JPH09501933A

JPH09501933A - 植物、動物、およびヒトのワクチンとして並びに免疫療法に有用な抗体の免疫優性エピトープの弱化

Info

Publication number: JPH09501933A
Application number: JP7507666A
Authority: JP
Inventors: アール．ギャリティー、ロバート; エル．ナラ、ピーター; ゴウトスミット、ヤープ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-08-20
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 1997-02-25
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: PT714444E; AU700786B2; EP0714444A1; AU7569294A; ES2170771T3; US5853724A; CA2623540A1; CA2169764A1; DK0714444T3; JP2006104216A; EP0714444B1; CA2169764C; JP3851938B2; US5585250A; DE69429625T2; WO1995006124A1; DE69429625D1; ATE211767T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳類に投与可能なワクチンを提供するものであって、免疫優性エピトープを有する病原性有機体に対して、その哺乳類に免疫防御を引き起こすことができるワクチンが提供される。本発明ワクチンは、免疫優性エピトープに配置された改変形態の抗原を含有する。この改変形態を有することにより、免疫優性エピトープは、数々の技法の何れによっても免疫的に弱化される。免疫弱化技法の例としては、Ｎ−結合グリコシル化部位の付加、エピトープの正味電荷の変更、および寛容化配列との置換が挙げられる。本ワクチンは薬学的に許容しうる担体も含有する。

Description

【発明の詳細な説明】植物、動物、およびヒトのワクチンとして並びに免疫療法に有用な抗体の免疫優性エピトープの弱化技術分野本発明は、免疫応答の操作に関する。より詳細には、免疫弱化(immunodampeni ng)によって免疫エフェクター応答の対象を、疾病関連の抗原に対してこれまで無反応(silence)であったかあるいは非免疫原性であるエピトープに向けるものである。背景技術ウイルス、細菌、後生動物の寄生虫、およびヒトの癌等の病原性の各種作因は、宿主の免疫応答に打ち勝つための巧妙な攻略法を発達させてきた。このため、多くの病原性有機体に対する有効なワクチンの開発努力に障害を受けることが多い。ある種の寄生生物は、抗体の影響を避けて自己を守ることを可能とするような細胞内生育環境を発達させてきた。また、その他の寄生生物の中でもアフリカントリパノソーマなどは、抗原変異(antigenic variation)と呼ばれるプロセスを利用して自己の表面外被の特性を変える。さらに他の寄生生物は、リンパ球障害性因子を放出して宿主の免疫応答を抑制する途を発達させている。上記以外の攻略法によれば、病原体は、構造の変化あるいは抗原連続変異(ant igenic drift)を受ける免疫優性エピトープを表示する。このエピトープに対抗して生起する早期中和抗体および／または細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、優勢な病原性の表現型の力価を減じようとする宿主免疫系の対抗手段である。しかしながら、感染と上記免疫応答の発言及び効果との間には時間的ずれがある。さらに、免疫優性エピトープの抗原連続変異の結果、上記の早期中和抗体やＣＴＬ応答は病原体に対して効果を失ってしまう。ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は、ヒトの免疫系に侵入してこれを破壊するための精巧な攻略法を発達させてきた。これに対してこれまで試みられたワクチンによる対抗手法はいずれも成功していない。ワクチン産生におけるある手法はＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０を中心としてきた。ｇｐ１２０／１６０の優性Ｖ３ドメインに対しては中和抗体を作ることができる。しかし、この中和抗体はインビボでのＨＩＶ−１の継続した生育を防ぐことに関しては有効でない。ヘイウッド(Haigwood)らは、Ｖ３ドメインを含むアミノ酸を除去することによって、優性Ｖ３ドメインを保持しないｇｐ１２０／１６０免疫原を生成した［ AIDS Research and Human Retroviruses 6:855-69(1990)］。この工作タンパクは酵母中で非グリコシル化形態で生産され、変性され、試験動物を免疫するのに用いられた。この手法は、より保存された中和応答を引き出すことができなかった。病原体でコードされた免疫優性抗原であって抗原性の変動を受けるものの他の例としてはインフルエンザウイルス凝集抗原（ＨＡ）が挙げられる。実際、ＨＡの抗原構造の変化は、このウイルスで引き起こされる呼吸器疾患の周期的な流行に関連している。実験的な条件下では、中和抗体の存在においてこのウイルスを増殖させる時に加えられる選択圧は、耐性変異体の出現という結果を引き起こした。ある例では、ＨＡ１の位置６３における突然変異（ＤからＮ）の結果、共通Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔに合致する３つのアミノ酸モチーフが創製された。この断片は、小胞体とゴルジを経由して移動するタンパクに対するＮ−結合オリゴ糖の付加に関するシグナルとして機能する。過剰の炭水化物の存在によってＨＡタンパクと中和抗体の間の相互作用が阻止された。このことはＮ−結合グリコシル化の阻害剤であるツニカマイシンの存在下で上記変異体の増殖が抗体結合を回復したことが発見されたことによって確認された。このため、ウイルスでコードされたエピトープの翻訳後修飾が中和抗体の結合を妨げる可能性がある。ゲシング(Gething)らは、タンパクのエピトープを防御する方法として、オリゴヌクレオチドの突然変異誘発を利用してＮ−結合修飾物を導入することを開示している［米国特許第５０４１３７６号］。タンパクのＮ−結合修飾物を使用する意図は、その免疫原性を低下させることによって抗原の循環時間を延長させる点にある。発明の概要本発明は、一態様において、ヒトに投与して、被験者内にＨＩＶ−１に対抗する免疫的保護を引き起こすワクチンに関する。このワクチンは、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０の修飾形態物と、ヒトに投与するための薬学的に許容される担体とを含有するものであって、前記修飾物においては、ｇｐ１２０／１６０のＶ３ループは免疫弱化されている。好ましくは、本ワクチン中のＶ３ループは、天然(native)のＶ３ループには存在しない一以上のＮ−結合グリコシル化シグナルを有する修飾されたアミノ酸配列を有する。本発明は、他の一態様においては、哺乳類に投与して、被験体の哺乳類動物内に病原性の有機体に対抗する免疫的保護を引き起こすワクチンに関する。この病原性の有機体は、免疫優性エピトープを有する抗原を含有する。本ワクチンは、このような抗原が修飾された形態の物と、薬学的に許容される担体とを含有するものであって、抗原の免疫優性エピトープは免疫弱化されている。担体は、薬学的に許容される生理食塩水緩衝液を含有することが好ましい。また、免疫優性エピトープは、炭水化物を構成する一部をエピトープに付加する方法等によって免疫弱化することができる。但し、免疫優性エピトープが複数のアミノ酸を含有する場合は、エピトープはこれらのアミノ酸の改変によって免疫弱化させることができる。この実施形態においては、改変はアミノ酸置換を包含することができ、複数のアミノ酸を、ヒトＢ細胞に寛容化された異なる複数のアミノ酸で置換することができる。この異なる複数のアミノ酸は、例えば直鎖状のヒトＢ細胞エピトープを含有することができる。前記複数のアミノ酸はまた、生来の(native)電荷を有することもでき、その場合、改変によってこの生来の電荷は変化する。改変は、さらに前記複数のアミノ酸の一以上を除去することを含むこともできる。本発明の上記の態様における他の実施形態では、免疫優性エピトープは、少なくとも一つの他の分子に対する結合部位を有し、ワクチンは、更にこのエピトープに非可逆的に結合された少なくとも一つの他の分子を含む。当該他の分子は、例えばエピトープに対する抗体を有することができる。この実施形態においては、前記エピトープはレセプターを含むことができ、また前記他の分子はこのレセプターに対するリガンドを含むことができる。本発明のさらに他の実施形態においては、免疫優性エピトープは、哺乳類がこのエピトープに対して中和抗体を産生することがてきるエピトープである。そのような免疫優性エピトープは複数のアミノ酸を含むことができ、この複数のアミノ酸は、病原性の有機体の生存能力に影響を与えることなく変更されることができ、それにより、当該複数のアミノ酸を、病原性有機体の複数の世代にわたって遺伝的浮動によって変化できるようにする。本発明のワクチンは、真菌、原虫類、細菌、さらにインフルエンザウイルスやＨＩＶなどのウイルスを含む多くの病原性有機体に対抗する免疫防御力を与えることができる。