JPH09500788A - Ｂ７−２：ｃｔｌａ４／ｃｄ２８カウンターレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｔ細胞を活性化を共剌激する新規なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドをコードする核酸を開示する。一態様において該核酸はＢリンパ球抗原Ｂ７−２をコードする配列を有する。好ましくは該核酸は、図８、配列番号１または図１４、配列番号２３に示すヌクレオチド配列の少なくとも１部分を含むＤＮＡ分子である。本発明の核酸配列を様々な発現ベクターにインテグレイトし、様々な宿主、特に哺乳動物および昆虫細胞培養等の真核生物細胞で、対応するタンパク質またはペプチドを合成することができる。本発明の核酸配列によりコードされるタンパク質またはペプチドを産生するようトランスホームされた宿主細胞、および新規なＢリンパ球抗原の少なくとも一部分を含む単離されたタンパク質およびペプチドも開示する。本明細書に記載したタンパク質およびペプチドはＴ細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するため患者に投与できる。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ７−２：ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８カウンターレセプター 政府資金 本明細書に記載した研究はナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスに より与えられたＣＡ−４０２１６−０８の下に支持された。それ故、米国政府は 本発明に一定の権利を有し得る。 発明の背景 抗原特異的なＴ細胞の活性化およびクローンエクスパンションを誘導するため には、抗原提示細胞(ＡＰＣ)により提供される２つのシグナルが静止Ｔリンパ球 の表面に伝達されねばならない(Ｊenkins，Ｍ．およびＳchwartz，Ｒ．(１９８ ７)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１６５、３０２〜３１９；Ｍueller，Ｄ.Ｌ．等(１９ ９０)Ｊ．Ｉmmunol．、１４４、３７０１〜３７０９；Ｗilliams，Ｉ.Ｒ．およ びＵnanue，Ｅ.Ｒ．（１９９０）Ｊ．Ｉmmunol．、１４５、８５〜９３)。免疫 応答に特異性を与える第１のシグナルは、主要組織適合性遺伝子複合体(ＭＨＣ) に示された外来の抗原性ペプチドの認識後に、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)により 媒介される。共刺激と呼ばれる第２のシグナルはＴ細胞が増殖し、機能性となる よう誘導する(Ｓchwartz，Ｒ.Ｈ.、（１９９０）Ｓcience、２４８、１３４９〜 １３５６)。共刺激は抗原特異的でもＭＨＣ限定性でもなく、ＡＰＣにより発現 される１以上の別の細胞表面分子により提供される(Ｊenkins，Ｍ.Ｋ．等(１９ ８８)、Ｊ．Immunol．、１４０、３３２４〜３３３０；Ｌinsley，Ｐ.Ｓ.等(１ ９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１〜７３０；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１ ９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８８、６５７５〜６５７９；Ｙ oung，Ｊ.Ｗ．等(１９９２)、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．、９０、２２９〜２３７； Ｋoulova，Ｌ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７５９〜７６２；Ｒ eiser，Ｈ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、２７１ 〜 ２７５；van−Ｓeventer，Ｇ.Ａ．等(１９９０)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４４、４ ５７９〜４５８６；ＬaＳalle，Ｊ.Ｍ.等(１９９１)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４７ 、７７４〜８０；Ｄustin，Ｍ.Ｉ.等(１９８９)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１６９、 ５０３；Ａrmitage，Ｒ.Ｊ.等(１９９２)、Ｎature、３５７、８０〜８２；Ｌiu ，Ｙ．等(１９９２)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７５、４３７〜４４５)。 ＡＰＣ上に発現されるＢ７タンパク質が一つのそのような重要な共剌激性分子 であることをかなりな証拠が示唆する(Ｌinsley，Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅ xp．Ｍed． 、１７３、７２１〜７３０；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８８、６５７５〜６５７９；Ｋoulova，Ｌ．等( １９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７５９〜７６２；Ｒeiser，Ｈ．等(１ ９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、２７１〜２７５；Ｌinsl ey，Ｐ.Ｓ．等(１９９０)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８７、５０３ １〜５０３５；Freeman，Ｇ.Ｊ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７４、６ ２５〜６３１)。Ｂ７はＴリンパ球上で発現される２つのリガンドについてのカ ウンターレセプターである。ＣＤ２８と名付けられる第１のリガンドは静止Ｔ細 胞上で構成的に発現され活性化後増加する。Ｔ細胞レセプターを介して信号を送 った後、ＣＤ２８のライゲーションはＴ細胞が増殖し、ＩＬ−２を分泌するよう 誘導する(Ｌinsley，Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１ 〜７３０；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８８、６５７５〜６５７９；Ｔhompson，Ｃ.Ｂ．等(１９８９)、Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８６、１３３３〜１３３７；Ｊune，Ｃ.Ｈ．等(１９９ ０)、Ｉmmunol．Ｔoday、１１、２１１〜６；Ｈarding，Ｆ.Ａ．等(１９９２)、Ｎature 、３５６、６０７〜６０９)。ＣＴＬＡ４と名付けられる第２のリガンド はＣＤ２８と相同性であるが、静止Ｔ細胞上では発現せず、Ｔ細胞活性化の後に 生じる(Ｂrunet，Ｊ．Ｆ等(１９８７)、Ｎature、３２８、２６７〜２７０)。ヒ トおよびマウスＣＴＬＡ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、Ｄariavich等 (１９８８)、Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．、１８(１２)、１９０１〜１９０５；Ｂrune t，Ｊ.Ｆ．等(１９８７)、上書；Ｂrunet，Ｊ.Ｆ．等(１９８８)、Ｉmmunol．Ｒ ev． 、１０３、２１〜３６；およびＦreeman，Ｇ.Ｊ．等(１９９２)、Ｊ．Immun ol． 、１４９、３７９５〜３８０１に記載されている。Ｂ７はＣＤ２８に対して より、ＣＴＬＡ４に対してより大きい親和性を有するが(Ｌinsley，Ｐ.Ｓ．等( １９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７４、５６１〜５６９)、ＣＴＬＡ４の機能は 未だ未知である。 Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性はインビトロおよびいくつか のインビボモデル系で示された。この共剌激経路を封鎖するとマウスおよびヒト の系において抗原特異的寛容の発生をもたらす(Ｈarding，Ｆ.Ａ．等(１９９２) 、Ｎature、３５６、６０７〜６０９；Ｌenschow，Ｄ.Ｊ．等(１９９２)、Ｓcie nce 、２５７、７８９〜７９２；Ｔurka，Ｌ.Ａ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl． Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８９、１１１０２〜１１１０５；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１ ９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、６５８６〜６５９０；Ｂ oussiotis，Ｖ．等(１９９３)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７８、１７５３〜１７６ ３)。逆に言えば、Ｂ７陰性のマウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶に 伴うＴ細胞媒介特異的免疫および腫瘍挑戦に対する長い永続的な保護を誘導する (Chen，Ｌ．等(１９９２)、Ｃell、７１、１０９３〜１１０２；Ｔownsend，Ｓ. Ｅ．およびＡllison，Ｊ.Ｐ．(１９９３)、Ｓcienco、２５９、３６８〜３７０ ；Ｂaskar，Ｓ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、５ ６８７〜５６９０)。従って、Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を操作するとヒ トにおける免疫応答を刺激し、または抑制する大きい可能性を提供する。 発明の概要 本発明はＴ細胞活性化を共刺激する新規な分子をコードする単離された核酸に 関する。好ましい共刺激分子にはＢリンパ球、専門的な抗原提示細胞(例えば単 球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、および免疫細胞に抗原を提示し、ＣＴＬ Ａ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方、または他の既知のもしくは 未だ定義されていない免疫細胞上の受容体に結合する他の細胞(例えばケラチノ サイト、内皮細胞、神経膠星細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞)の表面上の抗原 を含む。そのような共剌激分子は、本明細書ではＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合性カ ウンターレセプターまたはＢリンパ球抗原と呼び、活性化されたＴ細胞に共刺激 を与え、それによってＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン分泌を誘導する ことができる。好ましいＢリンパ球抗原には、Ｂ７−２およびＢ７−３、並びに ＣＴＬＡ４および/またはＣＤ２８を結合し、免疫細胞の共剌激を阻害し、また は誘導する能力を有するそれらの可溶性フラグメントまたは誘導体を含む。一態 様では、ヒトＢ７−２Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする単離 された核酸を提供する。好ましくはその核酸は、図８(配列番号１)に示す。ヒト Ｂ７−２をコードするヌクレオチド配列を有するcＤＮＡ分子である。他の態様 ではその核酸は、図１４(配列番号２２)に示す、ミュリン(murine)Ｂ７−２をコ ードするヌクレオチド配列を有するcＤＮＡ分子である。 本発明は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列、また は図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％、より好まし くは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の相同性であるペプ チドをコードする核酸に関する。Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示す アミノ酸配列、または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列と少なくとも約 ８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５ ％、最も好ましくは少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の相同性であ るペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内にある。他の態様では、Ｂ７−２ 活性を有するペプチドは、図８(配列番号２)のアミノ酸配列を有するペプチド、 または図１４(配列番号２３)のアミノ酸を有するペプチドをコードする核酸に、 高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイズする核酸によりコードさ れる。 本発明はさらに、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基長を有 するペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸に関する。Ｂ７−２活 性を有し、長さで少なくとも４０のアミノ酸残基、少なくとも６０のアミノ酸残 基、少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸残基、または 少なくとも２００以上のアミノ酸残基よりなるペプチドも本発明の範囲内である 。 特に好ましい核酸は、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基また は以上の長さ、および図８(配列番号２)に示す配列と少なくとも５０％または以 上の相同性(好ましくは少なくとも７０％)を有するペプチドをコードする。 １つの好ましい態様では、本発明はＢ７−２活性を有し、および式： Ｘn−Ｙ−Ｚm によって表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたＤＮ Ａに関する。 式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５より本質 的になる。ＸnおよびＺmは、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに 隣接するアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基である。Ｘnは、図８(配列番 号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択される、 すなわち、アミノ酸残基２３〜１から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは図 ８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から 選択される、すなわち、アミノ酸残基２４６〜３２９から選択されるアミノ酸残 基である。式においてnは０〜２３の数であり(n＝０〜２３)、mは０〜８４の数 である(m＝０〜８４)。特に好ましいＤＮＡは、Ｙが図８(配列番号２)に示す配 列のアミノ酸残基２４〜２４５であり、n＝０、m＝０である、式Ｘn−Ｙ−Ｚmに より表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。 本発明は、Ｂ７−２活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配 列、および第１のペプチドの溶解性、結合親和性、安定性、価数を変化させる部 分に対応する第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、Ｂ７−２融 合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡにも関する。好ましくは、Ｂ７−２ 活性を有する第１ペプチドは、Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメイン部分(例え ば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含み、第２ペ プチドは、免疫グロブリンの定常領域、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領 域を含むヒトのＣγ１またはＣγ４ドメインであり、Ｂ７−２免疫グロブリン融 合タンパク質(Ｂ７−２Ｉg)を形成する(Ｃapon等(１９８９)、Ｎature、３３７ 、５２５〜５３１、およびＣapon，米国特許第５,１１６,９６４号参照)。 本発明により得られる核酸を様々な発現ベクターに挿入し、様々な宿主、特に 哺乳類および昆虫細胞培養などの真核生物細胞、およびＥ．Ｃoli等の原核生物 細胞中で対応するタンパク質またはペプチドを合成させる。本発明の範囲にある 発現ベクターは、本明細書に記載した新規なＢリンパ球抗原の活性を有する少な くとも１つのペプチドをコードする核酸、およびその核酸配列に作動可能に結合 したプロモータを含む。一態様において、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の活性 を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および以前にキャラクタライズされたＢ ７活性化抗原(本明細書でＢ７−１と呼ぶ)等の他のＢリンパ球抗原の活性を有す るペプチドをコードするＤＮＡを含む。そのような発現ベクターは、宿主細胞を トランスフェクションし、それによって、本明細書に記載した核酸によりコード される、融合タンパク質を含むタンパク質またはペプチドを製造するのに使用で きる。 Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２およびＢ７−３を発現するＢ細胞の存在についての生 物学的試料を分析するのに有用な核酸プローブも本発明の範囲にある。 本発明はさらに、Ｂ７−２およびＢ７−３タンパク質抗原を含む、新規なＢリ ンパ球抗原の活性を有する単離したペプチドに関する。Ｂ７−２活性を有する好 ましいペプチドは組換え発現によって作られ、図８(配列番号２)に示すアミノ酸 配列を含む。Ｂ７−２活性を有する他の好ましいペプチドは図１４(配列番号２ ３)に示すアミノ酸配列を含む。Ｂ７−２抗原の活性を有する特に好ましいペプ チドは、患者のＴ細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するのに使用できる、細 胞外ドメイン部分(例えば配列番号２のアミノ酸残基約２４〜２４５)等の成熟形 のタンパク質の少なくとも一部分を含む。Ｂ７−２活性を有する他の好ましいペ プチドは次式により表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。 Ｘn−Ｙ−Ｚm 式中、Ｙは、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図８(配 列番号２)に示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列 のアミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１ ６０〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、図 ８(配列番号２)に示すアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択されるア ミノ酸残基である。式中、ＸnおよびＺmは、アミド結合によりＹに結合した付加 的なアミノ酸残基であり、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣 接するアミノ酸残基から選択される。Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列におい てＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。Ｚm は図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸 から選択されるアミノ酸残基である。式中、nは０〜３０の数であり(n＝０〜３ ０)、mは０〜３０の数である(m＝０〜３０)。 新規なＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有するペプチドを 含む融合タンパク質またはハイブリッド融合タンパク質にも関する。例えば、第 １ペプチドの溶解性、結合親和性、安定性および／または価数を変化させる、免 疫グロブリン定常領域等の第２ペプチドに融合した、新規なＢリンパ球抗原の細 胞外ドメイン部分を含む第１ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一態様 において、Ｃγ１またはＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応する配 列のアミノ酸残基を含む第２ペプチドに結合した、Ｂ７−２タンパク質の細胞外 ドメイン部分のアミノ酸残基を含む第１ペプチドを含んでなる融合タンパク質を 作り、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質を形成する。他の態様においては、Ｂ７−１ 抗原の細胞外ドメイン部分およびＢ７−２抗原の細胞外ドメイン部分を含む第１ ペプチド、およびＣγ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に対応するアミノ酸残基 を含む第２ペプチドを含むハイブリッド融合タンパク質を作る(例えばＬinsley 等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７８３、７２１〜７３０；Ｃapon等(１９ ８９)、Ｎature、３３７、５２５〜５３１；およびＣapon米国特許第５,１１６, ９６４号参照)。 本発明の単離されたペプチドおよび融合タンパク質は、１以上のＢリンパ球抗 原の発現を上方調節(upregulate)または阻害し、または１以上のＢリンパ球抗原 のＴ細胞等の免疫細胞上でのそれらの天然のリガンドへのライゲーションをブロ ックし、それによってインビボでの細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するた めに、患者に投与できる。 本発明の他の態様は、新規Ｂリンパ球抗原のペプチドまたは本明細書に記載す る融合タンパク質に特異的に反応する抗体、好ましくはモノクロナール抗体を提 供する。好ましい抗体は、ハイブリドーマ細胞ＨＦ２.３Ｄ１、ＨＡ５.２Ｂ７お よびＨＡ３.１Ｆ９により製造される抗ヒトＢ７−２モノクロナール抗体である 。これらのハイブリドーマ細胞はＡＴＣＣ寄託番号 (ＨＦ２.３Ｄ１ )、ＡＴＣＣ寄託番号 (ＨＡ５.２Ｂ７)、およびＡＴＣＣ寄託番号 (ＨＡ３.１Ｆ９)でアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション に寄託されている。 本発明のさらなる要旨は、本発明の核酸、特にcＤＮＡを用いて、哺乳動物細 胞の免疫原性を高めることを含む。好ましい態様において哺乳類細胞は、肉腫、 リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、カルチノーマ等の腫瘍細胞、または マクロファージ等の抗原提示細胞であり、これらの細胞をトランスフェクション し、本発明の新規なＢリンパ球抗原活性を有するペプチドを、細胞表面上で発現 させる。Ｂ７−２抗原等のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを発現するマ クロファージは、適当な病原体関連抗原または腫瘍抗原でパルス(pulse)された 場合、Ｔ細胞活性化および免疫剌激を高める、抗原提示細胞として用いることが できる。 哺乳動物細胞を、Ｂ７−２抗原等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプ チドをコードする核酸を含む適当な発現ベクターで半ビボ(ex vivo)でトランス フェクションし、次に宿主の哺乳動物に導入でき、あるいは細胞を遺伝子治療技 術によりその遺伝子でインビボでトランスフェクションできる。例えばＢ７−２ 活性を有するペプチドをコードする核酸を単独で、または他の共刺激性分子をコ ードする核酸と組み合わせてトランスフェクションできる。クラスＩまたはクラ スII ＭＨＣ分子を発現しない腫瘍の免疫原性を高める場合において、本明細書 に記載するＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸でトランス フェクトされるべき哺乳動物細胞中に、適当なクラスＩまたはII遺伝子を付加的 にトランスフェクトすることは有益であるかもしれない。 本発明は、例えば本発明の新規なＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２およびＢ７ −３のＴ細胞上でのそれらの天然のリガンドとの機能的な相互作用をブロックし 、それによってレセプターリガンド対を介して共剌激をブロックすることにより 、患者における一般的な免疫抑制および抗原特異的な寛容を誘導する方法をも提 供する。一態様においては、天然のヒトＢ７−２抗原の、その天然のリガンド( 例えばＣＴＬＡ４およびＣＤ２８)に対する相互作用をブロックするのに用いる ことのできる阻害性分子は、Ｂ７−２結合活性を有するが、免疫細胞を共剌激す る能力を有しない可溶性ペプチド、Ｂ７−２のそのリガンドへの結合をブロック し共刺激シグナルを伝達できない抗体(ブロッキング抗Ｂ７−２抗体等のいわゆ る「ブロッキング抗体」)、本発明の教示に従って製造できるＢ７−２−Ｉg融合タ ンパク質、並びにＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の可溶性形のＢ７−２レセ プターを含む。そのようなブロッキング剤は単独で、または他の共剌激性分子の それらの天然リガンドをブロックする薬剤(例えば抗Ｂ７抗体)と組み合わせて用 いることができる。本明細書に記載する方法によるＴ細胞応答の阻害およびＴ細 胞寛容の誘導は、移植拒絶(固体の器官、皮膚および骨髄)および移植片対宿主病 の予防、特に同種間骨髄移植において、予防的に有用であり得る。本発明の方法 は、自己免疫病、アレルギーおよびアレルギー反応、移植拒絶、および移植片対 宿主病の治療において、治療的にも有用であり得る。 本発明の他の要旨は、Ｂ７−２活性を有するペプチドおよびＢ７−２融合タン パク質等の可溶性の、多価形のＢ７−２タンパク質を含む、刺激性の形のＢ７− ２抗原を用いることによる共刺激性シグナルのＴ細胞への伝達により免疫応答を 上方調節する方法に関する。抗原と共に刺激性形のＢ７−２の運搬は、様々な病 原体に対する予防接種の効果を高めるのに予防的に有用であり、感染中の個別的 な病原体に対する、または腫瘍を有する宿主における腫瘍に対する免疫応答を上 方調節するのに治療的にも有用であり得る。 本発明は、Ｂリンパ球抗原、例えばＢ７−２、Ｂ７−３のそれらのレセプター との相互作用を阻害するか、またはそれらのレセプターを介しての細胞内信号伝 達を妨げることのできる分子を同定する方法にも関する。細胞上でのＢリンパ球 抗原の発現を調節できる分子を同定する方法をも提供する。更に新規なＢリンパ 球抗原によるＴ細胞の共刺激に応じて産生されるサイトカインを同定する方法も 本発明の範囲である。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜Ｂは、媒地、抗ＣＤ３単独、または以下のモノクローナル抗体若しく は組換えタンパク質、αＢ７(１３３、抗Ｂ７−１);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ ２８;コントロールＩg融合タンパク質(ＣＴＬＡ４Ｉgについてのアイソタイプコ ントロール);またはαＢ５(抗Ｂ５、抗Ｂ７−１についてのアイソタイプコント ロール)の存在下での抗ＣＤ−３中で培養された、Ｂ７(Ｂ７−１)でトランスフ ェクトされたＣＨＯ細胞(パネルａ)、または同系の(syngeneic)活性化Ｂリンパ 球(パネルｂ)により提供される共剌激に対する、³Ｈチミジン導入またはＩＬ− ２分泌により評価した、ＣＤ２８⁺Ｔ細胞の応答のグラフ表示である。 図２Ａ〜Ｃは表面免疫グロブリン(sＩg)架橋で活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ ７−１の細胞表面発現のlog蛍光強度のグラフである。全(パネルａ)、Ｂ７−１ 陽性(Ｂ７−１⁺、パネルｂ)およびＢ７−１陰性(Ｂ７−１−、パネルｃ)活性化 Ｂ細胞を、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体(１３３)およびフルオロセインイソチ オシアネート(ＦＩＴＣ)ラベルのヤギ抗マウス免疫グロブリンで染色し、フロー サイトメトリーで分析した。 図３Ａ〜Ｂは、媒地、抗ＣＤ３単独、または以下のモノクローナル抗体若しく は組換えタンパク質、αＢＢ−１(１３３、抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−３);αＢ ７(抗Ｂ７−１);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;コントロールＩg融合タンパク 質またはαＢ５(抗Ｂ５)の存在下での抗ＣＤ３中で培養した、Ｂ７−１⁺(パネル a)またはＢ７−１^-(パネルｂ)活性化同系のＢリンパ球により提供される共剌激 に対する、³Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価される、ＣＤ２８⁺ Ｔ細胞の応答のグラフ表示である。 図４は、分別したＢ７−１⁺およびＢ７−１^-活性化Ｂリンパ球上でのＢ７−１ 、Ｂ７−３および全ＣＴＬＡ４カウンターレセプターの細胞表面発現のグラフ表 示である。 図５は、sＩg架橋により活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１(ＣＴＬＡ４Ｉg およびmＡbsＢＢ−１および１３３)、Ｂ７−３(ＣＴＬＡ４ＩgおよびmＡbＢＢ１ )およびＢ７−２(ＣＴＬＡ４Ｉg)カウンターレセプターの時間的な表面発現のグ ラフ表示である。 図６は、ＭＨＣクラスII架橋により活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１(Ｃ ＴＬＡ４ＩgおよびmＡbsＢＢ−１および１３３)、Ｂ７−３(ＣＴＬＡ４Ｉgおよ びmＡbＢＢ１)、およびＢ７２(ＣＴＬＡ４Ｉg)カウンターレセプターの時間的な 表面発現のグラフ表示である。 図７Ａ〜Ｂは、媒地、抗ＣＤ３単独、または次のモノクローナル抗体若しくは 組換えタンパク質、αＢ７(１３３、抗Ｂ７−１);αＢＢ１(抗Ｂ７−１、抗Ｂ７ −３);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;およびαＢ５(抗Ｂ５)の存在下での抗Ｃ Ｄ３中で培養された、２４時間(パネルａ)または４８時間(パネルｂ)、sＩg架橋 により活性化された同系のＢリンパ球により提供される剌激に対する、³Ｈ−チ ミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価される、ＣＤ２８⁺Ｔ細胞の応答のグ ラフ表示である。 図８はヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２のヌクレオチド配列および推定されたアミ ノ酸配列である(hＢ７−２−クローン２９)。 図９は、コントロールmＡb(ＩgＭ)、抗Ｂ７−１(mＡbs１３３およびＢＢ−１) 、組換えタンパク質ＣＴＬＡ４Ｉg、またはアイソタイプのマッチしたコントロ ールＩgタンパク質に続く適当な第２のＦＩＴＣラベルの免疫グロブリンで染色 し、フローサイトメトリーで分析した、コントロールプラスミド(pＣＤＮＡＩ、 Ｂ７−１を発現するプラスミド(Ｂ７−１)、またはＢ７−２を発現するプラスミ ド(Ｂ７−２)でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のグラフ表示である。 図１０Ａ〜Ｂは、刺激されない、および抗Ｉg活性化ヒト脾Ｂ細胞および細胞 系(パネルa)およびヒトミエローマ(パネルＢ)中のＢ７−２発現のＲＮＡブロッ ト分析を示す。 図１１は、ベクター単独またはＢ７−１またはＢ７−２の発現を指向するベク ターでトランスフェクトされたフォルボールミリスチン酸(ＰＭＡ)およびＣＯＳ 細胞でのサブミトジェニック(submitogenic)剌激に対する、³Ｈ−チミジン導入 またはＩＬ−２分泌により評価した、ＣＤ２８⁺Ｔ細胞の増殖のグラフ表示であ る。 図１２は、ベクター単独(ベクター)、またはＢ７−１(Ｂ７−１)若しくはＢ７ −２(Ｂ７−２)を発現するベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞、およ びＰＭＡによる刺激に対する、³Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評 価した、ＣＤ２８⁺Ｔ細胞の増殖の組換えタンパク質およびmＡbsによる阻害のグ ラフ表示である。阻害の研究は、ＰＭＡ刺激ＣＯＳ細胞混合ＣＤ２８⁺Ｔ細胞へ の、抗体添加なし(no mＡＢ)、抗Ｂ７mＡb１３３(１３３)、抗Ｂ７mＡbＢＢ− １(ＢＢ１)、抗Ｂ５mＡb(Ｂ５)、抗ＣＤ２８のＦabフラグメント(ＣＤ２８Ｆab) 、ＣＴＬＡ４Ｉg(ＣＴＬＡ４Ｉg)、またはＩgコントロールタンパク質(コントロ ールＩg)の添加で行った。 図１３は、ヒトＢ７−２タンパク質(hＢ７−２)推定アミノ酸配列(配列番号２ )並びにヒトＢ７−１タンパク質(hＢ７−１)(配列番号２８および２９)およびミ ュリンＢ７−１タンパク質(mＢ７)(配列番号３０および３１)の両方のアミノ酸 配列間の配列相同性を示す。 図１４は、マウスＢ７−２抗原(mＢ７−２)のヌクレオチド配列および推定さ れるアミノ酸配列(配列番号２２および２３)である。 図１５は、Ｂ７ファミリー−Ｉg融合タンパク質による、固定化Ｂ７−２Ｉgに 対するビオチニル化ＣＴＬＡ４Ｉgの結合の競合的阻害のグラフ表示である。競 合物として調べたＩg融合タンパク質は、全長Ｂ７−２(hＢ７.２)、全長Ｂ７− １(hＢ７.１)、Ｂ７−２の可変領域様ドメイン(hＢ７.２Ｖ)、またはＢ７−２の 定常領域様ドメイン(hＢ７.２Ｃ)である。 図１６Ａ〜Ｂは、ラベルしないＢ７−１−Ｉg(パネルＡ)またはＢ７−２−Ｉg (パネルＢ)の濃度を増加させることによる、固定化ＣＴＬＡ４−Ｉgに対するビ オチニル化Ｂ７−１−Ｉg(パネルＡ)またはＢ７−２−Ｉg(パネルＢ)の結合の競 合的阻害のグラフ表示である。実験的に決定したＩＣ₅₀値を、パネルの上右隅に 示す。 図１７は、抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＡ３.１Ｆ９で染色した細胞の フローサイトメトリープロファイルを示す。抗体で染色した細胞(３Ｔ３−ｈＢ ７.２)は、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトされたＣＨＯ細胞(Ｃ ＨＯ−hＢ７.２)、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ｈＢ７.２)、およびコントロールのトランスフェクトされ たＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コント ロールとして用いた。 図１８は、抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＡ５.２Ｂ７で染色した細胞の フローサイトメトリープロファイルを示す。その抗体で染色した細胞は、ヒトＢ ７−２を発現するようトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒ トＢ７−２を発現するようトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−hＢ ７.２)、およびコントロールのトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３ ーネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。 図１９は、抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＦ２.３Ｄ１で染色した細胞の フローサイトメトリープロファイルを示す。該抗体で染色した細胞は、ヒトＢ７ −２を発現するようトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒト Ｂ７−２を発現するようトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−hＢ７ .２)、およびコントロールのトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３− ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。 図２０は、Ｂ７−１(Ｊ５５８−Ｂ７.１)またはＢ７−２(Ｊ５５８−Ｂ７.２) を発現するようトランスフェクトしたＪ５５８形質細胞腫細胞、またはＪ５５８ 形質細胞腫細胞の移植後のマウス中の腫瘍細胞の成長(腫瘍の大きさで測定)のグ ラフ表示である。 発明の詳細な記載 以前にキャラクタライズされたＢリンパ球活性化抗原Ｂ７(本明細書ではＢ７ −１と呼ぶ)の外に、ヒトＢリンパ球はＴ細胞活性化を共刺激する他の新規な分 子を発現する。これらの共刺激性分子は、Ｂリンパ球、専門的な抗原提示細胞( 例 えば単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、および免疫細胞に抗原を提示し、 ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方、または他の既知のも しくは未だ定義されていない免疫細胞上の受容体に結合する他の細胞(例えば角 化細胞、内皮細胞、神経膠星細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞)の表面上の抗原 を含む。本発明の範囲内の共剌激性分子を本明細書では、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８ リガンド(カウンターレセプター)またはＢリンパ球抗原と呼ぶ。活性化されたＴ 細胞に共刺激を与えて、それにより、Ｔ細胞の増殖および／またはサイトカイン 分泌を誘導する新規なＢリンパ球抗原は、本明細書に記載し、キャラクタライズ するＢ７−２(ヒトおよびミュリン)およびＢ７−３抗原を含む。 Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２は、抗免疫グロブリンまたは抗ＭＨＣクラスIIモノク ロナール抗体のいずれかによる剌激の後、約２４時間にヒトＢ細胞により発現さ れる。Ｂ７−２抗原は検出可能なＩＬ−２分泌およびＴ細胞増殖を誘導する。活 性化後約４８〜７２時間において、ヒトＢ細胞はＢ７−１、およびＢ７−１をも 結合する、モノクロナール抗体ＢＢ−１により同定された、第３のＣＴＬＡ４カ ウンターレセプター、Ｂ７−３の両方を発現する(Ｙokochi，Ｔ．等(１９８２) 、Ｊ．Ｉmmunol．、１２８、８２３〜８２７)。Ｂ７−３抗原は、Ｂ７−１陰性 の活性化されたＢ細胞上でも発現され、検出可能なＩＬ−２の産生なしにＴ細胞 増殖を共刺激し、このことはＢ７−１およびＢ７−３分子は別のものであること を示す。Ｂ７−３は活性化されたＢ細胞、活性化された単球、樹状細胞、ランゲ ルハンス細胞、および角化細胞を含む様々な細胞上で発現される。Ｂ細胞活性化 後７２時間において、Ｂ７−１およびＢ７−３の発現は衰え始める。活性化Ｂリ ンパ球表面上のこれらの共剌激性分子の存在は、Ｔ細胞共刺激がＢ細胞活性後こ れらの分子の一時的発現により部分的に制御されていることを示す。 従って、本発明の要旨の一つは、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２、そのような核酸 のフラグメント、またはそれらの均等物等の新規な共刺激性分子をコードするヌ クレオチド配列を含む単離された核酸に関する。本明細書で用いる「核酸」という 語は、そのようなフラグメントまたは均等物を含むことを意図する。「均等物」と いう語は、新規なＢリンパ球抗原の活性(すなわち、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４およ び／またはＣＤ２８等の免疫細胞上のＢリンパ球抗原の天然のリガンドに結合し 、免疫細胞共刺激を阻害（例えばブロック）し、または刺激（例えば高める）す る能力)を有する、機能的に均等なＢリンパ球抗原、または機能的に均等なペプ チドをコードするヌクレオチド配列を含むことを意図する。そのような核酸は図 ８に示したヒトＢ７−２ヌクレオチド配列(配列番号１)および図１４に示したミ ュリンのＢ７−２ヌクレオチド配列(配列番号２２)の均等物と考えられ、本発明 の範囲内にある。 一態様において、核酸はＢ７−２ Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドを コードするcＤＮＡである。好ましくは核酸は、図８に示すヒトＢ７−２をコー ドするヌクレオチド配列(配列番号１)の少なくとも一部分、または図１４(配列 番号２)に示すミュリンＢ７−２をコードするヌクレオチド配列(配列番号２２) の少なくとも一部分よりなるcＤＮＡ分子である。図８(配列番号１)または図１ ４(配列番号)のcＤＮＡ分子の好ましい部分は分子のコーディング領域を含む。 他の態様においては本発明の核酸は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２) または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。 好ましい核酸は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列と 少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約６０％の相同性、お よび最も好ましくは少なくとも約７０％の相同性を有するペプチドをコードする 。Ｂ７−２活性を有し、図８に示す配列(配列番号２)と少なくとも約９０％、よ り好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の 相同性を有するペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内である。相同性とは Ｂ７−２等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有する２つのペプチド間、または２ つの核酸分子間の配列類似性を言う。相同性は、比較の目的に一列に並べた各配 列中の位置を比較することにより決定できる。比較される配列中のある位置が同 じヌクレオチド塩基またはアミノ酸によって占められている場合には、それらの 分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度(パーセント)は配列によっ て共有された、マッチングした、または相同な位置の数の関数である。 本発明の他の態様は、図８に示すアミノ酸配列(配列番号２)のすべて、または 一部を有するペプチド、または図１４に示すアミノ酸配列(配列番号２３)のすべ てまたは一部を有するペプチドをコードする核酸に高または低ストリンジェンシ ィ条件下にハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーション を促進する適当なストリンジェンシィ条件、例えば約４５℃での６.０×塩化ナ トリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)、その後の５０℃での２.０×ＳＳＳ洗 浄)は当業者に知られており、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecnlar Ｂiolog y、Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons、ニューヨーク(１９８９)、６.３.１〜６.３.６ に見出すことができる。例えば洗浄工程における塩濃度は、約２.０×ＳＳＣ(５ ０℃)という低ストリンジェンシィから約０.２×ＳＳＣ(５０℃)という高ストリ ンジェンシィまで選択できる。更に洗浄工程における温度は室温、約２２℃の低 ストリンジェンシィ条件から、約６５℃の高ストリンジェンシィ条件まで選択す ることができる。 新規なＢリンパ球抗原を有するペプチドをコードし、遺伝コードにおける縮重 のため、図８(配列番号１)または図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列 と異なる配列を有する単離された核酸も本発明の範囲内にある。そのような核酸 は機能的に均等なペプチド(例えばＢ７−２活性を有するペプチド)をコードする が、遺伝コードにおける縮重のため、図８または図１４の配列とは配列が相異す る。例えば多くのアミノ酸は１以上のトリプレットにより指定される。同じアミ ノ酸を示すコドン、すなわち同義語(例えばＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに ついての同義語である)は、遺伝コードにおける縮重のため生じる。一例として 、Ｂ７−２のヌクレオチド配列内部のＤＮＡ配列多形性（特にコドンの３番目の コドン内部の）はコードされたアミノ酸に影響しないＤＮＡ配列における「サイ レント」な変異を生じるかも知れない。しかしながら、Ｂ７−２抗原のアミノ酸 配列の変化を生じるＤＮＡ配列多形性が集団内部に存在するであろうことが予期 される。新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸の１以 上のヌクレオチドにおけるこれらの変異（ヌクレオチドの約３〜４％までの）が 、天然のアレル変異のため集団内部の個々のものの間に存在し得ることは当業者 に 認識されるであろう。どのような、そしてすべてのそのようなヌクレオチド変異 体およびその結果生じるアミノ酸多形体も本発明の範囲である。さらに、本明細 書に記載する新規なＢリンパ球抗原の１以上のアイソ型、または関連する交差反 応性(cross−reacting)ファミリーのメンバーも存在し得る。そのようなアイソ 型またはファミリーメンバーは、Ｂリンパ球抗原(例えばＢ７−２抗原)に機能お よびアミノ酸配列において関連するが、異なる場所の遺伝子によるコードされた タンパク質と定義する。 新規なＢリンパ球抗原をコードする核酸の「フラグメント」は、Ｂリンパ球抗原 の全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有し 、Ｂリンパ球抗原の活性(すなわち、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ ２８等の、免疫細胞上のＢリンパ球抗原の天然リガンドへ結合し、免疫細胞共剌 激を刺激するか阻害する能力)を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列 と定義する。従って、Ｂ７−２活性を有するペプチドは、ＣＴＬＡ４および／ま たはＣＤ２８を結合し、例えば一次活性化シグナルを受け取ったＴ細胞によるサ イトカイン分泌産生および／またはＴ細胞増殖により実証されるような、Ｔ細胞 媒介免疫応答を刺激し、または阻害する。一態様においては、該核酸フラグメン トは、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合する抗原の能力を保持し、共剌 激性シグナルをＴリンパ球に運ぶＢ７−２抗原のペプチドをコードする。他の態 様では、該核酸フラグメントはヒトＢ７−２抗原の細胞外部分(例えば図８(配列 番号２)に示される配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含み、ＣＴＬＡ４およ び／またはＣＤ２８を結合し、一価形では共刺激を阻害し、または多価形では共 刺激を誘導し、もしくは高めるのに用いることができるペプチドをコードする。 好ましい核酸フラグメントは、長さで少なくとも２０のアミノ酸残基、好まし くは少なくとも４０のアミノ酸残基、そしてより好ましくは少なくとも６０のア ミノ酸残基よりなるペプチドをコードする。長さで少なくとも８０のアミノ酸残 基、少なくとも１００のアミノ酸残基、および少なくとも２００またはそれ以上 のアミノ酸残基よりなるペプチドをコードする核酸フラグメントも本発明の範囲 内である。特に好ましい核酸フラグメントは、式： Ｘn−Ｙ−Ｚm によって表わされるアミノ酸配列と、ヒトＢ７−２活性を有するペプチドをコー ドする。式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を 含んでなり、ＸnおよびＺmはアミド結合によりＹに結合した更なるアミノ酸残基 である。ＸnおよびＺmは図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列中のＹに隣接する アミノ酸残基から選択される。式中、Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列におい てＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸、すなわちアミノ酸残基２３〜１から選択 されるアミノ酸残基である。Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列のＹのカルボキ シ末端に隣接するアミノ酸、すなわちアミノ酸残基２４６〜３２９から選択され るアミノ酸残基である。更に、式中、nは０〜２３の数であり(n＝０〜２３)、m は０〜８４の数である(m＝０〜８４)。特に好ましいペプチドは、n＝０、m＝０ である上記の式Ｘn−Ｙ−Ｚmにより表わされるアミノ酸配列を有する。 本発明の範囲内の核酸フラグメントは、本明細書に記載したＢリンパ球と交差 反応性(cross−reacting)の新規タンパク質を検出するためスクリーニングプロ トコールにおいて使用するための、他の動物種からの核酸とハイブリダイズする ことができるものを含む。これら、および他のフラグメントは以下に詳細に記載 する。