JPH09501770A

JPH09501770A - 中枢神経系障害の検出及び治療方法

Info

Publication number: JPH09501770A
Application number: JP7507060A
Authority: JP
Inventors: ロジャース，スコット・ダブリュー; マクナマラ，ジェイムズ・オー，シニア; ハイネマン，スティーヴン・エフ
Original assignee: デューク・ユニヴァーシティ; ザ・ソーク・インスティテュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ
Priority date: 1993-08-19
Filing date: 1994-08-10
Publication date: 1997-02-18
Also published as: AU7560294A; EP0714511A1; CA2169273A1; US5529898A; EP0714511A4; WO1995005600A1; AU680939B2

Abstract

(57)【要約】自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害（例えば、炎症性発作障害）患者のスクリーニング方法において、患者からサンプルを採取するステップと、生物サンプル中のグルタミン酸受容体に対する自己抗体（例えば、GluR3グルタミン酸受容体に対する自己抗体）の有無を検出するステップを含む方法である。上記自己抗体が存在すれば、患者が自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害に罹患していると判定する。患者の体内中に存在するグルタミン酸受容体に結合する自己抗体数を減少させることにより上記疾患を治療する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】中枢神経系障害の検出及び治療方法この発明は、アメリカ合衆国国立予防衛生研究所の助成金第NS17771号及び第N S30990R29号による政府の後援を受けてなされたものである。合衆国政府はこの発明について権利の一部を所有する。技術分野この発明は、グルタミン酸受容体に対する自己抗体が関与する中枢神経系障害の検出及び治療方法に関する。背景技術血漿交換が治療法として提案された最初の神経筋障害は、重症筋無力症であった。その時以来、血漿交換は他の数種の神経系疾患、例えばイートン・ランバート筋無力症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、急性ギャン・バレー症候群、慢性ギャン・バレー症候群、多発性硬化症、レフスム症候群、筋萎縮性側索硬化症、過粘稠度性昏睡及び多発性神経障害に試みられてきた。このように各種の治療に試みられ、結果としては効果あり、効果がはっきりしない、効果が疑問である、及び効果がない、などと判定されきた。P．Reuther，Plasma Exchange Therapy in N eurological Disorders: A Clinician's Overview，in Therapeutic Hemapheres is，vol．2，pgs 27-54(J．MacPherson and D．Kasprisin Eds．1985); さらにまた、Current Practices in Therapeutic Plasmapheresis，pgs 158-177(Y．Sh iokawa and N．Inoue Eds．1985); Therapeutic Apheresis，pgs．35-58(J．Kol ins and J．Jones Eds．1983); H．Weiner，Science 259，1321(26 Feb．199 3)を参照されたい。重症筋無力症の基本的な病理因子は、抗アセチルコリン受容体抗体であって、この抗体は血漿交換によって取り除くことができると一般に認められている。血漿交換によって治療されている他の神経系疾患のほとんどは、基本的な病因がまだ分かっていない。しかしながら、病気の基本的なメカニズムが分からずに、血漿交換を行って、その抗体濃度をモニターして、正しい治療を行うことは困難なことである。したがって、神経系障害の根底に横たわっている自己免疫のメカニズムをより深く理解するように、常に努めて行かなくてはならない。発明の要旨本発明は、ある種のグルタミン酸受容体タンパクでウサギを免疫すると、ヒトのラスムッセン脳炎に非常によく似た障害を起こす観察に基いている。このことは、グルタミン酸受容体に対して自己免疫する過程が発病要因であることを示す。したがって、本発明の第一の実施態様は、自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害患者のスクリーニング方法である。この方法は、患者から生物サンプルを採取するステップと、生物サンプル中のグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出するステップとを含む。自己抗体の存在が検出されれば、この患者が自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害に罹患してる、あるいは罹患している可能性があると判定する。本発明の第二の実施態様は、自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害の治療方法である。