JPH09501562A - ヒト・免疫不全ウイルスに対する活性を有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖を阻害する化合物および方法を特徴とする。好ましいＨＩＶ標的部位が同定され、標的部位にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドが記載されている。該オリゴヌクレオチドの好ましい用途は、ＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶ増殖を阻害するための抗ＨＩＶ剤としてである。本発明の他の用途は、該オリゴヌクレオチドを検出プローブまたは増幅プライマーとして使用することによりＨＩＶの存在を検出すること、およびオリゴヌクレオチドのＨＩＶ増殖阻害能を測定してＨＩＶ表現型に対する抗ＨＩＶ剤としてのその適性を評価すること、または患者におけるＨＩＶの存在の診断を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト・免疫不全ウイルスに対する活性を有するオリゴヌクレオチド 発明の分野 本発明は、ヒト・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を阻害することにおいて 特に有用なオリゴヌクレオチドに関する。 発明の背景 アンチセンスオリゴヌクレオチドはウイルスのｍＲＮＡとハイブリダイズし、 ｍＲＮＡの翻訳またはプロセッシングを阻害し、そのことによりウイルス複製を 阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドのウイルスｍＲＮＡへ のハイブリダイゼーション（アンチセンス：ｍＲＮＡ）は、アンチセンスヌクレ オチドおよびウイルスｍＲＮＡ上に存在する相補的ヌクレオチド間の水素結合に より起こる。アデニン（Ａ）はチミジン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）に相補的で あり、一方、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）に相補的にである。アンチセンス ：ｍＲＮＡ鎖に沿って、古典的な塩基対ＡＵ、ＴＡまたはＵＡＮＧＣもしくはＣ Ｇが存在する。さらに、いくつかのミスマッチ塩基対（例えば、ＡＧ，ＧＵ）が 存在しうる。 ヌクレオチド間に水素結合を形成する能力は、アンチセンスヌクレオチドが特 定のウイルス核酸配列を標的とすることを可能にする。よって、アンチセンスヌ クレオチドはウイルス核酸にのみ存在する核酸配列を標的とすることができ、ウ イルス遺伝子の発現を選択的に阻害することができる。 オリゴヌクレオチドは、ウイルス核酸にハイブリダイズしうる抗ウイルス剤と して特許請求されている。例えば、トゥリス（Tullis），米国特許第５,０２３, ２４３号はアンチセンスヌクレオチドの使用に関する一般的説明を提供する。カ ジ（Kaji），米国特許第４,６８９,３２０号は、単純ヘルペスウイルスを標的と するヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した場合 、 単純ヘルペスでのマウスの死亡率の低下を示すデータを提供する。グッドチャイ ルド（Goodchild）ら,米国特許第４,８０６,４６３号は、ＨＩＶ感染した培養細 胞における、いくつかの異なる特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＨＴＬ Ｖ−III（ＨＩＶ）複製および遺伝子発現を阻害する能力を示すデータを提供す る。カンチン（Cantin）ら,米国特許第５,１１０,８０２号には、ＨＩＶ複製を 阻害するための特別なメチルホスホネート結合オリゴヌクレオチドの使用が記載 されている。エッカー（Ecker）,米国特許第５,１６６,１９５号は、ある種のア ンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる、クローン化されたｔａｔ遺伝子の阻害 を示すデータを提供する(これらの米国特許を参照により本明細書に取り入れる) 。マツクラ（Matsukura）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ ー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.）第８６巻： ４２４４頁には、ｒｅｖ配列を標的とするホスホロチオエート結合オリゴヌクレ オチドを用いる、宿主細胞を殺さない、慢性的に感染した細胞におけるＨＩＶ発 現の阻害が記載されている。 さらに、アンチセンス機構によるウイルスの阻害のほかに、オリゴヌクレオチ ドは、配列非特異的機構でウイルスを阻害することができる。例えば、マジュム ダー（Majumdar）ら,バイオケミストリー（Biochemistry）第２８巻：１３４０ 頁（１９８９年）には、ＨＩＶ逆転写酵素を阻害するためのホスホロチオネート オリゴヌクレオチドの使用が記載されている。 発明の概要 本発明は、ヒト・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製を阻害するための化合物 および方法を記載する。好ましいＨＩＶ標的部位は同定され、標的部位にハイブ リダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドが記載されている。オリゴヌ クレオチドの好ましい使用は、ＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶ複製を阻害するた めの抗ＨＩＶ剤としての使用である。本発明の他の使用は、検出プローブまたは 増幅プライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用することによりＨＩＶの存在を 検出すること、ＨＩＶ複製を阻害するオリコヌクレオチドの能力を測定して ＨＩＶ表現型に対する抗ＨＩＶ剤としてのその適性を評価すること、あるいは患 者におけるＨＩＶの存在を診断することを包含する。 記載されたオリゴヌクレオチドは特異的ＨＩＶ核酸配列を標的とし、異なる機 構の組み合わせによりＨＩＶを阻害すると考えられる。予想される１の機構は、 ＨＩＶ標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、および それによるＨＩＶ標的核酸からの蛋白生産の阻害を包含する。他の機構は、本発 明オリゴヌクレオチドによるＨＩＶ複製の阻害における役割も果たしうる。所望 オリゴヌクレオチドがアンチセンス機構以外の機構によりその効果を発揮すると いう可能性を排除または無視するつもりはない。実際、ホスホチオレートオリゴ ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド：標的ハイブリダイゼーションを必要とし ない機構によりＨＩＶ複製を阻害することができ；ホスホロチオネートオリゴヌ クレオチドはＨＩＶ逆転写酵素を阻害し、ｇｐ１２０の結合およびプロテインキ ナーゼＣ（ＰＫＣ）のリン酸化活性を阻害することができるかもしれない。 記載されたヌクレオチドは、ウイルス複製に必要な蛋白をコードしているＨＩ Ｖゲノムの保存的なヌクレオチド配列領域、すなわち、プライマー結合部位（ｐ ＢＳ）、ｐｓｉ、ｔａｔ、ｖｐｒ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、およびｎｅｆを標的とする 。ｔａｔまたはｖｐｒに存在する核酸配列（「標的部位１」,ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ. ９４）、あるいはｔａｔ、ｒｅｖおよびｅｎｖ、ならびにｎｅｆ ｍＲＮＡに存 在するヌクレオチド配列（「標的部位２」,ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９５）を標的とす るいくつかのオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ複製の阻害に特に有効である。好ま しいオリゴヌクレオチドは、標的部位１または標的部位２に存在する核酸配列領 域に完全に相補的である。これらの好ましいオリゴヌクレオチドの２つの例を、 標的部位１に完全に相補的なＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３５、および標的部位２に完全 に相補的なＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８により示す。 よって、第１の態様において、本発明は、精製オリコヌクレオチドを用いるＨ ＩＶ複製の阻害方法を特徴とする。該方法は、ＨＩＶ感染細胞を２０ないし１０ ０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドと接触させる工程からなる。該オリ ゴヌクレオチドは、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９４またはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９５の ＨＩＶ核酸配列に存在する２０ヌクレオチドの核酸配列領域に実質的に相補的で ある。該オリゴヌクレオチドは、必要とされるＨＩＶ核酸の正常な活性を減じる ことによりＨＩＶ複製を阻害すると予想される。複製に必要なＨＩＶ核酸の正常 な活性は、ＨＩＶ ＲＮＡの逆転写、ＨＩＶ ｍＲＮＡ合成およびゲノムＨＩＶ ｍＲＮＡのパッキングを包含する。 インビボでのハイブリダイゼーション条件は、約３７℃の生理学的温度を包含 する。インビボでの条件は、比較的低温で行われ、完全には相補的でない核酸間 のハイブリダイゼーションが起こり得ることから、診断的プローブのハイブリダ イゼーションアッセイ条件と比べれば低い緊縮性の条件である。インビボまたは インビトロでのハイブリダイゼーションに対して必要な相補性の程度は、隣接す る相補的塩基のセグメント長、水素結合に関与する塩基のタイプ（例えば、Ｇ： Ｃ水素結合の形成はＡ：Ｔ水素結合よりも強力である）、内部での付加または欠 失、およびオリゴヌクレオチドの構造的な化学修飾のごとき因子により影響され る。好ましくは、完全に相補的なな核酸鎖と比較した場合、１５個の「隣接」し た相補的塩基のうち塩基の２個またはそれ以下、より好ましくは１個またはそれ 以下、最も好ましくは０個の塩基対がミスマッチであり、かつ内部で欠失および ／または内部で付加がされているものである。