JPH09501051A - ヒトカルシウムチャネルα−１ＥサブユニットをコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サブタイプＥのヒトニューロンカルシウムチャネルα-１サブユニットをコードする単離されたDNAおよびその対応するポリペプチドが開示される。ヒトニューロンカルシウムチャネルα-１Ｅサブユニットを発現する細胞、およびそのような組成物を用いて、治療用化合物をスクリーニングする方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトカルシウムチャネルα-1EサブユニットをコードするDNA発明の分野 本発明は、ヒトカルシウムチャネル組成物に関する。より特定すれば、本発明 は、本明細書でサブタイプ「１Ｅ」と称されるヒトニューロンのカルシウムチャ ネルαサブユニットを含む組成物を含む。本発明の組成物は、サブユニットに対 するコード化配列、およびそのようなコード化配列を含み、そしてヒトニューロ ンα-1Eサブユニットを発現する細胞を含む。 発明の背景 多くの組織、特に興奮性組織において、電気依存性カルシウムチャネル(volta ge-gated calcium channel)が存在し、そこではそれらが、膜興奮性を制御する ために作用する。筋肉収縮およびシナプスの伝達としてのそれらの機能は、少な くとも部分的には、特異的な電気依存性カルシウムチャネルにより制御されてい る。これらのチャネルの特定のチャネルをブロックする、ジヒドロピリジン化合 物のような化合物が、高血圧、狭心症(angina)およびクモ膜下出血のような種々 の疾患の管理において治療的に用いられている。 電気依存性カルシウムチャネルは、一般に、それらの電気生理学的および薬理 学的性質に従って分類されている。現在、少なくとも４つのクラスの電気依存性 カルシウムチャネルが認められている：L-タイプ、T-タイプ、N-タイプ、および P-タイプである。しかし、分子クローン化技術により、これらのクラスのいくつ かでは、異なるサブタイプの存在が示されている。(Tsienら、Trends in Pharma cological Sciences 12：349-354をレビューのために参照のこと)。 一般に、電気依存性カルシウムチャネルは、少なくとも４つの異なるサブユニ ット：α-1サブユニット、α-２サブユニット、βサブユニットおよびγサブユ ニットからなることが示されている。恐らく最も特徴付けられているL-タイプカ ルシウムチャネルについては、α-１サブユニットがジヒドロピリジンリガンド に対する結合部位を含むことが示されている。 ラットニューロンのカルシウムチャネルα-１サブユニットの、ラット脳クラ スＡ、Ｂ、ＣおよびＤと称される、いくつかの異なるサブタイプの部分をコード する部分cDNAクローンが、最初、ラット脳cDNAライブラリーから単離された(Snu tchら、1990)。Horpoldらにより、ヒトにおいて同種(homologous)のα-１クロー ンサブタイプＡ-Ｄが記載されている(PCT/US92/06903；WO93/04083)。 本発明は、本明細書で「１Ｅ」またはｈα-１Ｅと称される、第５番目のヒト ニューロンカルシウムチャネルα-１サブユニットに関する。このサブユニット は、他のヒトα-１サブユニットクローンとはかなり異なり、他のヒトニューロ ンα-１サブユニットに対して約62％の推定アミノ酸配列相同性を有するに過ぎ ない。本明細書に示されるように、このサブユニットは、α-２サブユニットお よびβサブユニットと共に異種のカルシウムチャネルを形成し得る。新しいチャ ネルは、特有の薬理学を有し、そしてそれ故、カルシウムチャネル改変で、新し いより選択的な治療薬剤をスクリーニングで有用である。発明の要旨 １つの局面において、本発明は、ヒトニューロンのカルシウムチャネルのα-1 Eサブユニットをコードする単離されたDNAフラグメントを含む。このフラグメン トは、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を有する。 本発明にはまた、配列番号２として示される配列を有する、ヒトニューロンの カルシウムチャネルのα-1Eポリペプチドサブユニットが含まれる。別の局面に おいて、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む哺乳動物発現ベクター を含む。 本発明による真核生物細胞は、配列番号１として示される配列を有する異質DN Aを含む。この細胞は、配列番号２の配列を有するポリペプチドサブユニットを 含むニューロンのカルシウムチャネルを発現する。この細胞は、ニューロンのカ ルシウムチャネルサブユニットα₂およびβを発現するためにさらに設計され得 る。 この細胞株は、ニューロン細胞によるカルシウムの取り込みを阻害するために 有効な化合物をスクリーニングするために使用され得る。 本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明 を、添付の図面とともに読めば、より十分に認識される。図面の簡単な説明 図１は、ヒトニューロンのカルシウムチャネルαサブユニットhα-1EのDNA配 列(配列番号１)、およびこのチャネルサブユニットについての推定されるアミノ 酸配列(配列番号２)を示す；そして 図２は、ヒトニューロンのカルシウムチャネルαサブユニットhα-1Eを含む異 種のカルシウムチャネルを発現する真核生物細胞で測定されたバリウム電流の追 跡を示す。