者に公知の基準によって決定される。たとえば、効力は、腫 瘍生育の速度の変化（たとえば、時間当たりの腫瘍の大きさの変化速度によって 証明される生育速度の安定または低下）を観察すること、および／または病状の 進行の緩化（たとえば、疾患関連症状の時間当たりの低下）を観察することによ って示せる。そのような基準は固形腫瘍が放射線療法に適しているか否かを決定 するのに有用であり、本発明の方法および／または組成物が患者を治療ための放 射線療法の効果を改善するか否か決定するのにも有用である。本発明の方法およ び組成物による治療に適する固形腫瘍の悪性度は上述のように例示され列挙され ている。 Ｘ−線は細胞損傷または細胞死を誘発し無数のオリゴペプチド、蛋白質および ／または他の細胞成分が照射された細胞からインビボ放出する。これらの以前不 動の（すなわち、固形腫瘍に関連して）細胞成分がリンパおよび／または血液系 に入り、これら成分は当分野で周知の方法によってそこから単離できる。ここで 使用された、”単離”なる用語は、天然環境から取り出されるに調製物（たとえ ば、腫瘍由来抗原の回収物または白血球調製物）をいう。このように、たとえば 、患者から採取した血液試料は、たとえ該血液試料が該患者に後で再注入される 連続的流れの一部であるとしても、ここでは”単離”されるという。 ”腫瘍由来抗原”は集約的に照射後固形腫瘍から放出される成分をいう。腫瘍 由来抗原は本発明の方法および組成物によって使用される前に精製されるか濃縮 される。しかし、単離された調製物の腫瘍由来抗原の濃度は貯蔵前に濃厚化され て保存中の抗原の安定性を高める。”濃厚化”とは腫瘍由来抗原が患者から単離 されたときよりも高い濃度で存在することを意味する。一般的に、高い濃度の抗 原は処理された抗原が存在する細胞と混合するとき、動力学的に腫瘍由来抗原を 該処理された抗原が存在する細胞の空のクラスＩまたは空のクラスＩＩ主要組織 適合性複合体分子に負荷するのに有利であるので腫瘍由来抗原の濃厚化調製物は 好ましい。 抗原保存条件は当業者には公知であって、たとえば、プロテアーゼ阻害剤のよ うな蛋白質安定化剤および／またはペプチドおよび／または蛋白質抗原の天然立 体配座安定化剤（たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））の存在下に低温 （たとえば、−７０℃で）で保存することを含む。そのような薬剤は当業者には 公知であって、たとえば、グリセリン、蔗糖および尿素である。 細胞ワクチンは腫瘍由来抗原を、”変性”（たとえばフォトインキュベートさ せる）させて該腫瘍由来抗原と細胞調製物中に含まれる細胞との相互作用（たと えば、結合）を強化しておいた細胞調製物と接触させることによって調製される 。ここでは、用語”細胞調製物”とは抗原提供細胞の調製物をいう。抗原提供細 胞は、主要組織適合性複合体と結合したときに抗原を認識できる免疫系の他の細 胞に抗原を提供できる１群の細胞である。抗原提供細胞は、白血球（たとえば、 単球、マクロファージ、およびＴ細胞およびＢ細胞のようなリンパ球）のような 多様な細胞タイプ、ならびに、本明細書において参考文献としてその内容が記載 されている米国特許出願第０７／９７７，６７２号に記載された細胞のような合 成（”人工”）細胞である。これらの多様な細胞タイプは、抗原を特異的Ｔ細胞 受容体によって認識される形で提供する能力を共通して有している。好適抗原提 供細胞は白血球、より好ましくは単球またはＢ細胞である。白血球調製物はたと えば血液、リンパ液、骨髄、リンパ器官組織または組織培養液から単離される。 任意に、該単球またはＢ細胞はインビトロで培養してインビトロで細胞ワクチン を形成できる細胞の数を拡大する。 上記で検討したように、各Ｔリンパ球クローン、たとえばＴ−ヘルパー細胞ク ローンまたは細胞毒性Ｔ細胞クローンは、該抗原提供細胞の表面で主要組織適合 性複合体分子と結合したときのみ抗原を認識する異なる表面受容体を発現する。 一般的に、用語”主要組織適合性複合体分子”は、抗原と結合して抗原結合抗原 提供細胞を形成する抗原提供細胞上の分子をいう。抗原結合提供細胞のＴ細胞に よる認識はＴ細胞表面受容体によって仲介されている。好適具体例において、主 要組織適合性複合体分子はクラスＩまたはクラスＩＩ分子である。細胞毒性Ｔ細 胞は抗原が主要組織適合性複合体クラスＩ分子と結合されたとき抗原を結合する 。