JPH09500887A - ウイルス病を治療するためのチオール化合物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルス誘発病を治療するための製薬組成物の調製にチオール化合物を新たに使用することに関するものである。特に、本発明は、ウイルス誘発病を治療するための製薬組成物の調製にチオール化合物を新たに使用することであって、使用するチオール化合物がウイルスタンパク質中に存在するジスルフィド架橋を壊すことを特徴とするチオール化合物の使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス病を治療するためのチオール化合物の使用 本発明は、ウイルス誘発病を治療するための製薬組成物の調製にチオール化合 物を新たに使用することに関するものである。特に、本発明は、ウイルス誘発病 を治療するための製薬組成物の調製にチオール化合物を使用することであって、 使用するチオール化合物がタンパク質中に存在するジスルフィド架橋を壊すこと を特徴とするチオール化合物の使用に関するものである。 様々なウイルス性病原により生じる、植物、動物およびヒトの急性並びに慢性 感染は、重大な医学的並びに経済的問題を意味する。実際、産業国で生じている 疾病のおそらく60％はウイルスにより引き起こされるものである。このように、 例えば、肝炎ウイルスにより引き起こされる疾病は、世界中で最も頻繁な感染の 内に数えられる。このようなウイルス感染は実質的に肝臓に影響を与えるので、 この器官の進行性破壊は、続いて肝硬変を引き起こし、最終的に肝細胞癌を発生 させるかもしれない。 ウイルス性病原に対して特異性の大きいこと、並びにこれと同時に健康を損な う副作用のないことまたは副作用を最小限にすることは、抗ウイルス性治療薬に 必須の要求である。この点について、ウイルス生殖周期と宿主細胞の代謝並びに 複製機能との密接な関連が、特に問題となることが判明している。当分の間、医 学研究においては、ウイルスゲノムの複製を減少させるかまたは防ぐ抗ウイルス 薬の開発に焦点が当てられており、特に化学合成されたヌクレオシド類似体が重 要視されている。 しかしながら、抗ウイルス化学療法の主な問題の１つが、例えば、Ｂ型肝炎ウ イルスのような複数の重要な感染因子に役立つ、治療処理のための効果的な物質 がないという事実に見出されている。 同様に、本発明は、ウイルス病を制御するための、治療的に活性であり、同時 に製薬的に適合する物質をさらに提供する技術的問題に基づくものである。 請求の範囲により詳細に記載されている実施の形態を提供することにより、こ の技術的問題が解決される。特に、本発明が、ウイルス誘発病を制御するための 製薬組成物の調製にチオール化合物を治療的に能動的に使用することであって、 ウイルスタンパク質中に存在するジスルフィド架橋をこのチオール化合物により 壊すことを特徴とするチオール化合物の使用を開示している点で、上記技術的問 題は解決されている。 「チオール化合物」という用語は、還元チオール基（ＳＨ基）の存在により特 徴付けられる化学的化合物、並びに細胞代謝の過程によりチオール化合物に転化 され得る化合物を意味するものとする。このようなチオール化合物の好ましい例 としては、システイン；システイン誘導体；メタンチオール、エタンチオールま たはメルカプトエタノールのようなメルカプトアルカノール；ジチオカルバメー ト；チオフェノール；および２−メルカプトエタンスルホン酸が挙げられる。Ｎ −アセチルホモシステイン、Ｎ−アセチルシステインエチルエステルまたはＮ， Ｓ−ジアセチルシステインエチルエステルのようなＮ−アセチルシステイン誘導 体が本発明によるシステイン誘導体の例として挙げられる。Ｎ−アセチルシステ イン（ＮＡＣ）およびＮ，Ｓ−ジアセチルシステインエチルエステル（ＤＡＣＥ Ｅ）並びにそれらの誘導体が特に好ましい。本発明により使用するチオール化合 物はまた、治療処理に通常使用される濃度範囲（ＮＡＣの場合、例えば、数週間 に亘り毎日600 ｍｇ）内において非毒性であることにより特徴付けられる。医学 分野において、ＮＡＣは、パラセタモール中毒の場合には、現在粘性溶解薬とし て用いられており、また実験的にＨＩＶ並びにヘルペス治療薬として用いられて いる（ロデラー等、Proc. Natl. Acad. Sci.87(1990)、4884-4888 、米国特許第 4,708,965 号）。