一実施形態においては、病原性有機体はＨＩＶ−１であり、免疫優性エピトープはＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０のＶ３ループである。このエピトープはさらに、付加的なＮ−結合グリコシル化シグナルを含むように改変された複数のアミノ酸を有することもできる。本発明は、更に他の一態様においては、免疫優性エピトープを有する天然の抗原を含有する病原性有機体に対抗して哺乳類を免疫する方法に関する。この方法は、免疫優性エピトープが免疫弱化された天然抗原修飾物を含有するワクチンを哺乳類に投与する段階を含む。この方法は、ワクチンの投与に先立って哺乳類に天然抗原を投与する段階を含むことが好ましい。そのような天然抗原の投与の際には、当該天然抗原をコードしてこれを哺乳類中に発現するベクターを対象哺乳類に投与することもまた好ましい。本発明は、さらに他の一態様においては、元々の(original)免疫優性エピトープを有する抗原を含有する病原性有機体に対抗して哺乳類中に免疫防御を引き起こすためにその哺乳類に投与することができるワクチンの製法に関する。この抗原は、前記元々の免疫優性エピトープを含有するアミノ酸群のサブセットを含む複数のアミノ酸をも包含する。この方法は、１）上記元々の免疫優性エピトープを含有するアミノ酸群のサブセットを含む複数のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を得ること、２）元々の免疫優性エピトープとは異なるアミノ酸サブセットを含有する修飾された免疫優性エピトープをコードするようにポリヌクレオチド配列を修飾すること、３）上記修飾段階の結果得られたポリヌクレオチド配列を発現し、修飾された免疫優性エピトープを含む修飾抗原を産生してこれによって当該修飾免疫優性エピトープを前記元々の免疫優性エピトープと比較して相対的に免疫弱化すること、および４）前記修飾抗原と薬学的に許容される担体とを含有するワクチン組成物を調製すること、の各段階を包含する。本発明によるワクチンの製法においては、修飾段階は、少なくとも一つのアミノ酸置換をコードする修飾ポリヌクレオチド配列を、元々の免疫優性エピトープ中に産することを包含することができる。この修飾ポリヌクレオチド配列は、例えばヒトＢ細胞に寛容化された修飾免疫優性エピトープをコードすることができる。修飾免疫優性エピトープは、例えば直鎖状のヒトＢ細胞エピトープであることができる。修飾段階においては、元々の免疫優性エピトープを含有するアミノ酸群のサブセットは、生来の電荷も有してもよい。また修飾段階は、生来の電荷とは異なる電荷を有する修飾免疫優性エピトープをコードする修飾ポリヌクレオチド配列を産してもよい。他の実施形態においては、修飾段階は、少なくとも一つのアミノ酸欠損をコードする修飾ポリヌクレオチド配列を元々の免疫優性エピトープ中に産することを包含してもよい。本発明は、他の一態様においては、ヒトに投与してＨＩＶ−１に対する免疫防御を当該ヒトにもたらすことのできるワクチンの製法に関する。この方法は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０抗原を得ること、このｇｐ１２０／１６０をトロンビンに暴露処理してｇｐ１２０／１６０を分解すること、およびトロンビンで処理された抗原と薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物を調製すること、を含む。好ましくは、本発明の本態様で用いられるｇｐ１２０／１６０抗原の第９２３８部位は、本方法の処理段階の間、完全なまま保たれる。本発明は、さらに他の一態様においては、ヒトに投与してＨＩＶ−１に対する免疫防御を当該哺乳類にもたらすことのできるワクチンに関する。このワクチンは、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０抗原を得、このｇｐ１２０／１６０抗原をトロンビンに暴露処理してｇｐ１２０／１６０抗原を分解し、さらにトロンビンで処理された抗原と薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物を調製することによって生産される。図面の簡単な説明図１はプラスミドｐＪＪ２５の概略図である。図２はプラスミドｐＭＣＩＩの概略図である。図３はプラスミドｐＳＣ６５の概略図である。図４はプラスミドｐＪＪ５の概略図である。図５はプラスミドｐＳＣ５９の概略図である。図６はｇｐ１２０／１６０エンベロープタンパクのＨＸＢ２Ｖ３ループの概略図である。部位指向性突然変異によるアミノ酸置換を示す。各変異体は次のように標記される：１（ＲＩＲ）；２（ＲＧＰ）；３（ＦＶＴ）；４（ＮＭＲ）。ここに示す突然変異はすべて細胞外経路においてＮ−結合グリコシル化を指向するであろう共通モチーフを生成するように企図されている。図７はＨＸＢ２Ｖ３ドメインの主配列、リコンビナントエンベロープタンパクの抗原性を評価するために用いられる抗体試薬のエピトープ標的、およびウエスタン分析による抗体結合データのまとめを示す。“＋”は抗体試薬による染色を示し、“−”は検出可能な染色が無かったことを示す。発明の詳細な説明Ａ．用語の定義本明細書においては、“免疫防御”とは、有機体によって引き起こされる感染を避ける能力、および／または、有機体によって引き起こされる疾病の防御、予防、あるいは弱体化をもたらす能力をいう。 “免疫優性エピトープ”とは、抗原上のエピトープであって、宿主有機体中に選択的に免疫応答を引き起してその抗原から他のエピトープの実質的な排除を引き起こすエピトープをいう。 “エピトープを免疫弱化すること”とは、エピトープを修飾することにより、宿主有機体の免疫系がそのエピトープに対する抗体を産生することを実質的に防ぐことをいう。但し、免疫弱化はそのエピトープを除去することは含まない。 “ｇｐ１２０／１６０”とは、本明細書では、膜に結合したｇｐ１６０およびこれに由来する遊離ｇｐ１２０をコードする遺伝子、並びにその遺伝子産物のいずれかのものをいう。その他の用語については、以下の詳細な説明の記述に関連させつつ逐次その意味を記載する。Ｂ．使用したリコンビナントプラスミド本発明を実施・使用する方法の具体例に関連する各種プラスミドをここに記載する。デジョン(DeJong)らは、ＨＸＢ２の三番目の超可変ドメイン（Ｖ３ループ）であるＨＩＶ−１ｇｐ１２０／１６０を含有する領域のサブクローニングを容易にするためにリコンビナントプラスミドｐＪＪ２５とｐＭＣを利用した［Va ccines 92，Modern Approaches to new Vaccines Including the Prevention of AIDS,チャノック(Chanock)ら編、ニューヨーク（１９９２年）］。リコンビナントプラスミドｐＪＪ２５は、小さなＰｖｕＩＩ−Ｘｂａｌスタッファー挿入片を含有するＮｃｏｌからＢａｍＨＩまでのＨＸＢ２様の断片（ｎｔｓ５６７５ −８４７８）を担持する。リコンビナントプラスミドｐＭＣＩＩは、完全長の感染性のＨＸＢ２様のゲノムを担持する。Current Protocols in Molecular Biolo gy,（グリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス、補遺１５（1992年）、ページ16.17.2）に記載の発現ベクターｐＳＣ６５は、初期 −後期スーパーワクシニアプロモーターを、完全体(intact)チミジンキナーゼ遺伝子の中央に並列させ、下流側にサブクローニング部位を有して担持している。Ｖ３ループ交換には、修飾ｐＧＥＭ−１（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）を直接のレシピエントとして使用した。プラスミドｐＪＪ５は、Ｎｃｏｌ− ＢａｍＨＩ断片（ロス・アラモス(Los Alamos)の命名ではｎｔｓ５６７４−８４７４）を欠くＨＸＢ２の完全な分子クローンである。プラスミドｐＳＣ５９はｐＳＣ６５の構築に使用された親プラスミドである。ＨＸＢ２の配列（その包括的な制限地図を含む）は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号Ｋ０３４５５によって特定される。ＰｖｕＩＩおよびＸｂａｌの開裂部位を示す更なる配列データは、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号Ｍ１７４４９によって見いだされる。Ｃ．緒言本発明者らは、抗原上のある免疫優性エピトープを免疫弱化すると、宿主有機体においてその抗原上の非優性エピトープ群に対する高力価の抗体群を産生することができることを見いだした。そのような免疫弱化された抗原は、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、その他のウイルス等、非常に変わりやすい免疫優性エピトープの抗原を有する有機体に対する有効なワクチンとして用いることができる。本発明者らによる発見の例示的な適用では、本発明者らは、免疫優性Ｖ３ドメインに過剰なＮ−結合炭水化物を有するヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）のリコンビナントｇｐ１２０／１６０タンパクが、新規な抗原特性を示すことを見いだした。この抗原特性には、野性型のＶ３エピトープを認識する抗体に対する結合能の欠如が含まれる。