JPH09501418A

JPH09501418A - Stabilization of aerosolized proteins

Info

Publication number: JPH09501418A
Application number: JP7505271A
Authority: JP
Inventors: 力荒川; ニーブン，ラルフ・ダブリユ; プレストレスキー，ステイーブン・ジエイ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 1997-02-10
Also published as: NO960217L; FI960253L; FI960253A0; AU691514B2; NO960217D0; FI960253A7; NZ271181A; EP0710102A1; WO1995003034A1; CA2167538A1; AU7473294A

Abstract

(57)【要約】本発明は、エアゾール化によって誘発されるタンパク質活性の分解や損失からタンパク質を保護する方法を提供する。エアゾール化タンパク質は、エアゾール化する前にポリエチレングリコールのような水溶性極性有機化合物又は界面活性剤を水溶液に添加することにより安定化される。本発明は更に、極性有機化合物又は界面活性剤を含む安定化したタンパク質水溶液、及び安定化したタンパク質含有水溶液をエアゾール化するためのシステムを提供する。 (57) [Summary] The present invention provides methods of protecting proteins from aerosolization-induced degradation or loss of protein activity. Aerosolized proteins are stabilized by adding a water soluble polar organic compound such as polyethylene glycol or a surfactant to the aqueous solution prior to aerosolization. The present invention further provides a stabilized aqueous protein solution comprising a polar organic compound or a surfactant and a system for aerosolizing a stabilized aqueous protein-containing solution.

Description

【発明の詳細な説明】エアゾル化タンパク質の安定化発明の背景エアゾル化は重要な薬物送達方法である。エアゾル化された薬物は患者によって吸入され、その結果患者の肺と接触する。肺内の気道が吸着のための大きい表面積を提供するので、エアゾル化は薬物（例えば気管支拡張薬その他の抗喘息薬）の局所送達のみでなく全身投与にも有用である。実際、エアゾル化は、タンパク質を含めた或る種の薬物の非侵襲的全身投与のための好ましい方法であると考えられる。通常、エアゾル粒子の大きさを調節して、粒子を肺の狭小な気道及び肺胞に到達させる（全身投与に必要）か、それとも呼吸道全体に送達する（局所送達）かを制御する。エアゾル化薬物は、乾燥微粒子、または薬物を含有する水性もしくは非水性溶液を気体媒質中に分散させることによって得る。乾燥微粒子の場合は粒子を噴射剤中に懸濁させ、噴射剤は懸濁液が加圧装置から空中へ放出された後蒸発する。あるいは他の場合には、乾燥微粒子は乾燥散剤吸入装置から直接エアゾル化し得る。薬物を水溶液からエアゾル化する場合は薬物溶液を、微小な水滴から成る細かい霧に変換する。薬物のエアゾル化送達は一回計量薬量で、または連続送達によって行ない得る。エアゾル化薬物の計量薬量送達のための一手段に、計量薬量吸入器（ＭＤＩ）と呼称される装置が有る。作動時、ＭＤＩは微細粒子の懸濁液を加圧容器から分散させる。患者は吸入器の作動と同時に吸入し、こうしてエアゾル化された薬物を患者自身の肺と接触させる。きわめて典型的には、ＭＤＩによって送達される薬物は乾燥微粒子からエアゾル化されるが、水溶液からエアゾル化された薬物を一回計量薬量で送達することも可能である。ＭＤＩの使用には、幼児、老人及び虚弱者など、或る種の患者にはあまり期待できない或る程度の調整及び技術が必要である。加えて、ＭＤＩで用いるべく容易に配合可能な薬物の数は限られている。従って、エアゾル化薬物は連続送達することがしばしば好ましい。エアゾル化薬物を連続送達する最も普通の方法はネブライザーによるものであり、ネブライザーによって薬物を投与された患者は薬物を長期にわたって、通常の呼吸を介して吸入する。長期にわたる投与に必要な連続流を創出するべく、薬物の水溶液はネブライザー内で連続的に霧状に変換され、その際所与の時点に患者への送達のためにネブライザーを直接離れる霧状水溶液は少量（約１％）でしかない。ネブライザーから出てゆかなかった霧状水溶液はネブライザーの壁またはバッフルに衝突して、ネブライザー底部に位置する流体容器へと流れ戻り、ここで再び霧状にエアゾル化され、この一連の作業は容器が空となるまで、または別の理由で薬物投与が終了するまで繰り返される。気管支拡張薬、コルチコステロイド、抗生物質、抗ヒスタミン薬及び粘液破壊薬などのエアゾル化薬物の計量薬量送達及び連続流送達はいずれも多年にわたり広く用いられている。最近では、分子生物学の進歩によって、成長因子及びサイトカインなどのタンパク質ベース薬物が幾つか開発され、これらの薬物は、例えばヨーロッパ特許出願公開第０２５７９５６号に開示されているようにエアゾル化送達向きであることが示唆されている。先に言及したように、エアゾル化は、タンパク質分解酵素に対する不安定性などの障害に起因して経口では送達できないタンパク質のための好ましい代替送達方法であると看做される。しかし、タンパク質のエアゾル化送達は、タンパク質がより以前からの薬物に比べて脆弱な性質を有するために新たな困難をもたらす。或る種のタンパク質のエアゾル化送達に伴う潜在的問題点は、タンパク質分子の四次構造、更には二次及び三次構造もが有する脆弱な性質に有り、前記のような構造は破壊されるとタンパク質の凝集及び分解を招き、その結果生物活性が失われる。大面積の気−水界面の形成などのエアゾル化に固有の物理的圧力は、多くのタンパク質の構造を不安定にする。この問題は、水溶液中の薬物の約９９％が患者への送達前に還流され、即ち２回以上水溶液からエアゾル化される連続流送達ではより重大となる。薬物溶液の上記還流はタンパク質に、各エアゾル化サイクルの度に追加の物理的圧力を及ぼす。本発明は、水溶液からエアゾル化したタンパク質の活性損失並びに分解及び／または凝集を防止する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、エアゾル化の際のタンパク質の分解、凝集及び活性損失に対して耐性である安定なタンパク質含有水溶液の提供も目的とする。発明の概要本発明は、水溶液からエアゾル化するタンパク質を安定にする方法を提供する。エアゾル化タンパク質の安定化は、ポリエチレングリコールなどの水溶性極性有機化合物、または界面活性剤をエアゾル化前の水溶液に添加することによって行なう。本発明は、極性有機化合物または界面活性剤を含有する安定なタンパク質水溶液、及び安定なタンパク質含有水溶液をエアゾル化するシステムも提供する。図面の簡単な説明図１はＬＤＨの初期活性分率（初期活性に対する比率）をエアゾル化時間に対してプロットしたグラフである。図２はＰＥＧ含有水溶液及びＰＥＧ無含有水溶液（“対照”）からエアゾル化したＧ−ＣＳＦを示す非変性電気泳動ゲルである。図３は１％ＰＥＧ含有水溶液及びＰＥＧ無含有水溶液（“対照”）からエアゾル化したＧ−ＣＳＦの分解率をエアゾル化時間に対してプロットしたグラフである。図４はＰＥＧ含有水溶液及びＰＥＧ無含有水溶液（“対照”）からエアゾル化したＧ−ＣＳＦを示すＳＤＳ電気泳動ゲルである。図５はＰＥＧ含有水溶液及びＰＥＧ無含有水溶液（“対照”）からエアゾル化したＬＤＨの初期活性分率をエアゾル化時間に対してプロットしたグラフである。図６はＰＥＧを様々な濃度で含有する水溶液及びＰＥＧ無含有水溶液（“対照 ”）からエアゾル化したＬＤＨの初期活性分率をエアゾル化時間に対してプロットしたグラフである。図７Ａは濃度０．００１％のＰＥＧの異なる分子量がエアゾル化時のＧ−ＣＳＦの安定化に及ぼす影響を示すグラフである。図７Ｂは濃度１％のＰＥＧの異なる分子量がエアゾル化時のＧ−ＣＳＦの安定化に及ぼす影響を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、エアゾル化によって惹起される分解、凝集及び／またはタンパク質活性の損失からタンパク質を保護する方法を提供する。本発明は、エアゾル化したタンパク質ベース薬物の患者への肺送達を含めた、タンパク質のエアゾル化が望まれる任意の状況において用い得る。先に指摘したように、本発明は、エアゾル化の際のタンパク質の分解、凝集及び／または活性損失に対して耐性である安定なタンパク質含有水溶液、及び安定なタンパク質含有水溶液をエアゾル化するシステムも提供する。ほとんどの場合、安定なタンパク質含有水溶液をエアゾル化するシステムはエアゾル化した薬物の患者への肺投与において用いる。本発明の教示によれば、タンパク質を含有する水溶液に極性有機化合物または界面活性剤を添加することによってエアゾル化タンパク質をエアゾル化の際の活性損失、分解及び／または凝集から保護する。本発明の理解の一助となるように、本明細書中に用いた語を次のように定義する。 “極性有機化合物”という語は、分子の不定領域に適当な非極性部分を有する（即ち非極性部分が局在しない）有機化合物を意味する。極性有機化合物は水の表面張力を減少させ得る。ミセルを形成しがちである界面活性剤とは異なり、極性有機化合物はミセルを形成することなく水と完全に混和し得る。 “界面活性剤”という語は、極性部分と強度に非極性の部分との両方を有する化合物であって、前記各部分を分子上の別の局在領域に、当該界面活性剤が二つの非混和性相間の界面張力を界面での分子整列によって減少させ得、かつミセルを形成し得るように保有する化合物を意味する。界面活性剤では極性部分及び非極性部分が局在するので、界面活性剤化合物は極性有機化合物よりはるかに大幅に水の表面張力を減少させる。 “タンパク質”という語は、本発明の水溶液中に分散する任意のタンパク質を意味する。通常、このタンパク質は、吸入療法に用いられる治療用タンパク質である。タンパク質は化学的に合成しても天然源から精製してもよいが、典型的には天然タンパク質の組み換え体とする。普通はタンパク質分子への化学部分（残基）の共有結合によってタンパク質を化学的に改質し、それによってタンパク質の治療効果を長引かせるなど、該効果の向上を図ることも可能である。先に指摘したように、タンパク質のエアゾル化はタンパク質活性の経時損失を招きかねない。エアゾル化は、エアゾル化の過程で創出される大量の気−水界面を含めた幾つかの要因に起因してタンパク質の安定性に悪影響を及ぼす。エアゾル化によるタンパク質活性損失の程度は、特定タンパク質の構造及び安定性並びに用いるエアゾル化手段次第でタンパク質毎に様々となる。タンパク質を噴射式ネブライザーによって連続的にエアゾル化する場合、タンパク質と、エアゾル化過程で創出される気−水界面との相互作用に加えて、ジェットの空気圧に由来する剪断応力がタンパク質を破壊する。乾燥によってもタンパク質が変性する恐れが有り、なぜならタンパク質は蒸発する液滴中に濃縮されるからである。即ち、噴射式ネブライザーを用いるエアゾル化による活性損失の程度はジェットの空気圧と、容器内の水溶液の初期体積との両方に関連する。タンパク質を超音波ネブライザーでエアゾル化する場合は、同じ形態の剪断応力は存在しないが、超音波が別の形（例えば加熱）でタンパク質を変性させる恐れが有る。総てのタンパク質がエアゾル化の際に分解、凝集及び／または活性損失を被るわけではない。例えば、分泌ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）及びα１− アンチトリプシンはエアゾル化の際の分解に耐性であると報告されている。ＭｃＥｌｖａｎｅｙ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，ｐｐ．１２９６−１３０１，１９９２（ＳＬＰＩ）；Ｈｕｂｂａｒｄ等、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１（３），ｐｐ．２０６−２１２，１９８９（α１−アンチトリプシン）。幾つかのタンパク質はエアゾル化の際、エアゾル化の間存在する応力を被りやすいかどうかに応じて一部または全部が分解する。ごく一般的には、エアゾル化はタンパク質の部分的分解を惹起する。この部分的分解は治療薬としてのタンパク質の有効利用を妨げないが、該分解によって有効レベルの薬物の投与に、タンパク質をその完全な活性形態で送達した場合よりも大量のタンパク質が必要となる。凝集したタンパク質の免疫原性が生物活性形態のものとは異なる、即ちエアゾル化薬物を投与された患者から免疫応答が引き出される恐れも有る。タンパク質がエアゾル化の際に活性を失い、また分解及び／または凝集する正確な機構は未知である。薬物の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含有する水溶液の分析によって、Ｇ−ＣＳＦ自体がエアゾル化前にも水の表面張力を減少させることが証明されたが、このことは該タンパク質の気−水界面における配向を示している。（４ｍｇ／ｍｌの濃度においてＧ−ＣＳＦの水溶液の表面張力は、水の７２に対し４８と測定された）。典型的には、水溶液中で気−水界面にタンパク質が吸着されると、タンパク質の疎水性領域を非極性気相に対して曝露する少なくとも部分的なタンパク質の広がり（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）が生じる。Ｇ−ＣＳＦの水溶液の分析から上記時点（即ちエアゾル化前）におけるタンパク質の均質性が証明され、タンパク質は非変性電気泳動ゲル上に単一バンドとして現われ、凝集の証左は見出されなかった。このことは、エアゾル化前のＧ−ＣＳＦの表面吸着はおそらく可逆的な過程であろうことを示している。しかし、エアゾル化の際、Ｇ−ＣＳＦは不可逆的に変性し、従って凝集、化学分解、またはこの両方を被ることが観察された。Ｇ−ＣＳＦは、白血球数を増加させる強力な顆粒球系統成長因子である。上記活性ゆえに、Ｇ−ＣＳＦは感染性疾患を含めた幾つかの疾患及び状態の治療に有利に臨床適用される。現在市販されているＧ−ＣＳＦ投与手段は専ら静脈内注射用であるが、動物では肺投与の有効性が証明されている。（国際特許出願公開第９２／１６１９２号）。しかし、判明しているエアゾル化の際のタンパク質の凝集、分解及び活性損失に起因して、エアゾル化されたＧ−ＣＳＦの多くは共有及び非共有結合ダイマー並びにより高分子量の凝集物その他の分解形態などの不活性形態で患者に到達することが予測され得る。特に、酸性ｐＨのＧ−ＣＳＦの４ｍｇ／ｍｌ溶液を噴霧化する試みが為された。この処理の際、タンパク質は凝集と分解との両方の形態の損傷を受けたと考えられた。前記のような損傷はいずれも噴霧化の長さと共に増大した。驚くべきことに、本発明の教示に従い、エアゾル化するタンパク質を含有する水溶液に先に定義したような極性有機化合物または界面活性剤を添加したところ、エアゾル化タンパク質の分解に対する顕著な安定化が観察された。この顕著な安定性は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）酵素と先に述べたＧ−ＣＳＦとの両方に関して証明された。エアゾル化タンパク質に対する保護作用を有することが判明した好ましい極性有機化合物には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びメチルペンタンジオール（ＭＰＤ）が含まれる。極性有機化合物がＰＥＧであればなお好ましい。極性有機化合物はＰＥＧ１０００（即ち平均分子量１０００のＰＥＧ）であることが最も好ましいが他の分子量のＰＥＧも有効である。ただし、低めの分子量のＰＥＧであれば、エアゾル化タンパク質を好ましく保護するにはより高い濃度で用いなければならない。好ましい界面活性剤はＴｗｅｅｎ８０である。ポリエチレングリコールがタンパク質を安定化させる能力を有することは知られていない。実際、ＰＥＧは、その疎水性が弱いためにタンパク質を不安定化させるとして公知である。ＡｒａｋａｗａおよびＴｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４（２４），６７５６−６７６２（１９８５）参照。この化合物が、その排除体積が高いためにタンパク質を塩析させることも公知である。上記文献参照。機能上、ＰＥＧは立体排除の原理にしたがってタンパク質の表面から強く排除される。ＰＥＧと表面からＰＥＧが排除されたタンパク質との熱力学的に好ましくない相互作用により、タンパク質の溶解度が低下する。その結果、ＰＥＧはタンパク質を不安定化させてＧ−ＣＳＦのようなタンパク質の溶解度を低下させ、これによりタンパク質の凝集が促進するものと予測される。しかしながら、上記したように、ＰＥＧが水溶液から噴霧化（ムネブライザーション）している間ＬＤＨおよびＧ−ＣＳＦを安定化させることが知見された。これは、ＰＥＧ分子の非局在化した極性と非極性領域により形成される両親媒性単位が繰り返し存在することに起因していると考えられる。