JPH09500715A - 乳房腫瘍における前立腺特異性抗原の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、乳癌の予後または予測インジケーターとしての女性の乳房腫瘍抽出物中における前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）の検出に関する。乳房腫瘍における前立腺特異性抗原は、初期疾患および若い女性に多く存在し生存率が高くなる。ＰＳＡは、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体を有する腫瘍に関連している。

Description

【発明の詳細な説明】 乳房腫瘍における前立腺特異性抗原の検出 発明の分野 本発明は、乳癌の予後または予測におけるインジケーターとして、女性の乳房 腫瘍抽出物中における前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）の検出に関する。乳房腫瘍中 の前立腺特異性抗原は、初期疾患および若い女性の患者で認められ、生存率も高 い。ＰＳＡは、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体を有する腫瘍 に関連している。 発明の背景 この健康管理の分野において、多数の研究および関係する診断が行われている 。従来の技術と方法をさらに発展させるために、雑誌掲載論文の表をこの明細書 の末尾に添付しており、以後はこの番号を引用する。 乳癌は、女性の死亡および疾患の最大の原因である（１〜４）。乳癌の研究に おいて優先される題目の一つは、診断、予後およびモニタリングに利用できる新 しい生化学マーカーの発見である（４、５）。乳癌は、ステロイドホルモンおよ びその受容体に依存する数種の癌の一種である。最近、治療法の予測および選択 の手段として、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体が日常的に分析されて いる（４〜６）。 乳房腫瘍の診断およびモニタリングにおける現在の インジケーターは、腫瘍の大きさ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体 、年齢、異数性、有糸分裂活性、およびＫｉ６７である（２９）。予後における これらの因子の有用性は、乳癌患者が積極的な治療を必要とするか、またはモニ タリングの必要があるか評価できることである。 ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異は、乳癌を含むヒトの癌において最もよく知 られている遺伝的欠陥であり、突然変異型タンパクが高濃度に蓄積する。ｐ５３ タンパク発現の過剰は、初期疾患再発の独立した予測因子であることが知られて いる（２９）。ｐ５３タンパクの蓄積は、生存期間短縮の独立したマーカーであ ることが知られている（３０）。突然変異型ｐ５３タンパクを生成しない大部分 の腫瘍は、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体陽性である（１４ ）。 前立腺癌は、男性の死亡および疾患の最大の原因である（７、８）。前立腺の 組織および癌もステロイドホルモンに依存し、この効能を利用する治療が日常的 に行われている（９〜１０）。前立腺癌の際立った特質の一つは、前立腺特異性 抗原（ＰＳＡ）である３０〜３３−ＫＤ糖タンパクが高濃度で血清内に現れるこ とである（１１）。ＰＳＡは、前立腺組織の上皮細胞から分泌され、前立腺癌の 診断およびモニタリングの ための腫瘍マーカーとして現在広く用いられている。 これまでの免疫組織化学の研究から、乳房腫瘍またはその他の腫瘍においてＰ ＳＡの免疫反応性がないこと（１７）、あるいはポリクローナル抗体と一緒では 時にＰＳＡの免疫活性があり、モノクローナル抗体ではないことが知られており 、交差反応性作用を示唆している（１８）。女性の血清におけるＰＳＡレベルは 、９０％の女性で検出できない。少数の女性が痕跡量のＰＳＡを有し、これは尿 道腺から生成されると考えられる。 我々は、意外にも乳房腫瘍中にＰＳＡが存在することを発見した。 発明の要旨 我々は、乳房腫瘍が予後インジケーターとして使用できるＰＳＡを生成する能 力があることを発見した。乳房腫瘍中のＰＳＡ生成は、エストロゲンおよび／ま たはプロゲステロン受容体の存在に関連しているが、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子タン パクの存在とは関連がない。ＰＳＡ陽性腫瘍は、若い女性および初期疾患状態に 関連している。ＰＳＡは、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体と関連があ り、病気の進行が抑制され、患者の生存率が高くなるので、予後の有用なインジ ケーターとなる。ＰＳＡ陽性腫瘍は、内分泌系処置、特にエストロゲン受容体− 陰性腫瘍に対して感受性が ある。 本発明の目的は、予後、診断またはモニタリングに有用な女性乳房腫瘍抽出物 中のＰＳＡの分析である。 本発明の利点は、他の乳房腫瘍患者とは異なる予後を必要とする患者群をＰＳ Ａ分析により決定できることである。 本発明の一つの実施例によると、乳房腫瘍の予後に役立つ乳房腫瘍抽出物中の ＰＳＡを検出する方法は、 ａ）女性から乳房腫瘍抽出物を入手し、 ｂ）ＰＳＡの存在を試験し、かつ ｃ）ＰＳＡが検出された場合に、女性をＰＳＡ陽性患者と分類する ことから成る。 本発明の一つの実施例によると、ＰＳＡ陽性分類は、乳房腫瘍状態に対するホ ルモン治療が必要なことを示す。 本発明の一つの実施例によると、市販されており広く使用されている免疫測定 法よりも約４０倍感度が高い時間分解蛍光光度法（ＴＲ−ＦＩＡ）によるＰＳＡ 測定法が提供される（１２、１３）。この方法を十分に評価した結果、０．０５ μｇ／Ｌ以上のレベルのＰＳＡを容易にかつ正確に定量できる。 本発明の有利な実施例によると、時間分解蛍光光度法を用いた乳房腫瘍抽出物 中の前立腺特異性抗原超高 感度検出法が提供される。モノクローナル抗ＰＳＡ抗体と一緒に乳房腫瘍抽出物 をインキュベーションする。ＰＳＡに特異性のビオチン結合(biotinylated)ポリ クローナル抗体を結合ＰＳＡにすべて結合させるために加える。アルカリホスフ ァターゼ標識ストレプトアビジン(streptavidin)（ＳＡ−ＡＬＰ）を加える。Ａ ＬＰの活性は、基質５−フルオロサリチル−ホスファートを加え、次いでＴｂ³⁺ −ＥＤＴＡを加えて蛍光性キレートを形成させて測定する。蛍光は、ＰＳＡの存 在を示す所定の時間の間に測定する。ＰＳＡが存在するか否かは、乳癌の予後お よび予測インジケーターとして使用できる。 図面の簡単な説明 本発明の有利な実施例を添付の図面により説明する。 