一般にＢリンパ球抗原のフラグメントをコードする核酸は、成熟タンパク 質をコードする塩基から選択するが、いくつかの場合には、ヌクレオチド配列の リーダー配列または非コード部分からのフラグメントのすべて、または部分を選 択するのが好ましい。本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、修飾された制限 エンドヌクレアーゼ部位、および分子クローニング、組換えタンパク質の発現ま たは構成に有用な他の配列、またはそれらのフラグメントをも含み得る。核酸配 列のこれら、および他の修飾は以下に詳細に記載する。 Ｂ７−２抗原のような新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコード する核酸は、活性化されたＢリンパ球に存在するmＲＮＡから得ることができる 。Ｂリンパ球抗原をコードする核酸配列をＢ細胞ゲノムＤＮＡから得ることも可 能であろう。例えば、Ｂ７−２抗原をコードする遺伝子を、本明細書に記載する プロトコールに従ってcＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローンできる。 Ｂ ７−２抗原をコードするcＤＮＡは適当な細胞系からの全mＲＮＡを単離すること により得ることができる。次に、２本鎖cＤＮＡを全mＲＮＡから調製できる。次 に、多くの公知の技術のいずれか一つを用いてそのcＤＮＡを適当なプラスミド またはウイルス(例えばバクテリオファージ)ベクターに挿入できる。新規なＢリ ンパ球抗原をコードする遺伝子は、本発明により提供されるヌクレオチド配列情 報に従い、確立されたポリメラーゼチエインリアクション技術を用いてクローン することもできる。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましい核 酸は、図８(配列番号１)に示す配列を有するヒトＢ７−２抗原をコードするcＤ ＮＡである。他の好ましい核酸は図１４(配列番号２２)に示す配列を有するミュ リンＢ７−２抗原をコードするcＤＮＡである。 本発明は更に、少なくとも１つの制御配列に作動可能に結合した、本明細書に 記載の新規Ｂリンパ球抗原の活性を有する少なくとも１つのペプチドをコードす る核酸を含む発現ベクターに関する。「作動可能に結合した」とは、該核酸配列が 、その発現を可能にするような方法で制御配列に結合されている(例えばシスま たはトランスで)ことを意味することを意図する。制御配列は当業界で知られて おり、適当な宿主細胞中での所望のタンパク質の発現を指示するよう選択する。 従って、制御配列という語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節 因子を含む。そのような制御配列は当業者に知られており、Goeddel、Gene Exp ression Technology、Ｍethods in Ｅnzymology、Ａcademic Ｐress、サン ディエゴ、カリフォルニア(１９９０)に記載されている。発現ベクターのデサイ ンは、トランスフェクトされる宿主の選択、および／または発現されるよう望ま れるタンパク質のタイプに依存することが理解されるべきである。一態様におい ては発現ベクターは、細胞外ドメイン部分等のＢ７−２タンパク質の少なくとも 一部をコードする核酸を含む。他の態様では、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の 活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、およびＢ７−１等の他のＢリンパ球 抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含む。ヒトＢ７−１およびマ ウスＢ７−１抗原をコードするcＤＮＡは配列番号２８および配列番号３０にそ れぞれ示される。これらの抗原の推論されたアミノ酸配列は、配列番号２９およ び配列番号３１にそれぞれ示される。そのような発現を用いて、細胞をトランス フェクトし、それによって、本明細書に記載した核酸配列によりコードされる融 合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを製造すること ができる。これ等および他の態様は本明細書に更に詳細に記載する。 本発明は、新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを製造する方法にも 関する。例えばＢ７−２タンパク質の活性を有するペプチドをコードするヌクレ オチド配列の発現を指向する核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を 適当な条件下に培地中で培養し、ペプチドを発現させることができる。更に、Ｂ ７−２の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および第２のＢリンパ球抗 原(例えばＢ７−１、Ｂ７−３)の活性を有するペプチド等の他のペプチドをコー ドするＤＮＡを含む１以上の発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクト し、これらのペプチドを共発現させるか、または融合タンパク質またはペプチド を製造できる。一態様では、Ｂ７−２融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む 組換え発現ベクターを製造できる。Ｂ７−２融合タンパク質は、Ｂ７−２活性を 有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１のペプチドの 溶解性、親和性、安定性または価数を変化させる部分に対応する第２のペプチド 、例えば免疫グロブリン定常領域、をコードするヌクレオチド配列の組換え発現 により製造できる。好ましくは第１のペプチドは、ヒトＢ７−２抗原の細胞外ド メインの部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４ ５)よりなる。第２のペプチドは、免疫グロブリン定常領域、例えばヒトＣγ１ ドメインまたはＣγ４ドメイン(例えばヒトＩgＣγ１またはヒトＩgＣγ４のヒ ンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、Ｃapon等の米国特許第５,１１６,９６４号参照 、同特許は本明細書の一部を構成する)を含む。生じるＢ７−２Ｉg融合タンパク 質は、変化したＢ７−２の溶解性、結合親和性、安定性、および／または価数( すなわち分子あたり利用できる結合部位の数)を有し得、タンパク質精製の効率 を増加させ得る。組換え技術により製造された融合タンパク質およびペプチドは 分泌され、細胞および該タンパク質またはペプチドを含む培地の混合物から単離 し得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは細胞質に保持され、細胞を収穫 し、溶菌 し、タンパク質を単離し得る。細胞培養は典型的には、宿主細胞、培地、および 他の副生物を含む。細胞培養用の適当な培地は当該技術分野で周知である。タン パク質およびペプチドは、当該技術分野で知られたタンパク質およびペプチド精 製技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、または両者から単離できる。宿主細 胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製する技術は本明細書 に更に詳細に記載する。 特に好ましいヒトＢ７−２Ｉg融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域に 結合したヒトＢ７−２の細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインを含む。 免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン構造に固有なエフェクター活性を減 少させ、または失くす遺伝的修飾を含んでもよい。例えば、ヒトＢ７−２(hＢ７ −２)の細胞外部分をコードするＤＮＡも、ヒトＢ７−２の可変領域様ドメイン( hＢ７.２Ｖ)またはヒトＢ７−２の定単領域様ドメインをコードするＤＮＡも、 部位指定突然変異誘発により修飾されたヒトＩgＣγ１および／またはＩgＣγ４ のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合され得る。これら の融合タンパク質の製造およびキャクタリゼーションは実施例７に詳細に記載す る。 細胞の表面に１以上のＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有 するペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞も、本発明の範囲内である 。一態様においては、ＣＯＳ細胞等の宿主細胞が、細胞の表面でのＢ７−２活性 を有するペプチドの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトされる。そ のようなトランスフェクトされた宿主細胞は、Ｂ７−２をＴ細胞上でそのカウン ターレセプターに結合することを阻害し、あるいはＢ７−２相互作用に応答する Ｔ細胞への共剌激の分子内信号伝達を妨げる分子を同定する方法に使用できる。 他の態様では、肉腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、カルチノーマまたは神経芽細 胞腫等の腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面上での新規なＢリンパ球抗原の活性を有する 少なくとも１つのペプチドの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトす る。ある場合には、腫瘍細胞をトランスフェクトし、主要組織適合遺伝子複合体 (ＭＨＣ)タンパク質、例えばＭＨＣクラスIIαおよびβ鎖タンパク質またはＭＨ ＣクラスＩα鎖タンパク質、および必要ならβ２ミクログロブリンタンパク質を 共 発現させることも有益である。そのようなトランスフェクトされた腫瘍細胞を用 いて患者における腫瘍免疫性を誘導することができる。これらのおよび他の態様 は本明細書に更に詳細に記載する。 本発明の核酸配列は標準的な技術を用いて化学的に合成することもできる。ポ リデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法は、ペプチド合成と同様 に、商業的に利用できるＤＮＡ合成機において完全に自動化された固相合成を含 め、知られている(Ｉtakura等、米国特許第４,５９８,０４９号;Ｃaruthers等、 同第４,４５８,０６６号;およびＩtakura等同４,４０１,７９６号および第４,３ ７３,０７１号参照、これらの特許は本明細書の一部を構成する。)。 本発明の他の要旨は、新規なＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活 性を有する単離されたペプチドに関する。Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチ ドは、図８(配列番号２)に示すヒトＢ７−２配列、または図１４(配列番号２２) に示すミュリンＢ７−２配列等のＢリンパ球抗原とはアミノ酸配列は異なっても よいが、そのような相異はＢリンパ球抗原と同じ、または類似の方法で機能し、 またはＢリンパ球抗原と同じまたは類似の特徴を有するペプチドを生じる。例え ばＢ７−２タンパク質の活性を有するペプチドは、Ｔ細胞上のＣＬＴＡ４および ／またはＣＤ２８等の、免疫細胞上のＢ７−２タンパク質の天然のリガンドに結 合し、免疫細胞共剌激を剌激し、または阻害する能力を有するペプチドと本明細 書において定義する。従ってＢ７−２活性を有するペプチドはＣＴＬＡ４および ／またはＣＤ２８に結合し、Ｔ細胞媒介免疫応答を剌激し、または阻害する(例 えば１次活性化シグナルを受けたＴ細胞によるサイトカイン産生および／または 増殖により証拠づけられる)。１態様はＢ７−２結合活性を有するが、共刺激シ グナルをＴ細胞に伝達する能力を欠いたペプチドを提供する。そのようなペプチ ドは患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌を阻害しまたはブ ロックするのに用いることができる。或いは、Ｂ７−２結合活性およびＴ細胞に 共刺激シグナルを伝達する能力の両方を有するペプチドは患者におけるＴ細胞増 殖および／またはサイトカイン分泌を剌激し、または高めるのに用いる。これら の、および他の機能的に均等なペプチドを産生するＢ７−２タンパク質の様々な 修飾は本明細書に詳細に記載する。本明細書で用いる「ペプチド」の語は、ペプチ ド、タンパク質、およびポリペプチドを言う。 Ｂ７−２の機能(すなわちＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合し、およ び／またはＴ細胞共刺激を剌激し、または阻害するＢ７−２の能力)に直接関与 しないアミノ酸残基の置換、付加、または削除などの、図８(配列番号２)に示す ヒトＢ７−２タンパク質、または図１４(配列番号２３)に示すミュリンＢ７−２ タンパク質のアミノ酸配列の修飾によりペプチドを製造できる。本発明のペプチ ドは、典型的には長さで少なくとも２０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも ４０のアミノ酸残基、最も好ましくは６０のアミノ酸残基である。Ｂ７−２の活 性を有し、長さで少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸 残基、または少なくとも２００またはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプチド も本発明の範囲にある。好ましいペプチドは、ヒトＢ７−２抗原の細胞外ドメイ ン部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含 む。他の好ましい配列は、式： Ｘn−Ｙ−Ｚm (式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図(配列番 号２)を示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列のア ミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１６０ 〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、および 図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択 されるアミノ酸残基である。) によって示されるアミノ酸配列を有する。該式中、ＸnおよびＺmはアミド結合に よりＹに結合した付加的なアミノ酸残基である。ＸnおよびＺmは、図８(配列番 号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣接するアミノ酸より選択されるアミノ 酸残基である。Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣 接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは、図８(配列番号２) に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミ ノ酸残基である。式中、nは０〜３０の数であり(n＝０〜３０)、mは０〜３０の 数である(m＝０〜３０)。特に好ましいペプチドは、n＝０、およびm＝０である 、式Ｘn−Ｙ−Ｚmによって表されるアミノ酸配列を有する。 本発明の他の態様は、Ｂ７−２またはＢ７−３等の新規なＢリンパ球抗原の活 性を有するペプチドの実質的に純粋な製造物を提供する。そのような製造物は、 該ペプチドが細胞中に天然に共にあり、または細胞により分泌された場合天然に 共にあるタンパク質およびペプチドを実質的に含まない。 本明細書を通じて用いる「単離された」の語は、組換えＤＮＡ技術により製造 される場合には細胞物質または培養培地、化学的に合成させた場合には化学的な 前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、Ｂ７−２等の新規なＢリンパ球 抗原の活性を有する核酸、タンパク質、またはペプチドを言う。単離された核酸 は、該核酸が由来する生物において天然に該核酸の側面にある配列(すなわち該 核酸の５'および３'末端に位置する配列)をも含まない。 本発明のこれらの、および他の要旨は以下に詳細に記載する。Ｉ．細胞株からの核酸の単離 新規なＢリンパ球の活性を有するペプチドをコードする核酸を単離するのに用 いる適当な細胞は、Ｂリンパ球抗原(例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３)をコ ードするmＲＮＡを産生し、そのmＲＮＡを対応するタンパク質にほぼ翻訳するこ とのできる細胞を含む。mＲＮＡの１つの源は、静止、または抗免疫グロブリン 抗体若しくは抗ＭＨＣクラスII抗体により活性化された、或いは腫瘍性のＢ細胞 のサブセットからの通常のヒト脾Ｂ細胞である。ヒトＢ７−２抗原の発現は、静 止Ｂ細胞において、および活性化Ｂ細胞において検出可能であり、mＲＮＡレベ ルは刺激後、静止レベルから４倍増加する。全細胞のＲＮＡは、標準的な技術を 用いて、静止またはこれ等の間隔の間に活性化されたＢ細胞から得ることができ 、cＤＮＡライブラリーの構築に用いることができる。 更に、腫瘍性Ｂ細胞の様々なサブセットはＢ７−２およびＢ７−３を発現し、 cＤＮＡライブラリー構築のためのmＲＮＡ源として代わりに役立つ。例えば非ホ ジキンスリンパ腫を有する患者から単離された腫瘍細胞はＢ７−１mＲＮＡを発 現する。結節性(nodular)の、あまり分化していないリンパ腫(ＮＰＤＬ)からの Ｂ細胞は、大きい細胞リンパ腫(ＬＣＬ)を拡散させ、バーキットリンパ腫細胞系 もヒトＢ７−１mＲＮＡ、および恐らくＢ７−２およびＢ７−３mＲＮＡの適当な 供給源であろう。ミエローマはＢ７−２を一般に発現するが、Ｂ７−１mＲＮＡ を発現しないので、Ｂ７−２mＲＮＡの供給源を提供する。バーキットリンパ腫 細胞系ＲajiはＢリンパ球抗原mＲＮＡの一つの供給源である。好ましくはＢ７− ２mＲＮＡは静止および活性化した正常なヒトＢ細胞の両者の集団から得る。活 性化Ｂ細胞は、例えば抗免疫グロブリン抗体、または抗ＭＣＨクラスII抗体を用 い広い範囲の時間(例えば分から日)にわたる刺激により得られる。II．mＲＮＡの単離およびcＤＮＡライブラリーの構築 全細胞mＲＮＡは、様々な技術により、例えばChirgwin等、Ｂiochemistry、１ ８ 、５２９４〜５２９９(１９７９)のグアニジニウム−チオシアネート抽出方法 を用いることにより、単離できる。この方法によれば、Ｐoly(Ａ＋)mＲＮＡを、 オリゴ(dＴ)セルロース選択を用いて、cＤＮＡライブラリー構築における使用の ため調製し、精製する。cＤＮＡをオリゴ(dＴ)プライミングおよび逆転写酵素を 用いて、poly(Ａ＋)ＲＮＡから次に合成する。Ｍoloney ＭＬＶ逆転写酵素(Ｇi bco／ＢＲＬ、ベセスダ、メリーランドから入手できる)、またはＡＭＶ逆転写酵 素(Ｓeikagaku Ａmerica,Ｉnc．，セントピーターズバーグ、フロリダから入手 できる)を好ましくは用いる。 逆転写の後、mＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を通常の技術を用いて２本鎖 ＤＮＡに変換し、適当なベクター中に導入する。ここでの実験は２本鎖cＤＮＡ への変換にはＥ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩおよびリボヌクレアーゼＨを用い る。 cＤＮＡのクローニングは、２本鎖ＤＮＡを適当なベクターと結合するための 従来の技術のいずれかを用いて行うことができる。合成アタプターを用いること が特に好ましい。何故ならそれはクローニング前の制限酵素によるcＤＮＡの解 裂の可能性を緩和するからである。この方法を用い非自己相補体の、カイネース (kinased)したアダプターを、ベクタとのライゲーション前にＤＮＡに付加する 。実際上どのようなアダプタも使用し得る。以下の実施例により詳細に示すよう に、 非自己相補性のＢstＸＩアダプターを、ＢstＸＩ消化によりクローニングのため 調製したpＣＤＭ８ベクタ中へのライゲーションのために、クローニング用のcＤ ＮＡに好ましくは付加する。 真核生物cＤＮＡは、適当な真核細胞プロモーター、複製起点、およびエンハ ンサー、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列、並びにポリアデニ ル化シグナルを含む他の要素を提供するベクター中にセンスオリエンテーション で配置した場合に発現され得る。本発明のcＤＮＡを、原核生物プロモーター、 Ｅ．coli中で機能する複製起点、ＣＯＳ細胞中で増殖を可能にするＳＶ４０複製 起点、およびcＤＮＡ挿入部位を有する適当なベクター中に位置させる。適当な ベクターは、πＨ３(ＳeedおよびＡruffo、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．、８４ 、３３６５〜３３６９(１９８７)),πＨ３m(ＡruffoおよびＳeed、Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci ．、８４、８５７３〜８５７７(１９８７))、pＣＤＭ７およびpＣ ＤＭ８(Ｓeed、Ｎature、３２９、８４０〜８４１(１９８７))を含み、pＣＤＭ ８ベクターが特に好ましい(Ｉnvitrogen、サンディエゴ、カリフォルニアより入 手できる)。III．宿主細胞のトランスフェクションおよび新規なＢリンパ球活性化抗原のス クリーニング かく調製したcＤＮＡライブラリーを用いて、発現クローニング技術により問 題の遺伝子をクローンする。基本的な発現クローニング技術は、ＳeedおよびＡr uffo、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４、３３６５〜３３６９(１９８ ７)、およびＡruffoおよびSeed、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４、 ８５７３〜８５７７(１９８７)に記載されているが、この技術の改変は必要であ り得る。 １態様によれば、プラスミドＤＮＡを公知のトランスフェクション技術(例え ばＤＥＡＥ−デキストラン)を用いて、サルのＣＯＳ細胞株(Ｇluzman、Cell)、２３ 、１７５(１９８１))に導入し、cＤＮＡ挿入物を複製し、発現させる。Ｂ７ −１抗原を発現するトランスフェクタントを、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体( 例えば１３３およびＢ１．１)および抗ミュリンＩgＧおよびＩgＭでコートした イ ムノマグネチックビーズでディプリート(deplete)させる。ヒトＢ７−２抗原を 発現するトランスフェクタントを、そのトランスフェクタントを融合タンパク質 ＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgと反応させ、次いで抗ヒトIg抗体でコートした プレートでパニングすることにより、陽性選択できる。ヒトＣＴＬＡ４Ｉgおよ びＣＤ２８Ｉg融合タンパク質を用いたが、Ｂ７−１および例えばマウスＢ７− １間でクロススピシーズ(cross speciles)反応性があるとすれば、他の交叉反 応性種と反応性の他の融合タンパク質も使用できるであろうことが期待できる。 パニング(panning)後、エピソームＤＮＡをパン化された(panned)細胞から回収 し、コンピテントな細菌宿主、好ましくはＥ．coli．にトランスフォームする。 プラスミドＤＮＡを次にＣＯＳ細胞に再導入し、発現およびパニングのサイクル を少なくとも２回繰返す。最終サイクルの後、プラスミドＤＮＡを個々のコロニ ーから調製し、ＣＯＳ細胞にトラスフェクトし、例えばＣＴＬＡ４ＩgおよびＣ Ｄ２８Ｉgを用いる間接免疫蛍光法により新規なＢリンパ球抗原の発現について 分析する。IV．新規なＢリンパ球抗原の配列決定 ＣＤＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgと強い反応性のこれらのコロニーからプラス ミドを調製する。これらのプラスミドを次に配列決定する。約１.０kb以上のＤ ＮＡのトラクトを配列決定するのに適した従来の配列決定技術のいずれも使用で きる。 実施例４に記載したように、９８７ヌクレオチドよりなるシングルの長いオー プンリーディングフレームおよび３'非コード配列の約２７ヌクレオチドを有す る１,１２０塩基対挿入物を有するヒトＢ７−２クローン(クローン２９)が得ら れた(図８、配列番号１)。タンパク質のオープンリーディングフレームによりコ ードされる予想されるアミノ酸配列を図８のヌクレオチド配列の下に示す。コー ドされたＢ７−２タンパク質は長さで３２９のアミノ酸残基であると予想される (配列番号２)。このタンパク質配列は、他のタイプＩ Ｉgスーパーファミリー 膜タンパク質に共通の多くの特徴を示す。タンパク質翻訳は、コンセンサス真核 生物翻訳開始部位を有する領域におけるＤＮＡ相同性に基づいてメチオニンコド ン(ＡＴＧ、ヌクレオチド１０７〜１０９)で始まると予言される(Ｋozak,Ｍ.(19 87)、Ｎucl．Ａcids Ｒes、１５、８１２５〜８１４８参照)。Ｂ７−２タンパ ク質のアミノ末端(アミノ酸１〜２３)は、位置２３および２４におけるアラニン 間の予想される解裂による分泌シグナルペプチドの特徴を有する(von Ｈeijne( ９８７)、Ｎucl．Ａcids Ｒes．、１４、４６８３)。この部位でのプロセシン グは、約３４kＤaの非修飾分子量を有する３０６アミノ酸のＢ７−２膜結合タン パク質を生じる。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４〜２４５よりなるほぼ 細胞外ＩgスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、アミノ酸残基約２４６〜 ２６８よりなる疎水性の膜貫通ドメイン、およびアミノ酸残基約２６９〜３２９ よりなる長い細胞質ドメインよりなる。Ｉgスーパーファミリーに対する相同性 は位置４０〜１１０および１５７〜２１８におけるシステインにより結合された 細胞外領域における２つの隣接するＩg様ドメインによる。細胞外ドメインは８ つの可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位をも有し、Ｂ７−１と同様に多分グ リコシル化される。ヒトＢ７−２タンパク質のグリコシル化は約５０〜７０kＤa へ分子量を増加させ得る。ヒトＢ７−２の細胞質ドメインは、Ｂ７−１より幾分 長いが、抗原提示細胞(ＡＰＣ)内部で信号伝達または制御ドメインとして多分作 用する多数のシステイン、それに続く正に荷電したアミノ酸よりなる一般的な領 域を含む。ヒトＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ配列の両方の、ＧenＢank およびＥＭＢＬデータベースとの比較は、ヒトＢ７−１とのかなりな相同性(約 ２６％のアミノ配列の同一性)を示した。ヒトＢ７−１、ヒトＢ７−２およびミ ュリンＢ７−１はすべてヒトＣＴＬＡ４およびＣＤ２８に結合するので、相同性 のアミノ酸はＣＴＬＡ４またはＣＤ２８結合配列を含むのに必要なアミノ酸を多 分示す。ヒトＢ７−２をコードするcＤＮＡ挿入物を有するベクターでトランス フェクトされたＥ．coli(クローン２９)は、１９９３年７月２６日に、受託番号 第６９３５７号としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣ Ｃ)に寄託された。Ｖ．他の哺乳動物種からの新規なＢリンパ球抗原のクローニング 本発明はヒト核酸分子に限定されず、Ｂリンパ球抗原を発現する他の哺乳動物 種からの新規なＢリンパ球抗原ホモローグが、以下に記載する技術を用いてクロ ーンされ配列決定されることを意図する。クロススピーシーズ反応性を示す、１ つの種(例えばヒト)について単離されたＢリンパ球抗原を用いて、他の種(例え ばマウス)におけるＴ細胞媒介免疫応答を修飾し得る。他の種からのcＤＮＡクロ ーンの単離はハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトＢ７−２cＤＮＡ等 のヒトcＤＮＡ挿入物を用いて行うこともできる。 実施例６に示すように、９２７のヌクレオチドよりなるシングルの長いオープ ンリーディングフレーム、および３'非コード配列の約１２６ヌクレオチドを有 する１,１６３の塩基対よりなる挿入物を含むミュリンＢ７−２クローン(mＢ７ −２、クローン４)を得た(図１４、配列番号２２)。タンパク質のオープンリー ディングフレームによりコードされる予想されるアミノ酸配列を、図１４のヌク レオチド配列の下に示す。コードされるミュリンＢ７−２タンパク質は、長さで ３０９アミノ酸残基であると予想される(配列番号２３)。このタンパク質は他の タイプＩ Ｉgスーパーファミリー膜タンパク質に共通な多くの特徴を有する。 タンパク質翻訳は、コンセンサス真核生物翻訳開始部位を有する領域におけるＤ ＮＡ相同性に基づいて、メチオニンコドン(ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１〜１１ ３)で開始すると予想される(Ｋozak,Ｍ(１９８７)、Ｎucl．Ａcids Ｒes、１５ 、８１２５〜８１４８を参照)。ミュリンＢ７−２タンパク質のアミノ末端(アミ ノ酸１〜２３)は、位置２３のアラニンおよび位置２４のバリン間の予想される 解裂を有する分泌シグナルペプチドの特徴を有する(von Ｈeijne(１９８７)、Ｎucl．Ａcids．Ｒes ．、１４、４６８３)。この部位でのプロセシングは、約３ ２kＤaの非修飾分子量を有する、２８６のアミノ酸よりなるミュリンＢ７−２膜 結合タンパク質を生じるであろう。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４〜２ ４６のほぼ細胞外ＩgスーパーファミリーＶおよびＣ様領域、アミノ酸残基約２ ４７〜２６５の疎水性膜貫通ドメイン、およびアミノ酸残基約２６６〜３０９の 長い細胞質ドメインよりなるであろう。Ｉgスーパーファミリーに対する相同性 は、位置４０〜１１０および１５７〜２１６におけるシステインにより結合され た細胞外領域における２つの隣接するＩg様領域による。細胞外ドメインは９つ の可 能性のあるＮ−結合グリコシル化領域をも含み、ミュリンＢ７−１と同様、恐ら くグリコシル化されている。ミュリンＢ７−２タンパク質のグリコシル化は約５ ０〜７０kＤまで分子量を増加させ得る。ミュリンＢ７−２の細胞質ドメインは 、ＡＰＣ内部の信号伝達または制御ドメインとして多分機能するシステインに続 く正に荷電したアミノ酸を有する一般的な領域を含む。ミュリンＢ７−２のヌク レオチドおよびアミノ酸配列の両方を、ＧenＢankおよびＥＭＢＬデータベース と比較すると、ヒトおよびミュリンＢ７−１とかなりの相同性(約２６％のアミ ノ酸配列の同一)を示す。ミュリンＢ７−２は、そのヒトホモローグ、hＢ７−２ と約５０％の同一性および６７％の類似性を示す。ミュリンＢ７−２をコードす るcＤＮＡ挿入を含むベクター(プラスミドpmＢx４)でトランスフェクトされたＥ ．coli(ＤＨ１０６／Ｐ３)(クローン６)は、受託番号第６９３８８号として１９ ９３年８月１８日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ) に寄託された。 ミュリンＢ７−２等の、他の種から新規なＢリンパ球抗原をコードする核酸は 、トランスジェニック動物、または「ノックアウト」動物を創出するのに用い得、 その動物は治療的に有用な薬剤の開発およびスクリーニングに有用である。トラ ンスジェニック動物(例えばマウス)は、トランスジーンを有する細胞を有する動 物であり、そのトランスジーンを、動物または出生前の、例えば胚段階の動物の 前身に導入する。トランスジーンはそれからトランスジェニック動物が発生する 細胞のゲノムに結合されるＤＮＡである。一態様においてミュリンのＢ７−２c ＤＮＡまたはその適当な配列を用いて、確立された技術によりゲノムＢ７−２を クローンし、そのゲノム配列を用いてＢ７−２タンパク質を発現する細胞を有す るトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、 特にマウスのような動物、を創出する方法は当該技術分野でありふれたものとな っており、例えば米国特許第４,７３６,８６６号および同４,８７０,００９号に 記載されている。典型的には特別の細胞を組織特異的なエンハンサーを用いてＢ ７−２トランスジーン導入のための目標に定め、Ｔ細胞共刺激および高められた Ｔ細胞増殖および自己免疫性をもたらし得るであろう。胚段階にある動物の生殖 系 列に導入されたＢ７−２トランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物 を用いて増加したＢ７発現の影響を調べることができる。そのような動物は、例 えば自己免疫病からの保護を与えると考えられる薬剤に対するテスター動物とし て用いることができる。本発明のこの要旨に従い、ある動物を薬剤で処理し、ト ランスジーンを有する非処理動物と比べた病気の出現率の減少はその病気に対す る治療的関与の可能性を示すであろう。 或いは、内因性のＢ７−２遺伝子および動物の胚細胞に導入された変化させた Ｂ７−２ゲノムＤＮＡの間の相同的な組換えの結果としてＢ７−２遺伝子の欠陥 または変化を有するＢ７−２「ノックアウト」動物を作るために、Ｂ７−２の非ヒ トホモローグを用いることができる。例えばミュリンＢ７−２cＤＮＡを用いて 、確立された技術に従ってゲノムＢ７−２をクローンすることができる。ゲノム Ｂ７−２ＤＮＡの一部分(例えば細胞外ドメインをコードするエクソン等の)を削 除し、またはインテグレーションをモニターするのに用いる得る選択可能なマー カーをコードする遺伝子のような他の遺伝子で置換し得る。典型的には、変化さ せないフランキングＤＮＡ(５'および３'末端両方での)数キロの塩基をベクター 中に含ませる(例えば、Ｔhomas,Ｋ．ＲおよびＣapecchi,Ｍ．Ｒ．(１９８７)、Ｃell 、５１、５０３の相同的な組換えベクターの記述を参照)。そのベクターを 胚性の幹細胞系に導入し(例えばエレクトロポレーションにより)、導入されたＤ ＮＡが内因性のＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する(例えばＬi,Ｅ等( １９９２)、Ｃell、６９、９１５を参照)。選択した細胞を動物(例えばマウス) の胚盤胞に次に注入し、アグリゲーションキメラを形生する(例えばＢraley、Ｔ eratocarcinomas and Ｅmbryonic Ｓtem Ｃell :Ａ Ｐractical Ａpproach 、Ｅ,Ｊ．Ｒobertson編(ＩＲＬ、Ｏxtord,１９８７)１１３〜１５２頁参照)。キ メラ胚を適当な偽妊娠のメスのフォスター動物に移植し、その胚を折りあわせ、「 ノックアウト動物」を創出する。それらの胚細胞において相同的に組換えたＤＮ Ａを有する後代は標準的な技術により同定でき、動物のすべての細胞が相同的に 組換えられたＤＮＡを有する動物を育てるのに用いることができる。ノックアウ ト動物は、移植片を受容し、腫瘍を拒絶し、および感染性の病気に対し防御する そ れらの能力につきキャラクタライズでき、基本的な免疫生物学の研究に用いるこ とができる。VI．Ｂリンパ球抗原の発現 新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを発現するようトランスフェク トされた宿主細胞も本発明の範囲内である。宿主細胞は原核生物細胞、または真 核生物細胞であり得る。例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、Ｅ．coli等の 細菌細胞、昆虫細胞(バクロウイルス)、酵母、チャイニーズオバリーセル(ＣＨ Ｏ)およびＮＳＯ細胞等の哺乳動物中で発現し得る。他の適当な宿主細胞はＧoed del(１９９０)、上書に見出され、当業者に知られている。 例えば哺乳動物、酵母、または昆虫細胞などの真核生物細胞中での発現は、組 換えタンパク質の部分的または完全なグリコシル化および／または関連する鎖間 または鎖内ジサルファイド結合の形成をもたらし得る。酵母Ｓ．cerivisaeにお ける発現用のベクターの例は、pＹepＳecl(Ｂaldari等(１９８７)、Ｅmbo Ｊ． 、６、２２９〜２３４)、pＭＦa(ＫurjanおよびＨerskowitz(１９８２)、Ｃell 、３０、９３３〜９４３)、pＪＲＹ８８(Ｓchultz等(１９８７)、Ｇene、５４、 １１３〜１２３)およびpＹＥＳ２(Ｉnvitrogen Ｃorporation、サンディエゴ、 カリフォルニア)を含む。培養した昆虫細胞(ＳＦ９細胞)中でタンパク質の発現 に利用できるバクロウィルスベクターは、pＡcシリーズ(Ｓmith等(１９８３)、Ｍol．Ｃell Ｂiol． 、３、２１５６〜２１６５)およびpＶＬシリーズ(Ｌucklo w,Ｖ．Ａ．およびＳummers,Ｍ．Ｄ(１９８９)、Ｖirology、１７０、３１〜３９ )を含む。一般にＣＯＳ細胞(Ｇluzman,Ｙ．(１９８１)、Ｃell、２３、１７５〜 １８２)を、哺乳動物における一時的な増幅／発現のためpＣＤＭ８等のベクター (Ｓeed,Ｂ．(１９８７)、Ｎature、３２９、８４０)と組合せて用い、ＣＨＯ(dh fr^-チャイニーズハムスターオベリー)細胞は、哺乳動物細胞中の安定な増幅／発 現のためにpＭＴ２ＰＣ等のベクター(Ｋaufman等(１９８７)、ＥＭＢＯ Ｊ．、６ 、１８７〜１９５)と共に用いる。組換えタンパク質の製造用の好ましい細胞 株は、ＥＣＡＣＣ(カタログ＃８５１１０５０３)から入手でき、Ｇalfre,Ｇ．お よびＭilstein,Ｃ(１９８１)、Ｍethods in Ｅnzymology、７３(１３)、３〜 ４６およびＰreparation of Ｍonoclonal Ａntibodies:Ｓtrategies and Ｐrocedure 、Ａcademic Ｐress、ニューヨークに記載されているＮＳＯミエロ ーマ細胞株である。ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム 共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチンま たはエレクトロポレーション等の通常の技術により哺乳動物細胞に導入できる。 宿主細胞をトランスホームするのに適した方法は、Ｓambrook等、Ｍolecular Ｃloning:Ａ Ｌaboratory Ｍannual 、第２編、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa boratory press(１９８９)および他の実験室テキストブックに見出すことがで きる。哺乳動物細胞中で用いる場合、発現ベクターの制御機能はウイルス材料に よりしばしば提供される。例えば一般に用いるプロモーターは、ポリオーマ、ア デノウイルスス、サイトメガロウイル、および最もしばしばシミアンウイルス４ ０に由来する。 細胞の少部分(約１／１０⁵)が典型的にはＤＮＡをそれらのゲノムに組込む。 これらの組込体を同定するために、選択可能なマーカー(すなわち抗生物質に対 する抵抗性)を含む遺伝子を、問題の遺伝子と共に宿主細胞に一般に導入する。 好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキ セート等の薬剤に対する抵抗性を与えるものを含む。選択可能なマーカーは問題 の遺伝子と同じプラスミドに導入してもよく、別のプラスミドに導入してもよい 。問題の遺伝子を有する細胞は薬剤選択により同定できる。すなわち選択可能な マーカー遺伝子を導入した細胞は生き残り、他の細胞は死ぬ。生き残った細胞を 、Ｂ細胞抗原に対するリガンド(例えばＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉg)を用い る細胞表面染色により、新規Ｂリンパ球抗原の製造に関して次にスクリーニング し得る。或いは、該タンパク質をラベルしたアミノ酸で代謝的にラベルし、抗Ｂ リンパ球抗原モノクローナル抗体、またはＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の 融合タンパク質で細胞上清液から免疫沈澱させ得る。 原核生物における発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指向する構成 性または誘導性プロモーターを含むベクターを有すＥ．coli中で最もしばしば行 われる。融合ベクターは、発現される標的遺伝子の通常アミノ末端に多くのアミ ノ酸を加える。そのような融合ベクターは、１)組換えタンパク質の発現を増加 させる； ２)標的組換えタンパク質の溶解性を増加させる、および３)アフィニ ティ精製におけるリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精 製を助けるという３つの目的に典型的には役立つ。融合発現ベクターにおいては しばしば、タンパク質分解解裂部位を、融合部分と標的組換えタンパク質の結合 部分に導入し、融合タンパク質の精製後に、融合部分から標的組換えタンパク質 を分離するのを可能にする。そのような酵素、およびそれらの同種認識配列は、 因子Ｘa、トロンビン、およびエンテロキーゼを含む。典型的な融合発現ベクタ ーは、標的組換えタンパク質に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルト ースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合するpＧＥＸ(Ａmrad Ｃorp. 、メルボルン、オーストラリア)、pＭＡＬ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs,ビバリー 、マサチューセッツ)、およびpＲＩＴ５(Ｐharmacia、ピスカタウェイ、ニュー ジャジィ)を含む。 Ｅ．coli．発現系は、誘導性の発現ベクターpＴrc(Ａmann等(１９８８)、Ｇen e 、６９、３０１〜３１５)およびpＥＴ１１(Ｓtudier等、Ｇene Ｅxpression Ｔechnology:Ｍethods in Ｅnzymology 、１８５、Ａcademic Ｐress、サンジ ェゴ、カリホルニア(１９９０)、６０〜８９； Ｎovagen から商業的に入手で きる)を含む。pＴrcベクター系においては挿入された遺伝子を、ハイブリッドtr p−lac融合プロモータからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によるpelＢシグナル 配列と共に発現させる。誘導の後、組換えタンパク質をペリプラズム部画分から 精製できる。pＥＴ１１ベクター系においては、標的遺伝子を、共発現のウイル スＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７gn１０−lac ０融合プロモーター( Ｔ７gnl)からの転写による非融合タンパク質として発現させる。このウイルスポ リメラーゼは、lacＵＶ５プロモーターの転写調節の下Ｔ７gnlを有するレジデン トλプロファージから宿主Ｅ．coli株 ＢＬ２１(ＤＥ３)およびＨＭＳ１７４( Ｄ Ｅ３)により供給される。この系においては組換えタンパク質を変性した形の封 入小体から精製でき、望ましいならステップブラジエント透析により復元して変 性物を除去する。 Ｅ．coli中の組換えＢ７−２発現を最大にする１方策は、組換えタンパク質を タンパク質分解酵素によりより解裂する能力の損なわれた宿主細菌中でタンパク 質を発現することである(Ｇottesman,Ｓ.、Ｇene Ｅxpression Ｔechnology; Ｍethods in Ｅnzymology 、１８５、Ａcademic Ｐress、サンディエゴ、カリ フォルニア(１９９０)、１１９〜１２８)。他の方策は発現ベクターに挿入され るべきＢ７−２遺伝子または他のＤＮＡの核酸配列を、各アミノ酸の個々のコド ンが高度に発現されたＥ．coliタンパク質で優先的に用いられるものであるよう 変化させることであろう(Ｗada等(１９９２)、Ｎuc．Ａcids Ｒes．、２０、２ １１１〜２１１８)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的なＤＮＡ合成 技術により行い得る。 哺乳動物細胞中または他の方法で発現した新規なＢリンパ球抗原およびその部 分は、硫酸アンモニウム沈澱、分別カラムクロマトグラフィー(例えばイオン交 換、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ等)、および究極的に は結晶化を含む。当該技術分野の標準的な方法に従い精製できる(一般的には、 “Ｅnzyme Ｐurification and Ｒelated Ｔechniques”、Ｍethods in Ｅ nzymology 、２２、２３３〜５７７(１９７１)を参照)。部分的にまたは均一にな るまで精製されると、組換え的に製造されたＢリンパ球抗原またはその部分は、 以下に詳細に記載する薬学的投与に適した組成物に使用できる。VII．本発明の核酸およびアミノ酸配列の修飾およびＢ７リンパ球抗原活性の分 析 新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする他の核酸を上記方 法により単離できることは当業者に認識されるであろう。異なった細胞株が異な った塩基配列を有するＤＮＡ分子を生ずことは予期され得る。更に、変異体が遺 伝物質の遺伝的多型性および細胞媒介修飾により存在し得る。更に、Ｂリンパ球 抗原のＤＮＡ配列を遺伝技術を用いて修飾し、変化したアミノ酸配列を有するタ ンパク質またはペプチドを製造し得る。そのような配列は本発明の範囲内である と 考えられ、発現されたペプチドは活性化Ｔ細胞媒介免疫応答および免疫機能を誘 導し、または阻害できる。 多くの方法が単離されたＤＮＡ配列の均等物またはフラグメントを作るのに用 いることができる。Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸の小さいサブ領域また はフラグメント、例えば長さで１〜３０の塩基、を標準的な合成有機化学手段に より調製できる。その技術はＢ７−２ＤＮＡのより大きい合成フラグメントの作 製に用いる、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマーの調製にも有用 である。 Ｂリンパ球抗原をコードする遺伝子のより大きいサブ領域またはフラグメント は、ポリメラーゼチェインリアクション(ＰＣＲ)(Ｓambrook、ＦritshおよびＭa niatis、Ｍolecular Ｃloning;Ａ Ｌabaratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク(１９８９))を用いて関連するＤＮＡ片を合成し、このよ うにして得られたＤＮＡを適当な発現ベクターにライゲートすることにより、ペ プチドとして発現できる。ＰＣＲを用いて、クローン化された２本鎖ＤＮＡの特 殊な配列が作り出され、発現ベクターにクローン化され、次にＣＴＬＡ４／ＣＤ ２８結合活性につき分析する。例えば分泌(可溶)形のヒトＢ７−２タンパク質を 発現させるために、ＰＣＲを用いて、該タンパク質の膜貫通および細胞質領域を コードしないＤＮＡを合成できる。このＤＮＡ分子を適当な発現ベクターにライ ゲートし、ＣＨＯ等の宿主細胞に導入でき、そこでＢ７−２タンパク質フラグメ ントが合成され、分泌される。そのＢ７−２タンパク質フラグメントは培養培地 から容易に得ることができる。 他の態様では、単純な削除物若しくは挿入物、塩基クラスターの系統的な削除 物、挿入物若しくは置換物、または単一・塩基の置換物を作る方法を含め、多く の方法のいずれかでＤＮＡ中に突然変異を導入し、Ｂリンパ球抗原ＤＮＡの変異 体または修飾された均等物を作ることができる。例えば図８(配列番号１)に示す ヒトＢ７−２cＤＮＡ配列、および図１４(配列番号２)に示すミュリンＢ７−２c ＤＮＡ配列における、アミノ酸置換または削除などの変化は、部位指定突然変異 誘発により好ましくは得られる。部位指定突然変異誘発は当業界でよく知られて いる。プロトコールおよび試薬は、Ａmersham Ｉnternational ＰＬＣ、アマ ーシャム、英国より商業的に得られる。 新規なＢリンパ球抗原の活性、すなわち、例えば１次活性化シグナルを受取っ たＴ細胞によるサイトカイン産生および／またはＴ細胞増殖により証拠づけられ る、Ｔ細胞上でＢリンパ球抗原の天然のリガンドを結合し、活性化Ｔ細胞媒介免 疫応答を剌激(増幅)し、または阻害(プロック)する能力を有するペプチドは本発 明の範囲内にあると考えられる。より具体的には、Ｔリンパ球、例えばＣＤ２８⁺ に結合するペプチドは、共刺激性シグナルをＴリンパ球に運ぶことができ、該 シグナルは、抗原およびクラスIIＭＨＣ、または１次シグナルをＴ細胞に伝える ことのできる他の物質の存在下に伝達された場合、Ｔ細胞内部でのサイトカイン 遺伝子の活性化を結果として生ずる。或いは、そのようなペプチドをクラスＩＭ ＨＣと共に用い、それによりＣＤ８⁺細胞溶解性Ｔ細胞を活性化できる。更に可 溶性、モノマー性形のＢ７−２タンパク質は、ＣＤ２８⁺Ｔ細胞上でそれらの天 然のリガンドに結合する能力を保持するが、多分リガンドとの不十分な架橋のた め、サイトカイン産生および細胞分裂を高めるのに必須な２次的シグナルを伝達 できない。細胞中でアネルギーまたは寛容状態を誘導する手段を提供するそのよ うなペプチドも本発明の範囲内にあると考えられる。 本明細書に記載する特徴的なＢリンパ球抗原活性を保持するものについてのペ プチドのスクリーニングは、１以上の、いくつかの異なった分析を用いて行うこ とができる。例えばそのペプチドを、細胞表面Ｂ７−２、またはＣＴＬＡ４Ｉg またはＣＤ２８Ｉg等の融合タンパク質と反応性の抗７−２モノクローナル抗体 との特異的な反応性についてスクリーニングできる。具体的にはＣＯＳ細胞のよ うな適当な細胞を、ペプチドをコードするＢ７−２ＤＮＡでトランスフェクトし 、次に間接免疫蛍光およびフローサイトメトリーにより細胞表面の表現型につい て分析し、そのペプチドがＢ７−２活性を有するか否か決定する。トランスフェ クトされた細胞の細胞表面発現は、細胞表面Ｂ７−２またはＣＴＬＡ４Ｉgまた はＣＤ２８Ｉgタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて評価 する。分泌形のＢ７−２の産生は免疫沈降用の抗Ｂ７−２モノクローナル抗体ま た はＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８融合タンパク質を用いて評価する。 他の、より好ましい分析は、Ｂ７−２抗原の機能的な特徴を利用する。先に説 明したように、サイトカインを合成するＴ細胞の能力は、抗原に対するＴ細胞レ セプターの占有または架橋によるばかりでなく(「活性化Ｔ細胞」を作るための、 例えば抗ＣＤ３またはフォルボールエステルにより提供される「１次活性化シグ ナル)、この場合にはＢ７−２、Ｂ７−１またはＢ７−３等のＢリンパ球抗原と の相互作用による共刺激性の誘導にもよる。