各ＨＩＶタイプの塩基配列は異な る可能性があるので、ＨＩＶに対する特定のオリゴヌクレオチドの相補性は、患 者に感染する実際のＨＩＶ鎖またはイソ型に依存するであろう。 「ハイブリダイズ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸と安定な ２本鎖（すなわち、検出可能な２本鎖）を形成し、そのことにより当該核酸の正 常な活性を減じることを意味する。オリゴヌクレオチドと標的ＨＩＶ核酸との間 のハイブリダイゼーションは、好ましくは、インビボ条件において標的ウイルス 核酸に特異的である。しかしながら、インビボ条件下でウイルス標的部位および 非標的細胞性部位の双方と２本鎖を形成しうる抗ウイルスオリゴヌクレオチドは 、インビボにおける抗ウイルス剤としてさらに有用であるかもしれない。ウイル ス核酸活性の阻害と細胞性核酸活性の阻害との間の十分な認識のごとき異なる因 子により、あるいはＨＩＶ発現に必要な細胞性因子に対する影響により、インビ ボ での有効性を決定してもよい。 「実質的に相補的」な核酸配列は、オリゴヌクレオチドが核酸配列にハイブリ ダイズして検出可能な２本鎖を形成できることを意味し、核酸配列に完全に相補 的な核酸と比較して、好ましくは０ないし１０％、好ましくは０ないし５％のヌ クレオチド塩基の相違を有することを意味する。ヌクレオチド塩基の相違は、ミ スマッチ、内部付加および／または内部欠失を包含する。 用語「精製された」は、ある程度の人間の介在なしには天然に見いだすことの できない形態のオリゴヌクレオチドをいい、また、外来性核酸で組み換えられて いるオリゴヌクレオチドをいう。精製されたオリゴヌクレオチドを、化学合成、 および組み換え型核酸分子、例えばレトロウイルスベクターからのインビトロま たはインビボ発現のごとき当該分野で知られた方法により製造することができる 。 他の態様は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８〜２０ならびに２２〜２９、およびＳＥ Ｑ.ＩＤ.ＮＯ.６５〜６７ならびに６９〜７６により示されるそれらに対するＲ ＮＡ等価物（標的部位２）；さらにＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３５ならびに３８〜４６ 、およびＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８２ならびに８５〜９３により示されるそれらに対 するＲＮＡ等価物（標的部位１）からなる群より選択されるヌクレオチド配列領 域を必須としてなる、またはこれらを有する、あるいはこれらに実質的に相補的 な精製ヌクレオチドを用いてＨＩＶ複製を阻害する方法を記載する。 核酸配列についての「必須としてなる」とは、特定のヌクレオチド配列と比べ ると０ないし１０％、好ましくは０ないし５％のヌクレオチド塩基の相違（ＲＮ ＡまたはＤＮＡ等価ヌクレオチドを除く）を有し、特許請求されている活性（す なわち、抗ＨＩＶ活性）を有する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを意味する 。ヌクレオチド塩基の相違は、ミスマッチ、内部付加および／または欠失を包含 する。さらに、「必須としてなる」という語句は、４個までのさらなる付加また は２個までの外部欠失というサイズ制限を提供する。さらなるヌクレオチドは、 ＨＩＶ核酸に対して相補的であってもよく、相補的でなくてもよい。 「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物」は、同じ相補的塩基対のハイブリダイセーショ ン特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子をいう。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は異 なる糖基（すなわち、デオキシリボースに対するリボース）を有し、ＲＮＡにお けるウラシルおよびＤＮＡにおけるチミジンの存在により異なってもよい。ＲＮ ＡおよびＤＮＡ等価物は特定の配列に対して同程度の相補性を有する。 好ましくは、オリゴヌクレオチドをＨＩＶ感染患者の治療的処置に使用する。 「治療的」は、ＨＩＶ感染により引き起こされる疾病の治療または予防をいう。 「治療上有効量」は、ＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶ複製を阻害する量である。 好ましくは、治療上有効量は、ＨＩＶ感染に関連する１つまたはそれ以上の徴候 をある程度緩和する。 別の態様は、標的部位１または標的部位２に存在する２０ヌクレオチドの核酸 配列領域に実質的に相補的な２０ないし１００ヌクレオチドの精製オリゴヌクレ オチドからなる、ＨＩＶ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを記載する。 他の態様において、本発明は、標的部位１または標的部位２に存在するＨＩＶ 核酸配列を標的とする（すなわち相補的な）特定の核酸配列を有する、これらを 必須としてなる、あるいは実質的にこれらに対応するオリゴヌクレオチドを特徴 とする。 標的部位２に対するオリゴヌクレオチドに特異的な核酸配列はＳＥＱ.ＩＤ.Ｎ Ｏ.１８〜２０ならびにに２２〜２９に示され、それらに対するＲＮＡ等価物は ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.６５〜６７ならびに６９〜７６に示される。標的部位１に対 するオリゴヌクレオチドの特異的な核酸配列はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３５ならびに に３８〜４６に示され、それらに対するＲＮＡ等価物はＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８２ ならびに８５〜９３に示される。 本発明オリゴヌクレオチドは、一般的には、インビトロで合成され、治療組成 物として細胞中に導入されうる。標的部位の核酸配列を含むベクターにより該オ リゴヌクレオチドを細胞中に導入することもできる。かかるベクターは、アンチ センスオリゴヌクレオチドとして機能しうるＲＮＡをコードしている。イズナト （Iznat）ら,サイエンス（Science）第２２９巻：３４５〜３５２頁（１９８５ 年）参照。 個々のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットを、ホスホジエステル 結合もしくは修飾結合により、またはアンチセンス分子のハイブリダイゼーショ ン特性を妨害しない非ヌクレオチド部分により結合してもよい。修飾結合は、標 準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホス ホジチオエートまたはホスホセレネート結合のごとき異なる結合で置換されてい る結合を包含する。修飾結合は、一般的には、ホスホジエステル結合よりもヌク レアーゼ分解に抵抗性がある。 オリゴヌクレオチドがその標的核酸とハイブリダイゼーションすることを妨害 しないオリゴヌクレオチドの修飾も、本発明に包含される。修飾オリゴヌクレオ チドは、当該オリゴヌクレオチドがＨＩＶ活性または複製を阻害することを妨害 しない修飾された糖基を有していてもよい。同様に、オリゴヌクレオチドは、当 該オリゴヌクレオチドがＨＩＶを阻害することを妨害しない修飾プリンまたはピ リミジン塩基を有していてもよい。 標的部位１および２を標的とする、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌ クレオチドはＨＩＶ遺伝子発現を阻害することが見いだされた。実際、標的部位 １および２を標的とする、共有結合した１３〜１００個のヌクレオチドを有する アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明において活性がある。 さらに本発明は、上記ヌクレオチドおよびかかるオリゴヌクレオチドをコード しているベクターの使用方法を特徴とする。本発明の他の特徴および利点は、以 下の好ましい本発明の具体例の記載および請求の範囲から明らかであろう。 発明の詳細な説明 本発明は、ＨＩＶゲノムおよびｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドに関 する。該オリゴヌクレオチドは、特定のＨＩＶ核酸配列とハイブリダイズするよ うに設計されており、好ましくはＨＩＶ複製の阻害に使用される。該オリゴヌク レオチドは、ＨＩＶ複製を阻害する能力および／またはＨＩＶ核酸配列にハイブ リダイズする能力に関連した種々の用途を有する。かかる用途は、治療剤として の用途および診断アッセイにおける用途を包含する。 抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドのみを用いてＨＩＶ複製を阻害することができ、 あるいは他の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドもしくは抗ＨＩＶ治療と組み合わせて ＨＩＶ複製を阻害することができる。例えば、第１の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチ ドを第２の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。第 ２の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、１）副標的オリゴヌクレオチド、２）第２ の別の標的オリゴヌクレオチド、または３）非標的ホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドのいずれかであってよい。副標的オリゴヌクレオチドは、第１の標的 オリゴヌクレオチドの標的領域の副標的領域にハイブリダイズするように設計さ れている。よって、副標的オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの 切断された部分を含む。副標的／標的オリゴヌクレオチドの組み合わせの例は、 ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびＳＥＱ. ＩＤ.ＮＯ.２２のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの混合比１０対１のも のである。 以下の核酸配列が提供される： これらの配列を含む、これらの配列からなる、これらの配列に実質的に対応す る配列を含む、これらの配列を必須としてなるオリゴヌクレオチドは、本発明の １つまたはそれ以上の態様において有用である。 