JPH09500722A - 白血球付着測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、適当な培地に単球様株化細胞を懸濁させたものを少なくとも１０℃の温度でヒト血管組織試料と接触させ、組織試料の所定領域上の結合細胞数を定量することを含む血管組織への白血球結合測定法を提供する。この測定法により、ヒト血管組織に対する単球の結合を阻害する物質を同定することができ、このような物質をアテローム性動脈硬化症の治療に使用することにも本発明は関する。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球付着測定法 本発明は白血球付着測定法、さらに詳しくは血管組織への白血球結合を測定す る方法に関する。 アテローム性動脈硬化症は、西側諸国における死亡総数のほぼ半数の死因を占 める動脈疾患である。この疾患は、単球（血液中に通常存在する白血球の１タイ プ）の浸潤によって動脈壁の内側（内膜）の肥厚を招く。浸潤後、単球は成熟し てマクロファージと呼ばれる大型の細胞になり、次いで、まずマクロファージ内 でコレステロール沈着が起き、やがてさらに拡大する。おそらくマクロファージ から放出される成長因子の影響下で、平滑筋細胞も出現して増殖する。これらの 成分のすべてが動脈壁の肥厚に寄与し、動脈中の血流量を減らし、ついには当該 部位に血液凝固塊ができて血管が閉塞する。 最近、単球およびその他のタイプの白血球が血液から炎症組織へと遊走する機 構について多くのことがわかってきた。そのような機構の１つでは、炎症部位の 血管の内表面に存在する付着分子が関与している。すべての血管の内表面は内皮 細胞と呼ばれるデリケートな細胞でできていて、これらが白血球上の受容体と特 異的に結合する能力を有するタンパク質付着分子を形成する。これらの受容体は それ自体が付着分子であって、白血球表面上にある炭水化物、タンパク質、また はイオウ化合物のいずれかからできている。白血球はいくつかの同様の付着相互 作用によって組織内のその他の細胞や構造とも結合する。 最近の研究で、ある種の付着分子がアテローム性動脈硬化症動脈の罹病部位の 内皮細胞上に存在するが、これら動脈の正常部位には存在しないことが示された ［ポストンら（Poston et al．）、Am．J．Pathol.，140(3)，665-673（1992） ］。ある付着分子（ＩＣＡＭ−１）は肥厚部分の平滑筋細胞上に出現するが、そ れ以外の平滑筋細胞上には出現しない。これらの知見から、アテローム性動脈硬 化症病巣は炎症部位と似ていること、および疾患過程に入って何らかの作用を及 ぼす付着分子の影響下で単球が血液外に出ることが示唆される。 厳密な機構がどのようなものであるにせよ、動脈壁への白血球の付着、とくに 単球の付着がアテローム性動脈硬化症病巣の発現に重要な役目を果たしているこ とは明白である。したがって、血管組織への白血球結合を測定する方法が求めら れている。 組織への白血球の結合を調べるために従来から用いられている１つの方法はい わゆるスタンパー−ウッドラッフ測定法（Stamper-Woodruff assay）である。こ の測定法は元々リンパ節への白血球結合機構を調べる目的で開発されたものであ る［スタンパーとウッドラッフ（Stamper and Woodruff）、J．Exp．Med.，144, 828-833（1976）］。ＲＰＭＩ培地にラット胸管白血球を懸濁させたものをラッ トまたはマウスのリ ンパ節組織薄切片と約７℃で接触させ、結合細胞を固定して可視化させた後、光 学顕微鏡下で調べた。 その後、この測定法は他の用途にも使用されるようになり、たとえば改良方法 を用いて多発性硬化症と類似性を有する神経系炎症状態である実験的自己免疫性 脳脊髄炎が調べられた［イエドノックら（Yednock et al.）、Nature，356, 63- 66（1992）］。ＲＰＭＩ培地にヒト単球細胞系（Ｕ９３７）を懸濁させたものを 正常ラットおよび実験的自己免疫性脳脊髄炎罹患ラットの脳組織薄切片と接触さ せ、結合細胞を固定して可視化させた後、光学顕微鏡下で調べた。脳組織は通常 、氷上でＵ９３７細胞と接触させたが、一部の実験は２５℃で実施されたと言及 されている。 現在では、スタンパー−ウッドラッフ測定法の変法を応用して、たとえばアテ ローム性動脈硬化症病巣由来の組織などの血管組織への白血球付着を調べる機能 測定を実施することができる。 本発明は、適当な培地に単球様株化細胞を懸濁させたものを少なくとも１０℃ の温度でヒト血管組織試料と接触させ、組織試料の所定領域上の結合細胞数を定 量することを含む血管組織への白血球結合測定法を提供する。 原則として本発明の方法はあらゆる血管組織に適用できるが、本方法はとくに アテローム性動脈硬化症のヒト動脈への単球の結合の測定に適用できる。一般に 、組織はたとえば凍結切片形成法など標準的な組織学的手法によって薄切片とし て調製される。切片の厚みは約３０μｍまでが好ましく、さ らに好ましくは約１０μｍまで、最も好ましくは約５μｍである。 組織の切片を顕微鏡スライドガラスにのせる。アミノプロピルトリエトキシシ ラン（ＡＰＥＳ）でコーティングしたスライドガラスを用いて切片の付着性を高 めるのが好ましい［マドックスとジェンキンス（Maddox and Jenkins）、J．Cli n．Pathol.，40，1256-1257(1987)］。所望により化学的固定法を用いることも できるが、切片はあらかじめ化学的固定法を実施しないで測定に使用するのが好 ましい。 