この方法は、患者の体内に存在していて患者のグルタミン酸受容体と結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体を、障害の治療に充分となるまで、（例えば、選択的免疫吸着により）選択的に減量することを含む。本発明の第三の実施態様も、治療を必要としている患者の自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害の治療方法である。この方法は先ず、（例えば、血漿交換又は血漿瀉血によって）上記患者の体内に存在していて上記患者のグルタミン酸受容体と結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体を減量した後、上記患者から生物サンプルを採取し、上記生物サンプル中のグルタミン酸受容体に対する自己抗体の量を検出することを含む。その上で、患者の体内のグルタミン酸受容体に対する自己抗体が、上記疾患の治療に充分な程度まで減量されていないと判定される場合には、グルタミン酸受容体に対する自己抗体の減量段階を反復実施する。次に、本発明の上記その他の目的及び実施態様を、図面及び以下の明細書により詳細説明する。図面の簡単な説明図1は、ラスムッセン脳炎に罹患しているヒト女性患者に対する、血漿交換の効果を示す図である。最上欄は、相対光学密度（相対O.D.）に換算してＥＬＩＳＡにより測定した、この患者のGluR3抗体力価の測定結果である。中央欄及び最下欄は、血漿交換（ＰＥＸ）開始の前後おのおのにおける、全身性発作と部分発作の頻度を示す図である。発明の詳細な説明本発明のスクリーニング及び治療方法は、ラスムッセン脳炎に罹患している患者、又は罹患していると疑われる患者を対象とする。ラスムッセン脳炎とは、他の点では正常である小児に起こる進行性の片側脳不全及び難治性の部分発作からなる症候群である。片側半球脳不全の重篤度とその範囲は共に、月単位ないし十年単位の期間をかけて絶えず進行してゆき、最後には片側不全痲痺と痴呆となる。主な病理所見としては、軟膜にリンパ球の浸潤物が認められること、脈菅周囲にリンパ球のカフィングが存在すること、皮質に小グリア細胞節が多発していること、ニューロンが欠失していること、グリオーシス及びスポンジオーシスが挙げられる。固有の炎症性の組織病理異常が、大脳の片側半球の皮質に集中していることは謎とされている。発作が起きると患者からすべての能力が失われ、従来は鎮痙剤を投与していたがほとんど効果はなかった。皮質を部分的に切除することにより発作を一時的にコントロールすることはできるが、事実上このプロセスを脳半球の残りの部分にも広げて行かざるを得なくなる。機能不全を伴う大脳半球切除を行うと、片痲痺と重篤な脳半球機能不全を避けることはできないが、止むを得ざる選択とされている。本発明はさらに、上記でラスムッセン脳炎に分類される障害の他に、基本的な原因がグルタミン酸受容体に対する自己免疫である他の発作障害、特に炎症性発作障害の検出及び治療にも適用することができる。例えば、治療のために海馬を切除した側頭葉てんかん患者の約5%から採取するサンプルに、ラスムッセン脳炎に見られるような脳組織の炎症性病理変化が認められている。発作障害の他に、当業者はグルタミン酸受容体は、中枢神経系において異なる各種機能に関与しており、したがって、本発明は個々の障害はどうであっても、グルタミン酸受容体に対する自己免疫に起因する中枢神経系障害の治療全般に適用できることを理解するであろう。例えば、本発明はグルタミン酸受容体に対する自己免疫メカニズムを原因とする、ある種の散発性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）にも適用することができると考えられている。散発性ＡＬＳの組織病理所見は、ラスムッセン脳炎の所見と似ているが、異常が脊髄、運動皮質及び皮質脊髄路の前面部分で見い出されれる。さらに、脊髄の前面部分のホモジェネートとフロイント完全アジュバンの混合物によって、実験動物を処理すると、ＡＬＳに似た症状を示すことが知られている（これまでのところ、抗原の性質が明らかになっていないが）。グルタミン受容体に対する病理免疫反応が、アルツハイマー病のある病態である可能性もある。アルツハイマー病患者の脳にしばしば炎症変化が認められることから、このように免疫メカニズムがアルツハイマー病の病態生理に関連があると考えられるようになったのである。さらに、消炎剤でアルツハイマー病患者を治療すると、病気の進行を遅滞させるように見受けられる。Scie nce 260，1719-1720(1993)を参照されたい。これまでにさらに、ドーパミン自己免疫メカニズムが、ある種の精神分裂病の原因であると提案されていた。D．Kir ch，Schizophrenia Bulletin 19，355(1993)を参照されたい。現在まで提案されたことはなかったが、特にグルタミン酸受容体に対する（及びグルタミン酸受容体を阻止する）抗体（抗原が特定されている）がある種の精神分裂病に関連があると考えられている。理由は、（1）他の点では正常であるヒトが、NMDA受容体を阻止するフェンシクリジンなどの薬剤によって精神病症状を呈し、またこの薬剤によって潜伏性精神分裂病患者の精神分裂病の再発が促進される、（2）ラスムッセン脳炎の所見により、グルタミン酸受容体に対する自己免疫のプロセスが先行して存在することが立証されているからである。本発明の方法は本来ヒトを対象としているが、発作障害の治療を含む（ただし、これのみに限定されない）獣医科領域の医療を目的として動物（例えば、ウマ、イヌ、ネコ）にも適用することができる。