これらのＴ細胞タイプの各々は腫瘍に対する患者の免疫応答を仲介する機能す る。 クラスＩ分子は重鎖および非共有結合されたβ−２−マイクログロブリン分子 から構成され、腫瘍から誘導された抗原を受容するための中裂または凹部を有す る。したがって、好適な腫瘍由来抗原は抗原がクラスＩ分子に入るのを可能にす る寸法および嵩を有する。（たとえば、クラスＩ分子の中裂の嵩についてはＦ． Ｌａｔｒｏｎ，”Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓ ｅｒｖｅｄ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｒｅｆｔ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ ２ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｎａｐｅｐｔｉ ｄｅ ｔｏ Ｔ−ｃｅｌｌｓ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６４−９６７（ １９９２）参照）腫瘍由来抗原は実質的に凹部内に適合するが、クラスＩ分子と 結合すると上記抗原を認識できるＴ細胞にまだなお近づき易い。よって、好適具 体例においては、腫瘍由来抗原は約８ないし約１６個のアミノ酸を有するペプチ ドである。最も好適な具体例では、腫瘍由来抗原は、８ないし１０個のアミノ酸 を有し、そのうち２つのアミノ酸が該ペプチドを中裂に保持する疎水性残基であ るペプチドである。腫瘍由来抗原とクラスＩ分子との結合は、空のクラスＩ分子 と満たされたクラスＩ分子とを区別できるスクリーニングアッセイを使用して測 定される。スクリーニングアッセイの例示は実施例３に開示してある。 腫瘍由来抗原と抗原提供細胞の腫瘍組織適合性分子との結合は腫瘍に対する細 胞性免疫応答を誘発するために必須である。したがって、空の主要組織適合性分 子を抗原提供細胞の表面上での発現を増強させるための種々の方法がここに開示 されている。 空の主要組織適合性分子の発現を増強させるための好適方法はフォトフェレー シスである。フォトフェレーシスの工程は米国特許第５，１４７，２８９号（” Ｅｄｅｌｓｏｎ’２８９”）および第４，８３８，８５２号（”Ｅｄｅｌｓｏｎ ’８５２”）に記載され、それらの全内容がここに参考として記載されている。 フォトフェレーシスはＥｄｅｌｓｏｎ’２８９に記載のように連続的流れで行わ れるか、あるいはバッチで達成できる。上記調製物をフォトフェレーシスにさら すと、細胞内抗原を主要組織適合性複合体分子によって限定された凹部にあては まる形へ処理することに対応する、細胞の代謝路を破壊すると信じられているの で、満たされていない（すなわち”空の”）多数の主要組織適合性複合体分子を それらの表面に有する抗原提供細胞を得た。これらのフォトインキュベートされ た細胞は上記必須の寸法と荷電特性を有する腫瘍由来抗原を結合する。一旦結合 すると、腫瘍由来抗原結合抗原提供細胞は患者に細胞ワクチンの形で投与される 。 光活性化剤がプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）（下記）である場合、光活性化 のための照射が紫外線Ａ照射または約４２０ｎｍを越える波長の可視光線である （Ｇａｓｐａｒｒｏ，Ｆ．，ら”Ｔｈｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ８−ｍ ｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｌｉｇｈt，Ｒ ｅｖｅｒｓｅｄ Ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍ ｏｎｏａｄｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｓ”、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７：１００７−１０１０（ １９９３））。 空の主要組織適合性複合体分子の発現を増強するさらにもう１つの方法は、細 胞調製物をサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）と接触させることである。