あらゆる単球様株化細胞を本発明の方法に使用することができる。単球様株化 細胞とは、ヒト単球と同様の様式で血管組織（たとえば動脈壁）に付着する点で ヒト単球と似た付着性を有する株化細胞である。次に、単球の付着性は細胞表面 上の付着受容体によって決まる。 単球様株化細胞はモノクローナル株化細胞であることが好ましい。とくに好ま しい一つの単球様株化細胞としてＵ９３７組織球性リンパ腫株化細胞がある［ハ リスとラルフ（Harris and Ralph）、J．Leukocyte Biol．37, 407-422（1985） ；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５９３として一般に利用可能］。Ｕ９３７株化細胞はサ ンドストロムとニルソン（Sundstrom and Nilsson）によって初めて記載された ［Int．J．Cancer，17，565-577(1976)］。これに替わる単球様株化細胞として は、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ２０２として一般に利用可能なＴＨＰ−１単球株化細胞 がある［ツチヤら（Tsuchiya et al．）、Iｎt．J．Cancer，26，171(1980)］。 上記モノクローナル単球様株化細胞は常法によってＲＰＭＩ培地などの細胞培 養培地中で培養することができ、本発明に従って同じ培地または類似培地中で使 用されるのが普通である。Ｕ９３７株化細胞の場合、１０％ウシ胎児血清を含有 するＲＰＭＩ培地が細胞培養培地として好ましく、この培地は本発明の測定法に も使用できるが、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含んでいることが好ましい。モ ノクローナル単球様細胞は、付着性を高めるために、たとえばホルボールエステ ルなどを用いることによって活性化させておくのが好ましい。本発明の１つの態 様によれば、Ｕ９３７細胞はたとえば１０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリスチルア セテートを含有する組織培養培地に懸濁させたものなどのホルボール酢酸ミリス チルを用いて３７℃で２４〜４８時間活性化させることができる。 モノクローナル株化細胞が好ましいが、正常ヒト単球も本発明の方法に使用で きる。正常ヒト単球は、ヘパリン処理ヒト血液から、フィコールハイパック密度 勾配上の遠心分離による単核白血球単離後に、プラスチック製組織培養フラスコ に付着させることによって調製することができる。あるいは、単球は溶出装置（ elutriation apparatus）中で血液から単離することもできる。さらに、患者血 液由来の単球を使用すれば、アテローム性動脈硬化症やその他の疾患を有する患 者の単球の付着性を評価する目的にも本発明の測定法を使用することができる。 血管組織試料との接触に適した細胞濃度は１ｍｌあたり約 １０⁶ないし１０⁸個であり、好ましくは１ｍｌあたり約１０⁷個である。 血管組織切片を、そのような付着を引き起こすのに適した付着分子が存在する 血管組織片細胞に単球が付着する条件下で付着するのに十分な時間単球様細胞懸 濁液と接触させる。。顕微鏡スライドガラス上の血管組織の切片を約４０〜８０ ｒｐｍ、好ましくは約６０ｒｐｍの回転速度で回転台上で細胞懸濁液と接触させ るのが好ましい。接触時間は非常に短くてもよいし、約１時間以上になってもよ いが、約４０分が好ましい。 上記したように、かつてはスタンパー−ウッドラッフ測定法は低温すなわち４ 〜７℃程度で実施されるのが普通であったが、驚くべきことに、本発明の測定法 は４℃では結合が全く起こらないのでこの温度では実施できないことがわかった 。したがって、本測定法は少なくとも１０℃たとえば約１５〜４０℃、好ましく は約２０〜４０℃、さらに好ましくは約３７℃の温度で実施しなければならない 。 単球様細胞の懸濁液と接触させた後の血管組織試料は、標準的な組織学的手法 によって処理して、結合単球様細胞数を定量できる状態にする。そして、試料を たとえばリン酸緩衝食塩水で低温たとえば４℃で洗った後、たとえばパラホルム アルデヒドやグルタルアルデヒドを用いて固定する。 最後に、たとえばヘマトキシリンなどを使用する適当な方法で試料を染色した 後、単球様細胞の結合を顕微鏡下で観察することができる。たとえばＣＤ１５な どの単球関連抗原を 検出する免疫組織化学的染色を行なうことによって、識別度を上げることができ る。顕微鏡下では、丸みがあって異なる焦点面に存在しているという点で、結合 細胞を切片自体の中にある細胞と区別することができる。特定の試料領域に存在 する細胞の数を手動または自動で数えることによって結合単球様細胞数を求める ことができる。自動計数は、たとえばSight Systems 社（英国Hove）製造のイメ ージアナライザーなど付着細胞のサイズと丸みを認識するようプログラムされた イメージ分析装置の使用によって行なうことができる。 本発明の測定法は複数の目的に有用である。したがって、動脈硬化部位への単 球の進入における付着分子の関与が重要な意味を持っているかもしれない。なぜ なら、単球の進入は疾患の発現におけるこの最初の事象における重要な機構であ るらしいからである。単球進入がいったん始まると自己継続的に進行すると考え るのが妥当である。なぜなら、単球由来マクロファージが産生する因子はさらに 内皮付着分子の形成を惹起するようであるからである。