図１：ＴＲ−ＦＩＡ法および現在市販されていて入手できる３種類の免疫測定 法による乳房腫瘍抽出物中のＰＳＡの分析。上図：ＰＳＡ＞０．３μｇ／Ｌの２ ４種の乳房腫瘍抽出物におけるＴＲ−ＦＩＡとハイブ との比較である。中図：同じ抽出物におけるＴＲ−Ｆ Ａキットとの比較である。下図：ＴＲ−ＦＩＡとアボット(Abbott)IM_X 試験と の比較である。式は直線回 帰分析を示し、Ｒは相関係数である。図には含まれていない腫瘍抽出物試料１種 のＰＳＡ値は、ＴＲ−ＦＩＡ分析では６１．４μｇ／Ｌ、ハイブリテクでは３９ ．４μｇ／Ｌ、ＤＰＣキットでは５１．８μｇ／Ｌであった（IM_Xでは測定せず ）。これらのデータは、４種の異なる免疫学的試験による乳房腫瘍抽出物中のＰ ＳＡの存在の確認となる。 図２：ＴＲ−ＦＩＡ法による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）画分中 のＰＳＡの分析。カラムは、チログロブリン（６７０ＫＤ）、ＩｇＧ（１５８Ｋ Ｄ）、オボアルブミン（４４ＫＤ）、ミオグロビン（１７ＫＤ）およびシアノコ バラミン（１．４ＫＤ）を含む分子量標準液を用いて較正した。上図：ＴＲ−Ｆ ＩＡによるＰＳＡ６．７μｇ／Ｌを含む乳房腫瘍抽出物およびＴＲ−ＦＩＡによ るＰＳＡ４．２７μｇ／Ｌを含む男性血清試料。下図：ＴＲ−ＦＩＡによるＰＳ Ａ６１．４μｇ／Ｌを含む乳房腫瘍抽出物。画分４５のピークは、分子量約３０ ＫＤに相当し、遊離ＰＳＡを表す。画分４０のピークは、分子量約１００に相当 し、ａ１−抗キモトリプシンに結合したＰＳＡを表す。 図３：年齢（年数）３５以下、３５〜４４、４５〜５４およひ５５以上の患者 の４群中のＰＳＡ陽性（１）、エストロゲン受容体陽性（２）およびプロゲステ ロン受容体陽性（３）腫瘍の割合。ＰＳＡ陽性腫瘍は 、主として若い患者中に分布し（Ｐ＝０．０１２）、エストロゲン受容体陽性腫 瘍は高齢の患者中に分布していた（Ｐ＝０．００１）。プロゲステロン受容体陽 性腫瘍は、すべての年齢群に平均的に分布していた（Ｐ＝０．４５）。 図４：各疾患段階または段階０〜１または２〜３におけるＰＳＡ陽性腫瘍の割 合。段階０〜１は、局在腫瘍を示し、段階２〜３は、腫瘍の拡大を示している。 低い疾患段階に関係する明瞭なＰＳＡ陽性腫瘍の傾向がある（表４参照）。 図５：乳房腫瘍によるＰＳＡ生成に関して提案する機構。循環するリガンドは 、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲンまたはグルココルチコイド受容 体のいずれかに関係する。形成された複合体は、ＰＳＡ遺伝子の抑制解除作用を 有する。受容体陰性腫瘍は、ＰＳＡ生成を誘発できない。受容体陽性であるがＰ ＳＡを生成しない腫瘍の部分群は、リガンドが欠損しているか、欠陥受容体を持 つかまたはＬ−Ｒ複合体から下流側に欠陥を有するかのいずれかである。 図６：ＰＳＡ陽性およびＰＳＡ陰性患者におけるカプラン・マイヤー(Kaplan Meier)生存曲線。上図：総括生存率。下図：疾患がない場合の生存率。 選択実施例の詳細な説明 我々は、乳房腫瘍に関して広範な調査を行い、意外 にも、乳房腫瘍抽出物の２９％はＰＳＡ陽性（下限レベル０．０５μｇ／Ｌすな わち０．０３ｎｇ／ｍｇ総タンパク）であることを発見した。ＰＳＡは、エスト ロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体陽性の腫瘍と関連していた（Ｐ＜０ ．００２）。ＰＳＡレベルとｐ５３腫瘍抑制遺伝子生成物のレベルとの間に関連 は認められなかった（Ｐ＝０．３７）。高速液体クロマトグラフィーによると、 ＰＳＡは、遊離の３０ＫＤの形で腫瘍内に存在することが分かった。ＰＳＡ陽性 腫瘍は、若い（閉経前）女性（Ｐ＝０．０１２）および疾患の初期段階（Ｐ＝０ ．０６４）に関連していた。ＰＳＡ生成は、ステロイドホルモン受容体−リガン ド複合体により誘発されると考えられる。 本発明により、分子レベルの極小量が、乳癌のこの形式に向けられる治療法に 乳房腫瘍患者を分類するために役立つ。 ＰＳＡに対する下限値０．０５μｇ／Ｌ（０．０３ｎｇ／ｍｇ総タンパク）は 、ＰＳＡ試験の感度に基づいて任意に決定したものである。０．０５μｇ／Ｌ以 上のＰＳＡ値は、本発明により開発された試験法により容易にまた正確に定量で きる。ＰＳＡ検出のために、各種の試験法が使用できると考えられる。例えば、 酵素免疫測定法、放射性同位元素標識免疫測定法、化学的−または生物学的発光 免疫測定法、蛍光免疫測定 法およびｍＲＮＡレベルにおけるＰＳＡ遺伝子の発現を検出するためのＤＮＡに 基づく測定法がある。 本発明の有利な実施例により、時間分解蛍光免疫測定を含み、乳房腫瘍抽出物 中の前立腺特異性抗原のための超高感度検出法を含む試験法が提供される。乳房 腫瘍抽出物は、モノクローナル抗−ＰＳＡ抗体と一緒にインキュベーションされ る。ＰＳＡに特異的なビオチン結合ポリクローナル抗体を加えて、結合している ＰＳＡをすべて結合させる。アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（ ＳＡ−ＡＬＰ）を加える。ＡＬＰの活性は、基質５−フルオロサリチル−ホスフ ァートを加え、次いでＴｂ³⁺−ＥＤＴＡを加えて蛍光性キレートを形成させて測 定する。蛍光は、ＰＳＡの存在を示す所定の時間の間に測定する。ＰＳＡが存在 するか否かは、乳癌の予後および予測インジケーターとして使用できる。本発明 による検出法は、適当な抗体を用いて、ｐ５３タンパクのようなその他のマーカ ーまたは基質の存在の検出にも使用できる。 表Ｉに要約したデータは、乳房腫瘍とＰＳＡ組織中レベルとの関係を明らかに した。乳房腫瘍抽出物５２５例についてＰＳＡを分析し、その結果は表Ｉに記載 した。これらの腫瘍抽出物中で、３７４例（７１．２％）は、ＰＳＡレベルが０ ．０５μｇ／Ｌ以下であり、ＰＳＡ陰性と認められた。腫瘍抽出物の１５１例（ ２８．８％）はＰＳＡレベルが０．０５μｇ／Ｌ以上であり、９６例（１８．３ ％）はＰＳＡレベルが０．１μｇ／Ｌ以上、また４９例（９．３％）はＰＳＡレ ベルが０．３μｇ／Ｌ以上であった。市販のキットでも分析できるＰＳＡレベル ０．３μｇ／Ｌ以上の試料は、ハイブリッド・タンデム M-R ＰＳＡキット、Ｉ ＲＭＡカウントＰＳＡキットおよびアボットIM_Xキットでも分析した。その結果 も表Ｉに記載した。 非特異的効果の可能性をさらに排除するために、下記の条件で高度に陽性（Ｐ ＞０．３μｇ／Ｌ）の試料２５例について試験を繰り返した。（ａ）捕獲マウス のモノクローナル抗−ＰＳＡ抗体（α−胎仔タンパクに対し）が存在しない条件 で試験する。（ｂ）関連性がない捕獲マウスモノクローナル抗−ＰＳＡ抗体を用 いて試験する。（ｃ）ポリクローナルラビット検出抗体をビオチン結合ラビット ＩｇＧで置換した後に試験する。すべての場合に、非特異的効果が存在していな いことを確認する背景シグナルが得られた。 さらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、２種の乳房腫瘍 抽出物のＰＳＡ免疫反応性を試験した。ＴＲ−ＦＩＡによりＰＳＡレベル４．２ ７μｇ／Ｌである男性血清試料および陰性乳房腫瘍抽出物とを陽性および陰性対 照として使用した。ＰＳＡの分析は、ＨＰＬＣ画分について行い、その結果は表 ２に記載した。陽性試料の間で試験したＰＳＡ−陰性乳房腫瘍抽出物は、いずれ の場合でもすべて検出限界以下の結果であった。２個の乳房腫瘍抽出物中のＰＳ Ａ免疫反応性は、分子量約３０に相当する画分４５で一個のピークとして溶出し た。男性血清試料中のＰＳＡ免疫反応性は、画分４０および４５における２個の ピークとして溶出し、それぞれ分子量約１００ＫＤおよび３０ＫＤに相当する。 これらの２個のピークは、ａ１−抗キモトリプシンに結合したＰＳＡおよび遊離 ＰＳＡにそれぞれ相当する（１３、１５、１６）。これらの所見は、乳房腫瘍抽 出物中のＰＳＡは、遊離の３０ＫＤ型としてのみ存在することを証明している。 抽出物汚染の可能性を排除するために、−７０℃に冷凍保存してあったＰＳＡ 陽性乳房腫瘍６例およびＰＳＡ陰性乳房腫瘍６例を再度抽出した。ＴＲ−ＦＩＡ 試験で新しい抽出物を再試験した結果、いずれの場合にも最初の結果が確認され た。トロント市内の数カ所の病院のステロイドホルモン受容体研究室から、乳房 腫瘍抽出物９４例を入手した。これらの１７例（１８％）、１２例（１３％）お よび５例（５．３％）は、それぞれ＞０．０５、＞０．１および０．３μｇ／Ｌ のＰＳＡ値であった。 ＰＳＡ陰性腫瘍抽出物に精漿ＰＳＡを添加して行った回収実験から、平均で添 加外因性ＰＳＡの８３％が 得られた。６％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン溶液またはＰＳＡ陰性乳房腫瘍抽 出物を用いて高レベルＰＳＡ（２０．４μｇ／Ｌ）乳房腫瘍抽出物を希釈した希 釈試験を行った。希釈度２〜３２倍において得られた値は、非希薄試料中のＰＳ Ａ値から予想した値に非常に近かった（１００±５％）。ハイブリテクおよびＤ ＰＣ法により日常的にＰＳＡ分析を行っている別々の研究所２箇所に、乳房腫瘍 抽出物１６例（４例がＰＳＡ０．０５μｇ／Ｌ以下、１２例がＰＳＡ１μｇ／Ｌ 以上）のセットを送った。どちらの場合にも、我々の研究所で我々の方法により 得た値に非常に近かった。これらのデータは、本発明のＰＳＡ検出結果は、いか なる非特異的効果によるものではなく、また汚染はほとんど考えられないことを 証明している。 我々は時間分解免疫蛍光測定技術を用いるＰＳＡ検出を記載したけれども、こ の分野の専門家が、少なくとも０．０３ｎｇ／ｍｇ（総タンパク）のＰＳＡの定 量のために利用できるその他の技術または将来の免疫学的技術を使用することも 考えられる。例えば、この程度の感度を有する技術には、アクリジニウムエステ ルを標識とする化学発光法、アルカリホスファターゼを用いる酵素トリガー化学 発光法およびホースラディシュベルオキシダーゼにより強化したジオキセタン基 質ルミノール化学発光法、アルカリホスファターゼお よび発蛍光性基質の４−メチルウンベリフェリルホスファートまたはｐ−ニトロ フェニルホスファートを用いる免疫測定法、ホースラディシュペルオキシダーゼ およびＡＳＴＳおよびテトラメチルベンジジンのような基質を用いる免疫測定法 および標識としてＥｕ³⁺を用いる時間分解免疫蛍光試験法がある。 さらに、ＰＳＡ発現は、乳房腫瘍試料中にＰＳＡのｍＲＮＡが存在するか否か の測定によっても検出できる。ＰＳＡのｍＲＮＡ検出のための有利な方法は、Ｐ ＣＲ増幅による方法である。乳房腫瘍試料からｍＲＮＡを分離し、逆転写により ｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＰＳＡ特異性プライマーを用い ることも可能である。ＰＳＡのｃＤＮＡの検出にプローブを用いる。ＰＳＡのＲ ＮＡを検出するためのその他の方法として、例えばノーザーン・ブロット法も使 用できる。 ＰＳＡを分析した腫瘍抽出物試料の大部分において、エストロゲン（ＥＳ）お よびプロゲステロン（ＰＲ）受容体レベルのデータが利用できる。また、上に説 明した方法を用いてｐ５３腫瘍抑制遺伝子生成物の存在に関して試料４７４個を 分析した（１４）。次いで、下記の陰性下限レベルを用いて、ＥＲ、ＰＲ、ｐ５ ３およびＰＳＡに対する陽性または陰性に関して腫瘍を分類した：ＥＲおよびＰ Ｒに対して総タンパクｍｇ 当たりに１０ｆｍｏｌ以下（１４、３０、３１）；ｐ５３に対して３Ｕ／Ｌ以下 （０．０２ｎｇ／Ｌに相当）（１４）およびＰＳＡに対して０．０５μｇ／Ｌ以 下。データは表ＩＩに要約してある。 腫瘍内におけるエストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体の存在と、 ＰＳＡの存在との間に有意な関連性がある（Ｐ＜０．００２）。ＥＲ（＋）のみ またはＰＲ（＋）のみのいずれかである腫瘍は、この両方の受容体に対して陰性 である腫瘍と比較してＰＳＡに対して高い陽性の割合を有するので、ＰＳＡは、 ＥＲおよびＰＲと別々に関連している。その上、ＥＲおよびＰＲの両方に対して 陽性の腫瘍は、ＰＳＡ陽性腫瘍のほとんどを占めている（表ＩＩ）。ＰＳＡの存 在とｐ５３腫瘍抑制遺伝子生成物との間には関連はない（Ｐ＝０．３７）。最近 、後者がエストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体陰性腫瘍と強く関連 していることが認められており （１４）、この関連は本研究の試料において表 ＩＩにも示されている（Ｐ＜０．００１）。 ＥＲおよびＰＲおよびＰＳＡの間の直線回帰分析を用いた相関解析により、本 研究のすべての試料（Ｎ＝５２５）において、下記のピアソン回帰係数が得られ た。ＥＲに対してｒ＝−０．０２３、ゼロより有意には異ならない（ＮＳ）、Ｐ ＝０．６０およびＰＲに対 してｒ＝−０．０１５、（ＮＳ）、Ｐ＝０．７１。ＰＳＡ陽性腫瘍（Ｎ＝１５１ ）のみを相関に使用すると、下記のピアソン回帰係数が得られた。ＥＲに対して ｒ＝−０．０１５、（ＮＳ）、Ｐ＝０．８５およびＰＲに対してｒ＝−０．０６ ８、（ＮＳ）、Ｐ＝０．４０。 一部の乳房腫瘍は非常に高いＰＳＡレベルを有していた。最高値は、５例の腫 瘍で得られ、抽出物中でＰＳＡレベルは２０μｇ／Ｌ以上、乳房腫瘍組織ｇ当た りでＰＳＡ２００〜１０００ｎｇであった。 乳房腫瘍中のＰＳＡの存在と、患者の年齢との関連解析から、表ＩＩＩおよび 図３に示す結果が得られた。ＰＳＡは、主として若い患者（閉経前）に分布し、 統計的に有意であった（Ｐ＝０．０１２）。 患者２０３人の乳房腫瘍段階が利用できた。それぞれの段階におけるＰＳＡ陽 性腫瘍の分布の結果を表ＩＶおよび図４に記載した。