発明の詳細な説明 Ｉ．定義 特に示されていなければ、本明細書で用いられるすべての用語は、それらが本 発明の技術分野の当業者に示すと同一の意味を有する。実行者は、特に、当該技 術分野の定義および用語について、Current Protocols in Molecular Biology(A usubel)を参照のこと。 用語「異質DNA」および「異質RNA」とは、それらが存在する細胞またはゲノム の部分にとって内因性でないヌクレオチドをいう；一般に、そのようなヌクレオ チドは、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポーレ ーションなどにより、細胞に添加される。そのようなヌクレオチドは、一般に、 少なくとも１つのコード化配列を含むが、このコード化配列は発現される必要は ない。 用語「発現ベクター」は、外来細胞において異質DNAフラグメントを取り込み および発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核生物および真核生物発 現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範 囲内である。 II．ヒトニューロンα-1EサブユニットのDNAコード化配列の単離 組織間および組織内、ならびに種にわたる、電気依存性カルシウムチャネルの 多様性は、異なる電気生理学的および薬理学的特徴を有する新しいチャネルが報 告されるにつれ、より明らかになりつつある。本発明は、ヒト脳から単離された 新しいカルシウムチャネルを記載する。本明細書で報告されるように、このチャ ネルは、電気依存性カルシウムチャネルのαサブユニットとして分類される。本 明細書で報告される新規なヒトチャネルは、ラット脳由来のカルシウムチャネル αサブユニットＡ-Ｄに対するSnutchにより定義された命名法に従って、ヒトα- 1Eサブユニット、またはhα-1Eと称される。 完全hα-1Eコード化配列を特徴付けるために、多くの重複する部分的cDNAクロ ーンが、ヒト海馬(hippocampal)ライブラリーから単離された。完全hα-1Eヌク レオチド(nt)配列を、配列番号１として図１に示す。また、配列番号２として推 定アミノ酸配列(nt配列の下に示される単一の文字コード)を示す。４つの部分cD NAクローンのリストを、α1E配列を特徴付けるために使用し、そして完全長hα- 1E配列(配列番号１)に対する各クローンのヌクレオチド位置を以下の表１に示す 。 各部分的クローンの単離および特徴付けは、以下に記載されそして実施例１に 詳述されている。開始メチオニンに対するコドンはnt107で始まり、そしてnt691 2はオープンリーディングフレームの終わりを示す。最初の107および最後の10ヌ クレオチド(nt)は、それぞれ、５'および３'非翻訳領域を示す。 Ａ．ヒトカルシウムチャネルのライブラリーのスクリーニング ハイブリダイゼーションスクリーニングのための合成のオリゴヌクレオチドプ ローブを自動オリゴヌクレオチド合成機(Applied Biosystems，Foster City，CA )を用いて調製した。完全hα-1E配列を形成するためのクローンを得るために、 他のカルシウムチャネルに基づくオリゴヌクレオチドプローブを、実施例１に記 載のように構築した。プローブは、SnutchおよびDubelにより記載されるような ラットカルシウムチャネルの配列を基に構築した。これらのサブユニットは、ラ ットニューロンのカルシウムチャネルのα-１サブユニットである。それらは、 最終的に構築されたhα-1Eクローンと、約62％のアミノ酸配列同一性のみを示す 。さらなるプローブは、部分的クローンＨ６の制限フラグメントであった。 ヒト海馬ライブラリーを、市販供給者(Stratagene，La Jolla，CA)から得た。 あるいは、hα-1Eチャネルのスプライス改変体のような改変体を同定するために 、海馬または他の異なる脳領域、もしくは全脳からの脳ライブラリーを、当該技 術分野で既知の標準方法(Ausubel)に従って生成し得る。そのような方法は、RNA を抽出するために目的の領域を含む細胞を溶解することを含む。ポリＡ＋RNAを 次いで単離し、そして一本鎖cDNAを合成するために用いる。一本鎖cDNAから、特 定のまたはランダムなヘキサデオキシヌクレオチドプライマー(Clontech，Palo Al to，CA)のようなヘキサマープライマーを用いて二本鎖cDNAが生成される。 次いで、制限酵素アダプター領域が、標準法(Sambrook)に従って、一本鎖cDNA に連結される。そのようなcDNAを、次いでアガロースゲルクロマトグラフィーに より精製し、そしてサイズ選択される。このcDNAを次いで溶出し、そして本明細 書で報告される実施例で用いられるような、λgtllベクターまたはλZAPベクタ ーのような選択されたベクター配列に連結される。ベクターを次いで適切なファ ージ宿主中にパッケージ化し、そして当該技術分野に公知の方法に従って、E.co li のような細菌宿主を感染するために用いる。 