JPH09501681A - ニトロキシドを用いる酸素毒性の防止用組成物と防止法 - Google Patents

ニトロキシドを用いる酸素毒性の防止用組成物と防止法

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Abstract

(57)【要約】 この発明は、生理学的に適合性のある高分子にニトロキシドを付加することに基づく酸素毒性を軽減させる組成物と方法に関する。特に、ヘモグロビンをベースとする赤血球代替物は安定なニトロキシド遊離基によって特徴づけられ、無細胞ヘモグロビン溶液、カプセル化ヘモグロビン溶液、安定化ヘモグロビン溶液、重合ヘモグロビン溶液、複合ヘモグロビン溶液、ニトロキシド標識アルブミンおよびニトロキシド標識イムノグロブリン中で使用される。この組成物は遊離基と相互作用し、抗酸化性酵素類似体として作用し、酸化的ストレスと酸素関連毒性を軽減させる。

Description

【発明の詳細な説明】 ニトロキシドを用いる酸素毒性の防止用組成物と防止法 技術分野 この発明は、生体内の酸素関連種の毒性効果を低減するための、高分子、例え ば、ヘモグロビン、アルブミン、イムノグロブリンおよびリポソームと共に用い られるニトロキシド(nitroxide)化合物の使用に関する。特にこの発明は、赤血 球代替物として用いられるカプセル化された生理学的に適合性のある無細胞ヘモ グロビン溶液と関係づけられるニトロキシドおよび遊離基によって惹起される酸 化的ストレスと損傷を低減または防止するための生理学的に適合性のある他の高 分子と関係づけられるニトロキシドによって特徴づけられる組成物と方法を開示 する。 背景技術 酸素代謝の生理学的機構は多年にわたって知られているが、生理学と医学にお ける酸化的ストレスの果たす役割については未だに十分には解明されていない。 種々のタイプの生理学的損傷に寄与する遊離基による機構が酸化的ストレス(oxi dative stress)とその毒性効果との関係で研究されている。しかしながら、酸 素関連種と関係する酸化的ストレスまたは毒性と闘うために開発されている従来 の方法や組成物は限定的にしか満足すべき結果をもたらしていない。血液代替物 を調製するときに遭遇する困難は、酸素毒性の防止または低減の際にも重大な問 題となる。 科学者および医者は人体に安全に輸血できる血液代替物の開発のために数十年 間にわたって努力している。慢性的な血液不足、不適合な血液型、交叉試験法お よび病気の伝染等の問題は、多量の代替血液を顕著な生理学的副作用をもたらす ことなく安全に輸血できる組成物を開発するための私的企業、大学および政府に よる広範な研究を促した。現在のところ、数社が実験的な血液代替物について臨 床試験をおこなっている。しかしながら、予想外の不都合な生理学的反応と研究 開発に伴う固有の複雑性が規制承認段階での進展を遅らせ、臨床的に有用な代替 血液の採用を妨げている。 米国海軍の研究諮問委員会は、代替血液を製造するための数グループによる研 究を略述し、該研究の状態を評価し、遭遇する毒性の問題を一般的に説明するレ ポートを１９９２年８月に発表している。この研究諮問委員会のレポートは、現 存の血液代替品[これは「ヘモグロビンをベースとする酸素キャリヤー(hemoglobi n−based oxygen carriers)」(ＨＢＯＣ)と呼ばれる場合が多い]は酸素輸送に おいては明確な効果を発揮するが、毒性の問題については未解決であるという斯 界の現在のコンセンサスを反映している。現存のＨＢＯＣの臨床的研究において 観察される不都合な輸血反応には全身系の高血圧症と血管収縮が含まれる。これ らの不都合な反応があるため、多数の製薬会社は臨床的試験を放棄するか、また は投与量を少なくすることを余儀なくさせられている。 現存のヘモグロビンをベースとする代替血液の毒性の問題は、米国政府によっ て最重要課題として取り上げられた。海軍の研究諮問委員会の勧告は、国立保健 研究所により、「ヘモグロビンをベースとする酸素キャリヤー:毒性の機構」とい う題目の提案要望書(Ｒequest Ｆor Ｐroposal)(ＰＡ−９３−２３)の形で利 用されている。このため、現存のヘモグロビンをベースとする酸素キャリヤーに みられるような副作用をもたらさないで輸血できる代替血液を開発するという差 し迫った重大な必要性に医科学界は悩んでいるのである。 赤血球は血液の主成分であって、身体の酸素輸送系を含んでいる。血液代替物 の最も重要な特性は酸素輸送能である。赤血球が酸素を輸送できるのは、赤血球 の一次成分が酸素キャリヤーとして機能するヘモグロビンだからである。血液代 替物として臨床試験に供されている大部分の製品は、赤血球膜と赤血球の残余成 分から分離した後、実質上全ての汚染物を含まないように精製したヘモグロビン を含有する。しかしながら、ヘモグロビンを赤血球から取り出して、自然の形態 で溶液中に移すと、ヘモグロビンは不安定なために急速にその構成サブユニット に解離する。このため、ＨＢＯＣに用いられるヘモグロビンは溶液中で解離しな いように安定化されなければならない。溶液中で安定であって、酸素輸送機能が 損なわれないように安定化されたヘモグロビンをベースとする製品の開発にはか なりの科学的労力と資金が必要であった。ＨＢＯＣの酸素輸送能は十分に確立さ れている（次の米国特許の各明細書参照： ３,９２５,３４４;４.００１,２００;４,００１,４０１;４,０５３,５９０;４ ,０６１,７３６;４,１３６,０９３;４,３０１,１４４;４,３６６,２４８;４,３ ７６,０９５;４,３７７,５１２;４,４０１,６５２;４,４７３,４９４;４,４７３ ,４９６;４,６００,５３１;４,５８４,１３０;４,８５７,６３６;４,８２６,８ １１;４,９１１,９２９および５,０６１,６８８。 身体内では、赤血球中のヘモグロビンは血液が肺を通過すると酸素分子と結合 し、酸素分子を身体の隅々まで輸送することによって、身体の正常な代謝機能の 要求を満たす。しかしながら、大部分の生物が生存するために吸い込まなければ ならない大気中の酸素は科学的および医学的なパラドックスである。即ち、一方 では、ほとんど全ての生物は生存のためには酸素を必要とするが、他方では、正 常な酸素代謝中に種々の毒性酸素関連化学種が生成する。 ヘモグロビンによる酸素輸送に起因する酸化的ストレスに関しては、次のこと が知られている。即ち、酸素の輸送過程において、ヘモグロビン分子(Ｈb)はそ れ自体が輸送する酸素分子(Ｏ2)によって酸化される。この自己酸化反応によっ て２種の望ましくない生成物、即ち、メトヘモグロビン(met−Ｈb)と超酸化物ア ニオン(・Ｏ2 -)が形成される。この化学反応は次の通りである： Ｈb ＋ ４Ｏ2 → met−Ｈb ＋ ４・Ｏ2 - [１] この超酸化物アニオン(・Ｏ2 -)は、付加的な電子と負電荷を有する酸素分子であ って、反応性が高く毒性である。ヘモグロビンによる酸素輸送の場合、潜在的に 損傷性のある酸化的ストレスはヘモグロビンの自己酸化によって発生する超酸化 物アニオンに由来し、その後の超酸化物不均化酵素（ＳＯＤ）の存在下での超酸 化物アニオンの毒性過酸化水素への変換に起因する（次式参照）。 ２・Ｏ2 - ＋ ２Ｈ → ２Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ2 [２] 超酸化物アニオンと過酸化水素が赤血球中に共存することが、赤血球に対する 酸化性ストレスの主要な原因であると考えられている。 生体内で持続的におこなわれるヘモグロビンによる酸素輸送のほかに、赤血球 のあまり認識されていない特性として、酸素代謝の副生物として生成する酸素関 連化学種を解毒し得る特異的な酵素類を含有することが挙げられる。これらの特 異的酵素系を保護することなく、ヘモグロビンの自己酸化によって赤血球の劣化 と破壊がもたらされる。しかしながら、体内では、赤血球内での酵素系の保存能 (reserve capacity)により、正常な代謝中に生成する超酸化物アニオンを非毒 性種に変換させて酸化的ストレスのレベルを調節することによって生体を酸素毒 性から保護する。しかしながら、この酵素系が破壊されると、赤血球の統合性(i ntegrity)は損傷をうける。赤血球の保護系に含まれる酵素の１種を生成する遺 伝子の損傷によって観察され得る病的症状がもたらされる。例えば、グルコース −６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損(赤血球の遺伝的異常)は過酸化水素に よって誘発される溶血性貧血に起因する。この疾患は、グルタチオンペルオキシ ダーゼによる過酸化水素の不十分な解毒化をもたらす酸化グルタチオンを還元す るのに十分な濃度のＮＡＤ(Ｐ)Ｈを維持する機能が損傷赤血球では失われること に起因する[ホーホシュタイン(Ｐ．Ｈochstein)、「遊離基生物学および医学」、 第５巻、第３８７頁(１９８８年)参照]。 赤血球の保護酵素系は、毒性超酸化物アニオン分子を化学的二段階経路によっ て非毒性形態に変換させる。この経路の第一段階は、超酸化物不均化酵素(ＳＯ Ｄ)による超酸化物アニオンの過酸化水素への変換である(前記の化学反応式[２] 参照)。過酸化水素は細胞に対して毒性であるので、赤血球は別の酵素(カタラー ゼ)を含んでおり、該酵素は第二の経路において過酸化水素を水に変換する(次式 [３]参照)。 ２Ｈ2Ｏ2 → ２Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2 [３] 赤血球は、グルタチオンと反応して過酸化水素や有機過酸化物を水に変換させ る酵素(グルタチオンペルオキシダーゼ)を用いて過酸化水素や他の毒性有機過酸 化物を解毒化することができる。赤血球はまた、ヘモグロビンの自己酸化によっ て生成するメトヘモグロビンの蓄積を防止する酵素を含んでいる。メトヘモグロ ビンレダクターゼはメトヘモグロビンを自然形態のヘモグロビンに変換する。従 って、体内では、ヘモグロビンの自己酸化による毒性効果は、酸素代謝による望 ましくない副生物を排除する特異的酵素に基づく反応経路によって阻止される。 正常な酸素輸送中の酸素毒性から赤血球を保護するグルタチオンペルオキシダ ーゼ、カタラーゼおよび超酸化物不均化酵素の酵素的酸素解毒作用は、今日まで 開発されたＨＢＯＣには存在しない。酸素解毒作用がないために、現存するＨＢ ＯＣ溶液の安全性は毒性酸素関連種の存在のために損なわれる。 現存するＨＢＯＣ溶液を製造する基本的方法は、赤血球からヘモグロビンを採 取した後、輸血中に不都合な反応を惹起する可能性のある非ヘモグロビンタンパ ク質やその他の不純物を除去して精製する方法である(米国特許第４,７８０,２ １０号、同第４,８３１,０１２号および同第４,９２５,５７４号各明細書参照) 。酸素解毒酵素系の実質的な破壊または除去は、大部分のＨＢＯＣに用いられる 精製ヘモグロビンを得るための現在の単離精製技術によっては避けられない結果 である。別の製造法は、ヘモグロビンを赤血球から単離して精製せずに、組換え 技術によって純粋なヘモグロビンを調製する方法である。しかしながら、ヒトの 組換えヘモグロビンは高度に精製されており、赤血球に存在する酸素解毒系を含 まない。従って、高度に精製されたヘモグロビン溶液を製造するための最新の技 術の開発は、精製過程において有害な不純物と共に赤血球中に通常存在する有益 な酸素解毒系が除去されるので一長一短があり、結局は酸素関連毒性をもたらす ことになる。 現存のＨＢＯＣにみられる毒性副作用の一つは血管収縮または高血圧である。 周知のように、超酸化物不均化酵素(ＳＯＤ)は生体外では超酸化物アニオンを素 早く捕捉し、一酸化窒素(ＮＯ)による血管拡張効果を長びかせる。一酸化窒素は 、従来は「血管内皮由来拡張因子(ＥＤＲＦ)」として知られていたにすぎない物質 であることが最近判明した分子である。一酸化窒素の血管拡張効果のＳＯＤによ る延長は、超酸化物と一酸化窒素との反応を阻害するＳＯＤの作用によるもので あ る[マーフィー(Ｍ．Ｅ．Ｍurphy)ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、第 ８８巻、第１０８６０頁(１９９１年);イグナッロ(Ｉgnarro)ら、Ｊ．Ｐharmaco l．Ｅxp．Ｔher．第２４４巻、第８１頁(１９８８年);ルバニイ(Rubanyi)、Am． Ｊ．Ｐhysiol．