「実質的に対応する」は、特定の配列と比較して、同一であるか、または２０ ％を超えないヌクレオチド塩基の相違を有する（ＲＮＡまたはＤＮＡ等価ヌクレ オチドを除く）核酸配列を有し、特許請求された活性（すなわち抗ＨＩＶ活性） を有するオリゴヌクレオチドをいう。ヌクレオチド塩基の相違は、ミスマッチ、 内部付加および／または内部欠失を包含する。特定の配列の外部のさらなるヌク レオチドが存在してもよい。さらなるヌクレオチドはＨＩＶ核酸に対して相補的 であってもよく、非相補的であってもよい。好ましくは、実質的に対応する配列 は、当該特定の配列と比べて１０％未満、より好ましくは５％を超えない相違を 有する。 Ｉ.ＨＩＶ増殖の阻害 ＨＩＶ標的部位１および２を標的とするオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ遺伝子 発現の阻害に特に有効である。標的部位１はｔａｔおよびｖｐｒをコードするエ キソン中に存在する。標的部位２はｔａｔ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、およびｎｅｆをコ ードするエキソン中に存在する。１つ以上の遺伝子における同じ標的部位の存在 は、ＨＩＶゲノムにおける重複エキソンによる。重複エキソンの結果として、Ｈ ＩＶゲノム中のいくつかの遺伝子は、１つまたはそれ以上の読み取り枠中に多く の同じ核酸配列を含んでいる。シュワルツ(Schwartz)ら,ジャーナル・オブ・ウ イロロジー（Journal of Virology）第６４巻：２５１９頁（１９９０年）。 ＨＩＶを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を以下に詳述する 。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、当業者は、本願を指標として 、下記領域を標的とする等価なオリゴヌクレオチドが容易に設計され、合成され うることを認識するであろう。 Ａ.標的部位１および２の選択 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、弱い、あるいは強い２次構造を有する保 存的ＨＩＶ核酸配列を標的としていた。異なるＨＩＶ株の１次配列を、ＨＩＶ核 酸配列を記載する種々の刊行物から得た。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、 ＨＩＶのＨＸＢ−２株に関して公表されたＨＩＶ核酸配列を基礎として設計した 。必須のウイルス蛋白をコードしている保存的１次核酸配列を、ＨＩＶの異なる 株に関する公表されたＨＩＶ配列と比較することにより選択した。当該分野で知 られた方法を用いて、１次核酸配列から２次構造を予想した（例えば、ズッカー ,エム（Zucker,M）,メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology ), 第１９０巻,２６２頁（１９７９年））。 別の推理によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、弱い、あるいは強い ２次構造を有する核酸配列を標的としていた。２次構造は、相補的ヌクレオチド 間の分子内水素結合の形成により生じる。２次構造が弱いほど、水素結合の形成 の可能性は小さい。Ｂ.標的部位１および２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計 標的部位１および２のヌクレオチド配列をそれぞれＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９４お よび９５にに示す。これらの配列に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチ ドがＨＩＶ複製を阻害する能力は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９４または９５を標的と する他のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＨＩＶ遺伝子発現の阻害に有効であ ろうということを示す。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８および３５は、それぞれＳＥＱ. ＩＤ.ＮＯ.９５および９４に相補的である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８および３５ の延長バージョンおよび切断バージョンはともにＨＩＶ複製の阻害に用いること ができる。 ＨＩＶ複製の阻害に用いるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８および３５の適当なバージ ョンの決定において、いくつかの因子が重要である。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８お よび３５のバージョンは、生理学的条件下でＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.９５または９４ と十分にハイブリダイズでき、核酸活性を阻害するものでなくてはならない。ハ イブリダイゼーションに影響する因子は、塩基組成、オリゴヌクレオチド修飾お よびオリゴヌクレオチドサイズを包含する。 オリゴヌクレオチドの設計において重要である他の因子は、相補的領域の長さ 、グアニンおよびシトシン残基のパーセンテージ、オリゴヌクレオチド結合のタ イプ、そしてハイブリダイゼーションのための標的配列のアクセスし易さである 。これらの因子は当該分野において知られている。ブリテン,アール・ジェイ（B ritten,R.J.）およびデイビッドソン,イー・エイチ（Davidson,E.H.）,ハイブリ ダイゼーション・ストラテジー・イン・ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイ ゼーション（Hybridization Strategy In Nucleic Acid Hybridization）（ビ ー・ディー・ヘイムス（B.D.Hames）およびエス・ジェイ・ヒギンス（S.J.Higgi ns）編）ワシントンＤＣのＩＲＬプレス（IRL Press）（１９８５年）参照。こ れらを参照により本明細書に取り入れる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、好ま しくは、長さ１８ないし５０ヌクレオチド、より好ましくは、長さ２０〜３５ヌ クレオチドである。一定の場合におけるこれらの因子の重要性を、最初にインビ トロで、次いで、インビボでの研究により決定することができる。 １.オリゴヌクレオチドの修飾 オリゴヌクレオチドを修飾してそれらの抗ＨＩＶ活性および治療活性を高める ことができる。好ましい修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込み、オリ ゴヌクレオチドの安定性を高め、ＨＩＶ増殖を阻害する。活性および／または細 胞への取り込みが増大した修飾オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド 間結合および糖基を修飾されたオリゴヌクレオチドを包含する。修飾されたヌク レオチド間結合の例は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスホ ロジチオエートを包含する。修飾された糖基の例は、α−アノマーおよび２'− Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドを包含する（カンチン（Cantin）およびウールフ （Woolf）,トレンズ・イン・マイクロバイオロジー（Trends in Microbiology） 第１巻：２７０〜２７６頁,１９９３年）。 抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ホスホロチオエート結合を含む 。ホスホロチオエート結合はオリゴヌクレオチド安定性を増大させ、オリゴヌク レオチドの細胞への取り込みを容易にし、一部には配列依存性と考えられる機構 によるオリゴヌクレオチドのＨＩＶ増殖の阻害を可能にする。よって、ホスホロ チオエート結合したオリゴヌクレオチドは、その核酸配列に基づいて特異的なＨ ＩＶ標的部位を標的にすることによりＨＩＶを阻害し、さらに特異的配列に依存 しない機構によりＨＩＶを阻害する。 ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドはウイルス逆転写酵素を 阻害することができ、さらにＣＤ４受容体へのｇｐ１２０の結合およびＰＫＣの リン酸化活性を阻害しうる。ウイルス逆転写酵素阻害効果は、ホスオロチオエー トオリゴヌクレオチドのサイズが大きくなるにつれて増大する。ホスホロチオエ ート結合を有するオリゴヌクレオチドは、コーエン（Cohen）ら,米国特許第５, ２６４,４２３号、およびキンチントン（Kinchington）ら,アンタイバイラル・ リサーチ（Antiviral Research）第１７巻：５３〜６２頁,１９９２年に記載さ れている。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対する細胞の対応は、オリゴヌクレ オチド取り込みおよび安定性の測定実験において、ホスホジエステルオリゴヌク レオチドよりも一貫して１０倍大きかった。この効果の一部は、ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みがホスホジエステルオリゴヌクレオ チドよりも多いことによると思われ、その効果の一部は、増大したホスホロチオ エートオリゴヌクレオチドの安定性によるものである。取り込み機構の相違は、 細胞の会合に対して、オリゴヌクレオチドの安定性の相違よりも大きい影響を有 すると思われる。 シエリー（Thierry）およびドリチロ（Dritschilo）,ヌクレイック・アシッズ ・リサーチ第２０巻：６５９１〜５６９８頁（１９９２年）もまた、ホスホロチ オエート結合の存在によるオリゴヌクレオチドの取り込みおよび安定性の向上を 観察した。シエリーは、１００％のホスホロチオエート結合を有する第１のオリ ゴヌクレオチドおよび末端をホスホロチオエート基でキャップした第２のオリゴ ヌクレオチド（すなわち、両端に２個のホスホロチオエート修飾を有するオリゴ ヌクレオチド）は、どちらもホスホジエステル結合のみを有するオリゴヌクレオ チドよりも安定であり、非常によく細胞に取り込まれることを見いだした。 ２.オリゴヌクレオチドのサイズ 最適なオリゴヌクレオチドのサイズを、異なる抗ＨＩＶ機構およ細胞への取り 込みについて考慮すべきである。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、好ましくは、 長さ１８ないし１００ヌクレオチドであり、好ましい核酸配列または実質的に好 ましい核酸配列に対応した核酸配列を含む。かかるオリゴヌクレオチドは同定さ れた標的部位を標的とする。好ましい核酸配列のさらなるヌクレオチドは ＨＩＶ核酸に相補的であってもよく、あるいは非相補的であってもよい。より好 ましくは、これらのヌクレオチドは長さ１８ないし５０ヌクレオチドである。最 も好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さ２０ないし３５オリゴヌクレオチドで ある。 長いオリゴヌクレオチドにありうる不利は、オリゴヌクレオチドの取り込みの 減少および細胞毒性効果の増加を包含する。これらの効果の程度は、少なくとも 一部は、オリゴヌクレオチドのサイズおよびオリゴヌクレオチド結合のタイプに より決定される。例えば、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを 用いた場合、ありうる細胞毒性効果はより著しい。 標的配列に相補的な長い核酸配列を有するオリゴヌクレオチドは、短いオリゴ ヌクレオチドと比べると、標的特異性の増加およびオリゴヌクレオチド：標的２ 本鎖の安定性の増加をはじめとするいくつかの利点を提供する。オリゴヌクレオ チド：標的の２本鎖の安定性の増加は、異なる様式でオリゴヌクレオチドのＨＩ Ｖ阻害効果を容易にする可能性がある。例えば、主たる効果が翻訳抑制である場 合、２本鎖の増加した安定性は、リボゾームのオリゴヌクレオチド置換を妨害す ることにより、翻訳抑制を増大させることができる。 ありうる機構の別の例は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素でのＤＮＡ：ＲＮ Ａ ＨＩＶ２本鎖のＲＮＡ鎖の分解を包含する。この場合、２本鎖の増大した安 定性は、２本鎖が酵素作用を受けるという可能性を増加させる。ＲＮａｓｅＨ活 性により分解されるためには、好ましくは、ＤＮＡ：ＲＮＡ ＨＩＶ２本鎖中の 抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドが、３個またはそれ以上の隣接したホスホジエステ ルまたはホスホロチオエート結合を有することである。 ３.オリゴヌクレオチド相補性および融解温度 上述の通り、相補的オリゴヌクレオチドは、標的配列領域とハイブリダイズす るように設計される。完全には相補的でない核酸が、生理学的条件下では互いに ハイブリダイズするかもしれず、一般的には、完全に相補的な塩基配列の最長の 長さがハイブリッドの安定性を決定する。特定の配列領域にハイブリダイズする ように設計されるオリゴヌクレオチドは、適当な融解温度（Ｔｍ）（５０％のオ リゴヌクレオチドがその標的核酸とハイブリダイズする温度）を有するように設 計されるべきである。プローブ長およびヌクレオチド組成（Ａ＋Ｔに対するＧ＋ Ｃのパーセンテージ）を変更することにより、適当なＴｍを得ることができる。 プローブ長およびヌクレオチド組成は、生理学的温度（３７℃）よりも約２〜１ ０℃高いＴｍをもたらすべきである。 オリゴヌクレオチド上の相補的領域が長いほど標的配列に対する水素結合が多 くなり、一般的には、Ｔｍが高くなる。Ｇ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対よりも強力 な水素結合を示し、それゆえ高い熱安定性を示すので、ＧおよびＣのパーセンテ ージの増大もまたＴｍを上昇させる。アーノルド（Arnold）らの「ホモジーニア ス・プロテクション・アッセイ（Homogeneous Protection Assay）」と題された ＥＰＯ出願番号８８３０８７６７（公開番号３０９２３０）、およびネルソン（ Nelson）ら，「ノンアイソトーピック・ＤＮＡプローブ・テクニックス（Noniso topic DNA Probe Techniques）」２７５頁（サンジエゴのアカデミックプレス（ Academic Press）（クリッカ（Kricka）編））によるハイブリダイゼーション・ プロテクション・アッセイ（ＨＰＡ）によりハイブリダイゼーションを測定する ことのような当該分野で既知の方法を用いてＴｍを決定することができる（これ らの文献を参照により本明細書に取り入れる）。アーノルド（Arnold）らの「ア クリジニウム・エステル・ラベリング・アンド・ピューリフィケイション・オブ ・ヌクレオチド・プローブス（Acridinium Ester Labeling and Purification o f Nucleotide Probes）」と題されたＰＣＴ／ＵＳ８８／０３３６１（参照によ り本明細書に取り入れる）に記載のごとく、オリゴヌクレオチドをアクリジニウ ムエステル誘導体で標識することができる。 以下の方法でＨＰＡを用いてＴｍを測定することができる。オリゴヌクレオチ ドをアクリジニウムエステルで標識する。コハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍコ ハク酸リチウム緩衝液（ｐＨ５．０）、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ ＴＡ）、２ｍＭ エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）Ｎ ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウ ム）中で、過剰量のＨＩＶ ＲＮＡ標的を用いてオリゴヌクレオチド：標的ハイ ブリッドを形成させる。次いで、核酸ハイブリッドを含有する溶液の一部をコハ ク酸リチウム緩衝液で希釈する。その一部を、予想されるＴｍから２〜５℃きざ みで温度を上昇させた種々の温度で５分間インキュベーションする。次いで、溶 液を温和なアルカリ性のホウ酸緩衝液（０．１５Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ^RＸ−１００）で希釈し、低温で１０分 間インキュベーションする。これらの条件下で、１本鎖オリゴヌクレオチドに結 合したアクリジンエステルが加水分解されるが、ハイブリダイズしたオリゴヌク レオチドに結合したアクリジニウムエステルは比較的加水分解から防御される。 よって、加水分解処理後に残存するアクリジニウムエステル量は、試料中の存在 するハイブリッド分子の数に比例する。残存しているアクリジニウムエステルを 、過酸化水素およびアルカリを溶液に添加することによる化学発光をモニターす ることにより測定することができる。化学発光をルミノメーター（例えばＧｅｎ −ＰｒｏｂｅＬＥＡＤＥＲ^RＩまたはＬＥＡＤＥＲ^R５０）で測定することができ る。得られたデータを、温度に対する最大シグナルのパーセントとしてプロット する（通常は低温からプロット）。このアッセイにおいて、Ｔｍは、最大シグナ ルの５０％が残存する温度であると決定される。さらに、上記方法以外に、当該 分野でよく知られたアイソトープ法によりＴｍを決定してもよい（例えば、ホー ガン（Hogan）ら,上記参照）。 ４.スクリーニングアッセイ 生理学的条件を模倣するように設計されたオリゴヌクレオチドスクリーニング アッセイによりオリゴヌクレオチドをスクリーニングして生理学的条件下で起こ ると期待されるハイブリダイゼーションの測定値を得ることもできる。生理学的 条件の複雑さのため、該オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイは、細胞中 の実際のハイブリダイゼーション挙動の正確な予想というよりもむしろ近似値を 与える。試験ＤＮＡオリゴヌクレオチド、試験オリゴヌクレオチドと同じ配列を 有するアクリジンエステル標識オリゴヌクレオチド、およびＲＮａｓｅ Ｈ活性 を有する酵素を用いてオリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイを行うことが できる。 該アッセイは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＲＮＡ標的にハイブリダイズして ＤＮＡ：ＲＮＡ２本鎖を形成する能力を、引き続いてのＲＮａｓｅＨ活性による 標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ活性による分解を測定することにより測定するもので ある。アクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドを用いて残存する標的核 酸を検出する。 以下のようにオリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイを行うことができる 。 １）水性の生理学的緩衝液のごとき溶液中でオリゴヌクレオチドをその標的核 酸配列にハイブリダイズさせる。標的核酸の例は精製ＨＩＶ ｍＲＮＡである。 １００μｌの生理学的緩衝液中の０.９ｐｍｏｌの標的ｍＲＮＡ、０.１ｐｍｏｌ のアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、３７℃で２時間、ハイブリダ イゼーションを行うことができる。最適なＲＮａｓｅＨ酵素活性のための１ｘ最 終緩衝液濃度において反応物を分配して２系にする。 ２）イー・コリ（E.coli）のＲＮａｓｅＨ（メリーランド州ゲイサースバーグ のライフ・テクノロジーズ（Life Technologies）製、０.４Ｕ／反応）を２系に なった反応物の一方に添加する。他方にはＲＮａｓｅを入れず、（−）ＲＮａｓ ｅ対照として役立てる。反応を３７℃で１時間行い、９５℃で５分間変性させ、 次いで、直接氷上に置くことにより反応停止する。 ３）反応物の一部を適当なホスホジエステルアクリジニウムエステル−プロー ブとハイブリダイズさせる。適当なアクリジニウムエステル標識プローブは、試 験オリゴヌクレオチドと同じ核酸配列とハイブリダイズすることができ、相補的 領域にアクリジニウムエステルを含むことができる。アクリジニウムエステル標 識プローブを６０℃で１時間ハイブリダイズさせる。標的核酸配列以外の領域に ハイブリダイズすると考えられるアクリジニウムエステル−プローブを用いて対 照のハイブリダイゼーションを行う。 ４）反応物の一部をハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍ コハク酸リチ ウム緩衝液（ｐＨ５．０）、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ ｍＭ エチレングリコールビス（ベータ−アミノエチルエーテル）Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ '四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中に希釈する 。１２ｘ７５ｍｍのルミノメーター試験管中で、５０マイクロリットルの複製物 を、３００μｌの０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５％（ｖ／ｖ） ＴＲＩＴＯＮ^RＸ−１００とともに、６０℃で十分加水分解されるまで加水分解 する（通常６〜８分）。１.５Ｎ ＮａＯＨ、０.１％ Ｈ₂Ｏ₂を１回添加して化 学発光を生じさせ、ルミノメーターで測定する。 当業者に理解されるように、本法の変法を行うことができる。例えば、異なる 量の試薬およびインキュベーション時間を用いてアッセイを行うことができる。 Ｃ.治療活性 本明細書記載のオリゴヌクレオチドのＨＩＶ阻害活性は、いかなる理論にも限 定されない。インビボにおいてウイルス核酸と十分にハイブリダイズしてウイル ス核酸活性を阻害することにより、記載されたオリゴヌクレオチドがウイルス複 製を阻害しうると考えられる。 １.標的の識別 記載したオリゴヌクレオチドは、ウイルス核酸と十分にハイブリダイズしてウ イルス核酸活性を阻害するが、必須の細胞性核酸には十分にハイブリダイズせず 必須の細胞性核酸活性を阻害することなく、治療薬として機能する。必須の細胞 性核酸活性は細胞増殖または生命維持に必要な核酸活性である。細胞性核酸の核 酸活性は、細胞性ｍＲＮＡの翻訳およびプロセッシングを包含する。 ウイルス性核酸および必須の細胞性核酸の間を十分に識別できないアンチセン スオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ感染細胞にのみ送達されることにより（例えば 、ＨＩＶ感染細胞を標的とする認識分子を含有するリポソームを用いて）、治療 薬として作用する可能性がある。 異なるオリゴヌクレオチドの相対的な潜在活性の評価を、オリゴヌクレオチド のハイブリダイゼーション挙動により行うことができる。細胞内環境が非常に複 雑で、完全には知られていないために、インビボ条件下での正しい２本鎖化は著 しく困難である。そのうえ、ウイルスの標的のアクセス可能性および活性に影響 を及ぼしうる、細胞中に存在する核酸結合蛋白がある。 インビボでのハイブリダイゼーション活性をインビトロにおいてモデル化する ことができる（例えば、３７℃の標準的な生理学的セイラインまたは０．１２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ〜７．０）を用いる）。コーン（Kohne）の米国特許第４,８ ５１,３３０号、またはマニアティス（Maniatis）ら,モレキュラー・クローニン グ（Molecular Cloning）,ニューヨークのコールドスプリングハーバープレス（ Cold Spring Harbor Press）（１９８２年）に従って（両文献を参照により本明 細書に取り入れる）、インビトロ定量的アッセイを用いてハイブリダイゼーショ ンを調べることができる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、イ ンビボにおいて特別に標的とハイブリダイズする。しかしながら、絶対的な特異 性は必要ない。むしろ、アンチセンスオリゴヌクレオチドがウイルス性および細 胞性核酸を十分に識別でき、その結果、有意な細胞毒性を引き起こすことなくウ イルス増殖が阻害されうるべきである。特別なオリゴヌクレオチド濃度において 、ウイルス増殖よりも細胞増殖が阻害される場合に、有意な細胞毒性が生じる。 細胞毒性および化合物の効力を、異なる方法を用いて決定することができる。標 的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を特徴づけることにより 、最初のスクリーニングを行うことができる。引き続いて細胞毒性および／また は効力の試験を、細胞培養および動物モデルを用いて行うことができる。 インビボにおいて細胞性およびウイルス性核酸活性を識別する能力を、インビ トロにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を測定することにより評 価することができる。アンチセンス機構に関して測定される効力／毒性の比は、 特異性の増大とともに増加すると考えられる。特異性を、この目的のために最適 化された緊縮ハイブリダイゼーション条件下で全細胞性核酸を用いて測定するこ とができる。好ましくは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識ヌクレオチドを 用いて特異性を決定し、アーノルド（Arnold）らの「ホモジーニアス・プロテク ション・アッセイ（Homogeneous Protection Assay）」と題されたＥＰＯ出願番 号８８３０８７６７（公開番号３０９２３０）（参照により本明細書に取り入れ る）によるハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（ＨＰＡ）を用 いてハイブリダイゼーションを検出する。 ＡＥ標識オリゴヌクレオチドともに用いる緊縮ハイブリダイゼーション条件の 例は、（１）０.０９５Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５）、０.３１Ｍラウリル硫酸 リチウム、１.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１.５ｍＭ ＥＧＴＡを含有する溶液中、５０ ℃で１時間のハイブリダイゼーション；次いで（２）０.０５Ｍコハク酸リチウ ム（ｐＨ５）、０.６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１ ０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ中、５０℃で１５分、次いで、０.６Ｍ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８.５）を３００μｌ添加し、１％ＴＲＩＴＯＮ^RＸ−１ ００中、６０℃で５〜７分、を包含する。 アンチセンスオリゴヌクレオチドがＨＩＶ感染細胞から単離された核酸（全細 胞性ＲＮＡおよび／またはｓｓＤＮＡ）にハイブリダイズする場合には、ＨＩＶ 特異的なハイブリダイゼーションが判定でき、対照実験から得られるバックグラ ウンドシグナルの２倍となる。対照実験系は細胞性核酸のみを含む。好ましくは 、ＨＩＶ核酸へのハイブリダイゼーションから得られるシグナルは、バックグラ ウンドシグナルよりも少なくとも５倍大きいものである。 ２.オリゴヌクレオチドの投与 記載されたオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸活性を阻害することにより、Ｈ ＩＶ感染患者の治療に有用である。抗ウイルスオリゴヌクレオチドを用い、異な る処方および投与経路を用いてＨＩＶ患者を治療することができる。適当な投与 経路は、筋肉内、エアロゾル、経口（錠剤またはピル形態）、全身、眼、腹腔内 および鞘内である。 オリゴヌクレオチドとしてそのまま、発現ベクター（かかるアンチセンス分子 をコードしている）により、あるいは生理学的に許容される処方として、アンチ センスオリゴヌクレオチドを導入することができる。適当な処方は、リポソーム 、除放性担体、イオントホレシス（iontophoresis）を用いるもの、イオン対分 子、共有結合付加物、および他の薬理学的に適当な送達方法を包含する。 異なるタイプの送達方法は本発明において有用である。それは、オリゴヌクレ オチド修飾、粒子担体薬剤送達ビヒクル、およびレトロウイルス発現ベクターを 包含する。ホスホジエステル結合により結合したアンチセンスオリゴヌクレオチ ドはゆっくりと細胞に取り込まれる。細胞への取り込みを促進するために、アン チセンスオリゴヌクレオチドをホスホジエステル結合において修飾してその電荷 を減少させてもよい。例えば、個々のヌクレオチドをメチルホスホネート結合に より結合してもよい。 電荷を減少させるアンチセンスの修飾は、これらの大型分子の細胞への取り込 みを促進するための１つのアプローチに過ぎない。ヌクレアーゼ分解に対する感 受性を低下させるように修飾を設計することもできる（例えば、ホスホロチオエ ート結合を使用）。 全身投与および局所投与双方のために薬剤送達ビヒクルを選択することができ る。除放性リザーバーといて役立つように、あるいはその内容物を標的細胞に直 接送達するようにこれらのビヒクルを設計することができる。直接送達薬剤ビヒ クルを用いる利点は、１回の取り込みで複数の分子が送達されることである。か かるビヒクルは、かかるビヒクルなしでは血流から急速に除去されてしまう薬剤 の循環半減期を延長することが示されている。このカテゴリーに属するかかる特 別な薬剤送達ビヒクルのいくつかの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキ ストリン、生分解性ナノカプセル、および生体付着性微小球である。 薬剤送達としてのリポソームの使用はいくつかの利点を提供する。リポソーム は細胞内安定性を向上させ、取り込み効率を向上させ、生物学的活性を改善する 。リポソームは、細胞膜を形成している脂質と同様の様式で配列された脂質から なる中空小胞である。リポソームは、水溶性化合物を封入するための内部水性空 間を有し、直径０.０５ないし数ミクロンのサイズ範囲である。いくつかの研究 は、リポソームが核酸を細胞に送達でき、核酸は生物学的に活性のままであるこ とを 示している。例えば、もともと研究の道具として設計されたリポソーム送達ビヒ クルであるリポフェクチン（Lipofectin）は、無傷の核酸分子を細胞に送達する ことができる。 リポソームを使用することの特別な利点は以下のことを包含する。それらは成 分的に無毒で生分解性である；それらは長い循環半減期を示す；組織を標的とす る認識分子をその表面に容易に結合させることができる。