例えばＣＤ２８⁺Ｔ細胞上でのＢ７ −２のその天然のリガンドへの結合は、サイトカイン、特にインターロイキン− ２の増加したレベルの産生を誘導し、次にＴリンパ球の増殖を刺激する、Ｔ細胞 へのシグナルの伝達という効果を有する。Ｂ７−２機能の他の分析は、インター ロイキン−２、インターロイキン−４、または他の公知の、若しくは知られてい ない新しいサイカイン等のサイカイン類の合成の分析、および／または１次活性 化シグナルを受取ったＣＤ２８⁺Ｔ細胞によるＴ細胞増殖についての分析を含む 。 インビボで、Ｔ細胞は、抗Ｔ３モノクローナル抗体(例えば抗ＣＤ３)若しくは フォルボールエステル、より好ましくはクラスIIＭＨＣと結合した抗原により、 第１の、または１次的な活性化シグナルを与えられる。１次活性化シグナルを受 取ったＴ細胞を本明細書では活性化Ｔ細胞と言う。Ｂ７−２機能は、Ｔ細胞培養 に、Ｂ７−２源(例えばＢ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞、または 分泌形のＢ７−２)およびクラスIIＭＨＣに結合した抗原等の１次活性化シグナ ルを加え、培養上清液を、インタロイキン−２、γ−インターフェロンまたは他 の公知または知られていないサイトカインにつき分析することにより分析される 。例えばインターロイキン−２のいくつかの従来の分析法、例えばＰroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８６、１３３３(１９８９)に記載された分析法(その関 連部分は本明細書の一部を構成する)、のいずれも用いることができる。インタ ーフェロン産生分析用キットも、Ｇenzyme Ｃorporation(ケンブリッジ、マサ チューセッツ)より入手できる。Ｔ細胞増殖も以下の実施例に記載したように測 定できる。本明細書に記載したＢ７−２抗原の特徴を保持するペプチドは、Ｔ細 胞によるＩＬ−２等のサイトカインの細胞あたりの生産の増加をもたらし、共刺 激シ グナルを欠いている陰性対照と比較して高められたＴ細胞増殖をもたらす。 Ｂ７−２活性を有するが、共刺激シグナルを運ぶ能力を欠いたペプチドをスク リーニングするため同じ基本的な機能的分析も使用できるが、そのようなペプチ ドの場合、Ｂ７−２タンパク質の添加は増殖またはＴ細胞によるサイトカイン分 泌の顕著の増加をもたらさないであろう。正常なＢ７−２共剌激シグナルを阻害 しまたは完全にブロックし、アネルギーの状態を誘導するそれらのタンパク質の 能力は、細胞表面Ｂ７−２を発現し、抗原を提示する抗原提示細胞でＴ細胞を剌 激するその後の試みを用いて測定できる。ＩＬ−２合成およびＴ細胞増殖により 測定される、その後の活性化の試みにＴ細胞が非応答性であるなら、アネルギー の状態が誘導されている。本発明による分析の基礎として用いる分析システムに ついては、Ｇimmi,Ｃ．Ｄ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、９０、６５８６〜６５９０を参照。 溶解性の増加、治療または予防効果の増大、または安定性(例えば半ビボ(ex vivo)貯蔵期間、およびインビボのタンパク分解酵素による分解に対する抵抗性) の増大などの目的のための新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの構造 の修飾も可能である。そのような修飾されたペプチドは本明細書に定義したＢリ ンパ球抗原の機能的な均等物であると考えられる。例えばＢ７−２活性を有する ペプチドを、それがＴ細胞増殖を剌激および／またはサイトカインを産生する能 力を維持するよう修飾できる。Ｔ細胞上でＣＴＬＡ４／ＣＤ２８レセプターと相 互作用するのに必須であると示されたこれら残基を、その必須アミノ酸を、その 存在がレセプター相互作用を高め、減少させるかが、失くしはせず、または影響 しない、他の好ましくは類似のアミノ酸残基で置換することにより(保存的置換) 修飾できる。更に、レセプター相互作用に必須でないこれらのアミノ酸残基を、 その導入が反応性を高め、減少させ、または影響しない他のアミノ酸により置換 することにより修飾してもよい。 新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの修飾の他の例は、システイン 残基を、好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、またはグルタミ ン酸残基で置換して、ジサルファイド結合による二量化を最小限にすることであ る。更に、Ｂ７−２活性を有するペプチドのアミノ酸側鎖を化学的に修飾できる 。他の修飾はペプチドの環化である。 安定性および／または反応性を高めるために、Ｂ７−２活性を有するペプチド を、いずれかの天然のアレル変異から生じる抗原のアミノ酸配列の１以上多型性 を導入するよう修飾し得る。更にＤ−アミノ酸、非天然アミノ酸、非アミノ酸ア ナローグで置換し、付加して本発明の範囲内の修飾タンパク質を製造し得る。更 に、ペプチドをＡ．Ｓehonおよび協力者の方法(Ｗie等、上書)によるポリエチレ ングリコール(ＰＥＧ)を用いて修飾し、ＰＥＧと結合したペプチドを作ることが できる。更に、ＰＥＧはペプチドの化学合成の間に付加することができる。ペプ チドの他の修飾は、還元／アルキル化(Ｔarr、Ｍethods of Ｐrotein Ｍicro characterzation 、Ｊ．Ｅ．Ｓilver編、Ｈuman Ｐress、クリフトン、ニュージ ャージー、１５５〜１９９４(１９８６))、アシル化(Ｔarr、上書)、適当な担体 への化学的結合(ＭishellおよびＳhiigi編、Ｓelected Ｍethods in Ｃellul ar lmmunology 、ＷＨ Ｆreeman、サンフランシスコ、カリフォルニア(１９８ ０)、米国特許第４,９３９,２３９号)、または弱いホルマリン処理(Ｍarsh(１９ ７１)、Ｉnt．Ａrch．of Ａllergy and Ａppl．Ｉmmunol．、４１、１９９〜 ２１５)を含む。 ペプチドの精製を容易にし、溶解性をもしかすると増加させるために、タンパ ク質骨核にアミノ酸融合部分を付加することは可能である。例えばヘキサ−ヒス チジンを、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる精製のため ペプチドに付加することができる(Ｈochuli,Ｅ等(１９８８)、Ｂio／Ｔechnolog y 、６、１３２１〜１３２５)。更に無関係の配列を含まないＢリンパ球抗原の単 離を容易にするために、特異的なエンドプロテアーゼ解裂部位を融合部分および ペプチドの配列の間に導入できる。ペプチドに機能性の基を付加することにより 、またはペプチドの疎水性領域を省くことにより、ペプチドの溶解性を増加させ ることは必要であり得る。 VII．Ｂリンパ球抗原およびＢ７−２活性を有するペプチドをコードしている 核酸配列の用途。 Ａ．分子プローブ。 本発明に係る核酸は、生物学的試料中のＢリンパ球の活性化状態を測定するこ とにより疾病の進行を追跡し、またはＢリンパ球抗原の発現に及ぼす分子の効果 を検定する（例えば細胞のｍＲＮＡレベルを検出する）のに、診断上有用である 。これらの診断的検定に従い、この核酸配列を、検出可能なマーカー、例えば放 射性、蛍光、またはビオチニル化されたマーカーを用いて標識し、常套的なドッ トブロットまたはノーザンハイブリダイゼーション法を用いて生物学的試料由来 の総またはポリ（Ａ＋）ＲＮＡのｍＲＮＡ分子をプロービングする。 Ｂ．抗体の産生。 本発明に係る核酸分子から生成されるペプチドおよび融合蛋白はさらに、Ｂリ ンパ球抗原と特異的に反応する抗体の産生に使用することもできる。例えば、全 長のＢ７−２蛋白、または、Ｂ７−２の予想アミノ酸配列に基づくアミノ酸配列 を有するそのペプチドフラグメントを使用することにより、抗蛋白／抗ペプチド ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を、標準法を用いて作製するこ とができる。哺乳動物（例えばマウス、ハムスター、またはウサギ）を、その哺 乳動物において抗体反応を顕現させる免疫原性型の蛋白またはペプチドで免疫す ることができる。この免疫原は、例えば組み替えＢ７−２蛋白、またはそのフラ グメント、合成ペプチドフラグメントまたはその表面にＢリンパ球抗原を発現す る細胞であってよい。この細胞は、例えば脾臓Ｂ細胞、またはＢリンパ球抗原が その細胞表面に発現されるような本発明に係るＢリンパ球抗原をコードしている 核酸（例えばＢ７−２ ｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされた細胞であって よい。免疫原はその免疫原性を増すために修飾することができる。例えば、ペプ チドに免疫原性を付与するための技術には、担体へのコンジュゲーションまたは その他の当分野でよく知られる技術が包含される。例えば、ペプチドをアジュバ ントの存在下で投与することができる。免疫感作の進行は血漿または血清中の抗 体力価の検出により監視することができる。標準的ＥＬＩＳＡまたはその他のイ ムノアッセイを、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原と共に使用 することができる。 免疫感作の後、抗血清を取得し、所望ならばこの血清からポリクローナル抗体 を単離することができる。モノクローナル抗体を生成させるため、抗体産生細胞 （リンパ球）を免疫された動物から採取し、標準的体細胞融合法により骨髄腫細 胞と融合させてこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を生成させること ができる。このような技術は当分野においてよく知られている。例えば、ケーラ ーおよびミルシュタイン（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）、２５６巻４９５−４９７ 頁）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにヒトＢ細胞ハイブリ ドーマ技術（コズバー等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９８３）、４巻７２ 頁）、ヒトモノクローナル抗体を生成させるためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 （コール等、モノクローナル・アンティボディーズ・イン・キャンサー・セラピ ー（１９８５）（アレン・Ｒ．ブリス、Ｉｎｃ．、７７−９６頁）、および組み 合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（ヒューズ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９ ８９）、２４６巻１２７５頁）である。ハイブリドーマ細胞をこのペプチドと特 異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングし、モノクロー ナル抗体を分離することができる。 本明細書中使用される抗体という語は、本明細書に記載される新規なＢリンパ 球抗原の活性を有するペプチドまたは融合蛋白と特異的に反応するそれらのフラ グメントを包含する事を意図している。抗体は常套技術を用いてフラグメント化 され、そのフラグメントを、抗体全体について上に記載したものと同じ方法で、 用途についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ａｂ')₂フラグメン トは、抗体をペプシンで処理することにより生成させることができる。得られた Ｆ(ａｂ')₂フラグメントを処理してジスルフィド橋を還元し、Ｆａｂ’フラグメ ントを生成させることができる。本発明に係る抗体はさらに、抗Ｂリンパ球抗原 （即ちＢ７−２、Ｂ７−３）部分を有する二重特異性およびキメラ分子を包含す ることを意図している。 特に好ましい抗体は、ハイブリドーマＨＡ３.１Ｆ９、ＨＡ５.２Ｂ７およびＨ Ｆ２.３Ｄ１により産生される抗ヒトＢ７−２モノクローナル抗体である。これ らの抗体の製造および特性決定は実施例８に詳細に記載されている。モノクロー ナル抗体ＨＡ３.１Ｆ９はＩｇＧイソタイプのものであると確定され；モノクロ ーナル抗体ＨＡ５.２Ｂ７はＩｇＧ２ｂイソタイプのものであると確定され；モ ノクローナル抗体ＨＦ２.３Ｄ１はＩｇＧ２ａイソタイプのものであると確定さ れた。ハイブリドーマ細胞は、ＡＴＣＣ受理番号 （ハイブリドーマＨ Ａ３.１Ｆ９）、ＡＴＣＣ受理番号 （ＨＡ５.２Ｂ７）およびＡＴＣ Ｃ受理番号 （ＨＦ２.３Ｄ１）として、ブダペスト条約の要件にか なうアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９４年７月１９日に 寄託された。 ヒト以外の対象において産生された抗体が治療的に人間に使用される場合、そ れらは程度の差こそあれ外来性であると認識され、患者に免疫反応が起こり得る 。この問題を最小にまたは排除する、全身的免疫抑制より好ましい一つのアプロ ーチは、キメラ抗体誘導体、即ちヒト以外の動物の可変領域とヒト不変領域とを 結合させた抗体分子を産生させることである。キメラ抗体分子には、例えば、ヒ ト不変領域を伴う、マウス、ラット、またはその他の種の抗体由来の抗原結合ド メインが包含され得る。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載さ れており、そして本発明に係る新規なＢリンパ球抗原の遺伝子産物を認識する免 疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体の作製に使用することができる。例えば 、モリソン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻 ６８５１頁（１９８５）；タケダ等、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻４５２頁（１９８ ５）、キャビリー等、米国特許第４８１６５６７号；ボス等、米国特許第４８１ ６３９７号；タナグチ等、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開０１７ ３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照されたい。このようなキメラ抗 体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象における免疫原性が小さいと予想さ れる。 人間の治療目的のために、本明細書に記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペ プチドと特異的に反応するモノクローナルまたはキメラ抗体を、ヒト可変領域キ メラを生成させることにより、さらにヒト化することができるが、この場合、可 変領域の一部、とりわけ抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域がヒト起源 であり、超可変領域のみが非ヒト起源である。「ヒト化された」キメラ抗体の総 説は、Ｓ．Ｌ．モリソン（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻１２０２−１ ２０７頁およびオイ等（１９８６）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻２１４ 頁に提供されている。このような変化させた免疫グロブリン分子は当分野で知ら れる幾つかの技術のうち任意のもの（例えばテング等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻７３０８−７３１２頁（１９８３）；コ ズボー等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻７２７９頁（１９８３）； オルソン等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２巻３−１６頁（１９８２））に よって作成することができ、好ましくはＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３または ＥＰ０２３９４００の教示に従って作成する。ヒト化抗体は、例えばスコットジ ェン・リミッティド、２ホーリー・ロード、トゥイッケンハム、ミドルセクス、 英国により商業生産することができる。好適な「ヒト化」抗体は、別法としてＣ ＤＲまたはＣＥＡ置換により生成させることができる（ウィンターに対する米国 特許５２２５５３９；ジョーンズ等（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻５５ ２−５２５頁；ヴェルホーヤン等（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻１５ ３４頁；およびバイドラー等（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１巻４０ ５３−４０６０頁を参照されたい）。免疫原性を低下させたヒト化抗体が、ヒト 対象における免疫療法のために好ましい。ヒト化抗体を用いる免疫療法は、付随 する免疫抑制の必然性を減少させると思われ、また慢性疾患の状況または抗体処 置を反復する必要のある状況の処置に対する長期有効性を増大させる結果を生む ことができる。 マウスまたは他の種由来のモノクローナル抗体をヒト化する代わりに、ヒト蛋 白に対するヒトモノクローナル抗体を生成させることもできる。ヒトＢリンパ球 抗原、例えばＢ７−２で免疫され得る、ヒトの抗体レパートリーを有するトラン スジェニックマウスが作り出された。次に、これらの免疫されたトランスジェニ ックマウスの脾臓細胞を用いて、ヒトＢリンパ球抗原と特異的に反応するヒトモ ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作り出すことができる（例えば、 ウッド等、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００９０６、クチャーラパティ等、ＰＣＴ公開 ＷＯ９１／１０７４１；ロンバーグ等、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８；ケイ 等、 ＰＣＴ公開９２／０３９１７；Ｎ．ロンバーグ等（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、 ３６８巻８５６−８５９頁；Ｌ．Ｌ．グリーン等（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、７巻１３−２１頁；Ｓ．Ｌ．モリソン等（１９９４）、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻６８５１−６８５５頁；ブラッ ジマン等（１９９３）、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻３３−４０頁；テュ アイロン等（１９９３）、ＰＮＡＳ、９０巻３７２０−３７２４頁；およびブラ ッジマン等（１９９１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１巻１３２３−１ ３２６頁を参照されたい）。 本発明に係るモノクローナル抗体組成物は、組み替えＤＮＡ技術の分野におい て通常の知識を有する者によく知られるその他の方法によっても生成させること ができる。「組み合わせ抗体ディスプレー」法と呼ばれる別法は、特定の抗原特 異性を有する抗体フラグメントを同定し単離するために開発され、これを、本発 明に係るＢリンパ球抗原を結合するモノクローナル抗体の生成に利用することが できる（組み合わせ抗体ディスプレーの説明については、例えばサストリー等（ １９８９）、ＰＮＡＳ、８６巻５７２８頁；ヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ、２４６巻１２７５頁；およびオーランディ等（１９８９）、ＰＮＡＳ、 ８６巻３８３３頁を参照されたい）。動物をＢリンパ球抗原で免疫した後、得ら れたＢ細胞プールの抗体レパートリーをクローニングする。オリゴマープライマ ーの混合物およびＰＣＲを使用することによる、免疫グロブリン分子の多様な集 団の可変領域のＤＮＡ配列を直接取得するための方法は一般に知られている。例 えば、５'リーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１ （ＦＲ１）配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに保存さ れた３'不変領域プライマーに対するプライマーを、幾つかのマウス抗体由来の 重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅のために使用することができる（ラーリッ ク等（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻１５２−１５６頁）。 同様の戦法を、ヒト抗体由来のヒト重鎖および軽鎖可変領域の増幅にも使用する ことができる（ラーリック等（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｎｉｏ ｎ ｔｏＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍoｌｏｇｙ、２巻１０６−１１０頁 ）。 例示的態様においては、例えば末梢血球、骨髄、または脾臓試料の活性化Ｂ細 胞から、標準的プロトコルを用いてＲＮＡが分離される（例えば、米国特許第４ ６８３２０２号；オーランディ等、ＰＮＡＳ（１９８９）、８６巻３８３３−３ ８３７頁；サストリー等、ＰＮＡＳ（１９８９）、８６巻５７２８−５７３２頁 ；およびヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５−１２８ １頁）。第一のｃＤＮＡ鎖は、重鎖の不変領域ならびにκおよびλ軽鎖の各々に 対し特異的なプライマー、ならびにシグナル配列に対するプライマーを用いて合 成する。可変領域ＰＣＲプライマーを用いて、重鎖および軽鎖の両者の可変領域 を単独でまたは組み合わせて増幅し、ディスプレーパッケージの作成におけるさ らなる操作のために適切なベクター中にライゲーションする。増幅プロトコルに 役立つオリゴヌクレオチドプライマーは、特異なものであるか、縮重しているか 、または縮重位置にイノシンを組み入れ得る。増幅されたフラグメントをベクタ ー中の予め定められた発現のための読み取り枠にクローニングできるようにする ため、制限エンドヌクレアーゼ認識配列もまたこのプライマー中に組み入れるこ とができる。 免疫感作で誘導された抗体レパートリーからクローニングされたＶ遺伝子ライ ブラリーは、好ましくは、抗体ディスプレーライブラリーを形成させるための繊 維状ファージから誘導されるディスプレーパッケージの集団によって発現させる ことができる。理想的には、このディスプレーパッケージは、極めて大きな多様 な抗体ディスプレーライブラリーのサンプリング、各親和分離工程後の迅速な分 類、そして精製されたディスプレーパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離が 可能な系を含む。ファージディスプレーライブラリーの作成のための入手し得る 市販のキット（例えば、ファルマシアの組み替えファージ抗体系、カタログ番号 ２７−９４００−０１；およびストラタジーンのＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファー ジディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、多様な抗体ディ スプレーライブラリーの生成の際の使用に特に従う方法および試薬の例は、例え ば、ラドナー等、米国特許第５２２３４０９号；カング等、国際公開第ＷＯ９２ ／１８６１９号；ドウアー等、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号；ウィンター 等、国際公開ＷＯ９２／２０７９１；マークランド等、国際公開第ＷＯ９２／１ ５６７９号；ブライトリング等、国際公開ＷＯ９３／０１２８８；マッカファー ティ等、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ガラード等、国際公開第ＷＯ９２ ／０９６９０号；ラドナー等、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号；ファッハ等 （１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻１３７０−１３７２頁；ヘ イ等（１９９２）、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻８１ −８５頁；ヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５−１２ ８１頁；グリフツ等（１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ １２巻７２５−７３４頁；ホー キンズ等（１９９２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２６巻８８９−８９６頁；ク ラックソン等（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻６２４−６２８頁；グラム 等（１９９２）、ＰＮＡＳ、８９巻３５７６−３５８０頁；ガラド等（１９９１ ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻１３７３−１３７７頁；ホーゲンブー ム等（１９９１）、Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９巻４１３３−４１３７頁； およびバーバス等（１９９１）、ＰＮＡＳ、８８巻７９７８−７９８２頁に見い だすことができる。 或る態様において、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインを同じポリペプチド上で 発現させ、可変リンカーによって連結して一本鎖Ｆｖフラグメントを形成し、そ して続いてこのｓｃＦＶ遺伝子を所望の発現ベクターまたはファージゲノム中に クローニングすることができる。マッカファーティ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０ ）、３４８巻５５２−５５４頁に一般的に記載されるように、可変性の（Ｇｌｙ₄ −Ｓｅｒ）₃リンカーにより連結された抗体の完全なＶ_HおよびＶ_Lドメインを使 用して、ディスプレーパッケージを抗原親和性に基づき分離可能とすることので きる一本鎖抗体を生成させることができる。続いて、Ｂリンパ球抗原の活性を有 するペプチドと免疫反応する単離されたｓｃＦＶ抗体を、本発明方法での使用の ための薬用調製物に調合することができる。 ディスプレーパッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面上に表示されたなら ば、この抗体ライブラリーを、Ｂリンバ球抗原蛋白またはそのペプチドフラグメ ントでスクリーニングしてＢリンパ球抗原に対する特異性を有する抗体を発現す るパッケージを同定および単離する。選択された抗体をコードしている核酸をデ ィスプレーパッケージから（例えばファージゲノムから）回収し、標準的組み替 えＤＮＡ技術により他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。 本発明に係る抗体は、Ｔ細胞の共同刺激に必要なレセプター：リガンド相互作 用を遮断することにより、Ｔ細胞活性化の阻害に治療的に使用することができる 。これらのいわゆる「遮断抗体」は、本明細書に記載されるインビトロ共同刺激 検定に添加される時、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害するそ れらの能力によって同定することができる。Ｔ細胞の機能を阻害する遮断抗体の 能力は、これらの抗体がインビボで投与される時、免疫抑制および／または寛容 をもたらし得る。 Ｃ．蛋白の精製。 本発明に係るポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えばＢ７−２活性 またはＢ７−３活性を有する組み替えまたは合成ペプチドと特異的に反応する抗 体は、さらに、天然のＢリンパ球抗原を細胞から単離するために使用することが できる。例えば、このペプチドと反応する抗体を使用して、天然に存在するまた は天然型のＢ７−２を活性化されたＢリンパ球から免疫親和クロマトグラフィー によって単離することができる。加えて、天然型のＢ７−３は、モノクローナル 抗体ＢＢ−１を用いる免疫親和クロマトグラフィーによってＢ細胞から単離する ことができる。 Ｄ．その他の治療用試薬。 本明細書に記載される核酸配列および新規なＢリンパ球抗原は、Ｔ細胞仲介免 疫反応の上方調節（例えば増幅）または下方調節（例えば抑制または寛容を成立 させる）のいずれかを行う能力を有する治療用試薬の開発に使用することができ る。例えば、可溶性、単量体型のＢ７−２抗原またはＢ７−２融合蛋白、例えば Ｂ７−２Ｉｇを包含するＢ７−２活性を有するペプチド、および、最初の活性化 シグナルを受け取ったＴ細胞に共同刺激シグナルを送ることのできない抗Ｂ７− ２抗体を使用して、Ｔ細胞上のＢ７−２リガンドを遮断し、それにより対象に免 疫抑制を惹起そして／または寛容を誘発させる特異的手段を提供することができ る。このような遮断または阻害型のＢリンパ球抗原および融合蛋白および遮断抗 体は、本明細書前記のようなインビトロ共同刺激検定に添加された場合のＴ細胞 増殖および／またはサイトカイン産生を阻害する能力によって同定することがで きる。単量体型とは対称的に、刺激型のＢ７−２、例えば無傷の細胞表面Ｂ７− ２は、共同刺激シグナルをＴ細胞に伝達する能力を保持しており、その結果、二 次シグナルを受け取っていない活性化Ｔ細胞と比較してサイトカインの分泌が増 加する。 加えて、別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１）の活性を有する第二のペプチ ドと融合したＢ７−２の活性を有する第一のペプチドからなる融合蛋白を使用し て、Ｔ細胞仲介免疫反応を修飾することができる。別法として、Ｂリンパ球抗原 、例えばＢ７−２およびＢ７−１の活性を有する二つの別個のペプチド、または 、遮断抗体の組み合わせ（例えば抗Ｂ７−２および抗Ｂ７−１モノクローナル抗 体）を単一の組成物として合してまたは別々に（同時にまたは連続して）投与し て、対象におけるＴ細胞仲介免疫反応を上方調節または下方調節することができ る。さらに、Ｂ７−２活性および／またはＢ７−１活性を有する１またはそれ以 上のペプチドの治療的有効量を他の免疫調節試薬と共に使用して、免疫反応に影 響を及ぼすことができる。他の免疫調節試薬の例には、遮断抗体、例えばＣＤ２ ８またはＣＴＬＡ４に対するもの、他のＴ細胞マーカーに対するもの、またはサ イトカインに対するもの、融合蛋白、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、または免疫抑制薬 、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６が包含される。 本発明に係る核酸分子から生成されるペプチドはさらに、Ｔ細胞の破壊により Ｔ細胞の機能を遮断する治療薬の組み立てにおいて有用となり得る。例えば、記 載されたように、分泌された形のＢリンパ球抗原は、標準的遺伝子工学技術によ って組み立てることができる。可溶性型のＢ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−３を リシンのような毒素に連結することにより、Ｔ細胞活性化を防止できる物質を作 成することができる。患者の体内への１つのまたは組み合わせた免疫毒素、例え ばＢ７−２−リシン、Ｂ７−１−リシンの注入は、Ｔ細胞、特により大量のＣＤ ２８およびＣＴＬＡ４を発現する活性化されたＴ細胞の死をもたらし得る。一価 の 形のＢ７−２の可溶性型単独でも、上記のようにＢ７−２機能の遮断に有用であ り、この場合は担体分子をも使用してよい。 Ｂリンパ球抗原の機能を妨げるもう一つの方法は、アンチセンスまたはトリプ レックスオリゴヌクレオチドの使用によるものである。例えば、Ｂ７−１、Ｂ７ −２またはＢ７−３翻訳開始部位付近の領域に対し相補的なオリゴヌクレオチド （例えば、Ｂ７−１についてはＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡ（配列番号 ２０）ヌクレオチド３２６−３０９、そしてＢ７−２についてはＧＣＣＡＡＡＡ ＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡ（配列番号２１）を合成することができる。１またはそれ 以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、典型的には２００μｇ／ｍｌで、細 胞培地に添加し、または患者に投与して、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ ７−３の合成を妨げることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞に より取り込まれ、適当なＢリンパ球抗原ｍＲＮＡとハイブリダイズして翻訳を妨 げる。別法として、二本鎖ＤＮＡに結合しトリプレックス組み立て物を形成して ＤＮＡの巻き戻しと転写を妨げるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。 いずれの結果においても、１またはそれ以上のＢリンパ球抗原の合成が遮断され る。 Ｅ．免疫反応の下方調節による治療用途。 本明細書に開示される新規なＢリンパ球抗原の構造および機能が提供されるな らば、幾つかの方法でＢリンパ球抗原の機能を下方調節し、それにより免疫反応 を下方調節することが可能である。下方調節は、既に進行中の免疫反応を阻害ま たは遮断する形であってよく、または免疫反応の誘導の防止を含んでいてもよい 。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞反応を抑制することにより、またはＴ細胞にお いて特異的寛容を誘導することにより、またはその両者によって阻害することが できる。Ｔ細胞反応の免疫抑制は、一般に、Ｔ細胞が抑制薬物に絶えずさらされ ていることを必要とする、活発な非抗原特異的過程である。寛容は、Ｔ細胞に不 応性またはアネルギーを誘発することを含むが、これは、一般に抗原特異的であ り、且つ寛容化物質への暴露が終わった後も持続することで免疫抑制とは区別で きる。操作上は、寛容は、寛容化物質の不在下で特異抗原に再暴露させた時のＴ 細胞反 応の欠如によって立証することができる。 １またはそれ以上のＢリンパ球抗原機能を下方調節または妨げること、例えば 活性化Ｔ細胞による高レベルリンホカイン合成の防止は、組織、皮膚および臓器 移植の状況ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の際に有用であろう。例えば、 Ｔ細胞機能の遮断は組織移植の際の組織破壊の低下をもたらすに相違ない。典型 的には、組織移植においては、移植片の拒絶はそれが外来性であるとのＴ細胞に よる認識で始まり、続いてその移植片を破壊する免疫反応へと続く。Ｂ７リンパ 球抗原が免疫細胞上でその天然リガンドと相互作用することを阻害または遮断す る分子（例えば、Ｂ７−２活性を有する可溶性単量体型のペプチドを単独で、ま たは別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１、Ｂ７−３）の活性を有する単量体型 のペプチドまたは遮断抗体と組み合わせて）を移植前に投与することで、対応す る共同刺激シグナルの伝達なしに免疫細胞上の天然リガンドに当該分子を結合さ せることができる。この方法でのＢリンバ球抗原機能の遮断は、免疫細胞、例え ばＴ細胞によるサイトカイン合成を防止し、したがって免疫抑制手段として作用 する。その上、共同剌激の欠如はＴ細胞のアネルギー化に十分であり、それによ り対象に寛容を誘導することができる。Ｂリンパ球抗原遮断試薬による長期寛容 の誘導は、これらの遮断試薬の反復投与の必要性を回避し得る。対象に十分な免 疫抑制または寛容を達成するためには、組み合わせたＢリンパ球抗原の機能を遮 断することも必要であるかも知れない。例えば、それらの抗原の各々の活性を有 するペプチドの可溶性型の組み合わせまたは遮断抗体を移植前に投与（別々にま たは単一組成物で一諸に）することによって、Ｂ７−２およびＢ７−１、Ｂ７− ２およびＢ７−３、Ｂ７−１およびＢ７−３またはＢ７−２、Ｂ７−１およびＢ ７−３の機能を遮断することが望ましいかも知れない。別法として、阻害型のＢ リンパ球抗原を、他の抑制剤、例えば他のＴ細胞マーカーに対するもしくはサイ トカインに対する遮断抗体、他の融合蛋白、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、または免疫 抑制薬と共に使用することもできる。 特定の遮断試薬が臓器移植拒絶またはＧＶＨＤを防止する有効性は、人間にお ける有効性が予想される動物モデルを用いて評価することができる。Ｂ７−１の 機能上重要な側面は種間で構造的に保存されており、故に、他のＢリンパ球抗原 も種にまたがって機能できると思われ、よってヒトの蛋白で構成される試薬を動 物系で使用することができる。使用できる適当な系の例には、ラットにおける同 種間の心臓移植およびマウスにおける異種間の膵島細胞移植が包含され、そのい ずれもが、レンショウ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻７８９−７９２頁（１９９ ２）およびトゥルカ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９ 巻１１１０２−１１１０５頁（１９９２）に記載のようにＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋 白の免疫抑制効果をインビボで調査するために使用された。さらに、ＧＶＨＤの マウスモデル（パウル編、ファンダメンタル・イムノロジー、レイヴン・プレス 、ニューヨーク、１９８９、８４６−８４７頁を参照されたい）を用いて、この 疾患の進行に及ぼすインビボのＢリンパ球抗原機能遮断の効果を測定することが できる。 例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、単独、またはＢ７−１活性を有する ペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせて使用する ことにより、Ｂリンパ球抗原機能を遮断することは、自己免疫疾患の処置にも治 療上有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対し反応性であるＴ細 胞の不適当な活性化の結果であり、これがこの疾患の病理に含まれるサイトカイ ンおよび自己抗体の産生を促進する。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は疾病の 症候を軽減または排除し得る。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用 を破壊することによりＴ細胞の共同剌激を遮断する試薬の投与を用いてＴ細胞の 活性化を阻害し、疾病の過程に含まれ得る自己抗体またはＴ細胞により誘導され るサイトカインの産生を防止することができる。さらに、遮断試薬は自己反応性 Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し、これは当該疾患からの長期間の治癒につなが る。自己免疫疾患を防止または軽減する遮断試薬の有効性は、幾つかの十分に性 格決定されたヒト自己免疫疾患の動物モデルを用いて測定することができる。例 には、マウス実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺ Ｂハイブリッドマウスの全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関 節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットの真性糖尿病、ならびにマウスの実験的重 症筋無力症が包含される（パウル編、ファンダメンタル・イムノロジー、レイヴ ン・プレス、ニューヨーク、１９８９、８４０−８５６頁を参照されたい）。 アトピー性アレルギーにおけるＩｇＥ抗体の反応は高度にＴ細胞依存性であり 、したがって、Ｂリンパ球抗原の誘発するＴ細胞活性化の阻害は、アレルギーお よびアレルギー性反応の処置に治療上有用であり得る。阻害型のＢ７−２蛋白、 例えばＢ７−２活性を有するペプチドを単独でまたは別のＢリンパ球抗原、例え ばＢ７−１の活性を有するペプチドと組み合わせてアレルギー患者に投与して、 その患者のＴ細胞仲介アレルギー反応を阻害することができる。Ｔ細胞のＢリン パ球抗原共同剌激の阻害は、適当なＭＨＣ分子と結合したアレルゲンへの暴露を 随伴し得る。アレルギー反応の性質は、アレルゲンの侵入経路および肥満細胞ま たは好塩基性細胞上のＩｇＥ沈着のパターンに応じて、全身性または局所性であ り得る。そこで、阻害型のＢ７−２蛋白の適切な投与により、Ｔ細胞仲介アレル ギー反応を局所的または全身的に阻害する必要があり得る。 Ｂリンパ球抗原機能の遮断によるＴ細胞活性化の阻害は、Ｔ細胞のウイルス感 染の際にも、治療上重要であり得る。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ ）において、ウイルスの複製はＴ細胞の活性化によって剌激される。Ｂ７−２機 能の遮断は、より低いレベルのウイルス複製へと導き、それによりＡＩＤＳの経 過を改善する。さらに、組み合わされたＢリンパ球抗原、即ちＢ７−１、Ｂ７− ２およびＢ７−３の機能の遮断もまた必要であるかもしれない。驚くべき事に、 ＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞はＢ７−１およびＢ７−２を発現する。この発現 はＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞の成長において重要であり、また、Ｂ７−２お よび／またはＢ７−３の機能と共にＢ７−１機能の遮断はＨＴＬＶ−Ｉ誘発白血 病の進行を遅くするかも知れない。別法として、単離および使用に十分な量のレ トロウイルスを生成させる目的のために、刺激型のＢ７−２蛋白との接触によっ てＴ細胞活性化によるウイルス複製の剌激を誘発してもよい。 Ｆ．免疫反応の上方調節による治療上の用途。 免疫反応を上方調節する手段としてのＢリンパ球抗原機能の上方調節もまた治 療に有用となり得る。免疫反応の上方調節は、存在している免疫反応の促進また は最初の免疫反応の顕現という形であり得る。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を剌 激することによる免疫反応の増強は、ウイルス感染の場合に有用であり得る。ウ イルス感染は主として細胞溶解性Ｔ細胞により排除される。本発明に従えば、Ｔ 細胞上の天然リガンドを伴うＢ７−２、そして故にＢ７−１およびＢ７−３は、 少なくとも幾らかのＴ細胞の細胞溶解活性の増加をもたらし得る。さらに、Ｂ７ −２、Ｂ７−１およびＢ７−３がＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の初期活性化および生 成に関与していることも信ぜられる。単独で、または別のＢリンパ球抗原の活性 を有するペプチドと組み合わせて、多価型で、Ｂ７−２活性を有する可溶性ペプ チドを添加して共同刺激経路を介してＴ細胞活性を剌激することは、このように 、ウイルスのより迅速なまたは完全な排除が有利である状況において治療上有用 となるであろう。これらは、ヘルペスまたは帯状疱疹のようなウイルス性皮膚疾 患を包含し、これらの場合、Ｂ７−２活性を有する多価可溶性ペプチド、または 係るペプチドおよび／またはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７ −３活性を有するペプチドの組み合わせを局所的に皮膚に適用する。加えて、イ ンフルエンザ、風邪、および脳炎のような全身性ウイルス疾患が、刺激型のＢリ ンパ球抗原の全身投与によって軽快し得る。 別法として、患者からＴ細胞を除去し、Ｂ７−２活性を有するペプチドを発現 （単独でまたはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有 するペプチドと組み合わせて）する、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣにより、 またはＢ７−２活性を有する可溶性ペプチドの刺激型（単独でまたはＢ７−１活 性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせ て）と共に、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣにより、インビトロでＴ細胞を共 同刺激し、そしてこのインビトロで活性化したＴ細胞を再び患者に導入すること によって、感染した患者における抗ウイルス免疫反応を増進させることもできる 。抗ウイルス免疫反応を増進させる別の方法は、感染した細胞を患者から分離し 、それらを、本明細書に記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコード し ている核酸を用いてトランスフェクトしてその細胞がその表面にＢリンパ球抗原 、例えばＢ７−２またはＢ７−３の全てまたは一部を発現するようにさせ、そし てこのトランスフェクトされた細胞を再び患者の体内に導入することである。そ うすれば、感染した細胞は、インビボでＴ細胞に共同刺激シグナルを伝達でき、 そして故にＴ細胞を活性化することができるであろう。 剌激型のＢリンパ球抗原は、予防的に、種々の病原体に対するワクチンに使用 することもできる。病原体、例えばウイルスに対する免疫は、適当なアジュバン トに入れた、Ｂ７−２活性を有するペプチドまたはＢリンパ球抗原の活性を有す る別のペプチドの刺激型を伴うウイルス蛋白によってワクチン接種することによ り誘導し得る。別法として、病原性抗原およびＢリンパ球抗原の活性を有するペ プチド両者のための遺伝子をコードしている発現ベクター、例えば、ウイルス蛋 白をコードしている核酸と、本明細書に記載のようなＢ７−２活性を有するペプ チドをコードしている核酸とを発現するよう組み立てられたワクシニアウイルス 発現ベクターを、ワクチン接種に使用することもできる。例えばＢ７−２活性を 有するペプチドおよびＭＨＣクラスＩα鎖蛋白およびβ₂ミクログロブリンを同 時発現するようトランスフェクトさせた細胞による、クラスＩ ＭＨＣ蛋白を伴 うＢ７−２の提示もまた、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらし、ウイ ルス感染からの免疫感作を提供する。ワクチンが有用となり得る病原体には、Ｂ 型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、Ｈ ＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリアおよび住血吸虫症が包含される。 別の態様において、Ｂリンパ球抗原の活性を有する１またはそれ以上の可溶性 ペプチドの剌激型を、腫瘍を持つ患者に投与して、抗腫瘍性免疫を誘導するため のＴ細胞に対する共同剌激シグナルを提供することができる。 Ｇ．共同剌激分子を発現させるための腫瘍細胞の修飾。 腫瘍細胞がＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発できないのは、共同刺激分 子の発現の欠如、たとえ腫瘍細胞が係る分子を発現できる能力があったとしても 共同刺激分子の発現に失敗したこと、腫瘍細胞表面の共同剌激分子の発現が不十 分であること、または適切な共同刺激分子の発現が無いこと（例えばＢ７−２お よび／またはＢ７−３ではなくＢ７の発現）に起因し得る。したがって、本発明 の一つの態様によれば、腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面でのＢ７−２および／または Ｂ７−３の発現に好適な形のＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしている 核酸でトランスフェクトすることにより、この腫瘍細胞をＢ７−２および／また はＢ７−３を発現するよう修飾する。別法として、腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面で のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強する物質と接触させ ることにより、修飾する。さらに別の態様においては、Ｂ７−２および／または Ｂ７−３を腫瘍細胞の表面に結合させて修飾された腫瘍細胞を生成させる。これ らのおよびその他の態様を、以下の亜項においてさらに詳細に説明する。 （１）共同刺激分子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクシ ョン。 分離された腫瘍細胞を、その腫瘍細胞の表面に当該分子を発現するのに好適な 形でＢ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸でト ランスフェクトすることにより、Ｂ７−２またはＢ７−３を単独でまたはＢ７− １と組み合わせて発現するよう、この腫瘍細胞をエクスビボで修飾することがで きる。「トランスフェクション」または「でトランスフェクト」という語は、外 因性核酸を哺乳動物細胞中に導入することを意味し、電気穿孔、燐酸カルシウム 沈殿化、ＤＥＡＥデキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクシ ョンおよびウイルスベクターによる感染を包含する、哺乳動物細胞中に核酸を導 入するのに有用な様々な技術を包含している。哺乳動物細胞をトランスフェクト するための好適な方法は、サムブルック等（モレキュラー・クローニング：ア・ ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ トリー・プレス（１９８９））およびその他の研究室用教科書に見いだすことが できる。導入すべき核酸は、例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコード している遺伝子を包含するＤＮＡ、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードし ているセンス鎖ＲＮＡ、またはＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしてい るｃＤＮＡを含む組み替え発現ベクターであってよい。ヒトＢ７−２をコードし ているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表に示す。 腫瘍細胞中にＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸を導入す るための好ましいアプローチは、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードして いる核酸、例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用によるものである。