上記のようなファージ-cDNAライブラリーのような、市販または注文で生成し たライブラリーは、実施例１に記載のような、標準条件、および媒体ストリンジ ェンシー(Ausubel)下でオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを 用いてスクリーニングされる。簡単に述べれば、オリゴヌクレオチドハイブリダ イゼーションプローブは、ランダムプライム法(Sambrook)により放射標識され、 次いで、cDNAライブラリーからの固定化DNAにハイブリダイズされる。このプロ ーブとハイプリダイゼーションを示すファージプラークを選択し、サブクローン 化し、そして再試験する。ポジティブクローンはオートラジオグラフィーにより 同定される。上記の方法に従って同定されたクローンは、ライブラリーの生成に 用いたcDNAのサイズ選択、および他の種由来のカルシウムチャネルからのデータ に基づくカルシウムチャネルαサブユニットの推定サイズに起因して、部分的な 配列クローンであることが期待される。 上記のように同定されおよび単離されたクローンは、DNA抽出および二本鎖プ ラスミドcDNAの生産の前にプラーク精製される。次いで、市販のDNAシークエン サー(Applied Biosystems，Foster City，CA)を用いるような標準方法により、 プラスミドcDNAの配列が決定される。上記で注記したような、４つの部分的クロ ーンＨ６、Ｈ24、１２、および３-69Ａを、hα-1Eの完全長配列を決定するため に用いた。得られた異なるクローン間の重複する領域を、配列の比較により決定 した。 あるいは、これらの配列は、例えば、基質として部分的に精製された全細胞RN Aを用いて、第１鎖DNA合成反応における特異的配列プライマーとして有用な部分 クローンの末端終結配列により提供される(Maniatisら；Scharfら)。cDNAの第２ 鎖の合成は、ランダムに開始される(primed)(Boehringer Mannheim，Indianapol is IN)。上記の手法は、任意の部分的クローン配列に隣接している核酸領域に対 応しているcDNA分子を同定または生産する。これらの新規に単離された配列は、 次に、さらに隣接する配列などを同定するために用いられ、重複cDNAクローンを 同定し得、そこから完全hα-1E配列が決定され得る。上記、および実施例１に詳 述される一般的方法を用いて、完全長hα-1Eコード化配列の配列が決定される。 完全長hα-1Eクローンは、部分的に重複するクローンから構築され、実施例２に 詳述される。 Ｂ．完全長hα-1Eクローンの構築 表１および図１を参照して、上記のように単離された、α1EcDNAクローンＨ24 、Ｈ６、Ｉ２および３-69Ａが、全α1Eオープンリーディングフレーム、nt107〜 6912(配列番号１)をコードするヌクレオチド配列を重複しそして含むことが観察 され得る。これらの部分的cDNAクローンの制限フラグメントは、一緒に連結され て、真核生物発現ベクター(pcDNA III- Invitrogen)中の完全長α1E cDNAを生成 した。得られた構築物をNX-HE1と名付けた。 本明細書でNX-HE1と呼ばれ、そして配列番号１として同定されるhα-1Eの構築 は、実施例２で詳細に記載されるような複数工程により成し遂げられた。簡単に 述べれば、Ｈ24クローン(配列番号３)を、BSポリリンカー内で、BS XhoI部位が コード化領域に対して５'側にあり、構築物１を形成するような、適切な向きを 得るために、Bluescript SK＋(「BS」)(Stratagene，San Diego，CA)中に再クロ ーン化した。構築物１からのXhoIフラグメントを、次いで、真核生物発現ベクタ ーpcDNA III(Invitrogen，San Diego，CA)中に連結し、構築物２を形成した。ク ローンＨ６(配列番号４)からのXhoI/ApaIフラグメントを、次いで、構築物２中 に連結し、構築物３を形成した。残りの３'末端を以下のように別に構築した。 クローン３-69ＡからのSfil/BamHIフラグメントをクローン12中(配列番号５)に 連結し、構築物４を形成した。最後に、構築物４のApaIフラグメントを構築物３ 中に連結し、完全長クローン配列番号１を形成した。完全長配列を含むこの連結 産物は、NX-HE1と名付けられた。 III．細胞中におけるhα-1Eの異質発現 哺乳動物生理学における電気依存性カルシウムチャネルの多様性および重要性 が与えられれば、hα-1Eサブタイプカルシウムチャネルのような選択されたチャ ネルサブタイプを一時的または構成的に発現する細胞の所有により、医療分野、 特に、診断および/または薬剤スクリーニングの領域における用途が見い出され ることが認識され得る。これらの領域における例示のアッセイは、セクションV で記載される。 カルシウム電流の機能的発現が、本明細書で記載される発明の実行部分で特に 有用であることが認識され得る。しかし、特定の異質DNA配列の発現は、ノザー ンブロットアッセイのような非機能的なアッセイ、および免疫検出のようなタン パク質発現アッセイを用いてある程度の有利な立場でモニターされ得る。本発明 は、そのような方法で使用するためのツールを提供し、オリゴヌクレオチドプロ ーブ、免疫検出アッセイで使用するための抗体産生のためのタンパク質およびペ プチドを含む。 Ａ．異種hα-1EサブユニットをコードするDNAを含む組換え真核生物細胞の調 製 hα-1EカルシウムチャネルサブユニットをコードするDNAは、このDNAの発現の ために宿主細胞中に導入され得る。