最終的に、液状懸濁物 または凍結乾燥製品のいずれにせよ、リポソームに基づく医薬品のコスト的に効 率のよい製造は、満足な薬剤送達システムとしてのこの方法の有効性を示した。 アンチセンスオリゴヌクレオチドを全身的に投与してもよい。全身的な吸収は 、血流中での薬剤の蓄積と、その後の全身への分配をいう。全身的吸収を誘導す る投与経路は、静脈、皮下、鼻腔内、鞘内および眼からの経路を包含する。これ らの各投与経路は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをアクセス可能な障害細胞 に曝露する。皮下投与は、リンパネットワークを通して循環系へと進む局所的な リンパ節中に投与を行うものである。循環系への導入速度は、分子量またはサイ ズの関数であることが示されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾し て細胞中に拡散させることができ、あるいはリポソームは未修飾または修飾アン チセンスオリゴヌクレオチドの細胞への送達に直接的に関与することもできる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドをリンパ球およびマクロファージの表面に結 合させることのできるリポソーム処方も有用である。この処方は、マクロファー ジおよびリンパ球の感染細胞に対する免疫認識特異性を利用することにより、Ｈ ＩＶ細胞への向上した送達を提供するであろう。 腹腔内投与もまた、導入速度を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド−送 達ビヒクル複合体の分子量またはサイズに関連して、循環系中への導入を誘導す る。 選択した送達方法は、障害細胞における組成物の細胞内蓄積引き起こすであろ う。核送達は使用できるがあまり好ましくない。特定のコンパートメント中のオ リゴヌクレオチドの蓄積は、オリゴヌクレオチドの電荷および化学的性質により 大きく影響されるであろう。最も好ましい送達方法は、リポソーム（１０〜 ４００ｎｍ）、ヒドロゲル、放出調節性ポリマー、マイクロインジェンクション またはエレクトロポーレーション（エクスビボでの治療用）および他の医薬上許 容されるビヒクルを包含する。 正確な用量および投与回数は、臨床試験による有効性のデータに依存するであ ろう。送達ビヒクル、疾病の指示、投与経路、およびオリゴヌクレオチドを結合 している結合のごときいくつかの因子が用量に影響するであろう。考えられる用 量は０.００１〜２００ｍｇ／体重ｋｇ／日である。治療期間は疾病の徴候の経 過により延長されるてあろう。１日に複数回の投与は局所適用、眼への適用およ び膣への適用について考えられる。 細胞内でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療レベルの確立は、取り込み および分解の速度に依存する。分解速度を低下させることは、アンチセンスオリ ゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長させる。よって、化学修飾されたアンチセ ンスオリゴヌクレオチド、例えば、ホスフェート骨格の修飾を伴ったものが好ま しい。 ３.ＨＩＶ防御アッセイ 抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドのＨＩＶ細胞変性効果を 阻害する能力を測定するアッセイに使用することもできる。これらのアッセイは ヒトにおける病因としてのＨＩＶの存在を同定または確認するための用途、どの オリゴヌクレオチドを患者に投与すべきかを決定するための用途、およびオリゴ ヌクレオチドの初期の有効性を評価するための用途をはじめとする種々の用途を 有する。 抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖の測定のための標準的方法を用い てＨＩＶ防御アッセイを行うことができる。細胞増殖の測定として使用できる方 法は、細胞の代謝状態を測定するためのＸＴＴ（２,３−ビス［２−メトキシ− ４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシア ニリド）のごとき染料の使用、核酸の複製を測定するためのＢＵｄＲ（ブロモデ オキシウラジン）のごとき放射性または修飾ヌクレオチド前駆体の使用、および 宿主核酸の生成を測定するための宿主核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの使用 を包含する。 蛍光、化学発光、酵素または放射性標識のごとき検出可能な標識を有するオリ ゴヌクレオチドを用いて、細胞性核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを用いるア ッセイを行うことができる。ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに存在する宿主核 酸配列のごとき宿主核酸配列の領域にハイブリダイズするようにオリゴヌクレオ チドを設計することができる。かかるヌクレオチド配列領域の例は当該分野にお いて知られており、標準的方法により得ることができる。宿主細胞の増殖を試験 するための宿主標的核酸の好ましい源はｒＲＮＡである。ｒＲＮＡに特徴的な核 酸配列を有する核酸は、一般的には、ｍＲＮＡに存在する核酸配列よりもずっと 豊富に細胞中に存在する。 ＨＩＶはＣＤ４抗原を有する細胞（ＣＤ４⁺）に感染する。主要な標的細胞集 団はＴヘルパーリンパ球および単球／マクロファージ系統の細胞である。ＨＩＶ 防御アッセイを、ＨＩＶ感染の疑いのあるヒト由来のかかる細胞について行うこ とができる。患者から得たかかる細胞についてインビトロで直接行うことができ 、あるいは、ＣＤ４⁺細胞から得た溶解物を用いて行うこともできる。単離細胞 よりもＨＩＶ細胞変性効果に感受性のある細胞を感染させるために溶解物を用い ることができる。 ＨＩＶ防御アッセイを以下のように行うことができる。 １）患者からＣＤ４⁺細胞を単離する。好ましい細胞はＴリンパ球である。 ２）抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの存在下（処理細胞）または不存在下（対照 細胞）における細胞増殖に適合する条件下で細胞をインキュベーションする。細 胞増殖に適合する条件の例は、エス・ガートナー（S.Gartner）およびエム・ポ ポビッチ（M.Popovic）,１９９０年,テクニークス・イン・ＨＩＶ・リサーチ（T echniques in HIV Research）（エイ・アラルドチーニ（A.Alaldocini）および ビー・ディー・ウォーカー（B.D.Walker）編、ニューヨークのストックトン・プ レス（Stockton Press）中、ウイルス・アイソレイション・アンド・プロダクシ ョン（Virus Isolation and Production）,５３〜７０ページに記載されてい る。 ３）細胞をオリゴヌクレオチドに曝露した後の１またはそれ以上の時点におい て処理細胞および対照細胞の増殖を測定する。 対照細胞の正常な増殖はＨＩＶ感染のごときウイルス感染のないことを示す。 対照細胞の増殖を健康であることが分かっている同タイプの細胞と比較すること により、正常な増殖を決定することができる。 対照細胞の正常な増殖以下の増殖は、ＨＩＶのごときある種の細胞障害の存在 を示す。処理細胞における抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドのＨＩＶ毒性に対する防 御能力は、疾患がＨＩＶによるものであり、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを用い て患者を治療することができることを示す。異なるＨＩＶ株の核酸配列の多様性 のため、この細胞毒性アッセイにおいて抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドがＨＩＶを 阻害できないことは、時として、ＨＩＶの存在を正確に示すことを失敗させるか もしれない。よって、ＨＩＶ防御アッセイを、ＨＩＶの存在を検出するための当 該分野で知られた他のアッセイと併用して行うべきである。ＡＩＤＳの重篤さお よびＨＩＶに対する正しくない診断によって生じ得る悪影響のために、好ましく は、ＨＩＶ防御アッセイを用いてＨＩＶの存在を確認し、ＨＩＶ感染患者の治療 のために特異的なオリゴヌクレオチドの適性を考慮して初期の決定を行う。他の アッセイによりＨＩＶ感染していると決定されたがＨＩＶ防御アッセイによって は決定されなかった患者を、異なるオリゴヌクレオチドを用いるＨＩＶ防御アッ セイを用いて再検査するべきである。 ＩＩ.オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによるＨＩＶの検出 さらに、ＨＩＶ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを検出プローブとして用 いてＨＩＶ標的配列の存在を調べることができ、さらにこれを増幅プライマーと して用いて選択的にＨＩＶ核酸を増幅することができる。標的核酸または標的核 酸に相補的なヌクレオチド配列のいずれかに対するハイブリダイゼーションは、 ＨＩＶの存在の検出に有用である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または転写 増幅法（transcription mediated amplification method）（例えば、「ヌクレ イック・アシッド・アンプリフィケイション・メソッズ（Nucleic Acid Amplifi cation Methods）と題されたカシアン（Kacian）およびフルツ（Fultz）のＥＰ Ｏ出願番号第９０３０７５０３.４）のごとき増幅反応における鋳型として標的 核酸を用いることにより、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を 製造することができる。 ＨＩＶの検出および増幅プライマー用のプローブを設計するための有用なガイ ドラインは本明細書に記載されており、相補性を有する核酸へのオリゴヌクレオ チドのハイブリダイゼーションに関して上に記載した考えを包含する。これらの 考えは、オリゴヌクレオチドが機能する異なるハイブリダイゼーション条件に関 して考慮されるべきである。通常は、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは生理学的条 件下で使用される。対照的に、増幅プライマーおよび検出プローブを広範囲の条 件において使用することができ、好ましくは、緊縮ハイブリダイゼーションアッ セイ条件で使用する。 