、第２５０巻、第Ｈ８２２頁(１９８６年);グリグレウスキー(Ｇ ryglewski)ら、ネイチャー、第３２０巻、第４５４頁(１９８６年)]。 しかしながら、生体内においては、超酸化物アニオンによるＥＤＲＦの不活性 化は観察されておらず、また、一般的にもそのような効果があるとは考えられて いない。それにもかかわらず、ＳＯＤ活性を低下させる特定の病理生理学的症状 は、超酸化物アニオンによってもたらされる毒性効果によるとされている[イグ ナッロ、Ｊ．Ａnnu．Ｒev．Ｐharmacol．Ｔoxicol．、第３０巻、第５３５頁(１ ９９０年)参照]。現存のＨＢＯＣ溶液についての前臨床動物試験において観察さ れた高血圧効果は次のこのことを示唆する。即ち、現存する多量のＨＢＯＣ輸液 中の超酸化物アニオンの濃度がＥＤＲＦの破壊並びに観察されている血管収縮お よび全身系高血圧の原因であると考えられる。 従って、ヘモグロビンによるＮＯの結合と血液浸出に起因する高血圧効果によ るＮＯと超酸化物アニオンとの反応に起因する高血圧効果を解明することは重要 である。ＨＢＯＣの輸液においては、ヘモグロビンもＮＯによる血管拡張作用を 低下させるが、これはヘモグロビンがＮＯと反応して対応するニトロシル−ヘム (ＮＯ−ヘム)付加物を生成するからである。特に、デオキシヘモグロビンは、一 酸化炭素に対するよりも数桁高い親和力でＮＯと結合することが知られている。 このようなヘモグロビンとＮＯとの相互作用はＮＯのアッセイやＮＯの生物学的 活性の研究に利用されている。例えば、ヘモグロビンによるＮＯの血管拡張効果 の拮抗は、ヘモグロビンの細胞膜透過率によって左右されると考えられる。無傷 血小板においては、ヘモグロビンは、ＮＯの前駆体であるＬ−アルギニンの効果 を逆転させない。反対に、溶解血小板のサイトソル中では、ヘモグロビンは、Ｌ −アルギニンで誘発されてＮＯを媒介とする環状ＧＭＰの形成に対する最も有効 なインヒビターである。これらの実験結果は、ヘモグロビンが血小板膜を効果的 に透過しないことを示すものである[ラドムスキー(Ｒadomski)ら、Ｂr．Ｊ．Ｐh armacol．、第１０１巻、第３２５頁(１９９０年)参照]。従って、ＨＢＯＣの一 つの望ましい特性は、ＮＯとヘモグロビンとの相互作用を排除する性質である。 ヘモグロビンが上皮に依存する筋肉弛緩[マルチン(Ｍartin Ｗ．)ら、Ｊ．Ｐha rmacol．Ｅxp．Ｔher．、第２３２巻、第７０８頁(１９８５年)参照]およびＮＯ によって誘発される平滑筋弛緩[グレーター(Ｇrueter．Ｃ．Ａ．)ら、Ｊ．Ｃycl ic．Ｎucleotide Ｒes．、第５巻、第２１１頁(１９７９年)参照]に対して拮抗 作用を示すことが知られている。ＨＢＯＣ中のヘモグロビンを化学的に安定化、 重合化、カプセル化または複合化させることによってヘモグロビンの血液浸出や 高血圧効果を制限することにより循環時間を遅延させる試みがなされている。現 存のＨＢＯＣは細胞膜を比較的透過しにくくて酸素を輸送することができるが、 ＨＢＯＣ溶液は、輸液したときに超酸化物アニオンとＮＯとの反応を阻止する機 能を有していない。 現存の血液代替物の毒性問題についての理想的な解決策は、現存のＨＢＯＣの 酸素輸送機能と赤血球の酸素解毒機能を併有するヘモグロビンをベースとする配 合物を調製することである。しかしながら、超酸化物不均化酵素(ＳＯＤ)を既存 のＨＢＯＣ溶液を単に添加するだけでは望ましい効果は得られない。何故ならば 、超酸化物アニオンの濃度低下によってヘモグロビンをメトヘモグロビンに酸化 する反応が促進されてメトヘモグロビンの望ましくない蓄積がもたらされるから である(前記の反応式[１]参照)。また、ヘモグロビン溶液中で超酸化物アニオン を過酸化水素に変換する反応を促進することも望ましくない。何故ならば、過酸 化水素は毒性で反応性があり、貯蔵中に分解して毒性のヒドロキシルラジカルに なるか、または他の毒性の有機過酸化物を形成するからである。 この発明は安定なニトロキシド遊離基(以下、「ニトロキシド」という)を使用す ることによって、赤血球の酸素解毒機能をヘモグロビンをベースとする血液代替 物に付与すると共に、酸化的ストレスを低減させることによって遊離基毒性に関 連する生物学的損傷、例えば、炎症、虚血後の再潅流損傷(post−ischemic rep erfusion injury)、電離放射線損傷およびエイジングプロセス(aging process )損傷を回避するためになされたものである。ニトロキシドは安定な遊離基であ って、超酸化物不均化酵素(ＳＯＤ)と類似した抗酸化性触媒活性を有しており、 生体内においてはカタラーゼに類似した活性を示す他の物質と相互作用する。従 来からニトロキシドは電子スピン共鳴分光法において、生体高分子の配座特性と 運動特性を研究するための「スピンラベル(spin label)」として使用されてい る。ニトロキシドは反応性遊離基中間体を検出するのにも利用されているが、こ れはその化学構造中に十分に解明された超微細相互作用を安定な不対電子がある からである。さらに、ニトロキシドは酵素類似体として作用することが観察され ている。即ち、特定の低分子量ニトロキシドはＳＯＤ[サムニ(Ａ．Ｓamuni)ら、 Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．、第２６３巻、第１７９２１頁(１９８８年)参照]およびカ タラーゼ[メールホルン(Ｒ．Ｊ．Ｍehlhorn)ら、Ｆree Ｒad．Ｒes．Ｃomm．、 第１７巻、第１５７頁(１９９２年)参照]と類似の活性を示すことが確認されて いる。多くの研究によって確認されているように、細胞膜を透過し得るニトロキ シドは、ハイポキサンチン／キサンチンオキシダーゼによって発生する超酸化物 アニオンおよび過酸化水素暴露に起因する細胞毒性から哺乳類の細胞を短期間保 護する。 生体内での安全性に関しては、ニトロキシドは比較的安全であることが知られ ているので、比較的高濃度のニトロキシドも十分に許容される。例えば、ＴＥＭ ＰＯをマウスの腹腔内に投与する場合の最大許容量は２７５mg／kgであり、ＬＤ50 は３４１mg／kgである。さらに、高分子が結合したニトロキシドは遊離のニト ロキシドよりも安全である。従って、ニトロキシドで標識化した高分子の抗酸化 性酵素類似体としての有用性は、高濃度、従って高活性のニトロキシドを安全に 投与できる可能性に基づく。 今まで生体において試験された大部分のニトロキシドは、細胞膜を容易に透過 して身体組織内へ入ることのできる比較的低分子量の化合物である。本発明によ れば、酵素類似体として用いるニトロキシドは、血管裂孔へ注入して残存させて もよい生体高分子および合成高分子と結合させる。本発明の好ましい態様におい ては、ニトロキシドを高分子と共有結合させて遊離基の毒性を低減させると共に 、ニトロキシドを血管裂孔内に閉じ込め、該裂孔内において遊離基との有用な反 応性を最適化させる。 ニトロキシドを生体高分子、例えば、ヘモグロビン、アルブミン、イムノグロ ブリンおよびリポソーム等に共有結合させる方法は多数知られている。例えば次 の文献参照:マッコネル(ＭcＣonnell)ら、Ｑuart．Ｒev．Ｂiophys．、第３巻、 第９１頁(１９７０年);ハミルトン(Ｈamilton)ら、「構造化学と分子生物学」[リ ッチ(Ａ．Ｒich)ら編、フリーマン(Ｗ．Ｈ．Ｆreeman)、サンフランシスコ]、第 １１５頁(１９６８年);グリフィス(Ｇriffith)ら、Ａcc．Ｃhem．Ｒes．、第２ 巻、第１７頁(１９６９年);スミス(Ｓmith Ｉ．Ｃ．Ｐ．)、「電子スピン共鳴分 光法の生物学的応用」[シュバルツ(Ｓwartz Ｈ．Ｍ．)ら編、ウィリー／インタ ーサイエンス、ニューヨーク]、第４８３頁(１９７２年)。ヘモグロビンの協同 的酸素結合機構を研究する目的で特定のニトロキシドをヘモグロビン分子に共有 結合させることが知られているが、血液代替物と共に用いるために特別に調製さ れたヘモグロビンとの関連でニトロキシドが用いられた例はない。以下に示す実 験結果は、ニトロキシドは遊離基と反応するので、血液代替物として使用するた めに安定化、重合化、複合化およびカプセル化したヘモグロビンに結合できるこ とを例証するものである。ニトロキシドで標識したヘモグロビンと遊離基との相 互作用は次のことを示唆する。即ち、十分な血漿半減期を有する生物学的に適合 性のある他の高分子をニトロキシドで標識することによって、遊離基化学種によ って惹起される酸化性ストレスまたは毒性に対する耐性を都合よく得るか、また は該酸化的ストレスまたは毒性からの保護を都合よく達成できる。 前述のように、ニトロキシドは生体高分子、例えばヘモグロビン、血清アルブ ミン、イムノグロブリンおよびリポソーム等と化学的に結合することが知られて いる。しかしながら、この知見は、ニトロキシドが生物物理学的研究のための分 子プローブ(molecular probe)として一般的に用いることができることを示すも のであり、ニトロキシドで標識した高分子を治療用物質として用いるために特別 に調製した例はない。 本明細書に記載の高分子に関しては、ニトロキシドを高分子に結合させるには ２種の方法、即ち「標識化法(labelling strategy)」として知られている方法が 可能である。特異的標識化の意義は、ニトロキシドが高分子に結合する微視的環 境とニトロキシドによる触媒活性にある。１個または複数個の特定の配位子結合 部位における特異的標識化によって、より安定な結合部位のある微視的環境を有 する均一生成物、即ちニトロキシドの触媒的な特異性と活性の点で信頼性の高い 化合物が得られる。 ニトロキシドで標識したＨＢＯＣの注入を含む本明細書に示す実験結果に基づ けば、低分子量または高分子量のニトロキシドと遊離基との反応が生体外および 生体内の血管裂孔において観察された。これらの実験に基づけば、遊離基との酸 化／還元反応にニトロキシド標識化ＨＢＯＣが関与する反応機構は、遊離基を解 毒する新規なＨＢＯＣ化合物および他のニトロキシド−標識化高分子が調製でき ることを示すものである。 発明の開示 この発明は、生体高分子、特にヘモグロビン含有溶液との関連で安定なニトロ キシドを使用する方法およびこれらを含有する組成物を開示する。特定の態様に おいては、安定なニトロキシドをヘモグロビン含有溶液と共に用いることによっ て、赤血球の酸素解毒機能を有する血液代替物用の数種の製剤が得られる。これ らの製剤は本明細書においてはヘモグロビンをベースとする赤血球代替物[hemog lobin−based red cell substitute (ＨＲＣＳ)]として表示するが、その理 由は、ＨＢＯＣの酸素輸送能は身体の赤血球の酸素解毒作用を付与することによ って高められるからである。生体内で安定で非毒性の特徴的な配位子結合部位と 十分な血漿半減期を有する高分子にニトロキシドを共有結合させることによって 、ニトロキシド−標識化アルブミンおよびニトロキシド−標識化イムノグロブリ ンに酸素解毒機能を付与させることができる。 さらにこの発明は、容器(container)の内部表面に共有結合させたニトロキシ ドまたは既存のＨＢＯＣと併用して毒性酸素関連化合物を患者に注入する前に捕 捉するためにフィルター中に収蔵された不溶性マトリックスに結合させたニトロ キシドを開示する。本発明によるＨＲＣＳ調製物は既存のＨＢＯＣ溶液中での超 酸化物アニオンの発生に起因する酸化的ストレスを低減させ、また、輸液におい ては血管内皮由来拡張因子(ＥＤＲＦ)であるＮＯの分解を抑制する。ＥＤＲＦの 分解が抑制されるならば、既存のＨＢＯＣ溶液を患者に注入するときに観察され る血管収縮と全身系高血圧の問題は実質的に解決される。 本発明によるＨＲＣＳ製剤とニトロキシド−標識化高分子は、ニトロキシドが「 超酸化物オキシダーゼ」として作用する反応(この反応は赤血球内で起こること が知られていない酵素類似反応である)によって毒性酸素関連種の生成を阻止す る。これらのＨＲＣＳ製剤の場合、ニトロキシドは、ヘモグロビンの自己酸化に よって生成する望ましくない超酸化物アニオンの蓄積を阻止する(前記の反応式[ Ｉ]参照)。ニトロキシドで標識したアルブミンとノムノグロブリンは抗酸化性酵 素類似体と類似の機能を発揮する(該類似体の機能は血管や間質の裂孔において は局在的に保持される)。 「超酸化物オキシダーゼ」の反応においては、超酸化物アニオンは分子性酸素に 酸化され、過酸化水素は生成しない。このような反応は、ニトロキシドの濃度が 酸素濃度よりも非常に高いような貯蔵条件を設定することによってある程度おこ なわせることができる。