サイト カインとは上記文献でリンフォカイン、モノカイン、インターロイキン、インタ ーフェロンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ 第７版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ，英国オックスフォード，１１４０−１５０頁（１９９１））とし て言及された分子を意味し、たとえば、ガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子 アルファおよび顆粒球単球コロニー刺激因子ならびにインターロイキン族の分子 である。サイトカインは主要組織適合性複合体分子のいくつかの抗原提供細胞、 たとえば、単球またはＢ細胞での発現を増強する。 たとえば、フォトフェレーシスまたはサイトカインにさらすことによって変性 された上記抗原提供細胞を、細胞ワクチン形成条件下に腫瘍由来抗原と接触させ る。ここで使用されたように、”細胞ワクチン”なる用語は、患者に導入された とき細胞ワクチンに存在する成分（たとえば腫瘍由来抗原）に特異的な細胞性免 疫化学的複合体応答を生じる細胞の調製物をいう。”ワクチン”なる用語は、患 者の総白血球の小部分のみが処理されるが、ワクチンの注入後照射された腫瘍に ついての非常に大きな治療効果が得られるので本明細書で使用される。 好ましい態様においては、細胞性ワクチンは患者に投与する前に保存する。好 ましくは、ワクチンは、固形腫瘍に対する患者の細胞性免疫応答をブーストする のに十分な量の腫瘍由来抗原関連抗原提示細胞を含むアリコート中に保存する。 患者の免疫応答をブーストするのに必要なワクチンの量の決定は、当業者の技術 の範囲内である。好ましくは、最少約１０，０００個から最大約２００×１０⁶ 個の範囲の量の抗原提示細胞が、患者の免疫応答をブーストするのに十分である 。用いられる細胞の量は、部分的には、抗原提示細胞が有効である（例えばＢ細 胞または単球）かまたは有効でない（例えばＴ細胞）かに依存するであろう。 細胞性ワクチンの抗原および細胞性成分は、その対応する天然のものとは幾つ かの点において相違する。本発明の抗原関連抗原提示細胞は、比較的均一な細胞 集団を表す。これは、第１には、腫瘍由来抗原が、抗原提示細胞の表面上の主要 組織適合抗原複合体分子と会合する前に、抗原提示細胞によりそれ以上プロセシ ングされないためである。第２には、本発明の抗原提示細胞は、任意に細胞１個 あたり高い濃度の主要組織適合抗原複合体分子を有するためである。さらに、医 薬組成物は、抗原と主要組織適合抗原複合体分子との会合を容易にするために、 任意にβ−２ミクログロブリンを含む。調製物中のβ−２ミクログロブリンの濃 度は、インビボで見いだされるであろう濃度より高い。腫瘍由来抗原と主要組織 適合抗原複合体分子との会合を増大させるために必要なβ−２ミクログロブリン の濃度の選択は、当業者の技術の範囲内である。一般に、β−２ミクログロブリ ンのインビボ濃度は、約０．２から約１００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは 約２．０から約１０μｇ／ｍｌである（Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（ＵＳＡ）８７：７５１７−７５２１（１９９０ ））。 細胞性ワクチンは、免疫系を刺激してレシピエント患者の腫瘍を特異的に認識 し、このことにより患者の治療のための放射線照射療法の有効性を改良する。細 胞性調製物は典型的には白血球含有調製物であるが、他のタイプの抗原提示細胞 も本発明の範囲に含まれると見なされる。したがって、光不活性化白血球調製物 の「機能的均等物」との用語は、調製物中に存在する細胞の表面における空の（ ｅｍｐｔｙ）主要組織適合抗原複合体分子の発現を増強するために、光化学的 （例えばフォトフェレーシス）または非光化学的（例えば細胞を低い温度にさら すこと）方法による処理を施されている抗原提示細胞含有調製物を意味する。 照射段階は光活性化可能な薬剤の存在下に起こる。からの（ｅｍｐｔｙ）主要 組織適合遺伝子複合体分子の発現を誘導する別の方法（上述した）が使用できる 。光活性化可能な薬剤は、白血球の重要な成分またはその他の抗原提示細胞への 親和性をもち、かつ該成分と結合したときに主要組織適合遺伝子複合体分子の発 現を増強および／または安定化する薬剤であれば何でもよい。