標的ヌクレオチド配列領域の５’部分のプライマーおよび標的ヌクレオチド配 列領域の３’部分のプライマーを用いて核酸分子上に存在する標的ヌクレオチド 配列領域を増幅する。プライマー結合に最適な部位は、１５塩基より大きく３５ ０塩基以内の保存的ヌクレオチド配列領域である。これらの領域にハイブリダイ ズするように増幅プライマーを設計する。転写増幅のためにプロモーターをプラ イマーに結合させることができる。 プライマーまたはプロモーター／プライマーのセットに関して観察される増幅 の程度は、オリゴヌクレオチドがその相補的配列領域にハイブリダイズして伸長 される能力はじめとするいくつかの因子に依存する。ハイブリダイゼーション反 応の程度および特異性がいくつかの因子により影響されるので、オリゴヌクレオ チドが標的に対して正確な相補性を有するか否かにかかわらず、これらの因子の 取り扱いはオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性を決定する。種々のア ッセイ条件の重要性および影響は当業者に知られており、「ヌクレイック・アシ ッド・プローブス・フォー・ディテクション・アンド／オア・クアンティテイシ ョン・オブ・ノン−ウイラル・オーガニズム（Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organism）」と題されたホーガ ン（Hogan）らのＥＰＯ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９に記載されてい る。 種々の長さおよび種々の塩基組成のオリゴヌクレオチド検出および増幅プロー ブを用いてもよいが、好ましいプローブは長さ１８ないし１００ヌクレオチド、 より好ましくは長さ１８ないし５０ヌクレオチドであり、標的核酸に十分に相補 的であり緊縮条件下（例えば、プローブオリゴヌクレオチドがＨＩＶ標的配列に ハイブリダイズし、ヒト・核酸または他の生物由来の核酸とはハイブリダイズし ない条件）でハイブリダイズするものである。最適なプライマーは１８〜３８塩 基の標的結合領域を有し、標的：プライマー２本鎖の予想Ｔｍは約６５℃である 。 オリゴヌクレオチド：非標的核酸ハイブリッドの安定性を最小にするようにオ リゴヌクレオチド検出プローブおよび増幅プライマーを設計すべきである。プロ ーブは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、標的および非標的核酸配列領域 間を識別可能であるべきである。プローブの設計において、オリゴヌクレオチド ：標的およびオリゴヌクレオチド：非標的２本鎖間のＴｍ値の相違は可能な限り 大きくあるべきである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。 プローブおよび標的領域の２次構造もハイブリダイゼーションに影響する。ハ イブリダイゼーションを阻害する強力な内部構造を形成する核酸の領域はあまり 好ましくない標的部位である。かかる構造の例はヘパリンステムループ構造であ る。同ように、過剰な自己相補性を有するプローブも避けるべきである。十分な 自己相補性がある場合、プローブにおいて分子内および分子間ハイブリッドが形 成しうる。かかる構造を、注意深いプローブ設計により避けることができる。市 販コンピュータープログラムを用いてこれらのタイプの相互作用を検索すること ができる。利用可能なコンピュータープログラムは、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TM（ヒ タチ・ソフトウェア・エンジニアリング・アメリカン・リミテッド（Hitachi So ftware Engineering American Ltd.））およびＯＬＩＧＯ^Rバージョン４.１（ナ ショナル・バイオサイエンス（National Bioscience））を包含する。 統合されたゲノム標的ヌクレオチド配列領域は、天然においてはポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）生成物と同様２本鎖形態で存在する。これらの２本鎖標的核 酸はプローブ：標的ハイブリダイゼーションを阻害する。ハイブリダイゼーショ ンの前に熱変性のごとき標準的方法を用いると、２本鎖標的はアクセス可能とな る。 Ｃ₀Ｔ_1/2を測定することによりハイブリダイゼーションの速度を決定すること ができる。オリゴヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする速度は、一部に はプローブに相補的な領域における標的核酸の２次構造の熱安定性に依存する。 ハイブリダイゼーション速度の標準的測定値は、１リットルあたりのヌクレオチ ドのモル数に５０％の核酸がハイブリダイズするのに要した時間（秒）を掛けた 値Ｃ₀Ｔ_1/2として測定される。よって、Ｃ₀Ｔ_1/2は、遊離プローブ濃度にその濃 度いおける最大ハイブリダイゼーションの５０％が起こる時間を掛けたものであ る。決められた時間において種々の量のプローブを一定量の標的にハイブリダイ ズさせることによりこの値を決定する。標準的方法によりＣ₀Ｔ_1/2はグラフから 分かる。 非特異的プライマー伸長の程度（プライマー二量体形成または非標的コピー） は増幅効率に影響する。それゆえ、好ましくは、プライマーは、特に３’末端に おいて低い自己または交差相補性を有するものである。不正なプライマー伸長を 減じるためには長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量を避けるべきである。 市販コンピュータープログラムはＭａｃＤＮＡＳＩＳ^TM（ヒタチ・ソフトウェア ・エンジニアリング・アマリカン・リミテッド（Hitachi Software Engineering American Ltd.））およびＯＬＩＧＯ^Rバージョン４.１（ナショナル・バイオサ イエンス（National Bioscience））を包含する。 合成したならば、検出プローブをよく知られた方法（ジェイ・サムブルック（ J.Sambrook）、イー・エフ・フリッチュ（E.F.Fritsch）およびティー・マニア ティス（T.Maniatis）,モレキュラー・クローニン（Molecular Cloning）,第１ １章（第２版,１９８９年））を用いて標識する。有用な標識は蛍光、化学発光 、酵素および放射活性基を包含する。 ＩＩＩ.オリゴヌクレオチドの合成 ホスホジエステル結合ならびに修飾結合を有するオリゴヌクレオチドを、当該 分野で知られた方法により合成することができる。例えば、カルサーズ（Caruth ers）らは、メソッズ・イン・エンザイモロジー第１５４巻２８７ページ（１９ ８７年）において、標準的なホスホラミダイト固相化学によるホスホジエステル 結合を有するオリゴヌクレオチドの合成方法を記載しており；バット（Bhatt） は米国特許第５,２５２,７２３号において、ホスホロチオエート結合を有するオ リゴヌクレオチドの合成方法を記載しており；さらにクレム（Klem）らは、「イ ンプルーブド・プロセス・フォー・ザ・シンセシス・オブ・オリゴマーズ（Impr oved Process for the Synthesis of Oligomers）」と題されたＰＣＴ ＷＯ９ ２／０７８６４において、メチルホスホネート結合をはじめとする異なるヌクレ オチド間結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を記載している。 ＩＶ.実施例 本発明の異なる態様および具体例を説明するために、実施例を以下に提供する 。これらの実施例は開示された本発明を何ら限定するものではない。実施例１：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス阻害 この実施例は、異なるオリゴヌクレオチドのＨＩＶ阻害能を示す。いくつかの ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドのＨＩＶ複製に対する影響 を、８ｅ５細胞により産生されたｐ２４（ＨＩＶ特異的ポリペプチド）を測定す ることにより決定した。８ｅ５細胞系は、複製欠陥ＨＩＶを生じさせるヒト・Ｔ 細胞系である（フォルクス（Folks）ら,米国特許第４,７５２,５６５号）。当該 欠陥ＨＩＶは、ｐｏｌによりコードされているＨＩＶ蛋白以外の、慢性感染細胞 系において典型的に観察されるレベルのすべてのＨＩＶ蛋白を発現する単一の統 合されたプロウイルスを有する。この欠陥は、ｐｏｌにおけるフレームシフト変 異を引き起こす単一の塩基の挿入による。 ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドをバット（Bhatt）（上 記）の記載により合成した。合成されたオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて 精製し、ＥｔＯＡｃで抽出し、エタノール沈殿し、８０％エタノールで洗浄し、 次いで、滅菌水に懸濁して少量の添加（２〜２０μｌ）を容易ならしめる高濃度 のストック溶液を得た。 実験期間中、最大ｐ２４産生が得られる条件下で、２４ウェルプレート中で８ ｅ５細胞を培養した。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを８ ｅ５培養物に直接添加した。滅菌水および非特異的ホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドを対照として用いた。４日後に培養物を収穫し、生細胞数およびｐ２ ４抗原の生成を調べた。２ｍｌウェルからの細胞を４℃で１０分間、ベックマン （Beckman）Ｊ−１０を用いて１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を取ることに より、細胞溶解物を調製した。次いで、細胞を５ｍｌのハンクスバランス塩溶液 （ギブコ（Gibco））または滅菌セイライン溶液（０.９％ＮａＣｌ）で洗浄し、 ４℃で１０分間、ベックマンＪ−１０を用いて１０００ｒｐｍで遠心分離した。 細胞を、０.５％ＮＰ−４０を含有する３００μｌのＴＳＭ（１０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に再懸濁 し、氷上で５分間インキュベーションした。次いで、核および細胞残渣をベック マンＪ−１０を用いて２０００ｒｐｍで遠心分離した。ｐ２４抗原量を、ｐ２４ 捕捉ＥＬＩＳＡ（アメリカン・バイオテクノロジーズ・インコーポレイテッド（ American Biotechnologies,Inc.））