本明細書に記載の用法に従えば、超酸化物アニオンを最 初に生成する望ましくない酸化的カスケード反応はニトロキシドによって阻止さ れる。さらに、本明細書に記載の生理学的に適合性のあるＨＲＣＳ溶液は既存の ＨＢＯＣ溶液と比べて種々の点で優れているが、その理由は、前者を患者に注入 した後にニトロキシドが超酸化物不均化酵素やカタラーゼと類似の酵素活性を示 すからである。 生理学的に適合性のあるヘモグロビン溶液とニトロキシドを併用する好ましい 組成物には次の(１)〜(７)のものが含まれる: (１)貯蔵容器に結合させたニトロキシドまたはフィルターとして用いられる不 溶性マトリックスに共有結合させたニトロキシド、 (２)化学的または組換的架橋によって安定化されたヘモグロビンに共有結合さ せたニトロキシド、 (３)重合化ヘモグロビンに、特に２モル当量、４モル当量または８モル当量共 有結合させたニトロキシド、 (４)リポソーム内にヘモグロビンと共にカプセル化されたニトロキシドまたは リポソーム膜中に挿入されたニトロキシド、 (５)複合ヘモグロビンに共有結合されたニトロキシド、 (６)アルブミンに共有結合されたニトロキシド、および (７)イムノグロブリンに共有結合されたニトロキシド。 また、膜不透過性ニトロキシドとヘモグロビンを一緒にカプセル化することに よって調製されるＨＲＣＳも開示される。上記製剤の調製法は、既存のＨＢＯＣ の解毒および貯蔵のためのニトロキシド含有フィルターおよび容器の製法として 記載される。 ヒト血清アルブミンまたは組換えアルブミンとニトロキシドを併用する好まし い組成物には次の(１)および(２)のものが含まれる: (１)ニトロキシドで非特異的に標識化したアルブミン[例えば、ニトロキシド 対アルブミンの比が高い４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ]、 および (２)特異的な配位子結合部位においてニトロキシドで特異的に標識化したアル ブミン。 ノムノグロブリンとニトロキシドを併用する好ましい組成物には、部分抗原ま たは抗原に対して特異的なイムノグロブリンに結合した部分抗原または抗原をニ トロキシドで標識化したものが含まれる。 図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識化したo−ラフィノーズ 重合化ヘモグロビンの１日経過後(１Ａ)および３０日経過後(１Ｂ)の電子スピン 共鳴スペクトルである(ＴＥＭＰＯ:２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−１ −オキシル)。図１Ｃおよび１Ｄは、図１Ａの試料を等容量の非標識化ヘモグロ ビンで希釈した試料の１日経過後(１Ｃ)および３０日経過後(１Ｄ)の電子スピン 共鳴スペクトルである。 図２Ａおよび２Ｂは、４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯがω−アミ ノヘキシル−アガロースに共有結合したことおよび４−アミノ−ＴＥＭＰＯが１ ,４−ビス(２:３−エポシキプロポキシ)ブタンで活性化されたアガロースに共有 結合したことをそれぞれ示す電子スピン共鳴スペクトルである。 図３Ａおよび３Ｂは、３,５−ビス−ブロモシリシル−ビスフマレート(ＤＢＢ Ｆ)またはジアスピリンで架橋したヒトヘモグロビンに４−(２−ブロモアセトア ミド)−ＴＥＭＰＯおよび３−マレイミド−ＰＲＯＸＹＬがそれぞれ共有結合し たことを示す電子スピン共鳴スペクトルである。 図４Ａは４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯの電子スピン共鳴スペク トルである。図４Ｂは４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識したＨ ＢＯＣの電子スピン共鳴スペクトルである。図４Ｃはラクテート化したリンガー 液中での15ＮＤ17ＴＥＭＰＯＬの電子スピン共鳴スペクトルである(測定温度:室 温)。 図５は、ニトロキシド対Ｈbのモル比が２:１(５Ａ)、４:１(５Ｂ)または８:１ (５Ｃ)になるようにして４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識した ＨＢＯＣの電子スピン共鳴スペクトルである。装置の感度は、スペクトルの中央 ピーク(Ｍo)が同じピーク高さになるように図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃの順に 適宜低下させた。 図６は４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識化したＨＢＯＣおよ び15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬとの混合物の電子スピン共鳴スペクトルを示す。この 場合、前者の中央ピーク(下向矢印参照)と後者の高磁場ピーク(上向矢印参照)が 同じ強度になるように調整した。これは図４Ｂと４Ｃからのスペクトルの重ね合 わせである。 図７は、４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識化したＨＢＯＣの マウスにおける血漿半減期を示す。図７Ａは、図６の測定に用いた試料０．５ml をマウスの尾に注入してから約１０分後に測定したニトロキシドシグナルの電子 スピン共鳴スペクトルである。図７Ｂは、１０倍(感度)の装置で記録した図７Ａ の中央ピーク(Ｍo)のシグナル強度の経時的低下を示す(走査時間:３０分間)。図 ７Ｃは、走査終了時の図７Ｂの延長部分を示す。 図８は、４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識したＨＢＯＣ(Ｈb :８g／dl、ＴＥＭＰＯ対Ｈb＝８:１)および15ＮＤ17ＴＥＭＰＯＬ(体重３２gの マウス中に０．５ml)との混合物の血漿半減期を示す(この場合、マウスの尾にカ ニューレを挿入して注入ニトロキシドを直接測定した。注入前の試料の電子スピ ン共鳴スペクトルは図６に示す。図８Ａは０．５分間隔で測定した５種の電子ス ピン共鳴スペクトルである(磁場強度を各走査間において２ガウス増加させるこ とによってシグナル強度を時間の関数として低下させた)。図８Ｂは同じ時間間 隔で繰り返して測定した図８Ａの６種の電子スピン共鳴スペクトルの延長部分で ある(この場合、磁場強度は各走査間において２ガウス低下させた)。 図９Ａおよび９Ｂは、４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識し、o−ラフィノーズで 架橋し、さらに重合させたヒトヘモグロビンおよび３−マレイミド−ＰＲＯＸＹ Ｌで標識したＤＢＢＦ／グルタルデヒドで重合させたヘモグロビンの電子スピン 共鳴スペクトルをそれぞれ示す。 図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、３−ＤＯＸＹＬ−コレスタン(Ａ)、１６− ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸(Ｂ)および３−ＤＯＸＹＬ−コレスタンと１６−ＤＯ ＸＹＬ−スアアレート(Ｃ)をそれそれ含有するリポソームでカプセル化したヒト ヘモグロビンの電子スピン共鳴スペクトルを示す。 図１１は４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識すると共にデキストランと複合化させ たニトロキシド−標識化ヘモグロビンの電子スピン共鳴スペクトルである。 図１２は、ニトロキシドと結合し、ヘモグロビン含有溶液を通過させることの できる固体状マトリックスを有するフィルターカートリッジの一態様を示す。 産業上の利用性 本明細書においては、「ヘモグロビン」という用語は、特に言及しない限り、オ キシヘモグロビン、カルボキシヘモグロビン、カルボンモノキシヘモグロビンお よびデオキシヘモグロビンを示すために一般的に用いる。本発明において用いる ヘモグロビンはヒトヘモグロビン、組換えヘモグロビンまたは動物ヘモグロビン であってもよく、既知の方法によって入手して精製される。ヘモグロビンは、ヘ モグロビンの架橋誘導体とアルデヒド基との反応によってピリドキサール−５’ −ホスフェートまたは開環アデノシントリホスフェート(o−ＡＴＰ)のピリドキ サール基と共有結合させてもよい。この種の架橋誘導体には次の多官能性、ヘテ ロ二官能性またはホモ二官能性の架橋剤で架橋したヘモグロビンおよび重合化ヘ モグロビンが含まれる:ジアルデヒド、ポリアルデヒド、ジエポキシド、ポリエ ポキシド、活性化したポリカルボキシル基またはジカルボキシル基(例えば、３, ５−ビス−ブロモシリシル基)を有するビスフマレート、ＴＥＭＰＯサクシネー トまたはＴＯＰＳ(米国特許第４,２４０,７９７号明細書参照)シクロデキストラ ンおよびこれらのアニオン誘導体(例えばスルフェート)。本発明において用いる ヘモグロビン溶液は全て生理学的に適合性のあるものである。このようなヘモグ ロビン溶液は発熱物質、内毒素およびその他の汚染物の混入を防止するために無 細胞である。 本明細書で用いる「ニトロキシド」という用語は、安定なニトロキシド遊離基 、これらの前駆体およびこれらの誘導体(酸素原子がヒドロキシル基で置換され てハロゲン化水素の形態で存在する対応するヒドロキシルアミン誘導体を含む) を意味する。本発明の目的に対しては塩化物塩形態のヒドロキシルアミン誘導体 が好ましい。 本明細書に記載のニトロキシドにおいては、ニトロキシドの不対電子はある程 度安定であるが、これは、強い電子供与体で置換された２個の炭素原子に窒素原 子核が結合しているからである。Ｎ−Ｏ結合の酸素原子上の部分負電荷により、 隣接する２個の炭素原子は窒素原子核上の不対電子を共同して局在化させる。 ニトロキシドはヘテロ環構造または鎖状構造を有していてもよいが、基本的な 特徴は安定な遊離基である。化学構造的には、次式で表されるニトロキシドが好 ましい(式中、Ｒ1〜Ｒ4は電子供与体を示し、Ａはヘテロ環の残余員を示す): これらのヘテロ環構造において、Ａは５員ヘテロ環(ピロリジニルまたは二重 結合を１個有するＰＲＯＸＹＬ、即ちピロリン)または６員ヘテロ環(ピペリジニ ルまたはＴＥＭＰＯ)の残余炭素原子を示し、このうちの１個の炭素原子は酸素 原子で置換されていてもよく(オキサゾリニルまたはＤＯＸＹＬ)、水素原子は１ 個または２個の臭素原子で置換されていてもよい。このようなヘテロ環構造にお いては、安定な同位体(例えば、Ｎ15、重水素等)を利用してもよい。α−炭素原 子での置換は、不対電子がπp軌道配置に実質的に維持されるようにすべきであ る。Ｒ1〜Ｒ4は直鎖状または分枝鎖状のアルキル基またはアリール基を示すが、 好ましくはメチル基またはエチル基を示す。いずれのニトロキシドのα−炭素原 子上の置換基は安定性を増大させる強い電子供与体にすべきであり、メチル基ま たはエチル基が好ましいが、より長い炭素鎖を有する置換基であってもよく、実 際上は、ステアリル基を用いて実用的で経済的なニトロキシド化合物の範囲を限 定してもよい。本発明に用いる好ましいニトロキシドには次の構造を有するもの が含まれる: 上記の説明から明らかなように、最も適当なニトロキシド化合物は基本的には 次の構造式で表示してもよい(但し、Ｒは遊離基の安定性を保持する立体配置か ら選択される): 本発明に用いることのできるニトロキシドは種々の構造を有する。何故ならば 、ニトロキシドに要求される特性は、ＨＲＣＳ中での超酸化物アニオンのカスケ ード反応過程において実質的に消費されることなく超酸化物オキシダーゼ、超酸 化物不均化酵素またはカタラーゼと類似の活性を示す特性だからである。本発明 においては広範囲のニトロキシドを用いてもよいが、ＨＲＣＳ中の酸素毒性を低 減させるのに必要な最小濃度において生理学的に許容されるものでなければなら ない。有効なものを評価するに際しては、ニトロキシドは毒性が比較的低いため に、ＮＭＲ画像における造影剤として推奨されていることに注目すべきである( 米国特許第４,８３４,９６４号、同第４,８６３,７１７号および同第５,１０４, ６４１号各明細書参照)。 ヘモグロビンを生理学的に適合するように単離精製する方法は当業者には多数 知られている。