使 用できるウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター（Ｍ．Ａ．エグリテ ィス等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻１３９５−１３９８頁（１９８５）；Ｏ．ダ ノスおよびＲ．ミュリガン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８５巻６４６０−６４６４頁（１９８８）；Ｄ．マルコヴィッツ等、Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．、６２巻１１２０−１１２４頁（１９８８））、アデノウイルスベクター （Ｍ．Ａ．ローゼンフェルト等、Ｃｅｌｌ、６８巻１４３−１５５頁（１９９２ ））およびアデノ伴生ウイルスベクター（Ｊ．Ｄ．トラッチン等、Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻３２５１−３２６０頁（１９８５））を包含する。ウイ ルスベクターによる腫瘍細胞の感染は、細胞の大部分が核酸を受け入れ、それに より、核酸を受け入れた細胞の選択の必要性が回避され、また、例えばウイルス ベクター中に含まれるｃＤＮＡによりウイルスベクター内にコードされている分 子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率よく発現されるという 利点を有する。 別法として、Ｂ７−２および／またはＢ７−３は、Ｂ７−２および／またはＢ ７−３をコードしている核酸、例えばｃＤＮＡを含むプラスミド発現ベクターを 用いて腫瘍細胞上に発現され得る。好適なプラスミド発現ベクターは、ＣＤＭ８ （Ｂ．シード、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻８４０頁（１９８７））およびｐＭＴ２ ＰＣ（カウフマン等、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻１８７−１９５頁（１９８７））を 包含する。宿主細胞、例えば腫瘍細胞中で核酸を発現するための好適なベクター および方法は、本明細書にさらに詳細に記載される。 腫瘍細胞のトランスフェクションが、その腫瘍細胞の大部分の修飾および腫瘍 細胞の表面でのＢ７−２および／またはＢ７−３の効率的な発現につながる場合 、例えばウイルス発現ベクターを使用する場合、腫瘍細胞は、さらなる分離また はサブクローニングなしで使用することができる。別法として、トランスフェク トされた腫瘍細胞の均質な集団は、１個のトランスフェクトされた腫瘍細胞を限 界 希釈クローニングし、その後この１個の腫瘍細胞を標準技術により細胞のクロー ン集団へと拡大することによって調製することができる。 （２）腫瘍細胞表面での共同刺激分子の誘導または発現増強。 Ｂ７−２および／またはＢ７−３を発現する能力はあるがそれができない、ま たはＴ細胞を活性化するには不十分な量でＢ７−２および／またはＢ７−３を発 現する腫瘍細胞上でＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または発現レ ベルを増強することにより、Ｔ細胞において共同剌激シグナルを誘発するよう、 腫瘍細胞を修飾することができる。腫瘍細胞上でＢ７−２および／またはＢ７− ３の発現を誘導または増強するため、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発現を 剌激する物質を使用することができる。例えば、腫瘍細胞を、培養基中インビト ロでこの物質と接触させることができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発 現を剌激する物質は、例えばＢ７−２および／またはＢ７−３遺伝子の転写を増 強することにより、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ｍＲＮＡの翻訳を増強する ことにより、または、細胞表面に対するＢ７−２および／またはＢ７−３の安定 性もしくは輸送を増強することにより、作用し得る。例えば、Ｂ７の発現は、ｃ ＡＭＰを含む第二のメッセンジャー経路により細胞内で上方調節され得ることが 知られている。Ｎ．ナバヴィ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻２６６−２６８頁（１ ９９２）。Ｂ７−２およびＢ７−３も同様にｃＡＭＰによって誘導可能である。 即ち、腫瘍細胞を、細胞内ｃＡＭＰレベルを増大させる、またはｃＡＭＰ類似体 のようなｃＡＭＰに近似した物質、例えばジブチリルｃＡＭＰと接触させて、こ の腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を刺激することができ る。Ｂ細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子をＭＨＣクラスＩＩ分子に対する 抗体で架橋することにより、正常な静止Ｂ細胞上にＢ７の発現が誘導されること もまた知られている。Ｌ．クオロヴァ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻７５ ９−７６２（１９９１）。同様に、Ｂ細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を 架橋することによってＢ７−２およびＢ７−３が静止Ｂ細胞上に誘導され得る。 したがって、その表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞を抗ＭＨＣク ラスＩＩ抗体で処理して、その腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３ 発現を誘導または増強することができる。加えて、Ｂ細胞上のＢ７−２の発現を 誘導することが判明しているインターロイキン４（ＩＬ−４）を用いて、腫瘍細 胞上のＢ７−２の発現を上方調節することができる（Ｒ．Ｍ．スタック等、Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈeｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１（１８）巻４３４頁（１９９４） 。 腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強する のに使用できるもう一つの物質は、共同剌激分子をコードしている遺伝子の転写 を上方調節する転写因子をコードしている核酸である。共同剌激分子の遺伝子の 転写を増強させるためにこの核酸を腫瘍細胞中にトランスフェクトし、その結果 共同剌激分子の細胞表面レベルの増大をもたらすことができる。 （３）腫瘍細胞の表面への共同刺激分子の結合。 別の態様においては、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞の表面に結 合させることにより、この腫瘍細胞を、Ｔ細胞における共同剌激シグナルが誘発 可能となるよう修飾する。例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３分子は、共 同剌激分子の生成および単離を可能にする標準的組み替えＤＮＡ技術および発現 系を用いて取得することができる。別法として、標準的蛋白精製技術を用いてＢ ７−２および／またはＢ７−３を、共同剌激分子を発現する細胞から単離するこ ともできる。例えば、Ｂ７−３蛋白は、ＢＢ１モノクローナル抗体のような抗Ｂ ７−３抗体を用いる免疫沈降によって、活性化Ｂ細胞から単離することができる 。次いで、単離された共同剌激分子を腫瘍細胞に結合させる。「結合した」また は「結合している」という語は、それによってＢ７−２および／またはＢ７−３ が腫瘍細胞に連結し、その結果共同刺激分子が腫瘍細胞表面に存在してＴ細胞に おける共同刺激シグナルを誘発できるような化学的、酵素的またはその他の手段 （例えば抗体）を意味する。例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３は、市販 品が入手可能な架橋試薬（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を用いて腫瘍細胞表 面に化学的に架橋することができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細 胞に結合させる別のアプローチは、共同刺激分子と腫瘍細胞上の細胞表面分子の 両者に結合する二重特異性抗体を使用することである。腫瘍細胞の表面に結合さ せた時にＴ細胞において共同刺激シグナルを誘発する能力を保持している、Ｂ７ −２ および／またはＢ７−３のフラグメント、突然変異体または変異体もまた使用す ることができる。 （４）複数の共同剌激分子を発現させるような腫瘍細胞の修飾 本発明のもう一つの態様は、複数の共同刺激分子を発現するように修飾された 腫瘍細胞である。活性化されたＢ細胞上の共同剌激分子の一時的発現は、Ｂ７、 Ｂ７−２およびＢ７−３に対して異なっている。例えば、Ｂ７−２はＢ細胞活性 化後、早期に発現され、一方Ｂ７−３は後に発現される。即ち、異なった共同剌 激分子は、免疫反応の過程中、別個の機能を果たすことができる。有効なＴ細胞 の反応には、Ｔ細胞が複数の共同剌激分子から共同刺激シグナルを受け取ること が必要であるかも知れない。したがって、本発明は、１以上の共同刺激分子を発 現するよう修飾された腫瘍細胞を包含する。例えば、腫瘍細胞は、Ｂ７−２およ びＢ７−３の両者を発現するよう修飾することができる。別法として、Ｂ７−２ を発現するよう修飾された腫瘍細胞を、Ｂ７−１を発現するようさらに修飾する こともできる。同様に、Ｂ７−３を発現するよう修飾された腫瘍細胞を、Ｂ７− １を発現するようさらに修飾することもできる。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＢ７ −３を発現するよう、腫瘍細胞を修飾することもできる。本明細書に記載される 任意の技術によって、複数の共同刺激分子（例えばＢ７−１およびＢ７−２）を 発現するよう、腫瘍細胞を修飾することができる。 修飾の前には、腫瘍細胞は、いずれの共同刺激分子も発現しないかも知れない し、または或る共同剌激分子は発現するが別のものは発現しないかも知れない。 本明細書に記載のように、腫瘍細胞は、共同剌激分子をコードしている核酸でそ の腫瘍細胞をトランスフェクトすることにより、共同刺激分子の発現を誘導する ことにより、または、その腫瘍細胞に共同刺激分子を結合させることにより、修 飾することができる。例えば、Ｂ７−２をコードしている核酸でトランスフェク トされた腫瘍細胞は、Ｂ７−１をコードしている核酸でさらにトランスフェクト することができる。ヒトＢ７−１のｃＤＮＡおよび導き出されたアミノ酸配列を 配列表に示す。別法として、１以上の型の修飾を施すこともできる。例えば、Ｂ ７−２をコードしている核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞を、Ｂ７−１の 発現を誘導する物質で剌激することができる。 （５）ＭＨＣ分子を発現させるためのさらなる腫瘍細胞の修飾。 本発明のまた別の態様は、共同刺激分子を発現し、且つ１またはそれ以上のＭ ＨＣ分子をそれらの表面に発現して、Ｔ細胞に、共同剌激シグナルおよび第一の 抗原特異的シグナルの両者を誘発するように修飾した腫瘍細胞を特徴とする。修 飾の前には、腫瘍細胞は、ＭＨＣ分子を発現できないかも知れず、ＭＨＣ分子を 発現する能力はあっても係る分子の発現ができないかも知れず、または、Ｔ細胞 活性化を惹起するに十分な量のＭＨＣ分子を腫瘍細胞上に発現しないかも知れな い。腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれか、また は両者を発現するよう修飾することができる。ＭＨＣ分子を発現するよう腫瘍細 胞を修飾する一つのアプローチは、１またはそれ以上のＭＨＣ分子をコードして いる１またはそれ以上の核酸で腫瘍細胞をトランスフェクトすることである。別 法として、腫瘍細胞上での１またはそれ以上のＭＨＣ分子の発現を誘導または増 強する物質を用いて腫瘍細胞を修飾することもできる。腫瘍ペプチドをＣＤ４⁺ Ｔ細胞に直接提示するＭＨＣクラスＩＩ⁺腫瘍細胞の能力は、プロフェッショナ ルなＭＨＣクラスＩＩ⁺ＰＣの必要性を回避できることから、腫瘍細胞上のＭＨ ＣクラスＩＩ分子の発現の誘導または増強は、腫瘍に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞の活 性化にとって特に有益となり得る。可溶性の腫瘍抗原（腫瘍細胞の破片または分 泌された蛋白の形）はプロフェッショナルなＭＨＣクラスＩＩ⁺ＡＰＣによる取 り込みに利用され得ないため、このことは腫瘍の免疫原性を改善し得る。 本発明の一つの態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ならびに１またはそ れ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞表面に発現する、修飾された腫瘍細胞であ る。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、構造的には抗原性ペプチドがその中に結合する裂 け目を含み、そして、結合したペプチドを抗原特異性ＴｃＲに提示する機能を有 する、細胞表面α／βヘテロ二量体である。複数の異なったＭＨＣクラスＩＩ蛋 白が、プロフェッショナルＡＰＣ上に発現され、異なったＭＨＣクラスＩＩ蛋白 は異なった抗原性ペプチドに結合する。故に、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子の発 現は、ＡＰＣによりまたは修飾された腫瘍細胞により提示され得る抗原性ペプチ ドのスペクトルを増大する。ＭＨＣクラスＩＩ分子のαおよびβ鎖は異なった遺 伝子によりコードされている。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩＩ蛋白ＨＬＡ−ＤＲ は、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＨＬＡ−ＤＲβ遺伝子によりコードされている。さら に、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の多くの多形性対立遺伝子が、ヒトおよびその他の 種に存在する。特定の個体のＴ細胞は、自己のＭＨＣ分子と結合した抗原性ペプ チドによる刺激に応答し、これはＭＨＣ制限と呼ばれる現象である。加えて、或 るＴ細胞は、他の個体の細胞上に見いだされるＭＨＣ分子の多形性対立遺伝子に よる剌激にも応答することができ、これは同種性と呼ばれる現象である。ＭＨＣ クラスＩＩの構造および機能の総説については、ジャーメインおよびマーギュリ ーズ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻４０３−４５０頁１９９３、 を参照されたい。 本発明の別の態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ならびに１またはそれ 以上のＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に発現する、修飾された腫瘍細胞である。 ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子と同様に、複数のＭＨＣクラスＩ遺伝子があり、これら 遺伝子の多くの多形性対立遺伝子が、ヒトおよびその他の種で発見されている。 ＭＨＣクラスＩＩ蛋白と同様に、クラスＩ蛋白は、Ｔ細胞に対する提示のために 抗原のペプチドフラグメントに結合する。機能的細胞表面クラスＩ分子は、β２ ミクログロブリン蛋白と結合したＭＨＣクラスＩα鎖蛋白により構成される。 （６）ＭＨＣ分子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクショ ン。 １またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩα鎖および１またはそれ以上のＭＨＣク ラスＩＩβ鎖を、腫瘍細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩ分子の発現に好適な形で コードしている１またはそれ以上の核酸によって、単離された腫瘍細胞をトラン スフェクトすることにより、１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現す るよう、腫瘍細胞をエクスビボで修飾することができる。表面のヘテロ二量体を 形成させるためにαおよびβ鎖蛋白の両方が腫瘍細胞に存在せねばならず、いず れの鎖も単独では細胞表面に発現されないであろう。多くのマウスおよびヒトク ラスＩＩ遺伝子の核酸配列が知られている。例えば、Ｌ．フード等、Ａｎｎ．Ｒ ｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻５２９−５６８頁（１９８３）およびＣ．オーフ レイおよびＪ．Ｌ．ストロミンガー、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻１９７−２４７頁（１９８７）を参照されたい。好まし くは、導入されるＭＨＣクラスＩＩ分子は自己ＭＨＣクラスＩＩ分子である。別 法として、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、外来の同種ＭＨＣクラスＩＩ分子であって もよい。腫瘍細胞中に導入されるべき特定の外来ＭＨＣクラスＩＩ分子は、腫瘍 を持っている対象由来のＴ細胞に、その外来ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細 胞により刺激された場合にサイトカインを増加および／または分泌させるよう誘 導する能力によって（即ち、同種反応を誘導する能力によって）選択することが できる。トランスフェクトすべき腫瘍細胞は、トランスフェクション前にはその 表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないかも知れないし、またはＴ細胞の応答 を刺激するには不十分な量を発現するかも知れない。別法として、トランスフェ クション前にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞を、さらなる異なったＭ ＨＣクラスＩＩ遺伝子によって、またはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の他の多形性対 立遺伝子によってさらにトランスフェクトし、その腫瘍細胞がＴ細胞に対して提 示できる抗原性フラグメントのスペクトルを増大させることもできる。 Ｔ細胞による増殖および／またはリンホカイン産生によって立証されるような 、ペプチド抗原を結合させＴ細胞反応を活性化する能力を保持しているＭＨＣク ラスＩＩ分子のフラグメント、突然変異体または変異体は、本発明の範囲内にあ ると考えられる。好ましい変異体は、αおよびβ鎖の一方または両方の細胞質ド メインが末端切除されているＭＨＣクラスＩＩ分子である。細胞質ドメインの末 端切除は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの結合およびＭＨＣクラスＩＩ 分子の細胞表面での発現を可能にするが、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子の架橋 の際ＭＨＣクラスＩＩ蛋白鎖の細胞質ドメインによって生成される細胞内シグナ ルによって誘発される内因性Ｂ７発現の誘導を妨げることが知られている。Ｌ． クオロヴァ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻７５９−７６２頁（１９９１） ；Ｎ．ナバヴィ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻２６６−２６８頁（１９９２）。Ｂ ７−２およびＢ７−３の発現もまた架橋している表面ＭＨＣクラスＩＩ分子によ っ て誘導され、したがってＭＨＣクラスＩＩ分子の末端切除はＢ７−２および／ま たはＢ７−３の誘導をも妨げ得る。Ｂ７−２および／またはＢ７−３の構成的発 現を行うようトランスフェクトさせた腫瘍細胞においては、内因性共同刺激分子 の発現を阻害する、例えば、起こり得る下方調節フィードバック機作を抑制する ことが望ましいかも知れない。細胞質ドメイン末端切除型のＭＨＣクラスＩＩα およびβ鎖蛋白をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションは 、内因性Ｂ７−１の発現および恐らくは内因性Ｂ７−２およびＢ７−３の発現を も阻害するであろう。このような変異体は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ鎖遺伝子 中の膜貫通領域をコードしているヌクレオチドの後に停止コドンを導入すること によって生成させることができる。α鎖またはβ鎖蛋白いずれかの細胞質ドメイ ンを末端切除、または、より完全なＢ７（そして恐らくはＢ７−２および／また はＢ７−３）誘導の阻害のために、αおよびβ鎖の両者を末端切除することがで きる。例えばグリフィス等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８５巻４８４７−４８５２頁（１９８８）、ナバヴィ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１４２巻１４４４−１４４７頁（１９８９）を参照されたい。 腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白をコードしている核酸でトランスフェク トすることにより、ＭＨＣクラスＩ分子を発現するよう修飾することができる。 核酸の例については、Ｌ．フード等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻 ５２９−５６８頁（１９８３）およびＣ．オーフレイおよびＪ．Ｌ．ストロミン ガー、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻１９７ −２４７頁（１９８７）を参照されたい。所望により、その腫瘍細胞がβ２ミク ログロブリンを発現しないならば、これを、β２ミクログロブリン蛋白をコード している核酸でトランスフェクトすることもできる。核酸の例については、Ｄ． グソウ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９巻３１３２−３１３８頁（１９８７） およびＪ．Ｒ．パーンズ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ７８巻２２５３−２２５７頁（１９８１）を参照されたい。ＭＨＣクラスＩＩ分 子と同様に、腫瘍細胞で発現されるＭＨＣクラスＩ遺伝子またはＭＨＣクラスＩ 遺伝子の多形性対立遺伝子の数を増加させることにより、その腫瘍細胞がＴ細胞 に提示することのできる抗原性フラグメントのスベクトルを増大させることがで きる。 １以上の分子、例えばＢ７−２および／またはＢ７−３分子、ＭＨＣクラスＩ Ｉα鎖蛋白およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白をコードしている核酸で腫瘍細胞を トランスフェクトする時、このトランスフェクションは同時にまたは順次実施す ることができる。もしトランスフェクションを同時に実施するならば、コードさ れる配列が使用する特定のベクターの負担能力を超えない限り、当該分子は同じ 核酸上に導入できる。別法として、当該分子を別々の核酸によりコードすること もできる。トランスフェクションを連続的に実施し、且つ腫瘍細胞が選択マーカ ーを用いて選択される場合、一つの選択マーカーを最初に導入された核酸に関連 して使用し、一方、異なる選択マーカーを次に導入される核酸に関連して使用す ることができる。 腫瘍細胞の細胞表面でのＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）の発現は、 例えば、異なるＭＨＣ分子に対する蛍光標識されたモノクローナル抗体を用いて 腫瘍細胞の免疫蛍光によって測定することができる。特定のＭＨＣ分子の非多形 性領域（非対立遺伝子特異性）または特定のＭＨＣ分子の多形性領域（対立遺伝 子特異性）のいずれかを認識するモノクローナル抗体を使用することができ、そ してこれらは当業者に知られている。 （７）腫瘍細胞上でのＭＨＣ分子の誘導または発現の増強。 腫瘍細胞の表面でＭＨＣ分子を発現するよう腫瘍細胞をエクスビボで修飾する 別のアプローチは、その腫瘍細胞表面でＭＨＣ分子の発現を誘導または増強する ために、ＭＨＣ分子の発現を剌激する物質を使用することである。例えば、腫瘍 細胞を培養基中、インビトロで当該物質と接触させることができる。ＭＨＣ分子 の発現を刺激する物質は、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺 伝子の転写を増強することによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ ｍＲＮＡの翻訳を増強することによって、または、ＭＨＣクラスＩおよび／また はクラスＩＩ蛋白の細胞表面に対する安定性または細胞表面への輸送を増強する ことによって、働き得る。幾つかの物質がＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現 のレベルを増強することが示されている。例えば、Ｓ．Ｍ．コックフィールド等 、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻２９６７−２９７４頁（１９９０）；Ｒ．Ｊ ．ノエル等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻１７１８−１７２３頁（１９８６ ）；Ｊ．Ｊ．モンド等、Ｊ．ｍｍｕｎｏｌ．、１２７巻８８１−８８８頁（１９ ８１）；Ｃ．Ｌ．ウィリアム等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻１５５９−１ ５６７頁（１９８９）；Ａ．セラダおよびＲ．マキ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１ ４６巻１１４−１２０頁（１９９１）およびＬ．Ｈ．グリムチャーおよびＣ．Ｊ ．カラ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻１３−４９頁（１９９２） およびそれらの参照文献を参照されたい。これらの物質には、サイトカイン、他 の細胞表面分子に対する抗体、およびホルボールエステル類が包含される。広範 囲の細胞型においてＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を上方調節する一つの 物質はサイトカインインターフェロンγである。即ち、例えば、Ｂ７−２および ／またはＢ７−３およびＢ７−１を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、インタ ーフェロンγとの接触により、ＭＨＣ分子の発現を増強するようさらに修飾する ことができる。 腫瘍細胞表面でのＭＨＣ分子の発現を誘導または増強するために使用できるも う一つの物質は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子の転写を上方調節する 転写因子をコードしている核酸である。このような核酸は、腫瘍細胞中にトラン スフェクトされてＭＨＣ遺伝子の転写の増強を惹起することができ、その結果Ｍ ＨＣ蛋白の細胞表面レベルを増大させる。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝 子は異なった転写因子によって調節されている。しかしながら、複数のＭＨＣク ラスＩＩ遺伝子がそうであるように、複数のＭＨＣクラスＩ遺伝子が協同的に調 節されている。故に、ＭＨＣ遺伝子の発現を調節する転写因子をコードしている 核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションは、腫瘍細胞表面の幾つかの異なっ たＭＨＣ分子の発現を増強することができる。ＭＨＣ遺伝子の発現を調節する幾 つかの転写因子が同定され、クローニングされ、そして性格決定されている。例 えば、Ｗ．ライス等、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、４巻１５２８−１５４０頁（１９ ９０）；Ｈ．Ｃ．リュー等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻１５８１−１５８４頁（ １ ９８８）；Ｄ．Ｋ．ディディアー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻７３２２−７３２６頁（１９８８）。 （８）腫瘍細胞における非変異鎖の発現の阻害。 本発明のもう一つの態様は、Ｔ細胞共同刺激分子（例えばＢ７−２および／ま たはＢ７−３およびＢ７−１）を発現するよう修飾された腫瘍細胞であって、Ｍ ＨＣクラスＩＩに結合した蛋白、非変異鎖、の発現が阻害される腫瘍細胞を提供 するものである。非変異鎖の発現が阻害されて、内因性ＴＡＡペプチドとＭＨＣ クラスＩＩ分子との結合が促進し、抗原−ＭＨＣ複合体が作り出される。この複 合体は、共同剌激シグナルと関連してＴ細胞の活性化を誘導するためのＴ細胞に おける抗原特異的シグナルを誘発することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は内 因性ペプチドを提示する能力のあることが示されている。Ｊ．Ｇ．ナクターン等 、Ｎａｔｕｒｅ、３４３巻７４−７６頁（１９９０）；Ｓ．ワイスおよびＢ．ボ ーゲン、Ｃｅｌｌ、７６７−７７６頁（１９９１）。しかしながら、ＭＨＣクラ スＩＩ分子を天然に発現する細胞においては、αおよびβ鎖蛋白は、小胞体から のこの蛋白の細胞内輸送の間、非変異鎖（以下Ｉｉ）と結合している。Ｉｉは、 部分的には、内因性ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を妨げることによ り機能すると信ぜられる。Ｗ．エリオット等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻 ２９４９−２９５２頁（１９８７）；Ｂ．ストッキンガー等、Ｃｅｌｌ、５６巻 ６８３−６８９頁（１９８９）；Ｌ．グアグリアーディ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ ｎｄｏｎ）、３４３巻１３３−１３９頁（１９９０）；Ｏ．バッケ等、Ｃｅｌｌ 、６３巻７０７−７１６頁（１９９０）；Ｖ．ロットルー等、Ｎａｔｕｒｅ、３ ４８巻６００−６０５頁（１９９０）；Ｊ．ピーターズ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４ ９巻６６９−６７６頁（１９９１）；Ｐ．ロッチェ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４５巻 ６１５−６１８頁（１９９０）；Ｌ．テイトン等、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻３９ −４４頁（１９９０）。ＴＡＡは腫瘍細胞において内因性合成されるのであるか ら、これらから誘導されるペプチドは細胞内で利用できると思われる。したがっ て、Ｉｉを発現する腫瘍細胞でのＩｉの発現の阻害は、ＴＡＡペプチドがＭＨＣ クラスＩＩ分子と結合する見込みを増大させ得る。この機作と合致して、Ｉｉ遺 伝子 によるＭＨＣクラスＩＩ⁺、Ｉｉ^-腫瘍細胞の超トランスフェクションが、この腫 瘍細胞による腫瘍特異的免疫の刺激を妨げることが示された。Ｖ．Ｋ．クレメン ツ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻２３９１−２３９６頁（１９９２）。 修飾に先立ち、腫瘍細胞におけるＩｉの発現を、ノーザンブロッティングによ るＩｉ ｍＲＮＡの存在もしくは不在の検出により、または免疫沈降によるＩｉ 蛋白の存在または不在の検出により、評価することができる。Ｉｉの発現を阻害 するための好ましいアプローチは、Ｉｉ遺伝子のコーディングまたは調節領域に 対してアンチセンスの核酸を腫瘍細胞中に導入することによるものであって、こ れはかつて記載されている。Ｎ．コッホ等、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻１６７７−１ ６８３頁（１９８７）。例えば、Ｉｉ ｍＲＮＡの翻訳開始部位付近のヌクレオ チドに対し相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１またはそれ 以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍細胞を含む培地に、典型的には ２００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド濃度で添加することができる。このアン チセンスオリゴヌクレオチドは腫瘍細胞により取り込まれてＩｉ ｍＲＮＡとハ イブリダイズし、翻訳を妨げる。別の態様においては、組み替え発現ベクターを 使用し、ここで核酸は、Ｉｉ遺伝子のコーディングまたは調節領域に対しアンチ センスであるｍＲＮＡが産生されるような向きにＩｉ遺伝子の配列をコードして いる。したがってこの組み替え発現ベクターによりトランスフェクトされた腫瘍 細胞は、Ｉｉ蛋白の産生を妨げるためのＩｉアンチセンス核酸の継続的な供給源 を含む。別法として、腫瘍細胞におけるＩｉ発現は、この腫瘍細胞を、Ｉｉ発現 を妨害する物質で処理することによって阻害することもできる。例えば、Ｉｉ遺 伝子の発現、ＩｉｍＲＮＡの翻訳またはＩｉ蛋白の安定性もしくは細胞内輸送を 阻害する薬物を使用することができる。 （９）修飾される腫瘍細胞の型。 本明細書に記載されるような修飾を受ける腫瘍細胞は、Ｂ７−２および／また はＢ７−３を単独またはＢ７−１と組み合わせて発現するための、本発明により 包含される１またはそれ以上のアプローチによりトランスフェクトまたは処理す ることができる腫瘍細胞を包含する。必要ならば、この腫瘍細胞をさらに修飾し てＭＨＣ分子またはＩｉ発現の阻害剤を発現するようにすることができる。腫瘍 細胞を取得する腫瘍は、例えば人間の患者において、自然発生したものであって よく、または、例えば動物対象において実験的に誘導もしくは誘発したものであ ってよい。腫瘍細胞は、例えば、臓器の充実性腫瘍、例えば肺、肝臓、乳房、結 腸、骨などの腫瘍から取得することができる。充実性臓器の悪性腫瘍には、癌腫 、肉腫、黒色腫および神経芽細胞腫が包含される。腫瘍細胞は、リンパ腫、骨髄 腫または白血病のような血液に由来する（即ち、分散された）悪性腫瘍から取得 することもできる。 修飾されるべき腫瘍細胞は、トランスフェクション前にその細胞表面にＭＨＣ 分子を発現するもの、および皆無または低いレベルのＭＨＣクラスＩおよび／ま たはクラスＩＩ分子を発現するものを包含する。正常な細胞型のうち少数がＭＨ ＣクラスＩＩ分子を発現する。故に、多くの腫瘍細胞は天然にはＭＨＣクラスＩ Ｉ分子を発現しないであろうと予想される。これらの腫瘍は、Ｂ７−２および／ またはＢ７−３およびＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するよう修飾することができ る。幾つかの型の腫瘍、例えば黒色腫（ヴァン・ドゥイネン等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８巻１０１９−１０２５頁、１９８８）、び慢性大細胞リンパ腫（ オキーン等、Ｃａｎｃｅｒ、６６巻１１４７−１１５３頁、１９９０）、頭頸部 の扁平上皮癌（マティジュセン等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）６巻９５−１０ ０頁、１９９１）および大腸直腸癌（モラー等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６ 巻１５５−１６２頁、１９９１）は、表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を天然に発現す ることが判明している。天然にクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞は、Ｂ７−２ および／またはＢ７−３、そしてさらに、他のクラスＩＩ分子を発現するよう修 飾して、その腫瘍細胞により提示され得るＴＡＡペプチドのスペクトルを増大さ せ ることができる。殆どの非悪性腫瘍細胞の型はＭＨＣクラスＩ分子を発現する。 しかしながら、悪性腫瘍への形質転換はしばしば腫瘍細胞の表面でのＭＨＣクラ スＩ分子の発現の下方調節を伴う。Ａ．シバ等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、 ５０巻６９９−７０９頁（１９８４）。重要なことに、腫瘍細胞によるＭＨＣク ラスＩ抗原の発現の喪失は、腫瘍細胞のより大きな攻撃性および／または転移可 能性を伴う。Ｐ．Ｉ．シュリアー等、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻７７１−７７５頁 （１９８３）；Ｃ．Ａ．ホールデン等、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ ．、９巻８６７−８７１頁（１９８３）；Ｍ．バニヤッシュ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．、１２９巻１３１８−１３２３頁（１９８２）。ＭＨＣクラスＩ発現が阻 害されることが示されている腫瘍の型には、黒色腫、大腸直腸癌および扁平上皮 癌が包含される。ヴァン・ドゥイネン等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８巻１０ １９−１０２５頁（１９８８）；モラー等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６巻１ ５５−１６２頁（１９９１）；Ａ．シバ等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５０ 巻６９９−７０９頁（１９８４）；Ｃ．Ａ．ホールデン等、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９巻８６７−８７１頁（１９８３）。クラスＩ分子の発 現ができない、または低レベルのＭＨＣクラスＩ分子のみを発現する腫瘍細胞は 、本明細書に記載される１またはそれ以上の技術により修飾して、腫瘍細胞表面 でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導または増強させ、腫瘍細胞の免疫原性を亢 進させることができる。 （１０）インビボでの腫瘍細胞の修飾。 本発明のもう一つの態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１ を発現させてＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発させるよう、腫瘍細胞をイ ンビボで修飾することにより、この腫瘍細胞の免疫原性を増大させるための方法 を提供する。加えて、腫瘍細胞をインビボでさらに修飾してＭＨＣ分子を発現さ せ、Ｔ細胞における第一の、抗原特異的シグナルを誘発させるようにすることが できる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸 を、腫瘍細胞の表面での共同剌激分子の発現に好適な形でその腫瘍細胞中に導入 することにより、この腫瘍細胞をインビボで修飾することができる。同様に、Ｍ ＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子またはＩｉ遺伝子のアンチセンス配列をコー ドしている核酸を腫瘍細胞中にインビボで導入することができる。一つの態様に おいて、遺伝子治療の一形式として、組み替え発現ベクターを用いて、Ｂ７−２ および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸を腫瘍細胞にイン ビボで送り込むことができる。インビボ遺伝子治療に有用なベクターはかつて記 載されており、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ 関連ウイルスベクターを包含する。例えば、Ｍ．Ａ．ローゼンフェルト、Ｃｅｌ ｌ、６８巻１４３−１５５頁（１９９２）；Ｗ．Ｆ．アンダーソン、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ、２２６巻４０１−４０９頁（１９８４）；Ｔ．フリードマン、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ、２４４巻１２７５−１２８１頁（１９８９）を参照されたい。別法として 、腫瘍細胞中への裸の核酸の直接注射により、核酸を腫瘍細胞にインビボで送り 込むこともできる。例えば、Ｇ．アサディ等、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻８１５− ８１８頁（１９９１）を参照されたい。送り込むための装置は市販品が入手可能 である（バイオラド）。所望により、注射に好適となるように、この核酸をリポ ソームのような担体と複合体形成させることができる。リポソームと複合体形成 したＭＨＣクラスＩ分子をコードしている核酸は、黒色腫の患者の腫瘍中に直接 注射された。Ｍ．ホフマン、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻３０５−３０９頁（１９ ９２）。 腫瘍細胞は、本明細書に記載のように、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およ びＢ７−１（そして必要ならばＭＨＣ分子）の発現を誘導または増強する物質の 使用により、インビボで修飾することもできる。この物質は、全身的に、例えば 静脈内注射、または好ましくは腫瘍細胞に局所的に投与できる。 （１１）抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応のエフェクター相。 本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞における抗原特異的シ グナルおよび共同刺激シグナルを誘発することにより抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応 の剌激に有用である。この、免疫反応の誘導的または求心的相に続いて、Ｔ細胞 のエフェクター集団が生成される。これらのエフェクターＴ細胞集団は、ＣＤ４ ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を含み得る。このエフェクター集団は、例 えば腫瘍細胞の細胞溶解による、腫瘍細胞の排除を担う。いったんＴ細胞が活性 化されると、共同剌激分子の発現は、エフェクターＴ細胞による標的細胞の認識 またはＴ細胞のエフェクター機能にとって標的細胞上で必要ない。Ｆ．Ａ．ハー ディングおよびＪ．Ｐ．アリソン、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻１７９１− １７９６頁（１９９３）。故に、本発明に係る修飾された腫瘍細胞により誘導さ れる抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応は、修飾された腫瘍細胞および共同剌激分子を発 現しない非修飾腫瘍細胞の両者に対して有効である。 さらに、Ｔ細胞仲介免疫反応の求心的および遠心的相に要する細胞表面のＭＨ Ｃ分子の密度および／または型は相違し得る。Ｔ細胞の最初の活性化に要するよ り少ないＭＨＣ分子または或る型のＭＨＣ分子のみ（例えばＭＨＣクラスＩＩで はなくＭＨＣクラスＩ）が、エフェクターＴ細胞による認識のために腫瘍細胞上 で必要であるかも知れない。故に、天然で少量のＭＨＣ分子を発現するが、より 大量のＭＨＣ分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、非修飾腫瘍細胞に対し て有効なＴ細胞仲介免疫反応を誘導することができる。別法として、天然でＭＨ ＣクラスＩ分子を発現するがＭＨＣクラスＩＩ分子は発現せず、そこでＭＨＣク ラスＩＩ分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、親のＭＨＣクラスＩ＋、ク ラスＩＩ−腫瘍細胞を排除し得るエフェクターＴ細胞集団を含むＴ細胞仲介免疫 反応を誘導することができる。 （１２）腫瘍細胞の治療用組成物。 本発明のもう一つの態様は、対象へのインビボでの薬学的投与に好適な生物学 的に適合し得る型の、修飾された腫瘍細胞の組成物である。この組成物は、或る 量の修飾された腫瘍細胞および生理学上許容し得る担体を含む。修飾された腫瘍 細胞の量は、治療上有効であるように選択する。「インビボでの薬学的投与に好 適な生物学的に適合し得る型」という語は、その腫瘍細胞の毒性効果よりその腫 瘍細胞の治療効果が優っていることを意味する。「生理学上許容し得る担体」と は、対象と生物学的に適合し得る担体である。許容し得る担体の例には、食塩水 および緩衝剤水溶液が包含される。全ての場合において、組成物は無菌でなけれ ばならず、また容易な被注射性が成立する程度まで流体でなければならない。「 対 象」という語は、腫瘍が発生または実験的に誘導され得る生体を包含することを 意図している。対象の例には、人間、犬、猫、マウス、ラット、およびそれらの トランスジェニック種が包含される。 本発明に係る治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するために有効な期間 および用量で、既知の方法を用いて実施することができる。例えば、修飾された 腫瘍細胞の治療的有効量は、年齢、性別および個体の体重、腫瘍細胞の型および 腫瘍負荷の程度、ならびに対象の免疫学的応答能のような因子に応じて変わり得 る。投与計画は最良の治療応答を提供するよう調節することができる。例えば、 修飾された腫瘍細胞の単一の用量を投与することができ、または幾つかの用量を 回を追って投与することができる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内および皮下 注射を含む注射によるものであってよい。 （１３）腫瘍特異的Ｔリンパ球のインビトロ活性化。 Ｔ細胞における共同刺激シグナルの誘発により抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応を誘 導または冗進するもう一つのアプローチは、腫瘍を持っている対象からＴリンパ 球を取得し、腫瘍細胞および単独またはＢ７−１と組み合わせたＢ７−２および ／またはＢ７−３の刺激型でこれを刺激することによってこれをインビトロで活 性化することである。Ｔ細胞は対象から、例えば末梢血から取得できる。末梢血 はさらに分画して赤血球を除き、そしてＴリンパ球またはＴリンパ球亜集団に富 ませまたはこれを単離することができる。Ｔ細胞は、剌激型のＢ７−２および／ またはＢ７−３と合した、対象から（例えば、生検から、または血液由来の悪性 腫瘍の場合は末梢血から）取得した腫瘍細胞と共に培養することにより、または 別法として、本明細書に記載されるような修飾された腫瘍細胞に暴露することに より、インビトロで活性化することができる。「刺激型」という語は、その共同 刺激分子がＴ細胞上のそのレセプターと架橋してＴ細胞において共同剌激シグナ ルを誘発できることを意味する。共同刺激分子の刺激型は、例えば、共同刺激分 子の可溶性多価分子、または例えば固体支持体に結合させた共同剌激分子の固定 型であってよい。Ｔ細胞において共同剌激シグナルを誘発する能力を保持するＢ ７−２および／またはＢ７−３のフラグメント、突然変異体または変異体（例え ば融合蛋白）もまた使用することができる。好ましい態様においては、Ｂ７−２ および／またはＢ７−３の可溶性細胞外部分を使用してＴ細胞に共同剌激を提供 する。腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化するため、Ｔ細胞を腫瘍細胞およびＢ７−２お よび／またはＢ７−３と共に、または修飾された腫瘍細胞と共にインビトロで培 養した後、このＴ細胞を、例えば静脈内注射により対象に投与することができる 。 （１４）修飾された腫瘍細胞の治療用途。 本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍の免疫原性を増大させるのに使用す ることができ、故に腫瘍を持つ対象または腫瘍が発生するおそれのある対象にお いてＴリンパ球仲介抗腫瘍免疫を誘導または亢進するために治療的に使用するこ とができる。腫瘍を持つ対象を処置するための方法は、その対象から腫瘍細胞を 取得し、その腫瘍細胞を、例えば、適当な核酸でそれらをトランスフェクトする ことにより、Ｔ細胞共同刺激分子を発現するようエクスビボで修飾し、そしてこ の修飾された腫瘍細胞の治療的有効用量を対象に投与することを含む。腫瘍細胞 中に導入すべき適当な核酸は、本明細書に記載の、単独の、またはＢ７−１、Ｍ ＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）またはＩｉアンチセンス配列をコードし ている核酸と合した、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸を 包含する。別法として、対象から腫瘍細胞を取得した後、Ｂ７−２および／また はＢ７−３の発現を誘導または増強する物質を用いて（そしてことによるとＢ７ −１またはＭＨＣ分子を誘導または増強する物質をも使用して）これらをエクス ビボで修飾することができる。 腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の外科的除去、例えば腫瘍の生検によって対象 から、または、血液由来の悪性腫瘍の場合には対象の血液試料から取得できる。 実験的に誘導された腫瘍の場合、その腫瘍の誘導に使用される細胞、例えば腫瘍 セルラインの細胞を使用することができる。充実性腫瘍の試料は、最大のトラン スフェクション効率のために、修飾に先立ち、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を生成 するよう処理することができる。可能性ある処理には、細胞の手動分散または結 合組織の繊維の、例えばコラゲナーゼによる酵素的消化が包含される。 腫瘍細胞は、対象から取得した直後にトランスフェクトすることができ、また はその腫瘍細胞のさらなる性格決定（例えば、細胞表面分子の発現の測定）を可 能とするためトランスフェクション前にインビトロ培養することができる。トラ ンスフェクション用に選択される核酸は、その腫瘍細胞により発現される蛋白の 性格決定後に決定することができる。例えば、その腫瘍細胞の細胞表面でのＭＨ Ｃ蛋白の発現、および／またはその腫瘍細胞におけるＩｉ蛋白の発現を評価する ことができる。