実際、ＳＤＳやＴｗｅｅｎのような一般的な界面活性剤ほどではないが、ＰＥＧは水の表面張力を低下させる。したがって、ＰＥＧは空気−水界面で吸着され、Ｇ −ＣＳＦのようなタンパク質が表面に接近するのを排除し得る。他の極性有機化合物もエアゾル化中にタンパク質を保護するが、そのメカニズムは、これらの極性有機化合物の表面張力を低下させる能力が低いことに関連していると考えられる。ＰＥＧにより与えられる保護はＭＰＤで実証されるように濃度に依存する。他の極性化合物により与えられる保護効果も同様に濃度に依存し（ただし、分解および活性低下を防止するのに最適な濃度は極性有機化合物の種類により異なる）、エアゾル化されるタンパク質にも依存すると予測される。所与のタンパク質と組み合わされる極性有機化合物の最適濃度は、本発明の教示にしたがって当業者ならば容易に決定し得る。例えば、水の表面張力を約６５ダイン／cm²以下に低下させるのに十分な濃度で極性有機化合物を使用することが好ましい。ＭＰＤの場合、水の表面張力を約４８ダイン／cm²以下に低下させることができる濃度で極性有機化合物を使用することがより好ましい。本発明で使用することが意図される極性有機化合物は、水溶液からタンパク質をエアゾル化すると生ずるタンパク質の表面凝集を低下もしくは防止すると教示されてきた表面張力低下剤として公知のある種の界面活性剤活性剤と対比されるべきである。これらの界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類やアルコール類のような慣用の界面活性剤およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類が挙げられ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが特に好ましい界面活性剤である。ＷＯ９２／１６１９２を参照されたい。これらの界面活性剤は水溶液からＧ−ＣＳＦをエアゾル化させるのに不要であると結論づけられていることは興味深い。上記文献参照。Ｔｗｅｅｎのような界面活性剤は表面張力を低下させることができ、実際その程度は本発明を実施する際に使用されるＰＥＧや他の極性有機化合物よりも有意に高い。しかしながら、本発明で教示される極性有機化合物とは異なり、界面活性剤（特にカチオン性界面活性剤）はミセルを形成しタンパク質を不安定化させる。その原因のひとつとして、カチオン性界面活性剤は表面張力を低下させるものの、タンパク質、特にミセル形態のタンパク質と強く結合してその溶解度に変化が生ずることが挙げられる。さらに、界面活性剤が発泡性を有していることもしばしば、これらの化合物のもつ表面張力低下作用をエアジェット噴霧化に利用しにくくしている。しかしながら、ときにはタンパク質を分解から安定化させるのに界面活性剤を使用することが好ましい。界面活性剤をこの目的で使用するとき、水の表面張力を約４０ダイン／cm²以下に低下させるのに十分な濃度で界面活性剤を使用することが好ましい。本発明で意図される極性有機化合物は、タンパク質に結合したりタンパク質を不安定化させることなく、表面張力を低下させることができるという利点を有している。また、ＰＥＧの場合、水溶液中でＰＥＧがランダムなコイルを形成し、低分子量のＰＥＧが占有している場合でも高い流体力学的容量を有していることから、タンパク質が噴霧化中に生ずる空気界面に到達することができなくなり得る。本発明を実施する際には、水溶液からエアゾル化するのが望ましい各種タンパク質が使用され得る。最も典型的には、本発明によるタンパク質のエアゾル化は治療上有用なタンパク質を肺に送達させるためである。意図されるタンパク質の例としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１のような各種造血因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１やＩＬ−１２のようなインターロイキン類、ＩＧＦ類、Ｍ−ＣＳＦ、チモシン、ＴＮＦおよびＬＩＦを含めたサイトカイン類が挙げられる。使用し得る他の治療効果を有するタンパク質には、インターフェロン類（アルファ−、ベータ−、ガンマ−または共通インターフェロン）、成長因子またはホルモン、たとえばヒト成長ホルモンまたは（ウシ、ブタまたはニワトリ成長因子のような）他の動物成長ホルモン、ＥＴ−１、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ等が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、たとえば（ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２または他のプロテイナーゼ阻害剤のような）メタロプロテイナーゼ阻害剤も使用される。ＢＤＮＦやＮＴ３のような神経成長因子も使用される。ｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子も使用される。親タンパク質の主構造のすべてもしくは一部を有しており且つ親タンパク質の生物学的諸性質の少なくとも一部を有しているタンパク質のペプチド部分も使用される。アナログ、たとえば置換または欠失アナログ、あるいはペプチド類似物のような改変アミノ酸を含むものも使用される。本発明を実施する際には、水溶液からエアゾル化された治療物質を肺に送達させるための当業界で既知の各種装置または器具が使用され、ネブライザーや計量薬量吸入器具に限定されない。しかしながら、タンパク質を連続エアゾル化したときには通常かなり分解されることを経験していることから、本発明の最大の効果はネブライザーのような器具を用いてタンパク質を連続的に噴霧化したときにみられる。本発明を実施するのに適当な市販の装置をいくつか例示すると、ＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔＩｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー、ＭａｒｑｕｅｓｔＭｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）製Ａｃｏｒｎ IIネブライザー、ＢＧＩ，Ｉｎｃ．，（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）製Ｃｏｌｌｉｓｏｎ３−ジェットネブライザーである。ジェット式または超音波式ネブライザーを用いて使用するのに適した典型的な組成物は、エアゾル化すべきタンパク質（または化学的に改変したタンパク質）を水に溶解させて含む。タンパク質がＧ−ＣＳＦの場合、濃度は溶液１mlあたり約０．１〜２５ｍｇのＧ−ＣＳＦであるべきである。組成物にバッフアーを配合させてもよく、あるいは単なるＨＣｌ水溶液であってもよい。使用可能なバッフアーとしては酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびグリシンが例示される。Ｇ−ＣＳＦ組成物の場合、バッフアーが溶液のｐＨを２．５〜５．５の範囲に調整するのに適した組成およびモル濃度を有しているのが好ましい。一般に、この目的に適したバッフアーのモル濃度は１mM〜５０mMの範囲である。本発明のタンパク質を含む安定化された水溶液をエアゾル化する手段と水溶液とから、エアゾル化されたタンパク質を生成させるシステムが提供される。本発明のシステムはタンパク質をエアゾル化したい場所で使用することができるが、このシステムはエアゾル化したタンパク質を主成分とする薬物を肺に投与するときに最も有用である。したがって、本発明は所望の治療効果を達成するに十分な量のエアゾル化タンパク質を投与することも包含する。タンパク質の治療上有効量は専門の開業医が考慮すべき、所望の治療効果、治療すべき症状または病気の重篤度、患者の健康状態等の各種要因に依存する。Ｇ−ＣＳＦ投与の場合、治療を受ける患者の血中好中球数が正常範囲を維持するように、血中好中球数が著しく低下している場合は特に注意して投与する。ヒトの場合、正常な血中好中球数は血液１mlあたり約５０００〜６０００である。一般に好中球数が１０００以下になるとそのヒトは重篤な好中球減少症にかかっていると見做され、感染を受ける危険性が高くなる。化学療法により好中球減少症にかかっているガン患者を臨床的に研究したところ、２４時間毎に３〜５マイクログラム／キログラムのＧ−ＣＳＦを皮下注射したところ著しく低下していた血中好中球数を１０００以上に上昇させることができた。当業者には自明の通り、適切な吸入用量の送達のための操作条件は、使用する機械装置の型によって異なる。ネブライザー（噴霧器）のようなある種のエアゾール送達系では、投与頻度及び操作期間は、主にエアゾール中の単位容量当たりのタンパク質又は他の活性組成物の量によって決まる。一般に、ネブライザー溶液中のタンパク質濃度が高くなる程、操作期間は短くなる。他の装置よりも高濃度のエアゾールを生成し得るＭＤＩのような装置もあり、従ってより短期間の操作で所望の結果が得られる。以下の実施例は本発明を理解するためのものであり、その範囲は添付のクレームに記載する通りである。本発明の範囲を逸脱することなく、以下の手順で変形例が可能であると理解されたい。実施例１乳酸デヒドロゲナーゼのエアゾール化生物活性な（即ち非分解の）タンパク質の尺度としての酵素活性を定量するために標準的な酵素活性アッセイ技術を用いて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の安定性を測定することが容易であるため、まず乳酸デヒドロゲナーゼ溶液をモデルタンパク質溶液として、時間、空気圧及び噴霧化容量の影響を調べた。ＬＤＨを２５μｇ／ｍｌ濃度で含んでいる出発容量１０ｍｌの水溶液を、Ｃｏｌｌｉｓｏｎ３噴射式ネブライザー（ＢＧＩ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）及び１０、２５又は４０ｐｓｉｇの圧縮空気圧を用いて噴霧化した。各試料について、ｔ＝０、２、５、５、１０分で、リザーバー流体から１００μｌのアリコートを取り出して、酵素活性を分析した。上述の各条件下でのＬＤＨのエアゾール化では、電気泳動／濃度測定分析で判明するように、リザーバー溶液中の酵素活性の非可逆的な時間依存的損失が生じた。図１に示すように、４０ｐｓｉｇで６０分の噴霧化の後に、平均で出発酵素活性の約６０％が失われた。加える空気圧を実質的ではないが、漸進的に下げると、活性損失は減少した（図１参照）。実施例２Ｇ−ＣＳＦのエアゾール化ＬＤＨについて実施例１に記載した同一のプロトコルに従って、Ｇ−ＣＳＦ溶液を噴霧化した。エアゾール化タンパク質試料を、以下に記載するクロマトグラフィー及び電気泳動／濃度測定手順による分析のために取り出した。この凝集形態のタンパク質がモノマーピークの前にＨＰＬＣカラムから溶離することでわかるように、エアゾール化中にネブライザーのリザーバーから取り出したＧ−ＣＳＦ溶液試料のＳＥＨＰＬＣ分析により、凝集物の漸進的な形成が判明した。１５秒以内の噴霧化で凝集形態のタンパク質が観察され、凝集タンパク質の相対画分は、約５分の噴霧化の後にプラトーに達するように思えた。通常、これは、積分（integrated）ピーク面積の２５〜３０％であった。凝集物バンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上には出現しなかったので、この凝集物は非共有結合であるように思えた。実際、モノマーバンドだけが観察された。均質６％非変性（即ちＳＤＳの不在下）Ｎｏｖｅｘゲルを使用して、エアゾール化Ｇ−ＣＳＦを評価した。電極緩衝液は、２５ｍＭトリス及び２０ｍＭグリシンを含んでいた。ゲル用試料は、同一濃度の２５ｍＭトリス及び２０ｍＭグリシンを、２．５％グリセロール、２．５％スクロース及び０．０２５％β−ブロモフェノールブルーと共に含んでいた。ゲルに定電圧５０Ｖを印加し、全作動時間は約７時間であった。約３０ｍｇのＧ−ＣＳＦをゲルに装入した。次いで、各ゲルをクーマシーブルーで染色した。脱色後、必要に応じて、ＬＫＢＵｌｔｒａｓｃａｎ（登録商標）ＸＬレーザーデンシトメーターを用いて濃度分析に付した。本来の（native）条件下でゲル電気泳動を用いたエアゾール化タンパク質溶液の分析により、無傷の分子よりも僅かに高い移動度で移動する新たなバンドが形成されることが判明した。分解タンパク質を示すこの新たなバンドは、図２に示すように（ゲルの“対照”側）、１分間という短時間の処理後に観察できた。図２は更に、この新たなバンドの強さが増し、噴霧化時間が増すと共に飽和するようであることを示している。新たなバンドのパーセンテージを図３にプロットする。この図は、２０分の半分の時間で急速に変換が生じ、約５分にて４０％レベルで飽和することを示している。水性ＨＣｌ又はグリシン緩衝液中、ｐＨ３〜４で、程度は僅かに異なるものの同様の分解が観察された。無傷のタンパク質に対する分解バンドのほぼ同様の移動度は、タンパク質が尚少なくとも部分的に折り畳まれていることを示唆している。完全にアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）された分子は、本来のゲルでは遥かにゆっくりと移動する。これらの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、図４（“対照”側）に示すように実質的に単一のバンドが得られた。この図は、移動度の変化が、ペプチド開裂よりもむしろ帯電状態の変化、例えば陰電荷の増加によるものであることを示唆している。実施例３極性有機化合物がタンパク質の安定性に及ぼす作用それぞれ実施例１及び実施例２の水溶液からエアゾール化されたＬＤＨ及びＧ −ＣＳＦで観察された不安定性に基づいて、これらのタンパク質を含む水溶液に種々の濃度のＰＥＧ及びＭＰＤを添加して、観察される分解を最小限にした。特に、ＬＤＨ又はＧ−ＣＳＦを含んだ種々の水溶液に、ＰＥＧ１０００及び２−メチル−２，４−ペンタンジオールを添加した。０．１％、１％及び１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１０００並びに１％、５％及び１０％（ｗ／ｖ）ＭＰＤの濃度を使用して、試験中の２種のタンパク質を安定化させるための極性有機化合物の最適濃度を調べた。得られた溶液をエアゾール化し、エアゾール化したタンパク質を、上述の実施例に記載するようにゲル電気泳動及び濃度測定により分析した。１％ＰＥＧ１０００を含んだＬＤＨ溶液では、図５に示すように、４０ｐｓｉｇ、６０分の噴霧化期間で、タンパク質の初期活性が殆ど完全に保持された。図６に示すように、ＰＥＧの保護作用がＰＥＧ濃度によることも判明した。１％２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）中に処方されたタンパク質は、噴霧化期間中、実質的に全ての酵素活性を保持した。Ｇ−ＣＳＦ及び種々の濃度の２種の極性有機化合物を含んでいる水溶液で同様の結果が得られた。一方の極性有機化合物を加えたタンパク質含有溶液では、非変性ＰＡＧＥで観察される凝集物の量及び“分解バンド”の強さが共にＰＥＧを加えずに噴霧化したＧ−ＣＳＦに比べてかなり低下した。分解タンパク質の形成は遥かにゆっくりと生じ、この分解は、ＰＥＧの存在下では１０％未満で飽和し、これに対して対照試料では４０％であるように思えた（図３参照）。ＳＥＨＰＬＣを用いた分解タンパク質の分析により、ＰＥＧ及びＭＰＤ両方を含むＧ−ＣＳＦの安定化が濃度に依存することが判明した。実施例４種々の水溶液からエアゾール化したＧ−ＣＳＦについての比較測定分子量及び濃度の異なるＰＥＧ及びＭＰＤを含んでいる水溶液で、表面張力値を評価した。更には、水の表面張力に反作用するスクロースもタンパク質の安定化について調べた。表Ｉは、１０分の噴霧化後に観察されたＧ−ＣＳＦ分解の程度を示している。ここで分解の程度は、上記化合物の水中での表面張力値に対応している。Ｄｅｎｕｏｙのリング法（Ｌｅｕｋｅｎｈｅｉｍｅｒ及びＷａｎｔｋｅ，ＣｏｌｌｏｉｄａｎｄＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉ．，２５９，３５４（１９８１））により、Ｋｎｙ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、水溶液の表面張力を測定した。全ての測定は２０℃で実施した。全ての試料で、種々の成分の表面濃度を平衡化するために、測定前に少なくとも３０分を要した。全ての値を、Ｈａｒｋｉｎｓ及びＪｏｒｄａｎ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５２，１７７２（１９３０）が記載するように濃度について調整した。全ての測定の精度を高める前に又は高めた後に、純水（ＳｕｐｅｒＱ（登録商標），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の表面張力を測定した。更には、張力計のリング上への潜在的なタンパク質付着が測定値に悪影響を及ぼさないように実験を実施した。結果を表Ｉに示す。この分析は、ＰＥＧ及びＭＰＤが共に、エアゾール化中にタンパク質Ｇ−ＣＳＦに対して保護作用を示すが、高レベルを達成する（即ち９０％以上の活性を保持する）のに必要な極性有機化合物の量はＰＥＧ（１％）よりもＭＰＤ（５％）の方が高いことを示している。実施例５ある種の極性有機化合物及び界面活性剤がタンパク質の安定性に及ぼす比較作用別の実験を実施して、噴霧化中に種々の極性有機化合物及び界面活性剤がタンパク質の安定性に及ぼす比較作用を調べた。