一般的には、精製ヘモグロビン組成物は全タンパク質の少なくと も９９重量％のヘモグロビンを含んでおり、また、全リン脂質、ホスファチジル セリンまたはホスファチジルエタノールアミン、および不活性ヘム色素の含有量 はそれぞれ約３ug／ml以下、１ug／ml以下および６％以下である。本発明におい て有用な精製ヘモグロビン溶液は種々の常套法によって調製することができる。 このような調製法としては、特に限定的ではないが、下記の文献に記載の方法が 例示される: チャン(Ｃheung)ら、Ａnal．Ｂiochem．第１３７巻、第４８１頁〜第４８４頁 (１９８４年);ド・ベヌト(Ｄe Ｖenuto)ら、Ｊ．Ｌab．Ｃlin．fled．第８９巻 、第５０９頁〜第５１６頁(１９７７年);リー(Ｌee)ら、血液代替物に関する第 ６回国際シンポジウムのアブストラクトＨ５１ (サンディエゴ、カリホルニア、 １９９３年３月１７日〜２０日)。 本発明に用いる精製ヘモグロビン溶液は実質的に酸素を含有しない。溶液中の ヘモグロビンは、ヘモグロビンから酸素を放出させてこれを実質的な脱酸素状態 に維持する化学的還元剤と混合させることによって脱酸素化処理してもよい。ヘ モグロビン溶液を脱酸素化する好ましい方法は、ヘモグロビン溶液を実質的に酸 素を含有しない不活性ガス、例えば窒素ガスまたは一酸化炭素等と接触させるこ とによってヘモグロビンに結合している酸素を除去し、溶液中のヘモグロビンを 酸素を含まないデオキシヘモグロビンまたはカルボンモノキシヘモグロビンに変 換させる方法である。あるいは、ヘモグロビンを、酸素に透過させるがヘモグロ ビンは透過させない膜を用いて真空下またはガス中で処理してもよい。例えば、 ヘモグロビン溶液を、酸素は通過させるがヘモグロビンは通過させない膜であっ て該膜に沿ってヘモグロビンが流動するような膜を有する拡散セルを通過させて もよい。不活性ガスを、ヘモグロビン溶液とは反対側の膜壁に沿って循環させる ことによって酸素を除去し、溶液中のヘモグロビンを脱酸素化状態に変換する。 好ましくは、ニトロキシド−標識化、架橋、重合化または複合化の過程中はデオ キシヘモグロビンを実質的に酸素を含まない環境下に保持する。 ヘモグロビンから結合酸素を除去した後、ニトロキシドをヘモグロビンに共有 結合させる。単一のヘモグロビン分子に対して、通常は少なくとも１(好ましく は１以上)のニトロキシドを共有結合させる。ニトロキシドは、ヘモグロビン分 子上の次の(a)〜(c)を含むいくつかの部位のいずれに共有結合させてもよい: (a)例えばβ−９３部位の１または複数の遊離のスルフヒドロ基(−ＳＨ)、 (b)例えばβ−鎖のＶal−１および／またはβ−鎖のリシン−８２および／ま たはα−鎖のリシン−９９に位置するＤＰＧ部位のいずれかの反応性アミノ 基(−ＮＨ2)、および (c)不特定のいずれかの表面アミノ基(−ＮＨ2)またはカルボキシル基(−ＣＯ ＯＨ)。 ニトロキシドは、ヘモグロビンの架橋または重合化に用いる一価または多価架 橋剤の残余のアルデヒド基、エポキシ基または活性化カルボキシル基に結合させ てもよく、あるいは、ヘモグロビンの複合化剤、例えばデキストラン(Ｄx)、ヒ ドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)またはポリオキシエチレン(ＰＯＥ)のいずれか の残余反応性基に結合させてもよい。 前記の反応式[１]に示すように、ＨＢＯＣ溶液中のヘモグロビンは貯蔵中に酸 素によってゆっくりと自己酸化されてメトヘモグロビンと超酸化物アニオンを生 成する。しかしながら、本発明によるＨＲＣＳの貯蔵中においては、生成する超 酸化物アニオンはニトロキシドをヒドロキシルアミン誘導体に還元し、超酸化物 アニオンは酸化されて分子性酸素になる(次の反応式[４]参照)。 反応式[４]に示す超酸化物アニオンから分子性酸素への変換によって、超酸化 物アニオンの蓄積とその後の過酸化水素の生成は防止される。この活性(本明細 書では「超酸化物オキシダーゼ活性」という)は、組成物中の酸素の初期含有量が 最小に維持され、組成物が実質的に酸素を含まない環境下で貯蔵され、さらにニ トロキシドの濃度が超酸化物アニオンと過酸化水素の生成を阻止するのに十分高 いときに最も高くなる。従って、ＨＲＣＳは実質的に酸素を含まない容器内に貯 蔵するのが好ましい。 酸素を含まない環境下での溶液の貯蔵を可能にする容器系は周知である。何故 ならば、酸素の影響を受けやすい非ヘモグロビンをベースとする多くの静脈注射 液がこの種の容器系に収容されているからである。例えば、充填と封止過程中に 酸素を除去したガラス容器を用いてもよい。また、酸素を遮断するオーバーラッ プで封止してもよい可撓性プラスチック容器も利用である。基本的には、溶液中 のヘモグロビンと酸素との相互作用を防止するいずれの容器を用いてもよい。 ニトロキシドの超酸化物オキシダーゼ活性を例証するために、ニトロキシドで 標識したヘモグロビンの溶液の試料を高い酸化的条件下で貯蔵し、ニトロキシド のレドックス状態を電子スピン共鳴分光法によって経時的に調べた。例えば、４ −アミド−ＴＥＭＰＯで標識したo−ラフィノーズ−重合化ヘモグロビン溶液を 封止ガラス容器内において酸素化状態で貯蔵した(図１Ａ参照)。このような状態 では、溶液中での超酸化物アニオンとメトヘモグロビンの生成速度は十分に速い ので、ヒドロキシルアミン誘導体へのニトロキシドの変換反応は都合よく追跡す ることができる(反応式[４]並びに図１Ａおよび図１Ｂ参照)。反応式[４]に示す ように、反磁性ヒドロキシル誘導体へのニトロキシドの変換反応には、超酸化物 アニオンの分子性酸素への変換を伴う。このような変換を裏付ける実験的証拠を 図１Ａおよび図１Ｂに示す。ヘモグロビンに共有結合したＴＥＭＰＯの電子スピ ン共鳴スペクトル(図１Ａ参照)は該ニトロキシドがその反磁性誘導体に変換され たことを示すが、試料を４℃で３０日間貯蔵した後ではその共鳴ピークは完全に 消失する(図１Ｂ参照)。ニトロキシドはヘモグロビンの存在下でそのヒドロキシ ルアミン誘導体に変換されると、超酸化物オキシダーゼと類似の活性を示す。 ＨＢＯＣ溶液中でのニトロキシドの超酸化物不均化酵素活性は、ヒドロキシル アミン誘導体のニトロキシドへの変換を示すことによって例証される[反応式[４ ]および[５]参照)。図１Ａおよび１Ｂに示す実験条件下でニトロキシドはヒドロ キシルアミンに完全に変換されることを考慮するならば(反応式[４]参照)、より 多くの超酸化物アニオンを単に供給するだけでニトロキシドを再生することがで きる(反応式[５]参照)。この反応機構を例証するために、図１Ａの試料を等容量 の未標識ヘモグロビンを用いて希釈することによって、ニトロキシドに対するヘ モグロビン(従って超酸化物アニオン)の相対濃度を高めた。図１Ａと１Ｃの比較 から明らかなように、ニトロキシドのシグナル強度はこの希釈効果によって約５ ０％低下する。他方、試料を４℃で３０日間低温貯蔵した後では、ニトロキシド は反応式[５]から予測されるように、部分的に再生された(図１Ｄ参照)。この実 験結果は、ヒドロキシルアミン誘導体のニトロキシドへの再変換には超酸化物ア ニオンからの過酸化水素の生成が伴うということに一致する。 反応式[４]と[５]は次の反応式にまとめられる: ２・Ｏ2 - ＋ ２Ｈ ------〉 Ｏ2 ＋ Ｈ2Ｏ2 この反応式から明らかなように、ニトロキシドはＨＢＯＣ溶液中においては、 低分子量の金属不含ＳＯＤ類似体として作用する。電子スピン共鳴スペクトルに よるニトロキシドの検出(図１Ｄ参照)は、超酸化物アニオンと下記のヒドロキシ ルアミンとの反応によって下記のニトロキシドと過酸化水素が生成することに一 致する: 最近、オキソアンモニウムカチオンが、ニトロキシドを触媒とする超酸化物の 不均化反応において中間体として含まれるということが報告されている[クリシ ュ ナ(Ｋrishna)ら、Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、第８９巻、第５５３７頁 〜第５５４１頁(１９９２年)参照]。 ヘモグロビン分子あたりのニトロキシド分子の数は約１〜４０であるが、特異 的標識化の場合は約２が最も好ましい。しかしながら、薬物動態学、毒物学およ び免疫学の観点からはニトロキシド−ヘモグロビンの比は最小にすべきである。 例えば、３−マレイミド−ＰＲＯＸＹＬのようなニトロキシドは、エタノールを キャリヤー溶媒とする１００mＭニトロキシド溶液をまず調製することによって 、溶液中のヘモグロビンに共有結合させる。ヘモグロビンに対して２モル当量の ニトロキシドを、ＤＣＬ−Ｈbを８g／dl含有するラクテート化したリンガー液に 撹拌下で直接添加した。反応混合物を撹拌下で２２℃で反応させることによって ニトロキシドの９０％以上をＤＣＬ−Ｈbに共有結合させた(反応時間は通常１時 間以内である)。未反応のニトロキシドは、３０,０００ダルトンの分子量カット オフ値を有する十字流膜濾過系に用い、１０容量のラクテート化リンガー液で３ 回洗浄することによって除去した。ヘモグロビンの濃度を７〜１４g／dlに調整 した試料を濾過滅菌処理に付した後、４℃で貯蔵した。注入後、ＨＲＣＳが完全 に酸素化されると、ニトロキシドはまずＳＯＤ類似体として作用し、次にカタラ ーゼ類似体として作用することが期待される。ニトロキシドはＳＯＤ類似体とし て超酸化物アニオンを過酸化水素に不均化させ(反応式[２]参照)、その結果とし て、内皮でのＮＯの分解を阻止して血管収縮を防止する。ニトロキシドはカタラ ーゼ類似体として過酸化水素を無害の水に変換させることによって、過酸化水素 の毒性を防止する(反応式[３]参照)。 前述のように、ヘモグロビン分子自体の協同的酸素結合特性を研究するために ニトロキシドをヘモグロビンに共有結合させた報告はある。しかしながら、安定 化、即ち、架橋、重合化、カプセル化または複合化した生理学的に適合性のある ヘモグロビン溶液とニトロキシドを併用した例はない。ヘモグロビンとニトロキ シドの既知の化学によれば次のことが提案されている。即ち、化学的方法または 組換え技術によって架橋されたヘモグロビンのニトロキシド−標識化は、ヘモグ ロビン分子の安定化、重合化または複合化に用いられる特定の化合物によってブ ロックされていないヘモグロビン分子上の有効部位を選択することによっておこ なうことが可能である。以下に説明するヘモグロビンの特定の安定化および重合 化された形態のものは現在のところ臨床試験において用いられているので、これ らの安定化および重合化されたヘモグロビンをベースとする酸素キャリヤーへの ニトロキシドの結合については後述の第二、第三および第五の好ましい態様にお いて説明するが、これらの態様は本発明の酸素解毒作用が既存のヘモグロビン溶 液に適用できることを例証するものである。 本明細書においてニトロキシドＨＢＯＣの場合について説明するニトロキシド −標識化法は、有用な抗酸化性酵素類似活性を有する他のニトロキシド標識化高 分子、例えばニトロキシド−標識化血清アルブミンおよびニトロキシド−標識化 イムノグロブリンの製造にも容易に適用できる。この方法によりニトロキシドで 容易に標識できる血清アルブミンの形態は通常のアルブミンモノマー、アルブミ ンホモダイマー、アルブミンオリゴマーおよびアルブミン凝集体(ミクロスフェ ア)である。 ニトロキシドで標識したヘモグロビンおよび本明細書に記載の他の適当な高分 子の抗酸化性酵素類似効果は、抗酸化性触媒作用が有効な医学やその他の分野に おいても有用である。 発明の実施の態様 １．第一の好ましい態様…ニトロキシドで標識したＨＢＯＣ用容器およびフィ ルター 本発明の酸素解毒作用は既存のＨＢＯＣ溶液に適用できるが、この場合、該溶 液中のヘモグロビンを化学的に変性させる必要はない。ＨＢＯＣを貯蔵する容器 の内部表面にニトロキシドを共有結合させることにより、既存の製剤を用いた場 合に観察される酸素毒性に起因する生理学的悪影響を低減させることができる。 本発明に係るヘモグロビン含有溶液用容器は静脈注射液用容器と同様の生理学 的に適合性のある特性を有するものである。一般的には該容器の材質はガラスま たは生体適合性のあるプラスチックが適している。ヘモグロビン含有溶液を容器 に一定時間収容する態様の場合、該容器は酸素を含んでおらず、また、酸素を遮 断するために封止できるものでなければならない。ガラス容器の場合、常套の栓 や封止手段で十分である。しかしながら、現在利用し得る可撓性プラスチック容 器は酸素透過性であるので、この場合は、金属箔オーバーラップまたはその他の 封止手段を用いて溶液中のヘモグロビンが酸素と接触するのを防止すればよい。 