明らかに、ＰＳＡ陽性腫瘍 は、主として疾患段階初期に関連する傾向がある。 ＰＳＡ陽性腫瘍は、主としてＥＲ（＋）とＰＲ（＋）であった。ＰＳＡはＰＲ と密接に関連しているので、腫瘍中のＰＳＡの存在は、機能的ＥＲとＰＲの指標 である（表Ｖ）。ＰＲは、ＥＲの作用の生成物であり、機能的ＥＲの指標である 。従って、ＰＳＡのモニタリングは、機能的ＥＲとＰＲを有する患者を同定する ための試験に有用であろう。これらの患者は、現在下記のいずれか一種以上の投 与が行われている内分泌系処置に最も反応しやすい：抗エストロゲン、抗プロゲ ステロン、抗アンドロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、グルココルチコイ ド。従って、患者のＰＳＡ（＋）およびＰＳＡ（−）としての分類は、内分泌処 置による恩恵を受ける患者の選択に有用であろう。 その上、ＰＳＡ陽性かつＥＲ陰性患者群は、意外にも、内分泌処置に対して良 好な予後および応答を有することが分かった。ＥＲ陰性またはＥＲ陽性患者の一 群中のＰＳＡの予後的な有意性を検討するために、ＥＲ陰性およびＥＲ陽性の２ 群の一部の群について、コックス回帰モデルを用いて、ＰＳＡ陽性およびＰＳＡ 陰性患者間の危険率を計算した。解析は、受容体の２種の下限レベル、１０ｆｍ ｏｌ／ｍｇまたは２０ｆｍｏｌ／ｍｇにおいて行ったが、これは使用した受容体 試験では、１０〜２０ｆｍｏｌ／ｍｇの間のレベルが不確定と考えられたからで ある。解析の結果を表６に記載する。ＥＲ陽性群では、再発のリスクはＰＳＡ陽 性およびＰＳＡ陰性患者においてほぼ同じであり、ステロイドホルモン受容体は 乳房腫瘍の有利な予後インジケーターであることが知られていたので、これは予 想できることであった。しかし、ＥＲ陰性群においては、腫瘍がＰＳＡ陽性の場 合に再発のリスクはかなり 低下した（危険比率０．１３〜０．２０）。受容体の下限が２０ｆｍｏｌ／ｍｇ の場合には、この部分群内の患者数が多いために、この差異は統計学的に有意で あった。結節状態、臨床段階および組織タイプを解析で比較しても、ＥＲ陰性部 分群の危険比率は非常に低いままであった。 癌再発のリスクは、ＰＳＡ陽性腫瘍患者の方がＰＳＡ陰性腫瘍よりも有意に低 かった。ＰＳＡ陽性患者とＰＳＡ陰性患者の再発の危険比率は、０．３２であっ た。総括的な生存に関する同様な危険率も観察した。総括的で再発がない生存曲 線を図６に示す。再発がなく総括的生存確率は、ＰＳＡ陽性患者の方がＰＳＡ陰 性患者よりもかなり高かった。図６は、ＰＳＡ陽性患者の再発は、ＰＳＡ陰性患 者よりも少なくまた長く生存し、またこの差異は統計学的に有意である（それぞ れＰ＝０．０６および０．０４）ことを示している。患者１７４人中、４２人は 癌が再発し、２７人が死亡した。これらの患者の総括追跡期間は、７〜６７カ月 にわたり、中間値は３３カ月であった。０．０３ｎｇ／ｍｇ以上のＰＳＡ免疫反 応性が、患者の２７％から検出された（４７／１７４）。追跡期間を考慮しない で、ＰＳＡ陽性患者は、ＰＳＡ陰性患者よりも再発または死亡の恐れが低い（癌 再発に関して、ＰＳＡ陽性患者の１１％に対して、ＰＳＡ陰性患者は２９％。死 亡に関して、ＰＳＡ陽性患者の６％に対して、ＰＳＡ陰性患者は１９％）。 このデータは、ＰＳＡ、すなわちもともとは前立腺に対して高い特異性を有す ると考えられていた抗原を乳房腫瘍が生成することを示している。これまでの免 疫組織化学的研究は、乳房腫瘍またはその他の腫瘍中のＰＳＡ免疫反応性を発見 し（１７）、あるいはＰＳＡがポリクローナル抗体とは偶然的な免疫反応性があ り、モノクローナル抗体とはないことを発見しており、交差反応性効果を示唆し ている（１８）。 ＰＳＡを生成する腫瘍の割合は、有意（約２９％）であり、ＨＥＲ−２腫瘍遺 伝子の増幅を伴う割合と同程度またはより高い（１９）。腫瘍中のＰＳＡの型は 、約３０ＫＤの分子を有し、遊離ＰＳＡに相当する。 乳房腫瘍によるＰＳＡの生成は、エストロゲン、プロゲステロンまたはアンド ロゲンのいずれかと結合しているステロイドホルモン受容体によるＰＳＡ遺伝子 抑制解除による（図５）。これは、ＰＳＡを生成する大部分の腫瘍は、ステロイ ドホルモン受容体陽性であるという所見から分かる。１５１例のＰＳＡ陽性腫瘍 の中で、２０例のみがエストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体陰性で あった。この内、１５例は検出可能なエストロゲンおよび／またはプロゲステロ ン受容体レベルであったが、そのレベルは１０ｆｍｏ ｌ／ｍｇ（タンパク）の検出下限以下であった。５例（３．３％）のＰＳＡ陽性 腫瘍だけが使用した方法により検出できないエストロゲンおよびプロゲステロン 受容体レベルであった。この５例の腫瘍において、抽出物のＰＳＡ免疫反応性は 比較的低かった（０．０５、０．０６、０．１４、０．１７および０．３７μｇ ／Ｌ）。 最近の報告は、前立腺内のＰＳＡ発現は、ホルモン、すなわち合成アンドロゲ ンまたはテストステロンの直接の影響下にあるのであろうと示唆している（２０ 〜２３）。乳房腫瘍中におけるＰＳＡの存在は、ステロイドホルモン受容体の存 在に依存し、ＰＳＡと受容体とのレベルの間に相関がないという我々の観察は、 ＰＳＡ生成のために受容体は必要ではあるがこれで十分ではないことを示してい る。その上、まだ同定されていない１種以上のリガンドがステロイドホルモン受 容体と相互作用し、ＰＳＡ遺伝子抑制解除を調節する複合体を形成している（図 ５）。活性のリガンド−受容体複合体は、ステロイドホルモン受容体−陽性腫瘍 の３２％のみに存在するように見える。これ以外のステロイドホルモン受容体− 陽性腫瘍中にリガンドが存在しないか、以前に示唆されたように受容体が欠損し ているか（２４）、またはリガンド−受容体複合体は形成されるが、遺伝子抑制 解除のレベルではどちらか といえば効果がないのかどうかは明らかでない。 乳癌中のＰＳＡ遺伝子抑制解除のこの機構は、ＰＳＡ生成は若い患者の年齢に 関連するという所見（Ｐ＝０．０１２、表３）からも支持される。５５才以上の 患者では、エストロゲンまたはプロゲステロン受容体−陽性腫瘍が全体の８０％ 以上であっても、腫瘍の２４％のみがＰＳＡを生成する。３５才以下の患者では 、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体−陽性腫瘍が全体の５０％ に過ぎないけれども、腫瘍の３３％がＰＳＡを生成する。ＰＳＡ生成に対する年 齢の影響をさらに証明するために、エストロゲンまたはプロゲステロン受容体− 陽性腫瘍の総数からＰＳＡ生成腫瘍の割合を計算した。その値は、３５才以下の 年齢群ではそれぞれ６７％（６／９）および７５％（６／８）、５５才以上の年 齢群ではそれぞれ２９．７％（８０／２６９）および３８．１％（３０／２１０ ）であった（表３のデータから）。