特に、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、スクロース及びメチルペンタンジオール（ＭＰＤ）（全てＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製）で、噴霧化中のＧ−ＣＳＦ及びＬＤＨ安定化力を試験した。更には、分子量の異なるＰＥＧを分析して、分子量の異なる上記化合物が示す保護作用の相違を調べた。特に、上記実施例で使用したＰＥＧ１０００の外に、ＰＥＧ８０００（平均分子量８０００）及びＰＥＧ４００（平均分子量４００）を調べた（全てＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ製）。極性有機化合物及び／又は界面活性剤を添加した後に、上述の実施例１に記載のプロトコルに従って噴霧化を実施した。ドデシル硫酸ナトリウムの存在下及び不在下でのゲル電気泳動を実施例２に上述したように実施した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＦＰＬＣカラム（１×３０ｃｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及び溶離剤としての０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．９）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。流速は０．５ｍｌ／分に設定し、溶離を２８０ｎｍの吸光度で監視した。上述の実施例４に記載のリング法に従って、表面張力測定を実施した。Ａ．ＰＥＧ分子量の作用４００、１０００及び８０００ダルトンの分子量のそれぞれを０．００１％及び１．０％（ｗ／ｖ）濃度で用いて、ＰＥＧ分子量がエアゾール化中のＧ−ＣＳＦ安定化に及ぼす作用を調べた。結果はそれぞれ図７Ａ及び図７Ｂに示す。０．００１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ濃度では、タンパク質の安定化とＰＥＧの分子量との間には本質的に相関関係はなかった（図７Ａ）。対照的に、図７Ｂに示すように、１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ濃度で強い分子量依存性が観察され、ＰＥＧの分子量の増加と共に明らかにより大きな安定化への傾向が観察された。Ｂ．ＭＰＤの作用ＭＰＤで、エアゾール化中のＬＤＨ及びＧ−ＣＳＦの保護能力を試験した。ＰＥＧと同様に、ＭＰＤは界面活性の弱いタンパク質安定剤である。ＬＤＨを１％（ｗ／ｖ）ＭＰＤ中に処方すると、いかなる添加剤も使用しなければ僅かに３３％しか保持されなかったのに対して、このタンパク質では、噴霧化中に初期活性のほぼ１００％が保持された。ＭＰＤが１０分の噴霧化でＧ−ＣＳＦの分解に及ぼす安定化作用を表IIに示す。Ｇ−ＣＳＦ分解の時間経過は、対照実験よりもＭＰＤの存在下での方が遅かった。ＰＥＧと同様に、ＭＰＤによるＧ−ＣＳＦの安定化は、濃度に強く依存していた。ＭＰＤの場合、この特定の極性有機化合物は、０．１％を下回る最少量での安定化を示した。１％ＭＰＤでは、より高分子量のＰＥＧを同様の濃度で用いて達成された値よりも低くはあるが、実質的な安定化が観察された。５％ＭＰＤでは、１％ＰＥＧ１０００で得られるよりも幾分高い保護が達成され、１０％ＭＰＤは実質的に完全に保護するように思えた。Ｃ．スクロースの作用２％（ｗ／ｖ，０．０５８Ｍ）又は２０％（ｗ／ｖ，０．５８Ｍ）スクロースが噴霧化中のＬＤＨ活性保持に及ぼす作用を測定した。結果は、スクロースが分解に対して何ら有意な保護を示さず、事実ＬＤＨ活性を更に不安定化させる傾向にあることを示した。１０分の噴霧化の後に１％（ｗ／ｖ）及び０．５Ｍ（１７％）スクロースがＧ−ＣＳＦ安定化に及ぼす作用も調べた。結果は、ＬＤＨで得られた結果とほぼ同一であった。従って、上述したように、スクロースを加えても、Ｇ−ＣＳＦの噴霧化中の分解に対する保護作用は示さなかった。実際、スクロースは潜在的な不安定化作用を示した。Ｄ．Ｔｗｅｅｎ８０の作用Ｔｗｅｅｎ８０は過剰に起泡するため噴霧化が困難になるが、この界面活性剤が噴霧化中のＧ−ＣＳＦ分解に及ぼす作用を種々の異なる界面活性剤濃度で調べた。結果は以下の表IIIに示す。これらの結果から、Ｔｗｅｅｎ８０が極性有機化合物のＰＥＧやＭＰＤと同様に、大きく濃度に依存してＧ−ＣＳＦを分解しないように安定化させることは明白である。約０．０１％（ｗ／ｖ）で実質的な安定化が観察されたが、０．００１％（ｗ／ｖ）を下回る界面活性剤濃度では本質的に安定化作用は観察されなかった。０．０５％（ｗ／ｖ）を上回る界面活性剤濃度では実質的に完全な安定化が観察された。Ｔｗｅｅｎ８０の存在下でのＬＤＨ活性については、同様の安定化パターンが観察された。Ｅ．表面張力表IV、Ｇ−ＣＳＦ、種々の極性有機化合物並びに／又は本実施例及び上述の実施例で試験した界面活性剤を含む水溶液の表面張力測定の結果を示す。水の表面張力を低下させるＰＥＧ及びＭＰＤは共に、添加剤として使用すると噴霧化中にＧ−ＣＳＦタンパク質で観察される分解量を大幅に低下させることが、表IVのデータから明白である。他方で、水の表面張力を僅かに高めるスクロースは、タンパク質の分解も僅かに促進した。Ｔｗｅｅｎ８０は、図IVに示すように、噴霧化中のＧ−ＣＳＦの安定化に対して顕著な作用を示すことが判明した。これは界面活性剤の特徴であるが、上述したように、界面活性剤は起泡の傾向があるため、空気噴射による噴霧化で使用される極性有機化合物よりも相容性が下がる場合が多い。Detailed Description of the Invention Stabilization of aerosolized proteinsBackground of the Invention Aerosolization is an important drug delivery method. Depending on the patient, the aerosolized drug Are inhaled, resulting in contact with the patient's lungs. Large table for adsorption of airways in the lungs Because it provides an area, aerosolization can be useful for drugs such as bronchodilators and other anti-asthma drugs. ) Is useful not only for local delivery but also for systemic administration. In fact, aerosolization is a tamper Considered to be the preferred method for non-invasive systemic administration of certain drugs, including available. Usually, the size of the aerosol particles is adjusted so that the particles can be directed into the narrow airways of the lungs and Reach the alveoli (necessary for systemic administration) or deliver to the entire respiratory tract (local) Delivery). The aerosolized drug may be a dry particulate or an aqueous or non-aqueous solution containing the drug. Obtained by dispersing a liquid in a gaseous medium. Sprays particles for dry particles Suspended in the agent, the propellant evaporates after the suspension is released into the air from the pressure device. Alternatively, in other cases, dry particulate may be aerosolized directly from a dry powder inhaler. You. When aerosolizing a drug from an aqueous solution, the drug solution should be a fine droplet of water. Converts to fog. Aerosolized delivery of drug can be in a single metered dose or by continuous delivery . One way to deliver a metered dose of an aerosolized drug is to use a metered dose inhaler (MDI). There is a device called. When activated, the MDI separates the suspension of fine particles from the pressure vessel. Disperse. The patient inhales at the same time as the inhaler is actuated and thus the aerosolized drug With the patient's own lungs. Very typically delivered by MDI The drug is aerosolized from dry particles, but the drug aerosolized from an aqueous solution It is also possible to deliver a single metered dose. Expectations for certain types of patients such as infants, the elderly and the frail for using MDI It requires some adjustments and techniques that cannot be done. In addition, it is suitable for use with MDI. The number of drugs that can be easily mixed is limited. Therefore, the aerosolized drug should be delivered continuously. Is often preferred. The most common method for continuous delivery of aerosolized drugs is It is due to the blazer, and the patient who is given the drug by the nebulizer Inhale the substance over a long period of time via normal breathing. Required for long-term administration To create a continuous flow, the drug solution is continuously atomized in the nebulizer. At that time A small amount of nebulized aqueous solution (about 1 minute) leaves the nebulizer directly for delivery to the patient at that time. %) Only. The nebulizer is a nebulizer that does not come out of the nebulizer. Impinges on the wall or baffle of the tank and flows into the fluid container located at the bottom of the nebulizer Return, where it is atomized again into aerosol, and this series of operations is performed until the container is empty. , Or for another reason, until the drug administration is completed. Bronchodilators, corticosteroids, antibiotics, antihistamines and mucus destruction Both metered dose and continuous flow delivery of aerosolized drugs, such as drugs, has been around for many years. Widely used. Recently, due to advances in molecular biology, growth factors and Several protein-based drugs, such as tocaine, have been developed and these drugs For example, as disclosed in EP-A-0257956, an aerosol It has been suggested that it is suitable for denatured delivery. As mentioned earlier, aerosolization is Not deliverable orally due to instability to proteolytic enzymes It is considered to be the preferred alternative delivery method for some proteins. But Tan Aerosolized delivery of proteins makes proteins less vulnerable than older drugs New difficulties to have quality Let me down. Potential problems with the aerosolized delivery of certain proteins include protein molecules. Of the quaternary structure, and also the secondary and tertiary structures, have the fragile property, When this structure is destroyed, it causes protein aggregation and degradation, resulting in loss of biological activity. Will be The physical pressure inherent in aerosolization, such as the formation of a large area air-water interface, is high. Destabilizes the structure of many proteins. The problem is that about 99% of drugs in aqueous solution A continuous flow in which the product is refluxed before delivery to the patient, ie, is aerosolized from the aqueous solution more than once Delivery will be more critical. The above-mentioned reflux of the drug solution causes the protein to Each icle exerts additional physical pressure. The present invention provides for active loss and degradation and / or degradation of proteins aerosolized from aqueous solutions. Alternatively, it is intended to provide a method for preventing aggregation. The present invention also addresses protein degradation, aggregation and loss of activity during