本発明によるチオール化合物は、特に良好な適合性および軽い 副作用により特徴付けられる。このように、上記チオール化合物は、特に、現在 までウイルス治療に用いられているヌクレオシド類似体とは大きく異なっている 。 「ウイルス誘発病」という用語は、動物およびヒトの体の病気であって、ウイ ルスにより引き起こされるかまたは強められる病気を意味するものとする。本発 明によると、このようなウイルスの例としては、特に、ヘパドナウイルス科（he padnaviridae）、ワクシニアウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科 、アデノウイルス科、ポックスウイルス科、イリドウイルス科のようなＤＮＡウ イ ルス、または、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、フラ ビウイルス科、コロナウイルス科、ラプドウイルス科、フィロウイルス科（filo viridae）、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、バンヤウイルス 科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科（birnaviridae）の ようなＲＮＡウイルスが挙げられる。この定義の意味の範囲内において、ヘルペ スウイルスはＤＮＡウイルスとして見做されず、エイズウイルスはＲＮＡウイル スとは考えられない。本発明は好ましくは、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型またはデルタ型肝 炎ウイルスのような肝炎ウイルスにより引き起こされるウイルス誘発病を制御す るためにチオール化合物を使用することに関するものである。特に、ウイルス誘 発病は、慢性または急性のＢ型肝炎感染または肝細胞癌であってもよい。詳しく は、「ウイルス誘発病」という用語は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、「マーモッ ト肝炎ウイルス」（ＷＨＶ）、「ジリス肝炎ウイルス」（ＧＳＨＶ）、「樹上性 リス肝炎ウイルス」（ＴＳＨＶ）または「カモ肝炎ウイルス」（ＤＨＢＶ）のよ うなヘパドナウイルスにより引き起こされる疾病を意味するものとする。さらに 、本発明はまた、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）またはカリフラワーモザイ クウイルス（ＣａＭＶ）のようなウイルス性病原により引き起こされる植物病を 制御するためにチオール化合物を使用することも包含する。 「ウイルスタンパク質中に存在するジスルフィド架橋」という用語は、分子内 または分子間の共有結合によるウイルスタンパク質の機能および／または空間構 造に影響を与えるジスルフィド架橋を称する。同様に、本発明によるチオール化 合物の使用に関するウイルスタンパク質であって、少なくとも１つのウイルスタ ンパク質は少なくとも１つのシステイン残基を含む。好ましくは、ウイルスタン パク質は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓＡｇのようないくつかのシステイ ン残基を含む。一方で、ジスルフィド架橋がタンパク質の構造により安定化され ていることもよく知られている。このように、使用すべきチオール化合物の量は 、分子内または分子間のジスルフィド架橋の開裂に必要であり、それぞれのジス ルフィド架橋の接近可能性に依存する。 「ウイルスタンパク質」という用語は、ウイルスのＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡ ｇのようなタンパク質、好ましくは外皮タンパク質を意味するものとする。特に 、 この用語は、例えば、ＨＢｓＡｇのような表面抗原タンパク質を称する。 本発明によると、「ウイルスタンパク質」という用語には、外皮タンパク質の 前駆体タンパク質、すなわち、最終的なウイルス中には存在しないタンパク質も 含める。 さらに、本発明は、ウイルス誘発病を治療するための製薬組成物の調製にチオ ールを使用すること、チオール化合物により壊されるウイルスタンパク質中に存 在するジスルフィド架橋およびウイルスゲノムの複製に影響を与えないチオール 化合物に関するものである。 