JPH09501185A

JPH09501185A - Fluorescence measurement of the activity of lipolytic enzymes

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Publication number: JPH09501185A
Application number: JP7530054A
Authority: JP
Inventors: ヘルメッテル，アルビン; デューク，マルチン; パルタオフ，フリッツ
Original assignee: プローゲンビオテヒニークゲーエムベーハー
Priority date: 1994-05-19
Filing date: 1995-05-19
Publication date: 1997-02-04
Also published as: WO1995032181A1; ATA102994A; EP0710225A1

Abstract

(57)【要約】蛍光測定原理に基づく方法が、動物、野菜および微生物起源のリパーゼ、ならびに特に、血清中で検出可能なリパーゼの活性を測定するために、開発された。本目的のため、アシルまたはアルキル鎖がそのオメガ末端に蛍光団を有しおよび別のアシルまたはアルキル鎖が蛍光クエンチャーを有する蛍光源性トリグリセリドアナログ類を合成した。前記活性測定のため、蛍光源性脂質を、リポゾーム、小胞、ミセルまたはエマルジョンの形態で両親媒性物質で可溶化する。前記蛍光源性基質は、また、そのまま水性溶媒に分配するかまたは有機溶媒に溶解させ前記酵素に供することもできる。本発明は、初めて、蛍光源性トリグリセリドと適切なタンパク質（例えば、アルブミン）との水性媒体中における適切な複合体をリパーゼ分析のための新規基質可溶化形態として記載している。脂質溶解性酵素の活性は、蛍光強度の連続的増加と関連する蛍光源性基質の加水分解によって、測定される。 (57) [Summary] Methods based on fluorometric principles have been developed to measure lipases of animal, vegetable and microbial origin, and in particular lipase activity detectable in serum. For this purpose, fluorogenic triglyceride analogs were synthesized in which the acyl or alkyl chain has a fluorophore at its omega terminus and another acyl or alkyl chain has a fluorescent quencher. To measure the activity, the fluorogenic lipid is solubilized with an amphiphile in the form of liposomes, vesicles, micelles or emulsions. The fluorogenic substrate can be distributed to an aqueous solvent as it is or dissolved in an organic solvent to be used for the enzyme. The present invention describes for the first time a suitable complex of a fluorogenic triglyceride and a suitable protein (eg albumin) in an aqueous medium as a novel substrate-solubilized form for lipase analysis. The activity of lipolytic enzymes is measured by hydrolysis of the fluorogenic substrate associated with a continuous increase in fluorescence intensity.

Description

【発明の詳細な説明】脂質溶解性酵素の活性の蛍光測定明細書蛍光測定原理に基づく方法が、動物、野菜および微生物起源のリパーゼ（真菌および細菌リパーゼ）ならびに血清中で検出可能なリパーゼ｛リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、肝リパーゼ（ＨＬ）、膵リパーゼ（ＰＬ）｝の活性を測定するために、開発された。本目的のため、アシルまたはアルキル鎖がそのオメガ末端に蛍光団を有しおよび別のアシルまたはアルキル鎖が蛍光クエンチャーを有する蛍光源性トリグリセリドアナログ類を合成した（式ＩおよびII参照）。第三の置換基は脂肪族炭化水素残基である。前記活性測定のため、蛍光源性脂質を、リポゾーム、小胞、ミセルまたはエマルジョンの形態で両親媒性物質で可溶化する。前記蛍光源性基質はまた、そのまま水性溶媒に分配するかまたは有機溶媒に溶解させ前記酵素に供してもよい。本発明は、初めて、蛍光源性トリグリセリドと適切なタンパク質との水性媒体中における適切な複合体をリパーゼ分析のための新規基質可溶化形態として記載している。脂質溶解性酵素によって誘発された蛍光源性基質の加水分解の結果、蛍光団置換およびクエンチャー置換炭化水素鎖が空間的に離されることになり、従って蛍光が増大することになる。式１蛍光源性脂質とアルブミンの水性媒体中における複合体形成と、蛍光測定リパーゼ分析用固体「水溶性」基質を生成するその後の凍結乾燥とが、本発明の必須部分を形成する。この提案方法は、例えば、医学的診断におけるリパーゼ分析、バイオテクノロジーによる酵素産生、有機化学に使用するリパーゼの品質検査、食品中におけるリパーゼまたはリパーゼ阻害剤の検出ならびに生体材料の酵素スクリーニングのためなど、数多くの実用的用途に適している。この蛍光源性脂質の立体異性体がそれぞれ調製され、リパーゼ測定のために種々の基質形態で（上記参照）使用された。種々のリパーゼは、蛍光源性基質に対して極めて異なる立体特異性を示した。したがって、記載の方法は、天然酵素混合物（例えば、血清）中リパーゼの識別用ならびに（遺伝子技術で）改変された酵素のスクリーニング用に適している。先行技術下記のリパーゼ活性測定方法が公知である（Ｌｉｐａｓｅｓ、Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ＆Ｂｒｏｃｋｍａｎ、１９８４）。１）放射線測定方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０、７４８（１９８４））２）滴定方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏl．７１、６１９−６２７（１９８１））３）分光分析法：ａ）光測定ｂ）蛍光測定ａｄ１）放射線測定方法は、未反応出発化合物を分離した後、放射能標識脂肪酸のトリグリセリドからの放出を測定する非連続的方法である。放射能を適用することと再現性が乏しいために、これらの方法は非常に労力を要しかつ時間を要するものである。ａｄ２）脂肪酸のトリグリセリドからの放出は、塩基滴定によって測定される。しかし、正確な測定値を得るために多量の酵素ならびに基質を使用しなければならない。この方法は、極めて干渉を受けやすい。特に、この方法は、実際には、ある”基質形態”の場合、例えば基質が洗浄剤で可溶化されているかまたは有機溶媒中に溶解している時などは、適用できない。ａｄ３ａ）この場合、それらの（グリセロール）エステルからの発色性カルボン酸の形成が、測光法で（および蛍光測定法）で測定される（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ、欧州特許０２０７２５２Ｂ１）。これらの方法の感受性は余り高くない。それに対して、蛍光測定方法はより感受性が高く、基質はもっとさまざまである。ａｄ３ｂ）下記の原理に基づく公知の蛍光法（３ａも参照）が、記載されている（ＫＳＶ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＯｙＶａｌｉｍｏｔｉｅ７、欧州特許００３７５８３Ｂ１）。トリピレンアシル置換トリグリセリド（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、９６３（１９８８）３４０−３４８）が、両親媒性物質の存在下、分子内または分子間エクサイマー蛍光を示す基質であることが記載されている。ピレンアシル鎖を加水分解で切断すると、エクサイマー蛍光を犠牲にしてピレンモノマー蛍光が増大する。もうひとつの概念も同様に構築される。標識基質は蛍光脂肪酸（例えばピレン酪酸）を含有し、その蛍光はその分子内で隣接するクエンチャー脂肪酸（例えばブロモヘキサノン酸）によって抑制される。基質切断の結果、脱クエンチングが起こり、従って、蛍光が増大することになる。両方法とも、もし蛍光団（エクサイマー法）または蛍光団およびクエンチャー（臭素は数十分の１ｎｍの距離まで効果を示す）の両者が近接している場合にのみ、機能する。下記にも示したように、これは、ほとんどの場合に当てはまるというわけではない。我々は、チェコスロバキア連邦プラハで１９９３年１０月１８日から２１日に行われた第３回蛍光分光分析法および応用会議（ＴｈｉｒｄＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｉｎＰｒａｇｕｅ／ＣｚｅｃｈＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＯｃｔ１８−２１、１９９３）（”異なるモデル膜におけるピレン標識アルキルジアシルグリセロールの蛍光に及ぼす高次構造の効果（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｐｙｒｅｎｅ−ｌａｂｅｌｅｄａｌｋｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｄｅｌｍｅｍｂｒａｎｅｓ）”、ピアレビュー論文、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、印刷中）で、ジピレンアシルグリセロールがアルブミン存在下および有機溶媒中でミセル、エマルジョン中で”望ましくない ”構造を示すことおよび小胞中で分子内エクサイマー蛍光を有するに過ぎないことを報告した。もしブロモアシル置換ピレントリグリセリドをミセル、エマルジョン、アルブミン中および有機溶媒中で使用すると、同様の理由からブロモアシルおよびピレンアシル残基が隣接することが必要であるのにそれが得られないであろうし、所望のクエンチング効果も得られない。過去に公知の基質は、濃縮および純粋な酵素の活性測定のためにせいぜい小胞中で使用できるだけである。しかし、アポリポタンパク質およびアルブミンとのピレントリグリセリドの会合が血清分析の場合に起こり、従って、その結果、上述の問題が生じる。したがって、同一分子内に蛍光団とクエンチャーを含有しかつクエンチング効果がその高次構造に依存しないかまたはほとんど依存しない基質が必要とされている。このようなクエンチングは、磁気エネルギー移動（ＲＥＴ）によって実行できる（クエンチャーの吸収スペクトルが、蛍光団の放出スペクトルと重なり合う）（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（蛍光分光分析の原理）、Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、１９８３）。この場合エステル加水分解による直接の妨害が酵素によって起こることは全くないので、この場合、蛍光団およびクエンチャーが疎水性側鎖のオメガ末端に結合することが重要である。蛍光団の脂肪酸エステル（例えば、メチルウンベリフェロン；ＡｎａｌｙｔｉｃＳｃｉｅｎｃｅｓ、１９９１年２月、第７巻、１５−１８）も、発色性トリグリセリドに加えて記載されており、それは、その未変性状態では、ほとんど蛍光を発せず加水分解切断後はより強力に蛍光を発する（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、１００６（１９８９）８４−８８）。一般に、極めて多量の基質がその際必要となり、そのことが天然の生体物質を分析する際にアーチファクトを生じることになる。過去に公知の方法は全て、親油性基質の可溶化のために洗浄性を必要とする。このことは、その天然の生体環境をしばしば破壊することになる（例えば、リポタンパク質の可溶化およびヒト血清中におけるタンパク質の変性）（ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｒｕｃｈａｒｔ＆Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、ｄｅＧｒｕｙｔｅｒ、１９８９）。本発明は、新規蛍光源性リパーゼ基質（リパーゼアナログ）の化学合成を述べる。その光測定信号は脂質基質の高次構造に依存しておらず、従って、基質形態にも依存していない。さらに、新規基質形態が前記基質の可溶化のために述べられ、それは、多目的に生体および人工的環境におけるリパーゼ活性を測定するために使用できる。詳細な説明蛍光測定に使用される物質は、下記の構造式１を有する化合物である。記載の構造の化合物はｓｎ−グリセロールに由来し、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは０であってもよい。残基Ｒ_1,2,3の少なくとも１個はアシルまたはアルキル基で、そのオメガ末端において蛍光残基を含有し、さらに少なくとも１個のＲ_1,2,3は、それぞれ、アシル残基およびアルキル残基であり、それはオメガ末端において結合型の発色団を含有しかつ共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）によって蛍光団の蛍光を消滅させる。クエンチャーまたは蛍光団を含有する前記炭化水素鎖の少なくとも１個は、それぞれ、グリセロールおよびプロパン骨格の好適には１級アルコール官能基にアシルまたはチオエステル結合によって結合していなければならない。１個の残基Ｒ_1,2,3は、脂肪族炭化水素であってもよい。しかし、Ｘ、ＹまたはＺはまた、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ₂であってもよい。蛍光団置換側鎖Ｒ_1,2,3は、下記のようなものであってもよい。Ｉ．好適には、０乃至６個の二重結合を有する鎖長Ｃ₂−Ｃ₂₀のアシルまたはアルキル鎖のオメガ末端に結合したピレン。 II．ピレンの代わり、下記の蛍光団のひとつを使用することも可能である。ペリレン、アンスリル、アンスラニロイル、サリシロイル、テトラセン、アントラセン、フェナンスレン、ナフタレン、クマロン、クマリン、アクリジン、アミノナフトールスルホン酸、フェニルオキサジアゾール、ジフェニルオキサゾール、アロキサジン、スチルベン、ジベンゾピロン、フルオレン、フルオレノン、ｐ−キノン、メチルウンベリフェロン、トリニトロフェニルアミン・フェナジン・フェニルインドール、キノリン、ジフェニルアセチレン、ベンゾチオフェン、シアノチオカルボニル、１、３、５、７−デカテトラエン、ローダミン、ジフェニルヘキサトリエン、ダンシル、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、ベンゾカルバゾン、ジベンゾフラン、パリナリン酸、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−５−インダセン。クエンチャー置換側鎖Ｒ_1,2,3は、下記のようなものであってもよい。Ｉ．ピレンが蛍光団である場合、好適には、０乃至６個の二重結合を有する鎖長Ｃ₂−Ｃ₂₀のアシルまたはアルキル鎖のオメガ末端に結合したトリニトロフェニルアミン。 II．トリニトロフェニルアミンの代わりに、吸収スペクトル（アクセプター）が測定蛍光団の放出スペクトル（ドナー）と重なり合う全ての発色性または蛍光源性化合物を使用することも可能である。蛍光団の適切な組み合わせは全て、適切なドナーとアクセプターとの組合せとして使用してもよい（上記II項参照）。下記の構造で示される１−Ｏ−ヘキサデシル−２−ピレンデカノイル−３−トリニトロフェニルアミノドデカノイル−ｓｎ−グリセロールは、記載の化合物型の例として作用する。式II 蛍光源性アルキルジアシルグリセロールの出発化合物は、１−Ｏ−アルキルグリセロールであり、それは、公知の方法によれば（Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ＆Ｐａｌｔａｕｆ、Ｅｔｈｅｒｌｉｐｉｄｓ；ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｈ．Ｍａｎｇｏｌｄ＆Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ編著、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８３、ｐ．３８９参照）、１−Ｏ−アルキル−２−アシル−３−Ｏ−トリチルグリセロール（アシル化説明；Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ＆Ａ．Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９７、１９９１、１３４）に変換される。その中で、この２−アシル基は、蛍光団またはクエンチャーを保持してもよい。