JPH09501566A - ウレアプラズマに対する核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトまたは他の関連生物で発見されたウレアプラズマおよびウレアプラズマ・ウレアリティカム種の公知の株または血清型を識別できるハイブリダイゼーション・アッセイプローブを記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウレアプラズマに対する核酸プローブ 本出願は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）カシアン(Ｋacian)ら、 「核酸配列の増幅方法、組成物およびキット(Ｎucleic Ａcid Ｓequence Ａmpli fication Ｍethod，Ｃomposition and Kit)」なる発明の名称の１９９２年６月 ５日に出願された米国出願番号０７/８７９,６８６号の一部継続出願である。発明の分野 本明細書に記載し特許請求する発明は、試験試料中のウレアプラズマ(Ｕreapl asma)属の生物、およびウレアプラズマ・ウレアリティカム(Ｕreaplasma urealy ticum)種の公知の株または血清型を、例えば尿生殖器および頸管内の標本、組織 試料、羊水および他の体液から、ならびに培養物から検出することができる核酸 プローブの設計および使用に関する。発明の背景 ヌクレオチドから形成される２種の一本鎖のデオキシリボ-(「ＤＮＡ」)また はリボ-(「ＲＮＡ」)核酸(塩基アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、チミジン(Ｔ)、グ アニン(Ｇ)、ウラシル(Ｕ)またはイノシン(Ｉ)を含有する)は、ハイブリダイズ して、相補的な塩基の対間の水素結合によって互いに保持される二本鎖を形成し 得る。一般的に、ＡがＴまたはＵに水素結合する一方、ＧまたはＩはＣに水素結 合する。鎖に沿って古典的塩基対ＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣまたは ＣＧが存在する。加えて、ある種の誤対合した塩基対(例えば、ＡＧ、ＧＵ)が存 在し得る。 十分に隣接した相補的塩基を含有する２本の一本鎖核酸が、それらのハイブリ ダイゼーションを促進するであろう条件下にて互いに結合して二本鎖核酸となる 。適当な条件下では、ＤＮＡ/ＤＮＡ、ＲＮＡ/ＤＮＡまたはＲＮＡ/ＲＮＡハイ ブ リッドを形成することができる。 プローブとは、一般的に、検出しようとする核酸配列(「標的配列」)にある程 度相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、ラジオアイソトープ、蛍光色素 または化学ルミネッセンス部位のごときレポーター基部位で、または検出に用い ることができる酵素もしくは他のリガンドで標識し得る。特定の核酸配列を検出 する核酸ハイブリダイゼーションの使用の背景的記載は、(共に出典明示して本 明細書の一部とみなす)コーン(Ｋohne)、１９８９年７月２５日に発行された米 国特許第４,８５１,３３０号、ならびに、ホーガン(Ｈogan)ら、「非ウイルス生 物を検出および/または定量するための核酸プローブ(Ｎucleic Ａcid Ｐrobes f or Ｄetection and/or Ｑuantitation of Ｎon-Ｖiral Ｏrganisms)」なる発明 の名称の国際出願番号ＰＣＴ/ＵＳ８７/０３００９に記載されている。ホーガン (Ｈogan)ら、(前掲)は、試料(例えば、痰、尿、血液および組織切片、食物、土 壌および水)中の非ウイルス生物または非ウイルス生物群の存在を検出する方法 を記載している。 ウレアプラズマ(Ｕreaplasma)属およびマイコプラズマ(Ｍycoplasma)属は、原 核生物であって、分類学的にはモリキューテス(Ｍollicutes)綱を構成する。モ リキューテス鋼の微生物は細菌細胞壁を欠き、小さなゲノム・サイズを有する。 それらは、最小の独立して生存する微生物のうちの１種であると考えられている 。ウレアプラズマは、モリキューテス綱微生物の中でもユニークである。なぜな ら、それが尿素を代謝できる特性を有するためである。ユウ・ウレアリティカム (Ｕ.urealyticum)には１４種の既知の血清型がある(ステムケ(Ｓtemke)およびロ バートソン(Ｒobertson)、ダイアグノウスティック・ミクロバイオロジー・アンド・ インフェクシャス・ディジーズ(Ｄiagn.Ｍicrobiol.Ｉnfect.Ｄis.)第３１巻： ３１１頁(１９８５年))。１４種の血清型は、ユウ・ウレアリティカムゲノムＤＮ Ａの制限断片長多型(PELP)に基づいて(ハラサワ(Ｈarasawa)ら、アブストラクト Ｓ３０-６ＵＩＭＳミーティング、日本、大阪(Ｏsaka,Ｊapan)(１９９０年)、お よびロバートソン(Ｒobertson)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオ ロジー(Ｊ.Ｃlin.Ｍicrobiol.)第３１巻:８２４頁(１９９３年))、あるいは ｒＲＮＡ配列(ハモンド(Ｈammond)ら、アブストラクトＤ１７、セクション６０ 、アメリカン・ソサイエティー・フォー・ミクロバイオロジー・ジェネラル・ミーテ ィング(American Society For Microbiology General Meeting)(１９９１年))に 基づいて少なくとも２種の亜種(「生物型」)に分けることができる。 ユウ・ウレアリティカムは一般にヒト尿生殖器で発見されているが、広範な病 原スペクトルで関連付けられてきた。幾つかの実験においては、成人の男性、胎 児および幼児に影響する疾病における潜在的な原因因子として、ユウ・ウレアリ ティカムを関連付けている。ブランナー(Ｂrunner)ら、エール・ジャーナル・オ ブ・バイオロジカル・メディシン(Ｙale Ｊ.Ｂiol.Ｍed.)第５６巻：５４５頁( １９８３年)は、非淋菌性尿道炎(ＮＧＵ)を有する試験した成人男性の約３０％ で、該非淋菌性尿道炎の原因である原因因子としてユウ・ウレアリティカムを同 定した。カッセル(Ｃassell)ら、ペディアトリック・インフェクシャス・ディジー ズ(Ｐediatr.Ｉnfect.Ｄis.)第５巻：Ｓ２４７(１９８６年)は、妊娠の結果およ び新生児の健康に順番に有害な影響を及ぼし得る絨毛羊膜炎の可能性のある原因 としてユウ・ウレアリティカムを示した。スタグノ(Ｓtagno)ら、ペディアトリ クス(Ｐediatrics)第６８巻：３２２頁(１９８１年)は、肺炎を患った２１％の 幼児でユウ・ウレアリティカムを発見し、ユウ・ウレアリティカムと肺炎との関 連性が「統計的に有意」であることを見い出した。ウェイテス(Ｗaites)ら、ラ ンセット(Ｌancet)第８５７５巻：１７頁(１９８８年)は、新生幼児の高危険性 集団(ほとんどが状況前の幼児である１００人)から採取した脳脊髄液標本の８％ でユウ・ウレアリティカムを発見した。これらの研究者によれば、ユウ・ウレア リティカムは、これら探索したものの中で単離された最も一般的な生物であった 。ユウ・ウレアリティカムは、感染性関節炎を包含する数多くの他の病理状態に も関係付けられている(リー(Ｌee)ら、アースリティス・アンド・リューマティ ズム(Ａrthritis and Ｒheumatism)第３５巻：４３頁(１９９２年))。 標準的な微生物技術では、一般に、尿素の加水分解を観察することによってユ ウ・ウレアリティカムを同定する。これらの技術には、通常、複合ブロス培地、 および尿素および他の栄養物を含有する寒天培地の両方に新たに得られた標本を 注射することが含まれる(ブランナー(Ｂrunner)ら、前掲)。 ウレアプラズマの検出に関する文献には以下のものが含まれる：ロバーツ(Ｒo berts)ら、イスラエル・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス(Ｉsrael Ｊ.Ｍ ed.Ｓci.)第２３巻:６１８頁(１９８７年)は生殖器標本においてウレアプラズマ を検出するための全染色体DNAプローブの使用を記載している;オーセ(Ｏhse) エンス(Ｉsrael Ｊ.Ｍed.Ｓci.)第２３巻：３５２頁(１９８７年)は、イー・コ リ(Ｅ.coli)ｒＲＮＡオペロンのクローン化ＤＮＡに対するユウ・ウレアリティカ ムｒＲＮＡ遺伝子のハイブリダイゼーションを記載している；ゴーベル(Ｇobel) およびスタンブリッジ(Ｓtanbridge)(「ＤＮＡハイブリダイゼーションによるマ イコプラズマの検出(Ｄetection of Ｍycoplasma by ＤＮＡ Ｈybridization)」 、ＥＰＯ出願番号８６３０４９１９.