これまでに中枢神経系障害に罹患していると診断されたことがなかったが、今回初めて診断を必要としている動物、あるいはこれまでに既に中枢神経系障害であると診断されていて、以下で説明する方法によりこの診断を確認したり、現在受けている治療をモニターしようとしている動物を本発明の方法でスクリーニングしてもよい。本発明の方法が関与するグルタミン酸受容体には、イオノトロピック及びメタボトロピックグルタミン酸受容体の二つがある。グルタミン酸受容体の分類は、選択力の最も強いアゴニストを基準にして分類される。このようにして分類されたイオノトロピックグルタミン酸受容体の例としては、NMDA（Ｎ−メチル−Ｄ− アスパラテート）、KA（カイネート）、AMPA（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５ −メチル−４−イソキサゾールプロピオネート）受容体があるが、これらに限定されない。また、メタボトロピックグルタミン酸受容体の例としては、L-AP4（２−アミノ−４−ホスホノブチレート）及びACPD（トランス−１−アミノ−シクロペンタン−１，３ジカルボキシレート）受容体があるが、これらに限定されない。一般的には、G．Gasic and M．Hollmann，Ann．Rev．Physiol．54，507(199 2)を参照されたい。例えば、AMPA受容体のGluR1、GluR2、GluR3、及びGluR4サブタイプ、さらにはKA受容体のGluR5、GluR6及びGluR7サブタイプもこのサブタイプに入れられている。本発明で説明する方法の実施には、（細胞外ドメインなどの抗原フラグメントを含む）グルタミン酸受容体を使用する。このグルタミン酸受容体の起源と検査治療を受ける動物とは、種類が同じであっても、異なっていてもよいが（例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ラット）、典型的には哺乳動物由来である。グルタミン酸受容体は天然源から精製したり、あるいは組替え手段によって産生することができる。抗体含有生物サンプルは、患者から採取され、本発明を実施するために使われる。そのサンプルとしては、血液、血清、血漿、脳脊髄液及び脳組織が挙げられる。サンプルの採取方法としては、血漿瀉血などの施術の際に血液を採取してもよいし、静脈穿刺又は腰部穿刺によってサンプルを採取してよいし、外科手術の際の組織バイオプシーをサンプルにしてもよいし、また他の好適な手段によって採取してもよい。本発明の検出段階の実施方法としては、均質アッセイや不均質アッセイなどの免疫検定が好適である。好適な免疫検定の例としては、放射免疫測定、免疫蛍光測定、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学測定及びイムノブロッティングが挙げられるが、これらに限定されるものではない。典型的な検定では、通常、サンプル、検出する抗体、可視化のためのシグナルを生ずる手段が試薬となっている。サンプルとしては上記で説明したものを使用する。一般には、抗原（上記したように、グルタミン酸受容体）をビーズ、プレートあるいはスライドなどの支持体に固定して、液相中で抗体を含有していると思われるサンプルに接触させる。支持体と液相を分離して、可視化のためのシグナルを生ずる手段を用いて、支持体あるいは液相のいずれかを検査して、そのシグナルを検出する。シグナルが検出されれば、サンプル中に抗体が存在することになる。可視化のためのシグナルを生ずる手段としては、放射性標識、蛍光標識、酵素標識などを使用する手段が挙げられる。例えば、検出しようとする抗体に結合する抗体（例えば、ヤギ抗ヒト免疫グロブリン）を、検出基に結合しておいて、これを液相反応溶液に添加した後、分離を実施する。固体支持体上に検出基が存在していれば、試験サンプル中に抗原が存在することを示している。当業者は本発明の検出段階を実施するのに有用な、多くの特異的な免疫検定方法とその変法に熟知している筈である。一般に、E．Maggio，Enzyme-Immunoassay，(1980 )(CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL); R．Nakamura et al.，Enzyme Immunoass ays: Heterogeneous and Homogeneous Systems，In Handbook of Experimental Immunology，Vol．1，chap．27(D.M．Weir ed．1986)(Blackwell Scientific Pu blications)を参照されたい。さらに、Skoldらに付与された合衆国特許第4,727, 022号、Forrestらに付与された合衆国特許第4,659,678号、Davidらに付与された合衆国特許第4,376,110号、Litmanらに付与された合衆国特許第4,275,149号、Ma ggioらに付与された合衆国特許第4,233,402号及びBoguslaskiらに付与された合衆国特許第4,230,767号を参照されたい。本出願人らは、特に、本発明で引用するすべての合衆国特許引例の開示を、引用することにより本発明の一部とすることを意図している。本発明の方法を実施するために用いる診断キットは、いく通りにも構成することができる。一実施例の診断キットは、（a）固体支持体に結合したグルタミン酸受容体タンパク、及び（b）検出基（例えば、上記で説明した検出基）に結合している本発明の抗ヒト二次抗体を含む。