リン脂質の合成で先に記載されておりかつ本文で初めてトリグリセリド合成のために説明する方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、５０、１９８９、５７−６２）によれば、トリチル基は、別のアシル残基によって置換され、それは、その２位に関して相補性にクエンチャーまたは蛍光団を有している。この方法は、また、対応するジアルキルアシルおよびトリアシルグリセロールを、置換１、２−ジアルキル−３−Ｏ−トリチル、１−アシル−２−Ｏ−アルキル−３−Ｏ−トリチルおよび１、２−ジアシル−３−Ｏ−トリチルグリセロールから調製するためにも適用でき、前記出発物質の側鎖１個は蛍光団またはクエンチャーを含有し、および、アシル残基１個がトリチル交換によって導入され、それに関して相補性に、クエンチャーまたは蛍光団を含有している。また、１−アシル−２−アシルアミノ−３−Ｏ−トリチル−１、３−プロパンジオールから対応する１、３−ジアシル−２−アシルアミノ−プロパンジオールを調製することも可能であり、それは、本方法によるトリチル基交換によって蛍光団置換およびクエンチャー置換アシル残基を含有している。リパーゼの蛍光測定のため、この新規基質を水性環境中にすなわちリン脂質小胞中に、洗浄剤ミセルおよびエマルジョン中に従来のあらゆる方法によって配分する（Ｌｉｐａｓｅｓ、Ｂｏｒｓｔｒｏｍ＆Ｂｒｏｃｋｍａｎ編著、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８４）か、または、有機溶媒中に溶解させることも可能である。新規可溶化（基質）形態をここで説明するが、所定のモル分率で好適にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である適切なタンパク質と複合体を形成させることで基質を水相中に配分する。この目的のため、既にＢＳＡを含有している所定ｐＨの水性緩衝液中に脂質アナログのエタノール溶液を入れる。このようにして得られた基質形態（脂質−タンパク質複合体）は、生体環境および人工的環境の両方で使用することができる。特に、ヒト血清のような感受性の生体系の天然組成物が破壊されないことおよびこれらの試料のリパーゼ活性がそれらの未変性成分（タンパク質、リポタンパク質）の存在下で起こりうることを強調せねばなるまい。使用した複合体となったタンパク質は、通常、脂質結合タンパク質であり、特に下記の物質である。ＢＳＡ、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、カゼイン、ラクトアルブミン、卵アルブミン、水溶性アポリポタンパク質ならびに上述のタンパク質の改変形態（メチル化、カルボキシル化、アセチル化タンパク質ならびに化学または遺伝的方法で改変されたタンパク質）。脂質を全く含まないタンパク質および市販のタンパク質（部分的にのみ脱脂）も両者ともに、研究した。調製した複合体は、１／１モル分率の脂質およびタンパク質の会合物を示している。前記水溶性脂質タンパク質複合体は、凍結乾燥器で凍結乾燥でき固体粉末として単離できる。これらの調製物は、水性媒体中に再溶解後、リパーゼ活性測定に適している。脂質タンパク質複合体の凍結乾燥は、緩衝液または無機質塩ならびに低分子もしくは好適には炭水化物である高分子添加剤の非存在または存在下で実施できる。凍結乾燥は、１０ミリモルのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）／ＮａＯＨ（ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ）、ｐＨ７．４およびグリコーゲンまたはＰＢＳ（Ｈ₂Ｏ１リットル中２ｇＫＣｌ、２ｇＫＨ₂ＰＯ₄、８０ｇＮａＣｌおよび２１．６ｇＮａ₂ＨＰＯ₄・Ｈ₂ Ｏ）および澱粉の溶液から好適には行われる。リパーゼ測定のため、凍結乾燥を緩衝塩溶液から行った時には凍結乾燥培養物を好適には蒸留水中に再溶解するかまたは水性緩衝液中に再溶解させる。それらは、両者ともに、好適にはＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨまたはリン酸塩またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含有している。前記複合体調製のため、好適にはエタノール中における式ＩまたはIIに対応する蛍光源性トリグリセリドの溶液を、好適にはアルブミンであるタンパク質の緩衝液または無機質塩含有水溶液中に、好適には２０乃至３７℃の間の温度で撹拌しながら入れる。エタノール−水比率は、１／１００ｖ／ｖ未満である。この調製物は、リパーゼ測定のために直ぐに使用でき、または好ましくは、約２０時間の平衡相経過後に使用できる。リパーゼまたはリパーゼ含有調製物を添加した後、蛍光強度の時間依存性増大によってリパーゼ活性を連続的に測定できる（第１図）。試料中のリパーゼは、脂質アナログを切断し、蛍光団とクエンチャーが空間的に離れているために加水分解の程度に直線的に応じて蛍光が増大することになる。未変性基質中における蛍光団の当初の低強度は、１個の分子に蛍光団とクエンチャーが一緒に存在していることによって、実現される。したがって、測定の都度この基準値が基質中における蛍光団のクエンチングに対しておよび従って被験物質の品質および未変性度に対しての重要な参考となる。また、リパーゼ測定は終点法でも実施でき、その蛍光強度増大が一定インキュベーション期間後に簡単に読みとれる。蛍光測定それ自体は、蛍光スペクトロメーター、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダーによって連続的または非連続的に実施できる。蛍光源性基質のリパーゼ誘発切断は、未消光ピレン置換トリグリセリドを用いて作成される検量線（第２図）を利用し蛍光強度の増大から定量的に計算できる。時間依存性蛍光強度から得られた基質変換は、シリカゲル薄層クロマトグラフィ（溶出液石油エーテル／クロロホルム／氷酢酸９６／４／１）およびクロロホルム／メタノール２／１溶出による分離を実行した後、蛍光測定法で測定した蛍光切断生成物の増大に対応する。被験混合物中における蛍光強度とリパーゼの量または活性との間に直線的関係がある（第３図）。この直線性は、一般に、動物および微生物のリパーゼで観察された。特に、研究したのは、ヒト血清中、牛乳中、ヒト母乳中のリポタンパク質リパーゼ；濃縮純粋リポタンパク質リパーゼ；コリパーゼ存在下および非存在下における膵リパーゼ；肝リパーゼ；ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉ−ｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ，Ｒｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ由来リパーゼである。本発明は、リパーゼ分析の下記の重要な領域で実際に使用することができる。１）医療診断ヒト血清中におけるリパーゼ活性測定は、脂質代謝障害（高脂血症、脂肪症）のような病的例ならびにまた酵素が血清中に放出される臓器病巣を起こす破壊的プロセスの検査に重要であり、それは（酵素の血清中への放出は）、その中で全く発生しないかまたはその中では非常に低濃度でのみ発生する（例えば、肝および膵の腫瘍または炎症性経過またはアルコール中毒例におけるこれらの臓器の病巣中）。２）微生物および植物中におけるリパーゼのスクリーニングならびに化学的および遺伝子技術で改変された酵素。３）式ＩおよびIIの物質の立体異性体は、天然ならびに化学的および遺伝子技術で改変されたリパーゼの異なる立体特異性をスクリーニングするために使用できる。例えば、化合物IIのｓｎ−１アシル異性体は、そのｓｎ−３異性体よりも約２５倍速くリポタンパク質リパーゼによって変換される。血清中で検出可能な膵リパーゼのようなその他のリパーゼは、それほどの立体優先性を示さない。したがって、血清の総リパーゼ活性におけるリポタンパク質リパーゼ部分は、立体優先性を測定しその度合いで求めることができる。４）天然ならびに遺伝子技術でおよびバイオテクノロジーで産生され、カラムクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動、限外ろ過等のような種々の方法で生成されたリパーゼの単離および精製の場合の活性スクリーニング。電気泳動分離後、酵素検出をゲル上で直接行う。５）食品からのリパーゼおよびリパーゼ阻害剤の測定。本発明によれば、リパーゼ、特にリポタンパク質リパーゼ、肝および膵リパーゼの活性測定用キットも同様に提供され、それは、陽性対照としてのリパーゼ、特にリポタンパク質リパーゼ、肝および／または膵リパーゼ、および請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の１種以上の化合物ならびに従来の賦形薬から構成される。下記の実施例は、本発明をさらに詳細に説明する。実施例１１−Ｏ−ヘキサデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロールをそのｓｎ−３位においてトリチル化し（Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ＆Ｐａｌｔａｕｆ、Ｅｔｈｅｒｌｉｐｉｄｓ；ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｈ．Ｍａｎｇｏｌｄ＆Ｆ．Ｐａｌｔａｕf編著）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８３、３８９頁参照）、さらに、生成したアルキルトリチルグリセロールをまだ遊離のｓｎ−２ＯＨ基のピレンデカノン酸でエステル化し、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−トリチル−ｓｎ−グリセロールとする（アシル化説明；Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ＆Ａ．Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９７、１９９１、１３４）。生成した１− Ｏ−ヘキサデシル−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−トリチル−ｓｎ−グリセロール、１５０ｍｇ（１０９．５μモル）、および２８０ｍｇ（３３５μモル）のトリニトロフェニルアミノドデカノン酸無水物および塩化メチレン２ｍｌ中５００μｌの三フッ化ホウ素のエーテル溶液（５０％）の溶液を、０℃で３０分間および室温でさらに２時間撹拌した。反応混合物を撹拌しながらＮａＨＣＯ₃を添加し中性とする。粗生成物の有機溶媒溶液を分離し、Ｎ₂流中で１ｍｌまで濃縮する。その後、石油エーテル１０ｍｌを添加する。沈殿物を捨て、その上清をシリカゲルカラムにのせる。このカラムを石油エーテル／酢酸９／１（ｖ／ｖ）で溶出し、生成物８６．３ｍｇ（７９．９μモル）を得る（収率７３％）が、それは、薄層クロマトグラフィに関してシリカゲル上で均一である。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７９（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例２１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール実施例１と同様の調製：最初に１−Ｏ−トリチル−２−ピレンデカノイル−３ −Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロールを３−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロールから得た。１−トリニトロフェニル−アミノドデカノイル−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール（２１２．７ｍｇ）１９７、１μモル、収率６０％）は、カラムクロマトグラフィ後、後者の化合物（３００ｍｇ、３２８．４μモル）から得られた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７９（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例３１−Ｏ−ドデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニル−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール実施例１と同様に調製：１−Ｏ−ドデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２ ’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロールが７２．９ｍｇ（７１．２μモル、収率６９％）が、１００ｍｇ（１０３．２μ モル）の１−Ｏ−ドデシル−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−トリチル−ｓｎ− グリセロールから得られた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例４１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ドデシル−ｓｎ−グリセロール実施例１と同様に調製：１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ドデシル−ｓｎ−グリセロールが、１００ｍｇ（１０３．２μモル）の１−Ｏ−トリチル−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ドデシル−ｓｎ−グリセロールから得られた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例５１−Ｏ−テトラデシル−２−Ｏ−ピレンデシル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノヘキサノイル）−ｓｎ−グリセロール１−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロールは、塩化トリチルによって１−Ｏ −テトラデシル−３−Ｏ−トリチル−ｓｎ−グリセロールに変換される（Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ＆Ｐａｌｔａｕｆ、Ｅｔｈｅｒｌｉｐｉｄｓ；Ｂｉｏｃｈｅｍｉ− ｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｈ．Ｍａｎｇｏｌｄ＆Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ編著）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８３、３８９頁参照）。ピレンヘキサノールおよびメシルクロリドから得られた（Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ＆Ｐａｌｔａｕｆ、Ｅｔｈｅｒｌｉｐｉｄｓ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｈ．Ｍａｎｇｏｌｄ＆Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ、編著）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８３、３８９頁参照））ピレンヘキシルメシレートによる後者の物質のアルキル化は、１−Ｏ −テトラデシル−２−Ｏ−ピレンデシル−３−Ｏ−トリチル−ｓｎ−グリセロールを供与する。このジアルキルトリチル−グリセロール（２５０ｍｇ）２８６．９μモル）は、三フッ化ホウ素エーテル溶液（５０％）の存在下−実施例１の方法と同様に−トリニトロフェニルアミノヘキサノン酸無水物（５７３．７ｍｇ、８６０．７μモル）によって最終生成物に変換された（１９１．４ｍｇ、２００．８μモル、収率７０％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例６１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノヘキサノイル）−２−Ｏ− ピレンデシル−３−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロール実施例５と同様に調製：１−トリニトロフェニルアミノヘキサノイル−２−Ｏ −ピレンデシル−３−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロール１４８．８ｍｇ（１５６．１μモル、収率６８％）が、２００ｍｇ（２２９．５μモル）の１− Ｏ−トリチル−２−Ｏ−ピレンデシル−３−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロールから得られた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例７１−オレイル−２−ピレンドデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−グリセロールラセミ体実施例１の方法と同様に、１−オレイル−グリセロールラセミ体は、１−オレイル−３−Ｏ−トリチルグリセロールの調製に役立ち、それは、ピレンドデカノン酸無水物によって１−オレイル−２−ピレンドデカノイル−３−Ｏ−トリチル −グリセロールラセミ体に変換される。三フッ化ホウ素エーテル溶液（５０％）存在下、このジアシルトリチルグリセロール（２００ｍｇ、２０９．８μモル）のトリニトロフェニルアミノドデカノン酸無水物（５２５．５ｍｇ、６２９．