容器の内部表面にニトロキシドを適用するには、ニトロキシドポリマーまたは ニトロキシドをドープしたコポリマーの非浸出性層を該表面上に直接形成させれ ばよい。ニトロキシド含有ポリマーは、遊離基の安定性が重合過程中に維持され るような一般的に知られている多数の重合法によって製造できる。 また、ＨＢＯＣ容器の内部表面を、ニトロキシドと結合し得る基、例えば、ニ トロキシドのケトン基もしくはアルデヒド基と反応して安定なヒドラゾン誘導体 を形成する親水性ヒドラジド基等を有する物質の被覆層を有するように変性させ てもよい。この被覆反応は簡単におこなうことができる。例えば、ニトロキシド を酢酸塩緩衝液(pＨ５.０)に加えた溶液(１００mＭ)をヒドラジドで活性化させ たプラスチック容器に加えることによってヒドラゾン結合の形成を促進させれば よい。 容器が調製されたならば、生理学的に適合性のある溶液を加える。この溶液は 安定化された精製ＨＢＯＣまたは本発明によるＨＲＣＳであってもよいが、該溶 液は、ヘモグロビンと共に注入するのが望ましい静脈注射用のいずれかのコロイ ド溶液またはクリスタロイド溶液を含有していてもよい。この溶液は実質的に酸 素を含有しない環境下に維持する。 容器の内部表面の処理のほかに、ルアーロック式の入口と出口を有するフィル ター型のカートリッジであって、ニトロキシドが固定化されたゲル状または固体 状マトリックスを保有するカートリッジを用いることによって、ヘモグロビン溶 液が該カートリッジを通過する間に反応性酸素に由来する反応性種を除去しても よい。これらの処理によって、ニトロキシドはＨＢＯＣが通過する軟質または硬 質のゲルマトリックスに結合し、実質的に注入前の滅菌並列フィルターとしての 作用をする。ニトロキシドのような小さな配位子を硬質マトリックスに結合させ る方法は、ガラス表面やプラスチック表面を化学的に変性させる方法が多数知ら れているように、アフィニティークロマトグラフィーの分野において多数知られ ている。滅菌溶液と適合性のあるマトリックスとしては種々のタイプのもの、例 えばアガロースゲル、ポリスルホンをベースとする材料およびラテックス等が知 られている。 フィルターカートリッジの場合、固体状マトリックスをニトロキシドと共有結 合させてフィルターハウジングまたは類似の装置内に入れ、該装置内をヘモグロ ビン溶液を流通させることによって、患者に注入中の該溶液とニトロキシドを接 触させることができる。実用的には一般的に入手し得る活性化アガロースゲルを マトリックスとして使用し、該ゲルを滅菌ルアーロック式カートリッジ内に収容 する。このカートリッジはヘモグロビン含有溶液の注入に際して液体投与ライン 中に挿入される。実際は、ニトロキシドが存在してヘモグロビンが通過するフィ ルターハウジングを有する構造体としては既知の種々の構造体が利用できる。図 １２の場合、ハウジング(１)はニトロキシドで標識したアガロースゲル、例えば 、４−ブロモアセトアミド−ＴＥＭＰＯで標識したω−アミノヘキシルアガロー ス(図２Ａ参照)および４−アミノ−ＴＥＭＰＯを結合させた１,４−ビス(２,３ −エポキシプロポキシ)ブタンアガロース(図２Ｂ参照)等を保有する。 注入に際しては、ヘモグロビン溶液を保有する静脈用注入ラインをルアー入口 (２)と接続させてハウジング(１)内へ該溶液を導入させ、該溶液をハウジング内 でマトリックス（４）と結合したニトロキシドと接触させることによって毒性酸 素関連種を除去する。ヘモグロビン溶液はルアー出口(３)を通してカートリッジ から流出させた後、患者に直接注入する。４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識したエ ポキシアガロースの電子スピン共鳴スペクトルを図２Ａに示す。あるいは、ω− ア ミノヘキシル−アガロースを４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯと反応 させることによってＴＥＭＰＯで標識したアガロースを調製してもよく、該アガ ロースの電子スピン共鳴スペクトルを図２Ｂに示す。あるいは、カルボジイミド を用いて４−カルボキシル−ＴＥＭＰＯをアミドアガロースにカルボアミド結合 を介して結合させてもよい。逆に、カルボジイミド、例えば、１−エチル−３− (３−ジメチルアミノープロピル)カルボジイミドを用いて４−アミド−ＴＥＭＰ Ｏをアガロースゲルのカルボキシル基と容易結合させることができる。 ４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識したカートリッジを次の様にして調製した。即 ち、ラクテート化リンガー液に４−アミノ−ＴＥＭＰＯ[シグマ化学社(Ｓigma Ｃhem．Ｃo．)製]を１００mＭの濃度で加えた溶液をアルデヒド・アビド・クロ ム・カートリッジ[ユニシン・テクノロジー社(Ｕnisyn Ｔech．Ｉnc．)製]中を 室温で１時間循環させた後、ナトリウムシアノボーロハイドライドを用いる還元 処理を６時間おこない、次いでカートリッジのハウジングの内部をラクテート化 リンガー液を用いて充分に洗浄した。 ３−アミノ−ＰＲＯＸＹＬで標識したカートリッジは、前記の手順に準拠し、 ４−アミノ−ＴＥＭＰＯの代りに３−アミノ−ＰＲＯＸＹＬを用いることによっ て調製することができる。 II．第二の好ましい態様・・・ニトロキシドで標識した安定化ヘモグロビン ヘモグロビンの構成サブユニットへの解離を防止するために、化学的方法また は組換え技術によって該サブユニットの架橋によってヘモグロビンを分子内的に 安定化させる。ここで用いる安定化ヘモグロビンは、化学的方法または組換え技 術によって安定化されたヘモグロビンモノマーのほかに、個々のヘモグロビン分 子がシクロデキストランまたはそのスルフェート化誘導体を用いて架橋されたダ イマー、トリマーおよびより高位のオリゴマーを意味する。 ニトロキシドを安定化ヘモグロビンに結合させる好ましい方法と最良の態様は 、安定化ヘモグロビンの２本のβ鎖のβ−９３スルフヒドリル基にニトロキシド を共有結合させることである。β−９３部位の特異的標識化は自然のヒトヘモグ ロ ビンの立体配置研究に関して報告されているが[マッコネル(ＭcＣonnell)ら、Ｑ uart．Ｒev．Ｂiophys．、第３巻、第９１頁(１９７０年)参照]、架橋されたヘ モグロビンについてのこの種の標識化は報告されていない。前述のように、いく つかのタイプのヘモグロビンをベースとした酵素キャリヤー、即ち、ＤＢＢＦで 化学的に架橋されたもの、ジアスピリン架橋ヘモグロビンおよびo−ラフィノー ズで安定化されてオリゴマー化されたヘモグロビンが開発されている。 本件出願人による米国特許第４,８５７,６３６号明細書に記載の糖開環により 、二糖類、オリゴ糖類、好ましくはo−ラフィノーズのような三糖類から誘導さ れる多価アルデヒドが得られる。これらの化合物は分子内安定化(架橋)と分子間 重合化の２つの作用をする。該特許明細書に記載の反応を調整することにより、 重合を伴うことなく前記のような安定化ヘモグロビンを製造するのに多価アルデ ヒドを用いてもよい。別の場合には、安定化ヘモグロビンまたは重合化ヘモグロ ビンにニトロキシドを共有結合させてもよい。従って、多価アルデヒドを用いて 安定化されたヘモグロビンをベースとする溶液は、この態様においては安定化ヘ モグロビンとして取扱い、次の態様においては重合化ヘモグロビンとして取扱う 。 化学的に変性したヘモグロビンのβ−９３部位がニトロキシドの結合に対して 立体的に接近し難い部位でないことを例証するために、ＤＢＢＦ−Ｈbのβ−９ ３部位にニトロキシドが共有結合できることを裏付けるデータを示す。 この態様では、ＤＢＢＦ−Ｈbを、２つのタイプのスルフヒドロ基に特異的な 官能基と以下の構造式を有する２種のタイプのニトロキシド、即ちＴＥＭＰＯと ＰＲＯＸＹＬと反応させる: ＤＢＢＦ−Ｈbは、溶液中の精製した脱酸素化ヘモグロビンを既知の方法によ りビス(３,５−ジブロモサリシル)フマレートを用いて架橋させ、得られた生成 物をカラムクロマトグラフィーによって精製することによって調製される。３− マレイミド(２,２,５,５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル)[３−マレイ ミド−ＰＲＯＸＹＬ]による共有結合は、メタノールをキャリヤー溶媒とする約 １００mＭの溶液に調製した２モル当量の該ニトロキシドを、ラクテート化リン ガー液にＤＢＢＦ−Ｈbを約８g／dlの濃度で加えた溶液に添加し、２２〜２３℃ で攪拌しながら約３０分間反応させることによっておこなう。架橋度は、未反応 ニトロキシドの電子スピン共鳴スペクトルのシグナル強度の低下率から評価する 。未反応のニトロキシドを除去するために、反応混合物を１０容量過剰のラクテ ート化リンガー液を用いて３回洗浄した。この洗浄処理には、３０キロダルトン の見掛けの分子量限界(ＮＭＷＬ)カットオフ値を有するポリエチレンスルホン( ＰＥＳ)膜を備えたフィルトロン攪拌セル[フィルトロン・テクノロジー社(Ｆilt ron Ｔechnology Ｃo．)製]を使用した。ニトロキシド−標識化ヘモグロビン の電子スピン共鳴スペクトルの測定はブルーカー(Bruker)ＥＳＲスペクトロメー ターを用いておこなった。４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識し たＤＢＢＦ−Ｈbの電子スピン共鳴スペクトルを図３Ａに示す。３−マレイミド −ＰＲＯＸＹＬを用いて同様にして標識化したＤＢＢＦ−Ｈbの電子スピン共鳴 スペクトルを図３Ｂに示す。 この態様の場合、ニトロキシドは、ヘモグロビンの２本のβ−グロビン鎖上の 孤立スルフヒドロ基と共有結合する。従って、ヘモグロビンの２本のβ−グロビ ン鎖に結合したニトロキシドは２個あるので、９９.００％の脱酸素ヘモグロビ ンにおけるニトロキシド対ヘモグロビン結合酸素の比は約２００対１である。し かしながら、注入後は、脱酸素化ＨＲＣＳは肺臓内で酸素と結合するのでニトロ キシド対ヘモグロビン結合酸素の比は１００％の酸素化において約１対２になる が、これは、β−グロビン鎖上に残存する２個のニトロキシドを有するヘモグロ ビンの４本のグロビン鎖に４個の酸素分子が結合するからである。 ヘモグロビン対ニトロキシドの比を１:２にすることにより、９０％以上のニ トロキシドをＤＢＢＦ−Ｈbに共有結合させることができる。ＤＢＢＦ−Ｈbは、 図３Ｂと類似の共鳴スペクトルを示すＰＲＯＸＹＬ部分(即ち、３−マレイミド メチル−ＰＲＯＸＹＬ)とマレイミドの間のスペーサー基を用いて共有結合的に 標識してもよい。注意すべきことは、他のニトロキシドをＤＰＧ結合部位(例え ば、β−Ｖal−１、β−Ｌys−８２およびα−Ｌys−９９等)の特異的アミノ基 に共有結合させてもよく、あるいはヘモグロビン上の残存する４０−プラス表面 リシンε−アミノ基に結合させてもよいことである。ＴＥＭＰＯおよびＰＲＯＸ ＹＬのイソチオシアネート誘導体もアミノ基と反応性がある。例えば、４−イソ チオシアネート−ＴＥＭＰＯは約１０:１のモル比でヘモグロビンに添加しても よい。別の部位においてこのニトロキシドで標識したヘモグロビンの共鳴スペク トル(図示せず)は図３Ａと類似する。 ＤＢＢＦ−Ｈbのいくつかの部位にニトロキシドが結合できるので、α−グロ ビンダイマーで安定化させた組換えヘモグロビン[ルッカー(Ｄ．Ｌooker)ら、ネ イチャー、第３５６巻、第２５８頁(１９９２年)参照]もニトロキシドを用いて 同様にして標識できる。また、ニトロキシド−標識化架橋剤、例えば、ＴＥＭＰ Ｏ−標識化スクシネート(米国特許第４,２４０,７９７号明細書参照)のＤＢＢＦ 類似体を調製することも可能である。 図４は、(Ａ)２−(ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ、(Ｂ)２−(ブロモアセ トアミド)−ＴＥＭＰＯ−標識化ＨＢＯＣまたは(Ｃ)15ＮＤ17ＴＥＭＰＯＬ(ＴＥ ＭＰＯＬ:４−ヒドロキシ−２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ ル)をラクテート化リンガー液に加えた溶液のＥＳＲスペクトルである(測定温度 :室温)。図４Ａと４Ｂの相違は、低分子量ニトロキシドの移動度とヘモグロビン のような高分子に共有結合したニトロキシドの移動度の違いによる。