３号、公開番号０ ２５０ ６６２号)は、一 般に、マイコプラズマもしくは原核生物、または特異的なマイコプラズマおよび 真核性細菌種を検出するための生物学的プローブについて言及している;ゴンザ レス(Ｇonzales)ら(アメリカン・ソサイエティー・フォー・ミクロバイオロジー ・アニュアル・ミーティング(Ａmerican Ｓociety for Ｍicrobiology Ａnnual Ｍeeting)、１９９１年、アブストラクト Ｄ-１６)は、ｒＲＮＡに向けたＤＮＡ プローブを用いてウレアプラズマを検出する方法について言及している；リー( Ｌee)ら、前掲、およびウィロービィ(Ｗilloughby)ら、インフェクション・アン ド・イミュニティー(Ｉnfection and Ｉmmunity)第５９巻：２４６３頁(１９９ １年)は、ＰＣＲを利用したユウ・ウレアリティカムのウレアーゼ遺伝子を検出 する方法を記載している;デン(Ｄeng)ら、ピイシイアール・メソッズ・アンド・ア プリケーションズ(ＰＣＲ Ｍethods and Ａpplications)第１巻:２０２頁(１９ ９２年)は、ＰＣＲ-ＲＦＬＰ技術によってモリキューテス綱微生物を検出できる にちがいないことを示唆している;ブローガン(Ｂrogan)ら、モレキュラー・アン ド・セルラー・プローブス(Ｍolecular and Ｃellular Ｐrobes)第６巻：４１１頁 (１９９２年)は、１８６塩基対のユウ・ウレアリティカムのゲノムＤＮＡ断片の 増幅を記載している；ロバートソン(Ｒobertson)ら、前掲は、２種のユウ・ウレ アリティカム 生物型を識別する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に対する生物型特異的プライマー を用いたポリメラーゼ連鎖反応を含む技術を記載している。発明の概要 本発明の要旨は、特異的ウレアプラズマ核酸標的配列に対して標的化されてい るか、または実質的に特定の核酸配列よりなる新規なオリゴヌクレオチド・プロ ーブを開示し特許請求する。該プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼ ーションアッセイ条件下にて、標的ユウ・ウレアリティカムｒＲＮＡおよび/ま たはｒＲＮＡ遺伝子配列にハイブリダイズすることによって機能する。かくして 、該プローブは、臨床的に重要なユウ・ウレアリティカム血清型を含むウレアリ ティカム属を、その既知の系統発生的に最も近縁な系統(マイコプラズマ(Mycopl asma))から、およびヒト尿生殖管に生息する他の微生物から識別することができ る。したがって、該プローブをアッセイに用いてウレアプラズマおよびユウ・ウ レアリティカム生物を検出および/または定量することができる。 ヒトで発見されたマイコプラズマ種には、エム・ゲニタリウム(Ｍ.genitalium )、エム・ニューモニエ(Ｍ.pneumoniae)およびエム・ホミニス(Ｍ.hominis)が含 まれる。エム・ニューモニエがユウ・ウレアリティカムに最も近縁な系統のマイ コプラズマのようである。エム・ゲニタリウムはエム・ニューモニエに核酸配列 が酷似しており、ヒト生殖器から単離されている。エム・ホミニスは、尿生殖器 から最も頻繁に単離されているマイコプラズマである。 かくして、第１の態様において、本明細書に記載する本発明は、ウレアプラズ マ標的核酸配列に選択的にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション・アッ セイプローブをその要旨とする。ウレアプラズマ標的核酸配列は、ウレアプラズ マに存在する核酸配列、好ましくはユウ・ウレアリティカム核酸、またはそれに 相補的な配列である。好ましくは、該標的核酸配列は近縁系統のマイコプラズマ (例えば、エム・ニューモニエ)には存在しない。標的配列に相補的な配列は、ポ リメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)または転写介在増幅(例えば、カシアン(Ｋacian)お よびフルツ(Ｆultz)、「核酸の増幅方法(Nucleic Acid Amplification Methods) 」 なる発明の名称のＥＰＯ出願番号９０３０７５０３.４号；およびカシアン(Ｋac ian)ら、「核酸配列の増幅方法、組成物およびキット」なる発明の名称の前掲)の ごとき標的増幅技術によって作製することができる。 本発明の要旨であるプローブは、ユウ・ウレアリティカムを検出でき、系統発 生学的な近縁系統であるエム・ニューモニエを含めた他の細菌から、ヒトで発見 されたウレアプラズマ属、およびユウ・ウレアリティカムの公知株または血清型 を識別することができる。 ハイブリダイゼーション・アッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリ ダイゼーション・アッセイ条件下にて、ユウ・ウレアリティカムの５Ｓ、１６Ｓ もしくは２３ＳｒＲＮＡ、または対応するリボゾームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)核酸配列 、またはそれらに相補的な核酸配列にハイブリダイズするに十分に相補的な核酸 配列を有するオリゴヌクレオチドよりなる。ストリンジェントなハイブリダイゼ ーションアッセイ条件とは、特異的なプローブが標的核酸配列(例えば、ウレア プラズマのｒＲＮＡ)とハイブリダイズするが、他の微生物(例えば、マイコプラ ズマ・ニューモニエ)またはヒトからの試験試料中に存在する他の核酸とはハイ ブリダイズしない条件をいう。好ましくは、プローブは１０〜１００ヌクレオチ ド長である。 「プローブ」とは、天然に生じる核酸を排除することを意味する。精製された オリゴヌクレオチド・プローブは、化学合成のごとき当該分野で公知の技術、な らびに組換え核酸分子(例えば、レトロウイルス・ベクター)からのイン・ビトロ (in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)発現によって作製することができる。 オリゴヌクレオチドは、互いに共有結合したヌクレオチド・サブユニットでで きている。ヌクレオチド・サブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース 、またはＯ-メチルリボースのごときそれらの修飾誘導体であってもよい。ヌク レオチド・サブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾された結合のごとき結 合によって、あるいはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨害しな い非-ヌクレオチド部位によって連結されていてもよい。修飾された結合には、 標準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホスホネ ー ト結合のごとき別の結合で置換された結合が含まれる。ハイブリダイゼーション ・アッセイプローブとして用いる場合、該オリゴヌクレオチドには、好ましくは 、アクリジニウムエステルまたはラジオアイソトープのごときレポーター基を含 有し、プローブのその標的配列へのハイブリダイゼーションを同定するのを補助 する。 関連する態様において、本明細書に記載する発明は、生物型１または生物型２ のいずれかに存在するユウ・ウレアリティカム核酸標的配列に選択的にハイブイ ダイズできるハイブリダイゼーション・アッセイプローブをその要旨とする。特 許請求する標的配列は、生物型のうちの１つのみに存在する。かくして、生物型 １または生物型２の標的部位のいずれかに向けられたオリゴヌクレオチド・プロ ーブは、双方の生物型の間を識別することができる。 もう１つの関連する態様において、ウレアプラズマのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ に相補的な特異的核酸配列を有するハイブリダイゼーション・アッセイプローブ を記載する。該プローブは、存在し得るウレアプラズマを検出および/または定 量するのに有用である。これらのプローブはウレアプラズマおよびマイコプラズ マの間で変動するrＲＮＡまたはrＤＮＡの領域に相補的である。特異的なプロー ブはウレアプラズマ核酸にハイブリダイズして、マイコプラズマからウレアプラ ズマを識別することができ、配列(５'から３'方向へ記載している): ならびにそれらのＲＮＡ相当物(配列番号：３１、３４、３７、４０、４３、４ ６、４９、５２、５５、５８、６１および１０９)、それらに相補的なオリゴヌ クレオチド(配列番号：３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５ ６、５９、６２および１１０)、ならびにそれらに相補的なオリゴヌクレオチド のＲＮＡ相当物(配列番号：３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４ 、５７、６０、６３、１１１)よりなり、またはより実質的になる。好ましくは 、ヘルパー・プローブを用いてアッセイ・プローブがその標的核酸配列にハイブ リダイズするのを促進する。 「より実質的になる」なる句は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション アッセイ条件下にて、特定の生物の標的核酸配列にハイブリダイズし、好ましく は本明細書に記載するマイコプラズマとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオ チドとしてプローブが提供されることを意味する。ハイブリダイゼーション・プ ローブは、ハイブリダイゼーションに影響しない他の核酸に結合されていてもよ い。一般的に、プローブは、１０および１００ヌクレオチド長の間であることが 好ましい(最も好ましくは１５および５０ヌクレオチドの間)。加えて、該プロー ブはベクターに入れて提供されてもよい。 