若い患者におけるＰＳＡ陽性の割合が高いこ とは、機能している卵巣による図５の推定リガンドの生成に関係があるのであろ う。 エストロゲンおよびプロゲステロン受容体に対して陰性の腫瘍と比較して、エ ストロゲンおよびプロゲステロン受容体に対して陽性の腫瘍ではＰＳＡ陽性割合 が高く、エストロゲンのみまたはプロゲステロンのみ に対して陽性の腫瘍においてＰＳＡ陽性割合が中程度であることは（表ＩＩ）、 図５から分かるように、いずれの受容体もＰＳＡ生成を促進できることを証明し ている。 疾患段階は患者２０３人についてしか得られなかったけれども、ＰＳＡ生成と 疾患段階との間の関連分析から（表ＩＶおよび図４）、ＰＳＡ陽性腫瘍は低い疾 患段階と優先的に関連していることが証明されている。一部の患者群では試料数 が比較的少なかったので、Ｐ値は０．０５以下にはならなかった。 これらの所見の実際的な意義は、ＰＳＡ遺伝子抑制機構を乳房腫瘍処置に利用 できることである。ステロイドホルモン受容体結合に含まれるリガンドおよび乳 房腫瘍中のＰＳＡ遺伝子調節を検討すると、この処置に対する助けとなるであろ う。ＰＳＡを生成する乳房腫瘍は、選定した処置に対して患者が異なる予後また は有利な応答を示すか否かを確定するための遡及または将来的な研究で検討でき るかなり大きい群（患者の２９％）を構成する。 ＰＳＡは両方の受容体に陽性の腫瘍、低い疾患段階および患者の生存率改善に より強く関連しているので、ＰＳＡが有利な予後インジケーターであることをデ ータは示している（図６）。乳房腫瘍内に、ＰＳＡは遊離した３０ＫＤで、多分 酵素的に活性な型として存 在する。ＰＳＡ陽性腫瘍の大部分は検出可能な受容体を有し（１４６／１５１、 すなわち９７％）、また若い患者の方が高齢の患者より陽性率が高いという所見 に基づいて示唆されるＰＳＡ生成モードは（図５）、ＰＳＡ陽性腫瘍が、ＰＳＡ 生成から分かるように、遺伝子制御が可能な「有効な」受容体を有する部分群で あるという結論を導く。ＰＳＡ陽性腫瘍患者は、ステロイドホルモン療法に最も 反応が高くなるであろう。このことは、乳癌中の別の予後インジケーター候補で あるステロイドホルモン受容体−誘導性ｐＳ₂−ＢＣＥＩタンパクについても最 近示唆されている（２５、２６）。 かなりの割合の乳房腫瘍（２９％）がＰＳＡを生成する。ＰＳＡ生成は、ステ ロイドホルモン受容体−陽性腫瘍、若い年齢および初期の疾患段階に関連してい る。ＰＳＡは乳癌の日常的な予後マーカーとして使用でき、疾患の初発および経 過に関係しているであろう。本発明者の時間分解蛍光免疫試験法は、乳房腫瘍抽 出物中のＰＳＡレベル０．０５μｇ／Ｌまで検出できる感度を有し、これは総タ ンパクｍｇ当たりＰＳＡ約０．０３ｎｇに相当する。 方法 患者−乳房腫瘍 ステロイドホルモン受容体、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子 生成物およびＰＳＡに対し、本発明の新規で高感度の免疫蛍光測定法を用いて、 約５００個の乳房腫瘍抽出物を分析した。 本研究に用いたすべての原発腫瘍は、オンタリオの約１０箇所の病院から収集 したものである。原発乳房腫瘍組織は、外科切除の後直ちに液体窒素中に保管し 、研究所に輸送し、抽出を行うまで−７０℃で保管した（約１〜２週間）。腫瘍 組織約０．５ｇを秤取し、必要ならばハンマーで磨砕し、サーモバック(Thermov ac)組織微粉砕機で液体窒素を用いて微粉砕した。抽出緩衝液（０．０１ｍｍｏ ｌ／Ｌトリス、１．５ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミンテトラ酢酸、５ｍｍｏｌ／ Ｌモリブデン酸ナトリウム、５ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを用いてｐＨを７．４０に調 節）１０ｍＬと一緒に、得られた粉末を５０ｍＬプラスチック試験管に入れた。 ポリトロン(Polytron)の単独５ｓバーストを用いて組織粉末を氷上でホモジナイ ズした。粒子状材料を１０５，０００ｇで１時間遠心処理してペレット化した。 脂質または粒子状層を乱さないようにして中間層（シトゾル抽出物）を集めた。 シトゾル抽出物のタンパク濃度は、ローリー(Lowry)法により測定し、分析まで 抽出物を−７０℃で保管した（３週間以内）。試験しようとする腫瘍組織試料の 総タンパク濃度の測定の際に、抽出物のタンパク濃度がこの測定の基礎となる。 従って、総タンパクｍｇ当たりＰＳＡ０．０３ｎｇの検出レベルは、ＰＳＡ（＋ ｖｅ）または（−ｖｅ）決定の際に重要である。安定性試験から、シトゾル抽出 物中のｐ５３タンパクおよびＰＳＡは、−７０℃において少なくとも４カ月は安 定であることが分かった。エストロゲンおよびプロゲステロン受容体 エストロゲンおよびプロゲステロン受容体（ＥＲ、ＰＲ）の定量分析のために 、アボット酵素免疫試験キット(Abbott Laboratories，North Chicago，IL 6006 4)を用いて測定した。キットはメーカーの使用説明書に従って使用した。ＰＳＡおよびｐ５３の測定 ＰＳＡおよびｐ５３の測定は、本発明の時間分解蛍光免疫試験法を用いて行っ た。計器 白色マイクロタイターウエル中の液相Ｔｂ³⁺蛍光測定には、時間分解蛍光測定 器であるサイバーフルアー 間ゲート設定および発光通路内の干渉フィルターは、別の文献（３２、３３）に 記載のものと同じものを用いた。ＰＳＡ測定 試薬および溶液 特に断らないかぎり、試薬はすべてシグマ社(Sigma )から購入した。コーティング液は、アジ化ナトリウムをリットル当たり０．５ ｇ含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．８０であった。洗浄液は、Ｎａ Ｃｌをリットル当たり０．１５ｍｏｌおよびポリオキシエチレンソルビタン・モ ノラウラート(Tween 20)を０．５ｇ含む５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７． ８０であった。基質の緩衝液は、ＮａＣｌをリットル当たり０．１５ｍｏｌ、Ｍ ｇＣｌ₂ｍｍｏｌおよびアジ化ナトリウム０．５ｇを含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリ ス緩衝液、ｐＨ９．１であった。基質原液は、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ中の １０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ジフルニサル（ＤＦＰ）溶液である。これはサイバーフ ルアー社(Cyberfluor Inc.、トロント、カナダ)から入手できる。現像液は、ト リス塩基をリットル当たり１ｍｏｌ、ＮａＯＨを０．４ｍｏｌ、ＴｂＣｌ₃を３ ｍｍｏｌおよびＥＤＴＡを３ｍｍｏｌ含んでいる（ｐＨは調節せず）。