試薬として、緩衝剤や、タンパク安定剤、例えばポリサッカライド類などの補助薬剤を加えてもよい。必要な場合、診断キットに、検出基（例えば、酵素基質）をシグナルを生ずる系の構成要素としたり、かつこれに他の構成要素も加えたり、さらには試験体中のバックグラウンドの干渉を減らす薬剤、コントロール薬剤、試験の実施に必要な装置などを加えもよい。さらに第二の実施例では、試験キットは（a）グルタミン酸受容体抗原、及び（b）検出基に結合した抗原のための特異的結合相手を含む。このキットに、上記した補助薬剤を同様に加えてもよい。試験キットは好適な方法、典型的にはすべての構成素材を単一の容器に包装して、これに印刷した試験指示書を添付する。患者の体内のグルタミン酸受容体と結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体を減量させる好適な方法がある。例えば、自己抗体濃度を血漿瀉血によって低下させる（患者の血液を取り出し、血液細胞と血漿とを分離して、細胞を再注射する）。特定の実施例において、血漿交換（取り出した血液の全部、又は一部を乳酸リンゲル液などの代用血漿と取り替える）又は血漿潅流（血漿から自己抗体を分離して、血漿を患者に戻す）によって血漿瀉血を実施する。使用する好適な装置としては、Haemonetics Model 30血液プロセッサー、IBM 2997血液プロセッサー、Fenwall Laboratories CS-3000 血液細胞分離器などの遠心分離装置、及びCobe Centry TPE moduleなどの血漿濾過膜装置を挙げられるが、これらのみに限定されない。免疫グロブリン結合タンパク（例えば、プロテインＡ）を含有する固体支持体に血漿を接触させ、血漿を固体支持体から分離した後、この血漿を患者に戻すなどの好適な方法で、自己抗体を患者の血漿から取り除くことができる。典型的にはこの方法は、アフィニティーカラム中の親和支持体上に免疫グロブリン結合タンパクを固定し、血漿をアフィニティーカラムに通してから、血漿を患者に戻す（随意、血漿と患者の血液細胞とを再び合わせても良く、また、それが好ましい）ことによって実行されている。さらに、当業者が理解しているように、この方法は全血にも使えるし、また好適な血液分画にこの方法を実施し、その上で、血液細胞と再び合わせて患者に戻すこともできる。例えば、SjoquistとSjodinに付与された合衆国特許第3,996,898号、Sjoquistに付与された合衆国特許第3,995,018 号及びAllenに付与された合衆国特許第5,128,451号を参照されたい。上記の変法として、グルタミン酸受容体又はその抗原フラグメントを固体支持体に固定しておいて、上記で説明したように、患者の血液、血漿、又はその好適な分画をこの固体支持体に接触させることにより、患者の血液からグルタミン酸受容体に対する自己抗体を選択的に取り除くことができる。この方法は、患者が治療を受けているとき、他の抗体濃度を大きく低下させることがないという利点がある。患者の年齢、体重、病状、さらに取り出した血液を患者に戻すのか、好適な代用血漿と交換するのかによって、血漿瀉血の度毎に患者から取り出す血漿量が異なる。典型的には、施術1回当り0.5リットル〜3リットルの血漿を取り出す。血漿瀉血の施術回数は上記条件により、1日当り1回以上（例えば、1日2回〜3回）、1週当り1回、2回あるいは3回以上実施する。初回施術の場合には取り出し量をより大きくすることができるし、また上記で説明したように、患者の血液からグルタミン酸受容体に対する自己抗体を選択的に取り除いてから、この血液を患者に戻す場合でも、より大きい量の血漿を取り出すことができる。また、患者のグルタミン酸受容体に結合する抗体を減量する方法の代わりに、上記自己抗体の結合領域に結合する抗イディオタイプ抗体を患者に投与する方法もある。この投与段階の好適な実施手段としては、静脈注射、筋肉注射あるいは皮下注射がある。抗イディオタイプ抗体は、公知の方法により産生することができる。この抗イディオタイプ抗体は、PCT特許出願第WO92／15683号及びPCT特許出願第WO092／15699号に開示されているように、患者の体内で免疫反応を最小限度に抑制するに充分なヒト由来部分からなる、「ヒト化」抗体とすることができる。抗イディオタイプ抗体の投与量は、患者の体内に存在する自己抗体の力価又は量を、上記検定方法により測定して、その測定結果により決定する。免疫寛容を誘導する古典的な技術である経口耐性（例えば、H．Weiner，Scien ce 259，1321(1993); M．Chase，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．61，257(1946); H．Wells，J．Infect．Dis．9，147(1911)を参照されたい）を用いて、患者の体内に存在していて、グルタミン酸受容体と結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体を減量することができる。この方法は、上記したグルタミン酸受容体タンパク、又はその抗原フラグメント、又はこの二者のそれぞれの融合タンパクを含む活性薬剤を患者に経口投与する。これによって、抗原に対する免疫反応が変化して、従来この抗原に対して見られた免疫反応が抑制される。このグルタミン酸受容体タンパクの起源は、どの哺乳動物由来（例えば、ウシ、サル）のものでもよいが、ヒト由来が好ましい。