このようなDNAの細胞への導入方法は当業者 に公知である(Ausubel，Sambrook)。そのような方法は、例えば、本明細書のセ クションIIで記載されるベクター、または機能的カルシウムチャネルを形成する ための当該技術分野で公知のα-１、α-２、β、およびγサブユニット(William s)から選択される、異なるカルシウムチャネルサブユニットをそれぞれ含むプラ スミドベクターの組み合わせ(それぞれが１つ以上の異なる遺伝子をコードする) のような、適切な発現プラスミドベクターまたは直鎖状DNAを用いる真核生物細 胞のトランスフェクションを含み、そしてトランスフェクトされた細胞の選択も また、当該技術分野で周知である(Sambrookら、1989)。 本明細書で記載される、hα-1E DNA配列の配列番号１のような、ヒトカルシウ ムチャネルのα-1Eサブユニットをコードするクローン化完全長DNAは、真核生物 細胞中での発現のためにプラスミドベクター中に導入された。宿主細胞はまた、 標準方法に従って直鎖状DNAを用いてトランスフェクトされ得る。 本発明の実施は、酵母細胞を含む多くの哺乳動物発現系の任意の発現系を用い て効果的に行われ得る。しかし、哺乳動物発現系が本発明の特定の局面を実行す るために好適であり得る。 異種hα-1Eカルシウムチャネルサブユニットの導入に適切な真核生物細胞は、 そのようなDNAまたはRNAによりトランスフェクトされ得る、あるいはそのような DNAが注入され得る任意の細胞を含む。好ましい宿主細胞は、異種DNAおよびRNA もまた発現し得る宿主細胞である。本発明の特定の局面を実施するために、電気 生理学的測定のような測定がセクションIVで記載され、宿主細胞が、本明細書で 記載されるヒトα-１カルシウムチャネルサブユニットによって示される電流特 性と類似の電流特性を有する、内因性の機能的に発現する電気依存性カルシウム チャネルを欠いていることが好適であり得ることが認識される。そのような場合 、外来の添加されたα-1Eサブユニットの機能的発現を観察および測定するため に、細胞中に、α-２をコードする異種コード化配列、および恐らくβカルシウ ムチャネルサブユニットを導入することが必要であり得る。上記のように、その ような補助的なサブユニットのコード化配列は公開されており、そして細胞への 導入に適切なベクター内での発現は、当業者に周知である。 さらに、DNAを導入する好適な細胞は、一時的にまたは安定にトランスフェク トされた細胞を含み、そして限定されないが、COS細胞、マウス１細胞、チャイ ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞、アフリカミドリザル 細胞などの哺乳動物起源の細胞を含む。好適な細胞は、DG44およびHEK293細胞、 特に、懸濁液中の成長に適合されているHEK293細胞を含む。さらに、アフリカツ されるように、本発明の実施で用途を見い出している。さらに、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastorisのような酵母細胞が本発明の実施において利 用され得る。 hα-1Eカルシウムチャネルサブユニットのようなヒトα-1Eサブユニットをコ ードする異種DNAは、DNA配列の配列番号１のような、このサブユニットをコード するDNA配列を含むベクターを用いたトランスフェクションのような、当業者に 公知の任意の方法により導入され得る。哺乳動物細胞のトランスフェクションに 特に好適なベクターは、SV40初期プロモーター、マウスdhfr遺伝子、SV40ポリア デニル化およびスプライシング部位ならびに細菌中でこのベクターの維持に必要 な配列を含むpSV2dhfr発現ベクター、pCMVまたはpCDNA1またはPcDNA３(Invitrog en)のようなサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを基礎にしたベクター、お よびMMTVプロモーターを基礎にしたベクターである。ヒトカルシウムチャネルサ ブユニットhα-1EをコードするDNAは、その発現がCMVプロモーターにより制御さ れるように、ベクターpcDNA３中に挿入されている。そのような構築物は、COS細 胞およびHEK293細胞を含む多くの哺乳動物細胞をトランスフェクトするために適 切である。他の適切なベクターおよび細胞標的は、限定されないが、pCMVおよび pREPベクター(Invitrogen，San Diego，CA)を含む。 安定にまたは一時的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、当該技術分野 で周知の方法により調製され得る。細胞は、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レ ダクターゼなどのような選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターによりトラン スフェクトされる。細胞の安定なトランスフェクションは、トランスフェクト細 胞を、マーカー遺伝子を発現する細胞の成長を促進する条件下で増殖させること により首尾良く達成され得る。 