４ μモル）による変換は、１−オレイル−２−ピレンドデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−グリセロールラセミ体（１２２．１ｍｇ、１０９．１μモル、収率５２％）を供与する。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例８１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−２−ピレンドデカノイル−３−オレイル−ｓｎ−グリセロール実施例７の方法と同様に、３−オレイル−ｓｎ−グリセロールは、最初に、オレイルトリチル−ｓｎ−グリセロールによって１−Ｏ−トリチル−２−ピレンドデカノイル−３−オレイル−ｓｎ−グリセロールに変換され、トリニトロフェニルアミノドデカノン酸無水物とともに、三フッ化ホウ素エーテル溶液存在下、最終生成物を生成する（収率５０％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例９１−オレイル−２−ピレンドデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール実施例８の方法と同様に、１−オレイル−２−ピレンドデカノイル−３−Ｏ− トリチル−ｓｎ−グリセロールは、最終生成物に変換される（収率５６％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７５（石油エーテル／クロロホルム１：４）。実施例１０１−ピレンデカノイル−２−Ｏ−ヘキサデシル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−グリセロールラセミ体２−Ｏ−ヘキサデシルグリセロール（（Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ＆ＰａｌｔａｕｆｉｎＥｔｈｅｒｌｉｐｉｄｓ；ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍ− ｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｈ．Ｍａｎｇｏｌｄ＆Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ編著）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８３、３８９頁参照））（１００ｍｇ、３１５μモル）は、ジメチルアミノピリジン（８５．５ｍｇ、１００μモル）および５ｍｌのＣＨＣｌ₃中ジシクロヘキシルカルボジイミド（７５ｍｇ、３５０μモル）存在下ピレンデカノン酸によってアシル化された（アシル化説明；Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ＆Ａ．Ｈｅｒｍｅｔｔｅｒ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９７、１９９１、１３４）。生成した１−ピレンデカノイル−２ −Ｏ−ヘキサデシル−グリセロールラセミ体は、シリカゲルクロマトグラフィを行った（石油エーテルおよびエーテルによる勾配溶出）。純粋な生成物が、収率８７％（１４６ｍｇ）で得られた。シリカゲルＴＬＣ；Ｒｆ＝０．４０（クロロホルム／アセトン／氷酢酸９６：４：１）。このアシルアルキルグリセロール（１４６ｍｇ、１８８μモル）をその後トリニトロフェニルアミノドデカノン酸（１００ｍｇ；２３０μモル）によって、５２ｍｇのジメチルアミノピリジン（４２３μモル）およびクロロホルム５ｍｌ中４２ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（２００μモル）存在下、アシル化した。生成した１−ピレンデカノイル−２−Ｏ−ヘキサデシル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−グリセロールラセミ体をシリカゲルで精製した（石油エーテルおよびエーテルによる勾配溶出（シリカゲル、クロロホルム／アセトン／氷酢酸９６：４：１）（１３７ｍｇ、収率６８％）。ＴＬＣ；Ｒｆ＝０．８０実施例１１１−テトラデカノオイルアミノ−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’、６ ’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−プロパンジオールこの合成は、１−テトラデカノイルアミノ−３−Ｏ−シリチルプロパンジオールラセミ体に基づいており、これは、文献（Ｒ．Ｄｉｊｋｍａｎ、Ｎ．Ｄｅｋｋｅｒ、およびＧ．Ｈ．Ｈａａｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、 1043、1990、67−74）に記載された説明にしたがって調製した。アシルトリチルプロピンジオールをピレンデカノイル酸によりエステル化し、１−テトラデカノイノルアミノ−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−トリチルプロパンジオールラセミ体を得た（アルキルシリチルグリセロールのアシル化に用いたのに同様の方法を適応した。Ｈｅｒｍｔｔｅｒ＆ＰａｌｔａｕｆｉｎＥｔｈｅｒｌｉｐｉｄｓ；ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｈ．Ｍａｎｇｏｌｄ＆Ｆ．Ｐａｌｔａｕｆ編著）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、1983、389頁参照）。実施例１に記載した方法と同様に、トリニトロフェニルアミノドデカノイル酸無水物によりトリチル基の交換により、１５３．３ｍｇ（１７７．６μモル、６２％の収率）の最終生成物をこの化合物（２００ｍｇ、２８６．５μモル）から得た。ＴＬＣ；Ｒｆ＝０．７０（石油エーテル／クロロホルム１：４）実施例１２エタノール３０μｌ中９ナノモル（９μｇ）の１−Ｏ−ヘキサデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール（実施例１）溶液を可能な限り細いジェットで９ｍｌの１０ｍＭＴｒｉ／ＨＣｌｐＨ７．４中９ナノモル（０．６ｍｇ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液中に室温でハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）シリンジによって撹拌しながら注入する。このようにして得られたＢＳＡトリグリセリド複合体溶液の３ｍｌを、４０μｌのリパーゼ試料（リポタンパク質リパーゼ）と混合する。その後、３８０ｎｍにおける時間依存性蛍光強度増大によって、３７℃において、蛍光測定計によってこの反応を観察する（励起３４２ｎｍ；スリット幅；励起１０ｎｍ放出１０ｎｍ）。試料のリパーゼ活性を反応基質ピコモル（ｐｍｏｌｅｓ）／被験容量／単位時間（ここでは２．１ピコモル／ｍｌ／分）で、蛍光強度の傾き（第１図）およびアルブミン水溶液中における公知濃度のヘキサデシルピレンデカノイルトリチルグリセロール（ＨＰＴＧ）について得られた検量線（第２図）によって求める。求めたリパーゼ活性は、使用した酵素量（μｇ）と直線関係である（第３図）。実施例１３実施例１２に記載の通り、１μｇの（牛乳由来）リポタンパク質リパーゼ活性を、ＢＳＡおよび１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール（実施例２）のアルブミン−基質複合体で測定し、５２．３ピコモル／ｍｌ／分を得た。実施例１４実施例１２に記載の通り、１μｇの（牛乳由来）リポタンパク質リパーゼ活性を、ＢＳＡおよび１−Ｏ−ドデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’ 、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール（実施例３）のアルブミン−基質複合体で測定し、６ピコモル／ｍｌ／分を得た。実施例１５実施例１２に記載の通り、１μｇの（牛乳由来）リポタンパク質リパーゼ活性を、ＢＳＡおよび１−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−２−ピレンデカノイル−３−Ｏ−ドデシル−ｓｎ−グリセロール（実施例４）のアルブミン−トリグリセリド複合体で測定し、１５０ピコモル／ｍｌ／分を得た。実施例１６種々の複合体化タンパク質をリポタンパク質リパーゼの蛍光源性基質のために使用し、第１表に記載の結果が得られた。タンパク質および１−Ｏ−ヘキサデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロールの複合体を、前記表に記載のタンパク質を使用し、実施例１２に従って調製した。記載のタンパク質は、購入した（ＢＳＡ；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ；その他はＳｉｇｍａから）。リポタンパク質リパーゼ活性は、実施例１２に記載の説明に従い測定した。実施例１７種々のリパーゼについて、酵素濃度に直線的に依存する活性を、１−Ｏ−ドデシル−２−ピレンデカノイル−３−（２’、４’、６’−トリニトロフェニルアミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロールおよびＢＳＡの複合体によって、測定した。前記複合体の調製、活性測定ならびに評価は、実施例１２に記載の通り実施した。ブタ肝由来エステラーゼおよびブタ膵由来ホスホリパーゼＡ₂（両者ともにＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから）によって、活性は全く観察されなかった。下記のリパーゼは、顕著な活性を示した；ブタの膵リパーゼ（ＰＬ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨから）、ヒト血清および牛乳由来ならびにヒト血清および母乳由来リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）；Ｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（長瀬生化学社、日本）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ由来の微生物リパーゼ。実施例１８リポタンパク質リパーゼのリパーゼ活性に及ぼす塩および洗浄剤の影響を、測定した。使用した複合体：実施例１７に記載の通り調製および配合。使用したリポタンパク質リパーゼ：牛乳由来ＬＰＬ。結果を第２表に示した。実施例１９実施例１３に記載の通り、ヒト血漿各２０μｌの活性を正脂血症ドナーのヘパリン添加前後（６０Ｕ／ｋｇ体重；２５分後血液採取）において実施した。ヘパリン添加前血清リパーゼ活性わずかの活性乃至無活性ヘパリン添加後血清リパーゼ活性６０ピコモル／ｍｌ／分。実施例２０実施例１２において水性媒体中で得られかつ蛍光源性基質とウシ血清アルブミンからなる複合体を、−７５℃で凍結後凍結乾燥する。実施例２１実施例２０に記載の通り、凍結乾燥培養物を、アルブミンおよび蛍光源性基質から調製し、水性媒体として１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（ｐＨはＮａＯＨによって調節）３ｍｌ中のグリコーゲン２５ｍｇを用いた。実施例２２実施例２０に記載の通り、凍結乾燥培養物を、アルブミンおよび蛍光源性基質から調製し、水性媒体として３ｍｌの１０ｍＭＮａ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４中のサッカロース２５ｍｇを用いた。実施例２３実施例２０に記載の通り、凍結乾燥培養物を、アルブミンおよび蛍光源性基質から調製し、水性媒体として３ｍｌのＰＢＳ（Ｈ₂Ｏ１リットル中、ＫＣｌ２ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、ＮａＣｌ８０ｇおよびＮＡ₂ＨＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ２１．６ｇ）、ｐＨ７．４中の澱粉２５ｍｇを用いた。実施例２４実施例２０乃至２３で調製した凍結乾燥培養物を、９ｍｌのＨ₂Ｏ_dist（蒸留水）に溶解した。アリコット各３ｍｌを、実施例１１に記載のようにＬＰＬ活性測定に用いた。結果を第３表に示した。 Detailed Description of the Invention Fluorescence measurement of the activity of lipolytic enzymes Specification Methods based on the principle of fluorescence measurement include lipases (fungi) of animal, vegetable and microbial origin. And bacterial lipase) and lipase detectable in serum {lipoprotein lipase The activity of the lipase (LPL), liver lipase (HL), pancreatic lipase (PL)} is measured. Developed for. For this purpose, the acyl or alkyl chain has its omega end. Has a fluorophore at the end and another acyl or alkyl chain has a fluorescence quencher Fluorogenic triglyceride analogs were synthesized (see Formulas I and II). Third The substituent is an aliphatic hydrocarbon residue. To measure the activity, a fluorescent lipid was Solubilized with amphiphiles in the form of liposomes, vesicles, micelles or emulsions . The fluorogenic substrate may also be distributed as such in an aqueous solvent or dissolved in an organic solvent. You may make it decompose | disassemble and it may use for the said enzyme. The present invention, for the first time, with fluorogenic triglycerides For the appropriate complex in aqueous medium with the appropriate protein for lipase analysis It is described as a novel substrate solubilized form. Firefly induced by a lipolytic enzyme As a result of hydrolysis of the light-source substrate, fluorophore-substituted and quencher-substituted hydrocarbon chains are They will be spatially separated and will therefore increase fluorescence. Formula 1 Complex formation of fluorogenic lipid and albumin in aqueous medium and fluorescence measurement lipase Subsequent freeze-drying to produce a solid “water-soluble” substrate for enzyme analysis is essential to the invention. Forming part. This proposed method, for example, lipase analysis in medical diagnosis, Enzyme production by biotechnology, quality inspection of lipase used in organic chemistry, Detection of lipases or lipase inhibitors in foods and enzyme of biomaterials Suitable for many practical applications, such as for cleaning. This fluorescent lipid Each of the stereoisomers of is prepared in various substrate forms for lipase measurement (above Used). Different lipases are quite different for fluorogenic substrates. It showed body specificity. Therefore, the described method is used to analyze natural enzyme mixtures (eg, serum ) Screnin, an enzyme for identification of medium lipase and modified (by genetic engineering) Suitable for use inPrior art The following methods for measuring lipase activity are known (Lipases, Borgstr. om & Blockman, 1984). 