本発明の方法は、単球進 入機構を調べる手段を提供するばかりでなく、アテローム性動脈硬化症治療のた めの治療法の開発においても重要な用途がある。 本測定法は付着過程阻害物質の研究にも使用することができる。たとえば、Ｅ ＤＴＡやＥＧＴＡは二価カチオンを除去するので、単球と内皮の相互作用を阻害 する。この相互作用の少なくとも一部はＲＧＤ配列含有ペプチドによって阻害さ れるかもしれないが、この性質はインテグリンと呼ばれる白 血球付着分子による付着と関係がある。付着は、レクチン、コムギ胚芽アグルチ ニンなどある種の炭水化物結合タンパク質や様々な付着分子に対する多くの抗体 、とくにモノクローナル抗体によって阻害される。このことから、炭水化物も付 着阻害物質としての能力を有する可能性があることが示唆される。 動脈内膜への単球付着過程を阻害しうる物質はヒトアテローム性動脈硬化症治 療剤として使用するための候補物質である。本発明の方法は、ヒトアテローム性 動脈硬化症の治療手段の開発に役立つ可能性のある阻害物質のスクリーニングに 使用することができる。潜在的阻害物質の存在下および非存在下での単球様細胞 の付着を調べる測定法では、付着過程を阻害するものが同定される。あるいは、 細胞懸濁液または組織切片を潜在的阻害物質と共に前培養することもできる。 したがって、別の態様によれば本発明は、潜在的阻害物質の存在下および非存 在下で、すなわち細胞懸濁液または組織を潜在的阻害物質と共に前培養するかし ないかして、上記で定義した測定法を実施し、その物質が単球結合度に及ぼす影 響を評価することを含む、ヒト血管組織への単球結合阻害物質の同定方法を提供 する。本発明はまた、そのようにして同定されたアテローム性動脈硬化症治療用 の物質を提供する。 本発明の測定法のさらに別の用途は、ヒトアテローム性動脈硬化症の動物モデ ルと組み合わせて用いる用途である。すなわち、ヒト血管組織（とくにヒトアテ ローム性動脈硬化症病巣由来の組織）への単球様細胞の結合に及ぼす様々な薬剤 の影響を、たとえばウサギなど別の種に由来する組織（ここでもとくにアテロー ム性動脈硬化症病巣）への結合に及ぼす影響と比較するために本発明の測定法を 使用することができる。本発明の測定法の使用により、別種における実験誘導さ れるアテローム性動脈硬化症の阻害に有効であることがわかっている薬剤がヒト にも有効であるかどうかが判定される。 上記のようにして本発明の測定法を実施するにあたり、動脈内膜ならびに内皮 への単球の結合を観察する。内皮付着は動脈内膜結合と異なる付着反応に依存す るようである。この事象において本発明の測定法は、動脈内膜結合を選択的にブ ロックする阻害物質の存在下で測定を実施することにより、単球進入に極めて重 要な内皮結合に対して特異化させることができる。 本発明の測定法を用いて得られた結果から、アテローム性動脈硬化症における 単球細胞表面分子ＣＤ１４の関与が初めて示された。とくに、抗ＣＤ１４抗体Ｕ ＣＨＭ−１（以下参照）はアテローム性動脈硬化症病巣へのＵ９３７細胞の結合 を強力に阻害することがわかった。このことから、アテローム性動脈硬化症治療 にＣＤ１４依存性単球付着を阻害する物質が有用である可能性が示唆される。適 当な物質としては、たとえばＣＤ１４に対する抗体およびＣＤ１４依存性単球付 着を阻害する小型化学分子などのその他の分子に対する抗体などが挙げられる。 治療分野ではたとえばＵＣＨＭ−１やＯＫＭ１などのＣＤ１４に対する齧歯類抗 体を使用することができる。ＵＣＨＭ−１はたとえばSigma 社などから広く市販 されており、ホッグら（Hogg et al．）によって記載されている［Immunology，53 ，753(1984)］。ＯＫＭ１は、たとえばＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ８０２６とし て一般に利用可能である。他の抗ＣＤ１４抗体は入手可能かまたは既知の方法を 用いて調製することができる。しかし、キメラ抗体またはヒューマナイズド抗体 （たとえばＣＤＲ移植されたもの）の製造など既知技術を用いて、ヒト免疫系反 応惹起能力が弱い抗ＣＤ１４抗体を開発するのが好ましい。治療分野では、たと えば分子量が約１０００までの分子などの小型化学分子を使用するのがさらに好 ましい。 別の態様によれば、本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防のた めの薬品の製造を目的としてＣＤ１４依存性単球付着を阻害する物質の利用方法 を提供する。 さらに別の態様によれば、本発明は、ＣＤ１４依存性単球付着阻害剤の有効量 を患者に投与することを含むアテローム性動脈硬化症の治療または予防の方法を 提供する。 場合によっては、ＣＤ１４依存性単球付着を阻害する物質を原体のまま患者に 投与することも可能であるが、該物質は医薬品組成物として投与されるのが普通 である。この場合、医薬品組成物は少なくとも１つのＣＤ１４依存性単球付着阻 害剤（本明細書では有効成分という）と１つ以上の薬学的に許容される担体また は希釈剤を含む。単数または複数の担体または希釈剤は、患者に対して全く悪影 響を及ぼさず、処方の他成分と禁忌でないという意味において「許容される」も のでなければならない。該医薬品組成物は、たとえば抗凝固 剤や抗高血圧剤をはじめとする心臓または循環に影響を及ぼす薬剤など有効成分 と同一または異なる治療効果を有する他の治療成分を含んでいてもよい。 