ヒトα-1Eカルシウムチャネルサブユニットをコードする異種DNAは、細胞の染 色体物質中に組み込まれ得、またはエピソーム要素として細胞中に維持され得る 。このような異種DNAを含む細胞は、細胞タイプに適切なおよび当該技術分野で 公知の方法に従って培養および/または継代培養され得る。 Ｂ．アフリカツメガエルにおけるhα-1Eの機能的発現 pBluescript SK＋プラスミドのような、完全長のNX-HE1コード化配列を含むプ ラスミドを、Ｔ７またはSP６ポリメラーゼのような適切なRNAポリメラーゼを用 いて、相補的RNAを生成するために使用した。このようなRNAを、当該技術分野で 公知の方法に従って、アフリカツメガエル由来の卵に注入する(約５〜10pg/卵) 。卵中で機能的なカルシウムチャネルの発現のために、ウサギ骨格筋α-２サブ ユニット(Moriら、本明細書に参考として援用される)のようなカルシウムチャネ ルα-２サブユニットの同時発現が必要である。さらに、ウサギ心臓からのβ-３ サブユニット(Hulinら、本明細書に参考として援用される)のようなカルシウム チャネルβサブユニットを含むことにより、このチャネルの機能的発現の最適化 を助ける。前述のα-２およびβ-３サブユニットに対するコード化配列は、上記 で引用されたように公開されており、そして卵中への注入に適切な発現ベクター の構築は、当業者に公知である。卵における発現のため、各卵中にほぼ等モル量 のRNAが注入される。 Ｃ．哺乳動物細胞におけるhα-1Eの機能的発現 一時的または安定トランスフェクションに特に扱い易い１つの細胞タイプは、 ヒト胎児腎臓細胞株HEK293(ATCC受託番号CRL1573)である。このような細胞は、h α-1EサブユニットcDNA発現プラスミド、および１つまたはそれ以上のα₂カルシ ウムチャネルサブユニットcDNA発現プラスミド、実施例４に詳述されるようなβ₁ サブユニットcDNA発現プラスミド(Williams)で一時的に同時トランスフェクト され得る。 安定なトランスフェクションはまた、標準方法(Ausubel)に従って、HEK293細 胞中で達成され得る。安定なトランスフェクションに適切なベクターは、pcDNA1 およびpcDNA3を含む。 トランスフェクトされた細胞は、例えば、当該技術分野で公知の方法に従って 、制限培地中の鑑別成長により選択される。そのような細胞は、サブクローン化 され、そしてヒトα-1Eカルシウムチャネルの発現の証拠として、ノザーンブロ ット分析より試験される。あるいは、またはさらに、個々のトランスフェクトさ れた細胞は、(セクションIVに記載されるように、キャリアとしてバリウムを用 いて)電圧活性化カルシウム電流の存在について電気生理学的に分析され得る。 そのような細胞は、セクションVで記載されるような、機能的および/または結合 アッセイにおいて有用である。 IV．電気生理学的測定 Ａ．アフリカツメガエル卵におけるカルシウム電流の記録 異種hα-1Eカルシウムチャネルサブユニットの機能的発現は、セクションIII に記載されるように、異種RNAで注入されたアフリカツメガエル卵中で測定され 得る。電流は、増幅システムに接続された標準の２つの微小電極電圧クランプを 用いて簡便に記録される。細胞を、約40mMのBa(OH)₂を含み、バリウムがこの系 で電流キャリアとして作用するように、クロライドのない浴溶液中に置く。チャ ネルを電圧パルスの周期的送達により活性化する。電流を測定し、そして電気生 理学に関係する技術分野でよく使われる手順に従って更正する。 V．有用性 本発明は、カルシウムチャネルの活性を調節する、カルシウムチャネルアゴニ ストおよびアンタゴニストのような治療用化合物を同定する方法を包含する。こ のようなアッセイは、カルシウムチャネルアゴニストおよび/またはアンタゴニ スト活性を有する新規治療用化合物をスクリーニングするために有用である。現 在、L-タイプのカルシウムチャネルに向けのカルシウムチャネルアンタゴニスト は、高血圧、クモ膜下出血および種々の形態の狭心症の治療に使用できるように なっている。ある種のN-タイプカルシウムチャネルアンタゴニストは、本明細書 に参考として援用される共同所有の米国特許第4,051,403号および第5,189,020号 に記載されるように、大脳虚血を低減するために有用であることが見い出されて いる。 本発明によれば、本明細書で記載されるように、異種DNAによりコードされる 異種hα-1Eカルシウムチャネルサブユニットを発現する真核生物細胞は、hα-1E サブタイプ特異的化合物をスクリーニングするために、そしてそのような化合物 の相対能力を予想するために有用である。 特に、そのようなhα-1Eサブタイプの異種カルシウムチャネルを発現する細胞 は、全細胞またはその膜が試験化合物に結合する能力について、一般に、試験化 合物がチャネルの既知のリガンドを置き換える試験化合物の能力を測定すること により試験される結合アッセイにおいて使用され得る。チャネルに結合し、そし てhα-1Eカルシウム電流をブロックする１つの適切な機能的リガンドは、クモ毒 Aga-IIIＡである(本明細書に参考により援用されるMintzらにより記載されたよ うに単離した)。 そのようなスクリーニングアッセイを実施するための方法は、当該技術分野で 周知であり、そしてそのようなアッセイのセットアップは、当業者の技術範囲内 にある。