本発明者らはまた、上記過剰炭水化物部分の存在は、ＨＩＶ−１リコンビナントウイルスの感染性生存能を弱めないことを見いだした。さらに、本発明者らは、過剰のＮ−結合炭水化物部分を有するＶ３変異体ｇｐ１２０／１６０タンパクの発現を指向するリコンビナントウイルスで免疫した実験動物は、インビトロで、野性型のＨＩＶ−１による感染を中和する高力価の抗体を示すことを見いだした。よって、ｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメイン内の免疫優性エピトープを免疫弱化すれば、免疫応答は、同じ抗原上にある他の中和エピトープに向かうこととなる。Ｄ．有機体の同定本発明の技法は、互いに関係のない多数の病原性有機体に対する有効なワクチンを創製するために用いることができる。本発明は、高レベルの抗原連続変異を示す免疫優性エピトープを有することによって宿主生物の免疫応答を避けるという攻略法を発達させている有機体に対して最も適切に用いられる。この免疫優性エピトープは通常、病原性有機体の生残能力に影響を与えることなく変化しうるような複数のアミノ酸の形態を採っている。そのような免疫優性エピトープの例としては、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインやインフルエンザウイルスのＨＡが挙げられる。免疫優性を示すと思われる他のエピトープは、感染の過程にわたり大きく変化することが示されているエピトープであり、アフリカントリパノソーマの表面抗原などである。Ｅ．免疫優性エピトープの同定本発明のワクチンは、まず病原性有機体中の免疫優性エピトープを同定することによって創製される。免疫優性エピトープを担持することが疑われる抗原は、その病原性有機体の外表面上の抗原の選択によって同定できる。例えば、真菌、細菌、およびウイルス等の最も単純な有機体は、その病原性有機体の外表面上に露出した一個または二個のタンパクを有している。これらの外表面タンパクが相応の抗原を担持している可能性がもっとも高い。免疫優性エピトープを担持している可能性がもっとも高いタンパクは、ウェスタンアッセイによって同定することができる。このアッセイにおいては、全タンパクをゲル上に付してその病原性有機体に感染した生物から採取した血清に対して試験する。当該血清中の結合抗体は、良く知られたＥＬＩＳＡの種々技法において行われるものと同様に、標識抗−抗体によって同定する。免疫優性エピトープは、病原性有機体に感染した宿主生物の血清を検査することによって同定できる。血清の検査にあたっては、宿主生物において免疫応答を引き起こすと思われる同定済抗原に結合した抗体の量を調べる。もし、免疫優性エピトープがこの抗原に存在すれば、血清中の実質的に全ての抗体がその免疫優性エピトープに結合し、抗原に存在する他のエピトープには抗体は殆どあるいは全く結合しないことになる。免疫優性エピトープの同定の一例として、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインはＨＩＶ−１の免疫優性エピトープであることが他の研究者らによる競合アッセイでのペプチドスキャンニングによって同定された。インビトロでウイルスを中和する抗血清が得られた。ｇｐ１２０／１６０から一連の重複ペプチドが調製された。過剰量のこれらのペプチドそれぞれを血清に順次添加した。各血清サンプルを用いてＨＩＶ−１に対する中和活性を試験した。ｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインからのぺプチドが、血清の実質的に全ての中和活性を排除することが判明した。Ｆ．免疫優性エピトープの免疫弱化免疫優性エピトープか同定されたら、その免疫優性エピトープを免疫弱化する。免疫弱化は、以下に記載する技法を始めとする各種技法に従って行うことができる。Ｎ−結合炭水化物の導入：免疫優性エピトープは、Ｎ−結合炭水化物残基の導入によって免疫弱化することができる。ペプチドエピトープにおいては、これは、そのエピトープをコードする遺伝子に対する部位指向突然変異誘発によって付加的なＮ−結合グリコシル化シグナルを含むことにより簡単に行うことができる。Ｎ−結合炭水化物（ＣＨＯ）の存在はポリペプチドの主アミノ酸配列によって決定する。アスパラギン、次いで任意のアミノ酸、最後にセリンまたはスレオニン（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ、ここでＸはプロリンおよびアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸）の３つのアミノ酸からなる配列がＮ−結合ＣＨＯ付加に関するシグナルであると信じられている。Ｎ−結合配列と合体した炭水化物を始めとする複合炭水化物の付加は、この部位に抗体を発生させる免疫系の能力を低減あるいは弱化すると信じられている。この考え方はインフルエンザ赤血球凝集素タンパク上のある種のＮ−結合ドメインについて提起されているものである［ウィリー(Wiley )ら、Nature,289:373-387(1981)］。インフルエンザの場合には、ＣＨＯの付加はウイルスを免疫攻撃から防御する。そこで、この免疫系において観察されたタンパクを始めとする所与の病原性糖タンパクの主アミノ酸配列に関する知識を用いて分子操作を行い、Ｎ−結合配列を部位指向的に導入したり除去したりすることができる。このようなＮ−結合部位の導入は、この部位に対するＢ細胞の応答を防ぐことを企図するものである。Ｎ−結合炭水化物付加によるエピトープの免疫弱化の例として、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０／１６０の免疫優性Ｖ３ループをＰＣＲ部位指向突然変異誘発によって、実施例１に記載のように免疫弱化することができる。実施例１ＰＣＲ部位指向突然変異誘発Ｎ−結合グリコシル化共通部位（即ちアミノ酸ＮＸＴと−ＮＸＳ）をハグチ(H aguchi)の方法によって、ＰＣＲ部位指向突然変異誘発によってＶ３ループに導入した［PCR Protocols,pp177-183,アカデミック・プレス、カリフォルニア州、サンジエゴ（1990）］。この文献の開示を本明細書の一部として引用する。即ち、正しいＶ３配列と希望のＮ−結合変異とを担持する相補的プライマー対を合成した。ｐＭＣのＶ３領域を部分的に相補的な２つに分け、それぞれをＰＣＲで増幅した。反応１は、Ｖ３Ｎ−末端システインに隣接する部位であって唯一の自然の状態において存在するＰｖｕＩＩ部位（ｎｔｓ７０８２−７０８７）と重複する５’プライマーと、Ｎ−結合インフレーム変異を含む３’プライマーとを含んていた。反応２は、反応１で用いた３’に対する５’逆転相補体と、Ｖ３ループ（ｎｔｓ７２２３−７２２８）のＣ−末端システインに隣接する無反応のＸｂａＩ変異部に重複して含む３’プライマーを含んでいた。両反応をアガロース電気泳動に付し、ゲルから切り出し、ゲルスライスを１．５ｍｌのｃｏｓｔａｒチューブ（アミコン社）中で１５分遠心分離した。反応１と２から３μｌを取り出した。即ち、反応１からは５’Ｖ３ＰｖｕＩＩプライマーを、反応２からは３ ’Ｖ３Ｘｂａｌプライマーを取り出して第三のＰＣＲ増幅における基質およびプライマーとして用いた。得られた増幅生成物は、希望のＮ−結合の組合せを担持している断片を有するＰｖｕＩＩ−ＸｂａｌＶ３ループを含有した。その後のＶ３Ｎ−結合変異体組合せ物の増幅のための基質としては、一種類の変異体を用いた。図６は、ｇｐ１２０／１６０（配列番号：１）のＶ３領域のアミノ酸配列、および本発明におけるこの実施例に従ってこの領域に導入された４つのＮ−結合グリコシル化部位を示す。これらの変異部位を、本明細書では変異体１、２、３、４と略称する。表１は、希望のＮ−結合グリコシル化シグナルを導入して単一の変異体または各種多数の変異体を得る目的で本発明のこの実施例に従って用いられるＰＣＲプライマーを示す。表１にはまた、本明細書の他の箇所に記載するＮｏｔｌ部位の導入に用いるＰＣＲプライマーも合わせて掲載する。実施例１で得た突然変異ポリヌクレオチドは、実施例２に記載のようにしてカセット系に挿入して適切な発現ベクターへと容易に移送することができる。実施例２ｐＧＥＭ１２０カセットの構築修飾Ｖ３ドメインの伝達を容易なものとするために、２つの中間的プラスミドカセットを構築した。この構築が必要とされる理由は、ワクシニア発現ベクターであるｐＳＣ６５は固有のＰｖｕｌｌとＸｂａｌ部位を有しており、これらの部位の存在によって当該ベクターはＶ３Ｐｖｕｌｌ−Ｘｂａｌ移送に阻害的に作用するためである。Ｓａｌｌ−ＮｏｔｌポリリンカーをＳａｌｌ−Ｐｖｕｌｌで消化されたｐＧＥＭ−１に連結した。ｇｐ１６０の開始コドンに延びる５’Ｓａｌｌプライマーと、１２０／４１開裂部位にインフレームの停止コドンを有すると共に当該停止コドンに隣接してあるＮｏｔｌ部位を有する３’プライマーとを用いて、ｐＪＪ２５のｇｐ１２０／１６０配列を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌｌとＮｏｔｌで分解し、修飾ｐＧＥＭ−１のＳａｌｌ−Ｎｏｔｌにサブクローニングした。Ｖ３欠如ｇｐ１２０／１６０エンベロープの配列決定の結果、文献に記載されたＨＸＢ２配列と比較して、二つの無反応の変更および二つのアミノ酸の変更が見いだされた［ラトナー(Ratner)ら、AIDS Res.Hum.Retroviru ses 7:615(1991)］。