光活性化可能な薬 剤の例としては、プソラレン、ポルフィリン、ピレン、フタロシアニン、光活性 化コルチゾン、抗原提示細胞と特異的に反応する光活性化抗体、ならびにポルフ ィリン分子と結合されたモノクローナル抗体がある。 プソラレンは好ましい光活性化可能な薬剤のクラスである。プソラレンとＴ細 胞のＤＮＡ、タンパク質および脂質成分との相互作用が記載されている（"T cel l Molecular Targets for Psoralens"，Annals of N.Y．Academy of Science 63 6:196-208 (1991), Malane，M. and Gasparro，F.）。経口投与すると、プソラ レンは消化管から吸収され、１〜４時間後に血液およびその他の組織中で最高濃 度に達し、経口投与後２４時間以内にほぼ全てが排泄される。これらの薬剤は体 外の細胞調製物に直接加えることもできる。プソラレン分子は紫外線または可視 光線照射に暴露する前には不活性であり、照射後、一時的に励起状態に活性化さ れる。これらの一時的に活性化された分子は生物学的分子（例えばＤＮＡ、タン パク質）を光修飾して別の反応種、例えば一重項酸素、を生じることができ、こ の別の反応種がさらに別の細胞成分を修飾することができる。マイトマイシンＣ やシス−プラチンなどのその他の薬剤は核酸鎖とクロスリンクすることによって ＤＮＡを損傷する。しかしながら、このような薬剤は患者の体内に戻すと活性状 態のままであり、従ってからの主要組織適合遺伝子複合体分子の発現を増強する ために細胞を変更するという点ではプソラレンほど好ましくはない。 好ましいプソラレンは、８−メトキシプソラレン（８−ＭＯＰ）、４’−アミ ノメチル−４，５’，８−トリメチル−プソラレン（ＡＭＴ）、５−メトキシプ ソラレン（５−ＭＯＰ）およびトリメチルプソラレン（ＴＭＰ）を含む。８−Ｍ ＯＰは抗癌剤、免疫系調節剤、および光活性化可能な薬剤を開発するためのひな 型でもある。ＡＭＴは８−ＭＯＰの合成かつ水溶性類似体である。８−ＭＯＰの その他の合成水溶性類似体はＢｅｒｇｅｒたち（"The Medical and Biological Effects of Light", Annals of N.Y．Academy of Science 453:80-90 (1985))に 記載されている。ある研究者は、５−ＭＯＰは乾癬治療という点では８−ＭＯＰ ほど有効ではない、と報告する（Calzavara-Pinton，et al.，Exptl．Dermatol ．1:46-51 (1992)）。ＴＭＰは白斑患者の治療に用いられており、皮膚の脱色部 分の再色素化をもたらす。 照射細胞において８−ＭＯＰ−ＤＮＡ光付加物を認識するモノクローナル抗体 は、最適の細胞光不活性化を達成するための紫外線または可視光線照射の最適量 を決定するのに使用することができる（Yang et al.，"8-M0P DNA Photoadducts in Patients Treated with 8-MOP and UVA"，J．Invest．Dermatol．92:59-63( 1989)参照）。 本明細書に記載した、参考文献、患者及び患者適用例(patient application) の各々は、本明細書に援用される。上記が好ましいある一定の実施態様の詳細な 説明に過ぎないことを理解すべきである。それ故、本発明の要旨から逸脱せずに 種々な改良及び同等物(equivalent)を実施しうることは当然、当業者に明らかで ある。 実施例 実施例１．皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）と診断された３患者の症例研究： 腫瘍期の皮膚Ｔ細胞リンパ腫が、患者の生残と長い無症状期間とに関して、通 常の化学療法及び全身電子ビーム（ＴＢＥＢ）放射線療法に対して無反応性であ ることは周知である。一般に、直径３ｃｍより大きい腫瘍を２個以上有するＣＴ ＣＬ患者のメジアン生残時間は１８か月間である。 ３症例研究を以下に述べる。各研究において、ＣＴＣＬ患者を全身電子ビーム （ＴＢＥＢ）放射線及びフォトフェレシス(photopheresis)療法によって治療し た。治療後に、各患者を皮膚腫瘍に関して毎月検査し、各患者に定期的な皮膚バ イオプシーと規則的なＣＡＴスキャンとを実施して、内部リンパ種が発生したか どうかを判定した。疾患の予想された進行に反して、以下に述べるＣＴＣＬ患者 の各々は皮膚腫瘍の無い状態であった。 （ａ）患者Ｍ．Ｋ． 患者プロフィルと診断： 患者Ｍ．