皆無のまたは限られた量または型のＭＨＣ分子（クラスＩまたは クラスＩＩ）を発現する腫瘍は、ＭＨＣ蛋白をコードしている核酸でトランスフ ェクトすることができ、Ｉｉ蛋白を発現する腫瘍はＩｉアンチセンス配列でトラ ンスフェクトすることができる。必要ならば、トランスフェクションの後に、目 的とする核酸と共に腫瘍細胞中に導入された選択マーカー（例えば薬物耐性）を 用いることにより、当該核酸の導入について腫瘍細胞をスクリーニングすること ができる。 対象への投与に先立ち、修飾された腫瘍細胞が対象内でそれ以上増殖できない ようにする処理をし、それによりその修飾された腫瘍細胞の考え得る生長を防ぐ ことができる。可能な処理は照射またはマイトマイシンＣ処理であり、これらは 、腫瘍細胞の増殖能を破棄する一方で、Ｔ細胞における抗原特異的および共同刺 激シグナルを誘発し、そのようにして免疫反応を剌激する当該腫瘍細胞の能力を 維持する。 修飾された腫瘍細胞は、その腫瘍細胞を対象に注射することによって対象に投 与することができる。注射の経路は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮 下とすることができる。元の腫瘍の部位への修飾された腫瘍細胞の投与は、元の 腫瘍に対する局所Ｔ細胞仲介免疫反応の誘導にとって有益となり得る。播種的方 法、例えば静脈内注射）での修飾された腫瘍細胞の投与は、全身的な抗腫瘍免疫 を提供し、さらに、元の部位からの腫瘍細胞の転移性拡散から保護し得る。修飾 された腫瘍細胞は、他の治療形態の前にまたはそれと一緒に投与することができ 、または、化学療法もしくは外科的侵襲のような他の処置の後に投与することが できる。 さらに、１以上の型の修飾された腫瘍細胞が対象に投与され得る。例えば、有 効なＴ細胞反応は、１以上の型の共同剌激分子への暴露を必要とするかも知れな い。さらに、異なる共同刺激分子に対するＴ細胞の時間を追って連続した暴露が 、有効な反応の生成にとって重要であるかも知れない。例えば、活性化の際Ｂ細 胞は、その反応の初期にＢ７−２を発現することが知られている（刺激の約２４ 時間後）。続いてＢ７−１およびＢ７−３がＢ細胞により発現される（刺激の約 ４８−７２時間後）。即ち、Ｔ細胞は、免疫反応中のＢ７−１および／またはＢ ７−３への暴露による免疫反応の誘導の初期にＢ７−２への暴露が必要であるの かも知れない。したがって、腫瘍細胞に対する有効な免疫反応を対象に生成させ るために、異なる型の修飾された腫瘍細胞を異なった時期に投与することができ る。例えば、Ｂ７−２を発現するよう修飾された腫瘍細胞を対象に投与すること ができる。この投与の後、同じ腫瘍由来であるがＢ７−３を発現（単独でまたは Ｂ７−１と共に）するよう修飾された腫瘍細胞を、その対象に投与することがで きる。 腫瘍によって対象を処置するもう一つの方法は、単独でまたはＢ７−１、ＭＨ Ｃ分子および／またはＩｉ発現の阻害剤と共にＢ７−２および／またはＢ７−３ を発現するよう、腫瘍細胞をインビボで修飾することである。この方法は、本明 細書の前項に記載のようなインビボ遺伝子治療のために有効なベクターおよび運 搬法を用いて、発現されるべき蛋白をコードしている核酸を提供することにより 、腫瘍細胞をインビボで修飾することを含み得る。別法として、Ｂ７−２および ／またはＢ７−３、そしてことによるとＢ７−１またはＭＨＣ分子の発現を誘導 または増強する１またはそれ以上の物質を、腫瘍を持つ対象に投与することがで きる。 本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍の転移性分散を防止または処置する ための、または腫瘍の再発を防止または処置するための方法に使用することもで きる。以下の実施例の一つに詳細に立証されるように、Ｂ７−１発現腫瘍細胞に より誘導される抗腫瘍免疫は、再暴露の腫瘍細胞がＢ７−１を発現するか否かに 拘わらず、腫瘍細胞による後のチャレンジに対して有効である。即ち、本明細書 に記載されるような修飾された腫瘍細胞の投与または腫瘍細胞のインビボ修飾は 、元の、非修飾腫瘍の細胞ならびに元の腫瘍の転移または可能な元の腫瘍の再成 長 に対する腫瘍の免疫を提供することができる。 さらに本発明は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞における抗腫瘍反応を特異的に誘導するため の組成物および方法を提供する。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結 びついた抗原によって活性化される。ＴＡＡのペプチドフラグメントとＭＨＣク ラスＩＩ分子との結合は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞によるこれらの抗原性ペプチドの認識 を産む。Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現す るよう修飾された、または、Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共にＭＨＣクラ スＩＩ分子を発現するようインビボ修飾された腫瘍細胞を対象に提供することは 、腫瘍抗原の提示をＭＨＣクラスＩＩ経路に向かわせるのに有用であり、それに より、腫瘍細胞に対し特異的なＣＤ４⁺Ｔ細胞による抗原認識およびその活性化 がもたらされる。抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺Ｔ細 胞いずれかのインビボでの涸渇を用いて、特異的抗腫瘍免疫が特定の（例えばＣ Ｄ４⁺）Ｔ細胞亜集団により仲介されることを立証することができる。 修飾された腫瘍細胞に最初に暴露された対象は、その後の非修飾腫瘍細胞への 暴露に対して有効な抗腫瘍特異的Ｔ細胞反応を示す。即ち、その対象は抗腫瘍特 異的免疫を示す。別の人間の対象における抗腫瘍免疫を誘導する免疫原としての 一人の人間の対象からの本発明に係る修飾された腫瘍細胞の一般的使用は、血縁 のない人間間の組織適合性の相違によって阻まれる。しかしながら、将来の腫瘍 出現の可能性から防御するために、或る個体からの修飾された腫瘍細胞を使用し て別の個体における抗腫瘍免疫を誘導することは、家族性悪性腫瘍の場合に有用 であるかも知れない。この状況においては、修飾されるべき腫瘍細胞の、腫瘍を 持つドナーは、修飾された腫瘍細胞の（腫瘍を持たない）受容者と濃い血縁関係 にあり、故にドナーおよび受容者はＭＨＣ抗原を共有する。或る型の悪性腫瘍、 例えば或る乳癌および直腸癌には強い遺伝性要素が確認されている。特定の悪性 腫瘍への易罹患性がわかっており、一人が現在腫瘍を持っている家族において、 その一人からの腫瘍細胞を、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を単独でまたはＢ ７−１と組み合わせて発現するよう修飾し、易罹患性の組織適合性の家族成員に 投与して、その家族が罹患し易い型の腫瘍に対する受容者の抗腫瘍免疫反応を誘 導することができる。この抗腫瘍反応は、免疫感作された受容者におけるその後 の腫瘍出現に対する防御免疫を提供し得る。 （１５）腫瘍特異的Ｔ細胞寛容。 実験的に誘導された腫瘍の場合、対象（例えばマウス）を、非修飾腫瘍細胞に よりチャレンジする前に本発明に係る修飾された腫瘍細胞に暴露することができ る。即ち、最初に対象は、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を活性化するＢ７−２および／ま たはＢ７−３、およびＢ７−１と共に腫瘍細胞上のＴＡＡペプチドに暴露される 。すると活性化されたＴ細胞は、非修飾腫瘍細胞によるその後のチャレンジに対 して有効となる。自然発生腫瘍の場合は、人間の患者の場合がそうであるが、対 象の免疫系は、本発明に係る修飾された腫瘍細胞への暴露の前に、非修飾腫瘍細 胞に暴露される。即ちこの対象は、共同剌激シグナルの不在下で腫瘍細胞上のＴ ＡＡペプチドに最初に暴露される。この状況は、非修飾腫瘍細胞に暴露されてお り且つ接触しているＴ細胞においてＴＡＡ特異的Ｔ細胞の寛容を誘導すると思わ れる。共同刺激シグナルを誘発できる修飾された腫瘍細胞への対象の二次的な暴 露は、この腫瘍への一次暴露によりアネルギー化されたＴＡＡ特異的Ｔ細胞の寛 容に打ち勝つには十分でないかも知れない。故に、既に非修飾腫瘍細胞に暴露さ れた対象における抗腫瘍免疫を誘導するための修飾された腫瘍細胞の使用は、小 さな腫瘍負荷、例えば転移していない小さな限局性腫瘍を有する早期に診断され た患者において最も効果的となり得る。この状況においては、腫瘍細胞は身体の 限られた領域に限定されており、したがってＴ細胞レパートリーの一部分が腫瘍 抗原に暴露されアネルギー化しているに過ぎない。例えば限局された腫瘍の外科 的除去および分離された腫瘍細胞の修飾の後の全身的方法による修飾された腫瘍 細胞の投与は、非アネルギー化Ｔ細胞を、単独、またはＢ７−１と組み合わせた Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共に腫瘍抗原に暴露させ、それにより非アネ ルギー化Ｔ細胞における抗腫瘍反応を誘導することができる。この抗腫瘍反応は 、可能性ある腫瘍の再成長に対して、または、検出されていないかも知れない元 の腫瘍の微小転移に対して有効であり得る。対象において腫瘍細胞に対する広汎 に広がった末梢Ｔ細胞寛容に打ち勝つためには、サイトカインのようなさらなる シ グナルを、修飾された腫瘍細胞と共に対象に提供する必要があるかも知れない。 Ｔ細胞成長因子として機能するサイトカイン、例えばＩＬ−２は、修飾された腫 瘍細胞と共に対象に提供することができる。インビトロ系においてＩＬ−２は、 二次アロ抗原剌激の時点で外因性ＩＬ−２を添加する時、前にアネルギー化され たＴ細胞のアロ抗原特異的反応を回復できることが示されている。Ｐ．タン等、 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻１６５−１７３頁（１９９３）。 腫瘍に対する対象のＴ細胞の寛容にも拘わらず対象における抗腫瘍Ｔ細胞反応 を生成させる別のアプローチは、腫瘍に暴露されていない別の対象（ナイーヴド ナーと称する）由来のＴ細胞において抗腫瘍反応を刺激し、このナイーヴドナー からの剌激されたＴ細胞を、腫瘍を持つ対象に移し、その結果、移されたＴ細胞 が当該腫瘍細胞に対する免疫反応を装備できるようにする事である。このＴ細胞 を本発明に係る修飾された腫瘍細胞を用いてインビトロで剌激することにより、 ナイーヴドナー由来のＴ細胞で抗腫瘍反応が誘導される。このような養子免疫伝 達のアプローチは一般に、移入されるＴ細胞と腫瘍を持つ受容者との間の組織適 合性の相違のため、異系交配された集団では妨げられる。しかしながら、同種骨 髄移植における進歩をこの状況に適用して、受容者による養子免疫伝達された細 胞の受容および移植片対宿主病の防止を可能にすることができる。まず、腫瘍を 持つ対象（宿主と称する）を既知の方法によってナイーヴドナーからの同種骨髄 移植のために準備し、移植を施す。宿主の準備は、全身の照射を含み、これは、 腫瘍に対し寛容が成立しているＴ細胞および腫瘍細胞自身を含む、宿主の免疫系 を破壊する。骨髄移植は、骨髄移植片からの成熟Ｔ細胞の涸渇といったような移 植片対宿主病を防止するための処置、免疫抑制剤による宿主の処置、または宿主 組織に対するドナーＴ細胞の寛容を誘導するためのＣＴＬＡ４Ｉｇのような物質 による宿主の処置を伴う。次に、宿主に残った腫瘍細胞または宿主の元の腫瘍の 再成長もしくは転移に対して応答し得る抗腫瘍特異的Ｔ細胞を宿主に提供するた め、ナイーヴドナーからのＴ細胞を本明細書に記載のようにＢ７−２および／ま たはＢ７−３を発現するよう修飾した、この宿主由来の腫瘍細胞によってインビ トロで刺激する。即ち、ドナーＴ細胞は最初に共同刺激シグナルと共に腫瘍細胞 に暴露され、故にこの腫瘍細胞に応答するよう活性化される。次いでこれらの活 性化された抗腫瘍特異的Ｔ細胞を、非修飾腫瘍細胞に対し反応性である宿主に移 入する。宿主はドナーの免疫系により再構成されているため、この宿主は移入さ れたＴ細胞を拒絶せず、さらに、移植片対宿主病を防止するための宿主の処置が 、移入されたＴ細胞と正常な宿主組織との反応性を妨げるであろう。Ｈ．Ｂリンパ球抗原医薬製剤の投与 本発明のペプチドはＴ細胞を介する免疫反応を強化または抑制するための生体 内医薬投与に適する生物学的に適応性ある剤型として対象体に投与される。「生 体内投与に適する生物学的に適応性ある剤型」とは治療効果が毒性効果を凌いで いる投与される蛋白質の製剤を意味する。対象体という用語は免疫反応を起こす 生物体、たとえば哺乳類、を含むものを意図する。対象体の例には、ヒト、犬、 猫、マウス、ラットならびにこれらのトランスジェニック種を含む。ここに記載 する新規Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドの投与はペプチド単独あるいは他 種Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドとの組合せでの治療的活性量および医薬 的に許容される担体を含むいかなる医薬的剤型をとることもできる。本発明の治 療用組成物の治療的有効量の投与とは所期結果を得るために必要な用量と時間に おいて有効な量であると定義される。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドの治 療的有効量は病状、年齢、性および個体の体重および個体中で所期反応を起こす ペプチドの能力のような因子によっても変化しうる。用量範囲は最適な治療反応 を得るように調整してもよい。例えば、毎日数回に分割した用量を投与してもよ いし、用量を治療状況の実情が示すものに比例して減量してもよい。 活性化合物（たとえば、ペプチド）は注射（皮下、静脈内など）、経口投与、 吸入、経皮投与または直腸投与のような好都合な方法でも投与されうる。投与経 路に依存して、活性化合物は化合物を不活化するかもしれない酵素や酸の作用お よび他の天然の条件から化合物を保護する物質で被覆することもありうる。 非経口投与以外によりＢ７−２活性を持つペプチドを投与するためには、その ペプチドの不活化を阻止する物質で被覆するか、またはそれと同時に投与するこ とが必要になることもありうる。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドを個体に 適当な担体、希釈剤またはアジュバント内で投与するか、酵素阻害剤と同時に投 与するか、またはリポソームのような適当な担体中で投与する。医薬的に許容さ れる希釈剤は食塩水および緩衝水溶液を含む。アジュバントは最広義に解され、 インターフェロンのようないかなる免疫促進化合物をも含む。ここにアジュバン トにはレゾルシノール類、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキ サデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤をも含むことが意 図されている。酵素阻害剤には膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロ ホスフェート（ＤＥＰ）およびトラシロールをも含む。リポソームには水中油中 水型乳剤ならびに通常のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎなど（１９８４年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：２７頁）を含む。 活性化合物は非経口的または腹腔内にも投与されうる。分散剤はグリセリン、 液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中および油中で製造すること もできる。通常の貯蔵および使用条件の下では、これらの製剤には微生物の生育 を予防するための保存剤をも含ませうる。 注射のために適当な医薬的組成物には無菌水溶液（水溶性の場合）または水分 散剤および無菌注射用溶液または分散剤の要時調製用無菌粉末剤を含む。すべて の場合、組成物は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度に流動性で なければならない。それは製造保存条件下に安定でなければならず、細菌および カビのような微生物の汚染から予防されていなければならない。担体は、例えば 水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび 液体ポリエチレングリコールなど）およびその混合物を含む溶媒または分散媒体 であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆剤の使用 、分散剤の場合には必要な粒子径の維持および界面活性剤の使用などにより維持 することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノー ル、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗カ ビ剤 により達成することができる。多くの場合、組成物内に、例えば、糖、マンニト ール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を含 むことが好ましいと思われる。注射剤組成物の長時間の吸収は組成物内に、例え ばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤 を含有させることによって行うことができる。 無菌注射剤溶液は活性化合物（たとえばＢ７−２活性を持つペプチド）の適量 を、要すれば前記成分１種または組合せを含む適当な溶媒中に添加し、続いて無 菌濾過することにより製造することができる。一般に、分散剤は活性化合物を基 礎的分散媒体および前記からの必要な他種成分を含む無菌賦形剤中に添加するこ とにより製造される。無菌注射溶液を製造するための無菌粉末の場合、好適な製 法は真空乾燥および凍結乾燥であって、予め無菌濾過した溶液からの活性成分（ たとえば、ペプチド）プラス所期追加的成分の粉末を与える。 活性化合物が前記のように適当に保護されている時、蛋白質は、例えば不活性 希釈剤または同化しうる食用担体とともに経口投与もされうる。ここに使用する 「医薬的に許容される担体」にはすべてのいかなる溶媒、分散媒体、被覆、抗菌 剤および抗カビ剤、等張剤および吸収遅延剤などをも含む。医薬的活性物質のた めのそれら媒体および薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。この活性 化合物にその通常の媒体または薬剤が配合禁忌である場合を除き、この治療的組 成物中での使用は意図されているものである。この組成物中には補助的活性化合 物を添加することもできる。 投与容易化と用量均一化のために非経口投与組成物を単位用量剤型に製剤化す ることは殊に有利である。ここに使用する単位用量剤型は、処置さるべき哺乳類 対象体への均一な投与に適し、各単位が所期治療効果を得られるように予め計算 された活性化合物の所定量および必要な医薬的担体とともに含む、物理的に区別 された単位を示す。本発明の単位用量剤型の処方は（イ）活性化合物に独特な特 性および達成さるべき特定の治療効果と（ロ）各個体の感受性に対する処置のた めに活性化合物を混合する技術に必然的な制限とにより決定され、直接的に依存 する。Ｉ．共剌激により誘発されるサイトカインの認識 ここに記載する新規Ｂリンパ球抗原活性を持つペプチドをコードする核酸配列 を使用して、たとえばＢ７−２のようなＢリンパ球抗原の一型による刺激に反応 してＴ細胞によって生産されるサイトカインを認識することができる。Ｔ細胞は 試験管内ではホルボールエステル、抗−ＣＤ３抗体または好ましくは抗原とＭＨ ＣクラスＩＩ分子とのような一次活性化シグナルにより準最適（ｓｕｂｏｐｔｉ ｍａｌ）の剌激を受け、例えばＢ７−２活性を持つペプチドをコードする核酸で トランスフェクトされて表面にペプチドを発現する細胞によるか、またはそのペ プチドの可溶性剌激型によるようなＢ７−２抗原の刺激型から共刺激的（ｃｏｓ ｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）シグナルを受ける。培地に放出される既知サイトカイン はＥＬＩＳＡにより、また、Ｔ細胞増殖を阻害するサイトカインを遮断する抗体 の能力やサイトカインにより誘発される他種細胞型の増殖を阻害する抗体の能力 により認識することができる。ＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットやＩＬ−７遮断抗体は Ｇｅｎｚｙｍe社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。ＩＬ−９およ びＩＬ−１２に対する遮断抗体はＧｅｎｅｔｉｃｓ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａ ｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。 前記試験管内Ｔ細胞共剌激検定法は共刺激によっても誘導されうる新規サイト カインを認識する方法においても使用することができる。もし、共剌激により誘 導される特定の活性、たとえばＴ細胞増殖、が既知サイトカインに対する遮断抗 体の添加によって阻止できなければ、その活性は未知サイトカインの作用に起因 するかもしれない。共刺激後、このサイトカインを常法により培地から精製して Ｔ細胞増殖を誘発する能力によりその活性を測定することができる筈である。 寛容性の誘導を予防するサイトカインを認識するために前記の試験管内Ｔ細胞 共剌激検定法を用いることができる。この場合、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを 与え、続いて共剌激シグナルを与えずに、選択したサイトカインと接触させる。 Ｔ細胞を洗浄し、休止させた後に、細胞に一次活性化シグナルおよび共刺激シグ ナルの両方を与える。もしＴ細胞が応答（たとえば、増殖するかまたはＩＬ−２ を生産する）しなければ、細胞は耐性を獲得しており、そのサイトカインは寛容 性誘導を予防しなかったものである。しかしながら、もしＴ細胞が応答すれば、 そのサイトカインにより寛容性誘導が予防されたものである。寛容性誘導を予防 できるサイトカインは移植受容者または自己免疫疾患患者の寛容性を誘発するた めにより効果的な手段としてのＢリンパ球抗原を遮断する薬剤に関連する生体内 遮断のための目標とすることができる。例えば、Ｂ７−２遮断剤をサイトカイン 遮断抗体とともに対象体に投与することができよう。Ｊ．共剌激を阻止する分子の認識 本発明の新規Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチド（たとえば、Ｂ７−２およ びＢ７−３）の別の応用はこれらペプチドの１種またはそれ以上を共刺激リガン ド結合の阻止剤および／または共剌激後のＴ細胞の細胞内シグナル伝達の阻止剤 である未発見分子を発見するスクリーニング検定法で使用することである。例え ば、Ｂ７−２のようなＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドを使用する固相結合 検定法はその抗原と適当なＴ細胞リガンド（たとえば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８） との結合を阻止する分子を認識するために使用することができるであろう。加え るに、前記の試験管内T細胞共刺激検定法は、その分子のＴ細胞増殖および／ま たはサイトカイン生産の阻止能（しかし、Ｂリンパ球抗原のその受容体への結合 は予防しない）で判定される、共刺激後にＴ細胞を経る細胞内シグナル伝達を阻 害する分子を発見するために使用することができるであろう。例えば、サイクロ スポリンＡ化合物はＴ細胞活性化をＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路ではなく、Ｔ細胞 受容体経路を経由する剌激によって阻止する。それ故、共剌激には異なる細胞内 シグナル伝達経路が含まれている。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を経る細胞内シグ ナル伝達を阻害する分子は生体内で免疫抑制剤（サイクロスポリンＡの効果に類 似の）として有効であろう。Ｋ．Ｂリンパ球抗原発現を調節する分子の認識 本発明の蛋白質とペプチドとを用いて生産されるモノクローナル抗体は細胞上 のＢリンパ球抗原発現を調節する分子のスクリーニング検定法で使用できる。例 えば、Ｂリンパ球抗原誘導に導く細胞内シグナル伝達をもたらす分子、たとえば Ｂ７−２またはＢ７−３は細胞表面におけるＢリンパ球抗原１種またはそれ以上 の発現を検定することによって認識することができる。ある分子の存在下での抗 −Ｂ７−２抗体による免疫螢光染色の低減はその分子が細胞内シグナルを阻止す ることを指摘すると思われる。Ｂリンパ球抗原発現を増強する分子は免疫螢光染 色の強化をもたらす。他に、Ｂ７−２のようなＢリンパ球抗原の発現へのある分 子の効果はプローブとしてＢ７−２ｃＤＮＡを使用して細胞Ｂ７−２ｍＲＮＡ水 準を検出することにより判定できる。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドを発 現する細胞は被検分子と接触させ、その細胞内でのＢ７−２ｍＲＮＡ濃度の増減 をノーザンハイブリッド化分析または検出しうるマーカーで標識したＢ７−２ｃ ＤＮＡプローブを使用するｍＲＮＡまたは全ポリ（Ａ⁺）ＲＮＡの通常のドット ブロット検定のような標準的技術により検出できる。Ｂリンパ球抗原発現を調節 する分子は単独でまたは可溶性遮断剤または刺激剤とともに免疫反応を増強また は減衰するために治療上有用であろう。例えば、Ｂ７−２の発現を阻止する分子 はＢ７−２遮断剤とともに免疫抑制の目的で投与できるであろう。前記の検定法 で検査できる分子にはＩＬ−４、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−Ｃ ＳＦおよびプロスタグランジンのようなサイトカインを含む。 本発明を以下の実施例により例示するが、これらには限定的意図はない。本明 細書中に引用した全ての参考文献および公表された特許出願の内容は参考のため に提示するものである。 実施例１、２及び３では以下の方法論を使用した。方法および材料 Ａ．細胞 単核球はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法により正常ヒト脾 臓の遊離細胞懸濁液から単離し、羊赤血球によるロゼット形成によりＥ−および Ｅ＋画分に分離した（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）。Ｂ細胞はＥ−画分から単球のプラスチックへ の付着および抗−ＣＤ４、−ＣＤ８、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４および−ＣＤ１ ６モノクローナル抗体を用いる抗−ＭｓＩｇＧおよび抗−ＭｓＩｇＭ被覆磁性ビ ーズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ・Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ） での処理２回による残留Ｔ、天然キラー細胞（ＮＫ）および残留単球の除去によ り精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は同じ脾臓のＥ＋画分からプラスチックへの付着と ＮＫ、Ｂ細胞および残留単球の磁性ビーズおよび抗−ＣＤ２０、−ＣＤ１１ｂ、 −ＣＤ８およびＣＤ１６モノクローナル抗体での除去後に分離した。ＣＤ２８＋ Ｔ細胞は同様にこのＥ＋画分から抗−ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４および −ＣＤ１６モノクローナル抗体を用いて分離した。精製効果は間接的免疫螢光法 およびＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用するフロー サイトメトリーで分析した。Ｂ細胞製品は＞９５％ＣＤ２０＋、＜２％ＣＤ３＋ 、＜１％ＣＤ１４＋であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞製品は＞９８％ＣＤ３＋、＞９８ ％ＣＤ４＋、＜１％ＣＤ８＋、＜１％ＣＤ２０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。 ＣＤ２８＋Ｔ細胞製品は＞９８％ＣＤ３＋、＞９８％ＣＤ２８＋、＜１％ＣＤ２ ０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。Ｂ．モノクローナル抗体および融合蛋白質 別段の記述がない限り、モノクローナル抗体は精製Ｉｇとして使用した：抗− Ｂ７：１３３、ＩｇＭは遮断抗体であって、以前に報告があり（Ｆｒｅｅｄｍａ ｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３ ２６７頁）；抗−Ｂ７：Ｂ１．１、ＩｇＧ１（ＲｅｐｌｉＧｅｎ社、Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ、ＭＡ）（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂなど（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐ ａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁）は非遮断モノクローナル抗体 であり；ＢＢ−１：ＩｇＭは遮断抗体（Ｄｒ．Ｅ．Ｃｌａｒｋ、ワシントン大学 、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔなど（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁）であり；抗−ＣＤ２０：Ｂ１、Ｉ ｇＧ２ａ（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ，Ｐなど（１９８０年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１２５巻：１６７８〜１６８５頁）；抗−Ｂ５、ＩｇＭ（Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ａ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：２２２８〜２２３ ５頁）；抗−ＣＤ８：７ＰＴ３Ｆ９，ＩｇＧ２ａ；抗−ＣＤ４：１９Ｔｈｙ５Ｄ ７，ＩｇＧ２ａ；抗−ＣＤ１１ｂ：Ｍｏ１，ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１４：Ｍｏ２ ，ＩｇＭ（Ｔｏｄｄ，Ｒなど（１９８１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２６巻 ：１４ ３５〜１４４２頁）；抗−ＭＨＣクラスＩＩ：９−４９，ＩｇＧ２ａ（Ｄｒ．Ｒ ．Ｔｏｄｄ、ミシガン大学、Ａｎｎ・Ａｒｂｏｒ）、（Ｔｏｄｄ，Ｒ．Ｉ．など （１９８４年）、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻：２３〜４０頁）；抗−Ｃ Ｄ２８：９．３，ＩｇＧ２ａ（Ｄｒ．Ｃ．Ｊｕｎｅ、Ｎａｖａｌ・Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、（Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ａ．な ど（１９８０年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０巻：２４７〜２６０頁 ）；抗−ＣＤ１６：３Ｇ８，ＩｇＧ１（腹水症として使用）、（Ｄｒ．Ｊ．Ｒｉ ｔｚ、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ・Ｃａｎｃｅｒ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔ ｏｎ）；抗−ＣＤ３：ＯＫＴ３，ＩｇＧ２ａハイブリドマはアメリカンタイプカ ルチャーコレクションから入手し精製モノクローナル抗体をプラスチック板に１ μｇ／ｍＬの濃度で付着させた。抗−ＣＤ２８Ｆａｂ断片は製造元（Ｐｉｅｒｃ ｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の指示書に従って９．３モノクローナル抗体か らパパイン消化により発生させ、蛋白質Ａカラム上で精製した。ヒトＣＴＬＡ４ 融合蛋白質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）および対照融合蛋白質（対照−Ｉｇ）は以前の報 告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁）通りに製造した。Ｂｏｕｓ ｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（印刷用に受理済）。Ｃ．ＣＨＯ細胞のトランスフェクション Ｂ７−１トランスフェクト体（ＣＨＯ−Ｂ７）はＢ７−１陰性のチャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から製造し、パラホルムアルデヒドで固定し、 以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：６５７５〜６５７９頁）通りに使用した。Ｄ．試験管内でのＢ細胞活性化およびＢ７＋およびＢ７−細胞の選択 脾臓Ｂ細胞を組織培養フラスコ中の完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎児血 清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸 ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１０ ０μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝中で、２×１０⁶ 細胞／ｍＬに培養し、ｓＩｇをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）に結合したアフィニティー精製ウサ ギ抗−ヒトＩｇＭとの交差結合によって、またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズ に結合したＭＨＣクラスＩＩの９−４９抗体との交差結合によって活性化した。 Ｂ細胞は７２時間活性化し、活性化全Ｂ細胞集団として使用するか、または抗− Ｂ７（Ｂ１．１）モノクローナル抗体およびイソチオシアン酸フルオレッセイン （ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗−マウス免疫グロブリン（Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｐｉ ｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）で間接的に染色し、フローサイトメトリー細胞分別法（ ＥＰＩＣＳ・Ｅｌｉｔｅ・ｆｌｏｗ・ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ社） によりＢ７−１＋およびＢ７−１−集団に分画して使用した。Ｅ．免疫螢光法およびフローサイトメトリー 表面フェノタイプ分析のため、６、１２、２４、４８、７２および９４時間交 差結合したＭＨＣクラスＩＩまたはｓＩｇにより活性化したＢ細胞集団を抗−Ｂ ７（１３３）、ＢＢ−１モノクローナル抗体、対照ＩｇＭ抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇ または対照−Ｉｇにより染色した。細胞懸濁液を１０μｇ／ｍＬの一次モノクロ ーナル抗体に続いて適当な２次試薬による２段階間接膜染色法で染色した。具体 的には、抗−Ｂ７（１３３）およびＢＢ−１モノクローナル抗体との免疫反応性 をヤギ抗−マウスＩｇまたは免疫グロブリンＦＩＴＣ（Ｆｉｓｈｅｒ）を２次試 薬として使用する間接染色法により検討し、融合蛋白質との免疫反応性はビオチ ン化ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはビオチン化対照−Ｉｇおよびストレプトアビジン−フ ィコエリスリンとを２次試薬に使用して検討した。希釈および洗浄剤には１０％ ＡＢ血清添加ＰＢＳを使用した。細胞を０．１％パラホルムアルデヒドで固定し て、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ・Ｅｌｉｔｅ・Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析 した。Ｆ．増殖検定法 Ｔ細胞は９６穴平底マイクロタイター板穴当り１×１０⁵細胞の濃度で３７℃ で３日間５％ＣＯ₂中で培養した。同遺伝子型活性化Ｂ細胞（全Ｂ細胞集団また はＢ７＋およびB７−画分）を照射（２５００ラド）し、穴当り１×１０⁵細胞濃 度で培地に添加した。検討因子を穴当り最終全容積２００μＬになるのに必要 な濃度で添加した。指定した時にはＴ細胞を抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（最終濃度１０ μｇ／ｍＬ）と３０分間４℃でインキュベーションし、続いて実験用板に添加し た。同様に、ＣＨＯ−Ｂ７またはＢ細胞はＣＴＬＡ４Ｉｇまたは対照Ｉｇ（１０ μｇ／ｍＬ）と３０分間４℃でインキュベーションした。分裂促進活性の指標と してのチミジン取込みは培養の最終１５時間に｛メチル−³Ｈ｝チミジン（Ｄｕ ・Ｐｏｎｔ社、ボストン、ＭＡ）１μＣｉ（３７ｋＢｑ）とインキュベーション した後に評価した。濾過して細胞を収穫し、乾燥濾板上の放射能をＰｈａｒｍａ ｃｉａ社ベータプレート液体シンチレーションカウンター中で測定した。Ｇ．ＩＬ−２およびＩＬ−４検定 ＩＬ−２とＩＬ−４との濃度はＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍ ｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮおよびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、 ＣＡ）により培養開始２４時間後に集めた上清液中で検定した。実施例１ Ｔ細胞増殖を誘発する新規ＣＴＬＡ４リガンドの活性化Ｂ細胞上での 発現 交差結合表面Ｉｇはヒト休止Ｂ細胞がＢ７−１を７２時間目に最大（５０〜８ ０％）に発現するように誘導するので、活性化したヒトＢリンパ球が準分裂促進 的に（ｓｕｂｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）活性化したＴ細胞を増殖させ、ＩＬ −２を分泌させる能力を測定した。図１には抗−ＣＤ３モノクローナル抗体で準 分裂促進的に活性化したヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞のＢ７（Ｂ７−１）をトラン スフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｂ７）または抗−Ｉｇで７２時間活性化し た同遺伝子型脾Ｂ細胞での共剌激反応を示す。³Ｈ−チミジン取込みは７２時間 培養の最終１５時間に検定した。ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより培養２４時間後の 上清液で検定（検出限界：３１〜２０００ｐｇ／ｍＬ）した。図１は１７回の実 験結果を表す。 準分裂促進的に活性化したＣＤ２８＋Ｔ細胞はＣＨＯ−Ｂ７（図１、ａ）で与 えられるＢ７−１共刺激に反応して増殖し、高濃度のＩＬ−２を分泌した。増殖 もＩＬ−２分泌もＣＨＯ細胞上のＢ７−１分子を抗−Ｂ７−１モノクローナル抗 体でまたは高アフィニティー受容体であるＣＴＬＡ４の融合蛋白質によって遮断 することで完全に阻止された。同様に、増殖とＩＬ−２分泌はＦａｂ抗−ＣＤ２ ８モノクローナル抗体のＣＤ２８を経るＢ７−１シグナル伝達の遮断によって取 除かれた。対照モノクローナル抗体または対照融合蛋白質は無効であった。増殖 とＩＬ−２分泌の殆ど同じ共剌激は抗−Ｉｇで７２時間活性化した脾臓Ｂ細胞に よって示された（図１、ｂ）。抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体はＣＨＯ−Ｂ７ により起きる増殖とＩＬ−２分泌を完全に取除くことができたが、抗−Ｂ７−１ モノクローナル抗体は活性化Ｂ細胞により誘導される増殖を５０％しか確実に阻 止しなかったが、一方ＩＬ−２分泌は完全に阻止された。抗−Ｂ７−１モノクロ ーナル抗体に誘導される増殖の部分遮断とは対照的に、ＣＴＬＡ４ＩｇもＦａｂ 抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体も増殖とＩＬ−２分泌を完全に遮断した。これ らの結果は活性化ヒトＢ細胞はＴ細胞増殖とＩＬ−２分泌とを誘導できる追加的 なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンド１個またはそれ以上を発現するという仮説に適 合する。実施例２ 活性化ヒト脾臓Ｂ細胞はＢ７−１とは異なるＣＴＬＡ４リガンドを発 現する 前記観察から見て、別のＣＴＬＡ４結合性カウンターレセプターが活性化Ｂ細 胞上に発現するかどうか確認することにした。このため、ヒト脾臓Ｂ細胞を抗− Ｉｇで７２時間活性化し、次にＢ７−１を介する共剌激を阻止しない抗−Ｂ７− １モノクローナル抗体（Ｂ１．１）で染色した。イソチオシアン酸フルオレッセ イン（ＦＩＴＣ）とｍＡｂＢ１．１を用い、フローサイトメトリーで細胞選択を 行ってＢ７−１⁺画分とＢ７−１^-画分とを分離した。得られた分離後陽性集団は ９９％Ｂ７−１⁺であり、分離後陰性集団は９８％Ｂ７−１^-（図２）であった。 各集団の共刺激能を検討するため、ヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞を照射Ｂ７−１ ＋またはＢ７−１−抗−Ｉｇ活性化（７２時間）脾臓Ｂ細胞の存在下に抗−ＣＤ ３モノクローナル抗体で準分裂促進的に刺激した。³Ｈ−チミジン取込みは７２ 時間培養の最後の１５時間に検討した。ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより培養２４時 間後の上清液について評価（検定の検出限界：３１〜２０００ｐｇ／ｍＬ）した 。図３は１０回の実験結果を示す。Ｂ７−１＋Ｂ細胞は抗−ＣＤ３活性化Ｔ細胞 に 増殖とＩＬ−２の分泌を誘導した（図３ａ）が、ＩＬ−４は誘導しなかった。未 分画活性化Ｂ細胞集団で観察されたように、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体（ １３３）は増殖を５０％しか阻止しなかったが、ＩＬ−２分泌は十分に消滅した 。前記の通り、Ｆａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体によるＣＴＬＡ４Ｉｇ結 合またはＣＤ２８の遮断は増殖もＩＬ−２分泌も完全に阻止した。対照モノクロ ーナル抗体と対照−Ｉｇは阻止的ではなかった。Ｂ７＋Ｂ細胞により起こされる 残余非Ｂ７仲介増殖の原因となっているかもしれない他種潜在的ＣＴＬＡ４／Ｃ Ｄ２８結合性共刺激リガンドを発見する試みでは、増殖とＩＬ−２分泌に対する ＢＢ−１モノクローナル抗体の効果を試験した。前記のように、ＢＢ−１モノク ローナル抗体は増殖およびＩＬ−２分泌を完全に阻止した（図３ａ）。図３ｂは Ｂ７−１−活性化ヒト脾臓Ｂ細胞の共刺激能を提示する。照射Ｂ７−１−活性化 （７２時間）Ｂ細胞は準分裂促進的活性化ＣＤ４＋リンパ球に明瞭な共剌激シグ ナルを伝達するであろう。この共刺激は検出可能なＩＬ−２（図３ｂ）またはＩ Ｌ−４の蓄積も伴なわず、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体は増殖を阻止しなか った。しかしながら、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｆａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体 およびＢＢ−１モノクローナル抗体はすべて増殖を完全に阻止した。 Ｂ７−１⁺およびＢ７−１^-活性化脾臓Ｂ細胞のフェノタイプ分析は前記機能的 結果を確認した。図４は分画されたＢ７−１⁺およびＢ７−１^-で活性化されたＢ 細胞上でのＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３の細胞表面発現を示す。図４に示 すように、Ｂ７−１＋活性化脾臓Ｂ細胞は抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナ ル抗体、ＢＢ−１モノクローナル抗体および結合ＣＴＬＡ４Ｉｇで染色した。対 照的に、Ｂ７−活性化脾臓Ｂ細胞は抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗体 で染色しなかったが、ＢＢ−１モノクローナル抗体およびＣＴＬＡ４Ｉｇでは染 色した。これらフェノタイプおよび機能的結果はＢ７−１＋およびＢ７−１−活 性化（７２時間）ヒトＢリンパ球が１）準分裂促進的に活性化されたＴ細胞に検 出可能なＩＬ−２分泌を伴わずに増殖を誘導し、また、２）ＢＢ−１モノクロー ナル抗体には認識されるが、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体には認識されない ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターを発現することを証明する。そこで、これ らＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドはＢ細胞活性化後の一時的発現およびそれらと ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−Ｂ７モノクローナル抗体との反応性を基にして区別す ることができる。図４は５回の実験結果を表す。実施例３ ヒトＢ細胞活性化後、３種の異なるＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが 発現する 活性化後ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターの逐次的発現を判定するため、 ヒト脾臓Ｂ細胞を表面ＩｇまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合により活性化し、 Ｂ７−１、Ｂ７−３およびＢ７−２結合蛋白質の発現をフローサイトメトリー分 析により検討した。ＩｇまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合は同様なパターンの ＣＴＬＡ４Ｉｇ結合を誘導した（図５および６）。図５は抗−Ｂ７−１およびＢ Ｂ−１結合の実験２５回の結果およびＣＴＬＡ４Ｉｇ結合の実験５回の結果を表 す。図６は抗−Ｂ７−１結合の実験２５回の結果およびＣＴＬＡ４Ｉｇ結合の実 験５回の結果である。これらの実験結果は２４時間より前にはこれらの分子はど れも発現されていないことを示す。活性化後２４時間には多数の細胞がＣＴＬＡ ４Ｉｇに結合する蛋白質を発現するが（Ｂ７−２）、しかしながら２０％以下が Ｂ７−１またはＢ７−３を発現する。ＭＨＣクラスＩＩの交差結合は４８時間目 にＢ７−１およびＢ７−３を最大に誘導し、Ｉｇの交差結合は７２時間目に最大 発現を誘導し、その後は発現が減少する。これらの結果は新種のＣＴＬＡ４結合 カウンターレセプターは２４時間に発現され、種類の異なるＢ７−１とＢ７−３ 蛋白質の一時的発現と時間的に一致しているように見えることを示唆する。 一連の実験を行って、このＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターの一時的発現 とＴ細胞の増殖および／またはＩＬ−２分泌を共剌激する能力との相関が異なる かどうかを判定した。抗−ＣＤ３で準分裂促進的に刺激したヒト脾臓ＣＤ２８＋ Ｔ細胞をあらかじめ試験管内で２４、４８または７２時間ｓＩｇと交差結合して 活性化しておいた照射ヒト脾臓Ｂ細胞の存在下に７２時間培養した。ＩＬ−２分 泌は２４時間後上清液中でＥＬＩＳＡにより評価し、Ｔ細胞増殖は培養７２時間 の最終１５時間の間の³Ｈ−チミジン取込みにより評価した。図７は実験５回の 結果を表す。図７ａに見られるように、２４時間活性化Ｂ細胞は中庸な水準のＩ Ｌ−２生産を伴う共刺激的シグナルを与えたが、その増殖の程度は４８時間およ び７２時間活性化ヒトＢ細胞で観察されるよりも顕著に少なかった（³Ｈ−チミ ジン取込みのスケールに注目）。抗−Ｂ７−１（１３３）またはＢＢ−１はいず れも増殖もＩＬ−２蓄積も阻止しなかった。対照的にＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗− ＣＤ２８Ｆａｂモノクローナル抗体は増殖とＩＬ−２蓄積を完全に消滅させた。 ４８時間活性化したＢ細胞は共剌激を起こし、その結果殆ど最大の増殖とＩＬ− ２分泌に到った（図７ｂ）。ここに、抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗 体は増殖を約５０％阻止したが、ＩＬ−２蓄積は完全に遮断した。ＢＢ−１モノ クローナル抗体は増殖およびＩＬ−２分泌を完全に阻止した。前記のように、Ｃ ＴＬＡ４ＩｇおよびＦａｂ抗−ＣＤ２８も増殖およびＩＬ−２生産を完全に遮断 した。最後に、７２時間活性化Ｂ細胞は４８時間活性化Ｂ細胞により誘導される ものと同じＴ細胞の反応を誘導した。もし、準分裂促進的シグナルがホルボール ミリステートアセテート（ＰＭＡ）から伝達されれば、また、ヒト脾臓Ｂ細胞が Ｉｇ交差結合でなくて、ＭＨＣクラスＩＩにより活性化されていれば同様な結果 が観察される。これらの結果はＣＴＬＡ４結合分子には３種あり、一時的に活性 化Ｂ細胞に発現され、各々がＴ細胞に準分裂促進的な増殖を剌激誘導できること を示す。これらの分子の中で２種、早期ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター（ Ｂ７−２）およびＢ７−１（１３３）はＩＬ−２生産を誘導するが、一方、Ｂ７ −３は検出可能なＩＬ−２生産なしに増殖を誘導する。 以前の報告には抗−Ｂ７モノクローナル抗体、１３３およびモノクローナル抗 体ＢＢ−１が同じ分子を認識するか否かについて矛盾する証拠を提出されていた （Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７ 巻：３２６０〜３２６７頁；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．など（１９８２年）、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など （１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４〜２７２２頁）。 両モノクローナル抗体はヒトＢ細胞活性化４８時間後に発現する分子を認識する が、いくつかの報告はＢ７（Ｂ７−１）とモノクローナル抗体ＢＢ−１が認識す る分子とは細胞系により、またＢ細胞新生物上で、異なって発現されるので相違 することを示唆していた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．