このベクターｐＧＥＭ−Ｂ２−１２０を用いて、Ｐｖｕｌｌ−Ｘｂａｌで消化されたＮ−結合修飾Ｖ３断片を受容し、最終的に修飾ｇｐ１２０／１６０をワクシニア発現ベクター内に移送した。新規Ｎ−結合グリコシル化シグナルモチーフを構築するための別法を次の実施例３で説明する。実施例３新規Ｎ−結合グリコシル化シグナルモチーフを有するＨＩＶ−１ｇｐ１２０／１６０タンパクをコードする核酸配列の構築方法部位指向突然変異誘発のための複製連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコールを用いてＮ−結合グリコシル化シグナルをＨＸＢ２の一部てあるＨＩＶ−１ゲノム、即ちｇｐ１２０／１６０の第３の超可変ドメイン（Ｖ３ループ）に対応するＨＩＶ− １ゲノムに導入した。プラスミドｐＭＣＩＩは完全長の感染性ＨＸＢ２様ゲノムを担持するが、このプラスミドをＰＣＲ突然変異誘発のテンプレートとして用いた。希望のＮ−結合変異を導入するために設計した非適合物含有の相補的合成オリゴヌクレオチドプライマー対は、オペロン・テクノロジー社によって合成された。プラスミドｐＭＣＩＩのＶ３領域の一部相補的な半分体を、実施例１に記載の条件下でＰＣＲ増幅した。上記実施例３は、ｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインをコードする遺伝子配列がどのように新規Ｎ−結合グリコシル化シグナルモチーフをコードするように改変されるのかについて示すものである。本アプローチの基本的な構成要素は、ＰＣＲに基づく突然変異誘発のプロトコールの使用、および、変異されたＶ３ドメインポリヌクレオチド配列を受け入れることができるプラスミドカセットの使用である。ＰＣＲに用いるプライマー群は、ｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメイン内のＲＩＲアミノ酸の３個をコードする３つのコドンを除去するように設計、合成した。これらのプライマーを基本的に実施例３に記載の通りに使用し、野性型の配列中に存在するＲＩＲアミノ酸配列を除く、全ｇｐ１２０／１６０コード配列を有するｇｐ１２０／１６０カセットを作製した。本発明者らは、これらの修飾物をリコンビナントワクシニアウイルス発現構築体中に導入するための従来記載の手法と同一の手法を利用した。次いで、Ｖ３ドメイン内に小欠損を有するリコンビナントｇｐ１２０／１６０糖タンパクを生産する手段としてこれらの構築物を用いて、培養生育中の細胞を感染させた。これら同一のウイルス構築物に実験動物を感染させ、リコンビナントｇｐ１２０／１６０糖タンパクに対する免疫応答を引き起こした。実施例４ｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインをコードする野性型および修飾ＤＮＡ断片を受容するために用いるプラスミドベクターの構築方法実施例２に記載のｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインをコードするＰｖｕｌｌからＸｂａｌまでのＤＮＡ断片を含むサブクローニング操作を容易に行うために、修飾プラスミドベクターを構築した。この修飾プラスミドの使用が必要である理由は、実施例３のようにして調製した修飾ＤＮＡ断片を受容することを最終目的として用いられるｐＳＣ６５ワクシニア発現プラスミドは、望ましくないＰｖｕｌｌおよびＸｂａｌ制限部位を保持しているためである。そこで、ｐＳＣ６５プラスミドは、ＰｖｕｌｌおよびＸｂａｌを用いては、変異体Ｖ３配列をＰｖｕ１１−Ｘｂａｌｌ制限断片として適切に受容するようなやり方で１ヵ所を切断することができない。修飾プラスミドベクターは、以下のように２段階で調製する。プラスミドｐＧＥＭ１（プロメガ社）をＳａｌｌとＰｖｕｌｌで開裂する。次いでベクター含有断片を合成Ｓａｌｌ−Ｎｏｔｌポリリンカーオリゴヌクレオチドに連結する。これとは別に、小Ｐｖｕｌｌ−Ｘｂａｌスタッファー挿入片を含有するＮｃｏｌからＢａｍＨＩまでのＨＸＢ２様断片を保持するプラスミドｐＪＪ２５に対して分離操作を行った。ｇｐ１６０の翻訳開始コドンに延びる５’Ｓａｌｌプライマーと、ｇｐ１２０／１６０／４１開裂部位にインフレーム停止コドンを有すると共に当該停止コドンに隣接してＮｏｔｌ部位を有する３’プライマーとを用いて、ｐＪＪ２５のｇｐ１２０／１６０配列を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌｌとＮｏｔｌで消化し、修飾ｐＧＥＭ１プラスミドのＳａｌｌ− Ｎｏｔｌ部位にサブクローニングした。このプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｂ２−１２０と称す）を用いて、上記実施例３で調製した修飾Ｖ３領域ＤＮＡ配列を有するＰｖｕｌｌ−ＸｂａｌＤＮＡ断片を受容した。この結果、修飾Ｐｖｕｌｌ−Ｘｂａｌ挿入片を含有する変異体構築物のｇｐ１２０／１６０コード配列全体がＳａｌｌ−Ｎｔｏｌ断片として切断できる。実施例５Ｖ３ドメインに対応する野性型および修飾ＤＮＡ断片を受容可能であって、完全長エンベロープ遺伝子（ｇｐ１２０／４１）を再構築するプラスミドの構築実施例３に記載したもののようなＶ３領域部位指向による変異体をｇｐ１６０遺伝子配列本体中に入れるために、プラスミドｐＧＥＭ−Ｂ２−１２０を修飾して付加的なｇｐ１６０コード配列を含ませた。これは、プラスミドｐＧＥＭ−Ｂ２−１２０のＸｂａｌ−Ｎｏｔｌ断片がより大きなＸｂａｌ−Ｎｏｔｌ断片（１２０／４１開裂部位の下流部分であってｇｐ１６０コード配列中に存在するＤＮＡ配列を含む）で置換された新規プラスミドを創製することによって行った。これを行うにあたって、プラスミドｐＭＣＩＩをＰＣＲにおけるテンプレートとして用いた。このＰＣＲにおいては、５’プライマーは無反応のＸｂａｌ部位をｎｔｓ７２２３−７２２８に導入し、３’プライマーはｇｐ１６０停止コドンのすぐ下流にＮｏｔｌ制限部位を導入した。次いで、ｌｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ −Ｂ２−１２０プラスミド中のより小さいＸｂａｌ−Ｎｏｔｌ断片と交換し、ｐＧＥＭ−Ｂ２−１６０と称する新規プラスミドを創製した。そこで、ｐＧＥＭ− Ｂ２−１６０プラスミドをＰｖｕｌｌとＸｂａｌで開裂し、スタッファー断片を除去することによって、実施例４に記載のような変異Ｖ３ドメイン配列を有するＰｖｕｌｌ−ＸｂａｌＤＮＡ断片中に連結可能となった。以下の実施例によって変異体が発現可能であることを示す。実施例６Ｎ−結合ｇｐ１２０／１６０変異体タンパクの発現を指向するベクターをＨｅＬａ細胞中に構築する方法変異させたエンベロープ遺伝子セグメントを、合成Ｓａｌｌ−ＮｔｏｌポリリンカーをプラスミドのＳａｌｌ−Ｓｍａｌ部位に導入することによって修飾した、ｐＳＣ６５ワクシニア発現ベクター中にサブクローニングした。このプラスミドは、合成初期／後期プロモーターおよびＴＫ遺伝子内に配置されたｌａｃＺ遺伝子のコピーを有する。リコンビナントワクシニアウイルスの選択は、アール(Earl)とモス(Moss)によって記載されている［Current Protocols in Molecular Biology（グリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス、補遺15、ユニット16.1 5-16.18）。この文献の記載を本明細書の一部として引用する。即ち、１×１０⁶ のＣＶ−１細胞をワクシニアウイルス株ＷＲでＭＯＩ０．０５にて感染させた。これらの細胞は、Ｎ−結合修飾ＨＩＶ−１エンベロープを含有する１０〜２０μ ｇのワクシニア発現プラスミドでの感染２時間後にトランスフェクトした。感染細胞は、ペレット化し、０．５ｍｌのＭＥＭ中に再懸濁し、解凍し（３回）、逐次希釈して、その後のヒトＴＫ−ＨｅＬａ細胞の感染において１つのプラークを形成するようにした。これらの細胞を軟寒天と共に０．２５μｇ／ｍｌのデオキシブロモウリジンを含有する培地中に加え、４８時間インキュベートした。プラーク培地、１／２００容積の４％Ｘｇａｌ（ベーリンガー・マンハイム）および１／１００容積の天然赤色素（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する第二の軟寒天を重層した。一夜インキュベート後、リコンビナント候補群（即ちＴＫ−ブループラーク群）を選択し、０．５ｍｌのＭＥＭ中に再懸濁し、追加のプラーク精製サイクルに付して処理した。ウイルスＤＮＡを配列決定し、Ｎ−結合変異の存在を確認した。ｇｐ１２０またはｇｐ１２０／４１を発現するリコンビナントウイルスの検証は、以下のようにして行った。ＨＩＶ−１に対する収集血清を用いた全細胞免疫蛍光法、および二次ＦＩＴＣ接合抗−ヒトＩｇＧを用いて膜結合ｇｐ１２０／１６０／４１（即ち１６０の発現構築物）の存在を明らかにした。ｇｐ１２０のカルボキシ末端に対する抗体、ＨＩＶ−１に対する収集ヒト血清、およびＦＩＴＣ接合抗ヒトＩｇＧを用いた抗原捕捉を行うＥＬＩＳＡによって、ｇｐ１２０／１６０およびｇｐ１２０／４１の両方を発現するウイルスから分泌されたｇｐ１２０を同定した。加えて、ｇｐ１２０／１６０またはｇｐ１２０／１６０／４１の存在をウェスタンブロッティングで確認した。Ｎ−結合修飾Ｖ３タンパクの性状解析は、細胞性且つ可溶性のＣＤ４、０．５β、一群の診断Ｖ３抗体、および抗ｇｐ４１に対するこのタンパクの結合能に関してなされるであろう。本発明者らは、下記の２つの実施例に記載する方法に従って、変異体ｇｐ１２０／１６０タンパクのグリコシル化状態を検証した。