この液は 文献（２３、２４）の記載に従って調製され、サイバーフルアー社から入手でき る。試験緩衝液は、ＢＳＡをリットル当たり６０ｇ、ＫＣｌを０．５ｍｏｌ、ア ジ化ナトリウムを０．５ｇ、正常マウス血清を５０ｍＬおよびトリトン(Triton) Ｘ−１００を５ｇ含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．８０である。ポ リクローナルビオチン結合検出抗体およびＳＡ−ＡＬＰ希釈液は、ＢＳＡをリッ ト ル当たり６０ｇ含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．８０である。ＧＡ Ｒｌｇ−ＡＬＰ接合体希釈液は、ポリクローナルビオチン結合検出抗体希釈液と 同じであるが、ヤギ血清４％（ｖ／ｖ）を含んでいる。ブロッキング液は、ＢＳ Ａをリットル当たり１０ｇ含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．８０で ある。抗体 マウスモノクローナルＭＢＰ０４０５およびラビットポリクローナルＰＢＧ０ １０１抗ＰＳＡ抗体は、メデックス・バイオテク社(Medix Biotech，Foster Cit y，CA 94404)から購入した。ＳＡ−ＡＬＰ接合体は、ジャクソン社(Jackson Imm unoResearch，West Grove PA 193.90)から購入した。アルカリホスファターゼ共 役アフィニティー精製ヤギ抗ラビットＩｇＧ、Ｆｃ断片特異性（ＧＡＲｌｇ−Ａ ＬＰ）、もジャクソン社から購入した。ａ₁抗キモトリプシンに対するポリクロ ーナルラビット抗体はダコパッツ社(Dakopatts，Glostrup、デンマーク）から購 入した。標準 一般に認められているＰＳＡからの標準が入手できないので、われわれの研究 のために、ＢＳＡを６％（ｗ／ｖ）含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７ ．８０中のＰＳＡ標準を用いた。ヒト精漿から精製さ れたＰＳＡから調製したＰＳＡ原液は、スクリップス・ラボラトリーズ(Scripps Laboratories，San Diego，CA 92121)から購入した。我々の最終標準溶液は、 ハイブリテク・タンデム−ＰＳＡキット(Hybritech Inc,，San Diego,CA 92126) の標準に対して較正した。通常の使用のためには、濃度０、０．０２５、０．１ 、０．５、２および１０μｇ／ＬのＰＳＡ標準６種を推奨する。これらは４℃で 少なくとも１カ月は安定であった。ポリクローナル抗ＰＳＡ抗体のビオチン結合化 イオン交換クロマトグラフィーにより精製したポリクローナル抗ＰＳＡ抗体は 、０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム溶液５リットルに対して一晩透析した。 この原液（約２ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｏｌ／Ｌ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．１を用 いて２倍に希釈した。この溶液に、攪拌しながらジメチルスルホキシド５０μＬ 中に溶かしたＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierce Chemical Co.，Rockford，ILから 入手）１ｍｇを連続して攪拌しながら加え、室温で２時間インキュベーションし た。このビオチン結合抗体は、さらに精製せずに使用し、少なくとも６カ月間４ ℃で保管した。マイクロタイターウエルのコーティング ダイナテク・ラボラトリーズ(Dynatech Laboratories，Alexandria，VA 22314 )から白色不透明の１２ウエ ル・マイクロタイターポリスチレンストリップを入手した。このウエルに、コー ティング緩衝液中のコーティングモノクローナル抗ＰＳＡ抗体５００ｎｇ／１０ ０μＬ／ウエルを室温で１晩コーティングした。使用前に、ウエルを２回洗浄し 、ブロッキング液２００μＬ／ウエルを用いて１時間ブロックした。試験手順 ストリップを６回洗浄する。各ウエルに腫瘍組織抽出液またはＰＳＡ標準５０ μＬをピペットで入れ、ウエル毎に試験緩衝液５０μＬを加える。連続して機械 的に振とうしながら３時間室温でインキュベーションし、６回洗浄する。ポリク ローナル検出抗体希釈液により１０００倍に薄めたビオチン結合ポリクローナル ラビット検出抗体をウエル当たり１００μＬ加える（ウエル当たり抗体１００ｎ ｇ）。上記のようにして１時間インキュベーションし、６回洗浄する。ＳＡ−Ａ ＬＰ希釈液により３０，０００倍に希釈したＳＡ−ＡＬＰ接合体１００μＬ／ウ エルを加える（ウエル当たり接合体３ｎｇ）。上記のようにして１５分間インキ ュベーションし、６回洗浄する。基質緩衝液（試験用ＤＦＰ基質液は１ｍｍｏｌ ／Ｌ）により使用の直前に１０倍に薄めたＤＰＦ基質２００μＬ／ウエルを加え 、１０分間室温で振とうしながらインキュベーションする。現像液１００μＬ／ ウエルを加え、１分間振と うして混合させ、サイバーフルアー６１４免疫分析器を用いてＴｂ³⁺特異性蛍光 を読み取る。データのまとめは自動的に行った。ＰＳＡ−ａ１抗キモトリプシン複合体（ＰＳＡ−ＡＣＴ）の試験 この試験は上記のＰＳＡ試験と全く同一であるが、ビオチン結合ポリクローナ ルラビット抗ＰＳＡ抗体の代わりに、ＳＡ−ＡＬＰ接合体希釈液により５００倍 に薄めたポリクローナルラビット抗キモトリプシン抗体を用いた。次いで、５， ０００倍に薄めたＦＡＲｌｇ−ＡＬＰ接合体１００μＬ（ウエル当たり２０ｎｇ ）を加え、振とうしながら３０分間インキュベーションした。６回洗浄した後、 ＰＳＡ試験の記載通りにしてＤＦＰ基質を加えて試験を完了した。標準ＰＳＡ− ＡＣＴ複合体が入手できなかったので、この試験は較正しなかった。 市販のキット、（ａ）ハイブリテク・タンデム−ＲＰＳＡキット（Hybritech Inc.，San Diego，CA 92126)、（ｂ）ＩＲＭＡカウントＰＳＡキット(Diagnosti c Products Corp.，Los Angeles，CA 90045)、および（ｃ）アボットＩＭ_X自動 化ＰＳＡ法（Abbott Laboratories，Chicago，IL.，U.S.A.)を用いて選定した腫 瘍抽出物中のＰＳＡを測定した。高速液体クロマトグラフィーは、２８０ｎｍの 吸収モニターを備えた島津シ ステム（島津製作所、京都、日本）を用い、ＮａＨ₂ＳＯ₄を０．１ｍｏｌ／Ｌ、 ＮａＨ₂ＰＯ₄を０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８０を移動相としてイソクラティッ ク展開を行った。流量は０．５ｍＬ／分であった。使用したゲル透過カラムは、 バイオ・シル(Bio Sil)ＳＥＣ−４００、６００ｍｍ ｘ ７．