本明細書に参考として援用される共同所有の特許された米国特許出願第 07/855,269号は、特定のタイプのN-タイプのカルシウムチャネルアンタゴニスト をスクリーニングするために、単離されたニューロンのカルシウムチャネルを利 用するアッセイを記載する。そのような方法は、本発明に適用可能である。 あるいは、またはさらに、そのようなスクリーニングアッセイは、発現される カルシウムチャネルの機能的活性が測定されるアッセイを含み得る。そのような アッセイにおいて、カルシウム電流のような、そのような活性を改変する薬剤が 、上記で示唆されたまたは別のタイプのカルシウムチャネルを基礎にした治療薬 の候補である。 以下の実施例は、本発明を例示するが、いかなる方法においても本発明を限定 する意図はない。 材料および方法 λ-ZAP cDNAヒト海馬cDNAライブラリーを、Stratagene(La Jolla，CA)から得 た。真核生物発現ベクターpcDNA IIIをInvitrogen(San Deigo CA)から得た。T4D NAリガーゼおよびT4 DNAポリメラーゼを、New England Biolabs(Beverly，MA)か ら得た；ニトロセルロースフィルターは、Sch1eicher and Schuell(Keene，NH) から得た。 Bluescript SK＋(BS)はStratagene(San Diego，CA)から得た。 脱リン酸化子ウシ腸ホスファターゼ(CIP)は、Now England Biolabs(Beverly,M A)から得た。 合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーは、Applid Biosystems(Fo ster City，CA)から得られるような市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用 いて調製した。あるいは、注文設計した合成オリゴヌクレオチドは、例えば、Sy nthetic Genetics(San Diego，CA)から購入され得る。cDNA合成キットおよびラ ンダムプライミング標識キットは、Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB，Ind ianapolis，IN)から得た。 標準の分子生物学およびクローニング手法は、実質的に、Ausubelら、Sambroo kら、およびManiatisらに先に記載のように実施した。 実施例１ 部分的cDNAクローンの単離 Ａ．クローンＨ６ λ-ZAP II(Stratagene，La Jolla，CA)ヒト海馬cDNAライブラリーの百万の組 換え体を、ラットクラスＢα1サブユニットcDNAの２つの放射標識した1.6kb(Hin d IIIおよびXho I消化)フラグメントを用いて、２回、150mmプレートあたり50,0 00プラークの密度でスクリーニングした(ラットクラスＢα1サブユニットについ ては、本明細書に参考として援用されるDubelら(1992)Proc．Natl．Acad．Sci.8 9：5058-5062を参照）： ハイブリダイゼーションを、標準条件(５×SSPE、５×デンハート液、0.1％SD S、１mg/mlサケ精子DNA；処方箋はSambrookら(1989)Molecular Cloning，A Labo ratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中に見い出される)で行 った。フィルターを、中程度のストリンジェンシー条件(0.2×SSPE、0.1 SDS、5 0℃)で洗浄した。Ｈ６は、単離された２つのクラスＥ特異的クローンのうちの１ つであった。標準方法(Sambrookら(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Ma nnual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)を用いてＨ６バクテリオファー ジをプラーク精製し、二本鎖BSプラスミドcDNAを、標準プラスミド(phagemid)レ スキュー手順(Stratagene)用いて単離し、そしてPCRを基礎にした蛍光色素ター ミネーター手順(Applied Biosystems)を用いてDNA配列を得た。 Ｂ．クローンＨ24 λ-ZAP II(Stratagene)ヒト海馬cDNAライブラリーの百万の組換え体を、ラッ トクラスＢα1サブユニットcDNAの放射標識したNotI/EcoRIフラグメント(ヌクレ オチド118〜705)を用いて、２回、150mmプレートあたり50,000プラークの密度で スクリーニングした(ラットクラスＢα1サブユニットについては本明細書に参考 として援用されるDubelら(1992)Proc．Natl．Acad．Sci．89：5058-5062を参照) 。ハイブリダイゼーションは標準条件で行った。フィルターを中程度のストリン ジェンシーで行った。Ｈ24は、スクリーニングで単離された５つのポジティブク ローンのうちの１つであった(そのうちの４つはクラスＥのクローンであった)。 H24バクテリオファージをプラーク精製し、二本鎖プラスミドcDNAを調製し、そ してクローンをDNA配列決定により特徴付けした。 Ｃ．