実施例７変異体Ｖ３ドメインを示すｇｐ１２０／１６０タンパクのＮ−結合グリコシル化状態の検証方法Ｎ−結合オリゴ糖の翻訳後付加のための候補であるリコンビナントｇｐ１２０／１６０タンパクに過剰な炭水化物部分が存在するかどうかを試験した。リコンビナントワクシニアウイルス（実施例６）で感染させたＳｕｐＴ１細胞の溶解産物中のｇｐ１２０／１６０タンパクをレンチルレクチン親和反応で富化し、次いでＶ８プロテアーゼで部分的に開裂した。次に開裂産物を４〜２０％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ存在下、電気泳動し、ウェスタンブロッティングに付し、Ｖ３特異抗体で可視化した。野性型Ｖ３ドメインを示すタンパクに由来するペプチド断片は、見かけの分子量約６９ＫＤａで移動した。非グリコシル化変異体は、類似の移動度を示すと期待される。炭水化物部分の存在は、本アッセイにおいては、約２ＫＤａに相当量、タンパク断片の移動を遅延化した。本発明者らによる結果から、変異体１（ＲＩＲ）および２（ＲＧＰ）は、野性型のＶ３ペプチド断片と同等の移動度を示すことがわかる。これとは異なり、変異体３（ＦＶＴ）および４（ＮＭＲ）は、ウェスタンブロッティングにおいてわずかに遅延した移動度を示した。これらの結果は変異体３と４のＶ３ドメインにおける過剰炭水化物部分の存在と合致する。さらに、変異体３と４に由来するペプチド断片の分子質量の大きい方へのずれは、このタンパクサンプルをグリコシダーゼで予備処理した時には無かった。この実験計画は、変異体Ｖ３ドメイン２つが新規なグリコシル化修飾を受けることの決定的証拠を提供するものである。実施例８リコンビナントｇｐ１２０／１６０の機能的完全性の検証方法本発明者らは、天然のｇｐ１２０／１６０が、標的細胞結合に関与するとともにリコンビナントｇｐ１２０／１６０分子の機能上の完全性を評価するための設計アッセイへのエントリーにも関与していることを利用した。本発明者らは、リコンビナントＨＩＶ−１ｇｐ１６０Ｎ−結合変異体を細胞中に発現させた。ＥＬＩＳＡアッセイによってこれらの変異体タンパクと溶解性ＣＤ４レセプター分子との間の相互作用を試験した。各リコンビナントタンパクに対するｇｐ１２０／１６０の濃度は、ｇｐ１６０のＣ末端に対する抗体（インターナショナル・エンザイムズ・インク、カリフォルニア州ファルボック）と溶解ＣＤ４による捕捉を利用する抗原捕捉ＥＬＩＳＡプロトコールによって決定した。ＣＤ４の結合指標は、上記の比率（［Ｃ末端捕捉によるｇｐ１６０］／［ＣＤ４捕捉によるｇｐ１６０］を用いて、これを野性型について決定された比で除して計算した。結果を表２に示す。表２の結果から、Ｎ−結合部位指向変異物を有する全タンパクがＣＤ４に結合したことがわかる。この表においては、結果は全て野性型のｇｐ１６０タンパクに関して観察された結合レベルに対して正規化されている。位置３の変異体がＣＤ４結合において最大の減少を示した。他の変異体は全て野性型エンベロープタンパクで観察されたレベルに比較的近い。この結果によって、独立した評価手段を用いた変異体の機能の完全性の調査が促された。本発明者らはさらに、このｇｐ１２０／１６０エンベロープ遺伝子のＶ３ドメインの中にＮ−結合変異を保持するリコンビナントＨＩＶ−１ゲノムの生存可能性を試験することによって、Ｎ−結合ｇｐ１２０／１６０変異体の機能上の完全性を分析した。全部のＮ−結合変異が完全なＨＩＶ−１ゲノムを担持するプラスミド中に導入された。これらの潜在的に感染性の分子クローンをＳｕｐＴ１細胞にトランスフェクトした。感染性の存続可能性は、ｐ２４発現を監視して決定した。最初のｐ２４スパイクの後、細胞を含有しない上清を未感染ＳｕｐＴ１にトランスフェクトし、ｐ２４と融合細胞産生を監視した。単一種の変異体の４つ全てが生存可能である。ｇｐ１２０／１６０のＶ３ループへの多数のグリコシル化シグナルの導入の結果、全ウイルス構築物は生存可能性を有しなかった。これにより、ｇｐ１２０／１６０タンパクのＶ３ドメインにおける１つのグリコシル化シグナルモチーフの存在は、これがウイルスの生命力を弱める範囲まてｇｐ１２０／１６０構造(conformation)を破壊しない。実施例９変異体Ｖ３ドメインを有するｇｐ１２０／１６０タンパクが改変された抗原特性を示すことを検証する方法ウェスタンブロッティングプロトコールを用いて変異体ｇｐ１２０／１６０タンパクの抗原プロファイルを評価した。異なるエピトープを野性型ＨＩＶ−１Ｖ３ドメイン内に認識する抗体試薬のパネルを図７の右側に示す。また、これらの試薬の抗原性標的をＶ３アミノ酸配列の下に図示する。当該抗原性標的は実施例３に記載のように、部位指向性突然変異誘発によって改変されたＶ３ドメイン内の１以上の部位を含む。図７において、変異体１：２：３：４はいずれの抗体によっても認識されなかった。その他の一種類のあるいは多数の変異体は各種抗体との様々な反応性を示した。抗−ｇｐ４１抗体は全変異体に結合した。よって前述の実施例は、Ｎ−結合グリコシル化シグナルの付加によって抗体が免疫優性エピトープに結合する能力が改変されることを確認するものである。リコンビナントワクシニアウイルス構築物で感染されたＨｅＬａ細胞の粗溶解産物（実施例６）を、野性型および変異体のｇｐ１２０／１６０タンパクの供給源として用いて、抗体結合を研究した。レンチルレクチンセファロースカラムを用いた親和性クロマトグラフィーによって、高マンノース(manose)含有糖タンパクを富化した。結合糖タンパクは、α−メチル−Ｄ−マンノース含有カラムから溶出させた。次いでこのタンパクをＳＤＳの存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ウェスタンブロッティングに付した。各種の抗体試薬を用いてブロットを調査(probe)し、野性型ｇｐ１２０／１６０分子中に見いだされる様々な抗原性標的の有無をアッセイした。全サンプルに対する抗ｇｐ４１の染色強度を比較することにより、均一なサンプルローディング（実施）が確認された。抗Ｖ３試薬の何れによっても染色が無かったことは、実施に関する人工的変動要因からくるというよりむしろ、抗体がリコンビナント標的を認識する能力を有しないことが原因であると考えられる。特定の抗体試薬によって認識されるエピトープの存在は、ウェスタンブロッティングにおける染色バンドの存在によって示される。陽性コントロールである野性型ｇｐ１２０／１６０は、予想されたように全てのＶ３特異抗体と結合する。逆に、１：２：３：４変異体の抗原特性は野性型のエンベロープ分子の抗原特性とは全く異なるものである。この変異体は、本発明者らの抗体試薬パネルによって検出されうる何れの野性型エピトープをも表示しない。これらの結果は、ｇｐ１２０／１６０糖タンパクの抗原構造を修飾するという本発明者らによる手法の有効性を裏付けるものである。生来(native)の電荷の変更：免疫優性エピトープを免疫弱化するための別の方法は、エピトープ上の生来の電荷を変更することである。これは免疫優性エピトープをコードする遺伝子の部位指向性突然変異誘発によって行うことができる。例えば、荷電されたアミノ酸を特徴とするコドンは、反対の電荷のアミノ酸あるいは非極性アミノ酸をコードするように変更することができる。同様に、非極性アミノ酸を特徴とするコドンは、正あるいは負のいずれかの電荷を有する極性アミノ酸に変更することかできる。Ｎ−結合グリコシル化シグナルの付加に関連して掲載した上記の各実施例におけるアプローチは、十分一般的なものであるので、適切に選択されたＰＣＲプライマーを用いて各種の変異をｇｐ１２０／１６０遺伝子配列のＶ３コドン部へと導入することができる。Ｖ３ドメインの全体としての正味正電荷に寄与するアミノ酸は荷電されていないかあるいは酸性の側鎖を有するアミノ酸で置換可能である。一具体例として図６に示すＲＩＲ部位を指向された変異体は、二つの正に荷電したアルギニン残基が非荷電アスパラギンおよびセリン残基によって置換されたものである。抗体マスキングおよび免疫集中（focusing）：免疫応答を免疫優性エピトープから逸らすように再集中させるためのさらに別の方法においては抗体のマスキングを利用するが、このマスキングは、部分的にそのエピトープに結合して行う。同族の抗原ドメインと非可逆的に結合する抗体は、Ｂ細胞から見えないように標的エピトープを覆い隠す（マスクする）ことができる。免疫応答は、そのような方略によってｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合ドメインのような、より保存されたドメインに集中する。例えば、Ｖ３特異抗体は、非可逆的に架橋可能で、その複合体は免疫原として現れる。また、非可逆的にｇｐ１２０／１６０に結合したｓＣＤ４を出発免疫原として用いることもできる。この複合体に対抗して得られる抗血清は、ｇｐ１２０／１６０に非可逆的に結合することができる。これは、その分子上の非ＣＤ４結合ドメインに対して生起じる一群の抗体を含む。これによってこの複合体は、免疫原として現れ、抗体をＣＤ４結合ドメインに対して生じさせる。同族の抗原ドメインに非可逆的に結合する抗体やその他のリガンドは、結合エピトープが免疫サーベイランスを受けないよう、これをマスクすることができる。この方略を利用して、免疫応答をｇｐ１２０／１６０のＶ３ループのような免疫優性エピトープから逸らして、ｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合ドメインのようなより保存された分子領域へと集中させることができるであろう。