1) Radiation measurement method (Clin. Chem. 30, 748 (1984)) 2) Titration method (Methods in Enzymology, Vol. 71, 619-627 (1981)). 3) Spectroscopic analysis method: a) Optical measurement b) Fluorescence measurement ad1) The radiation measurement method is as follows. Is a non-continuous method of measuring the release of triglycerides from triglycerides. Apply radioactivity Due to the lack of reproducibility and reproducibility, these methods are very laborious and time consuming. Things. ad2) Release of fatty acids from triglycerides is measured by base titration. However, large amounts of enzyme and substrate must be used to obtain accurate measurements. No. This method is extremely susceptible to interference. In particular, this method actually In some "substrate forms", for example, the substrate is solubilized with detergent or is organic. It is not applicable when it is dissolved in a solvent. ad3a) in this case chromogenic carvone from their (glycerol) ester Acid formation is measured photometrically (and fluorometrically) (Boehringe r Mannheim GmbH, European Patent 0207252B1). These people The sensitivity of the law is not very high. In contrast, the fluorescence measurement method is more sensitive, The substrates are more diverse. ad3b) A known fluorescence method (see also 3a) based on the following principles has been described: (KSV-Chemicals, Oy Valimotie 7, European Patent 00 37583B1). Tripyrene Acyl Substituted Triglyceride (Biochemic a et Biophysica Acta, 963 (1988) 340-34. 8) is a group showing intramolecular or intermolecular excimer fluorescence in the presence of an amphipathic substance It is described as being quality. When the pyrene acyl chain is cleaved by hydrolysis, The pyrene monomer fluorescence increases at the expense of cymer fluorescence. Another concept Constructed similarly. The labeled substrate contains a fluorescent fatty acid (eg pyrene butyric acid) Fluorescence is due to adjacent quencher fatty acids in the molecule (eg bromohexanoic acid) Is suppressed by. De-quenching occurs as a result of substrate cleavage and therefore fluorescence Will increase. In both methods, if the fluorophore (excimer method) or fluorescence Both the group and the quencher (bromine is effective up to a distance of tens of nanometers) Only works if in close proximity. As shown below, this is mostly This is not the case. We are Czech Republic Slovakia Prague 3rd Fluorescence Spectroscopy and Reactions, October 18-21, 1993, Conferences (Third Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy copy in Prague / Czech Replica of Of Oc t 18-21, 1993) ("pyrene-labeled alkyldiynes in different model membranes. Effect of higher-order structure on fluorescence of acylglycerol (Conformation al effects on the fluoresence of py Rene-labeled alkyl diacyl glycerols i n different model membranes ””, peer review In a paper, Plenum Press, printing) "Undesired in the presence of albumin and in organic solvents in micelles and emulsions" "Showing structure and having only intramolecular excimer fluorescence in vesicles And reported. If bromoacyl-substituted pyrene triglyceride is a micelle, emulsion For the same reason, bromo reed Le and pyrene acyl residues are required to be adjacent but not available Well, the desired quenching effect cannot be obtained. Known substrates in the past are concentrated and And can be used at best in vesicles for measuring the activity of pure enzymes. I Or However, the association of pyrene triglyceride with apolipoprotein and albumin This occurs in the case of liquid crystal analysis and thus results in the problems mentioned above. Therefore, It contains a fluorophore and a quencher in the same molecule and its quenching effect is of higher order. There is a need for a structure-independent or almost independent substrate. like this Quenching can be performed by magnetic energy transfer (RET) (quenching The absorption spectrum of char overlaps with the emission spectrum of the fluorophore) (Prin couples of Fluorescence Spectroscopy ( Principle of fluorescence spectroscopic analysis), J. R. Lakowicz, Plenum Press , 1983). In this case, the direct inhibition by ester hydrolysis is caused by the enzyme. In this case, the fluorophore and quencher have hydrophobic side-chain residues. It is important to attach to the mega end. Fluorophore fatty acid esters (eg, methylumbelliferone; Analyti) c Sciences, February 1991, Vol. 7, 15-18), Listed in addition to glycerides, it is almost non-fluorescent in its native state. It does not emit light and emits more intense fluorescence after hydrolysis cleavage (Biochemica et Biophysica Acta, 1006 (1989) 84-88). In general, very large amounts of substrate are then required, which is a natural biomaterial component. Artifacts will occur during analysis. All previously known methods require detergency for the solubilization of lipophilic substrates. This often results in the destruction of its natural biological environment (eg lipoproteins). Protein solubilization and denaturation of proteins in human serum) (Human Serum Lipoproteins, Fruchart & Shepher d, de Gruyter, 1989). The present invention describes the chemical synthesis of a novel fluorogenic lipase substrate (lipase analog). You. Its photometric signal does not depend on the higher order structure of the lipid substrate and therefore the substrate morphology Also does not depend on. Furthermore, a novel substrate form has been described for solubilization of said substrate. It is versatile to measure lipase activity in biological and artificial environments. Can be used forDetailed description The substance used for fluorescence measurement has the following structure Formula 1 Is a compound having Compounds of the described structure are derived from sn-glycerol and have the formula Inside, X, Y, and Z may be 0. Residue R_1,2,3At least one of Or an alkyl group containing a fluorescent residue at its omega terminus and at least Also 1 R_1,2,3Are respectively acyl and alkyl residues, which are Resonant energy transfer (RET) containing bound chromophore at the omega end Extinguishes the fluorescence of the fluorophore. The above containing a quencher or fluorophore At least one of the hydrocarbon chains has glycerol and propane backbones, respectively. Preferably attached to a primary alcohol functional group by an acyl or thioester bond Must be. One residue R_1,2,3May be an aliphatic hydrocarbon . However, X, Y or Z can also be S, NH or CH₂It may be. Fluorophore-substituted side chain R_1,2,3May be as follows: I. Suitably a chain length C having 0 to 6 double bonds₂-C₂₀Acyl or a Pyrene attached to the omega end of the rutile chain. II. Instead of pyrene, it is also possible to use one of the fluorophores below. Peri Len, anthryl, anthraniloyl, salicyloyl, tetracene, anthrace , Phenanthrene, naphthalene, coumarone, coumarin, acridine, aminona Futholsulphonic acid, phenyl oxadiazole, diphenyl oxazole, Loxazine, stilbene, dibenzopyrone, fluorene, fluorenone, p-ki Non, methyl umbelliferone, trinitrophenylamine / phenazine / fe Nylindole, quinoline, diphenylacetylene, benzothiophene, cyano Thiocarbonyl, 1,3,5,7-decatetraene, rhodamine, diphenyl Xatriene, dansyl, 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD), benzocarbazone, dibenzofuran, parinaric acid, 4,4-diph Luoro-4-bora-3a, 4a-diaza-5-indacene. Quencher substitution side chain R_1,2,3May be as follows: I. When pyrene is a fluorophore, it preferably has a chain length of 0 to 6 double bonds. C₂-C₂₀Attached to the omega terminus of an acyl or alkyl chain of Luamine. II. Instead of trinitrophenylamine, the absorption spectrum (acceptor) All chromogenic or fluorescent sources that overlap the emission spectrum (donor) of the measured fluorophore It is also possible to use sex compounds. All suitable combinations of fluorophores It may also be used as a combination of various donors and acceptors (see Section II above). 