Ｋ．６８歳、白人男性、酪農家；約１年間 にわたって成長した、広範囲な皮膚腫瘍を有して、１９９０年２月に来訪。皮膚 バイオプシーを実施し、ＣＴＣＬと診断；ＣＡＴスキャンは明白な内部リンパ腫 の存在を否定。 治療法： Ｍ．Ｋ．に全体で３６００ＲＡＤの全身電子ビーム（ＴＢＥＢ）放 射線を１８回治療の２グループ（すなわち、１００ＲＡＤ／治療）で９週間の期 間にわたって実施。ＴＢＥＢ放射線療法の大体中途で、Ｍ．Ｋ．にフォトフェレ シス療法（続けて２日間）を初めて実施。Ｍ．Ｋ．に毎月、連続２日間のフォト フェレシス療法の実施を続ける。 患者評価： 治療以来、Ｍ．Ｋ．は皮膚腫瘍の無い状態であった。 （ｂ）患者Ｃ．Ｑ． 患者プロフィルと診断： 患者Ｃ．Ｑ．６４歳、白人男性、行政官；広範囲な 、大きい皮膚腫瘍（すなわち、３ｃｍを越える直径を有する腫瘍）を有して、１ ９８６年に来訪。皮膚バイオプシーを実施し、ＣＴＣＬと診断；ＣＡＴスキャン は明白な内部リンパ腫の存在を否定。 治療法： Ｃ．Ｑ．に全体で３６００ＲＡＤの全身電子ビーム（ＴＢＥＢ）放 射線を３６回治療（すなわち、１００ＲＡＤ／治療、４回治療／週）で９週間の 期間にわたって照射。ＴＢＥＢ放射線療法の大体中途で、Ｃ．Ｑ．に彼の初めて のフォトフェレシス療法を連続２日間実施。Ｃ．Ｑ．に毎月、連続２日間のフォ トフェレシス療法の実施を１９９２年まで続けて、１９９２年にフォトフェレシ ス療法を中断した。 患者評価： 治療以来（７年間）、Ｃ．Ｑ．は皮膚腫瘍の無い状態であった。 （ｃ）患者Ｃ．Ｄ． 患者プロフィルと診断： 患者Ｃ．Ｄ．４８歳、白人男性、行政官；右腿の非 常に大きい（すなわち、７ｃｍを越える直径を有する）潰瘍化腫瘍を含めて、５ ０個を越える腫瘍を有して、１９８８年に来訪。皮膚バイオプシーを実施し、Ｃ ＴＣＬと診断；ＣＡＴスキャンは明白な内部リンパ腫の存在を否定。 治療法： Ｃ．Ｄ．に全体で３６００ＲＡＤの全身電子ビーム（ＴＢＥＢ）放 射線を３６回治療（すなわち、１００ＲＡＤ／治療、４回治療／週）で９週間の 期間にわたって照射。ＴＢＥＢ放射線療法の大体中途で、Ｃ．Ｄ．に彼の初めて のフォトフェレシス療法を連続２日間実施。Ｃ．Ｄ．に毎月、連続２日間のフォ 卜フェレシス療法の実施を続ける。 患者評価： 治療以来、Ｃ．Ｄ．は皮膚腫瘍の無い状態であった。 実施例２．転移性結腸癌と診断された患者の症例研究： 患者プロフィルと診断： 患者Ｓ．Ｃ．７８歳、白人男性；重度な湿性咳（明 赤色の血液を喀血）を有して来訪、転移性結腸癌と、肺及び肝臓の病巣とを有す ると診断。ブロンコスコピー(bronchoscopy)による肺病巣のバイオプシーは、患 者の右肺の大部分が結腸癌であることを実証。 治療法：Ｓ．Ｃ．を最初、５０−フルオロウラシル化学療法によって治療した が、反応を得ることはできなかった。続いて、Ｓ．Ｃ．に肺病巣に対して全体で ３０００ＲＡＤのＸ線照射をそれぞれ３００ＲＡＤ線量の１０回にわけて１２日 間にわたって実施した。Ｘ線照射療法の大体中途で、Ｓ．Ｃ．に彼の初めてのフ ォトフェレシス療法を連続２日間実施。毎月、連続２日間のフォトフェレシス療 法を４か月間続けた。 患者評価： ４か月間のフォトフェレシス療法の終了時に、肝臓転移はまだ存 在したが（ＣＡＴスキャンによって判定）、肺病巣はもはや見られなかった。定 期的なＣＡＴスキャンによると、最初のＸ線照射／フォトフェレシス治療後の約 ３年目の患者の死亡まで、肺は腫瘍の無い状態であった。 実施例３．細胞表面におけるエンプティＭＨＣクラス１分子の８−ＭＯＰ／ＵＶ Ａ誘導：エンプティＭＨＣクラス１分子と外因性ペプチドとの会合 実験設計 ： 概観： ＲＭＡ細胞（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ等，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７６ 〜４８０（１９９０））を、８−ＭＯＰ／ＵＶＡによる処置後のエンプティクラ ス１発現に関してサイトフルオメトリー(cytofluometry)によって分析して、８ −ＭＯＰ／ＵＶＡがペプチド会合ＭＨＣクラス１錯体の細胞表面への輸送に関係 しない(uncouple)かどうかを判定した。光処理した(phototreated)細胞を、エン プティクラス１ＭＨＣの出現を特に促進する温度（約２８℃）に暴露させた。