同族の抗原ドメインに非可逆的に結合可能な抗体、抗体断片、抗体アナログ、あるいはその他のリガンドは、結合したエピトープが免疫サーベイランスを受けないようにマスクすることができる。マスキングされた免疫原の生産と使用に基づくこの方略を利用して、免疫応答をｇｐ１２０／１６０のＶ３ループのような免疫優性エピトープから逸らして、ｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合ドメインのようなより保存された分子領域へと集中させることができるであろう。実施例１０第二の分子を抗原のそのドメインに非可逆的に結合することによる免疫優性エピトープのマスキング方法ＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対するマスキングされた免疫原は、以下のようにして創製される。まず、レンチルレクチンセファロースクロマトグラフィーを用いて、野性型のＨＩＶ−１に感染したＨｅＬａ細胞培養の上清からｇｐ１２０を富化する。次いで、Ｖ３ループ内でエピトープを認識する部位特異性モノクローナル抗体を選択する。０．５βと称する抗体が、少なくとも１４個のアミノ酸を包含するＶ３ループ内のエピトープに結合する。次に、適切に緩衝された０．５β 溶液と部分的に精製したｇｐ１２０を合わせてチタス(Titus)らの方法に従って架橋させる［J.Immunol.,138:4018-4022(1987)］。この文献の開示内容を本明細書の一部として引用する。適切な反応期間の経過後、サンプルを希釈して反応生成物をゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。化学的に架橋したｇｐ１２０／０．５β対を含有するカラム分画を単離し、適切に緩衝された生理食塩水ベースの溶液に対して透析した。架橋複合体は、好適なアジュバンドと共に、標準的免疫プロトコールにおいて使用することができる。マスキングされたデコトープの起爆（プライミング）と増強（ブースト）：免疫弱化に関するさらに別のアプローチは、天然抗原への一次免疫に関するものである。例えば、好適に改変されたリコンビナントワクシニアでの感染により動物に天然のＨＩＶ−１エンベロープでプライムすることができる。次いで、その動物をＶ３改変ｇｐ１２０／１６０で増強して、二次応答を他のエピトープに向かわせることができる。寛容化配列の挿入：病原体でコードされた優性エピトープを免疫弱化するために用いることのできる別のアプローチとしては、その抗原の該当領域のアミノ酸配列を、ヒトの免疫系に寛容化されたタンパクモチーフで置換することものがある。例えば、Ｖ３ループの天然のアミノ酸配列は、ヒトＢ細胞に寛容化された配列と交換されることができる。これは、任意のヒトＢ細胞エピトープを含んでもよいと定めることかできる。このアプローチの目的は、病原体の抗原のセグメントがヒトの特徴を示すアミノ酸配列で置換されたような病原体抗原の変異体形態のものを創製することにある。これによって、ヒトの免疫系は、もし本発明が適用されない場合は病原体抗原が優性エピトープとして作用病原体の抗原のその領域に対する強力な免疫反応の係止を回避するであろう。実施例１１Ｖ３ループに寛容化されたヒトエピトープで置換されたｇｐ１２０／１６０タンパクを発現するリコンビナントワクシニアウイルスβの構築天然抗原の免疫優性ドメインが寛容化ヒト配列により置換されたキメラ状免疫弱化抗原を以下のようにして構築した。本発明者らは、まず、ヒトの免疫系が通常応答しないポリペプチドに対応する一続きのアミノ酸をコードするＤＮＡ制限断片の単離から着手した。このために、ヒトＩｇＭＣＨ３ドメインのアミノ酸配列を使用した。このドメインの完全アミノ酸配列は、カバット(Kabat)によるS equences of Proteins of Immunological Interest(1991)から入手可能である。ＤＮＡ制限断片を核酸クローンから単離して、好便に配置された制限部位が利用できるかどうかを確認する。あるいは、ＰＣＲプロトコールを用いて適切な制限部位をそのような核酸配列中に導入する。次にそのようなＤＮＡ断片を、本明細書においてすでに記載したｐＧＥＭ−Ｂ２−１２０およびｐＧＥＭ−Ｂ２−１６０プラスミド中に連結する。移植されたヒト抗原配列およびｇｐ１２０／１６０の翻訳リーディングフレームを保存するように特に注意する。このようにして、野性型Ｖ３ドメインのかわりに寛容化ヒト配列が置き代わった置換物を有する修飾ｇｐ１２０遺伝子カセットおよび修飾ｇｐ１６０遺伝子カセットが創製される。次にこれらのカセットから得たＳａｌ−Ｎｏｔｌ制限断片を上記の実施例６に記載した修飾ｐＳＣ６５ワクシニアベクターへと移す。引き続いて、これらの遺伝子配列を、生存能を有するウイルス構築物へと標準法によって組み入れる。以下の手続では実験動物としてモルモットを使用したが、当業者はヒトに適用可能な同様のアプローチをもってこれを容易に改変実施できるであろう。トロンビン開裂：トロンビンは、ＨＸ１０ｇｐ１２０／１６０を１ヵ所で開裂して、Ｖ３ループのアミノ酸ＲとＡの間の切断により２つの断片にする［クレメンツ(Clements) ら、AIDS Res.Hum.Retroviruses 7:3-16(1991)］。結合ドメインに上記のアミノ酸を有する中和抗体（１１０．５０．５Ｂ）は消化された上記ループには結合しない。その認識配列が直鎖状の完全体を維持するその他のＶ３結合抗体は、開裂されたループ（９２８４）とやはり結合する。しかしながら、トロンビンでの長時間の処理は二次的部位を開裂させ、他の開裂可能な部位に加えて９２３８部位をも多少破壊する。よって、トロンビンによる開裂の制御によってＶ３エピトープの中和抗原性をある程度除去できる。除去：ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を、５つの定常（Ｃ）ドメインの間に散在させた５つの主超可変（Ｖ）領域へとクラスター化し、Ｃ１−Ｖ１−Ｖ２−Ｃ２−Ｖ３− Ｃ３−Ｖ４−Ｃ４−Ｖ５−Ｃ５のパターンを得た。コフィン(Coffin)は、ｇｐ１２０／１６０構造内のループが分子の機能上の性質と干渉しないように上記可変領域が存在する、という仮説をたてた。このことは、ｇｐ１２０／１６０が可変ドメインの配列の異質性とは無関係にＣＤ４に結合することを暗示している。加えて、ｇｐ１２０／１６０の可変ドメインは、免疫応答をより保存されたドメインから逸らすことによってウイルス株間の抗原性の変動範囲に寄与し得る。この仮説を検証するために、ヘイウッド(Haigwood)ら（上掲書）は、ＳＦｇｐ１２０／１６０の可変領域群を系統的に除去し、これらの除去タンパクを酵母内で発現させた。彼らは、これらの除去物を免疫原として使用することで、より保存されたエピトープをマスキングしないであろうと仮説した。この研究は、酵母内で発現された変性非グリコシル化物を用いて行われたが、より保存された中和応答を引き出すことができなかった。更に、試験した除去変異体のいずれもがＣＤ４に結合しなかった。このことは、著者らが示唆しているように、ｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合ドメインに対する免疫原性を保持するためにはエンベロープ糖タンパクを天然の状態に保つ必要があるか、あるいは上記グリコシル化様式が非天然構造であることを示し得る。他の研究者らが独立して行った研究では、可変ドメインＶ１、Ｖ２、Ｖ３を除去した除去変異体からのタンパクがなおＣＤ４に高親和性で結合することから、ＣＤ４に対する結合にはｇｐ１２０／１６０の超可変領域は必要でないことが示唆されている。ＣＤ４に対する結合が明らかに妨害されなかったが、ＣＤ４との結合に要求されるＶ４およびＶ５超可変ドメインをなお担持するこの除去体タンパクは、ｇｐ１２０／１６０に対して得られた抗血清には結合しなかった。このことは驚くべきことである、なぜならｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合ドメインに対して低親和性抗体が得られることがチャング(C hang)によって報告されているからである。よってこれらのデータが示唆することは、Ｖ４およびＶ５が非免疫原性のドメインであるか、あるいは当該タンパクの天然構造が除去の結果改変されて免疫血清がその除去されたタンパクを認識できないか、のいずれかであるということであり、後者の可能性が高い。それにもかかわらず、これを免疫原として使用することにはいくらかの有望性が残され、それは免疫応答が潜在的により保存されたｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合ドメインを指向することができるためである。Ｇ．ワクチン種々の免疫弱化技法についての前記の説明から理解されるように、本発明者らは、ワクチンの手法即ちＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０の免疫優性Ｖ３ループの免疫弱化によるモデル系を利用した。しかし、当業者には容易に理解されるように、この手法は本明細書の開示に即して他の病原性有機体にも適用可能なものである。従って、有効なワクチン接種のための処方やプロトコールの開発について、以下ＨＩＶ−１ワクチンに関連して説明する。但し記載は例示のためのものてあり本発明の応用範囲を特定の病原性有機体に限定するものではない。ＨＩＶ−１ワクチンの最も効果的な設計は、このウイルスを首尾のよい病原体とした当該ウイルス独特の特徴を利用することによって達成される。