図４Ｃは、 核スピンが１／２の安定な同位体窒素15Ｎは２つの共鳴ピークを与えるが、核ス ピンが１の天然の同位体窒素14Ｎは３つの共鳴ピークを与えることを示す[図４ Ａと図４Ｃ参照]、これらの一連の実験においては、これらのピークの分離を利 用することによって酵素類似体および低分子量または高分子量ニトロキシドの生 体内または生体外での酸素／還元反応が例証される。 ヘモグロビンに対して異なったモル比のニトロキシドを用いて標識したＨＢＯ Ｃを以下のようにして調製した。２モル当量、４モル当量または８モル当量の４ −(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯを固体粉末として清浄フード内の３個 の別々の１５mlバキュテイナー(Ｖacutainer)内へ直接添加した。ゴム隔壁を置 換えた後、４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯをクロロボルム２０μl に溶解させた。バキュテイナーはゴム隔壁を通した２７ゲージの針を介して高真 空系(５mmＨg)に接続し、次いで、バキュテイナーの下半分を被覆する４−(２− ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯの皮膜からクロロホルムを除去した。適量の ＨＢＯＣをゴム隔壁を通した滅菌注入器を用いて導入した後、反応は室温で１／ ２時間にわたり約５分間隔で渦状に断続的に攪拌しながらおこなった(ヘモグロ ビンに対して４モル比または８モル比のニトロキシドを用いた場合には、未溶解 の固体があった)。次いで、バキュテイナーを４℃の冷蔵庫内で一夜放置した。 翌朝、室温での渦状攪拌をさらに１／２時おこなうことによって、４−(２−ブ ロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯの全ての固体をバキュテイナーの表面から視覚 的に消失させた。 反応混合物と対照を滅菌透析管に移し、遊離の非標識４−(２−ブロモアセト アミド)−ＴＥＭＰＯのＥＳＲスグナルが検出されなくなるまでラクテート化リ ンガー液に対する透析処理をおこなった。Ｈbに対して２モル当量、４モル当量 および８モル当量の４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯで標識したＨＢ ＯＣのＥＳＲスペクトルを図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃにそれぞれ示す。 ヘモグロビンに対して２モル当量の４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰ Ｏを用いた場合のＥＳＲは、透析をおこなった場合または透析をおこなわなかっ た場合と実質的に同一であり、このことは共有結合による標識化が定量的である ことを示す。ＨＢＯＣの場合、β−グロブリン鎖上の２個のＳＨ−基は共有結合 の部位となる(このことは、Ｎ−エチルマレイミドを用いる４−(２−ブロモアセ トアミド)−ＴＥＭＰＯ標識化の選択的ブロッキングまたは逆相ＨＰＬＣによる グロブリン鎖分析によって確認できる)。注意すべきことは、モル当量が２、４ および８に対応するＥＳＲシグナル強度(ピークＭo)の比が、スペクトルをこれ らに比例して低下させた装置感度で測定したので、同じ比になっていることであ る。 さらに、より多くの４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯを、例えば生 体内での放射線防護剤としてより高いモル比でＨbに結合させることができる。 血液代替製剤におけるヘモグロビンに対するニトロキシドの好ましいモル比は 後述するように８:１である。 図６には４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ−標識化ＨＢＯＣと15Ｎ Ｄ17−ＴＥＭＰＯＬとの混合物のＥＳＲスペクトルを示す。この場合、４−(２ −ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯの中央ピーク(下向きの矢印で示す)と15Ｎ Ｄ17−ＴＥＭＰＯＬの高磁場ピーク（上向きの矢印で示す）は同じ強度に調整し た。 共鳴ピークの分離により、低分子量ニトロキシド(ＴＥＭＰＯＬ)とその高分子 複合体を含む遊離基または酵素類似体の生体外および生体内(マウスの体内)での 反応における活性を同時に追跡することができる。例えば、この２種のニトロキ シドの生体内での血漿半減期を特有のスペクトル特性によって比較した。特に、 ヘモグロビンをベースとする溶液のマウス体内でのＥＳＲによる研究をニトロキ シド対ヘモグロビンの比を８:１にすることによっておこなうことにより、高い ＥＳＲシグナル強度が得られるという利点がある(図５Ｃ参照)。最初に、低分子 量ニトロキシド(15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬ;図４Ｃ参照)および高分子量の４−(２ −ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯＬ−標識化ＨＢＯＣ(図４Ｃ参照)の大体の 血漿半減期は、この２種の試料の混合物を調製し、ＥＳＲシグナル強度がほぼ同 一になるように調整した(図６参照)。この混合物０.５mlを、加熱ランプの下で 膨張させたマウスの尾の静脈内へ麻酔をかけて注入した。このマウスの尾をＥＳ Ｒ測定装置の空洞内に入れ、試料注入から１０分以内にスペクトルを測定した( 図７Ａ参照)。 図７Ａ〜７Ｃを比較すれば明らかなように、15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬシグナル は検出されなかったが、４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ−標識化Ｈ ＢＯＣは明瞭に解像された(図７Ｂと７Ｃは血漿半減期に関するものであり、図 ７Ｃは図７Ｂの延長部分である)。ＨＢＯＣの血管収縮効果はＨＢＯＣをラット に注入してから最初の５〜１５分間に完全に発現することが報告されているので 、遊離基レドックス反応におけるニトロキシド−標識化ＨＢＯＣの作用効果は試 料をマウスに注入直後から測定した。雌のＣＨ３マウスの尾の静脈に、一酸化二 窒素(８０％)、酸素(２０％)およびイソフルオラン(３％)で麻酔をかけた状態で カニューレを挿入した。加熱ランプの下で視覚的に膨張したマウスの尾の静脈内 に、長さ１フィートのポリエチレンチューブに装着した皮下注射用針(３０ゲー ジ)から成るカニューレを挿入し、これをシアノアクリレート接着剤で固定した 。生体内でのＥＳＲ測定のために、カニューレを挿入したマウスを麻酔をかけた 状態で円錐形の遠心分離管(５０ml)に移した。この場合、該遠心分離管は、その 円錐端部からマウスの尾が突出すると共に、麻酔ガスが該管の開口端から連続的 に流入するように改造した。マウスの尾をプラスチックチューブ内へ挿入し、こ れをＴＥ１０２空洞内へ適合させた。カニューレにはヘパリン(１００ユニット ／ml)を周期的に流してその開通性を保った。カニューレは尾の根元近くに位置 させると 共に、ＥＳＲ装置の空洞の外側に保持することによって尾からの純粋なシグナル を試料注入直後から測定した。試料(図８参照)０.５mlをカニューレを通して注 入し、スペクトロメーターを１／２分間の間隔で繰り返して走査できるようにセ ットした(図８Ａおよび８Ｂ参照)。図８Ａの場合、磁場は２ガウスずつ増加させ 、図８Ｂの場合は磁場を２ガウスずつ減少させることによって共鳴スペクトルを 重ね合わせた。15ＮＤ17−ＴＥＭＰＯＬシグナルは試料注入後２.５分以内に消 失した。同じ時間内に４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯＬ−標識化Ｈ ＢＯＣのシグナルは類似の速度で減少した。 しかしながら、ニトロキシド−ＨＢＯＣシグナルは血漿中では安定であった( 図８Ｂ参照)。従って、図８Ｂと図７の結果から明らかなように、ＨＢＯＣのよ うな高分子に標識化されたニトロキシドは低分子量ニトロキシド(例えば、15Ｎ Ｄ17−ＴＥＭＰＯＬ)に比べて相当長い血漿半減期を有する。 遊離基反応について観察された特性には次の２つの経路が含まれる: １．ニトロキシドからそのオキソアンモニウムカチオン中間体への遊離基(例 えば、超酸化物)酸化とその後のオキソアンモニウムカチオンからその安定なヒ ドロキシルアミン誘導体への還元を含む高速経路。この還元には血管裂孔中に存 在する１種または２種の還元性等価物(例えばＮＡＤＨ)の関与が含まれる。ニト ロキシドからそのヒドロキシルアミンへの還元によってＥＳＲシグナル強度は急 減する[モル比が８:１の４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ−標識化Ｈ ＢＯＣの場合、ＨＢＯＣ上の４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯは約２ ５％となる]。この経路には低分子ニトロキシドと高分子ニトロキシドが含まれ る。 ２．ニトロキシドが環状遊離基反応(例えば、ＳＯＤ類似反応)に含まれる反応 機構に従って、ＨＢＯＣ上に残存する７５％の４−(２−ブロモアセトアミド)− ＴＥＭＰＯによる抗酸化性酵素類似活性を示す低速経路（図８Ｂ参照）。ニトロ キシド遊離基がＳＯＤ類似体として実質的に消費されない場合には、ＥＳＲシグ ナル強度の遅い低下速度は主として前記の反応機構に起因するものであるが。二 次 的にはＨＢＯＣ濃度の減少も関係する。何故ならば、ＨＢＯＣは血管裂孔からそ の血漿半減期の関数としてゆっくりと除去されるからである。 この結果は、ニトロキシドで標識したＨＢＯＣが生体内での遊離の解毒に有用 であることを例証する。この有用性は、生体内における遊離基の短時間(分単位) の捕捉と酵素類似体として作用するニトロキシドによる酸化体反応からの長時間 (時間単位)にわたる持続的保護が得られることによって規定される。 図８のスペクトルの解析結果に基づけば、遊離状態で残存する４−(２−ブロ モアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ−標識化ＨＢＯＣの約７３％が酸化／還元(レドッ クス)サイクリング反応に含まれることになる。このことは、血管スペースの境 界内での生体内レドックス反応にＴＥＭＰＯＬが関与することを示す。 III．第三の好ましい態様・・・安定化ヘモグロビンのニトロキシド−標 識化ポリマー 架橋モノマーから安定化ヘモグロビンのダイマーを調製することは可能である が、安定化ヘモグロビンまたは自然のヘモグロビンからヘモグロビンポリマーを 調製することも可能である。ヘモグロビンポリマーの溶液はヘモグロビンのモノ マー、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高位のオリゴマーの混合物を 含有する。ＨＢＯＣとして用いる重合化ヘモグロビンを含有する溶液は一般に安 定化ヘモグロビンモノマーに比べてより長い血漿循環時間とより高い酸素輸送能 を有する。このような重合化ヘモグロビンはいくつかの重合化剤を用いる多数の 反応経路によって調製できる[米国特許第４,００１,２００号、同第４,８５７, ６３６号および同第４,８２６,８１１号各明細書参照]。重合化ヘモグロビン溶 液にニトロキシドを導入する好ましい方法は、ヘモグロビンのβ−グロビン鎖の β−９３スルフヒドリル基にニトロキシドを共有結合させる方法である。このよ うなスルフヒドリル基を安定化法または重合化法に関与させることは知られてい ない。従って、ヘモグロビンモノマーの安定化または重合化の前にニトロキシド をヘモグロビンに共有結合させるのが好ましい。 例えば、ニトロキシドを前記の第二態に記載の方法に従ってＤＢＢＦ−Ｈbに 共有結合させ、次いでセーガル(Ｓehgal)らの方法（米国特許第４,８２６,８１ １号明細書参照)に従ってグルタルデヒドを用いて重合させる。図４Ｂは、３− マレイミド−ＰＲＯＸＹＬで標識した後、グルタルデヒドで重合させたＤＢＢＦ −ＨbのＥＳＲスペクトルである。同様にして、グルタルデヒドで重合させたＤ ＢＢＦ−Ｈbを４−(２−ブロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯを用いて標識しても よい。 