図面の簡単な説明： 第１図は、時間の関数としての様々なＮＡＣ濃度による処理後のＨｅｐＧ２− ４Ａ５細胞の細胞培養上澄中のウイルス抗原ＨＢｓＡｇの含有量、すなわち、ウ イルス表面抗原と市販の抗体との間の免疫学的相互作用により検出される量を示 す。 第２図は、時間の関数としての様々なＮＡＣ濃度による処理後のＨｅｐＧ２− ４Ａ５細胞の細胞培養上澄中のウイルス抗原ＨＢｅＡｇの含有量を示す。 第３ａ図および第３ｂ図は、追加に様々なＮＡＣ濃度と一緒にインキュベート したＨｅｐＧ２−４Ａ５細胞の細胞培養上澄中の無傷ＨＢＶウイルス粒子の含有 量、およびＨＢＶ粒子を産生しない細胞系統ＨｅｐＧ２の細胞上澄を対照として 示している（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５；Nature 282(1979)、615-616）。 第４図は、市販されているＨＢｓＡｇ陽性血清中のＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡ ｇの含有量を示し、この血清は、それぞれ、ＮＡＣ、システインおよびＤＡＣＥ Ｅの様々な濃度と一緒にインキュベートされている。 第５図は、ワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）に感染したＣＶ１細 胞の細胞培養単層中のプラーク数に基づく感染ワクシニアウイルス粒子の含有量 を示し、これらウイルスは感染の前に様々なＮＡＣ濃度と一緒に予めインキュベ ートされている。 本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明する。 実施例１： Ｂ型肝炎ウイルスの複製へのチオール化合物の影響 Ｂ型肝炎ウイルスの複製へのチオール化合物の影響を調べるために、安定にト ランスフェクションした、潜在的に感染性のＨＢＶ粒子産生細胞系統ＨｅｐＧ２ ２．２．１５（セルズ等、Proc. Natl. Acad. Sci. 84(1987) 、1005-1009） およびＨｅｐＧ２．４Ａ５（プラスミドｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶｎｅｏにより安 定にトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞系統（実施例４を参照））を使用 した。ＮＡＣ、システイン、システイン塩酸塩およびＤＡＣＥＥをチオール化合 物として用いた。シスチンを陰性対照として用いた。 表Ｉは上記化合物により細胞を処理した48時間後のＨｅｐＧ２−４Ａ５細胞系 統の細胞培養上澄のＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの含有量を示している。この点 に関して、未感染細胞のそれぞれのＨＢｓＡｇ含有量およびＨＢｅＡｇ含有量を 任意に１に設定し、上記化合物の抑制インデクスをそれに関して測定した。ちょ うど実施例２および３のように、それぞれ、市販のＨＢｓＡｇ酵素イムノアッセ イおよびＨＢｅＡｇ酵素イムノアッセイ（アボット研究所）により抗原を測定し た。 表Ｉに示す結果は、細胞系統ＨｅｐＧ２ ２．２．１５によるＮＡＣに関して と、ＨｅｐＧ２細胞（およびＨｕＨ７細胞、それぞれ）の一過性トランスフェク ション後の、複製競合ＨＢＶプラスミドｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶによるＮＡＣに 関して得られたものである。ｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶを実施例４に記載したよう に調製した。 細胞培養上澄中のＨＢｓＡｇが、ＮＡＣ処理細胞、システイン処理細胞および ＤＡＣＥＥ処理細胞の全てにおいて著しく減少したことが分かる。上記データの グラフを図４に示す。これらと比較して、対照化合物であるシスチンは、分泌性 （secretable）ウイルス抗原、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの含有量への影響を まったく示さなかった（データは示さない）。 さらに、細胞培養上澄中のウイルス抗原の含有量へのＮＡＣの供与量依存性の 抑制効果を、インキュベーション期間の関数として、それぞれ、上記ＨＢｓＡｇ 酵素イムノアッセイおよびＨＢｅＡｇ酵素イムノアッセイにより調査した（第１ 図および第２図）。