任意に、免疫アジュバント（例えば、リポポリサッカライド）を抗原と併用投与してもよい。この活性薬剤の種類と性質、アジュバント投与の有無、患者の状態、投与計画に応じて、経口耐性を達成する有効量の活性薬剤を経口投与する。投与量の例としては、約10又は20mg〜約500又は1 000mgが挙げられるが、これに限定されない。投与回数は、1日当り1回、2回又は 3回などの好適な回数とする。上記の経口耐性療法を実施するのに有用な処方は、典型的には経口投与が可能な担体を組み合わせた、経口投与が可能な形をとった上記で説明した活性薬剤を含む。経口投与が可能な処方は、別々の単位として、所定量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤、舐剤、又は錠剤などがある。そのそれぞれは、粉末又は顆粒として、溶液又は水性や非水性液の懸濁液として、あるいは、水中油形又は油中水形のエマルジョンとして、所定量の活性成分を含む。本発明の処方は活性成分と好適な担体とを結合させるステップを含む、好適な製剤方法により調製する。一般的には、活性成分と、液体担体又は微細に粉砕した固体担体、あるいはその両者からなる担体とを均質に馴染みよく混合し、必要な場合にはこの混合物を造形して本発明の処方を調製する。例えば、活性成分を含有する粉末又は顆粒に、随意、一以上の免疫アジュバントなど補助成分を加えて、圧縮あるいは成形して錠剤を調製する。実際医療では、患者の体内に存在していてグルタミン酸受容体と結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体の量を上記した方法などによりモニターして、疾患の進行状況あるいは疾患の状態を反復モニターしたり、あるいは上記で説明した治療を効果的に実施する。約1週ないし1ケ月毎に、好ましくは各週毎に患者から生物サンプルを採取して、患者の自己抗体濃度の増減を経時的に観察する。自己抗体の減少は疾患が改善されていること、あるいは改善の可能性を示し、自己抗体の増加は疾患が進行していること、あるいは進行の危険度を示す。典型的には、疾患の治療と共にモニターを行う場合、治療開始前に患者について、この疾患が自己免疫に起因することを確認する測定を少なくとも１回行い、さらに好ましくは数回の測定により患者の体内の自己抗体の基準力価又は基準量を確定しておく。治療開始後は、少なくとも定期的に抗体を測定し、標準臨床指標により患者の病状をモニターして、治療の効果を判断したり、治療の調整を行って効果の増進を図る。次に、実施例により本発明を詳細説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。実施例１ラスムッセン脳炎のウサギモデルの開発他の理由により各種グルタミン酸受容体に対するウサギの抗血清を作る過程において、図らずもラスムッセン脳炎の動物モデルを開発した。簡潔に述べると、細菌により発現された、グルタミン酸受容体（GluRs）1〜6の細胞外ドメインの部分に対する抗血清がウサギで調製された。すべてのウサギは、注射した抗原に対する高力価で、サブユニット特異的な抗体を産生した。これらの抗血清の調製過程で、GluR3細胞外ドメインを含有する細菌融合タンパクを注射した2匹のウサギは第三回投与後の発作に一致した食欲不振、とっぴな振舞い、及び反復運動を示した。GluR1、GluR2、GluR5又はGluR6をおのおのを発現する関連融合タンパクを注射した2匹のウサギは、異常な振舞いや発作を示さなかった。 GluR3融合タンパクで免疫した2匹のウサギの脳を検査したところ、同じ様な炎症性神経病理の特徴を示していた。肉眼検査では特異性を認めなかった。顕微鏡検査では、軟膜に軽度の広汎性リンパ球浸潤物が存在していた。主として新皮質と嗅覚皮質において、脈管周囲のカフィングが存在していたが、海馬と尾状核には認められなかった。小グリア節が新皮質の外層部（主として、層IIと、層I及びIIの接合部）と、嗅覚皮質に点在していた。小グリア節は海馬と小脳ではほとんど認められず、脳幹神経節、視床又は脳幹では皆無であった。炎症性変化は、ラットの脳におけるGluR3の分布と一致するパターンで分布していた。これらの炎症性変化はGluR3（そのフラクション）で免疫したウサギに発生したので、GluR3に対する免疫が介在した反応である可能性が考えられる。さらにまた、これらの神経病理所見は、ラスムッセン脳炎の炎症性神経病理異常の特徴と非常によく似ていることが観察された。実施例２グルタミン酸受容体に対する自己抗体の検出のためのイムノブロッティングアッセイ S．Rogers et al.，J．Neurosci．11，2713(1991)及びS．Rogers et al.，J． Neurosci．12，4611(1992)が説明している公知の方法によって、グルタミン酸受容体とTrpEとの融合タンパクを構成し、細菌中でタンパクを過剰産生し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ウェスタンブロット解析を実施した。ウェスタンブロットは各々、新鮮なドライミルク２％を含むリン酸緩衝液（blotto: ブロトー）で、室温で一時間ブロッキングした後、1:100で希釈したサンプルから採取した血清を入れたブロトー中で4℃で一晩振盪した。さらに、ブロットを室温で2時間振盪し、PBSで1時間かけて4回洗い、比率1:750でヤギ抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを含有するブロトーに、室温で一時間戻した。