小型化学分子の場合、アテローム性動脈硬化症プラークの付近またはアテロー ム性動脈硬化症プラーク形成の可能性のある部位におけるＣＤ１４単球付着を阻 害できるように循環系に送達されるのであれば、有効成分はいかなる適当な手段 による投与用にも処方することができる。適当な投与形態の例としては、経口投 与、非経口投与、直腸内投与、たとえば吸入などの鼻腔内投与などが挙げられる 。 経口投与用医薬品組成物は、たとえば錠剤やカプセル剤の剤型をとりうるが、 従来のやり方で１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに有効成分を処理す ることによって調製することができる。錠剤は既知手段による圧縮または成型に よって調製することができ、適当な賦形剤としては、結合剤、充填剤、潤滑剤、 崩壊剤、および湿潤化剤などが挙げられる。錠剤やカプセル剤は、たとえば有効 成分の放出速度を遅くしたり制御したりする目的で、既知手段によってコーティ ングすることができる。 経口投与用液状製剤は、たとえば溶液、シロップ、懸濁液の剤型をとり、使用 前に水やその他の適当なビヒクルと共に再構成する乾燥品として投与することも できる。 非経口投与用組成物としては、既知手段による処方が可能な水性および非水性 無菌注射液などが挙げられる。これらの処方は、たとえばアンプルやバイアルな どの単回投与容器ま たは複数回投与容器に入れた形で提供してもよいし、たとえば注射用水などの無 菌液を添加することによって再構成するに適した凍結乾燥状態で保存してもよい 。 直腸投与用組成物は、既知手段による処方が可能な座剤や停留浣腸などの形で 投与することができる。 鼻腔内投与用組成物は、定量投与器具または単位投与器具によって投与するた めの溶液として処方してもよいし、適当な送達システムを用いて投与するのに適 した担体を含む粉末として処方してもよい。 ＣＤ１４依存性単球付着を阻害する抗体は一般に、抗体以外にも生理的に許容 できる担体または希釈剤を含むのが好ましい、医薬品組成物の形で患者に投与さ れることもあり、心臓や循環に影響を及ぼす抗生物質や薬物などの１つ以上のも のと混合して投与することができる。適当な担体としては、生理食塩水およびリ ン酸緩衝食塩水などが挙げられる。あるいは、抗体は凍結乾燥させ、使用前に水 性緩衝液を添加することによって再構成してもよい。抗体の投与経路としては、 静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内注射または送達などが挙げら れる。 ＣＤ１４依存性単球付着を阻害する薬剤をアテローム性動脈硬化症の治療また は予防に使用する場合にどの方法を用いるかは、薬剤の性質によって決まる。ア テローム性動脈硬化症の危険性がある治療対象者に長期的かつ予防的に小型化学 分子を使用することができる。抗体は、治療対象者の免疫系に副作用を引き起こ す危険性がさらに高いので、たとえば心 臓移植後などの特殊な状況下での特定のリスクにある患者の短期療法により適し ている。いずれの場合も、厳密な投与量は担当医の判断によって決められるが、 薬剤の性質や患者の年齢と性別、患者の状態、および治療対象障害の重篤度など の因子にも依存する。 本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。実施例では、下記の付 録図面を参照する： 図１は、アテローム性動脈硬化症組織および正常組織へのＵ９３７細胞と対照ハ イブリドーマ細胞の結合を示し、図２は、Ｕ９３７細胞の付着に及ぼすＲＧＤペ プチドの影響を示し、図３は、Ｕ９３７細胞の付着に及ぼすＣＤ１４抗体と対照 抗体の影響を示す。実施例１：測定プロトコル アテローム性動脈硬化症プラークなどの血管組織の試料でサイズが約８ｍｍま でのものを液体窒素冷却イソペンタンに浸漬することによって瞬時凍結させる。 厚さ５μｍの組織切片をクリオスタットで切り出し、アミノプロピルトリエトキ シシラン（ＡＰＥＳ）コーティングした顕微鏡スライドガラス上にのせる。疎水 性化合物を含むフエルトペン（Dako Ltd．社、英国High Wycombe）を用いて、ス ライドガラス上の切片を囲む任意のリングを描く。測定にあたり、切片は新鮮な 状態で使用する。すなわち、化学固定は行なわず、切り出してから１時間以内に 使用する。 Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５９３）を１０％の ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地で培養する。細胞を１０ ００ｒｐｍの遠心分離で集め、３７℃で２４〜４８時間にわたり１０ｎｇ／ｍｌ のホルボールミリスチルアセテートに再懸濁させる。その結果、細胞が活性化さ れ、付着が増強される。活性化段階の有りまたは無しで、研究をすることが可能 である。 攪拌によって組織培養フラスコ表面からＵ９３７細胞を分離した後、遠心分離 し、計数し、１０％ウシ胎児血清を含み１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で緩衝化さ れたＲＰＭＩ−１６４０培地中で１０⁷個／ｍｌの濃度に調整する。 ２００μｌの細胞懸濁液をスライドガラスにのせ（マーカーリングを使用した 場合はその内側に置く）、ただちにスライドガラスを６０ｒｐｍで回転する回転 台にのせ、３７℃に保つ。次いで、切片を同条件下で４０分間保温する。次いで 、切片を氷冷リン酸緩衝食塩水浴に軽く５回浸して洗う。