など （１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁；Ｆｒｅ ｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２ ７１４〜２７２２頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．とＹｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．（１９８４年） 、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、３３９〜３４６頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ ．など（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ−Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、７４０頁）。 加えて、これらＩｇＭモノクローナル抗体の免疫沈降とウエスターンブロッティ ングはそれらが異なる分子を認識することを示唆した（Ｃｌａｒｋ，Ｅ．とＹｏ ｋｏｃｈｉ，Ｔ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ・Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、３ ３９〜３４６頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｔｙ ｐｉｎｇ，１ｓｔ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏ ｒｋｓｈｏｐ、７４０頁）。本来の抗−Ｂ７モノクローナル抗体１３３は抗−免 疫グロブリン活性化ヒトＢリンパ球での免疫により生成したが、一方、ＢＢ−１ モノクローナル抗体はヒヒの細胞系での免疫によって生成した。それ故に、ＢＢ −１モノクローナル抗体はヒヒとヒトとの間で保存されているヒト細胞のエピト ープを認識する筈である。 ヒトＢ７遺伝子（Ｂ７−１）の分子クローニングと発現の後、Ｂ７トランスフ ェクトＣＯＳ細胞が抗−Ｂ７（１３３）とＢＢ−１モノクローナル抗体で同様に 染色されることが見出され、それら両方が同一の広い分子バンド（４４〜５４ｋ Ｄ）を沈降してそれらが同じ分子を認識することを強く示唆した（Ｆｒｅｅｍａ ｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４ 〜２７２２頁）。この発見はＢＢ−１モノクローナル抗体により認識される分子 をコードする遺伝子が以前に染色体１２に割付けられ（Ｋａｔｚ，Ｆ．Ｅ．など （１９８５年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０３〜６頁）、一方、２つ のグ ループがＢ７遺伝子を染色体３に置いた（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９ ９２年）、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：４８９〜４９４頁；Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ，Ａ ．など（１９９２年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３６巻：１７５〜１８ １頁）ので、予想外であった。その後、Ｂ７（Ｂ７−１）とＢＢ−１モノクロー ナル抗体が認識する分子の間のフェノタイプ発現に別の相違が注目された。ＢＢ −１モノクローナル抗体は胸腺上皮細胞（Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．など（１９９１ 年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻：１４２８〜３６頁；Ｍｕｎｒｏ，Ｊ． Ｍ．など、Ｂｌｏｏｄ、投稿済）およびケラチノサイト（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ， Ｂ．など（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１ ０４０頁；Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｍ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄ ｅｒｍａｔｏｌ．、１００巻：２７５〜２８１頁）を染色するが、一方、抗−Ｂ ７はこれを染色しなかった。最近、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆなど（１９９３年）、Ａ ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁はＢＢ−１および抗 −Ｂ７（Ｂ１．１および１３３）モノクローナル抗体を用いてケラチノサイトで ＢＢ−１モノクローナル抗体およびＢ７が認識する分子の不協和な発現を報告し た。ＮｉｃｋｏｌｏｆｆなどはこれらＢＢ−１陽性細胞はＢ７ｍＲＮＡを発現し ないがＣＤ２８トランスフェクトＣＯＳ細胞に結合して、モノクローナル抗体Ｂ Ｂ−１と結合する異なる蛋白質の存在に対する別の証拠があることも証明した。 今回の発見はＢＢ−１モノクローナル抗体Ｂ７−３が認識する別のＣＴＬＡ４ カウンターレセプターが存在することおよびこの蛋白質が機能的にはＢ７−１（ １３３）とは相違することを確認するものである。Ｂ細胞活性化後のＢ７−１お よびＢ７−３の発現はＢ７陽性Ｂ細胞では時間的に一致すると思われるが、これ らの研究からＢ７−３分子はＢ７陰性活性化Ｂ細胞でも発現されることを立証す る。さらに重要なことには、Ｂ７−３分子は検出可能なＩＬ−２またはＩＬ−４ 生産なしにＴ細胞増殖を誘導できると思われることである。この結果はＩＣＡＭ −１は検出可能なＩＬ−２またはＩＬ−４の生産なしにＴ細胞増殖を共刺激でき る（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．印刷中）という以 前の観察に類似している。これらのデータはＢＢ−１モノクローナル抗体はＢ７ −１蛋 白質上のエピトープを認識することおよびこのエピトープは共刺激的機能を持っ ているが異なる蛋白質Ｂ７−３にも存在することを示す。フェノタイプおよび遮 断の研究からＢＢ−１モノクローナル抗体はこれら蛋白質の１種（Ｂ７陰性細胞 上）または両方（Ｂ７陽性細胞上）を認識できることが証明された。対照的に、 抗−Ｂ７モノクローナル抗体１３３およびＢ１．１はＢ７−１蛋白質のみを認識 する。総合すると、これらの結果は表面免疫グロブリンまたはＭＨＣクラスＩＩ の交差結合によるＢ細胞の活性化４８時間後、Ｂ細胞は一方は抗−Ｂ７およびＢ Ｂ−１モノクローナル抗体の両方により認識されるものおよび他方はＢＢ−１モ ノクローナル抗体のみにより認識されるものの少なくとも２種の異なるＣＴＬＡ ４結合カウンターレセプターを発現することを示唆する。 Ｂ７−２抗原は活性化Ｂ細胞上では１２時間後には検出されないが、２４時間 には強く発現し、機能を示す。増殖とＩＬ−２生産がＦａｂ抗−ＣＤ２８モノク ローナルにより完全に阻害されるので、この分子はＣＤ２８を経てシグナル伝達 しているように思われる。抗−Ｂ７モノクローナル抗体がＩＬ−２生産を完全に 遮断するので、活性化４８時間後になるとＩＬ−２分泌はＢ７−１共刺激に起因 していると思われる。 以前の研究およびここに記載した結果からＢ細胞活性化後４８時間まではＢ７ （Ｂ７−１）は発現されず（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、 Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ． Ｓ．など（１９９１年）、Ｃｅｌｌ・Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：４２９〜４ ３７頁）Ｔ細胞増殖またはＩＬ−２分泌を共刺激することもできないことが立証 される。以前の研究から共刺激不在下でのＴＣＲを経るＴ細胞の活性化（Ｇｉｍ ｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．など（１ ９８９年）、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉ ｏｌ．、５４巻：６０５〜１０頁；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｂ．など（１９９２年）、 Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６１〜６７１頁）およびＩＬ−２の不在（ Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、投稿済；Ｂｅｖｅｒ ｌ ｙ，Ｂ．など（１９９２年）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６１〜６７ １頁；Ｗｏｏｄ，Ｍ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻： ５９７〜６０３頁）はアネルギーを起こすことが証明されている。Ｂ７−１がＩ Ｌ−２分泌の誘導が可能な唯一の共剌激分子であったとすれば、ＩＬ−２生産を 共剌激するＢ７−１が存在しないので、Ｔ細胞は活性化後最初の２４時間にはア ネルギー化されるものと思われる。それ故、他に最初の２４時間にＩＬ−２分泌 を共刺激できる早期誘導可能な共刺激分子の存在はアネルギーではなく、効果的 免疫反応を誘導するために必要と思われる。Ｂ細胞活性化１２時間と２４時間と の間の早期ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター、Ｂ７−２、の出現はこの機能 を果たす。 追加されたこれらＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター２種の生物学的および 潜在的臨床的意義について２個の新知見が光明をもたらした。第一に、Ｂ７（Ｂ ７−１）欠失マウスが開発されたが、その抗原提示細胞もＣＴＬＡ４Ｉｇに結合 することが見出された（ＦｒｅｅｍａｎとＳｈａｒｐｅ、投稿準備中）。このマ ウスは健常であり、分離された単核球は試験管内でＴ細胞と培養する時には検出 可能な水準のＩＬ−２を誘導する。それ故、別のＣＤ２８共剌激的カウンター受 容体または別のＩＬ−２生産経路が機能している筈である。第二にはネズミとヒ トの系で抗原特異的アネルギーを誘導する最有力な試薬はＣＴＬＡ４Ｉｇおよび Ｆａｂ抗−ＣＤ２８であるが、一方、抗−Ｂ７モノクローナル抗体ははるかに弱 い（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．など（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻： ６０７〜６０９頁；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．など（１９９２年）、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ、２５７巻：７８９〜７９２頁；Ｃｈｅｎ，Ｌ．など（１９９２年）、Ｃ ｅｌｌ、７１巻：１０９３〜１１０２頁；Ｔａｎ，Ｐ．など（１９９３年）、Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１６５〜１７３頁）。これらの観察もＩＬ−２ を誘導することのできる別種ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが存在するとの仮説 に一致し、ここに提出する結果を勘案すれば、ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプ ター３種全てがＴ細胞免疫の誘導に必須であろうことを示唆する。さらにＴ細胞 アネルギーの誘導のためにはそれらの遮断が必要であると思われる。同一の結果 が ヒトのＢ７−１およびＢ７−２分子に対応するＣＴＬＡ４結合リガンド２種の認 識によりネズミの系でも観察された。Ｂ７欠失マウスのＡＰＣはＣＴＬＡ４と結 合し、ＩＬ−２分泌を誘導できる。総合すると、これらの観察はネズミの系では 多重ＣＴＬＡ４結合のカウンターレセプターが存在し、逐次にＴ細胞活性化を共 刺激していることを示す。実施例４ Ｂ７−２抗原のクローニング、配列決定および発現 Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築 文献記載（Ａｒｕｆｆｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））のヒト抗−ＩｇＭ活性化Ｂ細胞からポ リ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２ ９巻：８４０頁（１９８７年））中にｃＤＮＡライブラリーを構築した。脾臓Ｂ 細胞を組織培養フラスコ中、完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣ Ｓ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウ ム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝中２×１０⁶細胞／ｍＬに 培養し、ｓＩｇとＡｆｆｉ−Ｇｅｌ・７０２ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、ＣＡ）（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．、１３４巻：１５１６頁）結合アフィニティー精製ウサギ抗−ヒトＩｇＭと の交差結合により活性化した。活性化Ｂ細胞を１／６、１／２、４、８、１２、 ２４、４８、７２および９６時間後に収穫した。 活性化Ｂ細胞を４Ｍ−チオシアン酸グアニジン、０．５％ザルコシール、２５ ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１３％Ｓｉｇｍａ社アンチフォームＡおよび ０．７％メルカプトエタノールの溶液中でホモゲナイズしてＲＮＡを調製した。 ＲＮＡはこのホモジェネートを５．７Ｍ−ＣｓＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、２５ ｍＭ−酢酸ナトリウム、ｐＨ７から毎分３２０００回転で２４時間遠心分離して 精製した。ＲＮＡのペレットを５％ザルコシル、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ− トリス、ｐＨ７．５に溶解し、５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イ ソアミルアルコール混液２容で抽出した。ＲＮＡはエタノールから２回沈降させ た。ｃＤＮＡライブラリー構築に用いたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）− セルロース選択２サイクルにより精製した。 抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ５．５μｇから５０ｍＭ−ト リス、ｐＨ８．３、７５ｍＭ−ＫＣｌ、３ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ−ジチオ スレイトール、５００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、オリゴ （ｄＴ）_12〜18５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ１８０単位／ｍＬおよびＭｏｌｏ ｎｅｙ−ＭＬＶ逆転写酵素１００００単位／ｍＬを全容５５μＬ中に含む反応液 中で３７℃１時間で相補ＤＮＡを合成した。逆転写後、溶液を２５ｍＭ−トリス 、ｐＨ８．３、１００ｍＭ−ＫＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、各２５０μＭ−ｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭ−ジチオスレイトール、ＤＮＡポ リメラーゼ１２５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８．５単位／ｍＬに調整し 、１６℃で２時間インキュベーションして、ｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換した 。ＥＤＴＡを添加して１８ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホ ルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡは２．５Ｍ−酢酸 アンモニウムと担体としての直線状ポリアクリルアミド４μｇとの存在下にエタ ノール２容で沈殿させた。別に抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ ４μｇから５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．８、オリゴ（ｄＴ）_12〜18５０μｇ／ｍ Ｌ、ＲＮａｓｉｎ３２７単位／ｍＬおよびＡＭＶ逆転写酵素９５２単位／ｍＬを 全容１００μＬ中に含む反応液中０．６７時間４２℃でｃＤＮＡを合成した。逆 転写後、７０℃に１０分間加熱して逆転写酵素を不活化した。水３２０μＬと０ ．１Ｍ−トリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、０．５Ｍ−ＫＣｌ、ウシ 血清アルブミン２５０μｇ／ｍＬおよび５０ｍＭ−ジチオスレイトールの溶液８ ０μＬとを加え、溶液を各２００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ Ｐ、ＤＮＡポリメラーゼ１５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８単位／ｍＬに 調整し、１６℃で２時間インキュベートしてｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換した 。ＥＤＴＡを添加して１８ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホ ルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸 アンモニウムおよび担体としての直線状ポリアクリルアミド４μｇの存在下に エタノール２容で沈降させた。 ＡＭＶ逆転写４μｇおよびＭｏｌｏｎｅｙＭＬＶ逆転写２μｇからのＤＮＡを 混合した。非自己相補ＢｓｔＸＩアダプターを以下のようにＤＮＡに添加した。 ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ６μｇからの二重鎖ｃＤＮＡをキナーゼ処理した配列ＣＴＴ ＴＡＧＡＧＣＡＣＡ（配列番号１５）のオリゴヌクレオチド３．６μｇおよびキ ナーゼ処理した配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列番号１６）のオリゴヌクレオチド２ ．４μｇとを６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ−Ｎａ Ｃｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、 ０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよ びＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む溶液全容０．４５ｍＬ中、１５℃で１６ 時間インキュベーションした。ＥＤＴＡを添加して３４ｍＭとし、溶液を５０％ フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出し た。ＤＮＡは２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下にエタノール２容から沈降さ せた。 ６００ｂｐより大きいＤＮＡは以下の通りに選択した：アダプターＤＮＡを１ ０ｍＭ−トリス、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、６００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ ザルコシル中に再溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラム上、同一緩衝液でクロ マトグラフィーした。カラム空隙容積中のＤＮＡ（６００ｂｐ以上のＤＮＡを含 む）を集め、エタノール沈降した。 ｐＣＤＭ８ベクターをＢｓｔＸＩ消化とアガロースゲル精製とにより調製し、 ｃＤＮＡクローニングに用いた。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ６μｇからのアダプターＤ ＮＡを２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８に６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５ 、６ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ−ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍ Ｌ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレ イトール、１ｍＭ−スペルミジンおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を全容１ ．５ｍＬ中に含む溶液中で１５℃で２４時間リゲートした。リゲート反応混合物 を感応大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に形質転換して独立のｃＤＮＡクローン合計４ ２９００００個を得た。 プラスミドＤＮＡはｃＤＮＡライブラリー形質転換体の培養液５００ｍＬから 製造した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解法により精製し、続いてＣｓＣｌ平 衡勾配２回でバンド化分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７年））。Ｂ．クローニング操作法 スクリーニングの第一段階で、５０％密集生長ＣＯＳ細胞の１００ｍｍシャー レ３０個を抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ライブラリーＤＮＡ０．０５μｇ／ｍＬ でＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））を用いてトランスフェク トした。細胞をトリプシン処理し、２４時間後に再播種した。４７時間後、細胞 をＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム中 で３０分間３７℃でインキュベーションして剥離した。脱離細胞をＣＴＬＡ４Ｉ ｇおよびＣＤ２８Ｉｇ１０μｇ／ｍＬで４５分間４℃で処理した。細胞を洗い、 アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆した培養皿に散布し、室温で 付着させた。３時間後、プレートをＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４ ／０．０２％アジ化ナトリウム、５％ＦＣＳで２回と０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、０ ．０１Ｍ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５％ＦＣＳで１回穏やかに洗浄した。エピ ソームＤＮＡを培養（ｐａｎ）細胞から集め、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に形質転 換 した。プラスミドＤＮＡを文献記載のスフェロプラスト融合（Ｓｅｅｄなど、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７ 年））によりＣＯＳ細胞に再導入し、発現と培養を２回反復した。 選択の第二および第三段階では、４７時間後、脱離したＣＯＳ細胞を初めにα −Ｂ７−１ｍＡｂｓ（１３３およびＢ１．１、１０μｇ／ｍＬ）とインキュベー ションし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞をα−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ被覆 磁気ビーズで除去した。ＣＯＳ細胞を次にヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ（ｈＣＴＬＡ４Ｉ ｇ）およびヒトＣＤ２８Ｉｇ（ｈＣＤ２８Ｉｇ）１０μｇ／ｍＬで処理し、ヒト Ｂ７−２発現ＣＯＳ細胞をヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体プレートのディッシュ上で培 養して選択した。第三段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥ ＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェ クトしたＣＯＳ細胞上のＢ７−２発現はＣＴＬＡ４Ｉｇとの間接免疫螢光法によ り分析した。 選択の最終段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを製造した。候補クロー ン４８個の中から全部で４個が約１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいた。 これら４個のクローンをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。クローン４個全て はＣＴＬＡ４Ｉｇを用いる間接免疫螢光法およびフローサイトメトリー分析によ ればＢ７−２発現が強陽性であった。Ｃ．配列決定 クローン２９のＢ７−２ｃＤＮＡ挿入断片を以下の方策を用いてｐＣＤＭ８発 現ベクター中で配列決定した。最初の配列決定はプライマーＴ７、クローン化し たＢ７−２ｃＤＮＡに隣接するＣＤＭ８ベクター配列に相同のＣＤＭ８Ｒ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った（表Ｉ参照）。配列決定は色素終結反応お よびＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定器（ＡＢＩ社、Ｆｏｓｔｅｒ・Ｃｉｔｙ、ＣＡ） を使用して行った。これらのプライマーを使用して得られたＤＮＡ配列を用いて 次の配列決定プライマーを設計した（表Ｉ参照）。この配列決定および次のプラ イマー選択のサイクルを両鎖についてＢ７−２ｃＤＮＡが完全に配列決定される まで継続した。 ヒトＢ７−２クローン２９は１１２０塩基対の挿入断片と９８７ヌクレオチド の単一の長い読み枠および約２７ヌクレオチドの３’非コード配列を含んでいた （図８、配列番号１）。この蛋白質のオープン読み枠がコードすると予測される アミノ酸配列を図８のヌクレオチド配列の下に示す。コードされた蛋白質である ヒトＢ７−２は長さ３２９アミノ酸であると予測される（配列番号２）。この蛋 白質配列は他の１型Ｉｇスーパーファミリー膜蛋白質に共通の特徴を多数示す。 蛋白質翻訳はコンセンサス真核細胞翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ（１９８７年 ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１５巻：８１２５〜８１４８頁）とのこ の領域でのＤＮＡ相同性を基にして、ＡＴＧコドン（ヌクレオチド１０７〜１０ ９）から始まると予測される。ヒトＢ７−２蛋白質のアミノ端末（アミノ酸１か ら２３）は２３位と２４位のアラニンの間に予測切断部位（ｖｏｎ・Ｈｅｉｊｎ ｅ（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻：４６８３頁）の ある分泌シグナルペプチドの特性を持つ。この部位でのプロセッシングは未修飾 分子量約３４ｋＤａを持つ３０６アミノ酸のヒトＢ７−２膜結合蛋白質をもたら すと思 われる。この蛋白質は大体アミノ酸残基２４〜２４５の細胞外Ｉｇスーパーファ ミリーＶおよびＣ様ドメイン、大体アミノ酸残基２４６〜２６８の親水性膜貫通 ドメインおよび大体アミノ酸残基２６９〜３２９の長い原形質ドメインからなる と思われる。Ｉｇスーパーファミリーとの相同性は４０から１１０位および１５ ７から２１８位にあるシステインで結合する細胞外領域中の近接するＩｇ様ドメ イン２個に起因する。細胞外ドメインはＮ−結合グリコシル化の可能性ある部位 ８個も含む。ヒトＢ７−２蛋白質をコードするクローン２９のｃＤＮＡ挿入断片 を含むベクターでトランスフェクトした大腸菌は、１９９３年７月２６日にアメ リカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号６９３５７で寄託 された。 ヒトＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の双方のＧｅｎＢａｎｋおよ びＥＭＢＬデータベースとの比較で、ヒトおよびネズミＢ７−１蛋白質だけが関 連していることが判った。Ｂ７蛋白質配列３種を並べると（図１３）ヒトＢ７− ２はヒトＢ７−１と約２６％のアミノ酸同一性を持つことが判る。図１３はヒト Ｂ７−２（ｈＢ７−２）（配列番号２）、ヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）（配列番 号２８および２９）およびネズミＢ７（ｍＢ７）（配列番号３０および３１）の アミノ酸配列の比較を示す。ヒトＢ７−１およびネズミＢ７（以下ネズミＢ７− １と記載する）のアミノ酸配列は各々Ｇｅｎｂａｎｋに寄託番号＃Ｍ２７５３３ およびＸ６０９５８として見出すことができる。図１３の垂直線はｈＢ７−２お よびｈＢ７−１またはｍＢ７との間の同一のアミノ酸を示す。ｈＢ７−１とｍＢ ７との間の同一アミノ酸は示していない。ｈＢ７−２蛋白質はＩｇスーパーファ ミリーが持つ共通のシステイン（ＩｇＶドメインの４０位と１１０位、ＩｇＣド メインの１５７位と２１７位）および他の多数の共通アミノ酸により定義付けら れるｈＢ７−１と同じ一般構造を示す。ｈＢ７−１とｍＢ７は両方ともヒトＣＴ ＬＡ４およびヒトＣＤ２８に結合することが知られているので、これらの関連蛋 白質２種の間に共通なアミノ酸はＣＴＬＡ４またはＣＤ２８結合配列を含むのに 必要であると思われる。この配列の例はＫＹＭＧＲＴＳＦＤ（８１〜８９位、ｈ Ｂ７−２）（配列番号１７）またはＫＳＱＤＮＶＴＥＬＹＤＶＳ（１８８〜２０ ０位、ｈＢ７−２）（配列番号１８）である。別の関連配列は配列比較から明ら かであり、他はアスパラギン酸とグルタミン酸、アラニンとグリシンおよび他の 認められた機能関連アミノ酸のような相同的に関連したアミノ酸を考慮すること によって推論できる。Ｂ７配列はおそらく細胞内シグナル伝達に関与しているで あろう原形質部分ＷＫＷＫＫＫＫＲＰＲＮＳＹＫＣ（２６９〜２８２位、ｈＢ７ −２）（配列番号１９）に高度にプラス荷電したドメインを持つ。実施例５ 組換えＢ７−２抗原の特性 Ａ．Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇと結合するが抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３モ ノクローナル抗体とは結合しない ＣＯＳ細胞をベクターＤＮＡ（ｐＣＤＮＡＩ）またはＢ７−１（Ｂ７−１）ま たはＢ７−２（Ｂ７−２）を含む発現プラスミドのいずれかでトランスフェクト した。７２時間後、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を０．５ｍＭ−ＥＤＴＡお よび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で３０分間３７℃でインキュベ ーションして脱離した。この細胞を細胞表面発現について間接免疫螢光法とイソ チオシアン酸フルオレッセイン結合（ＦＩＴＣ）ヤギ抗−マウスＩｇまたはヤギ 抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いるフローサイトメトリー分析法で分析した（図 ９）。Ｂ７−１の細胞表面発現はｍＡｂｓ１３３（抗−Ｂ７−１）およびＢＢ− １（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３）で、およびＣＴＬＡ４Ｉｇで検出し、一 方Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇのみと反応させた。Ｂ７トランスフェション体はい ずれもイソタイプ対照（ＩｇＭまたは対照Ｉｇ）では染色されなかった。ベクタ ーでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はどの検出試薬でも染色されなかった。さ らに、どの細胞もＦＩＴＣ標識検出試薬でも染色されなかった。これはＢ７−２ がＣＴＬＡ４カウンターレセプターである蛋白質をコードしてはいるが、Ｂ７− １ともＢ７−３とも異なることを証明する。Ｂ．非刺激および活性化ヒトＢ細胞、細胞系および骨髄腫におけるＢ７−２発現 のＲＮＡブロット分析 ヒト脾臓Ｂ細胞をＴ細胞と単核球を除去することにより文献記載（Ｆｒｅｅｄ ｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｃ．， Ｄａｌｅｙ，Ｊ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７ 年）、１３７巻：３２６０〜３２６７頁）通りに分離した。脾臓Ｂ細胞を抗−Ｉ ｇビーズを用いて活性化し、細胞を記載の時点で収穫した（Ｆｒｅｅｄｍａｎな ど（１９８７年）、前出）。骨髄標本のＥロゼット化と付着を用いて報告（Ｆｒ ｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９年）、１４３巻： ２７１４〜２７２２頁）通りにＴ細胞および単核球を除去してヒト骨髄腫を精製 した。ＲＮＡをチオシアン酸グアニジンによるホモゲナイズ化および塩化セシウ ム遠心分離によって調製した。等量のＲＮＡ（２０μｇ）をアガロースゲル上で 電気泳動し、染色し、³²Ｐ−標識Ｂ７−２ｃＤＮＡにハイブリド化した。図１０ のａには非剌激および抗−Ｉｇ活性化ヒト脾臓Ｂ細胞およびＲａｊｉ（Ｂ細胞バ ーキットリンパ腫）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞バーキットリンパ腫）、ＲＰＭＩ８２ ２６（骨髄腫）、Ｋ５６２（赤白血病）およびＲＥＸ（Ｔ細胞急性リンパ芽球白 血病）を含む細胞系のＲＮＡブロット分析を示す。図１０のｂにはヒト骨髄腫の ＲＮＡブロット分析を示す。 Ｂ７−２ｃＤＮＡへのハイブリッド化により１．３５、１．６５および３．０ ｋｂのｍＲＮＡトランスクリプト３個を検出した（図１０のｂ）。ＲＮＡのブロ ット分析はＢ７−２ｍＲＮＡは非刺激ヒト脾臓Ｂ細胞中に発現され、活性化後４ 倍に増加することを証明した。Ｂ７−２ｍＲＮＡはＢ細胞新生物系（Ｒａｊｉ、 Ｄａｕｄｉ）と骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６）とで発現されたが、赤白血病Ｋ５６ ２およびＴ細胞系ＲＥＸでは発現されなかった。対照的に、我々は以前にＢ７− １ｍＲＮＡは休止Ｂ細胞では発現されず、活性化後は一時的に発現されることを 報告した（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。ヒト骨髄腫 から分離したｍＲＮＡの研究からＢ７−２ｍＲＮＡは患者６人中で６人に発現さ れていることを証明したが、Ｂ７−１はこの６人中で１人にのみ発見された（Ｆ ｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。そこで、Ｂ７−１とＢ７ −２との発現は独立に制御されていることが明らかである。Ｃ．共刺激 ヒトＣＤ２８⁺Ｔ細胞を以前の文献報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９ ３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜 ６５９０頁）通りに免疫磁気ビーズ除去法によりＢ細胞、天然キラー細胞および マクロファージに対するモノクローナル抗体を用いて分離した。Ｂ７−１、Ｂ７ −２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクト後７ ２時間に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーション し、次に十分に洗浄した。１０⁵ＣＤ２８⁺およびＴ細胞をホルボールミリステー トアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよび指摘した数のＣＯＳトランスフェク ト体とインキュベーションした（図１１）。図１１のａに示すように、Ｔ細胞の 増殖は７２時間のインキュベーションの最後の１２時間に取込まれた３Ｈ−チミ ジン（１μＣｉ）により測定した。図１１のｂは培養開始２４時間後に収穫した 上清液を用いるＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）により測定されたＴ細 胞によるＩＬ−２生産を示す。Ｄ．Ｂ７−２共剌激は抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂｓでは遮断されな いが、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂによって遮断される ヒトＣＤ２８⁺Ｔ細胞をＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対す るｍＡｂｓを用いて以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ． Ｊ．、Ｇｒｉｂｂｅｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（ １９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５ ８６〜６５９０頁）通りに免疫ビーズ除去法により分離した。Ｂ７−１、Ｂ７− ２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクション後 ７２時間目に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーシ ョンし、次に十分に洗浄した。ＣＤ２８⁺Ｔ細胞１０⁵個をホルボールミリステー トアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬとＣＯＳトランスフェクト体２×１０⁴個 とともにインキュベーションした。遮断剤（１０μｇ／ｍＬ）は図１２の左端に 示したが、１）モノクローナル抗体不含（遮断剤なし）、２）ｍＡｂ１３３（抗 −Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍ Ａｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（ｍＡ ｂ９．３）、６）ＣＴＬＡ−Ｉｇおよび７）対照Ｉｇを含む。図１２のａは７２ 時 間インキュベーションの最後の１２時間の³Ｈ−チミジン（１μＣｉ）取込みに より測定された増殖を示す。図１２のｂは培養開始２４時間後に収穫した上清液 を用いてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）で測定したＩＬ−２生産を示 す。 Ｂ７−１およびＢ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は広範な剌激体／ 応答体細胞比率で検査した時に相応水準のＴ細胞増殖を共剌激した（図１１）。 Ｂ７−１と同様にＢ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の共剌激は広範な 刺激体／応答体細胞比率でＩＬ−２生産を示した（図１１）。対照的に、ベクタ ーでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はＴ細胞増殖もＩＬ−２生産も共刺激しな かった。Ｅ．Ｂ７−２共刺激は抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂｓでは遮断されな いが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂによって遮断される ヒトＣＤ２８⁺Ｔ細胞をＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対す るｍＡｂを用いて以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ ．、Ｇｒｉｂｂｅｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１ ９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８ ６〜６５９０頁）通りに免疫ビーズ除去法により分離した。Ｂ７−１、Ｂ７−２ およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクション後７ ２時間目に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーショ ンし、次に十分に洗浄した。ＣＤ２８⁺Ｔ細胞１０⁵個をホルボールミリステート アセテート（ＰＭＡ）Ｉｎｇ／ｍＬおよびＣＯＳトランスフェクト体２×１０⁴ 個とともにインキュベーションした。遮断剤（１０μｇ／ｍＬ）は図１２の左端 に示したが、１）モノクローナル抗体不含（遮断剤なし）、２）ｍＡｂ１３３（ 抗−Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ ｍＡｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（ｍ Ａｂ９．３）、６）ＣＴＬＡ−Ｉｇおよび７）対照Ｉｇを含む。図１２のａは７ ２時間インキュベーションの最後の１２時間に取込まれた³Ｈ−チミジン（１μ Ｃｉ）により測定された増殖を示す。図１２のｂは培養開始２４時間後に集めた 上 清液を用いてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）で測定したＩＬ−２生産 を示す。 Ｂ７−２をＢ７−１およびＢ７−３から区別するために、Ｂ７−１およびＢ７ −３に対するｍＡｂを用いて準分裂促進的に活性化したヒトＣＤ２８⁺Ｔ細胞の 増殖およびＩＬ−２生産を阻止した。Ｂ７−１およびＢ７−２ＣＯＳトランスフ ェクト体はＴ細胞の増殖およびＩＬ−２生産を共刺激した（図１２）。ｍＡｂ１ ３３（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）前出）（抗−Ｂ７−１） およびＢＢＩ（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．など（総説中）、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．、Ｈｏｌｌｙ，Ｒ． Ｄ．、Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ａ．（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻 ：８２３〜８２７頁）（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３）はＢ７−１により誘 導された増殖およびＩＬ−２生産を完全に阻止したが、Ｂ７−２をトランスフェ クトしたＣＯＳ細胞による共剌激には効果がなかった。イソタイプに適合した対 照Ｂ５ｍＡｂは無効であった。Ｂ７−２シグナルがＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を 辿るかどうか決定するために抗−ＣＤ２８ＦａｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合蛋 白質を検査してこれらがＢ７−２共刺激を阻止するかどうか判定した。抗−ＣＤ ２８ＦａｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇの双方ともＢ７−１またはＢ７−２ＣＯＳト ランスフェクト体により誘導された増殖およびＩＬ−２生産を阻止したが、一方 、対照Ｉｇ融合蛋白質は無効であった（図１２）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは増殖のＢ ７−２共刺激を９０％だけ阻止したが、別の実験では阻止はさらに大きかった（ ９８〜１００％）。遮断剤はどれもＰＭＡとフィトヘマグルチニンとの組合せに より誘導されたＴ細胞の増殖もＩＬ−２生産も阻害しなかった。 Ｂ７−１と同様に、Ｂ７−２はＣＤ２８およびＣＴＬＡ４・Ｔ細胞表面分子に 対するカウンターレセプターである。両蛋白質は次の点で類似している：１）Ａ ＰＣ表面に発現する、２）構造的にＩｇスーパーファミリーに関連し、ＩｇＶお よびＩｇＣドメインを持ち、アミノ酸同一性２６％を持つ；３）Ｔ細胞を共剌激 してＩＬ−２を生産し、増殖させる。しかしながら、Ｂ７−１とＢ７−２とはい くつかの点で基本的に相違する。第一に、Ｂ７−２ｍＲＮＡは非刺激Ｂ細胞に構 造的に発現されるが、一方、Ｂ７−１ｍＲＮＡは４時間目まで現出せず、細胞表 面蛋白質は２４時間目まで検出されない（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１ ９８７年）、前出；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。非 刺激ヒトＢ細胞は細胞表面上にＣＴＬＡ４カウンターレセプターを発現せず、Ｔ 細胞増殖を共刺激しない（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．など、前出）。それ 故、非刺激Ｂ細胞におけるＢ７−２ｍＲＮＡの発現は活性化後にその細胞表面上 におそらく貯蔵ｍＲＮＡまたは蛋白質からであろうＢ７−２蛋白質を急速に発現 させるものと思われる。Ｂ７−２トランスフェクト体による共剌激は部分的には パラホルムアルデヒド固定化に敏感であるが、一方、Ｂ７−２共刺激は抵抗性で ある（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：６５７５〜６５７９頁）。第二に、細胞系とヒト Ｂ細胞新生物とでのＢ７−１とＢ７−２との発現は実質的に異なっている。第三 に、Ｂ７−２蛋白質はＢ７−１より長い原形質ドメインを持ち、これがＢ細胞の 分化に役割を演じるであろう。これらのフェノタイプおよび機能的な相違はこれ らの相同性分子は生物学的に明確に異なる機能を持つであろうことを示唆する。実施例６ ネズミＢ７−２抗原のクローニングと配列決定 Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築 文献記載（Ａｒｕｆｆｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））の通りにジブチリル環状ＡＭＰ（ｃＡ ＭＰ）活性化Ｍ１２細胞（ネズミＢ細胞腫瘍系）からポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを用い てｐＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻：８４０頁（１９８ ７年））でｃＤＮＡを構築した。 Ｍ１２細胞を１×１０⁶細胞／ｍＬまで組織培養フラスコの中で完全培養培地 ｛１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グル タミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫 酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ ／ｍＬ）｝で培養し、ジブチリルｃＡＭＰ３００μｇ／ｍＬで活性化した（Ｎａ ｂａｖｉ，Ｎ．など（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻：２６６〜２６８ 頁）。０、６、１２、１８、２４および３０時間後に活性化Ｍ１２細胞を収穫し た。 ＲＮＡは活性化Ｍ１２細胞を４Ｍ−チオシアン酸グアニジン、０．５％ザルコ シル、２５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１３％Ｓｉｇｍａ社アンチフォー ムＡおよび０．７％メルカプトエタノール混液中でホモゲナイズして調製した。 ホモゲネートを５．７Ｍ−ＣｓＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、２５ｍＭ−酢酸ナト リウム、ｐＨ７混液中２４時間毎分３２０００回転で遠心分離してＲＮＡを精製 した。ＲＮＡのペレットを５％ザルコシル、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ−トリ ス、ｐＨ７．５中に溶解し、５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソ アミルアルコール２容で抽出した。ＲＮＡをエタノールから２回沈降させた。ｃ ＤＮＡライブラリー構築に使用したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロ ース選択２サイクルで精製したものである。 相補ＤＮＡを５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．３、７５ｍＭ−ＫＣｌ、３ｍＭ−Ｍ ｇＣｌ₂、１０ｍＭ−ジチオスレイトール、５００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、オリゴ（ｄＴ）_12〜18５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ１８ ０単位／ｍＬおよびモロニー−ＭＬＶ逆転写酵素１００００単位／ｍＬの反応液 全容積５５μＬ中、ジブチリルｃＡＭＰで活性化したネズミＭ１２細胞のポリ（ Ａ）⁺ＲＮＡ５．５μｇから１時間３７℃で合成した。逆転写後、溶液を２５ｍ Ｍ−トリス、ｐＨ８．３、１００ｍＭ−ＫＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、各２５０ μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭ−ジチオスレイトール 、ＤＮＡポリメラーゼ１２５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８．