５ｍｍ(BioRad L abs，Richmond，CA)。カラムは、チログロブリン（６７０ＫＤ）、ＩｇＧ（１５ ８ＫＤ）、オボアルブミン（４４ＫＤ）、ミオグロビン（１７ＫＤ）およびシア ノコバラミン（１．４ＫＤ）を含むバイオラド社(BioRad)からの分子量標準液を 用いて較正した。試料１５０ｍＬを注入した後、画分コレクター、モデルＦＲＡ Ｃ−１００(Pharmacia、Uppsala,、スエーデン)を用いて、それぞれ０．５ｍＬ の画分を集めた。統計学的解析 分布の相違の統計学的有意性を決定するためにχ₂検定を使用し、すべてのχ₂ 値および相当するＰ値は統計用ソフトウエアＳＡＳ(SAS Institute Inc.，Cary ，NC，USA)により算出した。ｐ５３測定 溶液および試薬 細胞溶解緩衝液：１５０ｍＭ ＣａＣｌ、２０ｍＭトリス、１％ノニデット（N onidet）Ｐ−４０、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルクロリド（ＰＭＳＦ） 、 １μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５０ｇ／ｍｌ アプロチニン。試料希釈液（細胞溶 解液、血清、ポリクローナル抗ｐ53ラビット抗血清およびアルカリホスファター ゼ−接合ヤギ抗ラビット抗体の希釈液）：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をリッ トル当たり６０ｇおよびアジ化ナトリウム１ｇを含む５０ｍＭトリス、ｐＨ７． ４０。モノクローナル抗ｐ５３抗体希釈液；ウシ血清アルブミンをリットル当た り６０ｇ、アジ化ナトリウムを１ｇおよびＫＣｌを０．５ｍｏｌ含む５０ｍＭト リス、ｐＨ７．４０。 基質緩衝液：０．１Ｍ トリス、ｐＨ９．１、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ。現像液：２ｘ１０^-3ＴｂＣｌ₃、３ｘ１０^-3ＥＤＴＡ。０．４Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍトリス塩基（ｐＨ調節なし）。文献（３２）の記載通りにして調 製。洗浄液：蒸留水。コーティング緩衝液：アジ化ナトリウムをリットル当たり １ｇ含む５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．８０。５−フルオロサリチル酸のリン酸エ ステル（ＦＳＡＰ）は、サイバー・フルアー社(CyberFluor Inc.，トロント、カ ナダ)から入手した。これは０．１Ｍ ＮａＯＨ中の１０ｍＭ原液として４℃で 数カ月間貯蔵した。使用直前に基質緩衝液によりこの原液を１０倍に希釈する。 他の薬品はシグマ社(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO，USA)から入手したが 、ノニデットＰ−４０(Boehrin ger-Mannheim，Indianapolis，IN，USA)、ＴｂＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ(IGFS Chemicals ，Columbus，OH，USA)およびビオチン結合化試薬ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン(Pierc e Chemical Co.，Rochford，IL，USA)。ｐ５３標準 範囲０．２５〜４ｎｇ／ｍｌの組換え突然変異型ヒトｐ５３タンパク標準は、 オンコジン社(Oncogene Science，Inc.，Uniondale，NY，USA)から入手し、一次 標準とみなした。以後の試験において、試験の最適化および細胞溶解物の標準化 にこの標準を使用した。文献（３３）の記載通りに調製した別のヒト野性型組換 えｐ５３液は、プライブズ博士(Dr．C．Prives，Columbia University)から提供 されたものである。標準液を調製するために、試料希釈液でこのｐ５３調剤を希 釈した。抗体 マウス抗ｐ５３モノクローナル抗体、ＰＡｂ ４２１およびＰＡＢ ２４０は、 ベキモル博士(Dr．S．Behchimol，Ontario Cancer Institute)から提供されたも のである。これらは、抗体約３０μｇ／ｍｌを含む組織カルチャー上清である。 ラビットポリクローナル抗ｐ５３抗体のＣＭ−１は、ジメンション・ラボ(Dimen sion Labs，Mississauga、Ontario,カナダ)から入手した。いずれも約１ｍｇ／ ｍｌのアルカリホスファ ターゼに接合したヤギ抗ラビット抗体およびヤギ抗マウス抗体、Ｆｃ特異性は、 ジャクソン社(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA，USA)から入手した。ｐ５３の免疫学的試験 ヤギ抗マウス抗体を用いて、コーティング緩衝液中の抗体１００μｌ ５００ ｎｇ／ウエルをピペット注入して、白色不透明の１２ウエル・マイクロタイター ポリスチレンストリップ(Dynatech Labs，Alexandria，CA，USA)をコーティング した。室温で一晩インキュベーションした後、蒸留水を用いてウエルを４回洗浄 した。次いで、試料希釈液２００μｌ／ウエルをピペットで注入してウエルをブ ロックし、１時間インキュベーションし、上記のようにして洗浄した。次いで、 下記のようにウエル試験に使用した。マウスモノクローナル抗ｐ５３抗体（ＰＡ ｂ ４２１またはＰＡｂ ２４０）１００ｎｇ／ウエルおよび試料（細胞溶解物の ｐ５３標準）５０μｌを加えた。抗体は、抗体約３０μｇ／ｍｌを含む細胞カル チャー上清であり、これをモノクローナル抗ｐ５３抗体希釈液により２０倍に希 釈した。細胞溶解物は、試料希釈液により１０〜１０００倍の各種の希釈度で使 用した。３７℃で振とうしながら３時間インキュベーションした後、プレートを ４回洗浄した。次いでポリクローナルラビット抗ｐ５３抗体（試料希釈液により ５０００倍に希釈）１００ μｌ／ウエルを加え、室温で振とうしながら１時間インキュベーションした。４ 回洗浄した後、ヤギ抗ラビットアルカリホスファターゼ共役溶液（試料希釈液に より５０００倍に希釈）１００μｌ／ウエルを加え、室温で振とうしながら１時 間インキュベーションした。ストリップを再び４回洗浄し、ＦＳＡＰ溶液（基質 緩衝液中１０^-3Ｍ）１００μｌ／ウエルを加え、室温で振とうしながら１０分間 インキュベーションした。現像液１００μｌ／ウエルを加え、次いで１分間短い 攪拌をして蛍光複合体を得た。６１５ｎｍにおける時間分解蛍光測定は、サイバ ーフルアー６１５免疫分析器により行った。データの整理および補正曲線の描写 は、分析用ソフトウエアにより自動的に行った。