次いで、氷上で付着Ｕ ９３７細胞を４％付着パラホルムアルデヒド中で１０分間保温して固定する。切 片を水中で洗い、メイヤーのヘマトキシリンで２分間染色し、洗い、アルコール 浴とトルエン浴で脱水し、組織学の常法によってＤＰＸ封入剤（ＢＤＨ社）に封 入する［たとえばTheory and Practice of Histological Techniques，Bancroft & Stevens，Churchill Livingstone，1990 参照］。 Ｕ９３７細胞の結合は顕微鏡下で観察することができ、丸みがあって異なる焦 点面内に存在するという点で、結合細胞を切片自体の細胞と区別することができ る。結合は、標本の 組織学的に明確な領域上の複数の顕微鏡高倍率視野内の細胞を計数することによ って定量することができる。 アテローム性動脈硬化症プラークへの結合を評価するには、プラークの動脈内 膜層およびヒト動脈壁の対照正常動脈内膜領域に結合している細胞の数を数える とよい。内皮への付着を定量するためには、内皮細胞層と接触または上にあるＵ ９３７細胞を評価するとよい。必要であれば、該層は固定段階を経てフォンウイ ルブランド因子を検出するための切片の免疫組織化学的染色によって可視化させ ることができる［ポストンら（Poston et al．）、Amer．J．Pathol.，140, 665 -673（1992）］。実施例２：動脈硬化プラークへの結合 アテローム性動脈硬化症プラークの切片を調べて、病巣の性質と範囲およびア テローム性動脈硬化症スペクトルにおけるサブタイプを決定した。病巣は、脂肪 条片、繊維脂肪プラーク、複合病巣、および繊維病巣に細分した。評価は組織学 的検査によって行ない、マクロファージ、平滑筋細胞、および内皮に対する抗体 による免疫組織化学的検査を補助的に実施した。これらの手順についてはすでに 文献に報告済みである［ポストンら（Poston et al．）、Amer．J．Pathol.，14 0(3) ，665-673(1992)］。内皮層の完全性を決定する際には、フォン−ウイレブ ランド因子に対する抗体で内皮を染色する方法がとくに有用であるが、以下に説 明するように、明らかに無傷の領域でしか定量はしなかった。さらに、同じ評価 法で、組織学的に正常な領域を決定し、これらを対照として用いた。以下に示す 結果はＰＭＡで刺激したＵ９３７細胞を用いて得られたものである。 アテローム性動脈硬化症プラークへのＵ９３７細胞の結合を評価するにあたり 、次のようにして２つの組織学的領域における結合細胞数を定量した： １）内皮：ある細胞が内皮層を横切るか内腔縁に付着した場合、その細胞は内皮 に付着したものとして計数した。１つのプラークの上の無傷の内皮の全長を測定 し（１０〜３０個の高倍率視野（ＨＰＦ）から成る）、結果を高倍率視野１個あ たりの細胞数（以下のとおり）または内皮の長さあたりの細胞数で表わした。 ２）動脈内膜：内皮直下から内部弾性ラミナに至る層を測定対象の動脈内膜領域 とした。無作為に１０個の高倍率視野を選び、結果はＨＰＦ１個あたりの平均値 で表わした。 結果 この測定で、Ｕ９３７細胞がアテローム性動脈硬化症プラークの内皮と動脈内 膜層全体に高度に選択的に結合することが証明された。内皮のフリー境界へのＵ ９３７細胞の結合がしばしば明白に見られた。動脈の正常領域では結合検出頻度 ははるかに少なかった。プラークと関連した結合は中間的なものであった。結合 レベルは病巣ごとに大きな変動があり、再現性があった。測定を４℃で実施した 場合の結合は、通常の３７℃で実施した場合の結合と比べて無視できる程度であ った。 １３個のアテローム性動脈硬化症動脈標本（繊維脂肪プラーク）と６個の正常 対照標本を評価したが、正常動脈の内皮への結合率は０．５８±０．４２個／Ｈ ＰＦ（平均±ＳＤ）であったのに対し、アテローム性動脈硬化症標本では３．０ ４±２．５１個／ＨＰＦ（平均±ＳＤ）の細胞がプラークの内皮に結合した（Ｐ ＝０．００７５、マン−ホイットニーのＵ検定）。 動脈内膜層では、正常動脈における結合量が１．３±１．１個／ＨＰＦであっ たのに対し、動脈硬化標本では１６．１±１０．２個／ＨＰＦが結合した（Ｐ＝ ０．００２５）。 一方、対照として用いたＢリンパ球／ミエローマハイブリドーマ株化細胞では 、アテローム性動脈硬化症の内皮領域と動脈内膜領域の結合量はそれぞれで０． １１および１．１８個／ＨＰＦにすぎず、正常領域ではさらに少なかった。これ らの結果を図１に示す。斜線バーはＵ９３７細胞の結合の結果を示し、黒塗りバ ーは対照（非特異的ハイブリドーマ）の結果を示す。 阻害物質の評価で、内皮と動脈内膜の結合は同様の挙動を示した。ＥＧＴＡと ＥＤＴＡは結合を完全に阻害した。このことは、二価カチオン依存性であること が知られているセレクチンまたはインテグリンの付着分子がプロセスに関与して いることと一致する。同様に、Ｎ−アセチルグルコサミンと結合するコムギ胚芽 アグルチニンは、結合を顕著に低下させた。したがって、糖残基が関与している 可能性がある。ペプ チドＧＲＧＤＳ（Sigma 社）は用量関連的に付着を阻害したので（図２）、ここ でも、ＲＧＤ配列含有ペプチドと結合するインテグリンの関与が示唆される。図 ２では、丸は動脈内膜への結合を示し、三角は内皮への結合を示す。β１および β２インテグリン鎖に対する抗体（ＣＤ２９とＣＤ１８）は阻害を示したが、内 皮付着分子ＩＣＡＭ−１に対する抗体は弱い作用を示しただけであった。ブロッ キングしない場合や対照免疫グロブリン（ＵＰＣＩ０、２０μｇ／ｍｌ）と比べ て、単球表面分子ＣＤ１４に対する抗体ＵＣＨＭ−１（２０μｇ／ｍｌ）は強力 な結合阻害を示した（図３）。