これに関して使用したＮＡＣ濃度は、使用した細胞培養の細 胞への細胞毒性効果を示さない。図面に示すデータは、細胞培養上澄中の調査し たウイルス抗原の含有量に対して著しい供与量依存性の抑制効果を示す。 ＨｅｐＧ２−４Ａ５細胞系統の細胞培養上澄中の無傷ゆえ潜在的に感染性のウ イルス粒子の含有量はチオール化合物による細胞の処理後に減少することを示す ために、内因性ポリメラーゼ反応を行なった。この反応は、ウイルスカプシド中 に存在するウイルスポリメラーゼがin vitroで部分的に二重鎖のＨＢＶゲノムを 完全なものにできるという事実を立証する。放射性標識ヌクレオチドの添加およ び続いてのＨＢＶゲノム中への取込みにより、無傷の潜在的に感染性のウイルス 粒子が細胞培養上澄中に存在することを証明することができる。第３ａ図に示す 結果は、細胞培養上澄中の潜在的に感染性の無傷ウイルス粒子の含有量が、ＮＡ Ｃによる細胞の処理後に著しく減少することを明白に示している。 この結果を、第３ｂ図に示す別の実験においても確認した。この目的に関して 、様々なＮＡＣ濃度により処理した細胞系統ＨｅｐＧ２−４Ａ５の細胞培養上澄 中のウイルス粒子を、ＨＢｃＡｇ抗体（ハンブルグ、ダコーＧｍｂＨ）によるイ ムノプレシピテーションにより特異的に濃縮し、その後、外側の外皮を除去し、 次 いで内因性ポリマー反応を行なった。ここでも、ＮＡＣによる処理後に、細胞培 養上澄中のＢ型肝炎ウイルス粒子が著しく減少する。 実施例２： ＮＡＣ、システインおよびＤＡＣＥＥの作用様式に関して行なった 研究 ＮＡＣ、システインおよびＤＡＣＥＥそれぞれの作用の抗ウイルス機構がウイ ルスタンパク質中に存在するジスルフィド架橋の破壊に基づくか否かを調査する ために、表IIに示したＮＡＣ濃度と一緒にＨｅｐＧ２−４Ａ５細胞系統の細胞培 養上澄を一晩インキュベートし、次いで、市販の試験方法（アボット研究所）に よりＨＢｓＡｇ含有量を測定した。 同様に、市販のＨＢｓＡｇ陽性血清（アボット研究所）を表IIIに示すＮＡＣ 、システイン、ＤＡＣＥＥおよびシステイン塩酸塩と一緒に５分間に亘り予めイ ンキュベートし、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの含有量を上述した試験方法によ り測定した。 表IIおよびIIIは、それぞれ、ＮＡＣ、ＤＡＣＥＥおよびシステイン塩酸塩の 使用した濃度の関数としてのＨＢｓＡｇの著しい減少を示している。このデータ 全体から、ＮＡＣ、システイン、ＤＡＣＥＥおよびシステイン塩酸塩それぞれの 抗ウイルス効果はＢ型肝炎ウイルスのＨＢｓＡｇ複合体中のジスルフィド架橋の 減少に基づき、したがって、Ｂ型肝炎ウイルス外皮の構築が妨げられることが推 測できる。 実施例３： 急性感染患者のヒト血清のＨＢｓＡｇ含有量へのＮＡＣの影響 実施例２に示すin vitroのデータがヒト血清によっても再現できるか否かを調 査するために、感染の急性段階におけるＨＢＶ患者の血清試料をＮＡＣと一緒に その量を増加させながらインキュベートした。ここでも、in vitroの発見と同様 に、使用したＮＡＣ濃度の関数として、ＨＢｓＡｇ含有量が著しく減少した。 非常に大きいＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ力値を有する感染性の大きいヒト血 清により表IVに示す結果が得られたので、使用するＨＢｓＡｇ試験の線形範囲内 にとどめるために、試験前に試料を1:200に希釈した。この代表実験は、予め30 分間に亘りインキュベートした。 表IVは、（ＮＡＣと一緒の細胞培養上澄のインキュベーション後であるが、） ＨＢｓＡｇの含有量がヒト血清においても著しく減少することを示す。 実施例４： ｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶおよびｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶｎｅｏプラ スミドの調製 ｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶを調製するために、プラスミドｐＢＲＨＢａｄｒ４か ら起因するＨＢＶ部分（フジアマ等、NAR 11(1983)、4601-4610）を、ＢａｍＨ Ｉにより線状化したクローニングベクターｐＳＰＴ１９（ベーリンガーマンハイ ム、注文番号909815）中にクローニングした。