クローンＩ２ λ-ZAP II(Stratagene)ヒト海馬cDNAライブラリーの百万の組換え体を、cDNA フラグメントＨ６からの放射標識したPstl/Apalフラグメント(ヌクレオチド4194 〜4740)を用いて、２回、150mmプレートあたり50,000プラークの密度でスクリー ニングした。ハイブリダイゼーションは標準条件で行った。フィルターを中程度 のストリンジェンシーで行った。Ｉ２は、スクリーニングで単離された13のポジ ティブクローンのうちの１つであった。Ｉ２バクテリオファージをプラーク精製 し、二本鎖プラスミドcDNAを調製し、そしてクローンをDNA配列決定により特徴 付けした。 Ｄ．クローン３-69Ａ λ-ZAP II(Stratagene)ヒト海馬cDNAライブラリーの百万の組換え体を、ラッ トニューロンαサブユニットcDNA由来の放射標識したDNAオリゴヌクレオチドプ ローブを用いて、２回、150mmプレートあたり50,000プラークの密度でスクリー ニングした。ハイブリダイゼーションは標準条件で行った。フィルターを中程度 のストリンジェンシーで行った。３-69Ａは、スクリーニングで単離された37の ポジティブクローンのうちの１つであった。３-69Ａバクテリオファージをプラ ーク精製し、二本鎖プラスミドcDNAを調製し、そしてクローンをDNA配列決定に より特徴付けした。 実施例２ 完全長ヒトα1EcDNAの構築 hα-1EcDNAクローンＨ24、Ｈ６、１２、および３-69Ａは、全hα-1Eオープン リーディングフレーム、nt107〜6912(配列番号１)をコードするヌクレオチド配 列を重複しそして含む。これらの部分的cDNAクローンの制限フラグメントを一緒 に連結し、真核生物発現ベクター(pcDNA III-Invitrogen)中で完全長hα-1EcDNA を生成した。得られる構築物を、NX-HE1と名付けた。NX-HE1の構築は、以下に詳 細に記載されるように、複数工程で実施した：１)Bluescript SK＋(BS)中へH24 を再クローニングして適切な向きを得る(構築物１)、２)構築物１からのXhoIフ ラグメント(nt 1〜1374)のpcDNAIII中への連結(構築物２を形成するため)、３) Ｈ６(nt 1374〜4181)からのXhoI/ApaIフラグメントの構築物２中への連結(構築 物３を形成するため)、４)３-69Ａ(nt 5884〜３'非翻訳)からのSfiI/BamHIフラ グメントの１２中への連結(構築物４を形成するため)、および５)ApaIフラグメ ントの連結(nt 4181〜３'非翻訳を構築物３中に、完全長クローン配列番号１を 形成する)。 １)構築物１を得るために、Ｈ24をEcoRIで消化し、そしてEcoRI消化BS中に再 連結した。この連結の目的は、BSポリリンカー内の当初のＨ24クローンを、BSの XhoI部位がコード化領域に対して５'側となるように再配向させることであった 。 ２)構築物２をXhoIで消化し、そして得られる1.4 kbフラグメントをアガロー スゲルから精製し、そして子ウシ腸ホスファターゼ(CIP)で脱リン酸化したXhoI 消化pcDNAIII中に連結した。この構築物は、従って、このクローン(nt 1〜1374) の５'末端を含んでいた。 ３)Ｈ６を、次いで、XhoIおよびApaIで消化し、そして得られる2.8Kbフラグメ ント(nt1374〜4181)を、XhoI/ApaI消化およびCIP処理構築物２中に連結した。連 結構築物を構築物３と称した。 ４)残りの３'末端は別に構築した。まず、３-69ＡをSfiIおよびBamHIで消化し 、2.7 kbフラグメント(nt5884〜３'非翻訳)を生成し、それをゲル精製し、そし てS fiI/BamHI消化およびCIP処理12中に連結した。連結構築物を構築物４と称した。 (すべての連結接続部は、次の工程に進む前に配列決定した)。 ５)最終構築物は、構築物４をApaIで消化することにより調製し、4.1 kbフラ グメント(nt 4182〜３'非翻訳)を生じ、それはゲル精製され、そしてApaI切断CI P処理構築物３中に連結した。完全長配列を含むこの連結産物は、NX-HE1と名付 けられた。 実施例３ アフリカツメガエル卵におけるhα-1Eの機能的発現 hα-1E完全長DNA配列の配列番号１を、pBluescript SK＋中に再クローン化し 、プラスミドphα-1E(SK＋)を得た。相補的RNAをＴ７またはSP６ポリメラーゼを 用いてインビトロでプラスミドから合成した。さらに、相補的RNAは、当該技術 分野で公知のカルシウムチャネルα-２サブユニットおよびβサブユニットを(Mo ri、Williams、Tanabe)含むプラスミドから合成される。各サブユニットからのR NAを、0.1μg ml^-1α₁、0.1μg ml^-1α₂、および0.03μg ml^-1βを用いて等モル 比で注入した；細胞あたり約50nlを注入する。hα-1E電流を、Warner増幅器(OC- 725A)を用いる標準の２つの微小電極電圧クランプにより、Ba(OH)₂、５mM；テト ラエチルアンモニウム-OH、40mM；KOH、２mM；HEPES、５mMを含有し、メタンス ルホン酸でpH 7.4に調整したクロライドのない浴溶液中で記録した。データは、 10kHzで採取し、そして２kHzでフィルターにかけた。リークおよびキャパシタン ス電流を、P/4プロトコールによりオフラインで引き算した。電圧パルスは、15 秒毎に送達した。定常状態不活性化実験には、電圧パルスは20秒毎に送達した。 