aerosolization. It is also an object to provide a stable protein-containing aqueous solution that is stable and resistant.Summary of the invention The present invention stabilizes proteins that are aerosolized from aqueous solutions Provide a way to. Stabilization of aerosolized proteins is achieved by polyethylene glycol Water-soluble polar organic compound, such as alcohol, or a surfactant into an aqueous solution before aerosolization. This is done by adding. The present invention includes polar organic compounds or surfactants. Aerosolize the stable aqueous protein solution and stable aqueous protein-containing solution We also provide a system to do.Brief description of the drawings Figure 1 shows the ratio of LDH initial activity (ratio to initial activity) to aerosolization time. The graph is plotted. Figure 2 Aerosolization from PEG-containing and PEG-free aqueous solutions (“control”) 3 is a non-denaturing electrophoresis gel showing G-CSF. Figure 3 shows air from 1% PEG-containing and PEG-free (“control”) solutions. A graph plotting the decomposition rate of solified G-CSF against the aerosolization time. is there. Figure 4 Aerosolization from PEG-containing and PEG-free aqueous solutions (“control”) 2 is an SDS-electrophoresis gel showing G-CSF. Figure 5: Aerosolization from PEG-containing and PEG-free aqueous solutions (“control”) The initial active fraction of LDH It is the graph plotted against the conversion time. FIG. 6 shows an aqueous solution containing various concentrations of PEG and an aqueous solution containing no PEG (“control The initial active fraction of LDH aerosolized from ") is plotted against the aerosolization time. This is the graph that was set. FIG. 7A shows that different molecular weights of PEG with a concentration of 0.001% are G-CS when aerosolized. It is a graph which shows the influence which it has on the stabilization of F. FIG. 7B shows that the different molecular weights of PEG with a concentration of 1% are stable in G-CSF when aerosolized. It is a graph which shows the influence which it has on.Detailed description of the invention The present invention relates to degradation, aggregation and / or protein caused by aerosolization. Methods of protecting proteins from loss of activity are provided. The present invention is an aerosol Protein aerosolization, including pulmonary delivery of protein-based drugs to patients It can be used in any desired situation. As pointed out above, the present invention Is resistant to degradation, aggregation and / or loss of activity of proteins during oxidization. Aerosolize a stable protein-containing aqueous solution and a stable protein-containing aqueous solution A system is also provided. In most cases A system that aerosolizes stable protein-containing aqueous solution Used in pulmonary administration to patients. According to the teachings of the present invention, polar organic compounds or By adding a surfactant, the aerosolized protein is activated during aerosolization. Protects against sex loss, degradation and / or aggregation. To aid in understanding the present invention, the terms used in this specification are defined as follows. You. The term "polar organic compound" has appropriate non-polar moieties in the indeterminate regions of the molecule It means an organic compound (that is, a non-polar portion is not localized). Polar organic compounds are water Surface tension can be reduced. Unlike surfactants, which tend to form micelles, The organic organic compounds are completely miscible with water without forming micelles. The term "surfactant" has both polar and strongly non-polar moieties. A compound, wherein each of the above moieties is placed in a different localized region on the molecule, The interfacial tension between the immiscible phases of can be reduced by molecular alignment at the interface, and micelles A compound possessed such that it can form In surfactants, polar and non-polar Since the polar part is localized, Surfactant compounds reduce the surface tension of water much more significantly than polar organic compounds You. The term "protein" refers to any protein that is dispersed in the aqueous solution of the invention. means. This protein is usually a therapeutic protein used in inhalation therapy. is there. Proteins may be chemically synthesized or purified from natural sources, but typically Is a recombinant form of natural protein. Usually a chemical moiety (residual Chemically modify the protein by covalent attachment of the It is also possible to improve the effect by prolonging the therapeutic effect. As pointed out above, protein aerosolization causes loss of protein activity over time. I could invite you. Aerosolization is a large amount of air-water interface created in the process of aerosolization. It adversely affects the stability of proteins due to several factors including. Eazo The extent of protein activity loss due to It varies depending on the protein depending on the aerosolization means used for. Protein injection formula When the aerosol is continuously formed by the nebulizer, the protein and the aerosol are formed. Interaction with air-water interface created in the process In addition, shear stress from jet air pressure destroys proteins. Dry Can also denature the protein because it evaporates This is because it is concentrated in the drops. In other words, in the aerosolization using the injection type nebulizer The degree of activity loss due to both the air pressure of the jet and the initial volume of the aqueous solution in the container is connected with. If the protein is aerosolized with an ultrasonic nebulizer, the same shape There is no normal shear stress, but ultrasonic waves alter the protein in another way (for example, by heating). There is a risk of having sex. All proteins undergo degradation, aggregation and / or activity loss upon aerosolization Do not mean. For example, secreted leukoprotease inhibitor (SLPI) and α1- Antitrypsin is reported to be resistant to degradation during aerosolisation. Mc Elvaney et al.J. Clin. Invest. 90Pp. 1296-13 01, 1992 (SLPI); Hubbard et al.,Ann. Int. Med. 111 (3) Pp. 206-212, 1989 (α1-antitrypsin). During aerosolization, some proteins are subject to the stresses that exist during aerosolization Some or all will decompose depending on whether it is present or not. Very Aerosolization generally causes partial degradation of the protein. This partial decomposition Does not interfere with the effective use of the protein as a therapeutic agent, but the degradation results in an effective level. Administration of the drug at higher doses than if the protein was delivered in its fully active form Protein is required. If the immunogenicity of the aggregated protein is in its biologically active form , That is, an immune response is elicited from a patient who receives an aerosolized drug. There is also a fear that A protein loses its activity during aerosolization and also decomposes and / or aggregates. The exact mechanism is unknown. Contains the drug granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) By analyzing the aqueous solution, the G-CSF itself reduces the surface tension of water even before it becomes an aerosol. It was proved to reduce the protein concentration at the air-water interface. It shows the direction. (The surface tension of an aqueous solution of G-CSF at a concentration of 4 mg / ml. Was measured to be 48 for 72 of water). Typically, at the air-water interface in an aqueous solution When a protein is adsorbed, the hydrophobic region of the protein is exposed to the non-polar gas phase At least partial protein unfolding occurs. From the analysis of the aqueous solution