1-O-hexadecyl-2-pyrenedecanoyl-3-to represented by the following structure Linitrophenylamino dodecanoyl-sn-Glycerol is the described compound type Acts as an example of. Formula II The starting compound for the fluorogenic alkyldiacylglycerol is a 1-O-alkyl group. Lyserolol, which according to known methods (Hermetter & Pal tauf, Etherlipids; Biochemical and Bio medical Aspects (H. Mangold & F. Paltaf) Written by Academic Press, 1983, p. 389), 1-O-a Ruquil-2-acyl-3-O-tritylglycerol (acylation description; F.Pa ltauf & A. Hermetter, Methods in Enzymol No. 197, 1991, 134). Among them, this 2-acyl group May carry a fluorophore or quencher. Described above in the synthesis of phospholipids Methods described and described for the first time in the text for the synthesis of triglycerides (Chem . Phys. Lipids, 50, 1989, 57-62). The group is replaced by another acyl residue, which is complementary to its 2-position. Has an encher or fluorophore. This method also provides the corresponding dialkyl Acyl and triacylglycerols are substituted with substituted 1,2-dialkyl-3-O-to Lityl, 1-acyl-2-O-alkyl-3-O-trityl and 1,2-dia It is also applicable to prepare from sil-3-O-tritylglycerol, said starting One side chain of the substance contains a fluorophore or quencher and one acyl residue Is introduced by a trityl exchange, in which complementarity, quencher or Contains a fluorophore. In addition, 1-acyl-2-acylamino-3-O-triti The corresponding 1,3-diacyl-2-acylamimine from ru-1,3-propanediol It is also possible to prepare no-propanediol, which is the Containing fluorophore-substituted and quencher-substituted acyl residues by chill group exchange You. For the measurement of lipase fluorescence, this novel substrate was used in an aqueous environment, Into the cells, into the detergent micelles and emulsions by all conventional methods Yes (edited by Lipases, Borstrom & Brockman, Elsev) ier, 1984) or dissolved in an organic solvent. The novel solubilized (substrate) morphology is described here, but is preferably bovine at a given mole fraction. By forming a complex with the appropriate protein, which is serum albumin (BSA) Partition the substrate into the aqueous phase. For this purpose, a predetermined pH that already contains BSA A solution of the lipid analog in ethanol is placed in the aqueous buffer of. Obtained this way The substrate morphology (lipid-protein complex) is generated in both biological and artificial environments. Can be used with In particular, natural compositions of sensitive biological systems such as human serum Are not destroyed and the lipase activity of these samples depends on their native components ( Protein, lipoprotein) must be emphasized . The complexed protein used is usually a lipid-binding protein, The following substances are BSA, HSA (human serum albumin), casein, LA Ctoalbumin, ovalbumin, water-soluble apolipoprotein and the above-mentioned tannins Modified forms of proteins (methylated, carboxylated, acetylated proteins and Proteins modified by chemical or genetic methods). Protein without any lipid Both quality and commercial proteins (only partially defatted) were also studied. Preparation The resulting complexes show a 1/1 molar fraction of lipid and protein associations. The water-soluble lipid-protein complex can be freeze-dried in a freeze dryer to give a solid powder. Can be isolated. These preparations were used for lipase activity measurement after re-dissolving in aqueous medium. Are suitable. Freeze-drying of lipid-protein complexes should be performed with buffer or mineral salts and In the absence or presence of low molecular weight or preferably polymeric additives, which are carbohydrates Can be implemented. Lyophilization was performed with 10 mM N- (2-hydroxyethyl) pipera. Gin-N '-(2-ethanesulfonic acid) / NaOH (HEPES-NaOH), pH 7.4 and glycogen or PBS (H₂2g KCl in 1 liter of O 2g KH₂PO_Four, 80 g NaCl and 21.6 g Na₂HPO_Four・ H₂ It is preferably carried out from a solution of O) and starch. Freeze drying for lipase measurement Is the lyophilized culture preferably redissolved in distilled water when made from a buffered salt solution? Or redissolve in aqueous buffer. Both are preferably HEPE Contains S-NaOH or Phosphate or Tris-HCl, pH 7.4 You. For the preparation of said complex, it preferably corresponds to formula I or II in ethanol. The solution of the fluorescent triglyceride is Stir in a buffer or an aqueous solution containing an inorganic salt, preferably at a temperature between 20 and 37 ° C. Put while. The ethanol-water ratio is less than 1/100 v / v. This tone The product can be used immediately for lipase measurement, or preferably for about 20 hours. It can be used after the equilibrium phase of. After adding lipase or lipase-containing preparation , Lipase activity can be measured continuously by the time-dependent increase in fluorescence intensity (1st Figure). Lipase in the sample cleaves the lipid analog, leaving the fluorophore and quencher empty. Due to the distant distance, the fluorescence increases linearly with the degree of hydrolysis. Become. The initial low intensity of the fluorophore in the native substrate is due to the fluorophore and the It is realized by the existence of the venture together. Therefore, the measurement Each time This reference value is for quenching of the fluorophore in the substrate and thus the test article. It is an important reference for quality and nativeness. The lipase measurement can also be performed by the end point method, and the increase in the fluorescence intensity is constant. Easy to read after the basation period. The fluorescence measurement itself is Monitor, continuous or discontinuous by fluorescence microscope or fluorescence plate reader Can be carried out. The lipase-induced cleavage of the fluorogenic substrate results in unquenched pyrene-substituted triglycerides. Quantitative from the increase in fluorescence intensity using a calibration curve (Fig. 2) created using ceride Can be calculated to Substrate conversion obtained from time-dependent fluorescence intensity Romanography (eluent petroleum ether / chloroform / glacial acetic acid 96/4/1 ) And chloroform / methanol 2/1 elution followed by fluorescence Corresponds to the increase in fluorescent cleavage products measured by the assay. Fluorescence in the test mixture There is a linear relationship between intensity and amount or activity of lipase (Figure 3). This straight line Sex was generally observed with animal and microbial lipases. Especially, I studied , Lipoprotein lipase in human serum, milk, human milk; concentrated pure lipota Protein lipase; pancreatic lipase in the presence and absence of colipase; liver lipase Pase; andPseudomonasseed,Chromobacteri−u m viscosum, Candida rugosa, Rhizopus a rrhizus, Geotrichum candidum Derived lipase . The invention can be used in practice in the following important areas of lipase analysis: 1) Medical diagnosis Measurement of lipase activity in human serum is performed for lipid metabolism disorders (hyperlipidemia, steatosis). As well as destructive processes that cause organ foci in which the enzyme is released into the serum. It is important for the examination of the process, which is the release of the enzyme in the serum, It does not occur or only occurs at very low concentrations therein (eg liver and Tumors of the pancreas or lesions of these organs in cases of inflammatory process or alcoholism During). 2) Screening and chemical analysis of lipase in microorganisms and plants And enzymes modified by genetic technology. 