ＨＩＶ−１ウイルスが最初の部位において免疫系を欺くことを防ぐことがこの点における大きな進歩となるものである。よって、本発明者らは、免疫優性エピトープか免疫弱化されているｇｐ１２０／１６０免疫原を生産した。ＨＩＶ−１病原体によって採用されたと見られる生き残り戦略は、抗原性の変動を受け、ウイルスでコードされた優性なエピトープの表示に部分的に依存するものである。ＨＩＶ−１感染の経過において、感染した時と免疫応答発現との時間的なずれは、このウイルスに、誤りがちな逆転写酵素を用いてそのゲノムを複製する機会を与えてしまう。その結果、密接に関連してはいるが中和抵抗性である変異体のサブポピュレーションを出現させてしまうことになる。これらの変異体は、中和抗体の効果から逃れるばかりでなく、親ウイルスに対する抗原性の類似の結果、デコトープの抗原特性が変わっても当初の免疫応答を継続して刺激する。この現象の実際の効果は、交叉反応性によって最も早期のウイルスの表現型に対する免疫エフェクターの応答を継続して生成する指向された免疫刺激応答が締め出されることである。よって、免疫優性デコトープの機能は、免疫系を誘引して一層保存されかつ潜在的に広い範囲で中和するドメインに対して応答しないようすることである。この方略はＨＩＶ−１による継続した病原性誘発において非常に重要なものである。ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパクの第３の超可変ドメイン（Ｖ３）は、ＨＩＶ−１の免疫優性エピトープであって、これは、中和抗体の第一の標的である。このドメインはその可変性にも関わらず、幾らかの保存された構造的な特徴を示す。Ｖ３ループは典型的には長さが３５アミノ酸であって、ジスルフィド結合を形成していると考えられる２つのシステイン残基に結合している。Ｖ３ループは全体として正に荷電され、コンピュータ予測では、ループの頂点であると考えられる所にＢターンβシートを有する。異なる各種のＨＩＶ−１単離物のタンパク配列同士を比較すると、このウイルスはｇｐ１２０／１６０のＶ３ドメインにおけるアミノ酸配列の相当な変動を寛容化することができると示される。前記ウイルスの生存可能性を危うくすることなくウイルスの免疫優性エピトープ中の配列変化を寛容化する上記能力は、中和表現型からの逃避に直接関連している。異なるＶ３ドメインを認識する抗体は、免疫化ドメインに対するタイプ特異性を示す。例えば、所与の株のＶ３ペプチドに対して生成した抗体はその株を中和するが、多くの場合、他のＶ３エピトープを示すウイルスを中和できない。様々に異なるＶ３特異性抗体が感染の経過の先の段階で出現するが、それらは感染の初期の期間においてはＶ３特異抗体を特徴付ける高力価には到達しない。その結果、変異体Ｖ３エピトープを指向する後期の体液性および／または細胞性仲介応答は、検査対象の同族ウイルス集団を捕らえるのに不十分である可能性がある。ｇｐ１２０／１６０構造全体がＶ３ドメインのように柔軟で変化しやすいとは考えにくい。標的細胞の結合を行う能力および標的細胞に入り込む能力を含む、ｇｐ１２０／１６０分子に対する機能面での要求は、構造に対して制約を課すものである。ｇｐ１２０／１６０のＣＤ４結合ドメインは、強く保存された構造を示すと思われる部位の一例である。ｇｐ１２０／１６０／ＣＤ４結合部位が免疫原性を有することを示しているエイズ患者から抗体を単離した。これにもかかわらず、ｇｐ１２０／１６０−ＣＤ４結合部位に対する抗体は抗−Ｖ３抗体と比較して力価が非常に低い。よって、ＨＩＶ−１はそのゲノム内容の一部を利用して宿主の免疫応答を惑わして囮のエピトープに向けさせ、より構造的に保存された機能的なドメインから逸らすという仮説は条理にかなったものである。Ｖ３のような可変領域エピトープに対して用意された免疫応答とは対照的に、本発明者らは、より保存されたエピトープに対する応答がウイルスの内転移を制限する可能性が非常に高いことを見いだした。ＨＩＶ−１への中和応答の多くはＶ３ドメインおよびＣＤ４結合ドメインに向けられている。今日までワクチンの試みは相同的な免疫的挑戦に耐えることができたに過ぎない。このことは、免疫応答が、免疫化株と侵入してきた(challenge)ウイルスとの構造を区別する優性可変エピトープに対するものであることを強く示唆している。この可変エピトープとしてもっとも可能性の高い候補はｇｐ１２０／１６０分子上にあるＶ３である。よって本発明者らの方法を用いて、通常では野性型ＨＩＶ−１単離体のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパクの免疫優性Ｖ３ドメインに向けられる、強力な体液性および／または細胞性仲介免疫応答を弱めることができる。本発明者らの手法は、免疫原性を減じるためにＶ３ドメインの抗原構造を修飾することを含む。この手法の目的はｇｐ１２０／１６０分子上のその他のエピトープに対する体液性免疫応答を高めることである。Ｂ細胞はＴ細胞依存性あるいはＴ細胞非依存性の経路て抗原に応答する。どちらの場合においても、Ｂ細胞レセプターと同族の抗原エピトープとの間の初期相互作用の結果、増殖およびクローン拡大、抗体の親和性成熟、そして最後に高親和性、高特異性の抗体産生をもたらす。本発明者らは、ｇｐ１２０／１６０−Ｖ３とその同族Ｂ細胞クローンとの間の初期の相互作用を阻止することを提案する。しかし、同時にｇｐ１２０／１６０に対する他のＢ細胞エピトープ、この構造的完全性Ｖ３特異性クローン拡大、さらに拡大、突然変異、および当該分子上の他のＢ細胞エピトープに対する特異性抗体産生を許容する。リコンビナントｇｐ１２０／１６０タンパク分子を哺乳類細胞中で発現させる一方法においては、実施例６に記載のように、ワクシニアウイルスの発現系を利用する。この発現系の数々の特徴の一つとして、各種リコンビナントタンパクをミリグラム量で生産することができる点が挙げられる。これらのタンパクは、その後、生化学的研究に利用できるとともに免疫原としても使用可能である。本発明者らは、弱化させた免疫優性エピトープを新規なワクチン戦略に使用できると予想している。各種の免疫処置経路によって免疫系の特定の分枝を選択的に刺激できるので、ここに記載の技術に基づく個々のワクチンもそれぞれ異なる投与ルートを必要とするであろう。例えば、中和抗体産生に力点を置くワクチンデリバリーシステムは、もし問題の病原体が細胞性免疫応答によって最も良く戦われるならば、選択されるべき方法ではないであろう。このことは、デリバリーシステムの範囲は本ワクチン技術の新規応用の各件ごとに試験しなければならないことを暗示している。免疫原の投与経路としては、アイドロップやスプレータイプの目薬による接種、鼻スプレーやエアロゾルの吸引、（経口）摂取、皮下、経皮、または筋肉注射、リコンビナントウイルスベクターによる感染、あるいは宿主細胞に入った後遺伝子発現を指向する裸のＤＮＡの注入などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。以下に記載の例は、ヒトのワクチン摂取プロトコールに利用し得る、リコンビナントワクシニアウイルスと精製されたリコンビナントサブユニットとによる方法の一例である。この例はあくまで一例であって、ヒトやその他の哺乳類のワクチン接種を行うのに免疫弱化された優性エピトープに基づくリコンビナント剤をもってする唯一の手段であることを意味するものではない。実施例１２ワクチンプロトコールにおける、リコンビナントウイルスおよびｇｐ１２０／１６０担持修飾Ｖ３ドメインの免疫原としての使用ＨＩＶ−１に曝される危険にあるヒトに対し、ＨｅＬａ細胞中で増殖し次いでショ糖濃度勾配バンド法で精製した１０⁷〜１０¹⁰ｐｆｕの生リコンビナントワクシニアウイルス（実施例６）を皮下注射した。このウイルス調製物は、力価測定の前に冷等張生理食塩緩衝液に対して十分に透析した。同一の生ウイルスの第二回目の投与は４週間後に行った。この時の注射は最初の接種と同じ場所に行った。次に、精製リコンビナントｇｐ１２０／１６０タンパクのサブユニットの追加免疫をフーらの記載にしたがって行い、中和抗体の産生を高めた［AIDS Res.H um.Retroviruses 7:615(1991)］。レンチルレクチン親和クロマトグラフィーによるリコンビナント糖タンパクの粗精製の後で、注射したタンパクもまた抗ｇｐ４１モノクローナル抗体を用いて親和クロマトグラフィーでほぼ均質になるまで精製した。冷等張生理食塩緩衝液に対して透析済の上記サブユニットタンパクは、最終濃度１０〜１０００μｇ／２００μｌの範囲に希釈し、完全フロインドあるいはＩＳＣＯＭアジュバンド［モレイン、Immunol.Lett.25:281-83(1992)］のいずれかと共に筋注した。ナラらの方法によって中和抗体力価の変化をアッセイした［AIDS Res.Hum.Retroviruses 3/283-302(1987)］。以下の手続は、実験動物としてモルモットを用いて行ったが、同様の手法はヒトにも適用されうるであろう。実施例１３リコンビナントワクシニアウイルスと体液性免疫応答の検出を利用するワクチン接種の開発本発明者らは、実験動物中にＨＩＶ−１中和抗体応答を引き出す２部ワクチン接種プロトコールを通常的に用いている。まず、本発明者らは、モルモットに生リコンビナントｇｐ１２０／１６０発現ワクシニアウイルスを１０⁷〜１０⁸プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）皮下注射する。