ピーク更正電流を、Hodgkin-Huxley不活性化曲線に適合させた。図２は、ヒトカ ルシウムチャネルサブユニットhα-1E(配列番号２)をコードするmRNAならびにα -２およびβサブユニットをコードするRNAを、上記のように、先に注入したアフ リカツメガエル卵で測定されたバリウム電流の追跡を示す。電流は、保持電位-8 0mVから試験電位０mVに発動された。 クモ毒素AgaIIIＡは、50nMの回分濃度で、この電流をプロックするために有効 であった。他のカルシウムチャネルブロック性化合物は、この電流をブロックす ることが出来ず、そして試験した最大濃度は、以下の通りである：ωコノトキシ ン(conotoxin)類 MVIIA(５μM)、MVIIC(５μM)、TVIA(５μM)、Aga IVA(100nM) およびデヒドロピリジン類。 実施例４ 哺乳動物細胞におけるhα-1Eの発現 ヒト胎児腎臓細胞(HEK 293細胞)を、一時的および安定に、カルシウムチャネ ルサブユニットをコードするヒトニューロンのDNAを用いてトランスフェクトし た。 Ａ．HEK 293細胞のトランスフェクション ヒトニューロンのカルシウムチャネルhα-1E、ラットα₂およびβ₁サブユニッ トをコードするDNAを含む別々の発現ベクターを用いた。実施例２に記載のよう に構築した。本明細書に配列番号１として記載されるhα-1Eコード化配列を、上 記のように、pcDNA1+3ベクター中に、確立された方法に従って、モニターするた めにhα-1Eコード化配列の５'末端上にc-mycエピトープタグを添加して導入した 。ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション手順(Ausubel)を用いるH EK293細胞の安定トランスフェクションに用いられた。約２百万のHEK 293細胞を 含む培養プレートを、５μgの各ベクターを含む、１MlのDNA/リン酸カルシウム 沈殿物でトランスフェクトした。500μgのG418を含む培地中で10〜20日間の成長 の後、コロニーが形成され、そして標準方法に従って分離した。 細胞によるhα-1Eの発現は、蛍光免疫標識によりモニターした。細胞を、c-my cエピトープ(それに対するコード化配列が、hα-1Eコード化配列の５'末端に添 加されている)に対する蛍光的にタグをつけた抗体(市販供給源由来)とともにイ ンキュベートした。エピトープを有するhα-1Eサブユニットの発現は、免疫蛍光 により証明される。 本発明を、特定の方法および実施態様を参照して記載してきたが、種々の改変 および変形が本発明を逸脱することなくなされ得ることが認識される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コング， ルース アメリカ合衆国 カリフォルニア 94606, オークランド，パーク ブールバード 2300 (72)発明者 ハシモト， チカ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロ パーク，バークレイ アベニュ ー 1027 (72)発明者 パルマ， アンドリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94583, サン ラモン，サドル クリーク コー ト 501 (72)発明者 フィリップ， モハン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061, レッドウッド シティ，ニューキャッスル コート 204 (72)発明者 ゾウ， メイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロ パーク，サン アントニオ ス トリート 1466， アパートメント ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトニューロンのカルシウムチャネルのα-1Eサブユニットをコードする ヌクレオチド配列を含み、そして配列番号１で示される配列を有する、単離され たDNAフラグメント。 ２．配列番号２で示される配列を有する、ヒトニューロンのカルシウムチャネ ルのα-1Eポリペプチドサブユニット。 ３．配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む哺乳動物発現ベクター。 ４．配列番号１で示される配列を有する異種DNAを含む、真核生物細胞。 ５．前記細胞がアフリカツメガエル卵である、請求項４に記載の細胞。 ６．前記細胞がヒト胎児腎臓細胞である、請求項４に記載の細胞。 ７．前記DNAが、配列番号２で示される配列を有するポリペプチドサブユニッ トを含むニューロンのカルシウムチャネルを発現する、請求項４に記載の細胞。 ８．ニューロンのカルシウムチャネルサブユニットα₂およびβをさらに発現 する、請求項７の細胞株。 ９．ヒトニュローン細胞におけるカルシウム取り込みをプロックし得る化合物 をスクリーニングする方法であって、 前記請求項７に記載の細胞を、該試験化合物に曝す工程、 細胞中へのカルシウム取り込みに対する該曝す工程の影響を調べる工程、およ び 該曝す工程が細胞中へのカルシウム取り込みを阻害する場合に該化合物を選択 する工程、 を包含する、方法。 １０．前記曝す工程が、前記細胞を、請求項８に記載の細胞と接触する工程を含 む、請求項９に記載の方法。