3) Stereoisomers of substances of formulas I and II can be obtained by natural and chemical and genetic techniques Can be used to screen for different stereospecificities of lipases modified with You. For example, the sn-1 acyl isomer of Compound II is about more than its sn-3 isomer. It is converted 25 times faster by lipoprotein lipase. Pancreas detectable in serum Other lipases, such as lipase, do not show so much steric preference. did Therefore, the lipoprotein lipase portion in the total lipase activity of serum is sterically dominant. The anteriority can be measured and the degree can be determined. 4) Natural and genetically and biotechnologically produced, Live by a variety of methods such as chromatography, HPLC, gel electrophoresis, ultrafiltration, etc. Activity screening in the case of isolation and purification of the lipase produced. Electrophoretic separation Later, enzyme detection is performed directly on the gel. 5) Measurement of lipase and lipase inhibitors from foods. According to the invention lipases, in particular lipoprotein lipases, liver and pancreatic lipases Also provided is a kit for measuring the activity of ze, which contains lipase as a positive control, In particular, lipoprotein lipase, liver and / or pancreatic lipase, and claim 1. Consisting of one or more compounds according to any one of items 1 to 15 and conventional excipients Is done. The following examples explain the invention in more detail. Example 1 1-O-hexadecyl-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-tri Nitrophenylamino dodecanoyl)-sn-Glycerol 1-O-hexadecyl-sn-Glycerolsn-Trityl in 3rd place (Hermitter & Paltaf, Etherlipids; Bio chemical and Biomedical Aspects (H. Ma ngold & F. Edited by Paltau), Academic Press, 19 83, page 389), and the alkyltrityl glycerol produced still Freesn-Esterified with -2OH group pyrenedecanoic acid to give 1-O-hexadecane Syl-2-pyrenedecanoyl-3-O-trityl-sn-Glycerol ( Acylation description; F. Paltaf & A. Hermetter, Method in Enzymology 197, 1991, 134). Generated 1- O-hexadecyl-2-pyrenedecanoyl-3-O-trityl-sn-Glycero Of 150 mg (109.5 μmol) and 280 mg (335 μmol) 50 in 2 ml of trinitrophenylamino dodecanoic anhydride and methylene chloride A solution of 0 μl of boron trifluoride in ether (50%) was kept at 0 ° C. for 30 minutes. And stirred at room temperature for a further 2 hours. NaHCO 3 while stirring the reaction mixture_ThreeWith Add neutral. The organic solvent solution of the crude product is separated and₂Concentrate to 1 ml in the flow I do. Then 10 ml of petroleum ether are added. Discard the precipitate and discard the supernatant. Place on the Rica gel column. Petroleum ether / acetic acid 9/1 (v / v) The product was eluted with to obtain 86.3 mg (79.9 μmol) of the product (yield 73%). It is homogeneous on silica gel for thin layer chromatography. TLC: Rf = 0.79 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 2 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) -2-pyre Ndecanoyl-3-O-hexadecyl-sn-Glycerol Preparation as in Example 1: First 1-O-trityl-2-pyrenedecanoyl-3 -O-hexadecyl-sn-Glycerol to 3-O-hexadecyl-sn−Guri Obtained from cerol. 1-trinitrophenyl-aminododecanoyl-2-pyrene Decanoyl-3-O-hexadecyl-sn-Glycerol (212.7 mg) 1 97, 1 μmol, yield 60%) was the latter compound ( 300 mg, 328.4 μmol). TLC: Rf = 0.79 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 3 1-O-dodecyl-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinito Rophenyl-aminododecanoyl)-sn-Glycerol Prepared as in Example 1: 1-O-dodecyl-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-sn-Grisero Le Is 72.9 mg (71.2 μmol, yield 69%) is 100 mg (103.2 μmol) Mol) of 1-O-dodecyl-2-pyrenedecanoyl-3-O-trityl-sn− Obtained from glycerol. TLC: Rf = 0.75 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 4 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) -2-pyre Ndecanoyl-3-O-dodecyl-sn-Glycerol Prepared as in Example 1: 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylamino Dodecanoyl) -2-pyrenedecanoyl-3-O-dodecyl-sn-Grisero Is 100 mg (103.2 μmol) of 1-O-trityl-2-pyrenedecano. Ile-3-O-dodecyl-sn-Obtained from glycerol. TLC: Rf = 0.75 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 5 1-O-tetradecyl-2-O-pyrenedecyl-3- (2 ', 4', 6'-tri Nitrophenylaminohexanoyl)-sn-Glycerol 1-O-tetradecyl-sn-Glycerol is 1-O with trityl chloride -Tetradecyl-3-O-trityl-sn-Converted to glycerol (Her metter & Paltauf, Etherlipids; Biochemi- cal and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Edited by Paltaf), Academic Press, 1983, 3 (See page 89). Obtained from pyrenehexanol and mesyl chloride (Her metter & Paltauf, Etherlipids, Biochemical al and Biomedical Aspects (H. Mangold & F. Paltaf, edited), Academic Press 1983, 389. See page)) Alkylation of the latter substance with pyrenehexyl mesylate is 1-O -Tetradecyl-2-O-pyrenedecyl-3-O-trityl-sn-Grisero Will be provided. This dialkyltrityl-glycerol (250 mg) 286. 9 μmol) in the presence of a boron trifluoride ether solution (50%)-Example 1 In the same manner as in the method, -trinitrophenylaminohexanoic anhydride (573.7 mg, 860.7 μmol) converted to the final product (191.4 mg, 200 . 8 μmol, yield 70%). TLC: Rf = 0.85 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 6 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminohexanoyl) -2-O- Pyrenedecyl-3-O-tetradecyl-sn-Glycerol Prepared as in Example 5: 1-trinitrophenylaminohexanoyl-2-O -Pyrenedecyl-3-O-tetradecyl-sn-Glycerol 148.8 mg (156.1 μmol, yield 68%) is 200 mg (229.5 μmol) of 1- O-Trityl-2-O-pyrenedecyl-3-O-tetradecyl-sn-Glycero Obtained from TLC: Rf = 0.85 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 7 1-oleyl-2-pyrendodecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitro Phenylaminododecanoyl) -glycerol racemate Similar to the method of Example 1, 1-oleyl-glycerol racemate was converted to 1-oleyl. Useful for the preparation of yl-3-O-tritylglycerol, which is pyrendodecano 1-oleyl-2-pyrenedodecanoyl-3-O-trityl by acid anhydride -Converted to racemic glycerol. Boron trifluoride ether solution (50%) In the presence of this diacyltrityl glycerol (200 mg, 209.8 μmol) Trinitrophenylaminododecanonic anhydride (525.5 mg, 629.4) μmol) conversion is 1-oleyl-2-pyrendodecanoyl-3- (2 ', 4 ', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) -glycerol racemate (122.1 mg, 109.1 μmol, yield 52%) is donated. TLC: Rf = 0.75 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 8 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) -2-pyre N-decanoyl-3-oleyl-sn-Glycerol Similar to the method of Example 7, 3-oleyl-sn-Glycerol is Rail Trityl-sn1-O-trityl-2-pyrendone with glycerol Decanoyl-3-oleyl-sn-Converted to glycerol, trinitropheny In the presence of boron trifluoride ether solution together with luaminododecanonic anhydride, A final product is produced (yield 50%). TLC: Rf = 0.75 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 9 1-oleyl-2-pyrendodecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitro Phenylaminododecanoyl) -sn-glycerol Similar to the method of Example 8, 1-oleyl-2-pyrendodecanoyl-3-O- Trityl-sn-Glycerol is converted to the final product (yield 56%). T LC: Rf = 0.75 (petroleum ether / chloroform 1: 4). Example 10 1-pyrenedecanoyl-2-O-hexadecyl-3- (2 ', 4', 6'-tri Nitrophenylaminododecanoyl) -glycerol racemate 2-O-hexadecylglycerol ((Hermetter & Paltaf in Etherlipids; Biochemical and Biom- edited by H. Mangold & F. Paltauf ), Academic Press, 1983, p. 389))) (100 mg 315 μmol) is dimethylaminopyridine (85.5 mg, 100 μmol) And 5 ml CHCl_ThreeMedium dicyclohexylcarbodiimide (75 mg, 35 Acylated by pyrenedecanoic acid in the presence of 0 μmol) (acylation description; F . Paltaf & A. Hermetter, Methods in Enzy m 197, 1991, 134). 