リストしたプローブについて、２セットのストリンジェントなハイブリダイゼ ーション・アッセイ条件を用いた。１つのセットは、０.０９５Ｍコハク酸リチ ウム、０.３１Ｍラウリル硫酸リチウム、１.５ｍＭエチレンジアミン四酢酸(Ｅ ＤＴＡ)、１.５ｍＭエチレングリコール=ビス(β-アミノエチルエーテル)Ｎ,Ｎ, Ｎ',Ｎ'四酢酸(ＥＧＴＡ)を含有するｐＨ５溶液中、６０℃にて１時間ハイブリ ダイゼーションを行うことよりなる。１時間後、０.７６Ｍホウ酸ナトリウム、 ６％トリトン(Triton)を含有するｐＨ７.５溶液中の磁性アミン・ミクロスフェア に６０℃にて１０分間結合させることによってハイブリッドをハイブリダイズし なかったプローブから分離し、８０ｍＭホウ酸ナトリウムを含有するpH10.4溶液 中で室温にて１回洗浄した。 もう１つのセットのストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条 件は、０.０５Ｍコハク酸リチウム、０.６ＭＬiＣl、１％(ｗ/ｖ)ラウリル硫酸 リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ５中、６０℃にて１５ 分間ハイブリダイズさせ、続いて０.６Ｍホウ酸ナトリウム３００μl(ｐＨ８.５ )、１％トリトンＸ-１００を６０℃にて５-７分間添加することよりなる。さら なるセットのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公 知の技術および本明細書に開示する技術に基づいて決定することができる。 もう１つの態様において、異なった生物型の間を識別できる特異的プローブを 記載する。１のみのウレアプラズマ生物型に存在する核酸配列にハイブリダイズ できる特異的プローブは、配列(５'から３'方向へ記載している)： および、それらのＲＮＡ相当物(配列番号：１２６および１２７)、それらに相補 的なオリゴヌクレオチド(配列番号：１３１および１３２)、ならびにそれらに相 補的なオリゴヌクレオチドのＲＮＡ相当物(配列番号：１３６および１３７)より なり、またはより実質的になる。好ましくは、ヘルパー・プローブを用いてアッ セイ・プローブがその標的核酸配列にハイブルダイズするのを促進する。 もう１つの態様において、特異的ヘルパー・プローブ・オリゴヌクレオチド配 列が決定された。ヘルパー・プローブを用いて、(出典明示して本明細書の一部 とみなす)ホーガン(Ｈogan)およびミリマン(Ｍilliman)、「核酸ハイブリダイゼ ーションを向上させる手段および方法(Means and Method for Enhancing Nuclei c Acid Hybridization)」なる発明の名称の１９９１年７月９日に発行された米国 特許第５,０３０,５５７号により記載されるごとく、ハイブリダイゼーション・ プローブがその標的核酸配列にハイブリダイズする速度を促進させる。本明細書 の要旨であるヘルパー・プローブには：配列番号１、３、４、６、７、８、９、 １０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、２４、２５、２６、２７、 ２８、３０、１２３、１２４、１２５；それらのＲＮＡ相当物、配列番号３７、 ４０、６４、６７、０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９ ７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２８、１２ ９、１３０；それらに相補的なオリゴヌクレオチド、配列番号３８、４１、６５ 、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０ １、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１３３、１３４、１３ ５；およびそれらに相補的なオリゴヌクレオチドのＲＮＡ相当物、配列番号３９ 、４２、６６、６９、７２、７５、７８、８1、８４、８７、９０、９３、９６ 、９８、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１３８、 １３９、１４０が含まれる。 ある種のオリゴヌクレオチド・プローブをアッセイ・プローブまたはヘルパー ・プローブとして用いることができる(例えば、配列番号８、９および２６、そ れらのＲＮＡ相当物、配列番号３７、４０および１０９、それらに相補的なオリ ゴヌクレオチド３８、４１および１１０、ならびにそれらに相補的なオリゴヌク レオチドのＲＮＡ相当物、配列番号３９、４２および１１１)。 もう１つの関連する態様において、本発明は、ハイブリダイゼーション・アッ セイプローブとそれに実質的に相補的な核酸配列との間の核酸ハイブリッド(プ ローブ:標的)よりなる組成物をその要旨とする。「実質的に相補的」とは、スト リンジェントなハイブリダイゼーション条件下にてハイブリッドが安定であるよ うに、核酸間に十分な相補性があることを意味する。形成されたハイブリッドの １つの用途は、標的配列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッドに 存在するアクリジニウムエステル(ＡＥ)はアルカリ性溶液中での加水分解に抵抗 性である一方、一本鎖核酸に存在するアクリジニウムエステルはアルカリ性溶液 中で加水分解される((出典明示して本明細書の一部とみなす)アーノルド(Ａrnol d)ら、「均質保護アッセイ(Ｈomogeneous Ｐrotection Ａssay)」なる発明 の名称のＥＰＯ出願番号８８３０８７６７.８号、公開番号３０９２３０号)。か くして、ＡＥ-標識プローブの標的への結合性は、非結合ＡＥ-標識プローブを加 水分解させた後、核酸ハイブリッド中に残存するアクリジニウムエステルの化学 ルミネッセンスを測定することによって検出することができる。 もう１つの関連する態様において、ウレアプラズマ・ウレアリティカムを検出 し、マイコプラズマ・オラレ(orale)、マイコプラズマ・ファーメンタンス(ferm entans)、マイコプラズマ・カプリコラム(capricolum)、マイコプラズマ・リポ フィラム(lipophilum)およびマイコプラズマ・サリバリウム(salivarium)のごと きマイコプラズマからウレアプラズマ・ウレアリティカムを識別し；ウレアプラ ズマ・ウレアリティカム生物型１およびウレアプラズマ・ウレアリティカム生物 型２の間で識別し；ウレアプラズマ・ウレアリティカム核酸配列の存在を検出す る方法を記載する。これらの方法は、ヒト標本から得た試験試料で用いることが できる。 本発明のプローブにより、試験試料中のウレアプラズマ属および全てのユウ・ ウレアリティカム株にユニークな特異的ｒＲＮＡ配列の存在を同定し定量する迅 速で、非主観的な方法が提供される。 本発明の他の特徴および利点は、以下その好ましい具体例の記載および請求の 範囲から明らかであろう。好ましい具体例の説明 本発明者らは、ユウ・ウレアリティカムのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに存在する 好ましい標的配列を同定し、ウレアプラズマ属の微生物を同定するのに用いるこ とができるこれらの配列およびその相補物に特異的なオリゴヌクレオチド・プロ ーブを設計した。該プローブにより、ユウ・ウレアリティカム血清型を含むウレ アプラズマ属微生物を検出することができ、それらの公知で恐らくは分類学的ま たは系統発生学的に最も近縁な系統からそれらを識別することができる。また、 ユウ・ウレアリティカム生物型１および生物型２を識別するプローブも記載する 。また、本発明の要旨であるプローブまたは標的部位を用いる方法も記載 する。 好ましい具体例において、核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブは 、エム・ゲニタリウム、エム・ニューモニエまたはエム・ホミニスからユウ・ウ レアリティカムを識別することができる。もう１つの好ましい具体例において、 核酸ハイブリダイゼーション・プローブはエム・オラレ、エム・ファーメンタン ス、エム・カプリコラム、エム・リポフィラムおよびエム・サリバリウムからユ ウ・ウレアリティカムを識別することができる。これらのマイコプラズマはヒト から単離された。 (ウイルスを除く)原核生物には、５Ｓ rＲＮＡ、１６Ｓ rＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするｒＲＮＡ遺伝子が含まれる。当業者に公知の方法を用いる ことにより、ユウ・ウレアリティカムおよびマイコプラズマの部分または完全長 のｒＲＮＡ配列を得た。これらの配列を配列相同性の領域に基づいて並べた。次 いで、並べた配列から配列変異を同定し、それをハイブリダイゼーション・アッ セイプローブ用の標的配列として用いた。ｒＲＮＡ配列の獲得 配列情報は実験的に、および公表された情報から得た(ワイスブルグ(Ｗeisbur g)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ.Ｂacteriol.)第１７１巻:６４５ ５頁(１９８９年)；およびロジャーズ(Ｒogers)ら、プロシーディングズ・オブ ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８２巻：１１６０頁(１９８５年)参照)。