ｍＲＮＡの検出 ＰＳＡ ｍＲＮＡの検出は、デグチ(Deguchi)らの方法またはその変形法によ り行うことができる。この方法は、腫瘍からのｍＲＮＡの分離、逆転写によるｃ ＤＮＡの合成およびＰＳＡ特異性プライマーを用いるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含 む。使用したプライマーの配列は下記である。 ５’− ＴＣＧ−ＧＣＡ−ＡＧＴ−ＴＣＡ−ＣＣＣ−ＴＣＡ−３’ ５’− ＣＣＣ−ＴＣＴ−ＣＣＴ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＴＣ−Ｃ−３’ ＰＣＲ増幅により７５４塩基対の断片が生成し、これをアガロースゲル上で電気 泳動処理し、ハイボンド(Hybond)Ｎ＋膜にサザン・ブロットした。ＰＳＡのｃＤ ＮＡをハイブリッドするためにフルオレセインで標識したプローブ（５’ − ＧＧＡ−ＡＣＣ−ＴＴＧ−ＧＡＡ−ＡＴＧ−ＡＣＣ−ＡＧ−３’）を加えた。ア マーシャム社(Amersham International)からの化学発光剤を用いてこのプローブ を検出した。乳癌生存率およびＥＲ陰性、ＰＳＡ陽性試験 原発乳癌を有する１７４人の患者がこの試験に含まれる。患者はすべてトリノ 大学婦人腫瘍学部で処置、追跡した。これらの患者の年齢の範囲は、２５〜９１ 才で、中間値は５６才であった。患者の３２％は５０才以下、６９％は５０才以 上であった。追跡期間は７〜６７カ月で、中間値は３３カ月であった。 臨床段階、組織学的細胞タイプおよびグレード、腋窩結節の発生、腫瘍の大き さ、腫瘍細胞中のＥＲおよびＰＲの存在、および外科処置の後のアジュバント処 置を含む臨床および病理学的情報を各患者毎に集めた。ＴＮＭ段階システムによ ると、患者の４５％、４７％および８％は、それぞれ段階Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ またはＩＶであった。乳癌標本それぞれについても、組織学的なグレードおよび タイプを決めた。患者の３９％は低グレード（Ｉ）、４２％は中間グレード（Ｉ Ｉ）１９％は高グレード（ＩＩＩ）であった。患者の７０％は、腺管癌であった 。これ以外は、小葉（１３％）、上皮内小葉（２％）、髄貭（５％）、乳頭状（ ２％）、管状（２％）、管−小葉（３％）または未知タイプ（３％）であった。 データ解析においては、腺管癌以外の癌を有する患者の数が少なかったので、組 織学的タイプを２分類、すなわち腺管と非腺管に分けた。 これらの患者の腫瘍の大きさは、０．７〜６ｃｍであり、中間値と平均値は同 じく２．４ｃｍであった。患者の５１％は、腋窩リンパ結節に侵入する腫瘍を有 していた。１７４人の患者の中で、５６％は下記のアジュバント処置を受けた。 タモキシフェン（３７％）、化学療法（１５％）または双方（４％）。残り（４ ４％）は、外科処置の後に特に処置は受けなかった。 ＰＳＡとその他の変量の関連を知るために、分割表およびχ₂検定を用いて、 ＰＳＡ陽性とＰＳＡ陰性群の間の年齢、臨床段階、組織学的グレードおよびタイ プ、結節の状態、腫瘍の大きさ、ＥＲおよびＰＲ、およびアジュバント処理を含 む人数統計、臨床および病理学的変量を比較した。各試験変量と無再発または総 括生存率との間の関係は、危険率および９５％信頼限界により表し、この信頼限 界はコックスの比例危険回帰モデルを用いて単変量的に算出した（３５）。患者 生 存率に対するＰＳＡ免疫反応性のインパクトを評価するために、コックスの多変 量回帰モデルも用いたが、その際、生存率に影響をおよぼす恐れのあるその他の 臨床的および病理学的変量、例えば臨床段階（Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ／ＩＶ）、 結節の状態（陽性または陰性）、腫瘍の大きさ（平均の大きさより大きいか小さ いか）、ステロイドホルモン受容体（存在または不在）、およびアジュバント処 置（処置せず、タモキシフェン、またはタモキシフェンと化学療法）も検討した 。ＰＳＡ陽性と陰性群の間の生存率の差を実証するために、ケプラン−マイヤー 無再発および総括生存率曲線（３６）を作製した。生存率曲線の有意差を検定す るために、ログランク(logrank)試験（３７）を用いた。 本発明の選択実施例をここに詳細に説明が、本発明の精神または特許請求範囲 から外れることなく、これを変更した方法も可能であることは、専門家には自明 であると考える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５７５ 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５７５ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．乳癌の診断、予後または処置であって、 ｉ）女性の乳房腫瘍組織の試料を入手し、 ｉｉ）前記の試料中のＰＳＡの存在を検出するために前記の試料を生物学的 に試験し、前記の試験は、前記の腫瘍組織の総タンパクｍｇ当たり少なくとも０ ．０３ｎｇ以下の濃度のＰＳＡを検出することができ、 ｉｉｉ）前記の試料中にＰＳＡが検出されたとき、前記の診断、予後また処 置のためにその女性をＰＳＡ陽性と分類する ことからなるステップ。 ２．前記の生物学的試験が前記の試料中に存在しているＰＳＡのｍＲＮＡを検出 することから成る請求項１に記載の診断、予後または処置。 ３．前記の乳房腫瘍試料が前記の腫瘍の一部を深冷したものである請求項１およ び２に記載の診断、予後または処置。 ４．前記のＰＳＡ陽性分類が、前記の乳房腫瘍状態のホルモン処置を指示する請 求項１および２に記載の診断、予後または処置。 ５．前記の生物試験がＰＳＡを検出するための酵素増幅を含む時間分解蛍光免疫 試験である請求項１に記載の診断、予後または処置。 ６．前記の蛍光免疫試験がモノクローナル／ポリクローナル抗体の組み合わせの 使用を含み、前記のモノクローナル抗体は腫瘍組織中のＰＳＡまたはＰＳＡ複合 体に特異的であり、かつ前記のポリクローナル抗体は前記のモノクローナル抗体 −ＰＳＡ複合体に特異的であり、前記の蛍光免疫試験は、前記のポリクローナル 抗体の存在、従ってＰＳＡの存在を示すシグナルを酵素的に増幅する請求項５に 記載の診断、予後または処置。 ７．前記のシグナルの前記の酵素的増幅がアルカリホスファターゼ共役ストレプ トアビジンを用いたリン酸ジフルニサルの蛍光キレート剤への酵素的変換から成 る請求項６に記載の診断、予後または処置。 ８．血清中のＰＳＡがＰＳＡ−抗キモトリプシン複合体を形成し、前記の蛍光免 疫試験が第一ポリクローナル／第二ポリクローナル抗体の組み合わせを使用し、 前記の第一ポリクローナルは、前記のＰＳＡ−抗キモトリプシン複合体に特異的 であり、前記の第二ポリクローナル抗体は前記の第一ポリクローナル−ＰＳＡ複 合体に特異的である請求項７に記載の診断、予後または処置。