of G-CSF, the above-mentioned time point (ie, azo Homogeneity of the protein (before depolymerization) is verified, and the protein is subjected to non-denaturing electrophoresis. It appeared as a single band on the gel and no evidence of aggregation was found. This is That surface adsorption of G-CSF before aerosolization is probably a reversible process. Is shown. However, upon aerosolization, G-CSF is irreversibly denatured, thus It was observed to undergo aggregation, chemical degradation, or both. G-CSF is a potent granulocyte lineage growth factor that increases white blood cell count. the above Due to its activity, G-CSF is useful in the treatment of several diseases and conditions, including infectious diseases. Clinically applied. Currently available G-CSF administration means are exclusively intravenous injection. However, pulmonary administration has proved effective in animals. (International patent application publication number 92/16192). However, it is known that protein coagulation during aerosolization Most of the aerosolized G-CSF has a common effect due to collection, decomposition and loss of activity. And non-covalently bound dimers as well as higher molecular weight aggregates and other forms of degradation It can be expected to reach the patient in a sexual form. In particular, G-CSF with an acidic pH of 4 Attempts were made to atomize the mg / ml solution. Protein aggregates during this treatment Damage of both form and It was thought to have been received. All of the above damages increased with the length of atomization . Surprisingly, in accordance with the teachings of the present invention, it contains an aerosolizing protein. Addition of polar organic compound or surfactant as defined above to the aqueous solution , A significant stabilization of the aerosolized protein against degradation was observed. This remarkable Stability is determined by using both lactate dehydrogenase (LDH) enzyme and G-CSF described above. Proved about him. May have protective action against aerosolized proteins The preferred polar organic compounds found are polyethylene glycol (PEG) and Included is methylpentanediol (MPD). Whether the polar organic compound is PEG Very preferable. The polar organic compound is PEG 1000 (ie, average molecular weight 1000 Most preferred is PEG), but other molecular weight PEGs are also effective. However However, a lower molecular weight PEG preferably protects aerosolized proteins. Must be used in higher concentrations. Preferred surfactant is Tween 80. It is known that polyethylene glycol has the ability to stabilize proteins. Not. In fact, PEG It is known to destabilize proteins due to their weak hydrophobicity. Araka wa and Timasheff, Biochemistry, 24 (24), 6 756-6762 (1985). Due to its high excluded volume, this compound It is also known to salt out proteins. See references above. Functionally, PEG stands up It is strongly excluded from the surface of proteins according to the principle of body exclusion. PEG and surface Due to thermodynamically unfavorable interactions with PEG-excluded proteins from , Protein solubility decreases. As a result, PEG destabilizes proteins. Decrease the solubility of proteins such as G-CSF, and Is expected to be accelerated. However, as mentioned above, PEG is atomized from an aqueous solution (Mnebulizer). It was found that LDH and G-CSF are stabilized during This is due to the amphipathic nature formed by the delocalized polar and nonpolar regions of the PEG molecule. It is considered that this is due to the fact that the unit is repeatedly present. In fact, SDS and Tw Although less than common surfactants like een, PEG has a low surface tension in water. Let me down. Therefore, PEG is adsorbed at the air-water interface and G -Can exclude proteins such as CSF from accessing the surface. Other polar organic compounds also protect proteins during aerosolization, but their mechanism Is associated with the low ability of these polar organic compounds to reduce surface tension. It is thought that it is. The protection afforded by PEG is demonstrated by MPD Depends on concentration. The protective effect provided by other polar compounds is also concentration dependent (However, the optimum concentration for preventing decomposition and activity reduction is of polar organic compounds. It also depends on the protein to be aerosolized. Optimal concentrations of polar organic compounds in combination with a given protein are taught by the present invention. Can be easily determined by those skilled in the art. For example, the surface tension of water is about 65 In / cm²It is possible to use polar organic compounds in concentrations sufficient to reduce preferable. In case of MPD, the surface tension of water is about 48 dynes / cm²Lower to It is more preferable to use the polar organic compound in a concentration that allows it. The polar organic compounds contemplated for use in the present invention include proteins from aqueous solution to proteins. Teaching to reduce or prevent surface aggregation of proteins caused by aerosolization Table that has been It should be contrasted with certain surfactant active agents known as surface tension reducing agents. These surfactants include polyoxyethylene fatty acid esters and alcohols. Conventional surfactants such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid Ters, with polyoxyethylene sorbitan monooleate being particularly preferred. It is a surfactant. See WO92 / 16192. These surface activities It was concluded that the agent is not necessary to aerosolize G-CSF from an aqueous solution It's interesting to be there. See references above. Surfactants such as Tween can reduce surface tension and, in fact, The degree is more significant than PEG and other polar organic compounds used in practicing the invention. High. However, unlike polar organic compounds taught in the present invention, surface active Agents (particularly cationic surfactants) form micelles and destabilize proteins You. One of the causes is that cationic surfactant lowers the surface tension. However, it binds strongly to proteins, especially those in the form of micelles, and changes its solubility. It can be mentioned that oxidization occurs. In addition, the surfactant has foaming properties. Often, the surface tension lowering effect of these compounds is used in air jet atomization. It is hard to do. However, it sometimes stabilizes proteins from degradation It is preferable to use a surface active agent. If a surfactant is used for this purpose The surface tension of water is about 40 dynes / cm²Interface at a concentration sufficient to reduce Preference is given to using activators. The polar organic compounds contemplated by the present invention are tan Lower surface tension without binding to proteins or destabilizing proteins It has the advantage that In the case of PEG, PE in an aqueous solution High even when G forms a random coil and is occupied by low molecular weight PEG Due to its hydrodynamic capacity, the air interface at which the protein forms during atomization May not be able to reach. In carrying out the present invention, various tampers that are desired to be aerosolized from an aqueous solution Quality can be used. Most typically, the aerosolization of proteins according to the invention is This is to deliver a therapeutically useful protein to the lung. Of the intended protein Examples include G-CSF, SCF, EPO, GM-CSF, CSF-1 Various hematopoietic factors, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 and Interleukins such as IL-12, IGFs, M-CSF, thymosin, T Included are cytokines including NF and LIF. Other therapeutic benefits that can be used Fruit-bearing