図３では、黒塗りバーはブロッキングしない場合 の結果を示し、濃い斜線バーは対照抗体の結果を示し、薄い斜線バーは抗ＣＤ１ ４抗体の結果を示す。ＵＣＨＭ−１およびＵＰＣ１０はどちらも同じクラス（Ｉ ｇＧ_2a）に属するマウス免疫グロブリンである。ＣＤ１４分子は最近、単球−内 皮付着を媒介することがわかった［ビークフイゼンとバンフルス（Beekhuizen a nd Van Furth）、J．Leukocyte Biol.，54，363-378（1993）］。これらの実験 から、インテグリン、炭水化物、ＣＤ１４、およびおそらくはセレクチンも上記 付着反応に関与していることが示唆される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年８月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．組織試料に結合する白血球を測定する方法であって、動脈組織試料切片を単 球または単球類似の動脈組織への付着性を有する株化細胞を適当な培地に懸濁し たものと少なくとも１０℃の温度で接触させ、ついで組織試料切片の一定領域に 結合した細胞の数を計測することを含む方法。 ２．血管組織がアテローム性動脈硬化症の動脈由来のものである、請求項１記載 の方法。 ３．該動脈組織がヒト由来のものである、請求項１または２記載の方法。 ４．単球または類似の付着性を有する株化細胞が約１５〜４５℃の温度で動脈組 織試料切片と接触させられるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の 方法。 ５．該動脈組織試料切片がクリオスタット切片の形状である、請求項１〜４いず れか１項に記載の方法。 ６．単球類似の動脈組織への付着性を有する該株化細胞がモノクローナル株化細 胞である、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。 ７．アテローム性動脈硬化症または他の疾病を有するまたは有するおそれのある 個体の血液由来のヒト単球を用いる、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。 ８．該単球または類似の付着性を有する株化細胞が細胞培養培地中に懸濁された 動脈組織試料と接触させられるものである、請求項１〜６いずれか１項に記載の 方法。 ９．該単球または類似の付着性を有する株化細胞が１０⁶〜１０⁸細胞／ｍｌの培 地中濃度で動脈組織試料と接触させられるものである、請求項１〜８いずれか１ 項に記載の方法。 １０．該濃度が約１０⁷細胞／ｍｌである、請求項９記載の方法。 １１．該血管組織試料切片が顕微鏡スライドグラス上にマウントされているもの である、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。 １２．該顕微鏡スライドグラスが約４０〜８０ｒｐｍの回転スピードの回転台上 にマウントされているものである請求項１１記載の方法。 １３．該回転スピードが約６０ｒｐｍである、請求項１２記 載の方法。 １４．該接触時間が１時間までである、請求項１〜１３いずれか１項に記載の方 法。 １５．該接触時間が約４０分である、請求項１４記載の方法。 １６．動脈組織試料との接触に続き、該細胞をパラホルムアルデヒドまたはグル タルアルデヒドで固定するものである、請求項１〜１５いずれか１項に記載の方 法。 １７．該固定試料が染色されるものである、請求項１６記載の方法。 １８．該試料がヘマトキシリンで染色されるものである、請求項１７記載の方法 。 １９．該試料が免疫組織化学的手順で染色されるものである、請求項１７記載の 方法。 ２０．結合細胞の数が顕微鏡下に手動計測により定量されるものである、請求項 １〜１９いずれか１項に記載の方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１１月６日 【補正内容】 原文明細書６ページ補正 最後に、たとえばヘマトキシリンなどを使用する適当な方法で試料を染色した 後、単球様細胞の結合を顕微鏡下で観察することができる。たとえばＣＤ１５な どの単球関連抗原を検出する免疫組織化学的染色を行なうことによって、識別度 を上げることができる。顕微鏡下では、丸みがあって異なる焦点面に存在してい るという点で、結合細胞を切片自体の中にある細胞と区別することができる。特 定の試料領域に存在する細胞の数を手動または自動で数えることによって結合単 球様細胞数を求めることができる。自動計数は、たとえばSight Systems 社（英 国Hove）製造のイメージアナライザーなど付着細胞のサイズと丸みを認識するよ うプログラムされたイメージ分析装置の使用によって行なうことができる。 本発明の測定法は複数の目的に有用である。したがって、動脈硬化部位への単 球の進入における付着分子の関与が重要な意味を持っているかもしれない。なぜ なら、単球の進入は疾患の発現におけるこの最初の事象における重要な機構であ るらしいからである。単球進入がいったん始まると自己継続的に進行すると考え るのが妥当である。なぜなら、単球由来マクロファージが産生する因子はさらに 内皮付着分子の形成を惹起するようであるからである。本発明の方法は、単球進 入機構を調べる手段を提供するばかりでなく、アテローム性動脈硬化症治療のた めの治療法の開発においても重要な用途がある。 