５単位／ｍ Ｌに調製し、２時間１６℃でインキュベーションしてｃＤＮＡを２重鎖ＤＮＡに 変換した。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで添加し、溶液を５０％フェノール、４９％ク ロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ −酢酸アンモニウムの存在下エタノール２容および担体としての線状ポリアクリ ルアミド４μｇで沈降させた。逆転写後、逆転写酵素は７０℃に１０分間加熱し て不活化した。水３２０μＬおよび０．１Ｍ−トリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ− ＭｇＣｌ₂、０．５Ｍ−ＫＣｌ、ウシ血清アルブミン２５０μｇ／ｍＬおよび５ ０ ｍＭ−ジチオスレイトールの混液８０μＬを添加し、溶液を各２００μＭ−ｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ１５０単位／ｍＬ、 リボヌクレアーゼＨ８単位／ｍＬに調製し、２時間１６℃でインキュベーション してｃＤＮＡを２重鎖ＤＮＡに変換した。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで添加し、溶液 を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容 で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下エタノール２容およ び担体としての線状ポリアクリルアミド４μｇで沈降させた。 このＤＮＡに非自己相補ＢｓｔＸＩアダプター２μｇを次のようにして添加し た：ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ５．５μｇからの２重鎖ｃＤＮＡを配列ＣＴＴＴＡＧＡ ＧＣＡＣＡ（配列番号１５）のキナーゼ処理オリゴヌクレオチド３．６μｇおよ び配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列番号１６）のキナーゼ処理オリゴヌクレオチド２ ．４μｇと６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ−ＮａＣ ｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０ ．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよび Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む全容０．４５ｍＬの溶液中、１５℃で１６ 時間インキュベーションした。ＥＤＴＡを３４ｍＭまで添加し、溶液を５０％フ ェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液の等容で抽出し た。ＤＮＡを２.５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下にエタノール２容から沈降さ せた。 ６００ｂｐ以上のＤＮＡは次の通りに選択した：アダプターＤＮＡを１０ｍＭ −トリス、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、６００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ザルコ シル中に再溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラム上、同じ緩衝液でクロマトグ ラフィーした。カラム空隙容積中のＤＮＡ（６００ｂｐ以上のＤＮＡを含む）を 集めてエタノールで沈降させた。 ｃＤＮＡクローニング用のｐＣＤＭ８ベクターをＢｓｔＸＩによる消化とアガ ロースゲル精製によって調製した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ５．５μｇからのアダプ ターＤＮＡを６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ−Ｎａ Ｃｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、 ０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよ びＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む溶液全容積１．５ｍＬ中、１５℃で２４ 時間に２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８にリゲートした。結合反応混合 物を有能大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に形質転換し、独立のｃＤＮＡクローン全部 で２００×１０⁶を得た。 プラスミドＤＮＡは原ｃＤＮＡライブラリー形質転換体培養液５００ｍＬから 製造した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解操作により精製し、続いてＣｓＣｌ 平衡勾配中で２回バンド化分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ・Ｓ ｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７年））。Ｂ．クローニング操作法 スクリーニングの第一段階では５０％密集生長ＣＯＳ細胞の１００ｍｍシャー レ３０個を活性化Ｍ１２ネズミＢ細胞ライブラリーＤＮＡ０．０５μｇ／ｍＬで ＤＥＡＥ−デキストリン法（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））を用いてトランスフェクト した。細胞をトリプシン処理し、２４時間後に再播種した。４７時間後、細胞を ＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム中、 ３７℃で３０分間インキュベーションして脱離した。脱離細胞をヒトＣＴＬＡ４ ＩｇとネズミＣＤ２８Ｉｇ１０μｇ／ｍＬで４５分間４℃で処理した。細胞を洗 い、アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆した培養皿に散布し、室 温で付着させた。３時間後、プレートをＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７ ．４／０．０２％アジ化ナトリウム、５％ＦＣＳで２回および０．１５Ｍ−Ｎａ Ｃｌ、０．０１Ｍ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５％ＦＣＳとで１回穏やかに洗浄 した。エピソームＤＮＡを培養した細胞から収穫し、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に 形質転換した。プラスミドＤＮＡを文献記載のスフェロプラスト融合（Ｓｅｅｄ など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（ １９８７年））によりＣＯＳ細胞に再導入し、発現と培養のサイクルを２回反復 した。選択の第二および第三段階では、４７時間後、脱離したＣＯＳ細胞をまず α−ネズミＢ７−１ｍＡｂ（１６−１０Ａ１、１０μｇ／ｍＬ）とインキュベー ショ ンし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞をα−マウスＩｇＧおよびＩｇＭでコート した磁気ビーズで除去した。ＣＯＳ細胞を次にヒトＣＴＬＡ４Ｉｇおよびネズミ ＣＤ２８Ｉｇの１０μｇ／ｍＬで処理し、ネズミＢ７−２発現ＣＯＳ細胞をヤギ 抗−ヒトＩｇＧ抗体被覆ディッシュ上で培養して選択した。第三段階の後、各コ ロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ 細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞上のＢ７−２の 発現はＣＴＬＡ４Ｉｇとの間接免疫螢光法により分析した。 選択の最終段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを製造した。候補クロー ン８個の中、全部で６個が約１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいた。クロ ーン８個のプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。１．２Ｋｂ のｃＤＮＡ挿入断片を持つクローン６個は全てＣＴＬＡ４Ｉｇを用いる間接免疫 螢光法とフローサイトメトリー分析によればB７−２発現が強陽性であった。Ｃ．配列決定 クローン４のＢ７−２ｃＤＮＡ挿入断片を次の方策を用いてｐＣＤＭ８発現ベ クター中で配列決定した。最初の配列決定は配列決定プライマーＴ７、クローン したＢ７−２ｃＤＮＡに隣接するＣＤＭ８ベクター配列に相同のＣＤＭ８Ｒ（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った（表ＩＩ参照）。配列決定は色素ターミ ネーター反応とＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定器（ＡＢＩ社、Ｆｏｓｔｅｒ・Ｃｉｔ ｙ、ＣＡ）を用いて行った。これらのプライマーを用いて得られたＤＮＡ配列を 使って次の配列決定プライマーを設計した（表ＩＩ参照）。この配列決定および 次段プライマー選択のサイクルをネズミＢ７−２ｃＤＮＡが両鎖について完全に 配列決定されるまで続行した。 得られたネズミＢ７−２クローン（ｍＢ７−２、クローン４）の一つは１１６ ３塩基対の挿入断片と９２７ヌクレオチドの単一の長いオープン読み枠および約 １２６ヌクレオチドの３’非コード配列（図１４、配列番号２２）が含まれてい た。この蛋白質のオープン読み枠がコードすると予測されたアミノ酸配列を図１ ４のヌクレオチド配列の下に示す。コードされたネズミＢ７−２蛋白質は長さが ３０９アミノ酸残基であると予測される（配列番号２３）。この蛋白質配列は他 のＩ型Ｉｇスーパーファミリー膜蛋白質に共通の特徴多数を示す。蛋白質翻訳は コンセンサス真核細胞翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１５巻：８１２５〜８１４８頁参照）とのこの領域で のＤＮＡ相同性を基にすればメチオニンコドン（ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１〜 １１３）から始まると予測される。ネズミＢ７−２蛋白質のアミノ端末（アミノ 酸１から２３）は２３位のアラニンと２４位のバリンとの間に予測切断部位（ｖ ｏｎ・Ｈｅｉｊｎｅ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻 ：４６８３頁）のある分泌シグナルペプチドの特性を持つ。この部位でのプロセ ッシングは未修飾分子量約３２ｋＤａを持つ２８６アミノ酸のネズミＢ７−２膜 結合蛋白質をもたらすと思われる。この蛋白質はほぼアミノ酸残基２４〜２４６ の細胞外ＩｇスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、ほぼアミノ酸残基２４ ７〜２６５の親水性膜貫通ドメインおよびほぼアミノ酸残基２６６〜３０９の長 い原形質ドメインから構成されると思われる。Ｉｇスーパーファミリーとの相同 性は４０から１１０位および1５７から２１６位にあるシステインが結合する細 胞外領域中の近接するＩｇ様ドメイン２個に起因する。細胞外ドメインはＮ−結 合グリコシル化の可能性ある部位９個も含み、ネズミＢ７−１と同様、おそらく グリコシル化されている。ネズミＢ７−２蛋白質のグリコシル化は分子量を約５ ０〜７０ｋＤａに増加する。ネズミＢ７−２の原形質ドメインはシステンとそれ に続いておそらくＡＰＣ内でシグナル伝達または制御ドメインとして機能するプ ラスに荷電したアミノ酸を持つ共通領域を含む。ネズミＢ７−２のヌクレオチド お よびアミノ酸配列の双方のＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースとの比較 で、ヒトおよびネズミＢ７−１が有意な相同性（アミノ酸配列同一性約２６％） を示した。ネズミＢ７−２はヒトの同族体ｈＢ７−２と同一性５０％と類似性６ ７％を示した。ネズミＢ７−２（クローン４）をコードするｃＤＮＡ挿入断片を 含むベクター（プラスミドｐｍＢｘ４）でトランスフェクトした大腸菌（ＤＨ１ ０６／ｐ３）は１９９３年８月１８日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（ＡＴＣＣ）に受託番号６９３８８で寄託された。Ｄ．共刺激 ＣＤ４⁺マウスＴ細胞を第一にトリス−ＮＨ₄Ｃｌで処理して赤血球を除去して 精製した。Ｔ細胞をナイロンウールカラムを通して濃縮した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞を 抗−ＭＨＣクラスＩＩおよび抗−ＣＤ２８のｍＡｂ混合物とウサギ補体で２回処 理して精製した。ネズミＢ７−１（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ癌研究所、ボストン 、ＭＡのＧｏｒｄｏｎ・Ｆｒｅｅｍａｎ博士から恵与；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ ．など（１９９１年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４巻：６２５〜６３１頁参 照）、ネズミＢ７−２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトラ ンスフェクションの７２時間後に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１ 時間インキュベーションし、十分に洗浄した。ネズミＣＤ４⁺Ｔ細胞１０⁵個をホ ルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよびＣＯＳトランス フェクト体２×１０⁴個とインキュベーションした（表ＩＩＩ）。Ｔ細胞増殖は ７２時間のインキュベーションの最終１２時間に取込まれた³Ｈ−チミジン（１ μＣｉ）により測定した。 実施例７ ヒトＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質の構築と特性 Ａ．ヒトＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質の製造 ヒトＢ７−２の細胞外部分を免疫グロブリン定常領域に結合した融合蛋白質と して製造した。免疫グロブリン定常領域は免疫グロブリン構造に必須のエフェク ター活性を減弱または除去する修飾を含む遺伝子的修飾を含んでいてもよい。総 括的にはｈＢ７−２の細胞外部分をコードするＤＮＡを指向性突然変異によって 修飾したヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領 域をコードするＤＮＡに結合した。これは以下のサブセクションに記載のように して行った。Ｂ．遺伝子融合体の調製 目的とするＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ断片は下記プライマー対を用いてポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製した。一般的に、ＰＣＲ反応物はプライ マー（各１μＭ）、ｄＮＴＰ（各２００μＭ）、テンプレートＤＮＡ１ｎｇ、お よびＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉなど（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２ ３９巻：４８７〜４９１頁）を含むＴａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｇｅｎｅ・Ａｍ ｐ・ＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ、 ＣＴ）最終容積１００μＬ中で調製した。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅はサーモサイ クラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ）Ｓａｎ・Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて各々が変性段階 （９４℃で１分間）、再生段階（５４℃で３０秒間）および鎖伸長段階（７２℃ で１分間）から構成される２５から３０サイクルを行った。各ｈＢ７−２−Ｉｇ 遺伝子融合体の構造はＢ７−２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＣγ１またはＩ ｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合する分泌促進シグナルの 配列から構成される。ＩｇＣγ１およびＩｇＣγ４の配列はヒンジ領域内にある ジスルフィド結合形成能のあるシステイン残基をセリン残基で置換したヌクレオ チド変換を含み、さらにＣＨ２ドメインにＦｃ受容体へのＩｇＣ結合および補体 活性化に必要と思われるアミノ酸を置換するヌクレオチド変換を含んでいよう。 配列分析でｍγ４およびｍγ１クローンの構造を確認し、各々の構築を用いて ２９３細胞をトランスフェクトして過渡的発現を検査した。ｈＩｇＧ・ＥＬＩＳ Ａによって両構築について１００ｎｇ蛋白質／ｍＬ細胞上清液にほぼ等しい過渡 的発現水準が観測され／確認された。ＮＳＯ細胞系をトランスフェクトして融合 蛋白質の永続的発現を行った。Ｃ．ｈＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質遺伝子の構築 （１）シグナル配列の調製 ＰＣＲ増幅を用いて哺乳類細胞からのＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質の分泌に適する 免疫グロブリンシグナル配列を製造した。このＩｇシグナル配列はネズミＩｇＧ 重鎖遺伝子を含むプラスミド（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．など（１９８９年）、Ｐｒ ｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：３８３３３８３７頁）か らオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡ ＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＣ−３’（＃０１）（配列番号：）を正方向プ ライマー（ｆｏｒｗａｒｄ・ｐｒｉｍｅｒ）とし、オリゴヌクレオチド５’−Ｇ ＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧ −３’（＃０２）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ・ ＰＣＲ・ｐｒｉｍｅｒ）として用いて調製した。正方向ＰＣＲプライマー（配列 番号：）は制限酵素ＢｓａＩの認識配列を含み、Ｉｇシグナル配列の５’開始メ チオニンへの配列に相同である。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はｈＢ ７−２の細胞外ドメイン５’端末およびＩｇシグナル配列３’端末から誘導され た配列から構成される。これらのプライマーを用いるネズミＩｇシグナルテンプ レートＤＮＡのＰＣＲ増幅は２２４ｂｐ生成物を与えるが、これはＢｓａＩ制限 部位とそれに続いてｈＢ７−２の細胞外ドメインをコードする最初の２０ヌクレ オチドの配列に融合するＩｇシグナル領域の配列から構成されている。シグナル 配列とｈＢ７−２との間の結合点はシグナル配列で開始する蛋白質翻訳が正しい 読み枠中のｈＢ７−２を通って継続するものである。 （２）ｈＢ７．２遺伝子セグメントの調製 ｈＢ７−２遺伝子の細胞外ドメインは発現ベクターｐＣＤＮＡＩ（Ｆｒｅｅｍ ａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２巻：９０９〜１１頁（１９９４年））に挿入 したｈＢ７−２ｃＤＮＡを含むプラスミドのＰＣＲ増幅により調製した： ｈＢ７−２の細胞外ドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＣＴＣＴＧ ＡＡＧＡＴＴＣＡＡＧＣ−３’（＃０３）（配列番号：）を正方向プライマーと し、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣ ＴＧＡＧＧＴＣＣ−３’（＃０４）（配列番号：）を逆方向プライマーとして使 用するＰＣＲ増幅により調製した。正方向ＰＣＲプライマーはＢ７−２細胞外ド メインの最初の２０ヌクレオチドに相当する配列を含み、逆方向ＰＣＲプライマ ーはＢ７−２細胞外ドメインの最後のヌクレオチド２２個とそれに続いてＢｃｌ Ｉ制限部位および非コードヌクレオチド７個に対応する配列を含む。プライマー ＃０３および＃０４でのＰＣＲ増幅はｈＢ７−２の細胞外ＩｇＶおよびＩｇＣ様 ドメインとそれに続く独特なＢｃｌＩ制限部位に対応する６７３ｂｐ生成物を与 える。 シグナル配列は次の通りＰＣＲによってｈＢ７−２の細胞外部分に結合した。 前記で得られたシグナル配列およびｈＢ７−２細胞外ドメインに対応するＤＮＡ のＰＣＲ生産物を等モル量混合し、１００℃に加熱して変性し、５４℃に３０℃ 間維持して相補端末をアニーリングさせ、両鎖をｄＮＴＰとＴｏｑポリメラーゼ を用いて充足した。ＰＣＲプライマー＃０１および＃０４を添加し、ＰＣＲ増幅 して完全断片を製造してＢｓａＩ制限部位とそれに続いてｈＢ７−２の細胞外ド メインに融合したシグナル配列とそれとに続くＢｃｌＩ制限部位から構成される 〜８８０断片を得た。 （３）免疫グロブリン融合ドメインのクローニングおよび修飾 プラスミドｐＳＰ７２１ｇＧ１はヒトＩｇＧ１重鎖ゲノムＤＮＡの２０００ｂ ｐセグメント（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．など（１９８２年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１０巻：４０７１〜４０７９頁）をクローニングベクターｐ ＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の多重クローニング部位に クローニングして調製した。プラスミドｐＳＰ７２１ｇＧ１はヒト重鎖ＩｇＣγ １遺伝子のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするゲノムの ＤＮＡを含んでいた。重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を中間のＤＮＡと共に 増幅するように設計されたＰＣＲプライマーは次の通りに調製した。正方向ＰＣ Ｒプライマー５’−ＧＣＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡ ＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣ ＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣ−３’（配列番号：）はＨｉｎｄＩＩＩおよび ＢｃｌＩ制限部位を含み、システイン残基３個をセリンに変更させるヌクレオチ ド置換５個を除きヒンジドメイン配列について相同であった。逆方向ＰＣＲプラ イマー５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：）は 購入可能なＴ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と同一で あった。これらのプライマーによる増幅で、５’−端末でＨｉｎｄＩＩＩおよび ＢｃｌＩ制限部位に結合し、３’−端末でＢａｍＨ１、Ｓｍａ１、Ｋｐｎ１、Ｓ ａｃ１、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、ＥｃｏＲ５およびＢｇ１１１制限部位に結合す る１０５０ｂｐ断片が得られた。この断片はＩｇＣヒンジドメインを含んでいた が、そこではシステインコドン３個がセリンコドンに置換され、続いてイントロ ン、ＣＨ２ドメイン、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび後続の３’配列が付い ていた。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１で消化し、同 じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨにクローニングした。これでプ ラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１が得られた。 同様なＰＣＲによる方策を用いて、ヒトＩｇＣγ４定常領域のヒンジ−ＣＨ２ −ＣＨ３ドメインをクローニングした。完全なＩｇＣγ４重鎖ゲノム配列を含む （Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．、Ｂｕｘｂａｕｍ，Ｊ．およびＨｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．（１ ９８１年）、ＤＮＡ）１巻：１１〜１８頁）プラスミドｐ４２８Ｄ（Ｍｅｄｉｃ ａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏｕｎｃｉｌ、ロンドン、英国）を、オリゴヌクレ オチド５’ＧＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧ ＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣ− ３’（配列番号：）を正方向ＰＣＲプライマーとし、オリゴヌクレオチド５’Ｇ ＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＴ ＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番 号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いるＰＣＲ増幅の鋳型に用いた。正方 向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はＢｃｌＩ制限部位に続いてＩｇＣγ４のヒ ンジドメインをコードする配列を含む。ヒンジ領域のシステイン残基をセリン残 基に入れ換えるためにヌクレオチド置換を行った。逆方向ＰＣＲプライマー（配 列番号：）はＰｓｐＡＩ制限部位（５’ＣＣＣＧＧＧ−３’）を含む。これらプ ライマーでのＰＣＲ増幅で１１７９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ生産物をＢ ｃｌＩとＰｓｐＡＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１ にリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を得た。この反応物ではＩｇ Ｃγ４ドメインがｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１中に存在したＩｇＣγ１ドメインの代 わりになっていた。 ＩｇＣ内のＣＨ２ドメインでＦｃ受容体に結合に関与すると思われるアミノ酸 を入れ換える修飾は次の通りに行った。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１をＩ ｇＣγ１ＣＨ２ドメインの修飾用鋳型に用い、プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ ４をＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインの修飾用鋳型に利用した。プラスミドｐＮＲＤＳ Ｈ／ＩｇＧ１は正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）およびオリゴヌクレオチ ド５’−ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧ ＣＣＣＣＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号： ）を逆方向ＰＣＲプライマーに用いてＰＣＲ増幅した。正方向ＰＣＲプライマー （配 列番号：）は前に記載があり、逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はアミノ 酸２３４、２３５および２３７（Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．およびＭｏｒｒｉ ｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９１年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻：１４８３ 〜１４９１頁）を各々ＬｅｕからＡｌａ、ＬｅｕからＧｌｕおよびＧｌｙからＡ ｌａに変換するように設計されたヌクレオチド置換５個を除いてＩｇＧ１のＣＨ ２ドメインのアミノ末端部分と相同である。これらＰＣＲプライマーの増幅で修 飾ヒンジドメイン、イントロンおよび修飾ＣＨ２ドメイン部分から構成される２ ３９ｂｐのＤＮＡ断片が得られる。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１について はオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧ ＣＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣ−３’ （配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド（配列番号：）を 逆方向ＰＣＲプライマーとするＰＣＲ増幅も行った。正方向ＰＣＲプライマー（ 配列番号：）はプライマー（配列番号：）に対して相補的で、ＣＨ２のアミノ酸 置換に必要な相補ヌクレオチド変化５個を含む。逆方向ＰＣＲプライマー（配列 番号：）は前に記載がある。これらのプライマーでの増幅は修飾されたＣＨ２ド メイン部分、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび３’付加的配列から構成される ８７５ｂｐの断片を与えた。修飾ヒンジドメイン、修飾ＣＨ２ドメインおよびＣ Ｈ３ドメインから構成される完全ＩｇＣγ１セグメントは更に１回のＰＣＲ反応 によって調製した。前記２回のＰＣＲ反応の生成物を精製し、混合し、変性（９ ５℃、１分間）し、次に再生（５４℃、３０秒）して断片２個の相補的末端をア ニーリングさせた。両鎖をｄＮＴＰとＴａｑポリメラーゼを用いて充足（ｆｉｌ ｌ・ｉｎ）し、全断片を正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）および逆方向Ｐ ＣＲプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。得られた１０５０ｂｐの断片 を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、予め同じ制限酵素で消化した ｐＮＲＤＳＨにリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨＩｇＧ１ｍを得た。 免疫グロブリンの２３５位と２３７位にあるアミノ酸２個を各々ＬｅｕからＧ ｌｕおよびＧｌｙからＡｌａに変更してＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインにあるＦｃ受 容体結合部を除去した。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を正方向プライマー （配列番号：）およびオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＡＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡ ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴ ＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＡＡＣ ＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：）を逆方向プライマーに用いて のＰＣＲ増幅も行った。正方向プライマーは前に記載があり、逆方向ＰＣＲプラ イマーは前記アミノ酸置換のために設計されたヌクレオチド置換３個を除いてＣ Ｈ２ドメインのアミノ末端部分と相同である。このプライマーは後続するクロー ニングのためにＰｍＩＩ制限部位も含む。これらプライマーでの増幅で修飾ヒン ジ領域、イントロンおよびＣＨ２ドメインの修飾５’部分から構成される２５６ ｂｐの断片を得た。 オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＧ ＧＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧ ＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴ ＧＣＧ−３’（配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド（配 列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとしてもプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ ４をＰＣＲ増幅した。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はプライマー（配 列番号：）に対して相補的で、ＣＨ２アミノ酸入換えのために必要な相補ヌクレ オチド変化３個を含む。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）は前に記載があ る。これらのプライマーでの増幅で修飾ＣＨ２ドメイン部分、イントロン、ＣＨ ３ドメインおよび３’付加配列から構成される１０１２ｂｐの断片を得た。修飾 ヒンジドメイン、修飾ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される完全 ＩｇＣγ４セグメントは更に一回のＰＣＲ反応で調製した。前記２回のＰＣＲ反 応の生成物を精製し、混合し、変性（９５℃、１分間）し、次に再生（５４℃、 ３０秒）して断片２個の相補的末端をアニーリングさせた。両鎖をｄＮＴＰとＴ ａｑポリメラーゼを用いて充足し、全断片を正方向ＰＣＲプライマー（配列番号 ：）および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。得られた １１７９ｂｐの断片を精製し、ＢｃＩＩとＰｓｐＡＩで消化し、予め同じ制限酵 素で消化しておいたｐＮＲＤＳＨにリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／Ｉｇ Ｇ４ｍを得た。 （４）最終ｈＢ７−２Ｉｇ遺伝子の組立 前記で調製したＩｇシグナル−ｈＢ７−２遺伝子融合体に対応するＰＣＲ断片 をＢｓａＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で消化し、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌ Ｉで消化しておいたｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１、ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１ｍ、ｐＮ ＲＤＳＨ／ＩｇＧ４およびｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４ｍにリゲートした。結合プラ スミドをＣａＣｌ₂能力細胞大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体をアン ピシリン（５０μｇ／ｍＬ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｉ ｔｓｃｈ，Ｅ．Ｅ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．編、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を含むＬ−寒天上で選択した。形質転 換大腸菌から分離されたプラスミドを制限酵素消化により分析した。予測された 制限プラスミドを配列決定してシグナルｈＢ７−２−ＩｇＧ遺伝子融合セグメン トの全部分を確認した。Ｄ．ｈＢ７−２Ｖ−ＩｇＧ１およびｈＢ７−２Ｃ−ＩｇＧ１の発現クローニング ヒトＢ７−２の可変および定常ドメインを別々にｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１中に クローニングした。これらのクローニングはＰＣＲを用いて行った。可変および 定常領域に対応するｈＢ７−２の部分はイントロン／エキソン地図および公表さ れた遺伝子構造分析から決定した。 （１）ｈＢ７−２ＶＩｇの組立 ｈＢ７−２ＶドメインＩｇ配列は前記と同様なＰＣＲ方策を用いて組立てた。 シグナル配列はｏｎｃｏＭ遺伝子を含むプラスミドのＰＣＲ増幅によりｏｎｃｏ Ｍ遺伝子からオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡ ＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧ−３’（＃０５ ）（配列番号：）を正方向ＰＣＲプライマーとし、５’−ＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧ ＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣ ＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０６）（配列番号：）を逆方向 プライマーとして用いて誘導した。正方向ＰＣＲプライマー（＃０５）はＨｉｎ ｄＩＩＩ制限部位およびｏｎｃｏＭシグナル配列のアミノ端末部分を含む。逆方 向ＰＣＲ（＃０６）はｈＢ７−２ＩｇＶ様ドメインの５’端末に融合したｏｎｃ ｏＭシグナル配列の３’部分に対応する配列を含む。 ｈＢ７−２ＩｇＶ様ドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＣＴＧＴＴＴ ＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧ ＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＣ−３’（＃０７）（配列番号：）を正方向 、オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧ ＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣ−３’（＃０８） （配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いるｈＢ７−２ｃＤＮＡのＰ ＣＲ増幅によって得られた。これらのプライマーでのＰＣＲ増幅でｏｎｃｏＭシ グナル配列の３’末端部分を５’端末に、ＢｃｌＩ制限部位を３’端末に持つｈ Ｂ７−２ＩｇＶドメインを得た。シグナルおよびＩｇＶドメインをＰＣＲ反応で 結合した。そこではｏｎｃｏＭシグナルおよびＩｇＶドメインＤＮＡ断片等モル 量を混合し、変性し、アニーリングし、鎖を充足した。正方向プライマー＃０５ および逆方向プライマー＃０８を用いる後続ＰＣＲ増幅でＨｉｎｄＩＩＩ制限部 位、続いてＢ７−２ＩｇＶドメインに融合したｏｎｃｏＭシグナル、続いてＢｃ ｌＩ制限部位を含むＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよび ＢｃｌＩで消化し、同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ １にクローニングしてｐＮＲＤＳＨ／Ｂ７−２ＣＩｇを得た。 （２）ｈＢ７−２ＣＩｇの組立 ｈＢ７−２ＩｇＣドメインのための発現プラスミドはＩｇＣドメインに特異的 なＰＣＲプライマーを使用した点を除いてＩｇＶのために前記したようにして製 造した。シグナル配列ｏｎｃｏＭはオリゴヌクレオチド＃０５を正方向ＰＣＲプ ライマーとし、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＴＴＴ ＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧ ＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０９）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマ ーとして用いて製造した。ｈＢ７−２ＩｇＣドメインはオリゴヌクレオチド５’ −ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＴＴ ＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣ−３’（＃１１）（ 配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いて製造した。両ＰＣＲ生成物 を混合し、プライマー＃０５および＃１１で増幅してシグナル配列ｏｎｃｏＭと ｈＢ７−２ＩｇＣドメインを組立てた。このＰＣＲ生成物を次にＨｉｎｄＩＩＩ およびＢｃｌＩで消化し、同様な制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨ ／ＩｇＧ１にリゲートして最終発現プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ｈＢ７−２ＣＩｇ Ｇ１を得た。Ｅ．ヒトＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質による競合的結合の検定 種々のＢ７族−Ｉｇ融合蛋白質がビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇの固定化Ｂ７−２ −Ｉｇへの結合を競合的に阻害する性能を測定した。競合結合検定は次の通りに 行い、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．（１９８５年）、Ｊ ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４巻：２１３〜２２８頁）に従って 分析した。溶解性ｈＣＴＬＡ４Ｉｇを¹²⁵Ｉで約２×１０⁶ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比 活性に標識した。ｈＢ７−２−Ｉｇ融合蛋白質１０μｇ／ｍＬｐＨ８．０の１０ ｍＭ−トリス溶液で５０μＬ／ウェルで一夜マイクロタイター板を被覆した。ウ ェルを結合緩衝液（１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１％ＢＳＡおよび５０ｍＭ−Ｂ ＥＳを含むＤＭＥＭ、ｐＨ６．８）により２時間室温でブロックした。各ウェル に完全長Ｂ７−２（ｈＢ７−２Ｉｇ）、完全長Ｂ７−１（ｈＢ７−１Ｉｇ）、Ｂ ７−２（ｈＢ７−２ＶＩｇ）可変領域様ドメインおよびＢ７−２（ｈＢ７−２Ｃ Ｉｇ）定常領域様ドメインを含む非標識競合Ｉｇ融合蛋白質の存在または不在下 に標識ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（４ｎＭ）を添加し、室温で２．５時間結合させた。ウ ェルを氷冷結合緩衝液で１回洗浄し、次に氷冷ＰＢＳで４回洗浄した。ウェルを ０． ５Ｎ−ＮａＯＨで５分間処理して結合放射能を回収し、溶解物質を取り、ガンマ 線計測器でカウントした。 これらの検定結果を図１５に示すが、ここではｈＢ７−２Ｉｇ（１０〜２０ｎ Ｍ）およびｈＢ７−２ＶＩｇ（３０〜４０ｎＭ）の双方が固定化Ｂ７−２蛋白質 へのＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を阻害している。ｈＢ７−２ＣＩｇは可溶性ＣＴＬＡ ４と競合せず、Ｂ７−２結合領域は可変領域様ドメインにあることが判明した。Ｆ．Ｂ７−１およびＢ７−２融合蛋白質のための競合的結合の検定 種々の型の組換えＣＴＬＡ４がｈＢ７−１またはｈＢ７−２に結合する性能を 次の通りに競合的結合ＥＬＩＳＡ検定により評価した。精製組換えｈＢ７−Ｉｇ （２０μｇ／ｍＬＰＢＳ）５０μＬ中、室温で一夜コスターＥＩＡ／ＲＩＡ９６ ウェルマイクロタイター皿（Ｃｏｓｔａｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳ Ａ）に結合させた。各ウェルをＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、１％ＢＳＡ・Ｐ ＢＳを添加（２００／穴）して非結合部分を室温で１時間ブロックした。各ウェ ルは前記のように洗浄した。ビオチン化ｈＣＴＬＡ４ＩｇＧ１（ｒｅｆ、ＭＦＧ Ｒ、１μｇ／ｍＬ、順次２倍希釈、１５．６ｎｇ／ｍＬまで、５０μＬ）を各ウ ェルに添加し、室温で２．５時間インキュベーションした。各ウェルは前記の通 り洗浄した。結合したビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇはストレプトアビジン−ＨＲＰ （Ｐｉｅｒｃｅ・Ｃｈｅｍiｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１：２０００ 希釈液５０１／１を室温で３０分間加えて検出した。ウェルを前記の通りに洗浄 し、ＡＢＴＳ（Ｚｙｍｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）５０μＬを添加し、３０分 後に４０５ｎｍで青色の呈色を観測した。典型的な結合検定結果のグラフを図１ ６に示す。種々の量の競合蛋白質と非飽和性が証明されたビオチン化ＣＴＬＡ４ ＩｇＧ１一定量（すなわち、７０ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎＭ）とを混合し、前記の 通り結合検定を行い、種々の型のＣＴＬＡ４がビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１と 競合する性能を評価した（図１５）。ビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１に予期され るシグナル（４０５ｎｍ吸光）の低下はｈＢ７−１への結合での競合を示す。 ＣＴＬＡ４がＢ７−１に親和性の高い受容体であるとの前記証拠を考慮して、 ＣＴＬＡ４とＣＤ２８とのＢ７−１およびＢ７−２への結合力を比較した。Ｂ７ −１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇをビオチンで標識し、種々の濃度の非標識Ｂ７ −１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇの存在または不在下に固定化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ に結合させた。実験は¹²⁵Ｉ−標識Ｂ７−１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇでも反 復した。この固相結合検定法を使用して、Ｂ７−２のＣＴＬＡ４に対する結合力 （２．７ｎＭ）はＢ７−１で観測されたもの（４．６ｎＭ）より約２倍大きいと 測定された。実験的に決定したＩＣ₅₀値は図の上右隅に示した。ＣＤ２８に対す るＢ７−１およびＢ７−２の双方の親和性は低くて信頼性よく結論を出すことは 困難であった。実施例８ ヒトＢ７−２に対するモノクローナル抗体の製造と特性 Ａ．免疫および細胞融合 Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ研究所、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎ Ｙから入手）を１匹当り完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に乳濁化したヒトＢ７．２−Ｉｇ５０μ ｇまたはＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞１０⁶個を腹腔内投与して免疫した。マウス を不完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ＳｔＬｏ ｕｉｓ、ＭＯ）中に乳濁化したヒトＢ７．２−Ｉｇ１０〜２５μｇで２回または ＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞で初めの免疫に続いて次の２ケ月間１４日の間隔で追 加免疫した。マウスの眼窩後部から採血し、血清をヒトＢ７．２−Ｉｇに対する ＥＬＩＳＡによりこの免疫原に反応する抗体の存否について検定した。ｈＣＴＬ Ａ４−Ｉｇに対するＥＬＩＳＡも行ってＩｇテイル指向性抗体反応に対する対照 とした。強い血清反応を示したマウスに尾部静脈からヒトｈＢ７．２−Ｉｇ２５ μｇを燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓ ｌａｎｄ、ＮＹ）に希釈して静脈内追加免疫を行った。この追加免疫後３日から ４日後にマウス脾臓に免疫グロブリンの重鎖も軽鎖も分泌できない（Ｋｅａｒｎ ｅｙなど（１９７９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３巻：１５４８頁）ＳＰ ２／０骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｎｏ．ＣＲＬ８００６）を５：１で注 入した。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎが開発した方法（Ｎａｔｕｒｅ（ １ ９７５年）、２５６巻：４９５頁）に基づく標準法を用いた。Ｂ．抗体スクリーニング １０日〜２１日後、注入液からのハイブリドマコロニーを含むウェルの上清液 をヒトＢ７．２に対して反応性のある抗体の存在を次の通りにスクリーニングし た：平底９６穴板（Ｃｏｓｔａｒ社、カタログ番号３５９０）の各ウェルをヒト Ｂ７．２−Ｉｇ１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬでコートするか、リジン被覆板に４℃ で燐酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２中、３Ｔ３−ｈＢ７．２細胞５×１０⁴個でコー トした。ヒトＢ７．