proteins include interferons (alpha-, beta-, cancer Or common interferon), growth factors or hormones such as human adult Long hormone or other animal growth (such as bovine, porcine or chicken growth factor) Includes hormones, ET-1, FGF, KGF, EGF, IGF, PDGF, etc. . Protease inhibitors, such as (TIMP-1, TIMP-2 or other pro- Metalloproteinase inhibitors (such as the proteinase inhibitors) are also used. BDN Nerve growth factors such as F and NT3 are also used. tPA, urokinase and su Plasminogen activators such as treptokinase are also used. Parent Tampa Of the parent protein and all or part of the main structure of the protein Also used are peptide portions of proteins that have at least some of the properties. A Analogs, such as substitution or deletion analogs, or modified analogs such as peptide analogs. Those containing modified amino acids are also used. In practicing the present invention, an aerosol was formed from an aqueous solution. Various devices or devices known in the art for delivering therapeutic agents to the lung are used. , But not limited to nebulizers and metered dose inhalers. However, protein Have you experienced that when it is continuously aerosolized, it usually decomposes considerably? The greatest effect of the present invention is that the protein is continuously treated using a device such as a nebulizer. It is seen when it is atomized. Goes on to commercially available equipment suitable for carrying out the invention. For example, Mallinckrodt Inc. (St. Louis, M Isouri) Ultravent nebulizer, Marquest Me A manufactured by digital Products (Englewood, Colorado) corn II nebulizer, BGI, Inc. , (Waltham, Massa Chulists) Collison 3-jet nebulizer. Typical suitable for use with jet or ultrasonic nebulizers The composition is a protein to be aerosolized (or a chemically modified protein) And dissolved in water. When the protein is G-CSF, the concentration is per 1 ml of solution There should be about 0.1-25 mg G-CSF. Incorporating a buffer into the composition May be allowed or HCI aqueous solution may be used. As a usable buffer, sodium acetate is used. And sodium citrate and glycine. In the case of G-CSF composition The buffer has a composition suitable for adjusting the pH of the solution within the range of 2.5 to 5.5. And preferably have a molarity. In general, a buffer suitable for this purpose Has a molar concentration in the range of 1 mM to 50 mM. Means for aerosolizing a stabilized aqueous solution containing the protein of the present invention and an aqueous solution Thus, a system is provided for producing aerosolized proteins. Departure Ming's system can be used wherever you want to aerosolize proteins, When this system administers a drug whose main ingredient is aerosolized to the lungs, Most useful. Accordingly, the present invention provides a sufficient amount of aerosolized tantalum to achieve the desired therapeutic effect. It also includes administering a protein. A professional practitioner will determine the therapeutically effective amount of protein The desired therapeutic effect, the severity of the condition or illness to be treated, the health of the patient to be considered It depends on various factors such as the condition. In the case of G-CSF administration, in the blood of the patient to be treated If the blood neutrophil count is significantly reduced so that the neutrophil count remains within the normal range Is special Please note that. In humans, the normal blood neutrophil count is about 50 per ml of blood. It is from 00 to 6000. Generally, when the number of neutrophils becomes 1000 or less, the human is serious Are considered to have severe neutropenia and are at increased risk of infection. Conversion A clinical study of cancer patients with neutropenia due to scholarship Subcutaneous injection of 3-5 microgram / kilogram of G-CSF every 24 hours Was able to raise the blood neutrophil count, which was markedly low, to over 1000 . As will be apparent to those of skill in the art, the operating conditions for delivery of an appropriate inhaled dose will be It depends on the machine type. Some types of azo, such as nebulizers In the drug delivery system, the dosing frequency and operating period are mainly per unit volume in the aerosol. Of protein or other active composition. In general, nebulizer dissolution The higher the protein concentration in the liquid, the shorter the operating period. Higher than other devices There are also devices such as MDIs that can produce high-speed aerosols, and therefore shorter duration operations. The desired result is obtained. The following examples are for the purpose of understanding the present invention, the scope of which is the accompanying clay As described in the section. Of the present invention It should be understood that modifications can be made in the following procedure without departing from the scope. Example 1 Aerosolization of lactate dehydrogenase To quantify enzyme activity as a measure of bioactive (ie non-degraded) protein Of lactate dehydrogenase (LDH) using standard enzyme activity assay techniques for Since the stability is easy to measure, the lactate dehydrogenase solution should be modeled first. As a protein solution, the effects of time, air pressure and atomization volume were investigated. An aqueous solution containing LDH at a concentration of 25 μg / ml in a starting volume of 10 ml was added to Co llison 3 injection nebulizer (BGI, Inc., Waltham, M and compressed air pressure of 10, 25 or 40 psig And atomized. Reservoir for each sample at t = 0, 2, 5, 5, 10 minutes A 100 μl aliquot was removed from the fluid and analyzed for enzyme activity. The LDH aerosolization under each of the above conditions was determined by electrophoresis / densitometry analysis. As can be seen, there is an irreversible time-dependent loss of enzyme activity in the reservoir solution. Was. Shown in Figure 1 As such, after nebulization at 40 psig for 60 minutes, on average about 60 of the starting enzyme activity % Has been lost. The applied air pressure is not substantial, but if the pressure is gradually reduced, activity loss will occur. Decreased (see FIG. 1). Example 2 Aerosolization of G-CSF Following the same protocol described in Example 1 for LDH, G-CSF dissolution was performed. The liquid was atomized. The aerosolized protein sample was chromatographed as described below. Removed for analysis by fee and electrophoresis / densitometry procedure. This aggregated form of protein elutes from the HPLC column before the monomer peak As you can see, it was removed from the nebulizer reservoir during aerosolization. SE HPLC analysis of the prepared G-CSF solution sample showed the gradual formation of aggregates. found. Aggregated protein was observed within 15 seconds after atomization, The relative fraction of the cumulus appeared to reach a plateau after about 5 minutes of nebulization. Normal , Which was 25-30% of the integrated peak area. Aggregate van No aggregates appeared on the SDS-PAGE gel, so this aggregate was non-covalently bound. Seemed to be. In fact, only the monomer band was observed. Using a homogeneous 6% nondenaturing (ie, in the absence of SDS) Novex gel, G-CSF was evaluated. The electrode buffer is 25 mM Tris and 20 mM Glycine. Included. The gel sample is 25 mM Tris and 20 mM Glycine at the same concentration. 