本測定法は付着過程阻害物質の研究にも使用することがで きる。たとえば、ＥＤＴＡやＥＧＴＡは二価カチオンを除去するので、単球と内 皮の相互作用を阻害する。この相互作用の少なくとも一部はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ ｓｐ配列含有ペプチドによって阻害されるかもしれないが、この性質はインテグ リンと呼ばれる白血球付着分子による付着と関係がある。付着は、レクチン、コ ムギ胚芽アグルチニンなどある種の炭水化物結合タンパク質や様々な付着分子に 対する多くの抗体、とくにモノクローナル抗体によって阻害される。 原文明細書１１ページ補正 ＣＤ１４依存性単球付着を阻害する抗体は一般に、抗体以外にも生理的に許容 できる担体または希釈剤を含むのが好ましい、医薬品組成物の形で患者に投与さ れることもあり、心臓や循環に影響を及ぼす抗生物質や薬物などの１つ以上のも のと混合して投与することができる。適当な担体としては、生理食塩水およびリ ン酸緩衝食塩水などが挙げられる。あるいは、抗体は凍結乾燥させ、使用前に水 性緩衝液を添加することによって再構成してもよい。抗体の投与経路としては、 静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内注射または送達などが挙げら れる。 ＣＤ１４依存性単球付着を阻害する薬剤をアテローム性動脈硬化症の治療また は予防に使用する場合にどの方法を用いるかは、薬剤の性質によって決まる。ア テローム性動脈硬化症の危険性がある治療対象者に長期的かつ予防的に小型化学 分子を使用することができる。抗体は、治療対象者の免疫系に副作用を引き起こ す危険性がさらに高いので、たとえば心臓移植後などの特殊な状況下での特定の リスクにある患者の短期療法により適している。いずれの場合も、厳密な投与量 は担当医の判断によって決められるが、薬剤の性質や患者の年齢と性別、患者の 状態、および治療対象障害の重篤度などの因子にも依存する。 本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。実施例では、下記の付 録図面を参照する： 図１は、アテローム性動脈硬化症組織および正常組織へのＵ ９３７細胞と対照ハイブリドーマ細胞の結合を示し、図２は、Ｕ９３７細胞の付 着に及ぼすＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドの影響を示し、図３は、Ｕ９３７細 胞の付着に及ぼすＣＤ１４抗体と対照抗体の影響を示す。 原文明細書１５ページ補正 １３個のアテローム性動脈硬化症動脈標本（繊維脂肪プラーク）と６個の正常 対照標本を評価したが、正常動脈の内皮への結合率は０．５８±０．４２個／Ｈ ＰＦ（平均±ＳＤ）であったのに対し、アテローム性動脈硬化症標本では３．０ ４±２．５１個／ＨＰＦ（平均±ＳＤ）の細胞がプラークの内皮に結合した（Ｐ ＝０．００７５、マン−ホイットニーのＵ検定）。 動脈内膜層では、正常動脈における結合量が１．３±１．１個／ＨＰＦであっ たのに対し、動脈硬化標本では１６．１±１０．２個／ＨＰＦが結合した（Ｐ＝ ０．００２５）。 一方、対照として用いたＢリンパ球／ミエローマハイブリドーマ株化細胞では 、アテローム性動脈硬化症の内皮領域と動脈内膜領域の結合量はそれぞれで０． １１および１．１８個／ＨＰＦにすぎず、正常領域ではさらに少なかった。これ らの結果を図１に示す。斜線バーはＵ９３７細胞の結合の結果を示し、黒塗りバ ーは対照（非特異的ハイブリドーマ）の結果を示す。 阻害物質の評価で、内皮と動脈内膜の結合は同様の挙動を示した。ＥＧＴＡと ＥＤＴＡは結合を完全に阻害した。このことは、二価カチオン依存性であること が知られているセレクチンまたはインテグリンの付着分子がプロセスに関与して いることと一致する。同様に、Ｎ−アセチルグルコサミンと結合するコムギ胚芽 アグルチニンは、結合を顕著に低下させた。したがって、糖残基が関与している 可能性がある。ペプ チドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（Sigma 社）は用量関連的に付着 を阻害したので（図２）、ここでも、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列含有ペプチド と結合するインテグリンの関与が示唆される。図２では、丸は動脈内膜への結合 を示し、三角は内皮への結合を示す。β１およびβ２インテグリン鎖に対する抗 体（ＣＤ２９とＣＤ１８）は阻害を示したが、内皮付着分子ＩＣＡＭ−１に対す る抗体は弱い作用を示しただけであった。ブロッキングしない場合や対照免疫グ ロブリン（ＵＰＣ１０、２０μｇ／ｍｌ）と比べて、単球表面分子ＣＤ１４に対 する抗体ＵＣＨＭ−１（２０μｇ／ｍｌ）は強力な結合阻害を示した（図３）。 図３では、黒塗りバーはブロッキングしない場合の結果を示し、濃い斜線バーは 対照抗体の結果を示し、薄い斜線バーは抗ＣＤ１４抗体の結果を示す。 請求の範囲 ２１．動脈組織への単球の結合を阻害する物質を同定するための、請求項１〜２ ０いずれか１項に記載の方法であって、潜在的阻害剤の存在下および不存在下に 、すなわち潜在的阻害剤と単球または組織とを前培養したものおよびしなかった ものの測定を行い、そして単球結合の程度に対する該阻害剤の影響を評価するこ とを含む方法。 ２２．