1-pyrenedecanoyl-2 produced -O-hexadecyl-glycerol racemate was subjected to silica gel chromatography. Done (gradient elution with petroleum ether and ether). Pure product yields Obtained in 87% (146 mg). Silica gel TLC; Rf = 0.40 (chloro Form / acetone / glacial acetic acid 96: 4: 1). This acylalkyl glycerol (146 mg, 188 μmol) then trinitrophenylaminododecanonic acid (100 mg; 230 μmol) gives 52 mg of dimethylaminopyridine ( 423 μmol) and 42 mg of dicyclohexylcarbo in 5 ml of chloroform. Acylation was performed in the presence of diimide (200 μmol). Generated 1-pyrenedecanoy Le-2-O-hexadecyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylami Nododecanoyl) -glycerol racemate was purified on silica gel (petroleum ether Elution with silica gel and ether (silica gel, chloroform / acetone / ice vinegar) Acid 96: 4: 1) (137 mg, 68% yield). TLC; Rf = 0.80 Example 11 1-tetradecanooylamino-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6 '-Trinitrophenylaminododecanoyl) -propanediol This synthesis is based on 1-tetradecanoylamino-3-O-cylytylpropanedio It is based on the racemic form, which is described in the literature (R. Dijkman, N. Dekk. er, and G.E. H. Haas, Biochem. Biophys. Acta, 1043, 1990, 67-74). Acyl trityl Esterification of propynediol with pyrenedecanoyl acid to give 1-tetradecanoic acid Inoramino-2-pyrenedecanoyl-3-O-tritylpropanediol racemic A mi body was obtained (similar method used for acylation of alkyl cylytyl glycerol) Adapted. Hermtter & Paltaf in Etherlip ids; Biochemical and Biomedical Aspec ts (edited by H. Mangold & F. Paltauf), Academic Press, 1983, p. 389). Similar to the method described in Example 1, Trini By exchanging the trityl group with trophenylaminododecanoyl anhydride, 15 3.3 mg (177.6 μmol, 62% yield) of the final product was added to this compound (2 00 mg, 286.5 μmol). TLC; Rf = 0.70 (petroleum ether / chloroform 1: 4) Example 12 9 nanomoles (9 μg) of 1-O-hexadecyl-2-pi in 30 μl of ethanol Rendecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecano Yl) -sn-glycerol (Example 1) solution with a jet as thin as possible 9 nanomolar (0.6 mg) bovine in 10 mM Tri / HCl pH 7.4 Hamilton Silane at room temperature in a solution of serum albumin (BSA) Pour with stirring by fringe. BSA Trigly obtained in this way 3 ml of the celide complex solution was added to 40 μl of a lipase sample (lipoprotein lipase). Mix). Then, by increasing the time-dependent fluorescence intensity at 380 nm The reaction is observed by fluorometer at 37 ° C. (excitation 342 nm; Slit width; excitation 10 nm emission 10 nm). The lipase activity of the sample was Moles (pmoles) / test volume / unit time (here 2.1 picomoles / ml / Min), the slope of the fluorescence intensity (Fig. 1) and the known concentration in the albumin aqueous solution. Of hexadecylpyrenedecanoyltritylglycerol (HPTG) It is determined by the obtained calibration curve (Fig. 2). The calculated lipase activity is the enzyme used It has a linear relationship with the amount (μg) (FIG. 3). Example 13 As described in Example 12, 1 μg (milk-derived) lipoprotein lipase activity With BSA and 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecano Yl) -2-pyrenedecanoyl-3-O-hexadecyl-sn-Glycerol ( 52.3 pmol / ml / min measured with albumin-substrate complex of Example 2) Obtained. Example 14 As described in Example 12, 1 μg (milk-derived) lipoprotein lipase activity With BSA and 1-O-dodecyl-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4'. , 6'-trinitrophenylaminododecanoyl)-sn-Glycerol (implemented The albumin-substrate complex of Example 3) was measured to obtain 6 picomoles / ml / min. Example 15 As described in Example 12, 1 μg (milk-derived) lipoprotein lipase activity With BSA and 1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecano Yl) -2-pyrenedecanoyl-3-O-dodecyl-sn-Glycerol (implemented Measured with the albumin-triglyceride complex of Example 4), 150 pmol / ml / Got a minute. Example 16 Various complexed proteins for fluorogenic substrates of lipoprotein lipase It was used and the results shown in Table 1 were obtained. Protein and 1-O-hexadeci Le-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylami Nododecanoyl)-sn-Glycerol complex with the proteins listed in the table above Was prepared according to Example 12. The described proteins were purchased (BSA; Boehringer Mannh eim GmbH; others from Sigma). Lipoprotein lipase activity was measured as described in Example 12. Example 17 For various lipases, the activity that depends linearly on the enzyme concentration is shown as 1-O-dodecane. Syl-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-trinitrophenyla Minododecanoyl)-sn-Determined by glycerol and BSA complex did. Preparation of the complex, measurement of activity and evaluation were carried out as described in Example 12. gave. Esterase from porcine liver and phospholipase A from porcine pancreas₂(With both By Boehringer Mannheim), no activity observed Was not done. The following lipases showed significant activity; porcine pancreatic lipase (PL) (Boe from human mannheim GmbH), human serum and milk And human serum and breast milk derived lipoprotein lipase (LPL);Crom oberium viscosum, Candida rugosa, R hizopus arrhizus, Pseudomonas Species (Nagase Biochemical Co., Ltd. ,Japan),Geotrichum candidumDerived microbial lipase. Example 18 The effect of salt and detergent on the lipase activity of lipoprotein lipase was measured. Specified. Complexes used: Prepared and compounded as described in Example 17. Lipoprotein lipase used: LPL derived from milk. The results are shown in Table 2. Example 19 As described in Example 13, the activity of 20 μl each of human plasma was measured with The measurement was performed before and after the addition of phosphorus (60 U / kg body weight; blood collection after 25 minutes). Serum lipase activity before heparin addition Slight or no activity Serum lipase activity after addition of heparin 60 pmol / ml / min. Example 20 Calf serum albumin obtained in Example 12 in aqueous medium and with a fluorogenic substrate The complex consisting of benzene is frozen at -75 ° C and then freeze-dried. Example 21 The lyophilized culture was treated with albumin and a fluorogenic substrate as described in Example 20. From 10 mM HEPES, pH 7.4 (pH is NaO 25 mg of glycogen in 3 ml was used. Example 22 The lyophilized culture was treated with albumin and a fluorogenic substrate as described in Example 20. Prepared from 3 ml of 10 mM Na-phosphate buffer, pH 7 as an aqueous medium. . 25 mg of sucrose in 4 was used. Example 23 The lyophilized culture was treated with albumin and a fluorogenic substrate as described in Example 20. Prepared from 3 ml of PBS (H₂KCl 2 in 1 liter of O g, KH₂PO_Four 2 g, NaCl 80 g and NA₂HPO_Four・ H₂O 21. 6 g), 25 mg of starch in pH 7.4 was used. Example 24 Lyophilized cultures prepared in Examples 20-23 were treated with 9 ml H 2₂O_dist(distillation Dissolved in water). Aliquots of 3 ml each were subjected to LPL activity as described in Example 11. Used for measurement. The results are shown in Table 3.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者パルタオフ，フリッツオーストリー国エイ―8042 グラッツセントペーテルフプストラーセ 29ビー／▲ＩＩＩ▼────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Partaof, Fritz Country of Austria A-8042 Gratz St. Peter Hupstrace 29 Bi ー／ ▲ III ▼

Claims