を用いて溶解物中において調べた。 ｔａｔおよびｒｅｖの発現は十分なｐ２４産生に必要であるため、ｐ２４に関 するＥＬＩＳＡアッセイをＨＩＶ複製の測定として選択した。ＨＩＶ ｐ２４産 生のパーセンテージを、アンチセンス処理細胞による細胞あたりのｐ２４生成量 を対照処理細胞による細胞あたりのｐ２４生成量で割った値として計算した。対 照処理細胞を、ランダムな対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ .ＩＤ.ＮＯ.４７：ＡＧＧＣＴＴＣＡＴＣ ＡＣＧＴＧＧＡＣＡＴ ＴＧＡＣＧ ）で処理した。 表２に示すように、いくつかの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドはＨＩ Ｖ産生を阻害した。試験された最も有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドはＳ ＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８または３５の核酸配列を有している。これらのオリゴヌク レオチドでの阻害は７０〜１００％の範囲（０ないし３０％のｐ２４産生）であ った。表２のデータは特定の実験の結果を示す。試験された他のアンチセンスオ リゴヌクレオチドのいくつかは、対照と比較するとｐ２４のパーセンテージを増 加させた。この現象は十分に理解されていない。 ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８または３５の核酸配列を有するいつかの異なる切断バ ージョンのオリゴヌクレオチドを、そのＨＩＶ複製阻害能について試験した。こ れらの結果を表３に示す。 表３からわかるように、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８のいくつかの切断バージョン （ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２０、２２、２６および２９）はｐ２４産生の阻害におい て部分的に有効であった。さらに、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３５の切断バージョン（ ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.４６）はｐ２４産生の阻害において有効であった。本明細書 に示した開示に基づいて他の適当な切断バージョンを選択することができる。実施例２：異なるＨＩＶ株を用いるウイルスの阻害 異なるＨＩＶ株に感染した異なる細胞を用いた場合のアンチセンスオリゴヌク レオチドのＨＩＶ複製阻害能を下に示す。この実験に使用したオリゴヌクレオチ ドの核酸配列をＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１８に示す。オリゴヌクレオチドのヌクレオ チド基はホスホロチオエート基により結合されており、デオキシリボース部分を 含んでいた。 ３７℃で８〜１０分間トリプシン−ＥＤＴＡを用いて特定の細胞（表４に示す ような）を剥離させた。次いで、細胞を１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。 細胞を５〜１０ｍｌの維持培地（１０％ウシ胎児血清、５００ユニット／ｍｇの ペニシリン、５００ユニット／ｍｇのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタ ミンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco'ｓ Modified Eagle M edium）（ＤＭＥＭ））に再懸濁した。週に１回細胞を全体積２００ｍｌの維持 培地中３ｘ１０⁴個／ｍｌの濃度として２個の７５ｃｍ²のＴフラスコに分けるこ とにより細胞を維持した。 ０日目に、細胞を２４ウェル組織培養プレート（ファルコン＃３０４７）中に ウェルあたり２.４ｘ１０⁴個の濃度で撒いた。細胞を３７℃で一晩インキュベー ションした。翌日、培地を吸引し、感染の多重度（ＭＯＩ）０.０３のＨＩＶウ イルス２００μｌを各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で２時間イ ンキュベーションした。２時間のインキュベーション後、細胞を最終濃度の１. ２５倍の濃度の８００μｌの薬剤で処理した。 処理細胞を３７℃で３日間インキュベーションした。４日目に、１ｍｌ／ウェ ルの１００％メタノールでプレートを１５分間固定した。次いで、ウェルを吸引 し、０.３％クリスタルバイオレット染料０.５ｍｌをウェルに添加した。５分後 、ウェルを水洗し乾燥させた。顕微鏡を用いてプラークを数えた。プラーク数を アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度に対してプロットした。プロットからＩ Ｃ₅₀を決定し、結果を表４に示す。 この実施例は、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの細胞毒性を評価するための薬理 学的研究を説明する。この実施例に用いたオリゴヌクレオチドの核酸配列はＳＥ Ｑ.ＩＤ.ＮＯ.１８および２２である。これらのオリゴヌクレオチドはホスホロ チオエート結合有していた。 試験オリゴヌクレオチドの細胞毒性を、抗新生物剤の細胞毒性を測定するため の当業者に知られた方法を用い、ヒトの１次血液細胞を用いる系において決定し た。ヒトの骨髄細胞を収穫し、等張溶液で洗浄し、次いで、０.３％（ｗ／ｖ） 寒天、２０％（ｖ／ｖ）ウシ・胎児血清、および１０ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニ ー刺激因子を含有する、種々の量の２種の試験オリゴヌクレオチドを含む組織培 養用培地中でインキュベーションした。培養８日後に生成したコロニー数を測定 した。この実験におけるコロニー形成に対するＩＣ₅₀は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１ ８に関しては２〜３μＭ、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２２に関しては２０〜３０μＭで あった。 齧歯類モデルを用いるインビボ実験も行った。これらの実験は、ＳＥＱ.ＩＤ. ＮＯ.１８（ＰＢＳ溶液中）を有するホスホロチオエート結合したオリゴヌクレ オチドを投与した場合の血液組織の大まかな形態学的変化に関する潜在能力に焦 点を絞った。３匹のマウスに１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量でオリゴヌクレオチド を与えた。対照マウスにはＰＢＳのみを与えた。ｔ＝０において血液試料をを各 動物から採取し、２４時間目に各動物を屠殺し、器官を取った。血液パラメータ ーに関する実験からの知見を表５に示し、器官の視覚的観察により得られた結果 を表６に示す。 他の具体例は以下の請求の範囲内である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．長さ２０ないし１００ヌクレオチドであり、 および からなる群より選択されるＨＩＶ核酸配列中に存在する２０ヌクレオチドの核酸 配列領域に対して実質的に相補的であり、インビボまたはインビトロにおいてＨ ＩＶ複製を阻害する精製オリゴヌクレオチドにＨＩＶ感染細胞を接触させる工程 を特徴とするＨＩＶ複製の阻害方法。 ２．該オリゴヌクレオチドが少なくとも１個のホスホロチオエート結合からな る請求項１記載の方法。 ３． および からなる群から選択されるヌクレオチド配列領域を必須としてなり、インビボま たはインビトロでＨＩＶ複製を阻害する精製オリゴヌクレオチドの使用を特徴と するＨＩＶ複製の阻害方法。 ４．該オリゴヌクレオチドが主としてホスホロチオエート結合からなる請求項 ３記載の方法。 ５．該核酸配列領域が および からなる群より選択される請求項４記載の方法。 ６．該オリゴヌクレオチドがヌクレオチド配列領域 からなる請求項５記載の方法。 ７． および からなる群より選択されるヌクレオチド配列領域を必須としてなり、インビボま たはインビトロでＨＩＶ複製を阻害する精製オリゴヌクレオチドをＨＩＶ感染患 者に投与する工程を特徴とするＨＩＶ感染患者の治療方法。 ８．該オリゴヌクレオチドが主としてホスホロチオエート結合からなる請求項 ７記載の方法。 ９．該核酸配列領域が および からなる群より選択される請求項８記載の方法。 １０．該オリゴヌクレオチドが で示されるヌクレオチド配列領域からなる請求項９記載の方法。 １１． および からなる群より選択されるヌクレオチド配列領域を有し、インビボまたはインビ トロでＨＩＶ複製を阻害する精製オリゴヌクレオチドをＨＩＶ感染患者に投与す る工程を特徴とするＨＩＶ感染患者の治療方法。 １２．該オリゴヌクレオチドが主としてホスホロチオエート結合からなる請求 項１１記載の方法。 １３．該核酸配列領域が および からなる群より選択される請求項１２記載の方法。 および からなる群より選択されるＨＩＶ核酸配列に存在する２０ヌクレオチドの核酸配 列領域に対して実質的に相補的な２０ないし１００ヌクレオチドの精製オリゴヌ クレオチドからなり、インビボまたはインビトロでＨＩＶ複製を阻害するＨＩＶ 核酸を標的とするオリゴヌクレオチド。 １５．該オリゴヌクレオチドが少なくとも１個のホスホロチオエート結合から なる請求項１４記載のオリゴヌクレオチド。 １６． および からなる群より選択されるヌクレオチド配列領域を必須としてなり、インビボま たはインビトロでＨＩＶ複製を阻害するオリゴヌクレオチド。 １７．該オリゴヌクレオチドが主としてホスホロチオエート結合からなる請求 項１６記載のオリゴヌクレオチド。 １８．該核酸配列領域が および からなる群より選択される請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。 からなる請求項１８記載のオリゴヌクレオチド。 ２０． および からなる群より選択されるヌクレオチド配列領域を有し、インビボまたはインビ トロでＨＩＶ複製を阻害する精製オリゴヌクレオチド。 ２１．該オリゴヌクレオチドが主としてホスホロチオエート結合からなる請求 項２０記載のオリゴヌクレオチド。 ２２．該核酸配列領域が および からなる群より選択される請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。