２−Ｉｇ溶液を吸引し去るか、細胞をグルタルアルデヒドで 板に結合し、各ウェルをＰＢＳで３回洗い、次に１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）溶液（１ ００μＬ／穴）で１時間室温でブロックした。このブロッキング用インキュベー ション後、ウェルをＰＢＳで３回洗い、ハイブリドーマ上清液を穴当り５０μＬ 加え、室温で１．５時間インキュベーションした。このインキュベーション後、 ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次に室温でホースラディッシュペルオキシダーゼ −結合、親和性精製、ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖および軽鎖−特異 性抗体（ＨＲＰ、Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃ ｉｓｃｏ、ＣＡ）の１：４０００希釈液ウェル当り５０ｐＬと共に１．５時間イ ンキュベーションした。穴を次にＰＢＳで３回洗浄し、続いて結合した抗体を検 出するＨＲＰへの基質として３０％過酸化水素１：１０００希釈を加えた１ｍＭ −２，２−アジノビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ Ｓ）の０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２溶液ウェル当り５０μＬ中で ３０分間インキュベーションした。続いて自動読取分光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ、ＶＡ）によりＯＤ₄₁₀で吸光度を測定した。 ハイブリドマ３種、ＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１が ヒトＢ７．２−Ｉｇに対する抗体を生産することを確認した。ＨＡ３．１Ｆ９は ＩｇＧ１イソタイプ、ＨＡ５．２Ｂ７はＩｇＧ２ｂイソタイプおよびＨＦ２．３ Ｄ１はＩｇＧ２ａイソタイプであると判定した。これらハイブリドマはさらに２ 回サブクローニングしてモノクローナルであることを確認した。各ハイブリドマ 細胞はブタペスト条約の規定に適合するアメリカンタイプカルチャーコレクショ ンにＡＴＣＣ受託番号−−−（ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９）、ＡＴＣＣ受理番 号−−−（ハイブリドマＨＡ５．２Ｂ７）およびＡＴＣＣ受託番号−−−（ハイ ブリドマＨＦ２．３Ｄ１）として１９９４年７月１９日に寄託した。Ｃ．競合的ＥＬＩＳＡ ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１からの上 清液をさらに競合的ＥＬＩＳＡで解析し、固定化ｈＢ７−２免疫グロブリン融合 蛋白質へのビオチン化ｈＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を阻止するモノクローナル抗体の 性能を検討した。ｈＣＴＬＡ４Ｉｇのビオチン化はＰｉｅｒｃｅ社のＩｍｍｕｎ ｏｐｕｒｅ・ＮＨＳ−ＬＣ・Ｂｉｏｔｉｎ（カタログ番号２１３３５）を用いて 行った。使用したＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質はｈＢ７．２−Ｉｇ（完全 長ｈＢ７−２）、ｈＢ７．２−ＶＩｇ（可変ドメインのみのｈＢ７−２）および ｈＢ７．２−ＣＩｇ（定常ドメインのみのｈＢ７−２）であった。ｈＢ７．１− Ｉｇ融合蛋白質を対照として用いた。ＥＬＩＳＡ用には、９６ウェル板をＩｇ融 合蛋白質（２０μｇ／ｍＬ溶液を５０μＬ／穴）で一夜室温でコートした。ウェ ルをＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液で１時間室温でブロックし、さらにＰＢＳで３ 回洗浄した。各穴にＢｉｏ−ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（７０ｎｇ／ｍＬ）５０μＬと 競合モノクローナル抗体上清液５０μＬとを添加した。対照抗体は抗−Ｂ７．１ ｍＡｂ（ＥＷ３．５Ｄ１２）および抗−ｈＢ７−２ｍＡｂＢ７０（ＩｇＧ２ｂκ 、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）であった。各ウェルを再び洗い、ストレプト アビジン−結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ社から、カ タログ番号２１１２６、１：２０００希釈、５０μＬ／穴）を添加し、室温で３ ０分間インキュベーションした。再びウェルを洗浄し、続いてＨＲＰの基質とし て抗体を検出するために３０％過酸化水素を１：１０００希釈で添加したＡＢＴ Ｓの０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２溶液ウェル当り５０μＬ中で３ ０分間インキュベーションした。続いて、自動読取分光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ、ＶＡ）によりＯＤ₄₁₀で吸光度を測定した。下記表ＩＶに示す結果はハイブ リドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１から生産される各 ｍＡｂはｈＣＬＴＡ４Ｉｇの完全長ｈＢ７．２−ＩｇまたはｈＢ７．２−ＶＩｇ への結合を競合的に阻止できることを証明する（ｈＣＬＴＡ４ＩｇはｈＢ７．２ −ＣＩｇには結合しない）。 Ｄ．フローサイトメトリー ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１からの上 清液をフローサイトメトリーによっても解析した。クローンから集めた上清液を ｈＢ７．２を発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯおよび３Ｔ３細胞（Ｃ ＨＯ−ｈＢ７．２および３Ｔ３−ｈＢ７．２）上または対照をトランスフェクト ３Ｔ３細胞（３Ｔ３−Ｎｅｏ）上でフローサイトメトリーによりスクリーニング した。フローサイトメトリーは次の通りに行った：細胞１×１０⁶個を１％ＢＳ ＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次に細胞を１×１０⁶細胞当りハイブリドマ上清 液または培養液５０μＬ中で４℃で３０分間インキュベーションした。インキュ ベーション後、細胞を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次にフルオレッセ イン結合ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１：５０希釈液を１×１０⁶ 細胞当り５０μＬを用いて４℃で３０分間インキュベーションした。次に細胞を １％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液で固定化 した。細胞標本を次にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄ ｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ・Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。図１７、１８および １９に示す結果はハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２． ３Ｄ１により生産されるモノクローナル抗体は各々細胞表面上のｈＢ７−２に結 合することを証明している。Ｅ．抗−ｈＢ７−２ｍＡｂによるヒトＴ細胞増殖の阻止 抗−ヒトＢ７−２ｍＡｂを含むハイブリドマ上清液がヒトＴ細胞のｈＢ７−２ 共刺激を阻止する性能について検討した。この検定では、精製ＣＤ２８⁺ヒトＴ 細胞を準分裂促進量のＰＭＡ（１ｎｇ／ｍＬ）で処理して一次シグナルを得、表 面にｈＢ７−２を発現するＣＨＯ細胞で共剌激シグナルを得た。Ｔ細胞の増殖は 培養液中３日後に³Ｈ−チミジンを添加して残りの１８時間の間に測定した。表 Ｖに示すように³Ｈ−チミジン（５１０ｐｍ）取込法による測定では休止Ｔ細胞 は増殖を示さなかった。ＰＭＡによるシグナル１の放出ではいくらかの増殖（３ ８００ｐｍ）が見られ、一次（ＰＭＡ）および共刺激（ＣＯＳ／ｈＢ７−２）シ グナルの両方を受けたＴ細胞では最高に増殖（９０２０ｃｐｍ）した。検査した 抗−ｈＢ７−２ｍＡｂ３個全ては共刺激シグナルが誘導した増殖をＰＭＡ単独処 理細胞で見られる増殖にまで低減し、これらｍＡｂがＢ７／ＣＤ２８共剌激経路 を遮断することによってＴ細胞増殖を阻止することを示した。 実施例９ Ｂ７−２を発現するようにトランスフェクトした移植腫瘍細胞の退縮 この実施例ではトランスフェクトしていないか、Ｂ７−２をトランスフェクト したＪ５５８形質細胞腫細胞を腫瘍退縮研究に用いて動物に移植した時、この腫 瘍細胞表面に発現するＢ７−２の腫瘍細胞成長に対する効果を検討した。 Ｊ５５８形質細胞腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手、＃ＴＩＢ６）にマウスＢ７−２（ｐＡＷＮＥ０３ ）またはＢ７−１（ｐＮＲＤＳＨまたはｐＡＷＮＥ０３）およびネオマイシン耐 性遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした。ネ オマイシン耐性を基準にして安定なトランスフェクト体を選択し、腫瘍細胞上の Ｂ７−２またはＢ７−１の細胞表面発現を抗−Ｂ７−２または抗−Ｂ７−１抗体 を用いるＦＡＣＳ分析により確認した。 同遺伝子型Ｂａｌｂ／ｃマウスを１群５〜１０匹として腫瘍細胞上のＢ７−２ 細胞表面発現が移植腫瘍細胞の退縮をもたらすかどうかを判定できるように設計 した実験に用いた。未トランスフェクトおよびトランスフェクトＪ５５８細胞を 試験管内で培養し、採取し、Ｈａｎｋの緩衝塩溶液（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ・ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）で洗浄後、１０⁸細胞／ｍＬの濃度で再懸濁 した。各マウスの右側腹部の皮膚の一部を脱毛薬で脱毛し、２４時間後にマウス １匹当り腫瘍細胞５×１０⁶個を皮内または皮下に移植した。２日または３日毎 にカリパスと定規を用いて腫瘍容積を（３垂直方向の直線的測定で）計測した。 典型的実験を１８〜２１日継続したが、終了時には、未トランスフェクト対照Ｊ ５５８細胞を移植したマウスでは腫瘍サイズはマウス体容積の１０％を超えてい た。図２０に示す通り、マウスは表面にＢ７−２を発現するようにトランスフェ クトしたＪ５５８細胞を排除した。３週間後にさえ、腫瘍生育は観察されなかっ た。同様な結果は表面にＢ７−１を発現するようにトランスフェクトしたＪ５５ ８細胞でも観察された。対照的に、未トランスフェクト（野生型）Ｊ５５８細胞 では１２日目には動物に治療不能な大きな腫瘍を造った。この実施例は腫瘍細胞 へのＢ７−２ｃＤＮＡのトランスフェクションによるような腫瘍細胞のＢ７−２ 細胞表面発現が感受性動物に腫瘍細胞拒絶を起こすに十分な抗腫瘍反応を誘導す ることを証明するものである。均等 当業者は通例的実験以上を用いずとも、ここに記載した本発明の特定的態様に 多数の均等体を認識するか、または確信できるものである。このような均等範囲 は本請求項に包含されるべきであると意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 19/00 19/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 15/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/566 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／１４７，７７３ (32)優先日 1993年11月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ナドラー，リー・エム アメリカ合衆国02159マサチューセッツ州、 ニュートン、クロス・ヒル・ロード36番 (72)発明者 グレイ，ゲーリー・エス アメリカ合衆国02146マサチューセッツ州、 ブルックリン、ミルトン・ロード32番 (72)発明者 グリーンフィールド，エドワード アメリカ合衆国02368マサチューセッツ州、 ランドルフ、アービング・ロード301番 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードするヌクレオ チド配列を含んでなる単離した核酸。 ２．cＤＮＡ配列である請求項１に記載の単離した核酸。 ３．cＤＮＡがヒト起源である請求項２に記載の単離した核酸。 ４．cＤＮＡが図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配列を含んでなる請求項 ３に記載の単離した核酸。 ５．cＤＮＡが図８(配列番号１)に示す核酸配列のコーディング領域を含んで なる請求項３に記載の単離した核酸。 ６．cＤＮＡがミュリン起源である請求項２に記載の単離した核酸。 ７．cＤＮＡが図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列を含んでなる請 求項６に記載の単離したヌクレオチド。 ８．cＤＮＡが図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列のコーディング 領域を含んでなる請求項６に記載の単離した核酸。 ９．ペプチドが図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求項１に 記載の単離した核酸。 １０．ペプチドが図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求 項１に記載の単離した核酸。 １１．ペプチドが図８(配列番号２)のアミノ酸配列を含んでなる配列と少なく とも５０％相同性である請求項１に記載の単離した核酸。 １２．ペプチドが図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチド をコードする核酸に高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイズする 核酸によりコードされている請求項１に記載の単離した核酸。 １３．ペプチドが長さで少なくとも２０のアミノ酸残基である請求項１に記載 の単離した核酸。 １４．ペプチドが図１４(配列番号２３)のアミノ酸配列を含んでなる配列と少 なくとも５０％相同性である請求項１に記載の単離した核酸。 １５．ペプチドが図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含んでなるペプ チドをコードする核酸に、高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイ ズする核酸によりコードされている請求項１に記載の単離した核酸。 １６．ペプチドが長さで少なくとも２０のアミノ酸残基である請求項１５に記 載の単離した核酸。 １７．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を 含んでなる請求項１に記載の単離した核酸。 １８．Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードするヌクレオ チド配列を含んでなる単離したＤＮＡであって、該ペプチドは、式： Ｘn−Ｙ−Ｚm （式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を含んで なり、 Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ 酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するア ミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 n＝０〜２３、m＝０〜８４である。） によって表わされるアミノ酸配列を有する、単離したＤＮＡ。 １９．n＝０、m＝０である請求項１８に記載の単離したＤＮＡ。 ２０．長さで少なくとも２０のアミノ酸残基またはそれ以上であって、図８( 配列番号２)に示す配列を含んでなるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同 性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離したＤＮＡ 。 ２１．Ｂ７−２活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、 および第１のペプチドの溶解性、結合親和性または価数を変化させる部分に対応 する第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、Ｂ７−２融合 タンパク質をコードする単離した核酸。 ２２．ＤＮＡである請求項２１に記載の単離した核酸。 ２３．第１のペプチドがヒトＢ７−２タンパク質の細胞外ドメインを含んでな る請求項２２に記載の単離した核酸。 ２４．第１ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４ ５を含んでなる請求項２３に記載の単離した核酸。 ２５．第１のペプチドがヒトＢ７−２の可変領域様ドメインを含んでなる請求 項２３に記載の単離した核酸。 ２６．第１のペプチドがヒトＢ７−２の定常領域様ドメインを含んでなる請求 項２３に記載の単離した核酸。 ２７．第２のペプチドが免疫グロブリン定常領域を含んでなる請求項２２に記 載の単離した核酸。 ２８．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＣ γ１ドメインである請求項２７に記載の単離した核酸。 ２９．免疫グロブリン定常領域が、定常領域媒介生物学的エフェクター機能を 減少させるよう修飾されている請求項２７に記載の単離した核酸。 ３０．生物学的エフェクター機能が、補体活性化、Ｆcレセプター相互作用、 並びに補体活性化およびＦcレセプター相互作用よりなる群から選択される請求 項２９に記載の単離した核酸。 ３１．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＣγ４ ドメインである請求項３０に記載の単離した核酸。 ３２．ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、付加、また は削除により修飾されている請求項３１に記載の単離した核酸。 ３３．Ｂ７−２活性を有する第１のペプチド、および第１のペプチドの溶解性 、結合親和性、または価数を変化させる部分に対応する第２のペプチドを含んで なる単離されたＢ７−２融合タンパク質。 ３４．第１のペプチドがヒトＢ７−２タンパク質の細胞外ドメインを含んでな る請求項３３に記載の単離されたＢ７−２融合タンパク質。 ３５．第１のペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２ ４５を含んでなる請求項３４に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ３６．第１のペプチドがヒトＢ７−２の可変領域様ドメインを含んでなる請求 項３４に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ３７．第１のペプチドがヒトＢ７−２の定常領域様ドメインを含んでなる請求 項３４に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ３８．第２のペプチドが免疫グロブリン定常領域を含んでなる請求項３３に記 載の単離されたＢ７−２融合タンパク質。 ３９．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＣ γ１ドメインである請求項３８に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ４０．免疫グロブリン定常領域が、定常領域媒介生物学的エフェクター機能を 減少させるよう修飾されている請求項３８に記載の単離したＢ７−２融合タンパ ク質。 ４１．生物学的エフェクター機能が、補体活性化、Ｆcレセプター相互作用、 並びに補体活性化およびＦcレセプター相互作用よりなる群から選択される請求 項４０に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ４２．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＣ γ４ドメインである請求項４１に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ４３．ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、付加または 削除により修飾されている請求項４２に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質 。 ４４．請求項３３に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４５．請求項３４に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４６．請求項３６に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４７．請求項３８に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４８．請求項１に記載の核酸を含んでなる組換え発現ベクター。 ４９．核酸がcＤＮＡ配列である請求項４８に記載の組換え発現ベクター。 ５０．cＤＮＡがヒト由来であり、図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配列 を含んでなる、請求項４９に記載の組換え発現ベクター。 ５１．プラスミドである請求項４９に記載の組換え発現ベクター。 ５２．請求項７に記載の核酸を含んでなる組換え発現ベクター。 ５３．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの発現を指向できる 請求項４８に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。 ５４．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの発現を指向できる 、請求項５０に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。 ５５．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの発現を指向できる 請求項５２に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。 ５６．請求項５４に記載の宿主細胞により発現された、Ｂ７−２リンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有する単離された組換えペプチド。 ５７．細胞表面でのペプチドの発現に適した形の、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２ の活性を有するペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞。 ５８．核酸が組換え発現ベクター中の図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配 列を含んでなるcＤＮＡである請求項５７に記載の細胞。 ５９．Ｔ細胞共刺激分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞。 ６０．Ｂ７−２の発現に適した形のヒトＢ７−２をコードする核酸でトランス フェクトされた請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６１．Ｂ７−２を発現するよう刺激された請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６２．腫瘍細胞と結合したヒトＢ７−２抗原を有する請求項５９に記載の腫瘍 細胞。 ６３．Ｔ細胞共剌激分子Ｂ７−１を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６４．Ｔ細胞共剌激分子Ｂ７−３を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６５．ＭＨＣクラスＩ分子を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６６．ＭＨＣクラスII分子を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６７．ＭＨＣクラスII関連タンパク質、インバリアント鎖を通常は発現し、該 インバリアント鎖の発現が阻害されている請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６８．Ｂ７−２発現に適した形の、Ｔ細胞共刺激分子、Ｂ７−２をコードする 核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞。 ６９．核酸が組換え発現ベクター中のcＤＮＡである請求項６８に記載の腫瘍 細胞。 ７０．Ｂ７−１発現に適した形の、Ｔ細胞共剌激分子、Ｂ７−１をコードする 核酸で更にトランスフェクトされた請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７１．Ｂ７−３発現に適した形の、Ｔ細胞共刺激分子、Ｂ７−３をコードする 核酸で更にトランスフェクトされた請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７２．(a)少なくとも１つのＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質、および (b)少なくとも１つのＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質、 をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１つの核酸で更にトランスフェクト された請求項６８に記載の腫瘍細胞であって、該核酸はＭＨＣクラスIIα鎖タン パク質およびＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質の発現に適した形である、腫瘍細胞 。 ７３．腫瘍細胞のトランスフェクション前にはＭＨＣクラスII分子を発現しな い請求項７２に記載の腫瘍細胞。 ７４．ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に適した形の少なくとも１つのＭＨＣ クラスＩα鎖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸で更にトランスフェ クトされた請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７５．β−２ミクログロブリンタンパク質の発現に適した形のβ−２ミクログ ロブリンタンパク質をコードする核酸で更にトランスフェクトされた請求項７４ に記載の腫瘍細胞。 ７６．ＭＨＣクラスII関連タンパク質、インバリアント鎖を通常は発現し、該 インバリアント鎖の発現が阻害されている請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７７．インバリアント鎖遺伝子の制御またはコーディング領域にアンチセンス である核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションによりインバリアント鎖の発 現が阻害されている請求項７６に記載の腫瘍細胞。 ７８．サルコーマである請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７９．リンパ腫である請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ８０．黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、およびカルチノーマよりなる群から選 択される請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ８１．(a)患者から腫瘍細胞を得て； (b)Ｂ７−２の発現に適した形のＢ７−２をコードする核酸で腫瘍細胞をトラン スフェクトし；そして (c)該腫瘍細胞を患者に投与する、 ことを含んでなる、腫瘍を有する患者を処置する方法。 ８２．腫瘍細胞をＢ７−１をコードする核酸で更にトランスフェクトする請求 項８１に記載の方法。 ８３．ＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質およびＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質の 発現に適した形の、少なくとも１つのＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質および少な くとも１つのＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸 で、腫瘍細胞を更にトランスフェクトする請求項８１に記載の方法。 ８４．ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に適した形の、少なくとも１つのＭＨ ＣクラスＩα鎖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸で、腫瘍細胞を更 にトランスフェクトする請求項８１に記載の方法。 ８５．β−２ミクログロブリンタンパク質の発現に適した形の、β−２ミクロ グロブリンタンパク質をコードする核酸で、腫瘍細胞を更にトランスフェクトす る請求項８４に記載の方法。 ８６．ＭＨＣクラスII関連タンパク質、インバリアント鎖の発現が腫瘍細胞中 で阻害されている請求項８１に記載の方法。 ８７．インバリアント鎖遺伝子の制御またはコーディング領域に対しアンチセ ンスである核酸で腫瘍細胞をトランスフェクトすることによりインバリアント鎖 の発現が腫瘍細胞中で阻害されている請求項８６に記載の方法。 ８８．腫瘍がサルコーマである請求項８１に記載の方法。 ８９．腫瘍がリンパ腫である請求項８１に記載の方法。 ９０．腫瘍が黒色腫、神経芽細胞腫、白血病およびカルチノーマよりなる群か ら選択される請求項８１に記載の方法。 ９１．(a)患者から腫瘍細胞を得て； (b)該腫瘍細胞を (ｉ)Ｂ７−２ (ii)ＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質；および (iii)ＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質 をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１つの核酸で腫瘍細胞をトランスフ ェクトし(該核酸は、Ｂ７−２、ＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質およびＭＨＣク ラスIIβ鎖タンパク質の発現に適した形である)；そして (c)患者に該腫瘍細胞を投与する； ことを含んでなる、腫瘍細胞を有する患者中でＣＴ４＋Ｔリンパ球による抗腫瘍 応答を誘導する方法。 ９２．Ｔ細胞共剌激分子、Ｂ７−２を発現するよう腫瘍細胞をインビボで修飾 することを含んでなる腫瘍を有する患者の処置方法。 ９３．Ｂ７−２発現に適した形のＢ７−２をコードする核酸をインビボで患者 に送ることにより、腫瘍細胞をインビボで修飾する請求項９２に記載の方法。 ９４．適当なビヒクル中の核酸を腫瘍中に注入することにより核酸をインビボ で患者に運ぶ請求項９３に記載の方法。 ９５．(a)患者から腫瘍細胞とＴリンパ球を得て； (b)患者からの腫瘍細胞と共に、および剌激形のＢ７−２と共に、患者からのＴ リンパ球をインビトロで培養し； (c)Ｔリンパ球を患者に投与する； ことを含んでなる、腫瘍を有する患者を処置する方法。 ９６．請求項１に記載の核酸の組換え発現により製造される、Ｂリンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 ９７．請求項４に記載の核酸の組換え発現により製造される、Ｂリンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 ９８．請求項５に記載の核酸の組換え発現により製造される、Ｂリンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 ９９．図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求項９８に記載の ペプチド。 １００．請求項１８に記載のＤＮＡの組換え発現により製造される、Ｂリンパ 球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 １０１．請求項２０に記載のＤＮＡの組換え発現により製造される、Ｂリンパ 球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 １０２．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの実質的に純粋な 製剤。 １０３．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−３の活性を有するペプチドの実質的に純粋な 製剤。 １０４．式： Ｘn−Ｙ−Ｚm (式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図８(配列 番号２)に示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列の アミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１６ ０〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、図８ (配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択され るアミノ酸残基であり、 Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ 酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するア ミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 n＝０〜３０で、m＝０〜３０である。） によって表わされるアミノ酸配列を有するペプチド。 １０５．n＝０でm＝０である請求項１０４に記載のペプチド。 １０６．ヒトＢリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードする 核酸の組換え発現により製造されるペプチドと特異的に反応する抗体。 １０７．ヌクレオチド配列が図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配列のコー ディング領域を含んでなる請求項１０６に記載の抗体。 １０８．モノクローナル抗体である請求項１０６に記載の抗体。 １０９．ＩgＧ１抗体である請求項１０８に記載の抗体。 １１０．ＩgＧ２ａ抗体である請求項１０８に記載の抗体。 １１１．ＡＴＣＣ受託番号 により表わされるハイブリドーマＨＦ ２.３Ｄ１。 １１２．請求項１１１に記載のハイブリドーマにより製造されるモノクローナ ル抗体。 １１３．ＡＴＣＣ受託番号 により表わされるハイブリドーマＨＡ ５.２Ｂ７。 １１４．請求項１１３に記載のハイブリドーマにより製造されるモノクローナ ル抗体。 １１５．ＡＴＣＣ受託番号 により表わされるハイブリドーマＨＡ ３.１Ｆ９。 １１６．請求項１１５に記載のハイブリドーマにより製造されるモノクローナ ル抗体。 １１７．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７の活性を有するペプチドを発現するようトラン スフェクトされた細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物。 １１８．マウスである請求項１１７に記載の非ヒトのトランスジェニック動物 。 １１９．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２をコードする変化させた遺伝子を有する細 胞を含む非ヒトのノックアウト動物。 １２０．マウスである請求項１１９に記載の非ヒトのノックアウト動物。 １２１．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチド、および薬学的に 許容し得る担体を含んでなる、医薬的投与に適した組成物。 １２２．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−１の活性を有するペプチドを更に含んでなる 請求項１２１に記載の組成物。 １２３．ペプチドが図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求項 １２１に記載の組成物。 １２４．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５ を含んでなる請求項１２３に記載の組成物。 １２５．請求項５３に記載の宿主細胞を培地中で培養してペプチドを発現させ 、培地からペプチドを単離することを含んでなる、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の 活性を有するペプチドを製造する方法。 １２６．請求項５４に記載の宿主細胞から培地中で培養してペプチドを発現さ せ、培地からペプチドを単離することを含んでなる、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２ の活性を有するペプチドの製造方法。 １２７．免疫細胞を、Ｂ７−２のその天然リガンドとの結合を阻害する薬剤と 接触させ、それによってＢ７−２−リガンド相互作用による免疫細胞の共刺激を 阻害することを含んでなる、免疫細胞の表面上でのＢリンパ球抗原、Ｂ７−２の その天然リガンドとの相互作用を阻害する方法。 １２８．薬剤が、Ｂ７−２結合活性を有するが共刺激シグナルを免疫細胞に伝 達する能力を欠いているペプチドである請求項１２６に記載の方法。 １２９．ペプチドが可溶性の、モノマー性のペプチドである請求項１２８に記 載の方法。 １３０．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５ を含んでなる請求項１２９に記載の方法。 １３１．薬剤が、Ｂ７−２の活性を有する第１のペプチド、および第１のペプ チドの溶解性、結合親和性、または価数を変化させる部分を含む第２のペプチド を含んでなるＢ７−２融合タンパク質である、請求項１３０に記載の方法。 １３２．第１のペプチドがヒトＢ７−２タンパク質の細胞外ドメインを含んで なる請求項１３１に記載の方法。 １３３．第１のペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜 ２４５を含んでなる請求項１３２に記載の方法。 １３４．第２のペプチドが免疫グロブリン定常領域を含んでなる請求項１３１ に記載の方法。 １３５．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む Ｃγ１ドメインである請求項１３４に記載の方法。 １３６．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１３１に記載の方法。 １３７．抗体がモノクローナル抗体である請求項１３６に記載の方法。 １３８．患者に、Ｂ７−２結合活性を有するが共剌激シグナルＴ細胞に伝達す る能力を欠いた薬剤を、患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分 泌を阻害するのに有効な量投与することを含んでなる、患者中のＴ細胞媒介免疫 応答を下方制御する方法。 １３９．薬剤がＢ７−２結合活性を有するが、共剌激シグナルをＴ細胞に伝達 する能力を欠いたペプチドである請求項１３８に記載の方法。 １４０．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１３８に記載に方法。 １４１．抗体がモノクローナル抗体である請求項１４０に記載の方法。 １４２．患者に、Ｂ７−１結合活性を有するが、Ｔ細胞に共刺激シグナルを伝 達する能力を欠いた薬剤を投与することを更に含んでなる請求項１３８に記載の 方法。 １４３．薬剤が、Ｂ７−１結合活性を有するが、Ｔ細胞に共刺激シグナルを伝 達する能力を欠いたペプチドである請求項１４２に記載の方法。 １４４．薬剤がＢ７−１と反応性の抗体である請求項１４２に記載の方法。 １４５．抗体がモノクローナル抗体である請求項１４４に記載の方法。 １４６．ＣＤ２８と反応性の抗体、ＣＴＬＡ４と反応性の抗体、サイトカイン と反応性の抗体、ＣＴＬＡ４Ｉg融合タンパク質、ＣＤ２８Ｉg融合タンパク質、 および免疫抑制剤よりなる群から選択する免疫調節剤を患者に投与することを更 に含んでなる請求項１３８に記載の方法。 １４７．患者に阻害形のＢ７−２タンパク質を投与し、それによりＢ７−２− リガンド相互作用による免疫細胞の共剌激を阻害することを含んでなる、Ｂリン パ球抗原、Ｂ７−２の免疫細胞表面上での、その天然リガンドとの相互作用によ り媒介される患者の自己免疫疾患を治療する方法。 １４８．自己免疫病が、真性糖尿病、慢性関節リウマチ、多発硬化症、重症筋 無力症、全身性エリテマトーデス、および自己免疫甲状腺炎よりなる群から選択 される請求項１４７に記載の方法。 １４９．阻害形のＢ７−２タンパク質が、Ｂ７−２結合活性を有するか共剌激 シグナルを免疫細胞に伝達する能力を欠いたタンパク質である請求項１４７に記 載の方法。 １５０．ペプチドが、可溶性モノマー性ペプチドである請求項１４９に記載の 方法。 １５１．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５ を含んでなる請求項１５０に記載の方法。 １５２．阻害形のＢ７−２タンパク質が、Ｂ７−２タンパク質の膜外ドメイン を含む第１のペプチド、および免疫グロブリン定常ドメインを含む第２のペプチ ドを含んでなるＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質(Ｂ７−２Ｉg)である請 求項１４７に記載の方法。 １５３．Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメインが、図８(配列番号２)に示す配 列のアミノ酸残基２４〜２４５を含んでなる請求項１５２に記載の方法。 １５４．阻害形のＢ７−２タンパク質がＢ７−２と反応性の抗体である請求項 １４７に記載の方法。 １５５．抗体がモノクローナル抗体である請求項１５４に記載の方法。 １５６．患者に、Ｂ７−１結合活性を有するが、Ｔ細胞への共剌激シグナルを 伝達する能力を欠いているペプチドを投与することを更に含んでなる請求項１４ ９に記載の方法。 １５７．患者に、Ｂ７−１に反応性の抗体、ＣＤ２８に反応性の抗体、ＣＴＬ Ａ４に反応性の抗体、サイトカインに反応性の抗体、ＣＴＬＡ４Ｉg融合タンパ ク質、ＣＤ２８Ｉg融合タンパク質、および免疫抑制剤よりなる群から選択され る免疫調節剤を投与することを更に含んでなる請求項１４７に記載の方法。 １５８．患者に阻害形のＢ７−２タンパク質を投与し、それによってＢ７−２ リガンド相互作用による免疫細胞の共刺激を阻害することを含んでなる、免疫細 胞表面でのＢリンパ球抗原、Ｂ７−２のその天然のリガンドとの相互作用により 媒介される患者におけるアレルギーを治療する方法。 １５９．阻害形のＢ７−２タンパク質が、Ｂ７−２結合活性を有するが免疫細 胞に共刺激シグナルを伝達する能力を欠いたペプチドである請求項１５８に記載 の方法。 １６０．被移植者におけるドナーＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌 を抑制し、それによって被移植者における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を阻止す る方法であって、該方法は移植されるべきドナーＴ細胞を、Ｂ７−２結合活性を 有するがＴ細胞への共刺激シグナルを伝達する能力を欠いている薬剤と接触させ ることを含んでなる方法。 １６１．薬剤がＢ７−２結合活性を有するが、Ｔ細胞へ共剌激シグナルを伝達 する能力を欠いているペプチドである請求項１６０に記載の方法。 １６２．ペプチドが図８（配列番号２）に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４ ５を含んでなる請求項１６１に記載の方法。 １６３．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１６０に記載の方法。 １６４．抗体がモノクローナル抗体である請求項１６３に記載の方法。 １６５．組織また器官移植の被移植者での移植拒絶を抑制する方法であって、 該方法は被移植者に、Ｂ７−２結合活性を有するが、Ｔ細胞へ共刺激シグナルを 伝達する能力を欠いている薬剤を投与することを含んでなる方法。 １６６．薬剤が、Ｂ７−２結合活性を有するが、Ｔ細胞へ共剌激シグナルを伝 達する能力を欠いているペプチドである請求項１６５に記載の方法。 １６７．ペプチドが、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４ ５を含んでなる請求項１６６に記載の方法。 １６８．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１６５に記載の方法。 １６９．抗体がモノクローナル抗体である請求項１６８に記載の方法。 １７０．患者におけるＴ細胞媒介免疫応答を上方調節する方法であって、該方 法はＢ７−２活性を有するペプチドを、患者におけるＴ細胞増殖および／または サイトカイン分泌を剌激するのに有効な量患者に投与することを含んでなる方法 。 １７１．患者にＢ７−１活性を有するペプチドを投与することを更に含んでな る請求項１７０に記載の方法。 １７２．患者に病原体またはその部分を投与し、それによって患者における抗 病原体免疫応答を誘導することを更に含んでなる請求項１７０に記載の方法。 １７３．病原体がウイルスである請求項１７２に記載の方法。 １７４．Ｂ７−２抗原の発現を調節する分子を同定する方法であって、該方法 は、 a) Ｂ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞を、試験すべき分子と、該分 子と細胞との相互作用に適当な条件下に接触させ;そして b) Ｂ７−２活性を有するペプチドの細胞発現に及ぼすその分子の影響を測定す る； ことを含んでなる方法。 １７５．Ｂ７−２活性を有するペプチドの細胞発現に及ぼす分子の影響を細胞 表面でのペプチドの存在を検出することにより測定する請求項１７４に記載の方 法。 １７６．細胞表面でのペプチドの存在を、ペプチドと反応性の抗体、またはＣ ＴＬＡ４Ｉg若しくはＣＤ２８Ｉg融合タンパク質を用いる免疫蛍光法により検出 する請求項１７５に記載の方法。 １７７．Ｂ７−２活性を有するペプチドの細胞表現に及ぼす分子の影響を、細 胞中のペプチドをコードするmＲＮＡの存在を検出することにより測定する請求 項１７４に記載の方法。 １７８．mＲＮＡの存在をＢ７−２cＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより 検出する請求項１７７に記載の方法。 １７９．Ｂ７−２抗原による共刺激に応答して免疫細胞により産生されるサイ トカインの同定方法であって、該方法は、 a) 活性化免疫細胞、およびＢ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞を、 適当な細胞培養培地中で接触させ;そして b) 細胞培養培地中のサイトカインの存在を測定する； ことを含んでなる方法。 １８０．免疫細胞がＴ細胞である請求項１７９に記載の方法。 １８１．細胞培養培地中のサイトカインの存在を、媒地をサイトカイン反応性 の抗体と接触させることにより測定する請求項１７９に記載の方法。 １８２．Ｂ７−２抗原による免疫細胞の共剌激を阻害する分子を同定する方法 であって、該方法は a) 一次活性化シグナルを受取った免疫細胞を、剌激形のＢ７−２タンパク質お よび試験すべき分子と、その分子の免疫細胞および剌激形のＢ７−２タンパク質 との相互作用に適当な条件下に接触させ;そして b) 剌激形のＢ７−２タンパク質による免疫細胞の共刺激に及ぼすその分子の影 響を測定する； ことを含んでなる方法。 １８３．免疫細胞がＴ細胞である請求項１８２に記載の方法。 １８４．Ｔ細胞の共剌激に及ぼす分子の影響を、Ｔ細胞増殖および／またはサ イトカイン産生により測定する請求項１８３に記載の方法。 １８５．共刺激形のＢ７−２が、細胞表面でＢ７−２活性を有するペプチドを 発現する細胞である請求項１８２に記載の方法。 １８６．免疫細胞の表面でのＢ７−２抗原のリガンドへの結合を阻害する分子 を同定する方法であって、該方法は、 a) ラベルしたＢ７−２リガンドおよび試験すべき分子を、Ｂ７−２活性を有す るペプチドと接触させ； b) 結合しなかったラベルしたＢ７−２リガンドを除去し;そして c) Ｂ７−２活性を有するペプチドに結合したラベルしたＢ７−２リガンドの量 を、Ｂ７−２リガンドのＢ７−２抗原への結合を阻害する該分子の能力の指標と して測定する； ことを含んでなる方法。 １８７．免疫細胞がＴ細胞であり、Ｂ７−２リガンドがＣＴＬＡ４またはＣＤ ２８である請求項１８６に記載の方法。 １８８．ペプチドを固相支持体に固定化する請求項１８６に記載の方法。 １８９．刺激形のＢ７−２タンパク質に応答する免疫細胞による細胞内信号伝 達を阻害する分子を同定する方法であって、該方法は、 a) １次活性化シグナルを受け取っており、細胞表面でＢ７−２リガンドを発現 する免疫細胞を、刺激形のＢ７−２タンパク質および試験すべき分子と、該分子 の免疫細胞および刺激形のＢ７−２タンパク質との相互作用に適当な条件下に接 触させ;そして b) 刺激形のＢ７−２タンパク質に応答する免疫細胞による細胞内信号伝達に及 ぼす該分子の影響を測定する； ことを含んでなる方法。 １９０．免疫細胞がＴ細胞である請求項１８９に記載の方法。 １９１．免疫細胞による細胞内信号伝達に及ぼす分子の影響を、Ｔ細胞増殖お よび／またはサイトカイン産生を検出することにより測定する請求項１９０に記 載の方法。 １９２．剌激形のＢ７−２が、細胞表面上でＢ７−２活性を有するペプチドを 発現する細胞である請求項１８９に記載の方法。 １９３．Ｂ７−３活性を有するペプチドを有する細胞物質を、Ｂ７−３と反応 性の抗体と、抗体のペプチドへの結合に適当な条件下に接触させ、抗体からペプ チドを単離することを含んでなる、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−３の単離方法。