再び、ブロットを前回と同様にしてPBSで洗い、その後、50mMのトリス、100mMのNaCl、及び2mMのMgCl₂ （発色用緩衝液）中で二回洗った。ニトロブルーテトラゾリウムを1μg／mlと、 BCIP（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）を0.5μg／mlを含有する発色用緩衝液中にブロットを入れて、免疫反応を視覚化した（Rogers e t al.，前掲(1992)）。次の操作によって、バックグラウンドの細菌タンパクに対する無関係の免疫反応を取り除いた。すなわち、大腸菌ＮＭ５２２細胞をYT栄養ブロス中で37℃にて14時間増殖させ、遠心分離により採取して、pH7.2の10mM トリス緩衝液で洗い、凍結解凍を繰り返して溶菌した。溶菌した細菌の懸濁液を血清サンプルに加え、室温で2時間振盪し、13,000×ｇで10分間遠心分離して、その上澄み液を上記で説明したウェスタンブロット解析に使用した。実施例３免疫細胞化学検定によるグルタミン酸受容体に対する自己抗体の検出 GluR3に対するcDNA（G．Huntley et al.，J．Neurosci．13，2965（1993））、又は細菌タンパクであるβ-ガラクトシダーゼのいずれかを含有する発現プラスミドで、ヒト胚腎臓 293 細胞をトランスフェクトし、パラホルムアルデヒドで固定し、トリトンX-100で浸透化して、公知の方法により血清と反応させた（H untley et al.,前掲を参照されたい）。典型的な血清の希釈倍率は、免疫したウサギに対しては1:2000、ヒト血清に対しては1:1000とした。ところが、ラスムッセン脳炎患者一名の血清が、強い細胞核免疫反応を示した。このため、免疫希釈血清サンプルは公知の方法（Rogers et al.,前掲（1992）；Huntley et al.，前掲）により、トランスフェクトしない293細胞に吸着させることとした。実施例４グルタミン酸受容体に対する自己抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ実質的に公知の方法（Rogers et al.，前掲（1992））により、ＥＬＩＳＡを実施した。過剰産生されたタンパク（GluR3とtrpEの融合タンパク、又は、バックグラウンドコントロールとして、ニューロン性のニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットβ4とtripEの融合タンパク）を、新しく調製した8Mの尿素（1 グラムのタンパク当り10 ml）に室温で1時間溶解し、遠心分離して、上澄み液に 50mMのKClと50mMのNaClとの溶液（pH10.5）をゆっくりと添加して10倍に希釈した。この溶液を1NのHClでpH8にして、10mMのNaClを含む10mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中で4℃にて繰り返し透析を行った後、BioRadタンパク検定キットを使ってタンパク濃度を測定した。IMMULON^TMマイクロタイタープレートを調製するため、50μlのリン酸緩衝液（PBS）中に抗原（0.2μg／ウェル）を入れたものを、4℃で14時間ウェル各々に添加した。ウェルは室温で1〜2時間かけて、ブロッキングPBS（ドライ脱脂ミルク2%を含有するPBS）で完全に洗った。これに、ブロッキングPBSにより各種希釈倍率（例えば、1:5、1:50、1:250）で血清を希釈したものを添加して、皿を室温で1時間インキュベートした。プレートをブロッキングPBSで5回洗った後、室温で45分間、二次抗体と結合したヤギ抗ヒトIg Gアルカリホスファターゼ（1:7500）を添加した。プレートをPBSで洗い、２，２ ’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（1 mg／ml）を含むMcIlvain緩衝液（pH4.6）と、0.0005%過酸化水素により発色させた。プレートをTERITEK^TM マルチスキャンＥＬＩＳＡ読み取り器でスキャンし、GluR3融合タンパクの値からニコチン性アセチルコリン受容体β4融合タンパクの価を差し引いて、GluR3に特異な度数とした。実施例５ラスムッセン脳炎患者のグルタミン酸受容体自己抗体の調査 GluR3に対する自己免疫のプロセスがラスムッセン脳炎と関連があるとする仮説を吟味するために、GluR3抗体の存在率を調査した。病理的にラスムッセン脳炎であると確認されている患者4名、年齢性別が同一であるてんかん小児患者4名、他のてんかん小児患者4名、年齢性別が同一である健康な小児4名、及び他の健康な小児4名の血清について、上記実施例2で説明したウェスタンブロット解析、及び上記実施例3で説明したGluR3を発現するトランスフェクトされた細胞を用いて、GluR3及び他の密接に関連するグルタミン酸受容体に対する免疫反応を検査した。表1に示すようにウェスタンブロット解析において,4名のラスムッセン脳炎患者のうち2名（JH、JS）の血清は、GluR3融合タンパクに対して陽性の免疫反応を示し、残り2名のラスムッセン脳炎患者のうち1名（CF）では、ウェスタンブロット解析により、断続的にGluR2融合タンパクに対する弱い免疫反応がみられた。他方、コントロール患者16名の血清で、GluR3、又は他のいずれかの融合タンパク（GluR1、GluR2、GluR4、GluR5又はnAChR）に対して免疫反応を示したものは1名しかいなかった。