[Claims] 1. General formula Racemic and enantiomeric forms of Where R₁, R₂And R_ThreeIs a double bond having 0 to 6 double bonds or Represents an alkyl or alkenyl chain having 26 C elements, wherein X, Y and Z are , -S-, -O-, -NH- or -CH₂-Also indicates that A, B, C Containing one fluorophore and another residue R as a photon sensor₁, R₂Or R_ThreeGaku It contains an encher and all of the above chromogenic and fluorogenic substituents are Cthul overlaps with the emission spectrum of the fluorophore used as a molecular light sensor. Therefore, they are the resonance energy for the sensor fluorophore (RET donor). -Can be a quencher considered as a transfer (RET) acceptor Racemic and enantiomers, characterized in that 2. The fluorescent group used is pyrene, perylene, anthryl, anthraniloyl. , Salicyloyl, tetracene, anthracene, phenanthrene, naphthalene, c Malon, coumarin, acridine, aminonaphtholsulfonic acid, phenyloxa Diazole, diphenyloxazole, alloxazine, stilbene, dibenzopi Rhone, fluorene, fluorenone, p-quinone, methylumbelliferone, tri Nitrophenylamine, phenazine, phenylindole, quinoline, dipheni Luacetylene, benzothiophene, cyanothiocarbonyl, 1,3,5,7-de Cattetraene, rhodamine, diphenylhexatriene, dansyl, 7-nitro Benz-2-oxa-1,3-diazole (NBD), benzocarbazone, dibe Nzofuran, parinaric acid, 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-dia The compound according to claim 1, which is The-5-indacene. Stuff. 3. The quenching group used is trinitrophenylamine or pyrene, Perylene, anthryl, anthraniloyl, salicyloyl, tetracene, ant Spiral, phenanthrene, naphthalene, coumarone, coumarin, acridine, ami Nonnaphtholsulfonic acid, phenyloxadiazole, diphenyloxazole , Alloxazine, stilbene, dibenzopyrone, fluorene, fluorenone, p -Quinone, methylumbelliferone, phenazine, phenylindole, quinoli Amine, diphenylacetylene, benzothiophene, cyanothiocarbonyl, 1,3 5,7-decatetraene, rhodamine, diphenylhexatriene, dansyl , 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD), benzocal Bazon, dibenzofuran, parinaric acid, 4,4-difluoro-4-bora-3a 4a-diaza-5-indacene, the absorption spectrum of which is defined in claim 1. 3. A compound according to claim 1 or 2, characterized in that it must meet the conditions of Stuff. 4. O-alkyl-diacyl-glycerol, di-, according to claims 1, 2 and 3. -O-alkyl-acyl-glycerol and triacyl-glycerol racemates Mi body and mirror image body. 5. Racemic and enantiomeric forms of the compounds of claims 1, 2 and 3, wherein This is the formula A racemate and an enantiomer of the above compound, comprising: 6.1-O-dodecyl-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-tri Nitrophenylamino dodecanoyl)-sn-Glycerol. 7.1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminodecanoyl) -2-pi Rendecanoyl-3-O-dodecyl-sn-Glycerol. 8.1-O-tetradecyl-2-O-pyrenedecyl-3- (2 ', 4', 6'- Trinitrophenylaminohexanoyl)-sn-Glycerol. 9.1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminohexanoyl) -2- O-pyrenedecyl-3-O-tetradecyl-sn-Glycerol. 10.1-oleyl-2-pyrendodecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-tri Nitrophenylaminododecanoyl) -glycerol racemate. 11.1- (2 ', 4', 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) -2 -Pyrendodecanoyl-3-oleyl-sn-Glycerol. 12.1-oleyl-2-pyrendodecanoyl-3- (2 ', 4', 6'-to Linitrophenylamino dodecanoyl)-sn-Glycerol. 13.1-Pyrendodecanoyl-2-O-hexadecyl-3- (2 ', 4', 6 '-Trinitrophenylaminododecanoyl) -glycerol racemate. 14.1-Tetradecanoylamino-2-pyrenedecanoyl-3- (2 ', 4' , 6'-trinitrophenylaminododecanoyl) -propanediol racemate . 15. An alkylacyl, a dialkyl according to claim 1, 2, 3 and 4 and Racemic and enantiomeric forms of diacyltritylglycerol, which have the formula: Including Raziru part R₁Or R₂Contains a fluorophore and another rasil moiety R₂ Or R₁Containing a quencher as a covalent bond And an enantiomer. 16. Prepare triacyl, alkyldiacyl and dialkylacyl glycerol A method for producing a corresponding alkylacyl trityl glycerol, dialky In rutrityl glycerol or diacyl trityl glycerol, Trityl group of boron trifluoride ether solution as catalyst in one-step reaction A method characterized by being substituted by an acyl group in the presence. 17． Novel mirror image triglyceride analog, 1-O-hexadecyl-2-pyrende Canoyl-3-trinitrophenylaminododecanoyl-sn-Glycerol, 1-O-hexadecyl-2-pyrenedecyl-3-trinitrophenylaminodode Canoesn-Glycerol and 1-O-hexadecanoyl-2-pyrenede Canoyl-3-trinitrophenylaminododecanoyl-sn-Glycerol A method for the preparation of a corresponding alkylacyl trityl glycerol, dial In quiltolytyl glycerol or diacyl trityl glycerol, The trityl group is a boron trifluoride ether solution as a catalyst in a one-step reaction. Substituted by an acyl group in the presence of 18. Water-soluble complex of the fluorescence-source compound according to any one of claims 1 to 15. Wherein the fluorescent lipid is a water-soluble lipid-binding protein, preferably bovine serum albumin. Bumin, human serum albumin, ovalbumin, lactalbumin, casein, a Modified proteins solubilized by polypoproteins or in aqueous solution Protein acylation, alkylation, hydroxymethylation, carboxymethylation or Is a water-soluble complex which is solubilized by carboxylation. 19. A lyophilized culture of the water-soluble lipid-protein complex according to claim 18. 20. Mirror image triglyceride analog, 1-O-hexadecyl-2-pyrenedecano Ile-3-trinitrophenylaminododecanoyl-sn-Glycerol, 1- O-hexadecyl-2-pyrenedecyl-3-trinitrophenylaminododecano Ill-sn-Glycerol and 1-O-hexadecanoyl-2-pyrenedecano Ile-3-trinitrophenylaminododecanoyl-sn-Water soluble glycerol Complex, wherein these lipids are water-soluble lipid-binding proteins, preferably Serum albumin, human serum albumin, ovalbumin, lactalbumin, Solubilized by zein, apolipoprotein, or Acylation, alkylation, and hydroxymethylation of modified proteins in aqueous solution Characterized by being solubilized by carboxymethylation or carboxylation Water-soluble complex. 21. A lyophilized culture of the water-soluble lipid-protein complex according to claim 20. 22. Additives, preferably starch, glycogen, organic and inorganic salts, sucrose The lyophilized culture according to claims 19 and 21, which is prepared in the presence of 23. 21. A fluorometric method for lipase activity, which comprises the fluorescence according to claims 18 and 20. 22. A complex of a native substrate and a water-soluble protein or freezing according to claims 19 and 21. Subjecting a solution of the dry culture in an aqueous buffer to a lipolytic enzyme, and Preferably, the enzymatic activity of the sensor fluorophore depends on the change in the fluorescence parameter. A fluorometric method characterized by being measured by an increase in fluorescence intensity. 24. Fluorescence assay for lipase activity, which includes phospholipid liposomes, vesicles, detergents In micelles or emulsions, solutions of organic solvents or mixtures of organic solvents with water The solubilized compound according to any one of claims 1 to 15 is used for lipase. And the enzymatic activity is preferably pre-determined by changes in fluorescence parameters. Fluorescence measurement characterized by being measured by an increase in fluorescence intensity of the sensor fluorophore Law. 25. In the presence of medical conditions such as tumor, steatosis, hyperlipidemia, alcoholism, hepatitis, pancreatitis For healthy and healthy donors, after or without heparin addition to the donor For clinical lipase analysis, preferably in human serum, plasma and adipose tissue Lipase in case of biotechnology lipase production in medical diagnosis For the analysis of lipase from animals, vegetables and microbial materials as well as chemical and And screening for lipases modified or produced by genetic technology. In the case of nutritional science and food chemistry research, lipase and lipase inhibition are preferred. Use of the measuring method according to claim 23 or 24 for screening agents. 26. A method for screening the stereospecificity of lipase, wherein the activity of lipase is A method according to any one of claims 1 to 15 using the method according to claim 22 or 23. A screen characterized by being measured by both enantiomers of the described fluorogenic compound. Learning method. 27. Measurement of lipase activity, especially lipoprotein lipase, liver and pancreatic lipase Kit, lipase as positive control, in particular lipoprotein lipase, liver And / or pancreatic lipase, and 1 according to any one of claims 1 to 15. A kit comprising at least one compound and a conventional excipient.