光 不活化(photoinactivation)後に、それぞれがＭＨＣ分子と結合して、これを安 定化することが知られている２種類のペプチド（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１と２）（ ２種類の特異的インフルエンザ核タンパク質フラグメント）のいずれかを加える ことによって、エンプティクラス１分子を定量した。処理済み細胞が、クラス１ と結合するオリゴペプチドを放出するかどうかを判定するために、エンプティク ラス１分子を処理後に最初に定量した。 細胞． 数個のみのエンプティクラス１分子とＲＭＡ−Ｓ細胞とを含むネズミ ＲＭＡ細胞、エンプティクラス１分子が室温においては安定であるが、体温にお いては不安定であることが判明している突然変異細胞ライン、Ｐ．Ｃｒｅｓｓｗ ｅｌｌ（Ｙａｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）によって提供。 ８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処理． 光処理に対するこれらの細胞の比感受性(specifi c sensitivity)を評価するために、ＰＢＳ中に懸濁したＲＭＡ細胞を８−ＭＯＰ の治療量（２０〜２００ｎｇ／ｍｌ）とＵＶＡ（１〜１０Ｊ／ｃｍ²）とに暴露 させた。処理直後に、生残率(viability)をトリパンブルー排除(tripan blue ex clusion)によって評価した。 免疫化学薬品． クラス１ＭＨＣに対して特異反応性を有するモノクローナル 抗体（Ｋ^b，Ｙ３ネズミハイブリドーマＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ１７６及びＤ⁶，２ ８１４８ＳネズミハイブリドーマＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ２７）はＡＴＣＣ（メリ ーランド州，ロックヴィル）から入手した。インフルエンザウイルス核タンパク 質オリゴペプチド（ＮＰ３６５−３８０及びＮＰ３４５−３６０）はＫｅｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒにおいて製造した。Ｋ^b結合１６ｍｅｒ（配列Ｓ ＦＩＲＧＴＫＶＳＰＲＧＫＬＳＴを有する配列番号：２）と、Ｄ^b最適結合９ｍ ｅｒ（配列ＡＥＮＥＮＭＥＴＭを有する配列番号：１）とをＰＢＳ中のＩＭＤＭ （Ｉｓｃｏｖｅの改良ダルベッコ培地，ＧＩＢＣＯ，ニューヨーク州，グランド アイランド）培地中に５０μＭで溶解し、４℃において貯蔵した。 ＭＨＣクラス１分子のＦＡＣＳ分析．クラス１ ＭＨＣ分子の発現に対する陽 性対照としてＲＭＡ−Ｓ細胞を用いた。１％ペン−ストレップ(pen-strep)抗体 （ＧＩＢＣＯ）を補助した、５％ＩＭＤＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で 細胞を培養した。インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ₂）から細胞を取り出 し、締め付けキャップを有する組織フラスコ中で培養した（１０⁶／ｍｌ）。ク ラス１分子の熱不安定性／安定性を判定するために、細胞を調節可能な水浴中で 所定温度において４８時間インキュベートした。サイトフルオロメトリー分析の ために、２ｘ１０⁶⁶細胞を氷上で１０％ヒトＡＢ型血清（ＧＩＢＣＯ）と共にイ ンキュベートし、次に、抗クラス１モノクローナル抗体組織培養上澄み液０．１ ５ｍｌと共に氷上で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、次に、フ ルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウス免疫グロブリ ン（Ｓｉｇｍａ，ミズリー州，セントルイス）０．１５ｍｌと共に氷上で３０分 間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド中で固定し、 ＦＡＣＳセルソーターにおいて分析した。クラス１ＭＨＣ分子を安定化するため に、インフルエンザ核タンパク質フラグメント（配列番号：１又は２）を加えた （５０μＭ）。結果 図１は、ＲＭＡ細胞の生存に対する８−ＭＯＰ（１０−３００ｎｇ／ｍｌ）お よびＵＶＡ（１Ｊ／ｃｍ²）（トリパンブルー排除によって決定した）の影響を 示す。