類似の方法により、重合化ヘモグロビン中間体、例えば、未反応アルデヒド基 を有するo−シクロデキストラン−重合化ヘモグロビン中間体、o−ラフィノーズ −重合化中間体またはグルタルデヒド−重合化中間体に４−アミノ−ＴＥＭＰＯ または３−アミノ−ＰＲＯＸＹＬを還元アミノ化によって共有結合させてニトロ キシド−標識化ヘモグロビンポリマーを調製してもよい。還元アミノ化の場合に は、反応の順序とタイミングが重要である。４−アミノ−ＴＥＭＰＯは、重合完 結後であって、重合化ヘモグロビンへのニトロキシドの共有結合をもたらす還元 反応の前にグルタルデヒド−重合化ヘモグロビンに添加する。同様に、o−ラフ ィノーズ−重合化ヘモグロビンのニトロキシドによる標識化は、還元アミノ化の 前に４−アミノ−ＴＥＭＰＯまたは４−アミノ−ＰＲＯＸＹＬを添加することに よっておこなってもよい。例えば、４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識したo−ラフ ィノーズ−重合化ヘモグロビンは本件出願人による米国特許第４,８５７,６３６ 号明細書に記載の方法によって調製される。但し、この場合には、重合の完結後 に６モル当量の４−アミノ−ＴＥＭＰＯを添加し、還元前に２０モル過剰のボラ ンジメチルアミンコンプレックスを添加する。前述のように、ヘモグロビンは二 糖類または開環糖、例えば、オリゴ糖または好ましくはo−ラフィノーズのよう な三糖類から誘導される多価アルデヒドを用いて架橋して重合してもよい。同様 に、単糖類を用いてヘモグロビンの安定化と重合化をおこなってもよいが、より 高い分子量の糖が好ましい。４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識したo−ラフィノー ズ−重合化ヘモグロビンを透析処理と洗浄処理に付した試料のＥＳＲスペクトル を図９Ａに示す。 重合化ヘモグロビンのヘモグロビンオリゴマー(Ｈbn;n＝２〜４)の収率を高め るためには、架橋剤のポリアルデヒドの原子価を高めるのが望ましい。α−シク ロデキストラン、β−シクロデキストランおよびγ−シクロデキストラン並びに ６−、７−および８−環化グルコース分子に相当するスルフェート誘導体を使用 する場合、開環α−シクロデキストラン、β−シクロデキストランおよびγ−デ キストランは反応性アルデヒド基をそれぞれ１２個、１４個および１６個有する 。これらの開環架橋剤を用いてヘモグロビンを架橋して重合させることによって オリゴマーに富む重合化ヘモグロビンを製造することができる。前述のように、 未反応のアルデヒドを利用してアミノニトロキシド、例えば４−アミノ−ＴＥＭ ＰＯまたは３−アミノ−ＰＲＯＸＹＬと共有結合させてもよい。 さらに、開環スルフェート誘導体、例えば、スルフェート化α−シクロデキス トランは次の２つの付加的な理由から有効な架橋剤である。(１)スルフェート基 はＤＰＧと類似の活性を示して架橋ヘモグロビンの酸素親和性を低下させて酸素 輸送特性を改良する。(２)スルフェート基は親和性標識として作用し、「クラス ター」を形成する多重(例えば、n＝２〜４)ヘモグロビンと複合化する。クラスタ ー複合体が形成されると、シクロデキストランのアルデヒド基はＤＰＧ結合部位 内のＮＨ2基と極めて接近するので、ヘモグロビンのサブユニット内および分子 内での共有結合的架橋が促進され、この結果、ヘモグロビンオリゴマーの収率が 増大する。抗酸化性酵素類似活性のほかに、開環シクロデキストランで重合化さ れてニトロキシドで標識されたヘモグロビンはo−ラフィノーズやグルタルデヒ ドで重合化されたヘモグロビンに比べて収率と組成の点で優れている。 IV．第四の好ましい態様・・・ニトロキシドで標識されてリポソーム でカプセル化されたヘモグロビン リポソームは両親媒性分子の凝集によって形成される粒子であって、内部の水 室と外部のバルク水に面した極性面を有する中空球状形態の二層構造を有する。 リポソームを製造するためのいくつかの利用し得る方法は当該分野においては周 知である。一般的には、ジパルミトイルホスファチジルコリンのような分子は水 溶液中でリポソームを形成する。リポソームは安定性を高めるためにコレステロ ールを用いて調製してもよく、また、中性脂質のような他の物質および正または 負に荷電した化合物のような表面改質剤を含有させてもよい。好ましいリポソー ムは小さな単一ラメラ状の二層球状殻である。 ヘモグロビンをリポソーム中にカプセル化する方法は知られている[ファルマ ー(Farmer)らによる米国特許第４,９１１,９２１号明細書参照]。この発明の目 的のためには、多数の方法を利用してニトロキシドに基づく酸素解毒作用をリポ ソームでカプセル化ヘモグロビン溶液に付与させることができる。例えば、前述 のようにして調製されるニトロキシドで標識した天然のヘモグロビンまたはニト ロキシドで標識した安定化ヘモグロビンを出発原料とし、該ニトロキシド−標識 化ヘモグロビンに既知のリポソームによるカプセル化法を適用することが可能で ある。この態様では、スピン膜イムノアッセイ用に開示されているＴＥＭＰＯ− コリンクロリドのような膜透過性ニトロキシドと共に精製ヘモグロビンをカプセ ル化してもよい[シア(Ｈsia)ら、米国特許第４,２３５,７９２号明細書参照]。 また、ニトロキシドで標識した脂肪酸(例えば、７−ＤＯＸＹＬ−ステアレー ト、１２−ＤＯＸＹＬ−ステアリン酸、１６−ＤＯＸＹＬ−ステアレート等)、 コレスタン、コレステロール類似体(例えば、３−ＤＯＸＹＬ−コレスタン等)ま たはリン脂質(例えば、１２−ＤＯＸＹＬ−ステアレートで標識したホスファチ ジルコリン等)を含むリポソームを用いて精製ヘモグロビンをカプセル化しても よい。３−ＤＯＸＹＬ−コレスタン標識物を含むリポソーム中にカプセル化した ヘモグロビン製剤はタブシ(Ｔabushi)らの文献[Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.、第１０６ 巻、第２１９頁(１９８４年)参照]に記載の方法と類似の方法によって調製して もよい。以下に説明するようなＤＯＸＹＬで標識したステアリン酸および／また はコレスタンを含む脂質組成物を含有するクロロホルム溶液５mlを窒素気流中で 溶媒を除去させて乾燥させ、残渣を真空下で乾燥させた後、得られた皮膜をラク テート化リンガー液にヘモグロビンを加えた溶液(２４g／dl)２ml中に懸濁させ た。懸濁液中の脂質の濃度は１００mＭである。リポソームでカプセル化したヘ モグロビンを回転させながら好ましくは３７℃でインキュベートし、全ての脂質 を分散させて多層状小胞を形成させた。多層リポソームでカプセル化したヘモグ ロビンを含有し、未カプセル化ヘモグロビンを含有しない溶液を、クック(Ｃook )らの方法(米国特許第４,５３３,２５４号明細書参照)に従い、マイクロフルイ ダイザー(microfluidizer)を通した。リポソーム中のジパルミトイルホスファチ ジルコリン:コレステロール:ジパルミチジルホスファチジン酸:３−ＤＯＸＹＬ −コレスタンのモル比は０.５:０.４:０.０２:０.０７である。３−ＤＯＸＹＬ −コレスタンで標識したリポソームでカプセル化したヘモグロビンのＥＳＲスペ クトルを図１０Ａに示す。この試料の立体配置においては、ニトロキシドはリポ ソーム膜中に挿入され、脂質の二層の水界面と内側と外側の表面上に存在する。 図１０Ａに示す脂質組成物中の３−ＤＯＸＹＬ−コレスタンを１６−ＤＯＸＹＬ −ステアリン酸で代替させた試料のＥＳＲスペクトルを図１０Ｂに示す。このス ペクトルから得られるニトロキシドの移動度は、ステアリン酸のＤＯＸＹＬ部分 が主として脂質の二層の疎水性内部に位置するという解釈と矛盾しない。３−Ｄ ＯＸＹＬ−コレスタンと１６−ＤＯＸＹＬ−ステアレートを同じモル比で脂質組 成物中に添加して調製したニトロキシド−標識化リポソームでカプセル化したヘ モグロビンのＥＳＲスペクトルを図１０Ｃに示す。図１０Ｃのスペクトルは図１ ０Ａと図１０Ｂのスベクトルの合成である。何故ならば、この態様においては、 ニトロキシドは膜−水界面とその疎水性脂質二層内部の両方に位置するからであ る。ニトロキシドが両方の位置に存在するこの態様によれば、脂質二層疎水性内 部と膜−水界面の両方において酸素解毒作用が発揮されるので、カプセル化され たヘモグロビンに酸素解毒能を保有させるという利点が付加的に得られる。 Ｖ．第五の好ましい態様・・・ニトロキシドで標識した複合化ヘモグロビン 生理学的に適合性のある複合化ヘモグロビン溶液は、プラズマエキスパンダー (plasma expander)としての生体適合性高分子とヘモグロビンの複合体を形成さ せることによって調製される。プラズマエキスパンダー、例えば、デキストラン (Ｄx)、ポリオキシエチレン(ＰＯＥ)およびヒドロキシルエチルスターチ(ＨＥＳ ) 等は体内でのヘモグロビンの循環半減期を長くするのに用いられる。このような 状態のヘモグロビン分子と生体適合性高分子は集合的にヘモグロビン複合体と呼 ばれる。ニトロキシドをヘモグロビン複合体に取り込む方法としては多数の簡便 な方法がある。例えば、被複合化ヘモグロビンをニトロキシドで標識したヘモグ ロビン、例えばＴＥＭＰＯ−標識化ＤＢＢＦ−Ｈbで代替させるだけでよい。こ れは、複合化ヘモグロビンの調製においてヘモグロビンまたはピリドキシル化ヘ モグロビンを３−マレイミド−ＰＲＯＸＹＬ−ＤＢＢＦ−Ｈbまたは４−(２−ブ ロモアセトアミド)−ＴＥＭＰＯ−ＤＢＢＦ−Ｈbで代替させることによっておこ なうことができる。 ４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識したデキストランとヘモグロビンとの複合体は タム(Ｔam)らの報文[Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．、第７３巻、第２１２８頁( １９７６年)参照]に記載の方法によって調製される。最初に、０.１５Ｍ ＮaＣ lと５mＭリン酸塩緩衝液(pＨ７.４)を含む８％ヘモグロビン溶液を過ヨウ素酸塩 で酸化したデキストランと複合させることによってシッフ塩基中間体を調製した 。２０モル当量の４−アミノ−ＴＥＭＰＯをヘモグロビンに付加させることによ ってニトロキシドとデキストランの残余反応性アルデヒド基との間でシッフ塩基 を形成させた。４℃でインキュベーションを３０分間おこなった後、５０モル当 量のジメチルアミンボラン水溶液を添加した。この溶液を４℃でさらに２時間イ ンキュベートし、透析処理に付した後、ラクテート化リンガー緩衝液を用いて再 調製し、次いでフィルトロン膜濾過ユニット(フィルトロンテクノロジー社製)を 用いる滅菌濾過処理に付した。４−アミノ−ＴＥＭＰＯで標識したデキストラン −ヘモグロビン複合体のＥＳＲスペクトルは、高い運動性自由度に起因するシャ ープな非対称トリプレットを示す(図１１参照)。デキストランに共有結合したＴ ＥＭＰＯの易動度の増大は、きつく折り重ねられたヘモグロビン分子に比べて柔 軟なデキストラン鎖にニトロキシドが結合したことに対応する(図３Ａおよび３ Ｂ参照)。従って、図１１のスペクトルは、ニトロキシドで標識されたデキスト ランとヘモグロビンとの新規複合体が形成されたことを示す。 VI．第六の好ましい態様・・・ニトロキシド−標識化アルブミンの酵素 類似活性 前述のように、ニトロキシド(例えば、ＴＥＭＰＯＬ)は、超酸化物を過酸化水 素に不均化させる金属酵素であるＳＯＤと類似の触媒活性を示す。さらに、生体 系においては、ニトロキシドはペルオキシダーゼとシュードペルオキシダーゼと 相互作用して、過酸化水素を酸素に変換させる酵素であるカタラーゼと類似の活 性を発揮する。ニトロキシドの生物学的効果には、酸化的ストレスを減少させる ことによって反応性酸素種の細胞毒性からの保護に寄与することが含まれる。例 えば、ニトロキシドは生体内および生体外における電離放射線による損傷から保 護する。従って、ニトロキシドを生体に投与すると、複雑な抗酸化性酵素類活性 を発揮する。 ＴＥＭＰＯＬは静脈内に注入されると、非常に短い血漿半減期を示す。ＴＥＭ ＰＯＬはその分子サイズと電荷特性に起因して、血管スペースから容易に放出さ れる。しかしながら、ＨＢＯＣまたはＨＲＣＳ以外の特定の医学的用途の場合、 血管スペース内に残存する抗酸化性酵素類似体を用いるのが望ましいこともある 。これは、ヘモグロビン以外の高分子であって、生物学的に安全で望ましい血漿 半減期を有する高分子にニトロキシド化合物を結合させることによって達成され る。