実験情報 は、当該分野で公知の配列の標準的な技術を用いて種々の生物からリボ核酸を単 離し配列決定することにより得た。核酸はｒＲＮＡの保存された領域に相補的な オリゴヌクレオチド・プライマーを用い、逆転写酵素を用いて該プライマーを伸 長させて得た。次いで、ジデオキシヌクレオチド鎖停止法を用いて核酸配列を導 き出した(例えば、レーン(Ｌane)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc i.ＵＳＡ)第８２巻：６９５５頁(１９８５年))。プローブ設計およびハイブリダイゼーション条件 プローブとして用いるべき核酸配列の同定を容易にするため、まず、異なった 生物からのヌクレオチド配列を相同性を最大とするように並べた。ｒＲＮＡ分子 内においては、二次構造と機能との間に密接な関係が存在する。このことは、二 次構造が維持されるように、一次配列中の進化的な変化に制限を課す。例えば、 ヘリックスの一方の側で塩基が変化した場合、それを補う変化が他方の側で起き て相補性が保存される(このことを同時変異(co-variance)という)。このことに よって、保存された一次配列に基づき、かつ保存された二次構造エレメントに基 づいて、非常に異なる２種の配列を並べることができる。ハイブリダイゼーショ ン・プローブ用の可能な標的配列は、並べた配列の相同性における変異を認識す ることによって同定した。 各可変領域における配列進化が最も発散性であった。この発散性のため、ユウ ・ウレアリティカムから系統発生的により遠い系統が、系統発生的により近縁な 系統よりもユウ・ウレアリティカムに対して、可変領域におけるより大きな変異 性を示す。本発明者らは、同一試料中に見い出されたユウ・ウレアリティカムお よびマイコプラズマ株の間の変異性が、数種の有用なプローブを設計し、好まし い標的部位を同定するのに十分であると認識した。 プローブの標的に対する選択的ハイブリダイゼーションは、適当なハイブリダ イゼーション・アッセイ条件および適当なプローブ設計を選択することによって 達成できる。プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性は、当該ハイブリッドが 高い相補性配列の間でのみ形成されるよう、アッセイ条件および洗浄条件と適合 して選択しなければならない。１またはそれを超える異なったアッセイ条件を操 作することによって、特定のプローブの正確な感受性および特異性が決定される 。以下のガイドラインは、プローブを設計し、ストリンジェントなハイブリダイ ゼーション・アッセイ条件を決定するのに有用である。 プローブは適当な融解温度(Ｔ_m)を有するよう設計しなければならない。適当 なＴ_mは、プローブ長およびヌクレオチド組成(Ｇ＋Ｃ対Ａ＋Ｔのパーセント)を 変化させることによって得ることができる。プローブ長およびヌクレオチド組成 は、好ましくは、最後のアッセイを行うであろう温度よりも約２-１０℃高いＴ_m に相当するよう選択すべきである。 一般に、約１０-５０塩基長のオリゴヌクレオチド・プローブについての最適 なハイブリダイゼーション温度は、与えられた二本鎖の融解温度よりも約５℃低 い。最適温度より低い温度でのインキュベーションでは、誤対合の塩基配列がハ イブリダイズし得、それゆえ特異性を減じる。プローブが長くなるほど、塩基対 間の水素結合も強固となり、一般にＴ_mも高くなる。また、Ｇ-Ｃ塩基対はさらな る水素結合を示し、よってＡ-Ｔ塩基対よりも熱安定性が向上するため、Ｇおよ びＣのパーセントを上げるほどＴ_mも高くなる。 Ｔ_mを決定する好ましい方法では、アーノルド(Ａrnord)ら、「均質保護アッセ イ」なる発明の名称、(前掲)によるハイブリダイゼーション保護アッセイ(ＨＰＡ )を用いてハイブリダイゼーションを測定する。Ｔ_mは以下のようにＨＰＡを用い て測定できる。過剰量の標的を用いて、プローブ:標的ハイブリッドをコハク酸 リチウム緩衝液(0.1Mコハク酸リチウム緩衝液、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧ ＴＡ、１０％(ｗ/ｖ)ラウリル硫酸リチウム、ｐＨ５.０)中で形成させる。次い で、ハイブリッドのアリコットをコハク酸リチウム緩衝液で希釈し、予想される Ｔ_m(典型的には５５℃)以下で出発して増加分２-５℃で上昇させる種々の温度に て５分間インキュベートする。次いで、この溶液を温和なアルカリ性ホウ酸緩衝 液(０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム、５％(ｖ/ｖ)トリトンＸ-１００、ｐＨ７.６) で希釈し、より低い温度(例えば５０℃)にて１０分間インキュベートする。これ らの条件下では、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルが加水分解 される一方、ハイブリダイズしたプローブに結合したアクリジニウムエステルは 加水分解から比較的保護される。かくして、残存するアクリジニウムエステル量 はハイブリッド量に比例し、過酸化水素に続きアルカリを添加するとアクリジニ ウムエステルから発生する化学ルミネッセンスによって測定することができる。 化学ルミネッセンスはルミノメーター(例えば、ジェン-プローブ・リーダー(Ｇen -Ｐrobe LEADER)Ｉまたはリーダー５０)で測定することができる。得られたデー タ を、最高シグナル(通常は最低温度からのもの)の％-対-温度としてプロットする 。Ｔ_mは、最高シグナルの５０％が残存する温度と定義する。前記方法に加えて 、Ｔ_mは当業者によく知られているアイソトープ法(例えば、ホーガン(Ｈogan)ら 、前掲)によって決定することができる。 与えられたハイブリッドに関するＴ_mが、用いるハイブリダイゼーション溶液 に依存して変動することに注意しなければならない。塩濃度、洗浄剤、および他 の溶質のごとき要因が、熱変性の間のハイブリッド安定性に影響し得る(ジェイ ・サムブルック(Ｊ.Ｓambrook)、イー・エフ・フリッシュ(Ｅ.Ｆ.Ｆritsch)およ びティー・マニアティス(Ｔ.Ｍaniatis)、モレキュラー・クローニング(Ｍolecu lar Ｃloning)１１章(第２版、１９８９年))。プローブを用いて標的にハイブリ ダイズさせるであろうイオン強度およびインキュベーション温度のごとき条件を 、プローブを構築するのに考慮しなければならない。ハイブリッドの熱安定性は 、反応混合物のイオン強度を上昇させるにつれて向上する。それとは反対に、ホ ルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコールのごとき水素結合を 断ち切る化学試薬は、ハイブリッドの熱安定性を顕著に低下させることができる 。 標的に対するプローブの特異性を確認するため、高ストリンジェンシィ条件下 でのみハイブリダイズするプローブを有するのが望ましい。高ストリンジェンシ ィ条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッドのみが形成され；十分な程度の相 補性がなければハイブリッドは形成されないであろう。したがって、アッセイ条 件のストリンジェンシィにより、２本の核酸鎖の間でハイブリッドを形成するの に必要な相補性の量が決定される。ストリンジェンシィは、標的で形成されたハ イブリッドと他の核酸配列とで形成されたハイブリッドとの間の安定性における 差異が最大となるよう選択する。 適当な特異性は、非-標的配列に対して相同的なＧおよびＣがリッチな領域を 避けつつ、非-標的生物に対して完全に相補的な長さを最小限とし、非標的配列 に対する可能な限り多くの不安定化する誤対合を含有するようにプローブを構築 することによって達成してもよい。プローブ配列が特定の型の生物のみを検出す るのに有効であるか否かは、プローブ:標的ハイブリッド-対-プローブ：非標的 ハイブリッドの間の熱安定性の差異に大きく依存する。プローブの設計において 、これらのＴ_m値における差異は可能な限り大きくなければならない(好ましくは ２℃-５℃またはそれを超える温度) 標的核酸配列長、それに応じてプローブ配列長も重要であり得る。ある場合に おいては、位置および長さにおいて変動する、特定領域からの幾つかの配列があ り得、これにより所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブが得られ る。他の場合においては、１つの配列が、単に単一の塩基が異なるに過ぎない他 の配列よりも顕著に良好であり得る。核酸がハイブリダイズさせるのに完全には 相補的でないこともあり得るが、完全に相同な塩基配列の最も長いストレッチが 一般にハイブリッド安定性を決定する。異なった長さのオリゴヌクレオチド・プ ローブおよび塩基組成物を用いてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチド・プ ローブは長さにして１０〜１００塩基長の間であって、より好ましくは１５〜５ ０塩基長の間である。 強固な内部構造を形成してハイブリダイゼーションを阻害することが知られて いるｒＲＮＡの領域はあまり好ましくない標的領域である。同様にして、広範な 自己-相補性を有するプローブも避けるべきである。