同様に、プラスミドｐＳＰＴ１， ２ｘＨＢＶは、全長のＨＢＶゲノム（ＢａｍＨＩ断片）および追加に621 ｂｐの 末端重複部（ＢａｍＨＩ／Ｓｔｕ１断片）を含む。このように、プラスミドｐＳ ＰＴ１，２ｘＨＢＶは、3.5 ｋｂの長さを有するプレゲノミック（pregenomic） ＲＮＡを含み、ウイルス転写体（transcripts）の全てを生成するのに絶対的に 必要な最小部分を含む。このＨＢＶ部分は排他的に、自己プロモータの制御下に ある。 ｐＳＰＴ１，２ｘＨＢＶｎｅｏの調製に関して、単純ヘルペスＴＫプロモータ の制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子を追加にベクターｐＳＰＴ１，２ｘＨＢ Ｖ中にクローニングした（ｐＮＥＯのネオマイシン部分、ファーマシア、注文番 号27-4924-01）。この場合、ＨＢＶ部分へのＴＫプロモータの影響をできるだけ 少なく維持するためにＨＢＶ部分およびネオマシイン耐性部分３′−３′が互い に面するようなクローニング方法を選択した。 実施例５： ワクシニアウイルスの複製へのＮＡＣの影響 ワクシニアウイルスの複製に対するチオール化合物、例えば、ＮＡＣの影響を 調査するために、最初にワクシニアウイルスを３、10および30ｍＭのＮＡＣそれ ぞれと一緒に45分間に亘り予めインキュベートした。次いで、これらのウイルス をＣＶ１細胞（一般的に得られるサル腎培養細胞）と一緒にインキュベートし、 細胞に対するウイルスの吸着を可能にした。細胞を数回洗浄した後、細胞を軟寒 天により覆った。約48分間のインキュベーション後、溶解しなかった（non-lyze d）細胞をクリスタルバイオレットで染め、得られたプラークを数えた。処理し なかった対照のプラーク数を1.0に設定し、処理した細胞の抑制インデックスを それに関して求めた（表Ｖ参照）。 表Ｖは、ワクシニアウイルスの場合にも、ＮＡＣのようなチオール化合物によ り感染性ウイルス粒子が減少することを示している。この結果のグラフを第５図 に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ウイルス誘発病を治療する製薬組成物の調製へのチオール化合物の使用で あって、ウイルスタンパク質中に存在するジスルフィド架橋が前記チオール化合 物により壊されることを特徴とする使用。 ２． 前記ウイルスがＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであることを特徴と する請求の範囲第１項記載の使用。 ３． 前記ウイルスが肝炎ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項ま たは第２項記載の使用。 ４． 前記ウイルスがヘパドナウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１ 項または第２項記載の使用。 ５． 前記ウイルスがＢ型肝炎ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３ 項または第４項記載の使用。 ６． 前記ウイルスがデルタ肝炎ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第 ３項記載の使用。 ７． 前記ウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第 １項または第２項記載の使用。 ８． 前記ウイルスタンパク質が表面抗原タンパク質であることを特徴とする請 求の範囲第１項から第７項いずれか１項記載の使用。 ９． 前記ウイルス誘発病が慢性または急性Ｂ型肝炎感染もしくは肝細胞癌であ ることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項並びに第８項いずれか１項記載 の使用。 10． 前記チオール化合物がウイルスゲノムの複製に影響を与えないことを特徴 とする請求の範囲第１項から第９項いずれか１項記載の使用。 11． 前記チオール化合物がＮＡＣ、ＤＡＣＥＥまたはそれらの誘導体であるこ とを特徴とする請求の範囲第１項から第１０項いずれか１項記載の使用。