このような望ましい高分子の一例としてはヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)が挙 げられる。 血清アルブミンは多重配位子−結合部位を有する血漿タンパク質であり、血中 の多くの配位子に対する運搬体タンパク質である。ニトロキシドはヒト血清アル ブミンの多くの特異的配位子結合部位に特異的または非特異的に結合する。 ニトロキシド−標識化アルブミンを生体内で利用することによって、反応性酸 素種による細胞損傷を防止してもよい。ニトロキシド−アルブミンは単独で使用 してもよく、または低分子量ニトロキシド化合物、例えば、ＴＥＭＰＯＬと併用 してもよい。ニトロキシド−標識化アルブミンは改良されたアルブミン変性物( 即ち、抗酸化剤活性を有するように改良されたアルブミン)として、アルブミン が 現在常用されている適用分野（非経口用コロイド溶液としての用途を含む）、生 体材料の分野および生体適合性表面コーティングの分野等において有効に利用で きる。 アルブミンは血漿から得てもよく、あるいは組換え遺伝子技術によって調製し てもよい。ＨＳＡは種々の形態、例えばモノマー(正常な血漿形)、ホモダイマー 、オリゴマーおよび凝集体(マイクロスフェア)として使用してもよい。ニトロキ シドを用いるアルブミンの特異的標識化は種々の結合部位(例えば、ビリルビン 、ＦＦＡ、インドール、Ｃu 結合部位等)において、タンパク質の関連部位へ の結合特異性を付与させるために活性されたニトロキシド化合物を用いておこな ってもよい。好ましい例は、ＨＳＡの主要なビリルビン−結合部位に共有結合さ せた２,２,６,６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジリデンスクシネ ート(ＴＯＰＳ)ニトロキシドである。アルブミンの非特異的標識化は約５０個の 利用し得るアミノ基上でおこなってもよい。 ＶＩＩ．第七の好ましい態様…ニトロキシド標識化イムノグロブリン 前述の態様の場合のように、特定のニトロキシドは静脈に注入すると非常に短 い血漿半減期を示した。長い血漿半減期を有する抗酸化性酵素類似体が要求され る場合には、ニトロキシド化合物をイムノグロブリンに結合させることによって 長時間にわたって持続する抗酸化性酵素活性を付与させればよい。 ノムノブロブリンは免疫系のＢ細胞内で生産される一群の血漿タンパク質であ って、２種の特異的配位子結合部位（抗原−結合部位）によって特徴づけられる 。ニトロキシドは、一次および二次免疫応答中におけるイムノグロブリンのヘプ タン−結合性特異性と親和性に関する研究におけるプローブとして従来から使用 されている。 ニトロキシド−標識化アルブミンに関する前記態様の場合のように、ニトロキ シド−ＨＢＯＣの例における前述のニトロキシド−標識化法はニトロキシド−標 識化イノムノグロブリンの製造に容易に適用できる。 ニトロキシド−標識化イムノグロブリンは、反応性酸素種による細胞損傷を防 止するために生体内で使用してもよい。ニトロキシド−イムノグロブリンは、長 期の血漿半減期を有する持続的抗酸化剤活性を付与するために単独で使用しても よく、あるいは低分子量ニトロキシド化合物と併用してもよい。 ニトロキシド−標識化イムノグロブリンはイムノグロブリン自体の特異的標識 化またはヘプタン−結合性部位における共有結合的標識化によって調製してもよ い。生体の自然な免疫応答の一部としてのニトロキシド−標識化イムノグロブリ ンのクリアランス(clearance)を回避するために、イムノグロブリンフラグメン ト、例えば、非特異的標識化法を用いる既知の方法によるイムノグロブリンの開 裂によって生成する(Ｆab)2を用いてもよい(ニトロキシドとイムノグロブリンの 好ましいモル比は６０:１までである)。 本発明は上記の特定の態様によって例証したが、生理学的に適合性のあるヘモ グロビンの多様な形態と安定なニトロキシド遊離基の構造的多様性に基づけば、 以下の請求の範囲によって記載される本発明の基本的な技術的思想を逸脱するこ となく、前記態様の多数の変形態様が可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＣＮ，ＤＥ，ＧＢ，Ｊ Ｐ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．安定化ヘモグロビンおよび該安定化ヘモグロビンと共有結合したニトロキ シドによって特徴づけられる生理学的に適合性のあるヘモグロビンをベースとす る溶液。 ２．ヘモグロビンが架橋によって安定化された請求項１記載の溶液。 ３．ヘモグロビンが組換え体であり、α−グロビンダイマーによって安定化さ れた請求項１記載の溶液。 ４．ヘモグロビンが、開環鎖状糖から誘導される多価アルデヒドを用いて架橋 された請求項２記載の溶液。 ５．ヘモグロビンが、開環環状糖から誘導される多価アルデヒドを用いて架橋 された請求項２記載の溶液。 ６．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは５員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項１から５いずれかに記載の溶液。 ７．ニトロキシドが２,２,５,５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシルで ある請求項６記載の溶液。 ８．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは６員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項１から５いずれかに記載の溶液。 ９．ニトロキシドが２,２,６,６−テトラメチルピペルジン−Ｎ−オキシルで ある請求項８記載の溶液。 １０．重合ヘモグロビンおよび該重合ヘモグロビンに共有結合したニトロキシ ドによって特徴づけられる生理学的に適合性のあるヘモグロビンをベースとする 溶液。 １１．ヘモグロビンポリマーが開環鎖状糖から誘導される多価アルデヒドを含 む請求項１０記載の溶液。 １２．ヘモグロビンポリマーが開環環状糖から誘導される多価アルデヒドを含 む請求項１１記載の溶液。 １３．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは５員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項１０〜１２いずれかに記載の溶液。 １４．ニトロキシドが２,２,５,５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル である請求項１３記載の溶液。 １５．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは６員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項１０〜１２いずれかに記載の溶液。 １６．ニトロキシドが２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル である請求項１５記載の溶液。 １７．生理学的に適合性のあるリポソーム、該リポソーム中にカプセル化され たヘモグロビンおよび該リポソーム中にカプセル化されたニトロキシドによって 特徴づけられる生理学的に適合性のあるヘモグロビンをベースとする溶液。 １８．ニトロキシドがリポソーム膜内に挿入された請求項１７記載の溶液。 １９．ヘモグロビンが架橋または重合によって安定化された請求項１８記載の 溶液。 ２０．リポソームがニトロキシド標識化脂肪酸、コレストンまたはリン脂質か ら成る請求項１７記載の溶液。 ２１．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは５員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項１７〜２０いずれかに記載の溶液。 ２２．ニトロキシドが２,２,５,５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル である請求項２１記載の溶液。 ２３．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは６員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項１７〜２０いずれかに記載の溶液。 ２４．ニトロキシドが２,２,６,６−テトラメチルピペルジン−Ｎ−オキシル である請求項２３記載の溶液。 ２５．ニトロキシドに共有結合し、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエ チレンまたはヒドロキシエチルスターチと複合体を形成した安定化ヘモグロビン を含有する生理学的に適合性のあるヘモグロビンをベースとする溶液。 ２６．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは５員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項２５記載の溶液。 ２７．ニトロキシドが２,２,５,５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル である請求項２６記載の溶液。 ２８．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは６員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項２５記載の溶液。 ２９．ニトロキシドが２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル である請求項２８記載の溶液。 ３０．下記の工程によって特徴づけられる安定化ヘモグロビンを含有する生理 学的に適合性のある溶液の製造法： ニトロキシドを安定化ヘモグロビンと共有結合させ、安定化ヘモグロビン溶液 を実質上酸素を含まない環境に移す。 ３１．ニトロキシドを、スルフヒドロ基、β９３サイトまたは反応性アミノ基 を含む安定化ヘモグロビンのサイトへ共有結合させる請求項３０記載の方法。 ３２．下記の工程によって特徴づけられる生物学的に適合性のある高分子を含 有する生理学的に適合性のある溶液の製造法： ニトロキシドと共有結合した生物学的に適合性のある高分子を含有する生理学 的に適合性のある溶液を調製し、ニトロキシドを、有機体の血管裂孔内の遊離基 種に対して反応性にする。 ３３．高分子がヘモグロビン、アルブミンおよびイムノグロブリンから成る群 から選択される請求項３２記載の方法。 ３４．高分子が安定化ヘモグロビンである請求項３３記載の方法。 ３５．高分子が重合ヘモグロビンである請求項３３記載の方法。 ３６．ニトロキシドとヘモグロビンをリポソームの内部にカプセル化すること を特徴とするリポソームでカプセル化されたヘモグロビンの製造法。 ３７．ニトロキシドがヘモグロビンに共有結合する請求項３６記載の方法。 ３８．内部表面上をニトロキシドで被覆したことを特徴とする生理学的に適合 性のあるヘモグロビン溶液用容器。 ３９．ニトロキシドが容器内部に位置するマトリックスの表面上に被覆された 請求項３８記載の容器。 ４０．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは５員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項３８または３９記載の溶液。 ４１．ニトロキシドが２,２,５,５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル である請求項４０記載の容器。 ４２．ニトロキシドが次式： （式中、Ｒ1〜Ｒ4は炭素原子数１〜４のアルキル基を示し、Ａは６員環の残余 員を示す） で表される構造を有する請求項３８または３９記載の溶液。 ４３．ニトロキシドが２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル である請求項４２記載の容器。 ４４．ヘモグロビンをベースとする生理学的に適合性のある溶液用ハウジング を有するフィルターであって、該フィルター内に含まれるマトリックスに結合し たニトロキシドによって特徴づけられるフィルター。
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