前記に説明したごとく、ハ イブリダイゼーションとは、相補的な一本鎖核酸２本が水素結合した二本鎖を形 成する会合である。２本の鎖のうちの１本が全体的または部分的に分子内または 分子間ハイブリッドに関与している場合には、新たな分子間のプローブ：標的ハ イブリッドの形成に関与することは可能性が低いであろうことは暗黙的である。 ｒＲＮＡの場合においては、分子が非常に安定な分子内ハイブリッドを形成する ことが知られている。標的配列の実質部分が一本鎖となるようプローブを設計す ることによって、プローブおよび標的の間のハイブリダイゼーション速度および 程度は顕著に増加し得る。 ｒＤＮＡ標的は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の生成物と同様に二本鎖形態 で自然に生じる。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーション を自然に阻害し、ハイブリダイゼーション前に変性させる必要がある。適当な変 性およびハイブリダイゼーションの条件は、当該分野で知られている(例えば、 イー・エム・サザン(Ｅ.Ｍ.Ｓouthern)ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ オロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂiol.)第９８巻：５０３頁(１９７５年))。プローブ合成 推定に基づくユニークな標的配列を同定したら、相補的なオリゴヌクレオチド ・プローブを選択し合成する。配列の明確なオリゴヌクレオチド・プローブは、 ジェイ・サムブルック(Ｊ．Ｓambrook)、イー・エフ・フリッシュ(Ｅ.Ｆ.Ｆrits ch)およびティー・マニアティス(Ｔ.Ｍaniatis)、モレキュラー・クローニング( Ｍolecular Ｃloning)第１１章(第２版、１９８９年)に記載されているごとく、 シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を用いた自動化固相化学合成(バロン(Ｂ arone)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch)第 １２巻：４０５１頁(１９８４年))を包含する幾つかのよく知られた方法のいず れかによっても作製することができる。特定のオリゴヌクレオチド・プローブを 合成し精製した後、幾つかの異なった方法を利用して、サイズおよび純度に関す る該プローブの許容性を判断することができる。１つのかかる方法は、ポリアク リルアミドゲル電気泳動である。もう１つのかかる方法は、高速液体クロマトグ ラフィー(「ＨＰＬＣ」)である。これらの方法は当業者によく知られている。 合成したら、幾つかのよく知られた方法のいずれかによって(例えば、ジェイ ・サムブルック(Ｊ.Ｓambrook)ら、前掲)、選択したオリゴヌクレオチド・プロ ーブをレポーター基で標識することができる。有用な標識には、ラジオアイソト ープおよび非-放射性のレポーター基が含まれる。アイソトープ標識には、³Ｈ、³⁵ Ｓ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、⁵⁷Ｃｏおよび¹⁴Ｃが含まれる。ニック・トランスレーショ ン、末端標識、第二鎖合成、逆転写酵素の使用のごとき当該分野で公知の技術、 ならびに化学的方法によって、アイソトープ標識をオリゴヌクレオチドに導入す ることができる。ラジオアイソトープ標識プローブを用いる場合、ハイブリダイ ゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレーション計測またはガンマ計測 によって検出できる。選択する検出方法は、標識するのに用いる特定のラジオア イソトープに依存するであろう。 また、非-ラジオアイソトープ物質も標識に用いることができ、核酸配列に内 部的に導入してもよく、または核酸配列の末端に導入してもよい。修飾ヌクレオ チドは、酵素的または化学的に導入してもよい。例えば、(出典明示して本明細 書の一部とみなす)アーノルド(Ａrnold)ら、「ヌクレオチド・プローブ用の非-ヌ クレオチド結合性試薬」なる発明の名称、ＥＰＯ出願番号８８３０８７６６.０ 号、公開番号３１３２１９号によって記載されるごとく、プローブ合成の途中ま たはその後に、プローブの化学修飾を行ってもよい。非-ラジオアイソトープ標 識には、蛍光分子、化学ルミネッセンス分子、酵素、補助因子、酵素基質、ハプ テンまたは他のリガンドが含まれる。 好ましくは、プローブはアクリジニウムエステルで標識する。アクリジニウム エステル標識は、(出典明示して本明細書の一部とみなす)アーノルド(Ａrnold) ら、「ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル標識および精製(Ａcri dinium Ｅster Ｌabeling and Ｐurification of Ｎucleotide Ｐrobes)」なる 発明の名称の１９９３年２月９日に発行された米国特許第５,１８５,４３９号に よって記載されているごとく行ってもよい。ヘルパー・プローブ アッセイ・プローブとその標的核酸との核酸ハイブリダイゼーション速度は、 (出典明示して本明細書の一部とみなす)ホーガン(Ｈogan)およびミリマン(Ｍill iman)、米国特許第５,０３０,５５７号に開示されている「ヘルパー・プラスミ ド」を用いることによって上昇させることができる。ヘルパー・プローブは、ア ッセイ・プローブにより標的化される領域の近傍に位置する核酸配列にハイブリ ダイズするよう選択する。ヘルパー・プローブのハイブリダイゼーションによっ て、二次および三次構造が変化し、そのことによって、検出プローブがより近付 き易い核酸の標的化領域となる。本明細書に記載するアッセイ・プローブと共に 用いるべきヘルパー・プローブには、以下のヌクレオチド配列(５'から３'方向 へ記載している)： それらのＲＮＡ相当物、配列番号３７、４０、６４、６７、７０、７３、７６、 ７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９ 、 １１２、１１５、１１８、１２８、１２９、１３０；それらに相補的なオリゴヌ クレオチド、配列番号３８、４１、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３ 、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、 １１６、１１９、１３３、１３４、１３５；およびそれらに相補的なオリゴヌク レオチドのＲＮＡ相当物、配列番号３９、４２、６６、６９、７２、７５、７８ 、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９８、１０２、１０５、１０８、１１ １、１１４、１１７、１２０、１３８、１３９、１４０を有するオリゴヌクレオ チドが含まれる。 好ましくは、以下のハイブリダイゼーション・アッセイプローブとヘルパー・ プローブとの組合せを用いる： 実施例 以下に提供する実施例において、本発明の別の態様および具体例を説明するも のである。これらの実施例は開示した本発明を如何なる場合においても限定する ものではない。 ウレアプラズマに特異的なプローブは、ユウ・ウレアリティカムＴ-９６０(Ｃ Ｘ-８)の１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な、または公開された５Ｓ配列 からのプライマーでの配列決定によって同定した。エム・ゲニタリウム、エム・ ニューモニエ、エム・イオワエ(iowae)、エム・マリス(muris)、エム・ピラム(p irum)およびエム・ガリセプティカム(gallisepticum)を包含する、発生系統的な 近縁系統からの核酸配列を、ユウ・ウレアリティカムからの核酸配列との比較物 として用いて可変領域を決定した。 以下のハイブリダイゼーション・アッセイプローブ配列はそれ以降に記載する 実施例の特色をなす： プローブは、アーノルド(Ａrnold)ら、前掲、「ヌクレオチド・プローブ用の 非-ヌクレオチド結合性試薬(Ｎon-Ｎucleotide Ｌinking Ｒeagents Ｆor Ｎucleotide Ｐrobes)」により記載されているごとく非-ヌクレオチド・リンカー で合成し、次いでアーノルド(Ａrnold)ら、前掲、米国特許第５,１８５,４３９ 号により記載されているごとく、化学ルミネッセンス、アクリジニウムエステル で標識した。ユウ・ウレアリティカムに対する該プローブの反応性および特異性 は、ハイブリダイゼーションおよび分離の形式(実施例１、表１-４)または均質 アッセイ形式(実施例２および３、表５および６；実施例４、表７および８)を用 いて立証した。これらの方法は、(出典明示して本明細書の一部とみなす)アーノ ルド(Ａrnold)ら、前掲、「均質保護アッセイ」；アーノルド(Ａrnold)ら、「ポ リカチオン性支持体および核酸の精製、分離およびハイブリダイゼーション(Ｐo lycationic Ｓupports and Ｎucleic Ａcid Ｐurification，Ｓeparation and Ｈybridization)」、ＥＰＯ出願番号８８３０１８３９.