生ウイルスの第二回目の投与は約４週間後に行う。この感染の効果は、注射した部位での小傷の外見で確認される。次に、本発明者らは、１０μｇのレンチルレクチンセファロース精製した野性型あるいはリコンビナントｇｐ１２０／１６０タンパクを上記動物に注射してサブユニット免疫原で１回追加免疫(boost)する。本発明者らは、体液性免疫応答を、血清サンプルか希釈可能であってかつ野性型ＨＩＶ−１で細胞のインビトロ感染を９０％中和する範囲で定量した。図６に示す部位指向変異を有するリコンビナントワクシニアウイルスに感染させた数対のモルモットの血清抗体価を表３に記載する。血清サンプルを採取し、感染２週間後に力価を測定した。ワクシニアコントロールで感染させた試験動物は、インビトロでＨＩＶ−１感染中和する抗体を引き出すことができなかったが、リコンビナントウイルス１：２：３：４による感染では、一匹の動物において中程度の力価、他方の動物においては本発明者らによる陽性コントロールと同等の力価が示された。従来の研究結果では１：２：３：４リコンビナントの変異Ｖ３ドメインは野性型と比べて全く異なる抗原プロフィルを示すということが判っていることに鑑み、本実験の結果は意義あるものである。野性型と１：２：３：４変異体ｇｐ１２０／１６０との間の抗原性の関連度が低いという前提で、表３の結果は、免疫弱化された変異体に対する体液性免疫応答は免疫優性Ｖ３ループからそらされ、野性型と変異体ｇｐ１２０分子の双方に存在する一層保存されたエピトープへと再指向させられる、というシナリオに合致するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ギャリティー、ロバートアール. アメリカ合衆国 21769 メリーランド州ミドルタウンバレーロード 8584 (72)発明者ナラ、ピーターエル. アメリカ合衆国 21701 メリーランド州フレドリックサンセットドライブ 6516 (72)発明者ゴウトスミット、ヤープオランダ国エヌエル―1105 ア―２アムステルダムマイベルクドレエス 15 アカデミックメディカルセンター内

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類に投与して該哺乳類内に病原性有機体に対する免疫的防除を引き起こし得るワクチンであって、前記病原性有機体は免疫優性エピトープを有する抗原を含み、当該ワクチンは前記免疫優性エピトープが免疫弱化された前記抗原の修飾形態物と薬学的に許容される担体とを含むワクチン。２．天然抗原または、当該ワクチンは前記天然抗原をコードしてこの天然抗原を前記哺乳類中に発現するベクターを更に含む請求の範囲第１項に記載のワクチン。３．ヒトに投与して被験者内でＨＩＶ−１に対する免疫的防除を引き起こし得るワクチンであって、前記ワクチンはＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０の修飾形態物と、前記ヒトに投与するための薬学的に許容される担体とを含み、ここで、前記ｇｐ１２０／１６０のＶ３ループは免疫弱化されたものである請求の範囲第１項に記載のワクチン。４．前記Ｖ３ループは天然Ｖ３ループには存在しない一以上のＮ−結合グリコシル化シグナルを含む修飾アミノ酸配列を有する請求の範囲第３項に記載のワクチン。５．前記担体は薬学的に許容される生理食塩緩衝液を含むものである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。６．前記免疫優性エピトープはこのエピトープに対する炭水化物部分の付加によって免疫弱化されたものである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。７．前記免疫優性エピトープは複数のアミノ酸を含み、前記エピトープはこのアミノ酸の改変によって免疫弱化される、請求の範囲第１項に記載のワクチン。８．前記改変はアミノ酸置換を包含するものである、請求の範囲第７項に記載のワクチン。９．前記複数のアミノ酸はヒトＢ細胞に寛容化された異なる複数のアミノ酸によって置換されたものである、請求の範囲第８項に記載のワクチン。１０．前記異なる複数のアミノ酸は直鎖状のヒトＢ細胞エピトープを含む、請求の範囲第９項に記載のワクチン。１１．前記複数のアミノ酸は生来の電荷を有し、前記改変はこの生来の電荷の変更をもたらすものである、請求の範囲第７項に記載のワクチン。１２．前記改変は前記複数のアミノ酸の１以上の除去を含むものである、請求の範囲第７項に記載のワクチン。１３．前記免疫優性エピトープは少なくとも１つの他の分子に対する結合部位を含み、前記ワクチンは前記エピトープに非可逆的に結合した少なくとも１つの他の分子をさらに含むものである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。１４．前記他の分子は前記エピトープに対して指向する抗体を含むものである、請求の範囲第１３項に記載のワクチン。１５．前記エピトープはレセプターを含み、前記他の分子は該レセプターに対するリガンドを含むものである、請求の範囲第１３項に記載のワクチン。１６．前記免疫優性エピトープは、前記哺乳類がこれに対する中和抗体を産生することができるエピトープである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。１７．前記免疫優性エピトープは複数のアミノ酸を含み、前記複数のアミノ酸は前記病原性有機体の生存能に影響を及ぼすことなく変更されることができ、これによって前記複数のアミノ酸が前記病原性有機体の複数の世代にわたる遺伝子的浮動によって変化され得るものである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。１８．前記病原性有機体はウイルス、真菌、原虫類、および細菌から成る群より選択されるものである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。１９．前記病原性有機体はインフルエンザウイルスである、請求の範囲第１８項に記載のウイルス。２０．前記病原性有機体はＨＩＶ−１であり、前記免疫優性エピトープはＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０のＶ３ループである、請求の範囲第１項に記載のワクチン。２１．前記免疫優性エピトープは付加的なＮ−結合グリコシル化シグナルを含むように改変された複数のアミノ酸を含むものである、請求の範囲第２０項に記載のワクチン。２２．哺乳類に投与して該哺乳類内に病原性有機体に対する免疫的防御を引き起こすワクチンを製造する方法であって、前記病原性有機体は元々の免疫優性エピトープを有する抗原を包含し、前記抗原は前記元来の免疫優性エピトープを含むアミノ酸のサブセットを含む複数のアミノ酸を含み、当該方法は、前記元々の免疫優性エピトープを含むアミノ酸の前記サブセットを包含する前記複数のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を得ること、前記元来の免疫優性エピトープとは異なるサブセットのアミノ酸を含む修飾された免疫優性エピトープをコードするようにポリヌクレオチド配列を修飾すること、前記修飾段階の結果得られた前記ポリヌクレオチド配列を発現し、これにより、前記修飾された免疫優性エピトープを含む修飾抗原を産生して、前記修飾免疫優性エピトープが前記元々の免疫優性エピトープと比較して相対的に免疫弱化されること、および前記修飾抗原と薬学的に許容される担体とを含有するワクチン組成物を調製すること、の各段階を含むものである、ワクチンの製造方法。２３．前記修飾段階は、前記元来の免疫優性エピトープ内における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする修飾ポリヌクレオチド配列を産生することを包含する、請求の範囲第２２項に記載の方法。２４．前記修飾ポリヌクレオチド配列はヒトＢ細胞に寛容化される修飾免疫優性エピトープをコードするものである、請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．前記修飾免疫優性エピトープは直鎖状のヒトＢ細胞エピトープである、請求の範囲第２４項に記載の方法。２６．前記元々の免疫優性エピトープを含む前記アミノ酸のサブセットは生来の電荷を有し、前記修飾段階は前記生来の電荷とは異なる電荷を有する修飾免疫優性エピトープをコードする修飾ポリヌクレオチド配列を産生するものである、請求の範囲第２３項に記載の方法。２７．前記修飾段階は前記元来の免疫優性エピトープ中の少なくとも１つのアミノ酸欠損をコードする修飾ポリヌクレオチド配列を産生することを包含する、請求の範囲第２２項に記載の方法。２８．ヒトに投与してＨＩＶ−１に対する免疫防御を前記ヒトにもたらすことのできるワクチンの製造方法であって、本方法は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／１６０抗原を得ること、前記ｇｐ１２０／１６０抗原をトロンビンに暴露処理してこのｇｐ１２０／１６０抗原を分解すること、さらに、上記トロンビンで処理された抗原と薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物を調製すること、の各段階を含むものである、請求の範囲第２２項に記載の方法。２９．ｇｐ１２０／１６０の９２３８部位が処理段階の間で完全体である、請求の範囲第２８項に記載の方法。