８−ＭＯＰまたはＵＶＡに暴露されなかった細胞の生存率は、図において ”Ｔｘなし”（即ち処理なし）として示されている。ＵＶＡに暴露されたが８− ＭＯＰには暴露されなかった細胞の生存率は、図において”１Ｊ／ｃｍ”と示さ れている。１Ｊ／ｃｍ²との組み合わせにおいて使用される８−ＭＯＰの用量が 増加するにつれて、細胞破壊が用量依存性増加が観察される。増加する用量は図 において示される（即ち、１０、３０、１００および３００という値は、８−Ｍ ＯＰの濃度をｎｇ／ｍｌ単位で示したものである）。 ８−ＭＯＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＵＶＡ（１Ｊ／ｃｍ²）のクラスＩ発 現並びに特異的オリゴヌクレオチド（配列番号１）のＲＭＡクラスＩ分子への結 合に対する影響を調べた。図２は、１００ｎｇ／ｍｌ ８−ＭＯＰおよび１Ｊ／ ｃｍ²ＵＶＡで処理したＲＭＡ細胞上のＤ^bクラスＩＭＨＣ分子の増強の時間経過 を示す混成セット実験を表す。このシリーズの実験では、８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処 理細胞をＵＶＡのみ（１Ｊ／ｃｍ²）に暴露した細胞と比較した。 Ｄ^bクラスＩ分子に特異的なＡＴＣＣ抗体を使用してクラスＩ発現の量を測定 するためにＦＡＣＳ分析を使用した。平均チャンネル蛍光の変化（△％ ＭＣＦ ）を、クラスＩオリゴヌクレオチド（配列番号：２、即ちＡＥＮＥＮＭＥＴＭ） と一緒におよび伴わずにインキュベートした細胞のシグナルの差異を用いること によって計算した。図２は、最適シグナル（即ち、クラスＩ発現の最大増加）が ８−ＭＯＰ／ＵＶＡ処理１０時間以内に観察されたことを示す。未処理対照細胞 の別のセット（図において”Ｔｘなし”と表されている）も分析した。クラスＩ 発現の最適時間は、より詳細な動的実験を行うことによって、例えば、８−ＭＯ Ｐ／ＵＶＡ処理に続くより頻繁な間隔でおよびいくつかの異なる温度条件下で細 胞を分析することによって決定することができる。 抗体は、上述したＦＡＣＳ方法の使用によって、空の（ｅｍｐｔｙ）クラスＩ 分子と会合する活性について選択される。従って、ＦＡＣＳ分析は、空のクラス Ｉ分子発現を誘導するための最適条件を選択するためのスクリーニングプロトコ ールとして、並びに空のクラスＩ分子に結合して安定化できる抗体を選択するた めのスクリーニングプロトコールとして役立つ。このように、様々のペプチドな らびにそれぞれについての最適濃度を、空のクラスＩ分子を安定化する活性につ いてスクリーニングした。 上述した特許および文献はそれぞれ参考文献として本明細書中に取り込まれる 。以上は、好ましいある態様の詳細な説明にすぎないことを理解すべきである。 従って、発明の思想および範囲から逸脱せずに様々な修飾および同等物が得られ ることは当業者にとって明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(a) 内部固形腫瘍に照射して、腫瘍由来抗原を放出させ； (b) 複数の腫瘍由来抗原を単離し； (c) 白血球調製物を、光活性化可能な物質の存在下で照射して、光不活性 化白血球調製物を生ぜしめ； (d) 前記複数の腫瘍由来抗原を、前記光不活性化白血球調製物と、細胞ワ クチンを生じる条件下で接触させ；そして (e) 前記患者に前記細胞ワクチンを投与することよりなる； 内部固形腫瘍の患者を治療するための放射線療法の効果を向上させる方法。 ２．ワクチンを、Ｘ線照射療法が可能な内部固形腫瘍の患者に投与する、請求 項１記載の方法。 ３．内部固形腫瘍が、肺、胸部、卵巣、子宮、前立腺、睾丸、肝臓、膵臓、胃 、咽頭の鱗状細胞癌腫、線維肉腫、腎臓、膀胱、脳、脊髄、悪性メラノーマおよ び皮膚の転移性鱗状細胞癌腫からなる群から選択される癌に関連するものである 、請求項２記載の方法。 ４．ワクチンが、コンピタントな免疫システムを有する患者に投与される、請 求項１記載の方法。 ５．ワクチンが、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の絶対レベルがほぼ正常な患者に投与され る、請求項４記載の方法。 ６．内部固形腫瘍への照射が、全照射量１００ないし約６００ラドで腫瘍に照 射して行われる、請求項１記載の方法。 ７．複数の腫瘍由来抗原の単離が、全血からの単離である、請求項１記載の方 法。 ８．腫瘍由来抗原の濃度が豊富化された抗原調製物を調製する工程をさらに含 む、請求項１記載の方法。 ９．照射した白血球調製物と接触させる前に、複数の腫瘍由来抗原を貯蔵する 工程をさらに含む請求項１記載の方法。 １０．白血球調製物が、患者から単離される、請求項１記載の方法。 １１．白血球調製物が複数のリンパ球を含む、請求項１０記載の方法。 １２．リンパ球調製物が複数の単球またはＢ細胞を含む、請求項１０記載の方 法。 １３．前記調製物を照射に暴露する前に、単球またはＢ細胞を培養する工程を さらに含む、請求項１２記載の方法。 １４．白血球調製物を、血液、リンパ液、骨髄、リンパ系器官の組織および組 織培養液からなる群から選択される供給源から単離される、請求項１１記載の方 法。 １５．白血球調製物の照射への暴露が、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）の存在 下で行われる、請求項１記載の方法。 １６．ソラレンが、８−メトキシソラレン、アミノメチルトリメチルソラレン 、５−メトキシソラレンおよびトリメチルソラレンからなる群から選択される、 請求項１５記載の方法。 １７．ソラレンが、８−メトキシソラレンである、請求項１６記載の方法。 １８．白血球調製物の照射への暴露が、該調製物をウルトラバイオレットＡ照 射または可視光線に暴露することよりなる、請求項１５記載の方法。 １９．白血球調製物を、約４２０nmより大きい波長の可視光線に曝露する、請 求項１８記載の方法。 ２０．複数の腫瘍由来抗原と光不活性化白血球調製物との接触を、約２２℃な いし約３０℃の温度で行う、請求項１記載の方法。 ２１．細胞ワクチンを、患者への投与の前に貯蔵する工程をさらに含む、請求 項１記載の方法。 ２２．細胞ワクチンの投与が、患者の血流中へ注射することよりなる、請求項 １記載の方法。 ２３．細胞ワクチンの投与が、皮内注射することよりなる、請求項１記載の方 法。 ２４．(a) 固形腫瘍由来の複数の抗原を単離し； (b) 白血球調製物を光活性化可能な物質の存在下に照射して、光不活性 化された白血球調製物を生ぜしめ；そして (c) 前記腫瘍由来の複数の抗原を、前記光不活性化白血球調製品と、細 胞ワクチンを生ぜしめる条件下で接触させることよりなる； 内部固形腫瘍の患者に投与するための細胞ワクチンの製造方法。 ２５．(1) 光不活性化した複数の白血球と混合された固形腫瘍由来の複数の抗 原を含む混合物の有効量；および (2) 薬学的に許容される担体を含有してなる； 内部固形腫瘍の患者を治療する照射療法の効果を向上させる細胞ワクチン。 ２６．白血球が単球またはＢ細胞である、請求項２５記載のワクチン。 ２７．(a) 固形腫瘍を照射して腫瘍由来抗原を放出させ； (b) 該腫瘍由来の複数の抗原を単離し； (c) 各々の抗原提示細胞が患者への投与に適する複数の抗原提示細胞を 含む細胞調製物を処理して、該細胞による主要組織適合性複合体分子の発現を向 上させ； (d) 前記複数の腫瘍由来抗原を、前記処理された細胞調製物と、複数の 抗原関連抗原提示細胞を生ぜしめる条件下で接触させ；そして (e) 該複数の抗原関連抗原提示細胞を患者に投与することよりなる、 内部固形腫瘍の患者の治療のための放射線療法の効果を向上させる方法。 ２８．細胞調製物の処理が、該調製物を約２２℃ないし３０℃の温度に付する ことよりなる、請求項２７記載の方法。 ２９．細胞調製物の処理が、該細胞調製物を光活性化可能な物質の存在下で照 射することよりなる、請求項２７記載の方法。 ３０．細胞調製物の処理が、主要組織適合性分子の発現を誘発することが知ら れている一種もしくはそれ以上のサイトカインと該細胞調製物とを接触させるこ とからなる、請求項２７記載の方法。 ３１．(a) 複数の腫瘍由来抗原をｉｎ ｖｉｖｏで放出させ； (b) 該複数の腫瘍由来抗原を単離し； (c) 白血球調製物を光活性化可能な物質の存在下で照射に暴露して、光 不活性化された白血球調製物を生ぜしめ； (d) 前記複数の腫瘍由来抗原を前記光不活性化白血球調製物と、細胞ワ クチンを生ぜしむる条件下で接触させ；そして (e) 該細胞ワクチンを患者に投与することよりなる； 内部固形腫瘍の患者の腫瘍特異的抗原に対する免疫システムの応答を向上させる 方法。 ３２．ｉｎ ｖｉｖｏにおける複数の腫瘍由来抗原の放出が、腫瘍を物理的に 操作すること、血管内化学剤灌流、フォトフリンおよびレーザー光での腫瘍の破 壊からなる群の放出方法から選択される、請求項３１記載の方法。