２号、公開番号０ ２８ １ ３９０号；ならびにアーノルド(Ａrnold)ら、クリニカル・ケミストリー(Ｃl in.Ｃhem.)第３５巻：１５８８頁(１９８９年)で得た。 結果は、相対光単位(ＲＬＵ)で記載する。ジェイ・サムブルック(Ｊ.Ｓambrook )、イー・エフ・フリッシュ(Ｅ.Ｆ.Ｆritsch)およびティー・マニアティス(Ｔ. Ｍaniatis)モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)(第２版、１９８ ９年)に従って精製した細胞溶解物またはＲＮＡに、プローブをハイブリダイズ させた。別法として、溶解物、特にマイコバクテリア(Ｍycobacteria)、グラム 陽性生物または酵母の溶解物は、(出典明示して本明細書の一部とみなす)マーフ ィー(Ｍurphy)ら、「細胞からＲＮＡおよびＤＮＡを放出させる方法(Ｍethod fo r Ｒeleasing ＲＮＡ and ＤＮＡ from Ｃells)」、ＥＰＯ出願番号８７３０３ ６４１.２号、公開番号２８８６１８号により記載されている方法を利用して得 ることもできる。以下の実施例では、ユウ・ウレアリティカムｒＲＮＡ配列を標 的化したハイブリダイゼーション・アッセイプローブ、または相当遺伝子、およ びハイブリダイゼーション・アッセイにおけるそれらの使用を記載する。実施例１ この実施例では、ウレアプラズマ１６Ｓ ｒＲＮＡに対して標的化したアクリ ジニウムエステル-標識プローブを含有する混合物が、他の微生物を検出せずに 種々のウレアプラズマ株を検出することができることを説明している。(前記し たごとき)配列番号２、５、８、９、１１、１４、１７および２０、ならびに相 当する非標識「ヘルパー・プローブ」を有するアッセイ・プローブが該混合物に 含まれる。 表１は、１０⁶-１０⁸の生物を含有する液体ブロス培地から放出された過剰量 のＲＮＡとこれらのプローブとを用いたデータを示している。等容量の細胞溶解 物と、０.１９Ｍコハク酸リチウム、０.６２Ｍラウリル硫酸リチウム、３ｍＭエ チレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、３ｍＭエチレンブリコール=ビス(β-アミノ エチルエーテル)Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'四酢酸(ＥＧＴＡ)を含有するｐＨ５ハイブリダイ ゼーション溶液とを混合し、６０℃にて１時間インキュベートした。次いで、ハ イブリッドを、０.７６Ｍホウ酸ナトリウム、６％トリトンを含有するｐＨ７.５ 溶液に入れた磁性アミン・ミクロスフェア(マサチューセッツ州、ケンブリッジ( Ｃambrdge,ＭＡ)のアドバンスド・マグネティクス,インコーポレイテッド(Ａdva nced Ｍagnetics,Ｉnc.)社)に結合させ、８０ｍＭホウ酸ナトリウムを含有する ｐＨ１０.４溶液中にて１回洗浄した。ハイブリダイズしたアクリジニウムエス テル標識プローブからの、該粒子と関連する化学ルミネッセンスを、１ｍＭ硝酸 中の０.１％過酸化水素、続いて１Ｎ過酸化ナトリウム溶液の自動注射を備えた ルミノメーターで測定した。非-標的ＲＮＡ１ｎｇを含有するハイブリダイゼー ション反応物からのＲＬＵを、示した値から差し引いた。表１に示すデータは、 ヒトで発見された公知のユウ・ウレアリティカム株または血清型、ならびに動物 起源のユウ・カティ(cati)、ユウ・ディバーサム(diversum)およびユウ・ガロラ レ(gallorale)にプローブがハイブリダイズすることを示している。 表２は、プローブが、数種の近縁系統のマイコプラズマ、アコレプラズマ(Ａc holeplasma)またはスピロプラズマ(Ｓpiroplasma)種からウレアプラズマを識別 することを示している。３００ＲＬＵより大きな正味のＲＬＵ値を陽性反応とみ なした。全-細菌/酵母・プローブ混合物を対照として用いて、細菌核酸の存在を 証明した(データは示さず)。ホーガン(Ｈogan)ら、前掲、「非-ウイルス生 物を検出および/または定量するための核酸プローブ」なる標題は、適当な全-細 菌/酵母・プローブ混合物の例を提供している。本明細書に記載した例で用いた 全-細菌プローブは、ホーガン(Ｈogan)らによって記載された全-細菌プローブＮ o.７の誘導体である(本明細書に記載した実施例で用いた全-細菌プローブは、ホ ーガン・プローブＮo.７よりも５'末端上で４ヌクレオチド短いが３'末端上で５ 塩基長いようにシフトされたプローブである)。酵母プローブは、ホーガン(Ｈog an)らに記載されている糸状菌プローブＮo.１の誘導体である。 表３は、該アッセイ・プローブ混合物が、パネルの尿生殖系微生物のメンバー からウレアプラズマを識別することを示している。また、全-細菌/酵母プローブ 混合物を本実験における対照として用いた。 表４は、該アッセイ・プローブが、微生物の系統発生的断面を代表する２７種 の細菌属からウレアプラズマを識別することを示している。再度、全-細菌/酵母 プローブ混合物を本実験における対照として用いた。 実施例２ ２３Ｓ ｒＲＮＡ ユウ・ウレアリティカム領域、ユウ・ウレアリティカムおよ び他の微生物を標的化したアクリジニウムエステル-標識プローブのハイブリダ イゼーションを評価した。溶解物(Ｌ)または精製ＲＮＡを、配列番号２９のプロ ーブ、ならびに配列暗号２８および３０のヘルパー・プローブと、０.０５Ｍコ ハク酸リチウム、０.６ＭＬiＣl、１％(ｗ/ｖ)ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ５中、６０℃にて１５分間ハイブリダイズ させ、続いて０.６Ｍホウ酸ナトリウム、１％トリトンＸ-１００、ｐＨ８.５の 溶液３００μlを６０℃にて５-７分間添加した。試料は、実施例１に記載したご とくルミノメーターで判読した。ウレアプラズマ試料は、ユウ・ウレアリティカ ムｒＲＮＡ１μｇを含有していた。 表５に示すごとく、２３Ｓ ｒＲＮＡユウ・ウレアリティカムを標的化したプ ローブは、マイコプラズマを包含する他の生物からユウ・ウレアリティカムを容 易に識別した。この表におけるデータは、バックグラウンド値および陰性対照値 を差し引いていないＲＬＵで報告されている。約２０,０００〜３０,０００RLU より大きな値を、本アッセイにおける陽性結果と見なした。 実施例３ ５Ｓ ｒＲＮＡを標的化した配列番号２２または２３のアクリジニウムエステ ル-標識プローブを、細胞溶解物の形態で細胞から放出されたか、または前記の ごとく精製した過剰量のＲＮＡとハイブリダイズさせ、実施例２に記載したごと くアッセイした。配列番号２２のプローブを、配列番号２４および２５のヘルパ ー・プローブの存在下でハイブリダイズさせ；配列番号２６および２７のヘルパ ー・プローブの存在下で配列番号２３のプローブとハイブリダイズさせた。 表６に示すごとく、ウレアプラズマ・ウレアリティカム５Ｓ ｒＲＮＡを標的 化したプローブは、他のモリキューテス綱微生物からこの生物を識別できた。 実施例４ この実施例では、生物型２から生物型１を識別できるプローブについて記載す る。プローブ開発の工程において、１つのプローブが、生物型２溶解物よりも生 物型１溶解物について実質的に低いシグナルしか供さないことが認められた。こ のことは、プローブ領域における配列変異性を示唆した。特定の生物型を標的化 するプローブ配列を同定するために、数種のウレアプラズマ・ウレアリティカム 株を分析した。配列情報を用いて、配列番号１２１および1２２の生物型特異的 プローブを合成し、アクリジニウムエステルで標識した。実施例２に記載したご とく１８株のウレアプラズマ・ウレアリティカムからのｒＲＮＡにそのプローブ をハイブリダイズさせた。そのデータを表７に示す。全-細菌/酵母プローブ混合 物で得られたシグナルにより、各試料中のｒＲＮＡ量の定量的指標が得られる。 生物型１プローブは生物型１の株とのみ反応し；生物型２プローブは生物型２の 株とのみ反応した。 同様な実験を行って、１８種の近縁系統のマイコプラズマ種および２種のスピ ロプラズマ種に対する該生物型プローブの特異性を検討した。表８に示す結果は 、正味ＲＬＵ｛すなわち、(試験した試料からのＲＬＵ)−(陰性対照試料からの ＲＬＵ)｝で示している。表８に示すごとく、生物型-特異的ウレアプラズマ・ウ レアリティカム・プローブは、それらの対応する特異的生物型の株とのみ反応し 、いずれの他の近縁系統の生物とも交差反応しなかった。 実施例５ この実施例では、標的核酸増幅の生成物を検出する標的核酸として同センスの ウレアプラズマに対するアッセイプローブの使用を説明する。ウレアプラズマ・ ウレアリティカムｒＲＮＡは、０.３μＭプロモーター・プライマー(配列番号： １４１)、５０ｍＭトリス-ＨＣl、２５ｍＭ ＫＣl、１７.５ｍＭ ＭｇＣl₂、５ ｍＭジチオスライトール、２ｍＭスペルミジン三塩酸塩、６.５ｍＭｒ ＡＴＰ、 ２.５ｍＭ ｒＣＴＰ、６.５ｍＭ ｒＧＴＰ、２.５ｍＭ ｒＵＴＰ、０.２ｍＭ ｄ ＡＴＰ、０.２ｍＭ ｄＣＴＰ、０.２ｍＭ ｄＧＴＰ、０.２ｍＭｄ ＴＴＰ、６０ ０Ｕ ＭuＭＬＶ逆転写酵素および４００Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ｐＨ７. ６よりなる溶液１００μＬ中、約３７℃にてインキュベートすることによって増 幅させた(カシアン(Ｋacian)ら、前掲、「核酸配列の増幅方法、組成物およびキ ット」なる標題)。