4名のラスムッセン脳炎患者の中、3名（JH、JS、CF）はGluR3を発現しているトランスフェクトされた細胞に免疫反応を示した。これら3名のうちでも、関連グルタミン酸受容体サブユニットGluR1、又はGluR6を発現するトランスフェクトされた細胞に免疫反応をしたものはなかった。16名のコントロールのうちで、トランスフェクトされた細胞中で発現されているGluR3に対して免疫反応を示したものはいなかった。ラスムッセン脳炎患者のうち、活性がある進行性疾患の患者（JH、JS）は、ウェスタンブロット解析によるGluR3に対しても、さらにはGluR3を発現するトランスフェクトされた細胞に対しても、最大の免疫反応を示した。ウェスタンブロット解析ではGluR2融合タンパクに断続的に弱い反応を示し、GluR3融合タンパクには反応がなかったが、GluR3を発現するトランスフェクトされた細胞に対しては表面的な免疫反応を示す患者（CF）は、安定した重篤な片側半球機能不全を持ち、発作がほとんどない。ウェスタンブロット解析のGluR融合タンパクのいずれにも、またGluR3（AT）を発現するトランスフェクトされた細胞にも、免疫反応を示さなかったラスムッセン脳炎患者が1名だけあったが、この患者はは2年前に大脳半球を切除し、以後臨床的に安定していて、発作が起こらない患者であった。これらの観察は、現在発生している発作、進行性の脳炎とGluR3抗体の発現の間に、関連性があることを示している。これらの観察はさらにまた、ラスムッセン脳炎患者の病態が月単位、あるいは年単位で進行して行った後、自然に事実上、安定して行く長期的結末と相関しながら、最終的にはGluR3に対する免疫反応も鎮静化することを示している。ウェスタンブロット解析でGluR3融合タンパクに免疫反応を示したコントロール患者は、この検査の実施時期が僧帽弁疾患のために受けた開胸手術の1週間後に当たっていた。この女性患者では、抗体がGluR3を発現しているトランスフェクトされた細胞と結合しなかった。このことの持つ意義は未だ定かになっていないが、数個の要因が関連していると考えられる。先ず、低体温麻酔下で心臓バイパスを形成すると、免疫系を非特異的に賦活して、細菌が発現したGluR3融合タンパクに対する非特異的な交差反応性が高まると考えられる。次に、ウェスタンブロット上で発現されたGluR3抗原の形状は、トランスフェクトされた細胞や、ニューロン中で発現されたGluR3の三次元形状とは異なっているため、その後は親和性が少し異なる抗体が選択されるようになると考えられる。実施例６グルタミン酸受容体自己抗体の除去によるラスムッセン脳炎の治療上記実施例5の患者J．S.は9才の女児で、6才の時まで健康な小児であった。6 才の時、左上額部を打ち、それ以来、難治性の右側部分全汎発作がだんだん頻発していき、認知力の低下が進行していた。神経イメージング検査結果では、左側脳半球に進行性萎縮が認められた。この左側脳半球からバイオプシーによる神経病理検査を行い、ラスムッセン脳炎の診断を確認した。従来治療技術では、機能不全を伴う大脳半球切除術が選択される症例である。しかしながら、この実施例においては、血漿交換（PEX）を反復してGluR3に対する抗体を除去することにより、この患者の治療を試みた。 PEX実施前では、この患者は常に傾眠状態で、ほとんど唖であった。会話は一段階、あるいは二段階の話しか理解することができず、読むことも、書くことも、2+2のような簡単な足し算すらできなかった。右側の視野の認識ができず、軽度の右側片不全痲痺があった。図1で示すように、発作頻度は1日に約12回であった。この患者に対して、単一量のPEX（最初の3週間では7回、その後各週毎に1回づつ）を処置量を変えることなく、反復して実施し、さらに従来からの少量の鎮痙剤を続けて、治療を行った。PEXでは、COBE Spectra装置を使用して、血漿1200m lを取り出し、これをヒトアルブミン5%を含有する乳酸リンゲル液と交換した。患者の血液には、酸性酢酸デキストロース（ACD）を、血液:ACDの比率を約12:1 で添加して、抗凝血措置を施した。 PEX開始後、この患者はPEXに対して急速に、劇的な、効果的反応を示した。最初の6〜7週では、発作頻度が80%減少し（図1参照）、患者自身も簡単な言葉や句を使って自発的に話し始め、理解力は向上し、右側不全片痲痺は改善し、さらに 2年間で初めて人形で遊び、自転車に乗り、自発的に家庭内行事に参加するようになった。筆記力、作画力が改善した証拠も若干認められ、3+5や4-2のような簡単な算術も正しく行えるようになった。しかしながら、その後の4週間で発作頻度がゆっくりと上昇し、認知力と運動技術が低下した。図1に示す通り、始めに臨床改善が認められ、後になってこれらが低下したことは、循環している抗GluR 3抗体の濃度が始めは低下したが、後になって上昇したことと密接に同時進行していた。。上記の記載は本発明を説明するためのものであって、これをもって本発明を限定するものと解釈してはならない。本発明の範囲は後述の請求項によって定められていて、この請求の範囲には請求項の同一物も含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マクナマラ，ジェイムズ・オー，シニアアメリカ合衆国、27514 ノース・キャロライナ、チャペル・ヒル、レイク・ショア・レイン 400 (72)発明者ハイネマン，スティーヴン・エフアメリカ合衆国、92037 カリフォルニア、ラ・ジョラ、クリフリッジ・レイン 8481

Claims