2.5% glycerol, 2.5% sucrose and 0.025% β-bromo. Included with Phenol Blue. Applying a constant voltage of 50V to the gel, total operating time Was about 7 hours. About 30 mg of G-CSF was loaded on the gel. Then each Le was stained with Coomassie blue. After decolorization, if necessary, LKB Ultra Concentration analysis was performed using a scan (registered trademark) XL laser densitometer. . Aerosolized protein solution using gel electrophoresis under native conditions Analysis revealed a new band migrating with slightly higher mobility than the intact molecule. It turned out to be done. This new band, which represents the degraded protein, is shown in Figure 2. As it was ("control" side of the gel), it could be observed after a short treatment of 1 minute. Figure 2 also becomes more saturated with increasing atomization time as the strength of this new band increases. Arm It indicates that there is. The percentage of new bands is plotted in FIG. This figure shows that the conversion took place rapidly in half the time of 20 minutes and at the 40% level in about 5 minutes. It is shown to be saturated. In aqueous HCl or glycine buffer at pH 3-4, Similar degradation was observed, albeit slightly differently. Against intact proteins Nearly similar mobilities of the degradation bands indicate that the protein is still at least partially folded. Suggests that Completely unfolding (unfoldin g) Molecules migrate much more slowly in the original gel. Of these samples By SDS-PAGE analysis, substantially single cells as shown in FIG. 4 (“control” side) are shown. A band was obtained. This figure shows that mobility changes are charged rather than peptide cleavage. It is suggested that it is due to a change in state, such as an increase in negative charge. Example 3 Effects of polar organic compounds on protein stability LDH and G aerosolized from the aqueous solutions of Examples 1 and 2, respectively. -On the basis of the instability observed in CSF, aqueous solutions containing these proteins Add varying concentrations of PEG and MPD to minimize observed degradation did. In particular, PEG 1000 was added to various aqueous solutions containing LDH or G-CSF. And 2-methyl-2,4-pentanediol were added. 0.1%, 1% and 1 0% (w / v) PEG 1000 and 1%, 5% and 10% (w / v) MPD Organization to stabilize two proteins under test using different concentrations The optimum concentration of the compound was investigated. The resulting solution is aerosolized and aerosolized The proteins were separated by gel electrophoresis and densitometry as described in the above examples. Was analyzed. In LDH solution containing 1% PEG 1000, as shown in FIG. ig, with a nebulization period of 60 minutes, the initial activity of the protein was almost completely retained. As shown in FIG. 6, it was also found that the protective effect of PEG depends on the PEG concentration. 1% The protein formulated in 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD) is , Retained substantially all enzyme activity during the nebulization period. Same for aqueous solutions containing G-CSF and two polar organic compounds in various concentrations. Was obtained. On the other hand, in the protein-containing solution containing the polar organic compound, Both the amount of aggregates and the intensity of the "decomposition band" observed on modified PAGE are Significantly reduced compared to nebulized G-CSF without the addition of PEG. Degraded protein Quality formation occurs much more slowly and this degradation is less than 10% in the presence of PEG. Saturates at 40% in the control sample (see Figure 3). Analysis of degraded proteins using SE HPLC showed that both PEG and MPD It was found that the stabilization of the included G-CSF was concentration dependent. Example 4Comparative measurement of G-CSF aerosolized from various aqueous solutions Surface tension values in aqueous solutions containing PEG and MPD with different molecular weights and concentrations Was evaluated. Furthermore, sucrose, which counteracts the surface tension of water, also stabilizes proteins. I investigated Table I shows the extent of G-CSF degradation observed after 10 minutes of nebulization. Shows the degree. Here, the degree of decomposition corresponds to the surface tension value of the above compound in water. doing. Denuoy's ring method (Leukenheimer and Wantke, Co lloid and Polymer Sci. , 259, 354 (1981) ), K ny, Hamburg, Germany) to measure the surface tension of the aqueous solution. Was. All measurements were performed at 20 ° C. The surface concentration of various components was leveled in all samples. At least 30 minutes were required before measurement for equilibration. All values are Harki ns and Jordan, J .; Amer. Chem. Soc. , 52, 1772 ( 1930) and adjusted for concentration. Increase the accuracy of all measurements Pure water (Super Q®, Millipore, before or after ) Was measured. Furthermore, there is potential protein loading on the tensiometer ring. The experiment was conducted so that the clothes did not adversely affect the measured values. The results are shown in Table I. This analysis shows that PEG and MPD together with protein G-CS during aerosolization. Protects against F, but achieves high levels (ie retains 90% or more activity). The amount of polar organic compounds needed to hold) is more MPD (5%) than PEG (1%) Is higher. Example 5 Comparative effects of certain polar organic compounds and surfactants on protein stability. Another experiment was conducted to test various polar organic compounds and surfactants during atomization. The comparative effect on the stability of protein was investigated. Especially, polyoxyethylene sorbita Monooleate (Tween 80), sucrose and methyl pentanedio (MPD) (all Sigma Chemical Co., St. Louis s, manufactured by Missouri), and tested G-CSF and LDH stabilizing power during atomization. did. Furthermore, by analyzing PEGs having different molecular weights, the above compounds having different molecular weights were analyzed. The differences in the protective effects shown were investigated. In particular, the PEG 1000 used in the above examples Outside, PEG 80 00 (average molecular weight 8000) and PEG 400 (average molecular weight 400) (All made by Union Carbide). Polar organic compound and / or surfactant Atomization was performed according to the protocol described in Example 1 above after the addition of . Gel electrophoresis in the presence and absence of sodium dodecyl sulfate is described above in Example 2. Performed as described. Superose® 12 FPLC column ( 1 × 30 cm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) and elution Gel filtration chromatography using 0.1M sodium phosphate (pH 6.9) as an agent. Totography was performed. Flow rate was set to 0.5 ml / min and elution was performed at 280 nm. Monitored by absorbance. Surface tension measurements were made according to the ring method described in Example 4 above. Carried out. A.Effect of PEG molecular weight Each of the molecular weights of 400, 1000 and 8000 daltons reaches 0.001% And 1.0% (w / v) concentration, the PEG molecular weight was G-CS during aerosolization. The effect on F stabilization was investigated. The results are shown in FIGS. 7A and 7B, respectively. 0. At a PEG concentration of 001% (w / v), There was essentially no correlation between stabilization and molecular weight of PEG (Figure 7A). versus Illustratively, as shown in FIG. 7B, there is a strong dependence on the molecular weight at a PEG concentration of 1% (w / v). Was observed, and there was a clear tendency toward greater stabilization with increasing molecular weight of PEG. Was observed. B.Action of MPD MPD tested the protective ability of LDH and G-CSF during aerosolization. P Like EG, MPD is a weakly surface active protein stabilizer. LDH 1% When formulated in (w / v) MPD, only 33 without any additive % Of the protein was retained, whereas this protein had an initial activity during nebulization. Almost 100% was retained. MPD decomposes G-CSF after 10 minutes of atomization. Table II shows the stabilizing effect of slag. The time course of G-CSF degradation was slower in the presence of MPD than in control experiments. Was. Similar to PEG, the stabilization of G-CSF by MPD strongly depends on the concentration. Was. In the case of MPD, this particular polar organic compound is present in a minimum amount below 0.1%. Showed stabilization. For 1% MPD, use higher molecular weight PEG at similar concentration Substantial stabilization was observed, albeit below that achieved. 