反応は、１５分および４時間の間の種々の時点でアリコート を取り出し、実施例２に記載した条件を用いて、標的ｒＲＮＡ(配列番号：５９ 、１１０)およびヘルパー・プローブ(配列番号：１０４、１０７)と同一センス の２種の５Ｓ ｒＲＮＡプローブを用いて生成物につきアッセイした。 表９に示すデータは、生物のｒＲＮＡとして逆センスの核酸配列に対して標的 化したアッセイ・プローブが標的増幅方法からの生成物を検出できることを証明 している。増幅時間が増加するに従って、より多くの標的配列が産生してプロー ブ検出からのシグナルが増大した。 前記した種々の実施例に示したデータにより、本明細書に記載し特許請求する 新規のプローブが、ウレアプラズマをその公知の系統発生的に最も近縁の系統か ら識別することできることが確証された。また、各他のおよび公知の系統発生学 的に最も近縁な系統からウレアプラズマの生物型を識別するのに用いることがで きるよう、該プローブが設計されていることをデータは示している。さらに、相 補的オリゴヌクレオチドプローブ、すなわち、標的配列と同一センスを有するも のを利用して、生物のアッセイの検出感度を上昇させるのに本発明で利用した標 的増幅工程の生成物を検出する。 他の具体例も以下の請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴードン，パトリシア アメリカ合衆国92077カリフォルニア州、 スプリング・バレー、サドル・ドライブ 3501番 (72)発明者 ハモンド，フィリップ・ダブリュ アメリカ合衆国80303コロラド州、ボール ダー、イースト・ユークリッド3160番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１０〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド・プローブよりなり、該 オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条 件下にてウレアプラズマ標的核酸配列にハイブリダイズするに十分に該配列に相 補的であって、該配列が： および よりなる群から選択される、ウレアプラズマを検出するための核酸ハイブリダイ ゼーション・アッセイプローブ。 ２．該プローブが、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて、 ウレアプラズマ・ウレアリティカム標的核酸配列にハイブリダイズできるが、マ イコプラズマ・ニューモニエに存在する核酸配列にはハイブリダイズできない請 求項１記載の核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブ。 ３．該プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件 下にて、マイコプラズマ・ゲニタリウムおよびマイコプラズマ・ホミニスよりな る群から選択されるマイコプラズマからウレアプラズマ・ウレアリティカムを識 別する請求項１記載の核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブ。 ４．該プローブが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件 下にて、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファーメンタンス、マイコ プラズマ・カプリコラム、マイコプラズマ・リポフィラムおよびマイコプラズマ ・サリバリウムよりなる群から選択されるマイコプラズマからウレアプラズマ・ ウレアリティカムを識別する請求項１記載の核酸ハイブリダイゼーション・アッ セイプローブ。 ５．ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレアプ ラズマ・ウレアリティカム生物型１または生物型２の標的核酸配列のいずれかに ハイブリダイズするに十分に該生物型１または生物型２配列に相補的な核酸配列 を有する、１０〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド・プローブよりな り、ここに、該プローブが該ハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にて両方 の生物型にはハイブリダイズせず、該核酸配列が： よりなる群から選択される、ウレアプラズマ・ウレアリティカム生物型を識別す るための核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブ。 ６．該プローブが、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条 件下にて、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ホミニスおよびマ イコプラズマ・ニューモニエからの核酸にはハイブリダイズしない請求項５記載 のハイブリダイゼーション・アッセイプローブ。 ７．該プローブが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる、ストリンジェントなハイ ブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレアプラズマ・ウレアリティカムを 検出するための核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブ。 ８．請求項７記載のオリゴヌクレオチドとヘルパー・プローブとよりなるプロー ブ混合物。 ９．該ヘルパー・プローブが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項８記載のプローブ混合物。 １０． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １１． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １２． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １３． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １４． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １５． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １６． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １７． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １８． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 １９． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 ２０． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項７記載のオリゴヌク レオチド。 ２１． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる、ストリンジェントなハイ ブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレアプラズマ・ウレアリティカムの 異なった生物型間を識別するためのオリゴヌクレオチド・プローブ。 ２２． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる、ストリンジェントなハイ ブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレアプラズマ・ウレアリティカムの 異なった生物型間を識別するためのオリゴヌクレオチド・プローブ。 ２３． よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチド間に形 成される核酸ハイブリッドよりなるウレアプラズマを検出するための組成物。 ２４．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ２５．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項２４記載の組成物。 ２６．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項２５記載の組成物。 ２７．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ２８．さらにヘルパー・プローブよりなる請求項２７記載の組成物。 ２９．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項２８記載の組成物。 ３０．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ３１．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項３０記載の組成物。 ３２．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項３１記載の組成物。 ３３．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ３４．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項３３記載の組成物。 ３５．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項３４記載の組成物。 ３６．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ３７．さらに核酸ヘルパー・プラスミドよりなる請求項３６記載の組成物。 ３８．該ヘルパー・プラスミドが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項３７記載の組成物。 ３９．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ４０．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項３９の組成物。 ４１．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項４０記載の組成物。 ４２．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ４３．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項４２記載の組成物。 ４４．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項４３記載の組成物。 ４５．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ４６．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項４５記載の組成物。 ４７．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項４６記載の組成物。 ４８．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ４９．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項４８記載の組成物。 ５０．該ヘルパー・プローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項４９記載の組成物。 ５１．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ５２．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項５１記載の組成物。 ５３．該ヘルパー・プローブが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項５２記載の組成物。 ５４．該オリゴヌクレオチドが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる請求項２３記載の組成物。 ５５．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項５４記載の組成物。 ５６．該ヘルパー・プローブが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項５５記載の組成物。 ５７． および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチド間に形 成される核酸ハイブリッドよりなる、ウレアプラズマ・ウレアリティカム生物型 １またはウレアプラズマ・ウレアリティカム生物型２の存在を検出するための組 成物。 ５８．さらに核酸ヘルパー・プローブよりなる請求項５７記載の組成物。 ５９．該ヘルパー・プローブが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチドである 請求項５８記載の組成物。 ６０．ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレア プラズマ標的核酸配列にハイブリダイズできるが、しかし、該ストリンジェント なハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてマイコプラズマ・ゲニタリウム 、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラ ズマ・オラレからの核酸配列にはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼー ション・アッセイプローブと試験試料とを、該ストリンジェントなハイブリダイ ゼーション・アッセイ条件下にて接触させる工程よりなり、ここに、該ウレアプ ラズマ標的核酸配列が： および よりなる群から選択される、ウレアプラズマの存在を検出し、かつマイコプラズ マ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ホミニス およびマイコプラズマ・オラレから該ウレアプラズマを識別する方法。 ６１．ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレア プラズマ・ウレアリティカム生物型１または生物型２のいずれかからの該標的核 酸配列にハイブリダイズできる核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブ と試験試料とを、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件 下にて接触させる工程よりなり、ここに、該プローブが該ストリンジェントなハ イブリダイゼーション・アッセイ条件下にて該生物型１および該生物型２の両方 にはハイブリダイズしなく、該ウレアプラズマ・ウレアリティカム標的核酸配列 が： よりなる群から選択される、ウレアプラズマ・ウレアリティカム生物型１および ウレアプラズマ・ウレアリティカム生物型２の存在を検出し、かつその間を識別 する方法。 ６２．該ハイブリダイゼーション条件下にて、該プローブが、マイコプラズマ・ ゲニタリウム、マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラズマ・ニューモニエ からの核酸配列にはハイブリダイズしない請求項６１記載の方法。 ６３．ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレア プラズマ・ウレアリティカム標的核酸配列にハイブリダイズできるが、しかし該 ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてマイコプラズ マ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ホミニス およびマイコプラズマ・オラレからの核酸配列にはハイブリダイズできない核酸 ハイブリダイゼーション・アッセイプローブと試料とを、該ストリンジェントな ハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にて接触させる工程よりなり、ここに 、該ハイブリダイゼーション・アッセイプローブが： および よりなる群から選択される核酸配列より実質的になる、ウレアプラズマの存在を 検出し、かつマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニエ、 マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラズマ・オラレからウレアプラズマを 識別する方法。 ６４．ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件下にてウレア プラズマ・ウレアリティカム生物型１または生物型２のいずれかからの該標的核 酸配列にハイブリダイズできる核酸ハイブリダイゼーション・アッセイプローブ と試験試料とを、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション・アッセイ条件 下にて接触させる工程よりなり、ここに、該プローブが該ストリンジェントなハ イブリダイゼーション・アッセイ条件下にて該生物型１および該生物型２の両方 にはハイブリダイズしなく、該ハイブリダイゼーション・アッセイプローブが： よりなる群から選択される核酸配列より実質的になるウレアプラズマ・ウレアリ ティカム生物型１およびウレアプラズマ・ウレアリティカム生物型２の存在を検 出し、かつその間を識別する方法。 ６５．(ａ) ならびに、それらに実質的に相補的なヌクレオチド・ポリマーよりなる群から選 択される核酸配列より実質的になるオリゴヌクレオチド間に核酸ハイブリッドを 形成させ：次いで (ｂ)該ハイブリッドの形成を検出する工程よりなるウレアプラズマ・ウレアリテ ィカムの存在を検出する方法。 ６６．さらにヘルパー・プラスミドを使用する請求項６０-６５いずれか記載の 方法。