【特許請求の範囲】１．自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害患者のスクリーニング方法において、上記患者から生物サンプルを採取するステップと、上記生物サンプル中のグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出して、上記自己抗体が存在するときは、上記患者が自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害に罹患しているか、発病する危険があると判定するステップとを含む方法。２．請求項１に記載の方法において、上記生物サンプルが体液である方法。３．請求項１に記載の方法において、上記生物サンプルが血液、血漿、血清、脳脊髄液及び脳組織よりなる群から選ばれる方法。４．請求項１に記載の方法において、上記中枢神経系障害が発作障害である方法。５．請求項１に記載の方法において、上記中枢神経系障害が炎症性障害である方法。６．請求項１に記載の方法において、上記中枢神経系障害が炎症性病理変化を伴う側頭葉てんかんである方法。７．請求項１に記載の方法において、上記中枢神経系障害がラスムッセン脳炎である方法。８．請求項１に記載の方法において、上記中枢神経系障害が筋萎縮性側索硬化症である方法。９．請求項１に記載の方法において、上記検出ステップがイオノトロピックグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出することを含む方法。１０．請求項１に記載の方法において、上記検出ステップがNMDA、KA及びAMPA グルタミン酸受容体よりなる群から選ばれるイオノトロピックグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出することを含む方法。１１．請求項１に記載の方法において、上記検出ステップがAMPAグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出することを含む方法。１２．請求項１に記載の方法において、上記検出ステップがメタボトロピックグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出することを含む方法。１３．請求項１に記載の方法において、上記検出ステップがL-AP4及びACPDグルタミン酸受容体よりなる群から選ばれるメタボトロピックグルタミン酸受容体に対する自己抗体の有無を検出することを含む方法。１４．請求項１に記載の方法において、上記患者がこれまでに中枢神経系障害に罹患していると診断されたことがない方法。１５．請求項１に記載の方法において、上記患者がこれまでに中枢神経系障害に罹患していると診断されたことがある方法。１６．治療を必要としている患者の自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害の治療方法において、患者の体内に存在していて患者のグルタミン酸受容体に結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体を、上記障害の治療に充分となるまで選択的に減量するステップを含む方法。１７．請求項１６に記載の方法において、上記患者に血漿瀉血を施術することによって上記の選択的減量ステップを実施する方法。１８．請求項１６に記載の方法において、上記患者から上記自己抗体を取り除くことよって上記の選択的減量ステップを実施する方法。１９．請求項１６に記載の方法において、上記患者に抗イディオタイプ抗体を投与して、上記自己抗体の結合領域にこの抗イディオタイプ抗体を結合させることによって、上記の選択的減量ステップを実施する方法。２０．請求項１６に記載の方法において、上記の抗イディオタイプ抗体がヒト化抗体である方法。２１．請求項１６に記載の方法において、上記患者が発作障害に罹患している患者である方法。２２．請求項１６に記載の方法において、上記のグルタミン酸受容体に対する自己抗体がメタボトロピックグルタミン酸受容体に対する自己抗体である方法。２３．治療を必要としている患者の自己免疫疾患に起因する中枢神経系障害の治療方法において、（ａ）患者の体内に存在していて患者のグルタミン酸受容体に結合するグルタミン酸受容体に対する自己抗体を減量するステップと、（ｂ）上記患者から生物サンプルを採取するステップと、（ｃ）上記生物サンプル中に存在するグルタミン酸受容体に対する自己抗体の量を検出するステップと、グルタミン酸受容体に対する自己抗体が上記患者の体内で上記障害の治療に充分となるまで減量されていない場合には（ｄ）上記ステップ（ａ）を反復することを含む方法。２４．請求項２３に記載の方法において、上記減量ステップを血漿瀉血によって実施する方法。２５．請求項２３に記載の方法において、上記減量ステップを血漿交換によって実施する方法。２６．自己免疫疾患の罹患患者の中枢神経系の自己免疫疾患をモニターする方法において、（ａ）上記患者から生物サンプルを採取するステップと、（ｂ）上記生物サンプル中のグルタミン酸受容体に対する自己抗体の量を検出するステップと、（ｃ）上記ステップ（ａ）及び（ｂ）を反復実施して、上記生物サンプル中の自己抗体の量の変化を測定ステップと、減量している場合には上記疾患が改善していると判定し、増量している場合には上記疾患が進行していると判定するステップを含む方法。２７．請求項２６に記載の方法において、上記患者が同時に上記疾患の治療も受けている方法。２８．請求項２６に記載の方法において、上記採取ステップを約1週間〜約1ケ月の間隔で反復実施する方法。