単球の動脈組織への結合の阻害を含む方法によりアテローム性動脈硬化症 の治療用または予防用の医薬を製造するための請求項２１記載の方法により測定 されたとき、動脈組織への単球の結合を阻害する性質によって特徴付けられる物 質の使用。 ２３．該物質がペプチド、タンパク質または炭水化物である、請求項２２記載の 使用。 ２４．該物質が抗体である、請求項２３記載の使用。 ２５．アテローム性動脈硬化症の治療用または予防用の医薬の製造のために、Ｃ Ｄ１４細胞表面抗原依存性単球付着を阻害する物質の使用。 ２６．該物質が約１０００までの分子量を有する化学分子で ある、請求項２５記載の使用。 ２７．該物質がＣＤ１４細胞表面抗原に対する抗体である、請求項２５記載の使 用。 ２８．アテローム性動脈硬化症の治療用または予防用医薬の製造のための、Ａｒ ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐアミノ酸配列を含むペプチドの使用。 ２９．アテローム性動脈硬化症の治療方法または予防方法であって、ＣＤ１４細 胞表面抗原依存性単球付着を阻害する物質の有効量を患者に投与することを含む 方法。 ３０．該物質が約１０００までの分子量を有する化学分子である、請求項２９記 載の方法。 ３１．該物質がＣＤ１４細胞表面抗原に対する抗体である、請求項２９記載の方 法。 ３２．アテローム性動脈硬化症の治療方法または予防方法であって、Ａｒｇ−Ｇ ｌｙ−Ａｓｐアミノ酸配列を含むペプチドの有効量を患者に投与することを含む 方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血管組織に結合する白血球を測定する方法であって、適当な培地に単球様株 化細胞を懸濁したものをヒト血管組織試料と共に少なくとも１０℃の温度で接触 させ、そして組織試料の一定領域に結合した単球様細胞の数を計測することを含 む方法。 ２．該血管組織がアテローム性動脈硬化症の動脈由来のものである、請求項１記 載の方法。 ３．該血管組織がアテローム性動脈硬化症のヒト動脈由来のものである、請求項 １記載の方法。 ４．単球様株化細胞が約１５〜４５℃の温度で血管組織と接触させられるもので ある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５．該血管組織がクリオスタット切片の形状である、請求項１〜４いずれか１項 に記載の方法。 ６．該単球様細胞がモノクローナル株化細胞である、請求項１〜５いずれか１項 に記載の方法。 ７．該単球様細胞が患者の血液由来の単球である、請求項１ 〜５いずれか１項に記載の方法。 ８．該単球様細胞が細胞培養培地中に懸濁された血管組織試料と接触させられる ものである、請求項１〜７いずれか１項に記載の方法。 ９．該単球様細胞が１０⁶〜１０⁸細胞／ｍｌの培地濃度で血管組織試料と接触さ せられるものである、請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。 １０．該濃度が約１０⁷細胞／ｍｌである、請求項９記載の方法。 １１．該血管組織試料が顕微鏡スライドグラス上にマウントされているものであ る、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。 １２．該顕微鏡スライドグラスが約４０〜８０ｒｐｍの回転スピードの回転台上 にマウントされているものである請求項１１記載の方法。 １３．該回転スピードが約６０ｒｐｍである、請求項１２記載の方法。 １４．該接触時間が１時間までである、請求項１〜１３いず れか１項に記載の方法。 １５．該接触時間が約４０分である、請求項１４記載の方法。 １６．血管組織試料との接触に続き、該単球様細胞をパラホルムアルデヒドまた はグルタルアルデヒドで固定するものである、請求項１〜１５いずれか１項に記 載の方法。 １７．該固定試料が染色されるものである、請求項１〜１６いずれか１項に記載 の方法。 １８．該試料がヘマトキシリンで染色されるものである、請求項１７記載の方法 。 １９．該試料が免疫組織化学的手順で染色されるものである、請求項１７記載の 方法。 ２０．結合細胞の数を顕微鏡下に手動計測により定量するものである、請求項１ 〜１９いずれか１項に記載の方法。 ２１．ヒト血管組織への単球の結合を阻害する物質を同定するための、請求項１ 〜２０いずれか１項に記載の方法であって、潜在的阻害剤の存在下および不存在 下に、すなわち潜在的阻害剤と細胞懸濁液または組織とを前培養したものおよび しなかったものの測定を行い、そして単球結合の程度に対する該阻害剤の影響を 評価することを含む方法。 ２２．請求項２１記載の方法により同定されたアテローム性動脈硬化症の治療に 使用するための物質。 ２３．該物質がペプチド、タンパク質または炭水化物である、請求項２２記載の 物質。 ２４．該物質がＲＧＤ配列を含むペプチドである、請求項２３記載の物質。 ２５．該物質が抗体である、請求項２３記載の物質。 ２６．該物質がＣＤ１４依存性単球付着の阻害剤である、請求項２３記載の物質 。 ２７．アテローム性動脈硬化症の治療または予防用の医薬を製造するための、Ｃ Ｄ１４依存性単球付着を阻害する物質の使用。 ２８．該物質が小型化学分子である、請求項２７記載の使用。 ２９．該物質が抗ＣＤ１４抗体である、請求項２７記載の使 用。 ３０．アテローム性動脈硬化症の治療または予防方法であって、ＣＤ１４依存性 単球付着を阻害する物質の有効量を患者に投与することを含む方法。 ３１．該物質が小型化学分子である、請求項３０記載の方法。 ３２．該物質が抗ＣＤ１４抗体である、請求項３０記載の方法。