5% MPD Results in a slightly higher protection than that obtained with 1% PEG 1000, 10% MPD seemed to be virtually fully protected. C.Action of sucrose 2% (w / v, 0.058M) or 20% (w / v, 0.58M) sucrose Affects the retention of LDH activity during nebulization The effect was measured. The results show that sucrose showed no significant protection against degradation, In fact, it was shown that LDH activity tends to be further destabilized. 10 minutes atomization Followed by 1% (w / v) and 0.5M (17%) sucrose for G-CSF stabilization. The effect exerted was also investigated. The results were almost the same as those obtained with LDH. Follow As described above, addition of sucrose does not affect the decomposition of G-CSF during atomization. Did not show any protective effect. In fact, sucrose has a potential destabilizing effect Was. D.Action of Tween 80 Although Tween 80 foams excessively, atomization becomes difficult, but this surfactant The effect of the agent on G-CSF degradation during nebulization was adjusted at various different surfactant concentrations. Solid. The results are shown in Table III below. From these results, Tween 80 is similar to polar organic compounds PEG and MPD. Similarly, it is not possible to stabilize G-CSF so as not to decompose it greatly depending on the concentration. It's obvious. Substantial stabilization was observed at about 0.01% (w / v), but 0.0 Essentially no stabilizing effect is observed at surfactant concentrations below 01% (w / v). won. Substantially complete stability at surfactant concentrations above 0.05% (w / v) Was observed. LDH activity in the presence of Tween 80 was similar to A stabilization pattern was observed. E. FIG.surface tension Table IV, G-CSF, various polar organic compounds and / or this example and the above mentioned Contains the surfactants tested in the examples The result of surface tension measurement of an aqueous solution is shown. Both PEG and MPD, which reduce the surface tension of water, when used as additives Can significantly reduce the amount of degradation observed with G-CSF protein during nebulization. , Is evident from the data in Table IV. On the other hand, a scroll that slightly increases the surface tension of water. Also slightly promoted protein degradation. The Tween 80 is shown in Figure IV. Sea urchin, G-CS during atomization It was found to have a significant effect on the stabilization of F. This is the characteristic of the surfactant However, as described above, since surfactants tend to foam, they can be sprayed with air. Often less compatible than polar organic compounds used in atomization.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＫＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者プレストレスキー，ステイーブン・ジエイアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、プレザント・ウエイ・2426・ケー────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G B, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, KT, LU , LV, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, UA, U S, UZ, VN (72) Inventor Prestress Key, Stephen Jay 91362, California, USA Thousand Oaks, Pleasant Wei Lee 2426 K

Claims

[Claims] 1. Loss of activity of aerosolized protein from aqueous solution containing protein and A method for preventing decomposition, in which the surface tension of water is reduced to about 65 dyne / cm or less. The above method comprising adding a polar organic compound to the solution at a decreasing concentration. 2. The polar organic compound is polyethylene glycol and methyl pentanedio The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of: 3. The polar organic compound is polyethylene glycol, and the protein is a condyle. The method according to claim 2, which is a granulocyte colony stimulating factor. 4. The polyethylene glycol is PEG 1000, at least about 1% The method of claim 3, wherein the method is present at a concentration of. 5. The polar organic compound is methylpentanediol, and the surface tension of water is about 4 The method according to claim 2, wherein the method is reduced to 8 dynes / cm or less. 6. The methylpentanediol is 2-methyl-2,4-pentanediol. And said protein is granulocyte colony stimulating factor, said 2-methyl-2,4 -Pentage The method of claim 5, wherein the all is present at a concentration of at least about 5%. 7. The method according to claim 1, wherein the protein is aerosolized by atomization by air injection. How to list. 8. Loss of activity of aerosolized protein from aqueous solution containing protein and A method for preventing decomposition, in which the surface tension of water is reduced to about 40 dynes / cm or less. The above method, which comprises adding a surfactant to the solution at a decreasing concentration. 9. The surfactant is Tween 80 and the protein is granulocyte colonies. -A stimulator, said Tween 80 being present at a concentration of at least about 0.01% The method of claim 11, wherein 10. Tans dispersed in water at a concentration that reduces the surface tension of water to less than about 65 dynes / cm An aqueous solution containing a polar substance and a polar organic compound. 11. The polar organic compound is polyethylene glycol and methyl pentanedio. The aqueous solution according to claim 10, which is selected from the group consisting of: 12. The polar organic compound is polyethylene glycol, and the protein is Claim to be a granulocyte colony stimulating factor Item 12. The aqueous solution according to item 11. 13. The polyethylene glycol is PEG 1000, at least about 1 The aqueous solution according to claim 12, which is present in a concentration of%. 14． The polar organic compound is methylpentanediol, and the surface tension of water is about The aqueous solution according to claim 11, which is reduced to 48 dyne / cm or less. 15. The methylpentanediol is 2-methyl-2,4-pentanediol The protein is granulocyte colony stimulating factor, the 2-methyl-2, 15. The 4-pentanediol is present in a concentration of at least about 5%. Aqueous solution. 16. Tans dispersed in water at a concentration that reduces the surface tension of water to less than about 40 dynes / cm An aqueous solution comprising a protein and a surfactant. 17． The surfactant is Tween 80 and the protein is granulocyte Is a knee stimulator and said Tween 80 is present at a concentration of at least about 0.01%. 17. The aqueous solution of claim 16, which is present. 18. The aqueous solution according to claim 10 and an aerosol of the aqueous solution. A method for administering an aerosolized protein to a patient, the method comprising: Tem. 19. The aqueous solution, protein dispersed in water, and polyethylene glycol 19. The system of claim 18, including. 20. The protein is granulocyte colony stimulating factor, the polyethylene glycol The call is PEG 1000, the PEG 1000 having a concentration of at least about 1%. 16. The system of claim 15, which is present in degrees. 21. The aqueous solution contains a protein dispersed in water and methylpentanediol. 19. The system of claim 18 including. 22. The methylpentanediol is 2-methyl-2,4-pentanediol The protein is granulocyte colony stimulating factor, the 2-methyl-2, 16. The 4-pentanediol is present in a concentration of at least about 5%. system.